ES2626611T3 - Sistema microfluídico usando micro-aberturas para la detección de alto rendimiento de entidades - Google Patents

Abstract

Un sistema de detección microfluídica (10) para la detección de entidades diana de tamaño de micrómetros en un fluido que contiene una cantidad de perlas magnéticas y una cantidad de entidades diana unidas a una o más perlas magnéticas, en el que cada entidad diana unida a una perla magnética tiene una dimensión eficaz más pequeña superior a una dimensión eficaz más grande de cada perla magnética, comprendiendo el sistema: un componente de detector (12) que incluye: un cuerpo (15) que define un depósito (16); una placa (18) dispuesta dentro de dicho depósito (16) y que separa dicho depósito (16) en una primera cámara (16a) y una segunda cámara (16b), definiendo dicha placa (18) una pluralidad de orificios (50) a su través, teniendo cada orificio (50) una dimensión eficaz dimensionada para siempre permitir el pase de la dimensión eficaz más grande de cada perla magnética y dimensionada además para siempre prevenir el pase de la dimensión eficaz más pequeña de cada entidad diana; teniendo dicha primera cámara (16a) de dicho depósito (16) una primera entrada (13a) y una primera salida (13b), dicha primera entrada (13a) conectable de forma fluida con una fuente de fluido que contiene las entidades diana; y un imán dispuesto con respecto a dicho depósito (16) de manera que dicha segunda cámara (16b) de dicho depósito (16) y dicha placa (18) estén situadas entre dicho imán y dicha primera cámara (16a) de dicho depósito (16), dicho imán configurado para generar una fuerza magnética suficiente para atraer perlas magnéticas en dicha primera cámara (16a) de dicho depósito (16) a dicha segunda cámara (16b) de dicho depósito (16); y una bomba (40; 41) para hacer circular continuamente el fluido de la fuente de fluido que contiene las entidades diana mediante dicha primera cámara (16a) de dicho depósito (16).

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

DESCRIPCION

Sistema microflmdico usando micro-aberturas para la deteccion de alto rendimiento de entidades REIVINDICACION DE PRIORIDAD

La presente solicitud es una solicitud no provisional que reivindica prioridad a la solicitud provisional en tramitacion junto con la presente N.° de serie 61/471.762, presentada el 5 de abril de 2011, en nombre de los mismos inventores, cuya divulgacion entera se incorpora en el presente documento por referencia.

CAMPO TECNICO

La presente invencion se refiere generalmente a la microflmdica y particularmente a la deteccion de celulas elegidas como diana presentes en fluidos de muestra.

ANTECEDENTES

Las celulas tumorales circulantes (o CTC) son celulas raras presentes en la sangre de pacientes metastasicos con cancer. La deteccion cuantitativa de CTC es importante para la deteccion precoz de cancer, ademas de la monitorizacion de la progresion de la enfermedad y respuesta a terapia. El recuento de CTC se correlaciona con la carga tumoral global y puede frecuentemente servir de indicadores mas fiables de enfermedad metastasica que los marcadores de enfermedad moleculares. Por ejemplo, el nivel de antigeno espedfico de la prostata (PSA) puede frecuentemente subir debido a hiperplasia prostatica benigna (comun en personas de mas de 60) y, por lo tanto, puede no necesariamente indicar cancer.

La presencia de un numero significativo de CTC puede ser un indicador fiable de la presencia de cancer. Por tanto, la posible reaparicion despues de la cirugfa puede detectarse mucho antes por CTC que por la mayona de los marcadores moleculares. Otra ventaja es que las CTC pueden ser ademas interrogadas despues de la deteccion; la secuenciacion del genoma y transcriptoma podnan revelar las mutaciones que habfan conducido al cancer, ademas de los niveles de expresion de los genes en cuestion. Las celulas tambien pueden cultivarse, hacerse crecer y probarse con diferentes combinaciones de agentes quimioterapeuticos para el descubrimiento de farmaco y la medicina personalizada.

La deteccion de CTC, sin embargo, es una tarea exigente debido a su escasez en muestras de sangre, tan solo una celula individual en muestras de sangre de multiples mililitros (ml). El actual enfoque favorecido para detectar celulas completas en entornos clmicos y de laboratorio es la citometna de flujo, en la que las celulas marcadas se detectan a medida que circulan en una unica fila a traves de un detector optico. Esta tecnologfa se usa ampliamente del analisis de vacunas para la monitorizacion de SIDA. Sin embargo, el alto coste y el gran tamano de los citometros de flujo normalmente limitan este enfoque de prueba a instalaciones centrales compartidas por muchos usuarios. Ademas, como las celulas tienen que pasar a traves de una porcion detectora de los citometros de flujo en un modo de fila unica, el rendimiento de la muestra volumetrica es relativamente bajo y los citometros necesitan ser operados largos tiempos para analizar grandes muestras. Para las llamadas celulas "raras" - es decir, celulas que son escasas en una muestra de fluido, tales como celulas CTC - pueden requerirse muestras de volumen relativamente grandes para encontrar las celulas. En este caso, los citometros de flujo actuales pueden ser prohibitivamente caros para el frecuente uso de diagnostico.

Se han desarrollado detectores de celda microflmdica para vencer las limitaciones de coste y de tamano de los citometros de flujo tradicionales en ciertas aplicaciones. Estos sofisticados sistemas pueden interrogar satisfactoriamente pequenas muestras, del orden de pl (microlitros), pero se ha encontrado que tales sistemas tienen capacidad limitada para analizar grandes muestras, del orden de multiples ml. La mayona de los sistemas microflmdicos ofrecen buen rendimiento en el analisis de volumenes de muestra pequenos del tamano de microlitros o nanolitros. Sin embargo, debido a sus dimensiones de micrometros, los detectores microflmdicos "laboratorio en un chip" necesitan muchas horas para procesar grandes volumenes de muestra del tamano de mililitros. Caudales lentos en ensayos microflmdicos son normalmente a consecuencia de las dimensiones a escala micrometrica de los canales detectores. Estas dimensiones son necesarias para aumentar la probabilidad de que una celula rara (es decir, una CTC) se una sobre las paredes de los microcanales y en algunos casos para aumentar la relacion de senal con respecto a ruido del mecanismo de deteccion subyacente. Asf, los detectores de celda microflmdica previos pueden ser generalmente ineficientes y pueden requerir tiempos de analisis prohibitivamente largos para analizar las muestras de gran volumen necesarias para la deteccion de dianas raras como CTC.

En un sistema de deteccion microflmdico desarrollado por los grupos de Toner y Haber del Hospital General de Massachusetts, se puebla un laboratorio sobre un chip con posiciones de 100 pm de diametro funcionalizadas con anticuerpo separadas 50 pm para crear trayectorias de flujo de fluidos. En otro diseno de chip, los puestos se sustituyeron con una estructura en espiguilla para ayudar activamente en la mezcla de las celulas y aumentar su probabilidad para unirse a las paredes funcionalizadas. En estos estudios, los caudales usados con muestras clmicas fueron del orden de 1 ml por hora, tasa a la que el procesamiento de una muestra de sangre tfpica de 7,5 ml podna durar muchas horas. Con el fin de reducir los tiempos de transporte flmdico a un nivel manejable de minutos en vez de horas, el caudal a traves de estos sistemas previos tendna que aumentarse uno o dos ordenes de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

magnitud. En general, las modificaciones necesarias a los sistemas microflmdicos previos pueden ser problematicas debido a que: 1) la resistencia flmdica de los canales de flujo de tamano de micrometros y las macro a micro- conexiones asociadas senan muy altas; 2) un alto caudal a traves de una pequena area de seccion transversal producina una alta "velocidad lineal" que creana tensiones de cizallamiento mas alla de los niveles que podnan ser sostenidos por la union anticuerpo/celula sobre la pared del dispositivo y conducir al desprendimiento de las celulas; y 3) una velocidad lineal demasiado alta afectana perjudicialmente la eficiencia de captura de las celulas diana en el primer sitio. El aumentar el tamano de los canales permitina caudales mas altos, pero esto reducina significativamente la probabilidad de la interaccion de las celulas diana con las paredes funcionalizadas.

En el caso de otros dispositivos microflmdicos que usan tecnicas de deteccion electronica, dimensiones mas grandes reducinan la sensibilidad de deteccion del dispositivo, ya que la mayona de los microdispositivos necesitan alguna forma de enfocar las dianas sobre una pequena area sensora para la deteccion. Otros investigadores han puesto paralelos sus detectores microflmdicos (muchos micro-canales unos al lado de los otros) para vencer el problema de rendimiento. Sin embargo, los caudales que se usan pueden ser del orden de solo 10 microlitros (jl) por minuto, que puede conducir a horas de tiempo para procesar las muestras de gran volumen necesarias para la deteccion de CTC.

Un sistema de deteccion de celulas raras de alto rendimiento todavfa relativamente simple y robusto sena altamente beneficioso en muchos ambitos de investigacion y clmicos. Por tanto, se necesita un aparato sensor que pueda detectar celulas raras, tales como CTC, en sangre completa en un modo de alto rendimiento por el que se procesan fluidos de muestra a tasas de mililitros por minuto (a diferencia de microlitros por minuto) para capturar las celulas contenidas. Un sistema tal tambien sena altamente util en detectar diversos otros tipos de celulas, bacterias y esporas presentes en fluidos de muestra o en el entorno.

El documento US 2005 / 0 148 064 A2 desvela un dispositivo microflmdico para fraccionar y/o atrapar moleculas seleccionadas con una membrana porosa, donde marcas magneticas son mayores que el tamano de poro de la membrana porosa.

SUMARIO

Segun un aspecto de las presentes ensenanzas, se desvela un sistema de deteccion microflmdica para la deteccion de entidades diana de tamano de micrometros en un fluido que contiene una cantidad de perlas magneticas y una cantidad de entidades diana unidas a una o mas perlas magneticas, en el que cada entidad diana unida a una perla magnetica tiene una dimension eficaz mas pequena superior a una dimension eficaz mas grande de cada perla magnetica, incluyendo el sistema un componente de detector con micro-aberturas que esta configurado para detectar entidades diana unidas por elementos de reconocimiento, tales como perlas magneticas, en un analisis de alto rendimiento para caudales de mililitros por minuto. En particular, se proporciona un sistema de deteccion microflmdica para la deteccion de entidades diana en un fluido que contiene una cantidad de perlas magneticas y una cantidad de entidades diana unidas a una o mas perlas magneticas, en el que cada entidad diana unida a una perla magnetica tiene una dimension eficaz mas pequena superior a una dimension eficaz mas pequena de cada perla magnetica. En un aspecto, el sistema comprende un componente de detector que incluye un cuerpo que define un deposito y un chip sensor en forma de una placa con aberturas dispuesta dentro del deposito y que separa el deposito en una primera camara y una segunda camara. La placa incluye una pluralidad de micro-orificios, teniendo cada orificio la dimension eficaz mas pequena superior a la dimension eficaz mas pequena de cada perla magnetica e inferior a la dimension eficaz mas pequena de cada entidad diana unida a una perla magnetica. En un aspecto, la primera camara del deposito tiene una primera entrada y una primera salida, en la que la primera entrada esta conectada de forma fluida con una fuente de fluido que contiene las entidades diana, mientras que la primera salida esta conectada de forma fluida con un recipiente de recogida.

El componente de detector incluye ademas un iman dispuesto con respecto al deposito de manera que la segunda camara del deposito y la placa con aberturas esten situadas entre el iman y la primera camara del deposito. El iman configurado para generar una fuerza magnetica suficiente para atraer perlas magneticas en la primera camara del deposito a la segunda camara del deposito. El sistema de deteccion microflmdica comprende ademas una bomba para hacer circular continuamente el fluido de la fuente de fluido que contiene las entidades diana a traves de la primera camara del deposito.

Se proporciona un metodo de deteccion de entidades diana de tamano de micrometros en un fluido que contiene una cantidad de perlas magneticas y una cantidad de entidades diana unidas a una o mas perlas magneticas, en el que cada entidad diana unida a una perla magnetica tiene una dimension eficaz mas pequena superior a la dimension eficaz mas grande de cada perla magnetica. En un aspecto, el metodo comprende: hacer circular continuamente el fluido a traves de una primera camara de un deposito separada de una segunda camara del deposito por una placa con aberturas, teniendo cada orificio en la placa una dimension eficaz mas pequena superior a la dimension eficaz mas pequena de cada perla magnetica e inferior a la dimension eficaz mas pequena de cada entidad diana unida a una perla magnetica; y aplicar una fuerza magnetica debajo de la placa con aberturas suficiente para extraer perlas magneticas no unidas a una entidad diana a traves de las aberturas en la segunda camara y suficiente para mantener las entidades diana unidas a una o mas perlas magneticas contra la superficie de la placa con aberturas dentro de la primera camara del deposito.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1A es una vista esquematica de un sistema de deteccion microflmdica segun la presente divulgacion.

La FIG. 1B es una vista esquematica de una porcion del sistema mostrado en la FIG. 1B modificado segun una realizacion alternativa.

La FIG. 2 es una vista en seccion transversal lateral de un componente de detector segun la presente divulgacion para su uso en el sistema de deteccion mostrado en la FIG. 1.

La FIG. 3 es una vista en planta de una placa micro-perforada de chip sensor para su uso en el sistema mostrado en la FIG. 1A.

La FIG. 4 es una representacion lateral de la operacion del chip sensor mostrado en la FIG. 44 para capturar celulas diana y extraer elementos de reconocimiento magneticos no unidos.

Las FIGS. 5A-D son vistas esquematicas del sistema de deteccion microflmdico de la FIG. 1A, que muestran trayectorias de flujo de fluidos en diferentes etapas de la operacion del sistema.

La FIG. 6 es una imagen microscopica de campo brillante de celulas diana capturadas sobre un chip sensor segun una realizacion desvelada.

DESCRIPCION DETALLADA

Para los fines de promover un entendimiento de los principios de la invencion, ahora se hara referencia a las realizaciones ilustradas en los dibujos y descritas en la siguiente memoria descriptiva escrita. Se entiende que mediante la presente no se pretende ninguna limitacion al alcance de la invencion. Se entiende ademas que la presente invencion incluye cualquier alteracion y modificacion a las realizaciones ilustradas e incluye ademas aplicaciones de los principios de la invencion como normalmente se producinan para un experto habitual en la materia a la que se refiere la presente invencion.

La presente divulgacion proporciona un sistema microflmdico con un componente de detector que tiene una placa con aberturas o chip configurado para proporcionar analisis de alto rendimiento de ml (mililitros) por minuto de una muestra de fluido que circula a traves de canales de flujo relativamente grandes (milfmetros (mm) a diferencia de micrometros (pm)). La muestra de fluido puede ser un fluido corporal que incluye, pero no se limita a, sangre completa, sangre procesada, suero, plasma, saliva y orina, o fluidos medioambientales, que incluyen, pero no se limitan a, muestras de lfquido de nos, lmeas de aguas residuales, instalaciones de procesamiento de agua y fabricas. Usando perlas funcionalizadas capaces de unirse a celulas diana en tres dimensiones, el sistema elimina la necesidad de union basada en afinidad qmmica de las celulas a una superficie de chip bidimensional estacionaria. El sistema usa tanto flujo de fluidos convectivo para ayudar en el transporte de masas de celulas diana unidas por perlas magneticas funcionalizadas, como tamizado magnetico de las celulas unidas sobre una placa o chip con micro-aberturas que captura las celulas pero permite que perlas magneticas libres (es decir, aquellas no unidas a celulas diana) pasen a traves de las aberturas. En ciertas realizaciones, las perlas magneticas sirven simultaneamente para: 1) union basada en afinidad de celulas diana espedficas; 2) transporte magnetico de las celulas unidas a la superficie de placa o chip; y 3) generacion de senales de reconocimiento o de marca para la deteccion. El novedoso sistema flmdico de la presente divulgacion puede analizar grandes cantidades de fluidos de muestra, que incluyen cantidades clmicamente significativas de fluidos corporales tales como sangre completa, en una cantidad de tiempo relativamente corta.

La FIG. 1A representa un esquema de un sistema microflmdico 10 segun una realizacion de la presente divulgacion. El sistema l0 incluye un componente de detector 12 que tiene un primer segmento de flujo 13 y un segundo segmento de flujo paralelo 14. El primer segmento de flujo 13 esta provisto de una entrada 13a y una salida 13b, en el que la entrada esta conectada por un conducto de entrada 35 a una fuente de fluido de muestra S. La salida 13b esta conectada por el conducto de salida 36 a un recipiente de recogida CC, que es adecuado para recoger y guardar celulas diana aisladas por el sistema de deteccion microflmdica 10. La segunda entrada 14a esta conectada por un conducto de entrada 38 a una fuente de una disolucion tamponada o fisiologicamente inerte o no reactiva B. La segunda salida 14b esta conectada por un conducto de salida 39 a un recipiente de recogida BC para recoger la disolucion tamponada que sale del componente de detector 12.

En una realizacion, se proporciona una bomba 40 para hacer circular fluido de la fuente de muestra S a traves del primer segmento de flujo 13 del componente de detector 12. En la realizacion mostrada en la FIG. 1, la bomba 40 esta integrada en el conducto de salida 36 para extraer fluido a traves del componente de detector. Sin embargo, se contempla que la bomba 40 puede estar situada dentro del conducto de entrada 35, segun se desee. La realizacion de la FIG. 1A incluye ademas una segunda bomba 41 que esta integrada en el conducto de salida 14b para hacer circular el fluido de tampon de la fuente B a traves del segundo segmento de flujo 14 del componente de detector 12. La bomba 41 puede proporcionarse en el conducto de entrada 38 para extraer fluido de tampon de la fuente B y bombearlo a traves del segundo segmento de flujo 14. Alternativamente, la misma bomba, tal como la bomba 40, puede usarse para bombear tanto el fluido de muestra de la fuente S a traves del primer segmento de flujo 13 como

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

el fluido de la fuente B a traves del segundo segmento de flujo 14, como se representa en el segmento a escala ampliada mostrado en la FIG. 1B. En esta realizacion, los dos conductos de salida 36, 39 estan conectados a la bomba 40 mediante una valvula bidireccional V6 que es controlable para conectar selectivamente una u otra salida para el flujo a traves de la bomba, segun un protocolo de flujo de fluidos tratado en el presente documento.

Volviendo a la FIG. 1A, el sistema microflmdico 10 incorpora lmeas de derivacion que son selectivamente activadas segun un protocolo de flujo de fluidos descrito mas adelante. Se proporciona una lmea de derivacion 42 entre la fuente de tampon B y el conducto de entrada 35 al primer segmento de flujo 13 del componente de detector. Una valvula V1 es operable para controlar el flujo de disolucion de tampon de la fuente B en ambos conductos de entrada 35, 38, mientras que una valvula V2 es operable para controlar el flujo de disolucion de tampon en el primer conducto de entrada 35.

En una segunda trayectoria de derivacion, una lmea de derivacion 43 esta conectada entre el primer conducto de salida 36 y el primer conducto de entrada 35. Esta lmea de derivacion devuelve asf el fluido que sale del primer segmento de flujo 13 del componente de detector de nuevo a la entrada 13a para el primer segmento de flujo. Una valvula V3 controla el flujo de fluidos mediante la segunda lmea de derivacion 43. Una tercera trayectoria de derivacion incluye la lmea de derivacion 44 del segundo conducto de salida 39 a la fuente S que contiene el fluido de muestra. Una valvula V4 esta configurada para dirigir el flujo de fluido de tampon que sale del segundo segmento de flujo 14 tanto al recipiente de recogida de tampon BC como a la tercera lmea de derivacion 44. El sistema 10 esta provisto de un modulo de control 45 que es operable para controlar la(s) bomba(s) 40 (y 41 si esta presente), ademas de las valvulas para controlar el flujo de fluidos mediante cada segmento de flujo 13, 14 del componente de detector 12, segun un protocolo de flujo descrito en el presente documento.

El sistema microflmdico 10 puede configurarse para aceptar fluidos de muestra de multiples fuentes Si. Las multiples fuentes Si pueden conectarse en serie o en paralelo, con valvulas apropiadas para conectar la fuente particular al conducto de entrada 35 al primer segmento de flujo 13 del componente de detector. El sistema puede modificarse adicionalmente para incluir componentes de detector 12i adicionales conectados al conducto de salida 36 del primer segmento de flujo 13, a modo de una valvula de control V5.

El flujo de fluido de muestra y la disolucion de tampon a traves del sistema 10, y particularmente a traves del componente de detector 12, ha sido asf descrito hasta ahora. Detalles del componente de detector 12 y su funcion se ilustran en las FIGS. 2-4. Volviendo primero a la vista en seccion transversal en la FIG. 2, el componente de detector 12 incluye un cuerpo 15 que puede estar en forma de dos mitades 15a, 15b que se combinan para formar el componente completo. El cuerpo 15 define un deposito 16 que se separa en una primera camara 16a y una segunda camara 16b por un chip sensor en forma de una placa con micro-aberturas 18. La primera camara 16a esta en comunicacion con la primera entrada de flujo 13a y la primera salida de flujo 13b y asf forma el primer segmento de flujo 13 del componente de detector. Un primer canal de entrada 22 comunica entre la primera camara 16a y la entrada 13a, mientras que un primer canal de salida 23 comunica con la salida 13b. En la realizacion ilustrada, los dos canales estan inclinados hacia el deposito 16, o definen un angulo no plano con respecto al deposito, de manera que las celulas diana y el fluido de muestra no se acumulen dentro del canal 22 o conducto de entrada 35.

La segunda camara 16b esta en comunicacion con la segunda entrada y salida 14a, 14b respectivas para formar el segundo segmento de flujo 14 del componente de detector. Un canal de entrada 25 comunica entre la segunda camara y la segunda entrada 14a, que un canal de salida 26 comunica con la segunda salida 14b. Los dos canales 25, 26 pueden estar inclinados, pero no necesitan estarlo ya que la segunda camara 16b esta conectada a la fuente de disolucion de tampon B y ninguna celula diana circula a traves de esta segunda trayectoria de flujo de fluidos 14.

El deposito 16 puede estar abierto en un lado del componente de detector 12, con el orificio de deposito sellado y cerrado por una ventana o panel de visualizacion 20. El panel de visualizacion 20 esta orientado para proporcionar una vista libre de la placa con aberturas 18 dentro del deposito 16. En una realizacion, el panel de visualizacion 20 es opticamente transparente para permitir la visualizacion directa de la superficie de la placa con aberturas.

El chip sensor o placa con aberturas 18 puede esta soportado por una montura de placa 28, formada alrededor del penmetro de la placa, que esta atrapado entre las dos mitades de cuerpo 15a, 15b cuando se acoplan juntas. Puede proporcionarse una junta 29 en uno o ambos lados de la montura de placa 28 para garantizar una junta estanca al fluido entre las dos camaras 16a, 16b. Detalles de la placa con aberturas se muestran en las FIGS. 3-4. En particular, la placa 18 incluye una superficie superior 51 y una pluralidad de aberturas microdimensionadas u orificios 50 definidos a su traves. En una realizacion, los orificios estan generalmente uniformemente dimensionados y tienen una dimension eficaz mas grande d que es inferior a la dimension eficaz mas pequena de una celula diana T (FIG. 4) que es la que va a detectarse. Ademas, la dimension eficaz mas pequena d de los orificios de placa es mayor que una dimension eficaz mas grande de elementos de reconocimiento magnetico M. Para los fines de la presente divulgacion, el termino "dimension eficaz" se refiere a una dimension de un elemento particular medida a lo largo de un eje particular. Para un orificio circular en la placa o una perla magnetica esferica, la dimension eficaz mas pequena y la mas grande son las mismas y son simplemente el diametro del orificio o perla. Para un orificio oblongo, la dimension eficaz mas grande es la longitud del orificio a lo largo de su eje largo, mientras que la dimension eficaz mas pequena es la anchura a lo largo del eje corto. Las celulas diana pueden no presentar una forma tridimensional uniforme (tal como una esfera), de manera que la celula tendra una dimension diferente que depende del eje de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

medicion. Para celulas de este tipo, el termino "dimension eficaz mas pequena" se refiere a la mas pequena de aquellas mediciones. As^ la dimension relativa eficaz de los orificios de placa es tal que una perla magnetica puede siempre pasar a traves de cualquier orificio sin importar como la perla este orientada, mientras que una celula diana nunca puede pasar a traves de cualquier orificio independientemente de como este orientada.

El sistema microflmdico 10 esta configurado para detectar y aislar celulas diana T que estan unidas a elementos de reconocimiento M. Asf, la fuente de fluido S contiene un fluido de muestra que contiene celulas diana, por ejemplo una muestra de sangre de un paciente que contiene celulas tumorales circulantes (CTC) o una muestra que tiene a modo de ejemplo lmeas de celulas tumorales tales como carcinoma de ganglio linfatico de las celulas de la prostata (LNCaP) o celulas de cancer de ovario (IGROV). La muestra de fluido contiene ademas elementos de reconocimiento en forma de perlas magneticas M que se unen a las celulas diana. Detalles de las celulas diana y elementos de reconocimiento seguiran, pero con respecto a los orificios 50 en la placa 18 puede apreciarse que el tamano de los orificios se calibra de manera que cualquier perla magnetica libre M (es decir, perlas que no se han unido a una celula diana T) pasara libremente a traves del orificio, tal como las perlas Mx en el lado derecho de la placa en la FIG. 4. Por otra parte, los orificios 50 estan dimensionados de manera que las celulas diana T no puedan pasar a traves, con o sin ninguna perla magnetica unida a ellas, tal como perlas Mb.

La significancia de las perlas magneticas M puede apreciarse refiriendose de nuevo a la FIG. 2. En particular, el cuerpo 15 del componente de detector 12 incluye un iman 32 montado dentro de una cavidad 31 debajo de la segunda camara 16b. En particular, el iman 32 esta posicionado de manera que la fuerza magnetica atraiga perlas magneticas M dentro de la primera camara 16a hacia la placa con aberturas 18. Es esta fuerza magnetica la que atrae a las perlas magneticas libres Mx a traves de los orificios 50, como se ilustra en la FIG. 4, incluso mientras que las perlas estan bajo la influencia de un flujo de fluidos F que es sustancialmente paralelo a la superficie 51 de la placa 18. Esta misma fuerza magnetica tambien atrae a las perlas Mb que estan unidas a una celula diana T, que tambien estan bajo la influencia del flujo de fluidos paralelo F. Sin embargo, como la celula diana T es demasiado grande para pasar a traves de cualquier orificio, la fuerza magnetica sirve para mantener la celula diana unida contra la superficie 51 de la placa con aberturas 18. En ciertos casos, la celula diana T es lo suficientemente grande con respecto a las perlas magneticas M como para tener varias perlas Mb unidas a la celula. Como se representa en la FIG. 4, algunas de las perlas unidas Mb se extienden parcialmente en un orificio 50. Las perlas Mb se mantienen dentro del orificio por la fuerza magnetica, que no solo mantiene la celula diana unida T a la superficie de placa 51, sino que tambien limita o "bloquea" la celula contra la traslacion a lo largo de la superficie o que se lave bajo la influencia del flujo de fluidos F. Asf, las perlas unidas Mb no solo capturan celulas diana, sino que tambien ayudan a prevenir que las celulas diana capturadas se amontonen o acumulen en el extremo de salida de la primera camara 16a.

El iman 32 esta calibrado con respecto a las perlas magneticas M para ejercer una fuerza magnetica suficiente para atraer a las perlas hacia la placa con aberturas, pero no tan fuerte que se separen las perlas unidas Mb de una celula diana T capturada sobre la superficie de placa 51. La fuerza magnetica tambien es suficientemente fuerte como para atraer las perlas y celulas diana fuera del flujo de fluidos F que tiende a impulsar las perlas y celulas en una trayectoria de flujo paralela a la superficie 51 de la placa de chip sensor 18. En un ejemplo espedfico, el iman es un iman NdFeB Cube (aproximadamente 5x5x5 mm) con una densidad de flujo medida y gradiente de 0,4 T y 100 T/m, respectivamente. Se conciben otros imanes que incluyen, pero no se limitan a, imanes permanentes mas grandes o mas pequenos hechos de diversos materiales, y electroimanes que estan comercialmente disponibles o se fabrican usando procedimientos estandar o de microfabricacion y que son capaces de generar campos magneticos variables con el tiempo. En la realizacion ilustrada de la FIG. 2, el iman 32 se aloja dentro de una cavidad 31 formada en la mitad inferior 15b de la carcasa. Sin embargo, el iman puede fijarse a o soportarse con respecto al exterior del componente de detector 12 a condicion de que se oriente de un modo que extraiga las perlas magneticas M de la primera camara 16a a la segunda camara 16b. Se contempla ademas que el iman 32 puede asociarse al cuerpo de detector 15 de manera que la distancia del iman desde la placa con aberturas 18 pueda variarse para asf variar la fuerza magnetica aplicada a las perlas magneticas en la primera camara 16a. La fuerza magnetica puede asf calibrarse a una perla magnetica particular. Ademas, el iman 32 puede moverse para eliminar la fuerza magnetica completamente segun un protocolo de flujo para el sistema microflmdico 10. La eliminacion del campo magnetico puede facilitar la eliminacion de celulas diana capturadas de la superficie de placa de manera que las celulas diana puedan sertransportadas o descargadas a un recipiente de recogida separado CC.

En otra realizacion, el campo magnetico puede aplicarse desde la parte superior del componente de detector 12 o directamente por encima de la superficie 51 de la placa de chip sensor 18. Este campo magnetico puede asf "levitar" las celulas diana capturadas lejos de la superficie 51 para facilitar su eliminacion. Se contempla en esta realizacion que el campo magnetico del iman 32 se rompe como se ha descrito anteriormente, de manera que el campo magnetico aplicado desde la parte superior del componente no "compita" con el campo magnetico de captura original.

Como se ha explicado anteriormente, la(s) bomba(s) 40 (41) y las valvulas V1-V5 estan controladas segun un protocolo de flujo adaptado a: a) preparar el componente de detector 12 para recibir un fluido que contiene celulas diana unidas; b) capturar las celulas diana unidas; c) descargar perlas magneticas no unidas; y d) extraer celulas diana capturadas. En una primera etapa del protocolo, el sistema se sensibiliza con una disolucion no reactiva o tamponada de la fuente B. La disolucion de la fuente B es preferentemente no reactiva para las celulas diana T, para

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

los elementos de reconocimiento o perlas magneticas B, y para cualquier ligando, anticuerpo, aptamero, peptido, ligando de bajo peso molecular o antigeno usado para funcionalizar y unir los elementos de reconocimiento. En una realizacion espedfica, la disolucion puede ser una solucion salina tamponada con fosfato (PBS). Con referencia a las FIGS. 1A y 5A, el deposito 16 se inunda inicialmente con PBS abriendo la valvula V1, moviendo la valvula V4 para cerrar la lmea de derivacion 44 pero abriendo la trayectoria de flujo al recipiente de recogida BC, y moviendo la valvula V2 para cerrar el conducto de entrada 35 a la fuente de muestra S y abrir el conducto a la lmea de derivacion 42. Las valvulas V3 y V5 se cerraron de manera que todo el fluido que salfa al componente de detector 12 se alimentara al recipiente de recogida de tampon BC. La disolucion tamponada PBS circula libremente a traves de ambas camaras 16a, 16b y a traves de la placa con aberturas 18 de manera que todos los flujos circulen a traves del segundo canal de salida 26 y la segunda salida 14b en el conducto de salida 39 y el recipiente de recogida BC. En ciertas realizaciones puede desearse abrir la valvula V5 para bombear PBS de la camara 16a en el recipiente de recogida CC con el fin de evitar cualquier aumento de presion dentro de la camara. La bomba 41 se activa asf para controlar el flujo de PBS mediante ambos segmentos de flujo 13, 14. En la configuracion alternativa de la FIG. 1B, la bomba 40 proporciona la fuerza motriz para el flujo de fluidos con la valvula V6 abierta a ambas salidas 13b, 14b, pero con la descarga de bomba a solo el segundo conducto de salida 39. Puede apreciarse que este flujo inicial de PBS a traves del sistema purgara el aire del deposito y canales.

Con el componente de detector sensibilizado, el circuito de fluido de disolucion tamponada se desactiva cerrando las valvulas V1 y V4, cerrando la lmea de derivacion 42 en la valvula V2 y desactivando la bomba 41. La primera camara 16a esta ahora lista para recibir el fluido de muestra de la fuente S abriendo la valvula V2 al conducto de entrada 35 y la valvula V5 al recipiente de recogida CC, como se ilustra en la FIG. 5B. La bomba 40 se activa para extraer el fluido de muestra de la fuente S a traves del componente de detector 12, y mas particularmente para extraer el fluido de muestra a traves de la primera entrada 13a en la primera camara 16a. El iman 32 se activa para atraer las perlas magneticas M a la placa con aberturas 18, como se representa en la FIG. 4. Puede apreciarse que la velocidad de flujo F del fluido de muestra se calibra de manera que la presion del fluido no venza la fuerza magnetica. A modo de ejemplo no limitante, la bomba 40 puede configurarse para producir un caudal de varios ml/min, que es significativamente mas rapido que las velocidades de ml/hora de sistemas microflmdicos previos. En una realizacion espedfica, los canales de entrada y salida 22, 23 pueden tener una dimension eficaz mas pequena de 0,5 mm de manera que un caudal de 1 ml/min pueda generar una velocidad de flujo lineal de aproximadamente 3 mm/s en los canales y aproximadamente 0,7 mm/s a traves del deposito 16. Estas velocidades lineales son casi 100 veces mas bajas que las velocidades que se cree que producen dano a las celulas diana T. Sin embargo, a este caudal, una muestra de fluido tfpica de 7,5 ml puede pasar a traves del componente de detector 12 en 7,5 minutos o menos. Similarmente, un caudal de 3 ml/min indicana un paso de una muestra de 7,5 ml en aproximadamente 2,5 minutos.

Las celulas diana y perlas magneticas estan bajo la influencia de flujo de fluidos que intenta lavarlas lejos de la superficie de chip sensor, ademas de una fuerza magnetica que intenta extraerlas a la superficie del chip. La fuerza magnetica producida por el iman 32 puede asf calibrarse para contrarrestar la influencia del flujo de fluidos F. En otras palabras, puede llevarse a cabo un mayor caudal aumentando la fuerza magnetica, ya que se requiere una mayor fuerza para desalojar las celulas y perlas del flujo de fluidos. Un factor limitante a la intensidad del campo magnetico generada por el iman 32 es que la fuerza magnetica no puede ser lo suficientemente grande como para disociar las perlas magneticas B de las celulas diana unidas T o suficientemente grande como para danar la celula diana a medida que las perlas son atrafdas por la fuerza magnetica.

A medida que la muestra de fluido circula a traves de la primera camara 16a, el iman atrae los elementos de reconocimiento M a la placa 18 y el segundo deposito inferior 16b. Como se ha explicado anteriormente, la mayona de las perlas no unidas Mb pasaran a traves de las orificios 51 y al deposito inferior 16b donde se mantienen en su sitio por la fuerza magnetica. Asimismo, las celulas diana unidas T seran capturadas contra la superficie 51 de la placa con aberturas 18 mientras que la fuerza magnetica este presente. El fluido de muestra restante, menos las celulas diana capturadas, puede suministrarse al recipiente de recogida CC. Alternativamente, puede cerrarse la valvula V5 y abrirse la valvula V3 para permitir que el fluido de muestra se descargue de la salida 13b para ser devuelto a la entrada 13a mediante la lmea de derivacion 43, como se refleja en el diagrama de FIG. 5C. El uso de la derivacion puede representar cualquier celula diana unida o cualquier perla magnetica no unida que escape a la captura dentro del deposito 16. El fluido de muestra puede ser continuamente recirculado durante un periodo de tiempo considerado suficiente para capturar todas las celulas diana unidas.

Puede apreciarse que al final de esta segunda etapa del protocolo de flujo todas o al menos la mayona de las celulas diana unidas T en el fluido de muestra han sido capturadas contra la superficie 51 de la placa con aberturas 18 dentro de la primera camara superior 16a. Asimismo, todas o al menos la mayona de las perlas magneticas no unidas Rb han sido extrafdas a traves de los orificios y se recogen en la segunda camara inferior 16b. Las celulas diana capturadas estan asf disponibles para visualizacion a traves del panel de visualizacion 20 con el fin de contar el numero de celulas diana, por ejemplo. Se contempla que en un procedimiento tfpico las celulas diana seran raras o a una concentracion extremadamente baja dentro de una muestra (por ejemplo, CTC en una muestra de sangre). Asf, el numero de celulas capturadas puede ser muy bajo, pero facilmente discernible sobre la placa con aberturas. En un enfoque, las celulas capturadas pueden visualizarse por microscopfa de campo brillante. Ademas, las celulas capturadas pueden marcarse ademas con indicadores fluorescentes y visualizarse usando microscopfa fluorescente. Alternativamente o ademas, las perlas magneticas pueden funcionalizarse con un indicador visual, tal como con

7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

marca fluorescente. Las perlas magneticas pueden visualizarse usando microscopfa de fluorescencia. Como las celulas diana normalmente estan unidas a varias perlas magneticas, la imagen fluorescente de las perlas revelara la presencia de las celulas diana unidas. Un ejemplo de celulas diana capturadas se muestra en la imagen de microscopfa de campo brillante en la FIG. 6. En esta imagen, las celulas capturadas son claramente visibles. Las celulas son MCF-7 (celulas de cancer de mama) que estan unidas a perlas magneticas funcionalizadas con anticuerpos anti-EpCAM de una manera conocida. Puede observarse que mientras que la gran mayona de los varios millones de perlas magneticas no unidas en la muestra pasaron a traves de orificios de placa, algunas perlas magneticas no unidas tambien estan presentes sobre la superficie de placa. Sin embargo, es evidente que la presencia de estas algunas perlas no interfiere con una vista clara de las celulas diana capturadas. En el ejemplo espedfico mostrado en la FIG. 6 los orificios tienen un diametro (o dimension eficaz mas pequena) de 5 pm y las perlas magneticas tienen un diametro de 300 nm.

Con el fin de mejorar la visualizacion de las celulas recogidas, el deposito puede lavarse para eliminar el fluido de muestra y otras celulas que podnan interferir visualmente. En este caso, el campo magnetico se mantiene mientras que la disolucion tamponada de la fuente B se hace circular a traves de las porciones superior e inferior del deposito. El ciclo de lavado puede realizarse del mismo modo que el ciclo de preparacion inicial descrito anteriormente, concretamente abriendo las dos camaras 16a, 16b a la disolucion de PBS, cerrando la valvula V5 y abriendo la valvula V4 al recipiente de recogida de tampon BC. Como el iman sigue en posicion durante este ciclo de lavado, las celulas diana quedaran capturadas sobre la placa con aberturas dentro de la camara superior 16a y las perlas magneticas no unidas quedaran recogidas dentro de la camara inferior 16b.

El sistema microflmdico 10 desvelado en el presente documento tambien es capaz de recoger las celulas diana capturadas T, ademas de recuperar las perlas magneticas M. En un enfoque, la disolucion tamponada (PBS) se hace circular solo a traves de la primera camara superior 16a con el campo magnetico quitado. Asf, como se muestra en el diagrama de la FIG. 5d, la valvula V1 esta controlada para cerrar el flujo a la entrada 14a pero abrir al conducto 35 y la valvula V1. La valvula V1 esta controlada para prevenir el flujo de la fuente S pero aceptar el flujo de PBS de la fuente B. Las valvulas V3 y V4 se cerraron, pero la valvula V5 esta abierta al recipiente de recogida CC. En ausencia del campo magnetico, las celulas diana unidas son facilmente desalojadas de la placa con aberturas. El flujo de PBS puede lavar las celulas diana mediante el conducto de salida 23 y en un recipiente de recogida CC. Como la segunda entrada 14a y salida 14b se cerraron no hay flujo de fluidos a traves de la segunda camara inferior 16b. Asf, las perlas recogidas M siguen reunidas en el fondo del deposito 16 incluso a medida que las celulas diana son lavadas. Alternativamente, el campo magnetico puede ajustarse para reducir la fuerza magnetica experimentada por las celulas diana unidas a un nivel suficiente para ser vencido por la presion de fluido del PBS que circula a traves de la camara superior 16a. Como las perlas no unidas reunidas en la camara inferior estan mas proximas al iman, la fuerza magnetica es suficiente para mantener las perlas en su sitio. Una vez las celulas diana han sido eliminadas y recogidas, el campo magnetico puede eliminarse y las valvulas V1 y V4 abrirse para hacer circular PBS a traves de la camara inferior para lavar las perlas no unidas en el recipiente de recogida BC. Alternativamente, la valvula V4 puede activarse para abrir la lmea de derivacion 44 para redirigir las perlas no unidas de nuevo a la fuente de muestra S. En este caso las perlas no unidas pueden incubarse para unirse con cualquier celula diana previamente no unida en la fuente original S o fuentes adicionales Si.

Como se describe previamente, el sistema microflmdico 10 puede incluir componentes de detector 12i adicionales que pueden ponerse en lmea mediante la valvula V5. En ciertos protocolos puede contemplarse que el fluido de muestra circulara continuamente del primer componente de detector 12 a cada componente de detector sucesivo 12i antes de circular al recipiente de recogida CC.

Se contempla que los conductos y valvulas esten formados de materiales qmmicamente inertes. En un ejemplo espedfico los conductos 35, 36, 38 y 39, y las lmeas de derivacion 42-44, pueden ser tubo tal como tubos de tipo Cole-Parmer de 1/16 de pulgada u otro tubo qmmicamente inerte. En ciertos procedimientos la fuente de celulas diana puede ser una muestra de sangre completa de 7,5 ml convencional en la que las celulas elegidas como diana han sido unidas a elementos de reconocimiento, tales como perlas magneticas. Para un protocolo de flujo tfpico, la fuente de tampon B puede ser un deposito de PBS de 10 ml o mas grande. En ciertos procedimientos, la muestra puede ser una muestra de sangre procesada en la que los globulos rojos ya han sido eliminados por medio de lisado o por medio de tubos comercialmente disponibles, tales como los tubos de preparacion de celulas BD Vacutainer. En otros procedimientos la muestra puede ser otros fluidos corporales tales como orina, o puede ser agua u otras muestras de fluido recogidas de fuentes medioambientales o industriales.

En una realizacion, las mitades superior e inferior 15a, 15b del cuerpo de componente de detector 15 estan mecanizadas de acnlico y aseguradas con tornillos de un modo que intercale la placa con aberturas 18 y el anillo de junta 29 para formar una junta estanca al fluido entre las camaras. Sin embargo, tambien se conciben otra fabricacion y material, que incluyen, pero no se limitan a, plastico moldeado formado en una operacion de moldeo de plastico.

En una realizacion, la placa con aberturas de chip sensor 18 tiene aproximadamente una oblea de silicona sobre aislante (SOI) de 15 mm por 15 mm que tiene un espesor de aproximadamente 0,5 mm. Los orificios 50 pueden limitarse a un area activa predeterminada del componente de detector de aproximadamente 10 mm por 10 mm. La matriz de orificios (tal como la disposicion en damero) puede definirse sobre la oblea usando litograffa y entonces los

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

agujeros se forman por decapado con iones reactivos de la parte delantera de la oblea. Pueden definirse chips sensores individuales por decapado con iones reactivos de la parte trasera de la oblea, seguido de decapado con HF del oxido aislante. Alternativamente, pueden definirse ranuras usando litograffa y decaparse en la parte delantera de una oblea de silicio por decapado con iones reactivos, seguido de recubriendo con una delgada capa de nitruro. El nitruro sobre la parte trasera de la oblea puede estamparse usando decapado por litograffa para definir chips individuales. Finalmente, la oblea de silicio puede decaparse en el patron de matriz de orificios usando decapado con iones reactivos o hidroxido potasico, y la capa de nitruro restante puede eliminarse por decapado. Como se trata anteriormente, los orificios tiene una dimension eficaz mas pequena que es suficientemente pequena para atrapar perlas magneticas unidas a celula diana, todavfa suficientemente grande para permitir que las perlas magneticas libres que no se unen a las celulas diana pasen a traves. En un ejemplo espedfico, las celulas diana son CTC, asf los orificios necesitan ser mas pequenas que las CTC elegidas como diana, pero mas grandes que las perlas. Por ejemplo, el tamano promedio de un carcinoma de ganglio linfatico de las celulas de la prostata (LNCaP) o celulas de cancer de ovario (iGROV) es aproximadamente 20 pm, mientras que el tamano de un cierto tipo de perla magnetica puede ser aproximadamente 1 pm. Por lo tanto, los orificios de 3 pm seran lo suficientemente grandes para que una perla libre pase facilmente, pero demasiado pequenos para permitir una CTC a su traves. En una realizacion espedfica, los orificios pueden proporcionarse a aproximadamente el 30 % de densidad de relleno, que puede producir aproximadamente 14 orificios debajo de una celula de 20 pm. Ademas, si cada celula esta unida por multiples perlas magneticas (como se representa en la FIG. 4), cada perla es atrafda por la fuerza magnetica de manera que la celula diana es cerrada en multiples localizaciones, haciendo incluso mas diffcil que una celula pase a traves de un unico orificio. Los orificios tambien estan configurados para atrapar las perlas magneticas unidas a celula para "bloquear" que las celulas diana se muevan horizontalmente, previniendo que sean lavadas de la superficie de la placa por el flujo de fluidos. En la realizacion ilustrada en las FlGS. 3-4, se muestra que los orificios 50 tienen un diametro circular o cilmdrico. Sin embargo, los orificios pueden tener otras formas, tales como una perforacion conica o un orificio oblongo en la direccion del flujo de fluidos F a condicion de que la dimension eficaz mas pequena del orificio cumpla los requisitos dimensionales expuestos anteriormente. En una realizacion alternativa, la placa 18 puede configurarse con micro-ranuras que tienen cada una una anchura igual a la dimension eficaz mas pequena d tratada anteriormente dimensionada de manera que las celulas diana no puedan entrar en las micro-ranuras pero puedan las perlas magneticas mucho mas pequenas.

La placa con aberturas 18 puede recubrirse o pasivarse con un material fisiologicamente inerte, tal como albumina de suero bovino (BSA) o polietilenglicol (PEG). Como el sistema segun la presente divulgacion no utiliza union qrnmica entre una celula diana funcionalizada y la placa, la superficie de la placa puede ser, y es preferentemente, no reactiva.

Segun la presente divulgacion, la union celula diana a perla magnetica es la unica etapa de union por afinidad que se pretende, ya que el componente de detector 12 no se basa en unir qmmicamente las celulas diana a una porcion del componente. Las perlas magneticas se funcionalizan de muchas formas convencionales, que incluyen con anticuerpos monoclonales o policlonales apropiados (que incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos contra EpCAM), aptameros o peptidos cortos que pueden unirse a celulas diana espedficas. En una estrategia de funcionalizacion alternativa, se usan ligandos de bajo peso molecular (por ejemplo, acido 2-[3-(1,3-dicarboxipropil)- ureido]pentanodioico o "DUPA" para celulas de cancer de prostata, y acido folico para celulas de cancer de ovario u otras celulas cancerosas que expresan en exceso el receptor de folato sobre sus superficies que incluyen canceres de pulmon, colon, renal y mama) para promover la union a ciertas celulas, lo mas particularmente CTC. Espedficamente, pueden producirse ligandos de bajo peso molecular (por ejemplo DUPA y folato) con un grupo funcional (amino, n-hidroxisuccinamida (NHS), o biotina dependiendo del grupo funcional sobre la perla magnetica que va a usarse) con una cadena de PEG entre el ligando de bajo peso molecular y el grupo funcional para suprimir la union no espedfica a las perlas.

Estan disponibles perlas funcionalizadas de una variedad de vendedores con grupos qmmicamente reactivos. Tambien estan disponibles perlas magneticas en un amplio intervalo de tamanos (de 100 nm a 5 pm, por ejemplo) que pueden seleccionarse basandose en las dimensiones de la celula diana a la que las perlas se unen. En una realizacion, perlas de 1 pm recubiertas de NHS pueden ser el punto de partida de Chemagen. Para estas perlas, la cadena de PEG se terminara con un grupo amino para el enlace covalente al grupo de NHS sobre la perla. Tambien pueden probarse perlas de otros vendedores con otros grupos funcionales, y pueden estar terminadas con la cadena de PEG y el grupo funcional por consiguiente. Las perlas tambien pueden funcionalizarse con moleculas fluorescentes usando la qrnmica apropiada para el grupo funcional. Para el ejemplo de un ligando de bajo peso molecular, pueden sintetizarse moleculas de DUPA-PEG-amina y folato-PEG-amina que pueden hacerse reaccionar con las perlas antes del marcado fluorescente. A partir de aqm, la cantidad deseada de colorante fluorescente reactivo (fluorescema, por ejemplo) puede hacerse reaccionar con las perlas, despues de lo cual los grupos NHS residuales (u otros restos activados sobre las perlas) pueden ser pasivados mediante reaccion con glucosamina (u otra molecula apropiada para neutralizar el resto activado sobre las perlas). Puede optimizarse la relacion de folato- PEG-amina o DUPA-PEG-amina con respecto a colorante fluorescente y molecula de pasivacion, segun se necesite. Similarmente, pueden inmovilizarse anticuerpos (tales como la molecula de adhesion a celulas epiteliales o "EpCAM") sobre perlas. Un ejemplo comercialmente disponible, en el que las perlas funcionalizadas magneticas son perlas magneticas funcionalizadas por la union a un anticuerpo monoclonal contra la molecula de adhesion a celulas epiteliales humanas (EpCAM), tales como Dynabeads® Epithelial Enrich, esta comercialmente disponible de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Invitrogen. Por ejemplo, pueden unirse covalentemente anticuerpos a perlas recubiertas de NHS, o pueden unirse a perlas recubiertas de estreptavidina mediante una biotina. Tambien pueden usarse diversos otros esquemas de funcionalizacion que incluyen, pero no se limitan a, grupos carboxilo, tioles y silanos. Alternativamente, las perlas pueden solo tener los elementos de reconocimiento para unir y atrapar las celulas sobre la superficie de placa, pero carecer de los indicadores fluorescentes que podnan introducirse por separado para unirse directamente a las celulas capturadas. En un procedimiento, anticuerpos fluorescentemente marcados (por ejemplo, citoqueratina), ligandos de bajo peso molecular, peptidos o aptameros, pueden exponerse por separado a las celulas capturadas.

El sistema microflmdico 10 y el componente de detector 12 desvelados en el presente documento son particularmente adecuados para la deteccion de celulas cancerosas unidas a perlas magneticas. Estan disponibles muchas tecnicas para la funcionalizacion y union de perlas magneticas a celulas diana tales como CTC. Procedimientos a modo de ejemplo se desvelan en las siguientes publicaciones publicadas: T. Mitrelias, et al., "Biological cell detection using ferromagnetic microbeads", Journal of Magnetism and Magnetic Materials, vol. 310, pp. 2862-2864, Marzo de 2007; N. Eide, et al., "Immunomagnetic detection of micrometastatic cells in bone marrow in uveal melanoma patients", Acta Ophthalmologica, vol. 87, pp. 830-836, Dec 2009; Yu et al., "Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization", The Journal of Cell Biology, Vol. 192, No. 3, pp. 373-382 (7 de febrero de 2011); Hayes & Smerage, "Circulating Tumor Cells", Progress in Molecular Biology and Translational Science, Vol. 95, 2010, pp. 95-112; Alexiou et al., "Medical Applications of Magnetic Nanoparticles", Journal of Nanoscience and Nanotechnology, Vol. 6, 2006, pp. 2762-2768; e Ito, et al., "Medical application of functionalized magnetic nanoparticles", Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol. 100, 2005, pp. 1-11, siendo la divulgacion de cada publicacion incorporada en el presente documento por referencia.

Publicaciones que desvelan procedimientos a modo de ejemplo para la smtesis y modificacion de folato y DUPA se identifican en el Apendice. Cualquiera de los procedimientos y metodos desvelados en estas publicaciones pueden ser adecuados para la union de perlas magneticas para seleccionar CTC que pueden ser posteriormente capturadas por el componente de detector 12 desvelado en el presente documento. La funcionalizacion de perlas magneticas con folato se describe completamente en referencias enumeradas en el Apendice, por tanto un experto habitual en la materia esta facultado para funcionalizar perlas magneticas similares con DUPA como se describe ademas en las referencias enumeradas. La propia molecula de DUPA tambien se describe completamente en las referencias enumeradas en el Apendice y en cualquier parte en esta memoria descriptiva.

La capacidad para atraer celulas cancerosas unidas a perlas a una superficie solida (es decir, sin ningun orificio) ha sido verificada en experimentos usando celulas MCF-7 (lmea de celulas de cancer de mama) unidas a perlas magneticas mediante anticuerpos contra EpCAM. Las celulas diana se hicieron circular con caudales volumetricos superiores a 2 ml/minuto y fueron satisfactoriamente magneticamente atrafdas a la superficie solida durante el flujo. Las celulas diana tienen una dimension eficaz mas pequena de aproximadamente 20 pm, de manera que en otro experimento las celulas diana se hicieron circular sobre una placa que tema orificios con un diametro eficaz de 5 pm. Se observaron celulas cancerosas intactas sobre la placa usando superficie dual (citoqueratina) y tincion nuclear (DAPI). En estos experimentos, 9 de las 10 celulas diana se detectaron en una muestra de 12 ml, para una recuperacion de celulas del 90 %.

La operacion del sistema de deteccion microflmdica 10 desvelado en el presente documento puede controlarse mediante un controlador maestro 45. El controlador puede ser un microprocesador configurado para seguir un protocolo de flujo controlado segun una celula diana particular, elemento de reconocimiento y tamano de muestra. El controlador maestro puede incorporar un lector para leer los indicios asociados a una muestra o muestras particulares, y automaticamente cargar y ejecutar un protocolo de flujo predeterminado asociado a la muestra particular.

El controlador 45 tambien puede configurarse para permitir la operacion controlada por el usuario. Por ejemplo, el caudal para una combinacion de celula diana-perla magnetica particular puede optimizarse aumentando el caudal de una muestra de celulas diana unidas hasta que ya no sea posible atraer perlas a la superficie 51 de la placa con aberturas 18. La operacion continua del sistema puede observarse directamente a traves de la ventana de visualizacion para determinar si se requiere una derivacion de flujo o si el proceso de deteccion esta completo.

En las realizaciones ilustradas, las perlas magneticas se describen pueden funcionalizarse con un marcador fluorescente. En estas realizaciones, la placa con aberturas 18 es generalmente opaca de manera que las senales de fluorescencia procedentes de las perlas no unidas Mb en la camara inferior 16b no se detectaran a traves del panel de visualizacion 20. Sin embargo, en casos, algunas perlas libres pueden quedar sobre la superficie 51 y producir senales de fluorescencia que pueden confundir la visualizacion. En estos casos, las perlas pueden funcionalizarse solo con ligandos y no con marcadores fluorescentes. Despues de que la muestra haya sido completamente procesada y las celulas diana capturadas sobre la placa con aberturas 18, pueden introducirse por separado ligandos marcados con fluorescencia en el deposito para unirse a las celulas diana directamente. Las celulas diana pueden entonces observarse facilmente a traves del panel de visualizacion 20. Con este enfoque modificado, en algunos casos la placa 18 puede carecer de cualquier micro-abertura ya que las celulas diana sobre la superficie de placa pueden ser facilmente diferenciadas de perlas magneticas no unidas por medio de fluorescencia.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

En el proceso de deteccion, la camara inferior 16b puede ser inundada con una cantidad mmima de tampon o sangre, despues de lo cual no hay flujo de fluidos a traves de la camara inferior hasta que la deteccion se complete. La difusion de fluido a traves de los orificios 50 entre las camaras superior e inferior 16a, 16b sera minima ya que este sistema de deteccion microflmdica 10 no esta basado en un flujo accionado por la presion.

Pueden detectarse CTC de muestras de sangre de pacientes de diversos canceres, que incluyen, pero no se limitan a, canceres de prostata, ovario, mama, colon, renal y pulmon, ya que muchas celulas cancerosas expresan ciertas moleculas o antigenos sobre sus superficies que pueden ser dirigidas con diversos elementos de reconocimiento, que incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos (por ejemplo, EpCAM), aptameros, ligandos de bajo peso molecular (por ejemplo, folato y DUPA) y peptidos. Las perlas pueden funcionalizarse como se ha descrito previamente (por ejemplo, DUPA para celulas de cancer de prostata, y folato y EpCAM para celulas de cancer de ovario, mama, colon, renal y pulmon) y entonces incubarse y mezclarse con el fluido de muestra durante 20-30 minutos. Este tiempo de incubacion puede ser mas largo o mas corto dependiendo del numero de perlas usadas, volumen de muestra y el numero de celulas diana buscado. Por ejemplo, sembrar la muestra con un numero mas grande de perlas aumenta la probabilidad de que una celula diana "encuentre" una perla magnetica y se una. Si hay multiples muestras, la incubacion de todas las muestras puede llevarse a cabo simultaneamente. El analisis del fluido de muestra por el presente sistema de deteccion, y la secuencia de flujos de fluido de muestra y de tampon, puede llevarse a cabo como se describe en el presente documento. Las almuotas de las celulas cancerosas capturadas pueden tenirse con elementos de reconocimiento adicionales, tales como anticuerpos para citoqueratinas y EpCAM, para asegurar que las celulas retenidas por el componente de detector sean de hecho celulas cancerosas. Ademas, puede determinarse una indicacion preliminar de si los numeros de CTC se correlacionan con la etapa de la enfermedad del donante de muestra. Aunque el sistema desvelado no se limita a un tipo particular de cancer, celulas de cancer de prostata y de ovario se mencionan especialmente en el presente documento como modelos para el sistema debido a que ambas enfermedades pueden tener smtomas difusos que producen pruebas biomoleculares confusas, y ambos pueden beneficiarse de una prueba de CTC fiable, rapida y sensible. Por ejemplo, el cancer de prostata puede tener smtomas similares a la hiperplasia prostatica benigna. Las pruebas de biomarcadores de PSA pueden ser confusas debido a tanto positivos falsos como negativos falsos. Similarmente, el cancer de ovario puede tener smtomas difusos y puede detectarse tan tarde como en la etapa III o IV.

En comparacion con varios estudios que usaron satisfactoriamente perlas magneticas para separar manualmente una amplia variedad de celulas (de patogenos a linfocitos T a CTC) de muestras complejas, el enfoque segun la presente divulgacion ofrece ventajosamente separacion y deteccion, analisis mas rapido y la capacidad de recoger las celulas capturadas y ponerlas disponibles para otros tipos de analisis, que incluyen, pero no se limitan a, analisis genetico. Ademas, en comparacion con sensores magnetorresistivos gigantes (GMR) o de valvula de espm que son conocidos para un experto habitual en la materia (hechos de multiples nanocapas con espesores controlados con presion) que pueden detectar perlas magneticas, el presente enfoque es ventajosamente mas robusto, facil de construir y usar, y ofrece rendimiento mucho mas alto. El sistema segun la presente divulgacion tambien ofrece una ventaja significativa con respecto a los ensayos de atrapamiento de celulas basado en el tamano que fuerzan a las celulas a traves de cavidades de tamano de micrometres por presion flrndica. Estos ensayos pueden sufrir obstruccion de las cavidades (ya que todas las entidades en la muestra son forzadas a pasar a traves de las cavidades), o atrapamiento de otras entidades similares en tamano a celulas diana, o paso completo y de aim perdida de celulas diana a traves de la cavidad.

La fuente S puede incluir celulas diana que ya se han unido a elementos de reconocimiento, ademas de perlas magneticas. Alternativamente, la fuente puede contener inicialmente un fluido de muestra, tal como un especimen de sangre completa, al que se anaden perlas magneticas y se dejan incubar. Como las celulas diana son raras o estan a baja concentracion, se desea sembrar el especimen con millones de perlas magneticas funcionalizadas. Por ejemplo, en un enfoque se proporcionan 100 millones de perlas por cada ml de especimen de sangre completa. Se ha encontrado que un tiempo de veinte minutos de incubacion es suficiente para unir CTC raras. El sistema 10 puede sensibilizarse como se ha descrito anteriormente durante el periodo de incubacion, ya que la fuente de muestra S no participa en el flujo de fluidos durante esta etapa. Una vez el periodo de incubacion se completa, puede implementarse el protocolo de flujo para detectar las celulas diana descrito anteriormente. Alternativamente, como se ha descrito anteriormente, la muestra proporcionada puede ser una sangre muestreada procesada por una combinacion de tubos de preparacion de celulas comerciales y centrifugacion con el fin de desechar los globulos rojos que normalmente no se buscan durante la deteccion de CTC. Alternativamente, la muestra puede ser una muestra de sangre procesada en la que los globulos rojos han sido lisados usando un tampon de lisis de globulos rojos.

Se contempla que el sistema 10 puede modificarse para la incorporacion en un sistema de dialisis o de tipo dialisis. En este caso, las perlas magneticas funcionalizadas pueden inyectarse en la corriente sangumea del paciente antes de la dialisis. En vez de circular en un recipiente de recogida CC, la circulacion sangumea a traves del componente de detector 12 o componentes de detector 12i se devuelve a la dialisis. Puede incorporarse un elemento de recogida magnetica en la salida del sistema para capturar todas las perlas magneticas no unidas y celulas unidas que no han sido recogidas dentro del (de los) componente(s) de detector.

Aquellos expertos en la materia reconoceran que pueden hacerse numerosas modificaciones a las implementaciones espedficas descritas anteriormente. Por tanto, la divulgacion anterior no debe limitarse a las

5

10

15

20

25

30

realizaciones espedficas ilustradas y descritas anteriormente. La descripcion como se presenta y como puede ser modificada engloba variaciones, alternativas, modificaciones, mejoras, equivalentes y equivalentes sustanciales de las realizaciones y ensenanzas desveladas en el presente documento, que incluyen aquellas que son actualmente inesperadas o no apreciadas, y que, por ejemplo, pueden surgir de los solicitantes/patentes y otros.

Por ejemplo, en las realizaciones a modo de ejemplo se describen celulas biologicas particulares, tales como CTC, ya que estan siendo capturadas por el componente de detector 12 del sistema de deteccion microflmdica 10. Otras entidades, que incluyen partfculas o cuerpos similares, en el intervalo de tamano de micrometros (pm) tambien pueden detectarse y capturarse por el sistema desvelado en el presente documento, siempre que las partfculas o cuerpos puedan unirse a uno o mas elementos de reconocimiento, tales como las perlas magneticas descritas en el presente documento.

Ademas, la placa con aberturas 18 se representa como que es generalmente paralela a la mitad inferior 15b de la base de componente de detector 15. Alternativamente, la placa puede estar inclinada hacia el canal de salida 23 de manera que las celulas diana capturadas tiendan a acumularse desde el extremo de salida y llenar hacia el extremo de entrada. Una placa inclinada tambien puede facilitar el pase de las perlas magneticas no unidas en la camara inferior 16b induciendo una traslacion a lo largo de la superficie 51 de la placa. Ademas, la placa 18 se muestra como generalmente plana, aunque se contemplan otras configuraciones que facilitan la captura de celulas diana y el pase de perlas no unidas.

El iman 32 se describe en el presente documento como un iman permanente con la aplicacion del campo magnetico controlado moviendo el iman. El campo magnetico puede manipularse por una proteccion ajustable dispuesta entre el iman y el deposito 16. La proteccion puede usarse para bloquear completamente el campo magnetico o para reducir el campo segun sea necesario. Alternativamente, el iman puede ser un electroiman que puede ser controlado por el controlador 45 para activar o desactivar el campo magnetico o ajustar la intensidad del campo. El controlador puede tambien modular el campo magnetico durante un ciclo de deteccion para facilitar la captura de las celulas diana y extraer las perlas magneticas no unidas en la camara inferior.

En otra alternativa, el iman 32 puede incluir multiples imanes dispuestos en un patron predeterminado para facilitar el recuento de celulas capturadas sobre la placa con aberturas 18. Asf, en una realizacion, varios imanes pueden disponerse en tiras paralelas de manera que las celulas capturadas aparezcan en varias lmeas.

En los protocolos de flujo de fluidos descritos anteriormente, las celulas diana se lavan del componente de detector 12 en una etapa. Alternativamente, las celulas pueden ser retenidas sobre la placa con aberturas y retirarse la propia placa del componente de detector. En esta alternativa, las magneticas pueden quedar en posicion a medida que se retira la mitad de cuerpo superior 15a para proporcionar acceso a la placa con aberturas. La mitad de cuerpo inferior 15b puede transportarse con la placa con aberturas y el iman intacto y encajarse con otra mitad de cuerpo para procedimientos adicionales.

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Un sistema de deteccion microflmdica (10) para la deteccion de entidades diana de tamano de micrometros en un fluido que contiene una cantidad de perlas magneticas y una cantidad de entidades diana unidas a una o mas perlas magneticas, en el que cada entidad diana unida a una perla magnetica tiene una dimension eficaz mas pequena superior a una dimension eficaz mas grande de cada perla magnetica, comprendiendo el sistema:

   un componente de detector (12) que incluye:

   un cuerpo (15) que define un deposito (16);

   una placa (18) dispuesta dentro de dicho deposito (16) y que separa dicho deposito (16) en una primera camara (16a) y una segunda camara (16b), definiendo dicha placa (18) una pluralidad de orificios (50) a su traves, teniendo cada orificio (50) una dimension eficaz dimensionada para siempre permitir el pase de la dimension eficaz mas grande de cada perla magnetica y dimensionada ademas para siempre prevenir el pase de la dimension eficaz mas pequena de cada entidad diana;

   teniendo dicha primera camara (16a) de dicho deposito (16) una primera entrada (13a) y una primera salida (13b), dicha primera entrada (13a) conectable de forma fluida con una fuente de fluido que contiene las entidades diana; y

   un iman dispuesto con respecto a dicho deposito (16) de manera que dicha segunda camara (16b) de dicho deposito (16) y dicha placa (18) esten situadas entre dicho iman y dicha primera camara (16a) de dicho deposito (16), dicho iman configurado para generar una fuerza magnetica suficiente para atraer perlas magneticas en dicha primera camara (16a) de dicho deposito (16) a dicha segunda camara (16b) de dicho deposito (16); y

   una bomba (40; 41) para hacer circular continuamente el fluido de la fuente de fluido que contiene las entidades diana mediante dicha primera camara (16a) de dicho deposito (16).
2. 2. El sistema de deteccion microflmdica (10) de la reivindicacion 1, en el que dicho componente de detector (12) incluye un panel de visualizacion que forma parte de dicha primera camara (16a) de dicho deposito (16) y dispuesto para visualizar la superficie de dicha placa (18) a traves de dicha primera camara (16a).
3. 3. El sistema de deteccion microflmdica (10) de la reivindicacion 1, en el que dicha primera entrada (13a) y dicha primera salida (13b) incluyen canales definidos en dicho cuerpo (15) en comunicacion con dicho deposito (16), dichos canales dispuestos a un angulo no plano con respecto a dicho deposito (16).
4. 4. El sistema de deteccion microflmdica (10) de la reivindicacion 1, en el que dicho cuerpo (15) incluye una porcion que define al menos parte de dicha segunda camara (16b) de dicho deposito (16), definiendo dicha porcion ademas una cavidad con dicho iman montado dentro de dicha cavidad.
5. 5. El sistema de deteccion microflmdica (10) de la reivindicacion 4, en el que dicho iman esta montado de forma ajustable dentro de dicha cavidad para variar la distancia entre dicho iman y dicha placa (18).
6. 6. El sistema de deteccion microflmdica (10) de la reivindicacion 1, en el que dicha segunda camara (16b) de dicho deposito (16) incluye una segunda entrada y una segunda salida, dicha segunda entrada conectable de forma fluida con una fuente de fluido no reactivo diferente de dicho fluido que contiene las entidades diana.
7. 7. El sistema de deteccion microflmdica (10) de la reivindicacion 6, en el que dicha bomba (40, 41) incluye:

   una entrada conectada a dicha primera salida (13b) y a dicha segunda salida; y

   una salida conectada a una lmea de fluido conectable con un primer recipiente para recibir fluido bombeado mediante dicha primera salida (13b) y con un segundo recipiente separado para recibir fluido bombeado a traves de dicha segunda salida.
8. 8. El sistema de deteccion microflmdica (10) de la reivindicacion 7, que comprende ademas:

   una primera valvula controlable dispuesta entre dicha primera y segunda salida y la entrada de dicha bomba (40, 41); y

   una segunda valvula controlable separada dispuesta entre dicha salida de dicha bomba (40, 41) y dicho primer y segundo recipientes.
9. 9. El sistema microflmdico de la reivindicacion 1, que comprende ademas:

   un conducto de salida conectado a dicha primera salida (13b) y conectable a un recipiente de fluido para recibir fluido bombeado a traves de dicha primera salida (13b);

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   una lmea de derivacion dispuesta entre dicho conducto de salida y dicha primera entrada (13a); y

   una valvula controlable para dirigir el flujo de fluidos a traves de dicha primera salida (13b) a tanto el recipiente de fluido como dicha lmea de derivacion.
10. 10. Un metodo de deteccion de entidades diana de tamano de micrometros en un fluido que contiene una cantidad de perlas magneticas y una cantidad de entidades diana unidas a una o mas perlas magneticas, en el que cada entidad diana unida a una perla magnetica tiene una dimension eficaz mas pequena superior a una dimension eficaz mas grande de cada perla magnetica, comprendiendo el metodo:

    hacer circular continuamente el fluido a traves de un componente de detector (12) que tiene una primera camara (16a) de un deposito (16) separada de una segunda camara (16b) del deposito (16) por una placa (18), definiendo la placa (18) una pluralidad de orificios (50) entremedias con cada orificio (50) dimensionado para siempre permitir el pase de la dimension eficaz mas grande de cada perla magnetica y ademas dimensionado para siempre prevenir el pase de la dimension eficaz mas pequena de cada entidad diana; y

    aplicar una fuerza magnetica debajo de la placa (18) suficiente para extraer perlas magneticas no unidas a una entidad diana a traves de los orificios (50) en la segunda camara (16b) y suficiente para mantener las entidades diana unidas a una o mas perlas magneticas contra la superficie de la placa (18) dentro de la primera camara (16a) del deposito (16).
11. 11. El metodo de la reivindicacion 10, que comprende ademas visualizar la superficie de placa (18) para determinar la presencia y/o cantidad de entidades diana.
12. 12. El metodo de la reivindicacion 10, que comprende ademas:

    despues de que las entidades diana hayan sido mantenidas en la superficie de placa (18), modificar la fuerza magnetica a un nivel suficiente para permitir el desalojamiento de las entidades diana de la superficie de placa (18); y

    hacer circular un lfquido no reactivo a traves de la primera camara (16a) para desalojar las entidades diana.
13. 13. El metodo de la reivindicacion 10, que comprende ademas:

    despues de que las entidades diana hayan sido mantenidas en la superficie de placa (18), modificar la fuerza magnetica a un nivel suficiente para permitir el desalojamiento de las perlas magneticas no unidas de la segunda camara (16b); y

    hacer circular un lfquido no reactivo a traves de la segunda camara (16b) para desalojar las perlas magneticas.
14. 14. El metodo de la reivindicacion 10, en que el fluido se hace circular a una velocidad del orden de mililitros (ml) por minuto.
15. 15. El metodo de la reivindicacion 10 usado para detectar celulas tumorales circulantes (CTC) en una muestra de sangre de un paciente, que comprende la etapa de obtener una muestra de sangre como el fluido que contiene CTC como las entidades diana que se han unido a una o mas perlas magneticas funcionalizadas y una cantidad de perlas magneticas funcionalizadas no unidas a una CTC.