CN109311023B - 高通量颗粒捕获与分析 - Google Patents

Abstract

描述了用于捕获与一个或多个磁珠结合的磁性靶标实体的微流体系统和方法。该系统包括孔阵列装置，所述孔阵列装置包括具有表面的基板，所述表面具有排列在所述表面上的一个或多个阵列中的多个孔。将孔的第一阵列与表面上的第一位置相邻排列。如果第二和随后的阵列存在的话，将第二和随后的阵列依序排列在表面上的第二和随后的位置处。当将液体样品添加到基板上并使其流动时，所述液体样品将首先流经第一阵列，并然后以相继次序流经第二和随后的阵列。在第一阵列中的孔各自具有允许仅一个靶标实体进入孔中的尺寸，并且在第一阵列中的每个孔具有大致相同的尺寸。

Description

高通量颗粒捕获与分析

相关申请的交叉引用

本申请要求于2016年4月22日提交的并且标题为“高通量颗粒捕获与分析(HIGH-THROUGHPUT PARTICLE CAPTURE AND ANALYSIS)”的美国临时申请第62/326,405号的优先权，其全部公开内容通过引用并入本文。

领域

本说明书通常涉及微流体系统。

背景

当样品中包括大量细胞时，可能难以在高通量微流体系统内分析流体样品中的个体颗粒(诸如细胞)。此外，必须首先从流体样品中分离个体细胞，以根据所进行的测试类型恰当地分析细胞内容物，诸如DNA、RNA和/或蛋白质。在一些情况下，个体细胞也可能需要以预定义的几何排列进行分离，以使得自动化处理和分析成为可能。常用的分离技术通常包括以使得仅单细胞可以与微孔板的单个微孔相符的方式稀释流体样品。然而，这些技术缺乏足够的准确性和速度，并且主要依赖于统计学，从而降低了获得可重复结果的机会。

尽管已经提出高通量微流体系统来克服与单细胞分析相关的挑战，但是此类系统仍然具有各种限制。例如，虽然可以将微孔的各种几何排列用于增加个体细胞的捕获，但是这些技术通常不能够捕获单个流体样品中的个体细胞和细胞簇两者。此外，此类系统的设计通常不能够捕获流体中具有相对低浓度的稀有细胞。影响这些系统使用的另一个限制是它们通常不能够允许接近捕获的细胞，从而妨碍了直接操作捕获的细胞而没有降低细胞存活力的风险的能力。

概述

可以将本文描述的系统和技术用于疾病状况的许多科学和临床研究中，其中分别分析个体细胞对于理解和检测细胞-至-细胞的变异是至关重要的。例如，可以将该系统和技术用于改进具有肿瘤异质性的癌症的研究，所述研究可能通常需要鉴定多种肿瘤的存在和性质。作为实例，如果将多个细胞组合并裂解，那么它们的遗传内含物将混合，并且与细胞-至-细胞变异有关的信息将受到损害和/或丢失。然而，如果可以使用本文描述的系统和技术分别分离、捕获和分析它们，则可以保留与细胞-至-细胞变异相关的信息以用于分析。这适用于从流体(例如血液、尿液和唾液)获得的细胞以及还适用于通过化学或机械研磨实体组织(例如肿瘤组织)获得的细胞。

因此，贯穿本公开描述的创新方面包括能够捕获流体样品内的通常为“靶标实体”个体颗粒(例如，细胞、细胞簇和/或其他类型的颗粒)的装置、系统和方法，所述流体样品流经或被引入例如排列在微流体腔室中或作为微流体腔室的一部分的微孔阵列装置(在本文中也被称为“微孔芯片”)上。微孔芯片包括具有表面的基板(例如薄板)，所述表面具有一个或多个微孔阵列，其中微孔具有选定的使得特定尺寸的靶标实体能够进入微孔的尺寸。在一个实施方案中，所有微孔都在一个阵列中并且都具有大致相同的尺寸，例如，在选定尺寸的±5％之内。在其他实施方案中，微孔芯片可以具有两个或更多个微孔阵列，其中在给定阵列中的微孔都具有大致相同的尺寸，但是在一个阵列中的微孔具有与在另一个阵列中的微孔不同的尺寸。

如本文所用的，当涉及微孔时，术语“尺寸”可以是微孔的直径、横截面积、深度、形状和/或总体积中的任一个或多个。

例如，微孔芯片可以具有两个微孔阵列，其中第一较小微孔阵列位于基板表面上靠近表面的第一位置(例如第一端)的位置(例如更靠近微流体腔室的入口端口)以捕获个体靶标实体(例如细胞)，并且其中包括相对较大的微孔的第二阵列位于表面上更靠近第二位置(例如第二端)(例如，第一阵列的“下游”)并且更靠近微流体腔室的出口端口以捕获不适合进入上游较小微孔的较大细胞或细胞簇。

该系统还可以包括磁体组件，该磁体组件可以被用于施加流动非依赖性的可变磁力，以引导和控制有磁性或被制成有磁性的靶标实体的移动。例如，磁体组件被用于将靶标实体移动到微孔中和/或将靶标实体保持在微孔中，而不需要使用洗涤步骤来避免非特异性靶标实体(例如细胞)的假阳性检测，其通常可导致特定靶标实体的意外丢失。

如本文所用的，当涉及靶标实体时，术语“有磁性的”意指通过施加磁力或电力而是固有有磁性的、顺磁性的或超顺磁性的，或者被制成有磁性的、顺磁性的或超顺磁性的。当涉及靶标实体时，术语有磁性的还指通过被附接(即被连接)至本身是有磁性的、顺磁性的或超顺磁性的珠或颗粒而成为或者被制成有磁性的、顺磁性的或超顺磁性的靶标实体。

在不同的实施方案中，调节磁力的量级以增大或减小靶标实体(例如细胞)的沉降速率，并且可以调整所施加的磁场的方向以引起沿着微孔芯片表面的一维或二维的磁性感应的靶标实体移动。在这方面，可以将平板的微孔排列和可变磁场的应用用于以更高的准确性和一致性更有效地捕获磁化的细胞和细胞簇。

在一个实施方案中，样品流体中的靶标实体和颗粒(例如，较小和较大的细胞或细胞簇)在遇到具有较大微孔的一个或多个另外的阵列之前最初遇到具有较小微孔的第一阵列。例如，较小的靶标实体可以进入第一阵列的微孔，但较大的靶标实体不可以进入，因为它们太大而不能进入第一阵列中的微孔开口。在使用该实施方案的典型捕获操作期间，将磁体在微孔芯片下方移动或扫掠(例如，水平地)，以将未被捕获的较大的靶标实体引导穿过微孔芯片的表面朝向具有较大微孔的第二阵列。在一些实施方案中，然后通过以类似方式向下游移动磁体，将太大而不能位于第二阵列的微孔中的剩余靶标实体引导朝向第三阵列的微孔。为了实现这一点，可以使靶标实体流入腔室，同时磁体基本上位于第一阵列下方，以便将所有靶标实体放置在第一阵列上。然后可以停止或显著地减少流动以防止较小的实体意外地到达后续阵列的较大微孔。一旦小的靶标实体被捕获在第一阵列的微孔中，就可以重新开始或增加流动以帮助磁体将剩余的较大的靶标实体移动到下游具有较大孔的下一个阵列中，以此类推。

靶标实体(例如细胞)可以是固有有磁性的、顺磁性的或超顺磁性的，或者可以通过将本身是有磁性的、顺磁性的或超顺磁性的一个或多个珠或颗粒与靶标实体连接而将靶标实体制成有磁性的、顺磁性的或超顺磁性的。因此，靶标实体和珠或颗粒的组合复合物然后是有磁性的、顺磁性的或超顺磁性的，并且如本文进一步详细描述，可以用与微孔芯片相邻排列(例如，在微孔芯片的下面、在侧面或在上面)的磁体来操纵所述靶标实体和珠或颗粒的组合复合物。

在第一概括性方面，本公开的特征在于用于捕获有磁性的或被制成有磁性的靶标实体的微孔阵列装置。第一微孔阵列装置包括基板，所述基板包括表面，所述表面包含排列在表面上的一个或多个阵列中的多个微孔，其中将微孔的第一阵列排列在表面上的第一位置处。将第二和随后的阵列(如果存在的话)依序排列在表面上第二的和随后的位置处，其中当将液体样品添加到基板上并使其流动时，液体样品将首先流经第一阵列，然后以相继次序流经第二和随后的阵列。在第一阵列中的微孔各自具有允许仅一个靶标实体进入微孔的尺寸，并且其中在第一阵列中的每个微孔具有大致相同的尺寸。第二和随后的阵列中的微孔(如果存在的话)各自具有比先前相邻阵列中的微孔的尺寸大至少10％的尺寸，并且其中在给定的随后阵列中的每个微孔具有大致相同的尺寸。多个微孔全部具有以下尺寸：其足以使得在靶标实体进入微孔之后，当流体流经表面时、或当向微孔中的靶标实体施加磁力时、或流体流动并同时施加磁力时，至少一个靶标实体保留在微孔内。

在某些实施方案中，微孔阵列装置包括与表面相邻排列的磁体组件。将磁体组件排列和配置为产生以下的磁力：其足以在靶标实体进入微孔之后，将靶标实体吸引到微孔的一个或多个阵列中，并且当流体流经表面时足以将至少一个靶标实体保持在至少一个微孔中。

在一些实施方案中，将磁体组件可调节地与表面相邻排列。在此类实施方案中，将磁体组件排列和配置为产生足以在将磁体移动(例如水平地)到与表面相邻时将至少一个靶标实体保持在至少一个微孔中的磁力。

在一些实施方案中，基板是具有第一端和第二端的多边形(例如矩形)。在此类实施方案中，将微孔的第一阵列排列在基板的第一端，并且将第二和随后的阵列排列得比先前相邻的阵列更远离基板的第一端。

在一些实施方案中，基板是径向对称的(例如圆形或八边形)，并且微孔的第一阵列包括围绕没有微孔的基板的中心位置排列的微孔的一个或多个同心圆。基板包括第二和随后的阵列，每个阵列包括排列得比先前相邻的阵列更远离基板的中心位置的微孔的一个或多个同心圆。

在第二概括性方面，本公开的特征在于用于捕获有磁性的或被制成磁性的靶标实体的微流体系统。微流体系统包括主体，其包括具有入口、出口并且被配置为容纳上述微孔阵列装置的腔室。微流体系统还包括可调节地与表面相邻排列的磁体组件。将磁体组件排列和配置为产生以下磁力：其足以沿着表面(例如，水平地在表面上)移动其尺寸适合进入第一阵列中的微孔靶标实体并且进入第一阵列中的微孔中，和足以沿着表面(例如，水平地在表面上)移动更大的靶标实体并且进入第二和随后的阵列中。磁力足以使得在靶标实体进入微孔之后，当流体流经表面时、或当向靶标实体施加磁力时、或流体流动并同时施加磁力时，至少一个靶标实体保留在微孔内。

在一些实施方案中，微流体系统还包括被配置为分析靶标实体的光学性质的检测器。

在一些实施方案中，将磁体组件配置为相对于表面沿着至少一个轴(例如两个轴，例如水平轴)移动。

在一个实施方案中，在腔室上方的主体的一部分(例如，透明部分)可从微流体系统的主体拆卸，例如一旦捕获并保留了靶标实体，就允许接近微孔阵列装置。

在一些实施方案中，微孔阵列装置是主体的整体部分，并且微孔阵列装置的表面形成腔室的一个壁(例如底板)。可替代地，微孔阵列装置可以是单独的微芯片的形式，所述微芯片可以被插入微流体腔室中和/或从微流体腔室移除。

在某些实施方案中，微流体系统包括泵，其用于使流体以足以允许靶标实体到达微孔阵列的流动速率，从腔室的入口流到腔室的出口。

在某些实施方案中，微流体系统包括靶标实体提取模块，其被配置为从多个微孔的至少一个中提取靶标实体。在此类实施方案中，微流体系统包括第二磁体组件，将所述第二磁体组件相对于与多个微孔相对的靶标实体提取模块可调节地排列。将第二磁体组件配置为产生以下可变磁力：其足以吸引有磁性的或者被制成有磁性的靶标实体从微孔进入靶标实体提取模块的入口通道。

在一些实施方案中，靶标实体提取模块包括微量移液器，并且第二磁体组件包括放置在微量移液器尖端上的磁环。

在一些实施方案中，表面包括基底层和呈微孔阵列层形式的微孔阵列装置，所述微孔阵列层排列在基底层的顶部上并与基底层接触。微孔阵列层包括形成多个微孔的多个通孔。可替代地，微孔阵列层可以简单地是具有不是通孔的微孔的微孔阵列装置，并且被排列以形成腔室的一个壁。

在一些实施方案中，将基底层或一个或多个阵列中的微孔用一个或多个结合部分官能化，以增强靶标实体与基底层或与微孔内壁的结合。

在一些实施方案中，第二阵列中的微孔各自具有允许第二靶标实体进入微孔中的尺寸。在此类实施方案中，第二靶标实体大于第一靶标实体，并且第一阵列中的微孔各自具有不允许第二靶标实体进入微孔中的尺寸。

在一些实施方案中，微孔的尺寸是直径、横截面积、深度、形状和总体积中的任一个或多个。

在一些实施方案中，在阵列之间变化的微孔的尺寸是直径、体积或横截面积，而多个微孔的深度在所有阵列中大致相同。

在一些实施方案中，微流体系统包括一组磁珠，磁珠在其表面上包含与靶标实体表面上的分子特异性结合的一个或多个结合部分。

在第三概括性方面，本公开的特征在于捕获靶标实体的方法。该方法包括将含有磁性靶标实体的流体样品添加到上述微孔阵列装置的微流体系统的腔室中。该方法还包括使用被可调节地排列在表面下方的磁体组件向腔室施加可变磁力，并且调整磁体组件相对于表面的位置，使得所施加的可变磁力将靶标实体吸引到微孔的第一和/或第二阵列中。在某些实施方案中，该方法包括使用检测器组件分析靶标实体的性质。

在一些实施方案中，待分析的性质包括靶标实体内含有的分子、DNA、RNA、蛋白质、小分子和酶，或靶标实体表面上含有的分子标志物，或从靶标实体分泌的分子的数量、尺寸、序列和/或构象。

在某些实施方案中，在调整磁体组件相对于表面的位置之后，该方法包括拆卸微流体系统的主体的盖子，并从多个微孔的至少一个中提取靶标实体。

在一些实施方案中，从多个微孔的至少一个中提取靶标实体包括将提取的靶标实体输送到微流体系统外的容器。

在一些实施方案中，分析包括检测由靶标实体发射的荧光。在一些实施方案中，调整磁体组件的位置包括使磁体组件相对于表面沿一个、两个或三个轴(例如，水平轴)移动。在一些实施方案中，在调整磁体组件相对于表面的放置之后，该方法还包括向微流体装置提供湍流，并从多个微孔的至少一个中提取磁化的靶标实体。在一些实施方案中，调整磁体组件相对于表面的放置包括使磁体组件以一定模式移动，所述模式使得靶标实体沿着表面遵循所述模式。在一些实施方案中，将含有磁性靶标实体的流体样品添加到腔室中包括使流体样品经过包含多个微孔的表面从入口流到出口。

在一些实施方案中，将含有磁性靶标实体的流体样品添加到腔室中包括将流体样品分配到包含多个微孔的腔室的表面上。在一些实施方案中，当将流体样品放入微流体腔室的腔室中时，向腔室施加可变磁力。

在第四概括性方面，本公开的特征在于用于捕获有磁性的或被制成有磁性的靶标实体的微孔阵列装置。微孔阵列装置包括基板，所述基板包括表面，所述表面包含在表面上的一个或多个阵列中排列的多个微孔。将微孔的第一阵列与表面的第一端相邻排列，并且将第二阵列(如果存在的话)排列得比第一阵列更远离表面的第一端，以及将任何另外的阵列依序排列，使得将每个随后阵列排列得比邻近阵列更远离表面的第一端。第一阵列中的微孔各自具有允许仅一个靶标实体进入微孔中的尺寸，并且其中第一阵列中的每个微孔具有大致相同的尺寸。第二阵列中的微孔(如果存在的话)各自具有比第一阵列中的微孔的尺寸大至少10％的尺寸。多个微孔全部具有以下深度：其足以使得在靶标实体进入微孔之后，当流体流经表面时，至少一个靶标实体保留在微孔内。

在一些实施方案中，基板包括排列在表面上的两个或更多个阵列中的多个微孔。在某些实施方案中，基板包括排列在表面上的一个阵列中的多个微孔。在一些实施方案中，尺寸是直径、体积、横截面积。

在第五概括性方面，本公开的特征在于用于捕获有磁性的或被制成有磁性的靶标实体的微流体系统。微流体系统包括主体，所述主体包括具有入口、出口和从入口延伸到出口的表面的腔室。表面包括多个微孔，其全部具有为最小靶标实体的尺寸的至少1倍的深度，使得在靶标实体进入微孔之后，当流体流过腔室时，至少一个靶标实体保留在微孔内。微流体系统还包括被可调节地与所述表面相邻排列的磁体组件，其中将磁体组件排列和配置为产生以下磁力：其足以在靶标实体进入微孔之后，将靶标实体吸引到微孔的阵列中，当例如水平移动磁体时，至少一个靶标实体保留在微孔中。

在某些实施方案中，微流体系统包括被配置为分析靶标实体的光学性质的检测器。在一些实施方案中，将磁体组件配置为相对于表面沿着一个或两个轴(例如水平轴)移动。在一些实施方案中，多个微孔的深度允许通过腔室中的液体湍流将靶标实体运载到多个微孔外。在一些实施方案中，多个微孔被充分间隔开，使得当在第二微孔附近通过移液器施加吸取力时，在与第二微孔相邻的第一微孔中的靶标实体保留在第一微孔内。

在一个实施方案中，腔室上方的主体的一部分可从微流体系统的主体拆卸，使得一旦拆卸主体的该部分，多个微孔的至少一部分可被微量移液器的尖端接近。

贯穿全文描述的各种微孔阵列装置可以包括基板，所述基板仅包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、十个或甚至更多个阵列，例如呈微孔列或微孔同心圆形式的阵列。可以将微孔阵列装置简单地插入腔室(例如玻璃或塑料或其他腔室)、容器或样品池中，然后将样品流体施加到表面上，作为跨装置扩散的微滴或跨表面从一端到另一端的样品流动。可以通过在装置下方移动磁体组件，将磁体组件用于引导靶标实体直到大部分或全部靶标实体进入微孔。此后，可以将磁体组件固定到装置的底部或充分靠近装置的底部，以确保当在微孔测定装置上进行其他测定步骤(例如洗涤步骤、标记步骤、孵育步骤或分析步骤)时，靶标实体保留在微孔中。可替代地，这可以通过使用排列在单元阵列附近的一个或多个电磁体来实现。在此类实施方案中，电磁体可以是静止的，并且可以控制和/或打开或关闭它们的磁场。通过依次打开和关闭电磁体，可以产生“移动的”磁力，以引起磁化的靶标实体(例如，颗粒或细胞)的运动，而不必物理地移动磁体。

可以将微孔阵列装置用于例如在同一装置上分别捕获和分离个体细胞和细胞簇，或者在同一装置上分别捕获和分离不同尺寸的细胞。

本文所述的微孔阵列装置(微孔芯片)以及微流体细胞分析系统允许基于所施加的磁力的量级、位于微孔芯片表面上的微孔的尺寸、以及流经微孔芯片(例如通过包围微孔芯片表面的微流体腔室)的液体的流动速率，来增加不同尺寸的靶标实体的捕获效率。可以将微孔芯片用于捕获个体细胞(例如不同尺寸的细胞)，以及可以存在于流体样品中的细胞簇，因为位于微孔芯片表面上的微孔阵列的尺寸(例如，直径、横截面积、深度、形状和/或总体积)从一个阵列到另一个阵列变化。另外，可以以非依赖于流过微流体腔室的流体的流动速率和体积并且非依赖于重力的方式施加磁力，使得不必需细胞沉降来捕获微孔芯片的微孔内的细胞。这样就不需要在将样品注入微流体腔室后进行洗涤步骤，这降低了丢失靶细胞的可能性并提高了测试速度。

如本文所述的，流体样品中的“靶标实体”或“靶标颗粒”是固有有磁性的、顺磁性的或超顺磁性的，或者是使用例如如本文所述的不同技术至少暂时被磁化的(例如被制成有磁性的、顺磁性的或超顺磁性的)。靶标实体或颗粒可以是细胞(例如，人或动物血细胞、哺乳动物细胞(例如如在母体血液样品中的人或动物胎儿细胞、人或动物肿瘤细胞如循环肿瘤细胞(CTC)、上皮细胞、干细胞、B细胞、T细胞、树突细胞、粒细胞、先天性淋巴细胞、衰老细胞(以及与特发性肺纤维化相关的其他细胞)、巨核细胞、单核细胞/巨噬细胞、骨髓源性抑制细胞、自然杀伤细胞、血小板、红血细胞、胸腺细胞、神经细胞)、细菌细胞(例如肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌属(Salmonella)、李斯特菌属(Listeria)及其它细菌，诸如导致脓毒症的那些细菌，其包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MRSA))。

靶标实体或颗粒也可以是植物细胞(例如，花粉粒细胞、叶细胞、花细胞和蔬菜细胞、薄壁细胞、厚角细胞、木质部细胞和植物表皮细胞)或各种生物分子(例如，DNA、RNA或肽)、蛋白质(例如，抗原和抗体)、或环境样品中的污染物(例如，污水、类鼻疽伯克氏菌(burkholderia pseudomallei)、小隐孢子虫(cryptosporidium parvum)，蓝氏贾第鞭毛(giardia lamblia)和寄生虫)或工业样品中的污染物(例如，洗涤剂、消毒副产物、杀虫剂、除草剂、挥发性有机化合物、石油及其副产物、包括氯化溶剂和药物的溶剂)。为细胞的靶标实体可以具有100纳米至1微米的最小直径和高达约20、30或40微米或更大的范围。靶标实体簇的尺寸可以更大并且范围高达100μm或1mm(例如，250、500或750μm)。尽管在关于细胞或细胞簇的捕获中描述了本公开，但本文所述的系统和方法还可以是从液体样品中捕获或分离其他类型的靶标实体或颗粒。例如，靶标实体可以是外泌体或其他细胞外囊泡，其尺寸可以小至30纳米或更小。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管可以将与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料用于本发明的实践或测试，但下文描述了适合的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用整体并入。如果发生冲突，将以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的而不是意在限制性的。

在以下附图和描述中阐述了一个或多个实施方案的细节。根据描述、附图和权利要求，其他潜在的特征和优点将变得显而易见。

附图简述

图1A是示出细胞分析系统的实例的顶视图的示意图。

图1B是用于本文所述系统的微孔芯片的实例的顶视图的示意图。

图1C-1、1C-2、1C-3和1C-4是示出微孔形状的实例的横截面图。

图2A是示出在微流体腔室内的磁性感应细胞捕获的实例的示意图，所述微流体腔室包括形成为腔室的下壁或底壁的一部分的微孔芯片。

图2B-D是示出不同微孔阵列的实例的示意图。

图2E是可以被用于将细胞簇的个体细胞分离到不同微孔中的磁性感应细胞捕获系统的实例的横截面侧视示意图。

图2F是用于解聚和/或分离有磁性的或磁化的靶标实体的技术的实例的示意图。

图2G是具有圆形基板和呈两种同心圆的微孔阵列的微孔装置的实例的示意图。

图3A-B是示出具有可拆卸表面的微孔芯片的实例的横截面侧视图，所述可拆卸表面在图3A中一起形成微流体腔室并且在图3B中形成独立的微孔芯片。

图3C-D是示出细胞捕获系统的实例的示意图，所述细胞捕获系统使得能够接近在微孔内捕获的靶标实体。

图3C-1和3C-2是示出具有可拆卸部分的微孔芯片的实例的截面图。

图3D是示出具有微孔芯片的系统的实例的示意图，所述微孔芯片具有可移除的聚合物膜以能够接近微孔。

图4A-B是示出与本文所述的微孔芯片和微流体腔室一起使用的两种不同细胞提取模块的实例的横截面图。

图4C是示出在两个微孔芯片之间的靶标实体的转移操作的实例的截面图。

图5是示出单细胞提取装置和技术的实例的示意性横截面侧视图。

图6是使用本文所述的细胞分析系统捕获细胞的过程的实例的流程图。

图7A(光学显微镜)和7B(荧光显微镜)表示显示在细胞捕获装置上进行的实验的结果的照片，所述细胞捕获装置包括具有微细加工微孔的硅基板。

图8表示显示其中借助于移液器提取位于微孔芯片中的细胞的实验结果的照片。

图9A-D表示显示比较在使用和不使用微孔的情况下细胞提取的实验结果的照片。

图10A-C表示显示检查在微孔芯片的表面上使用环形磁体解聚和/或分离靶标实体簇的实验结果的照片。

在附图中，同样的参考编号始终表示相应的部件。

详述

通常，本公开描述了细胞分析系统和方法，其能够捕获和分离个体颗粒(诸如细胞，例如不同尺寸的细胞)和颗粒簇(诸如细胞簇)，所述个体颗粒和颗粒簇悬浮在流经微孔芯片(例如通过包围微孔芯片或其中在底壁中形成微孔图案化表面的微流体腔室)的流体样品中。腔室的底面包括一部分的底板或单独的微孔芯片，其具有微孔排列，例如其中所有微孔的是大致相同的尺寸的单个微孔阵列，或者两个或更多个阵列，例如其中较小微孔的阵列位于更靠近微流体腔室的入口端口以捕获个体细胞(例如，较小的细胞)和具有较大微孔的阵列位于远离入口端口的位置(并且更接近于出口端口)以捕获较大的细胞或细胞簇。可以将微孔排列成多个阵列，例如，其中每个阵列中的微孔是相同的尺寸或大致相同的尺寸(例如，一个阵列内的所有微孔具有是阵列中微孔的选定尺寸的加或减5％的尺寸，例如直径、或横截面积、或深度、或形状和/或总体积)，但是在不同阵列中微孔的尺寸(例如，直径或横截面积，或深度、形状和/或总体积)不同于第一阵列中的尺寸(例如，至少10％、20％、30％、40％或50％，例如至少75％、100％、125％、150％、200％、500％、750％或甚至1000％)。例如，第三阵列中的孔可以比第二阵列中的那些孔大相同的百分比。类似地，每个阵列的孔可以比在前的阵列中的那些孔大与上述相同的百分比。

即使对于一些应用来说，保持所有阵列中所有孔的深度相同并且仅改变它们的直径可能就足够了，也可能有必要增加随后的阵列中的孔的深度以及它们的直径以考虑到多达3个维度上更大的实体和簇。在一个实施方案中，每个阵列占据的面积可以类似或相等。在其他实施方案中，阵列占据的面积可以彼此不同(例如，25％、50％或100％)。例如，第一阵列可以占据所有阵列覆盖的整个面积的50％至75％。该实施方案可以帮助确保在流体流经微孔芯片表面存在的情况下，所有靶标实体首先落在第一阵列上并且有助于使小靶标实体到达下游其他阵列的可能性最小化。

在一些实施方案中，可以将微孔以列阵列排列，其中将微孔以垂直于从一端到另一端(例如如果将微孔芯片排列在腔室内或者是腔室的一部分，则从微流体腔室的入口到出口)的微孔芯片的中心轴的列排列(例如，每个阵列是微孔列)。最靠近入口的列中的微孔可以具有最小尺寸(例如直径、横截面积、深度、形状和/或总体积)，并且最靠近出口的列中的微孔具有最大尺寸(例如直径)。在所有的实施方案中，在一个、一些或所有阵列(例如，列)中的所有微孔的深度可以相同或不同，但是每个微孔必须足够深以包围和“捕获”细胞或细胞簇并且即使当液体流经微孔顶部时或者当移动(例如水平地)磁体以将靶标实体引导进入随后的孔中时，保持细胞在微孔中。

在一些实施方案中，在一列中所有微孔的直径和深度相同或大致相同。除了其中打算从微孔中提取靶标实体的情况之外，通常希望一旦将靶标实体捕获在微孔中，即使在磁体的流体流动和/或运动(例如水平运动)的影响下它们全部保留在微孔中。在一些实施方案中，可能有必要将100％的靶标实体(例如细胞)保持在微孔中，而在其他实施方案中，保持90％、80％、50％或低至10％或甚至仅1％的靶标实体或单个靶标实体在微孔中可能就足够了，即使其余部分是从微孔中无意提取的。

在某些实施方案中，可以限制微孔的深度以防止多个细胞非计划中的堆叠在彼此的顶部。在这些实施方案中，微孔深度可以略大于细胞的标称直径以帮助防止第二细胞堆叠。可替代地，只要仍然阻止或抑制细胞过早地移出微孔，微孔深度可以略小于细胞的标称直径。在该实施方案中，细胞的一部分可以突出在围绕微孔的表面上方。可替代地，该实施方案还可以利用细胞的柔性，其在施加垂直向下力下将在垂直方向上压缩，最终使细胞的高度小于其标称直径。在这种情况下，细胞可以完全保留在微孔内。

在一个实施方案中，可以将具有相同微孔直径但更大深度的第二微孔芯片以对准所有微孔的入口的方式放置在微孔芯片110的顶部，使得外部磁力可以从微孔芯片110的微孔中提取细胞并将它们移动到第二芯片的微孔中。该实施方案将有效地改变细胞所处的微孔的深度。

在一些实施方案中，第二微孔芯片可以具有与第一微孔芯片的那些直径不同的直径的微孔。

该系统还能够施加流动非依赖性的可变吸引力来引导有磁性的、顺磁性的或超顺磁性的目标细胞的移动，而无需使用洗涤步骤来避免非特异性细胞的假阳性检测。例如，可以操纵所施加的流动非依赖性吸引力的量级以增加或降低细胞沉降速率，并且可以调整所施加的磁场方向以引起沿着平板表面的两个维度的磁性感应细胞移动。在这方面，可以将平板上的微孔排列和可变磁场的施加用于以高准确性和一致性有效地捕获细胞和细胞簇。

系统综述

图1A示出了细胞分析系统100的实例，所述细胞分析系统100通常包括用于供应具有待分析的有磁性的或磁化细胞的流体样品的流体控制装置120，用于捕获悬浮在流体样品中的有磁性的或磁化细胞的微孔芯片110，用于产生吸引力以吸引有磁性的或磁化细胞的通常位于芯片下方的磁体130，以及用于检测与细胞相关的特性的分析仪装置140。

如本文所述的用于本文所述系统和方法中的“磁珠”可以是有磁性的、顺磁性的或超顺磁性的颗粒，其可以具有任何形状并且不限于球形。此类磁珠是可商购获得的或可以被特定设计用于本文所述的方法和系统中。例如，

是有磁性的或超顺磁性的，并且具有各种直径(1.05μm、2.8μm和4.5μm)。Sigma提供顺磁珠(1μm、3μm、5μm和10μm)。Pierce提供超顺磁珠(例如1μm)。Thermo Scientific

珠是超顺磁性的，并且具有各种直径(1μm至4μm)。Bangs Lab销售磁珠和顺磁珠(0.36、0.4、0.78、0.8、0.87、0.88、0.9、2.9、3.28、5.8和7.9μm)。R&D Systems

Furrofluid含有超顺磁性纳米颗粒(直径为150纳米)。Bioclone销售磁珠(1μm和5μm)。此外，PerkinElmer提供(Chemagen)超顺磁珠(例如，0.5-1μm和1-3μm)。磁珠是颗粒，其尺寸可以在例如10纳米至100微米(例如50、100、250、500或750纳米或1、5、10、25、50或75微米)的范围内。

如果细胞在基本上水平的流体流和向下磁力的影响下在流体腔室中行进，它与表面的接触取决于流体阻力和向下磁力之间的平衡，这取决于磁场以及细胞表面上珠的性质和数量。流体阻力取决于平均流动速度，其相关性由以下等式表示：Q＝V*A，其中Q是流动速率，V是平均流体速度，并且A是流体腔室的横截面积。

研究人员已经证明，当肿瘤细胞(例如循环肿瘤细胞(CTC))与至少7个超顺磁珠(具有1μm的平均直径，例如来自Sigma)结合时，如果平均流体速度大约为4.4mm/s(即，2ml/min的流动速率，横截面积为约7.6mm²)，该细胞遇到固体表面的概率为90％。参见LabChip,2015,15,1677-1688。在该研究中，所用的磁体是钕永磁体(K&J Magnetics，等级为N52)，其具有0.4至1.5T的通量密度和磁体表面附近的160至320T/m的梯度，所述磁体被放置在芯片表面下面约650微米处。在这些条件下，即使具有单个磁珠的细胞也可以被吸引至芯片表面，尽管概率较低。

在一些实施方案中，可以显著降低流动速率和速度以将捕获细胞的概率最大化。较高的流动速率(ml/min)可能导致较高的速度(mm/s)，这可能引入细胞逃逸表面的风险。可替代地，仍然可以与较大的横截面积一起使用较高的流动速率，以防止平均速度增加。在这些实施方案中，“横截面积”是指垂直于流体流动的流体腔室的横截面积。可替代地，也可以使用具有较高磁化率(例如较高的氧化铁含量)的较强磁体或珠。在一些其他变体中，可以将更高亲和力的抗体偶联在珠的表面上。这将导致与细胞表面结合的更多数量的珠，并因此导致更大的总磁力。

在一些实施方案中，也可以增加流体流动速率和速度，而不会引起微孔中捕获的细胞从微孔芯片的表面逃逸。例如，在一个实施方案中，将体积流动速率和横截面积配置为使得平均流动速度能够在0.01mm/s至50mm/s的范围内，例如0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15、20、25、30、35、40或45mm/s。

大多数磁珠通常在其中心具有氧化铁核，具有聚合物壳。也可以将珠预先包被有可能易于官能化的表面，例如链霉亲和素、生物素、葡聚糖、羧基、NHS或胺的表面覆盖层。

在各种实施方案中，将磁珠与在流体样品内的靶细胞表面上表达的特异性抗原结合或连接。在这些实施方案中，将磁珠以任何一种或多种方式(例如新的、常规的或商业上可获得的方式)官能化以包括一个或多个结合部分或一种或多种不同类型的结合部分，例如适当的单克隆或多克隆抗，包括但不限于针对以下的抗体：EpCAM、EGFR、波形蛋白、HER2、孕酮受体、雌激素受体、PSMA、CEA、叶酸受体或具有其他结合部分(诸如适配子)、或可与特定靶标实体结合的短肽。

在特定的实例或官能化技术中，将用于前列腺癌细胞的低分子量配体(例如2-[3-(1,3-二羧基丙基)-脲基]戊二酸(“DUPA”)和用于卵巢癌细胞或在其表面上过表达叶酸受体的其他癌细胞(包括肺癌、结肠癌、肾癌和乳腺癌))的叶酸用于促进与某些细胞的结合。具体地，可以用在低分子量配体和官能团之间的连接基团(例如，用聚乙二醇(PEG)链)将低分子量配体(例如，DUPA和叶酸)与官能团(氨基、n-羟基琥珀酰胺(NHS)或生物素，这取决于待使用的磁珠上的官能团)结合，以抑制与珠的非特异性结合。

在其他情况下，通过将流体样品暴露于磁性颗粒的微滴，磁性颗粒的流体流动，或者使用磁泳流动到微孔芯片，磁性颗粒被靶细胞内化。例如，可以将靶细胞在足以使细胞内化磁性颗粒的条件和时间下在流体中孵育，所述流体含有磁性的、顺磁性的或超顺磁性的颗粒，通常为具有约1nm至微米尺寸的纳米颗粒。在一个实施方案中，磁性颗粒的尺寸是几微米，只要颗粒足够小于细胞的尺寸，使得它们可以被细胞内化。在一个实施方案中，细胞是血细胞或肿瘤细胞，其尺寸范围为5微米至20微米。

微孔芯片110可以包括形成微流体腔室的多个表面，其中流体样品在入口端口和出口端口之间流动。微流体腔室的底面包括或含有平板，所述平板包括微孔(在本文中也被称为“孔”)阵列，其被设计成捕获悬浮在流体样品中的个体细胞或细胞簇。微孔的尺寸(例如，直径、深度、形状等)和微孔阵列模式可以基于使用微孔芯片110捕获的靶标实体(例如，靶细胞)而变化。在一些情况下，微孔芯片110还可以包括具有多个微孔阵列的排列，其中每个阵列(或阵列组)中的所有微孔具有相同的尺寸，但是在不同的阵列(或者阵列组)中的微孔的尺寸不同以同时捕获通过腔室的单个样品运行中的个体细胞和细胞簇。

在可替代的实施方案中，微孔芯片110在没有流体腔室或任何入口端口和出口端口或流体控制装置的情况下起作用。在该实施方案中，使用常规方法(诸如移液)将含有磁化细胞的样品流体以微滴的形式暴露于微孔芯片110的顶面。例如，可以将样品池类型的流体腔室(具有开放的顶部)配置为容纳微孔芯片110。可以直接通过移液器或入口和出口管从上方接近这种样品池。可替代地，也可以将样品池配置为具有流体入口和流体出口。

流体控制装置120可以是用于将样品流体引入流体回路中的任何类型的流体递送装置。例如，流体控制装置120可以是蠕动泵、注射泵、具有流量计的压力控制器或具有矩阵式阀的压力控制器。可以将流体控制装置120配置为连接到微孔芯片110的入口端口的管道，以将样品流体引入微孔芯片110的微流体腔室中。在一些情况下，流体控制装置120也能够根据预定程序调整被引入到微流体腔室中的样品流体的流动速率。这一预定程序可以基于特定顺序，该特定顺序涉及以一定速度使含有细胞的样品流体流动一定的时间段，然后引入某些染料以将细胞染色和引入某些分子和酶以与细胞结合或与细胞相互作用。

可以将流体控制装置120放置在与微孔芯片110相关的流体回路的不同位置。在一些实施方案中，流体控制装置120位于微孔芯片110的上游(例如，在流体回路内的微孔芯片110的入口端口之前)。在此类实施方案中，可以将流体控制装置120用于施加将一定体积的流体从样品室(如样品池)“推”到含有微孔芯片110的腔室中的力。在其他实施方案中，流体控制装置120可以位于微孔芯片110的下游(例如，在流体回路内的微孔芯片110的出口端口之后)。在此类实施方案中，可以将流体控制装置120替代地用于施加将流体从样品容器“拉”到含有微孔芯片110的腔室中的力，例如吸取力。处于下游或上游配置中的流体控制装置120所用的流动速率的范围可以是例如0-100mL/分钟，或0.1-3mL/分钟之间，例如10、20、30、40、50、60、70、80或90mL/分钟，或0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5或3.0mL/分钟。

磁体130通常位于芯片100下方，并且相对于与靶标实体连接的磁珠进行校准，以施加足以将靶标实体拉向微孔芯片110的表面中的微孔入口，和一旦靶标实体已经通过微孔的入口，就将目标实体保持在微孔内的磁力。磁力也足够强以将靶标实体拉出通过微流体腔室的流体流，所述流体流倾向于在平行于微孔芯片110的表面的流动路径中拉靶标实体。作为实例，磁体130可以是NdFeB立方磁体(约5×5×5mm)，具有分别为0.4T至2T和100至400T/m(取决于测量的确切位置)的测量的表面通量密度和计算的梯度。在其他实例中，也可以使用其他磁体，其包括但不限于由各种材料制成的更大或更小的永久磁体，以及可商购或使用标准或微型品制造程序制造并且能够产生随时间变化的磁场的电磁体。磁性通量密度和梯度的范围可以分别为0.01至10T/m、10至100T/m、100至100T/m和1至1000T/m。

基于特定应用，磁体130可以具有不同的形状和尺寸。例如，磁体130的形状可以是但不限于立方形，矩形棱柱形、环形、圆形或椭圆形或其组合。另外，可以使用多个磁体。磁体130的尺寸可以变化，使得其最小尺寸可以为0.1-30cm。在一些实施方案中，磁体130是环形磁体，其被用于引起和/或帮助分散有磁性的颗粒或磁化的靶标实体的聚集体。例如，可以将环形磁体放置在靶标实体的聚集体周围，以帮助个体靶标实体朝向磁体130的周界分散。

可以将磁体130安置在形成于包括微孔芯片110的外壳的下半部分中的腔体内，或者可以将磁体130与外壳的外表面连接而不需要腔体。可以将磁体130固定到微孔芯片110的外部或者相对于微孔芯片110的外部支撑，只要它以吸引靶标实体朝向微孔芯片110的表面并且以受控方式调整细胞在腔室表面上移动的方式定向或定位。例如，可以将磁体130用于沿着由微孔芯片110下方的磁体130的移动限定的路径来引导表面上的细胞。在其他实施方案中，可以在系统中的接收腔室内一个或多个磁体固定，可向所述接收腔室中插入例如以盒或样品池形式的如本文所述的微流体装置。此类系统还可以包括所需的泵、控制器(例如，计算机或微处理器)、流体导管、用于流体通过微流体装置的储存器以及如本文所述的分析系统和设备。

磁体84的移动可以通过马达手动完成，和/或可以配备有允许选择用于磁体的特定扫掠模式的控制器。磁体130可以是电磁体，其可以根据需要被启动或停用。此外，可以将电磁体配置为反转极性，作为用于控制磁珠以及配体结合的实体的移动的技术的一部分。另外，可以改变磁体130的定向以选择性地控制所施加的吸引力的量级和方向。

在一些实施方案中，可以例如串联或依次使用和控制多个磁体(例如电磁体)，以产生相对于时间和空间变化的磁场。例如，可以控制位于微孔芯片110附近(例如下面)的两个或更多个电磁体以产生用于沿着微孔芯片110的表面移动磁性实体的移动磁力。

可以基于与细胞连接的颗粒的磁性性质、磁体130的强度和/或磁体130相对于微孔芯片110的放置来调整由磁体130施加的吸引力的量级。例如，磁体130可以与外部主体相关联，使得磁体与微孔芯片110的距离可以被改变，从而改变施加到微流体腔室中的靶标实体的磁力。然后可以将施加的磁力校准到靶标实体的特定类型或所用的官能化磁珠的特定类型。另外，可以根据系统100的方案移动磁体130以完全去除磁力。可以使用磁力的去除来促进在微孔内去除捕获的靶标实体，使得然后可以将靶标实体运输或冲洗到单独的收集容器。在一个实施方案中，可以将磁体130或另一个磁体放置在芯片的顶部，以帮助将细胞从微孔中提取出来。然后可以将放置在顶部上的磁体130向侧面移动，以用于微孔阵列中细胞的随后提取。

在一些实施方案中，磁体130包括以覆盖微孔芯片110的一部分的方式放置在微孔芯片110下方的电磁体阵列。然后，可以阵列内的一个或多个电磁体以一定顺序被选择性地供电，以施加吸引力导致沿着沿着微孔芯片110的表面的特定路径的细胞运动。

可以将分析仪装置140配置为使用光学技术来分析在腔室表面的微孔内捕获的细胞。例如，可以将分析仪装置140配置为使用基于荧光、明场、暗场、诺马尔斯基(Nomarski)、质谱、拉曼光谱、表面等离子体共振等其他已知技术的各种显微技术。

分析仪装置140可仪包括CCD照相机和计算机化图像获取和分析系统。CCD照相机可以足够大从而以从微孔芯片110中的所有微孔获取图像的方式覆盖微孔芯片110的整个区域的尺寸。可替代地，CCD相机可能能够分析只包含一个微孔或一组微孔的较小的视场。在此类实施方案中，可以手动或使用平移台或其他计算机控制的模态移动CCD照相机或芯片100以依序地将CCD照相机与其他微孔对准并获取它们的图像。

可以将分析仪装置140用于使用微孔芯片110分析细胞捕获过程的各个方面。例如，可以将分析仪装置140用于分析已经从微孔芯片110的微孔中提取的细胞。可替代地，在细胞提取之前，可以另外地或可替代地将分析仪装置140用于可视化和/或确认微孔芯片110的微孔内的细胞捕获。

细胞分析系统100可以任选地包括控制器150。可以将控制器150用于使微孔芯片110上进行的动作自动化，以用于本文所述的方法的各个步骤，例如样品流体注入、细胞捕获、捕获细胞的提取和/或捕获细胞的分析。在一个实例中，可以将控制器150用于调整平移台的位置，所述平移台相对于分析仪装置140的视场调整微孔芯片110的位置以记录每个微孔的内容物的图像，或相对于用于提取捕获的细胞的微量移液器调整微孔芯片110的位置。在另一个实例中，控制器150能够产生计算机执行的指令，所述指令调整磁体130的位置和产生的吸引力的量级，以定制用于特定类型的样品流体的细胞捕获技术。

控制器150可以是微处理器，其被配置为遵循对特定的靶标实体、识别元件和样品尺寸的受控流动方案。控制器150可以包含读取器以读取与特定的一种或多种样品相缔合的标记，并自动上传和执行与特定样品相关联的预定流动方案。控制器150还可以在检测循环期间调节磁场，以便于捕获靶标实体并将未结合的磁珠拉入微孔阵列中。

还可以将控制器150配置为允许用户控制的操作。例如，可以通过增加结合的靶细胞样品的流动速率来确定特定靶细胞-磁珠组合的流动速率，直到其不再可能将珠吸引到微孔芯片110的表面为止。可以通过可视化窗口直接观察系统100的连续操作，以确定是否需要流动旁路或检测过程是否完成。控制器150还可以引起微孔芯片110移动以使分析仪装置140能够扫描并获得微孔芯片110的不同部分上的图像。然后，可以将这些图像用于重建微孔芯片110的表面的整个或部分的图像。

微孔排列

图1A示出了微孔芯片110内的微孔阵列的实例。如所描绘的，微孔芯片110包括三个单独的微孔阵列112、114和116，其中每个阵列中的微孔全部具有相同的或者大致相同的尺寸(例如直径、横截面积、深度、形状和/或总体积)，但是不同阵列中微孔的尺寸(例如直径)是不同的。例如，可以将微孔阵列112中的微孔102a用于捕获个体细胞或最小的靶标实体，微孔阵列114中的微孔102b的直径稍大并且可以被用于捕获小细胞簇或更大的单细胞，并且微孔阵列116中的微孔102c具有最大直径并且可以被用于捕获大细胞簇或甚至更大的单细胞。在其他的实施方案中，微孔芯片可以仅具有一个阵列，其中所有微孔具有大致相同的尺寸。

可以配置微孔芯片110的表面上的微孔102a、102b和102c的入口的尺寸使得在微孔内仅捕获单细胞或细胞簇。微孔102a、102b和102c也具有足够的深度，使得一旦在微孔内捕获单细胞或细胞簇，即使流体样品继续从入口端口到出口端口流过微流体腔室或者在不存在由磁体130施加的吸引力的情况下，捕获的细胞仍保留在微孔内。

在一个实施方案中，限制每个微孔的深度以防止多个细胞堆叠。微孔的深度可以在靶向细胞的标称直径和小于靶细胞的标称直径的2倍之间。作为一个实例，循环肿瘤细胞的直径约为15微米。微孔的深度可以是15至30微米。作为另一个实例，细菌的尺寸为约1微米，微孔的深度可以为1至2微米。在另一个实施方案中，微孔的深度可以等于细胞的标称直径或甚至比细胞的标称直径小5、10、20或50％，考虑到一旦细胞在微孔内并且受到向下磁力的影响，其厚度可以减少而其宽度可以增加。对于这些情况，可以配置微孔的深度，使得当第一细胞已经在微孔中时，在第一细胞顶部重合的另一个第二细胞的一部分被暴露在微孔外，使得可以通过流动或侧向磁力冲走它，同时防止第一个细胞被冲走。对于15微米循环肿瘤细胞(CTC)的实例，微孔的深度可以为1微米至15微米。应当理解，微孔的深度需要根据寻求捕获/分离的靶细胞或细胞簇的标称尺寸来配置，并因此在实际装置中以微米计微孔的特定深度可以不同于这里提及的那些深度。另外，在一些实施方案中，微孔的深度被制造成在阵列与阵列之间或在同一阵列内不同。

在一个实施方案中，调整磁力以及微孔之间的间隔以使磁化实体聚集的可能性最小化并因此使多个磁性实体进入相同微孔的可能性最小化。

在一个实施方案中，配置微孔的尺寸使得一经施加通过微流体腔室湍流，可以从微孔释放捕获的细胞。例如，可以仔细地选择和控制样品流体的流动速率、微孔深度和由磁体130施加的吸引力的量级，使得可以通过调整所施加的吸引力或样品流体的流体流动速率以控制的方式提取在微孔中捕获的细胞。在一些实施方案中，在存在或不存在流体流动的情况下，借助移液器手动或以计算机控制的形式取回个体细胞或细胞簇。

作为一个实例，如果在微孔芯片110中捕获的细胞是具有10-20微米直径的白血细胞，则在微孔芯片110的表面上的微孔102a的入口可以是15-30微米。可替代地，在其他情况下，入口的尺寸可以等于细胞直径或比细胞直径小5至20％，使得通过由磁体130施加的吸引力将细胞挤压到微孔中。作为另一个实例，捕获的细胞可以是具有10-20微米直径的循环肿瘤细胞，并且微孔芯片110的表面上的微孔102a的入口可以是10-35微米。作为另一个实例，捕获的细胞可以是具有6-8微米直径的红血细胞。在这种情况下，微孔芯片110的表面上的微孔102的入口可以是6至10微米。作为另一个实例，捕获的细胞可以是具有大约1微米直径的细菌，并且微孔芯片110表面上的微孔102a的入口可以是1至2微米。作为另一个实例，捕获的细胞可以是直径范围为50至100纳米的外泌体，并且微孔芯片110表面上的孔102a的入口可以大于50nm。

在图1A所描绘的实例中，将具有较大尺寸入口的微孔(诸如微孔116的阵列)，相对于具有较小尺寸入口的微孔(诸如微孔112的阵列)，放置在微流体腔室内的入口端口的下游。在此类微孔排列中，可以将微孔芯片110下方的磁体130从微孔芯片110的一侧(离如，左侧)移动到微孔芯片的另一侧(例如，右侧)，使得较小的个体细胞(或最小的靶标实体)最初被捕获在微孔112的阵列中，而较大的细胞以及较小和较大的细胞簇沿着磁体130的路径向下游行进，因为它们太大而不能符合通过微孔112阵列的入口。

在一些实施方案中，微孔的底部包括一个或多个微孔或开口，其能够使液体和未结合的磁珠从微孔中通过出去，同时保留捕获的细胞。在此类实施方案中，一旦细胞已经被捕获在微孔内，就可以引入流体通过微孔来洗涤捕获的细胞。在一个实例中，可以将洗涤步骤用于筛选游离的未结合的磁珠和通过微孔被捕获在微孔内的其他小实体。

在具有需要微孔芯片的长度不成比例地大于其宽度的许多微孔阵列的一些实施方案中，可以以曲折模式排列不是以线性方式排列的微孔阵列，这可以使得能够实现在矩形表面上聚集更多微孔。

图1B示出了微孔芯片110的实施方案，所述微孔芯片110包括位于微孔芯片110的入口端口附近的上游的微孔阵列118。可以将微孔102d用于捕获样品流体内游离的未结合的磁珠。可以将这些微孔的尺寸配置得足够大以捕获磁珠，但也可以足够小以使得流体样品内的细胞不能进入微孔102d。在此类实施方案中，可以最初将磁体130围绕这些微孔移动，以在未结合的磁珠上施加吸引力，以便在微孔102d内捕获。

图1C-1、1C-2、1C-3和1C-4是示出微孔形状的实例的横截面图。图1C-1示出了圆柱形微孔的实例，图1C-2示出了圆锥形微孔的实例，图1C-3示出了截头圆锥形微孔的实例，并且图1C-4示出了反向截头圆锥形微孔的实例。在截头圆锥形的情况下，微孔的入口可以具有大的直径，而微孔的底部可以具有较小的直径。可替代地，在反向截头圆锥形的情况下，与微孔的底部相比，微孔的入口可以具有较小的直径以使得细胞更难以从微孔中逃逸。当整个微孔芯片不是在液体中但其微孔含有液体时，这种排列也可以帮助保持液体更长的时间段。

图2A示出了在微流体腔室内的磁性感应细胞捕获的实例。该图描绘了位于腔室中的微孔芯片110的侧横截面视图，该腔室具有排列在微孔芯片110的左侧上的腔室的入口端口(未示出)和排列在微孔芯片110的右侧上的腔室的出口端口(未示出)。在该实例中，将磁体130放置在微孔芯片110的下方并产生吸引力212，其有助于捕获个体细胞(或最小的靶标实体)202a、小细胞簇202b和大细胞簇202c进入微孔芯片110表面上的不同微孔中。磁体130最初被放置在上游(例如，微孔芯片110的左侧)以捕获个体细胞202a。在微孔(例如，微孔110的阵列)内捕获个体细胞之后，然后将磁体130向下游移动以捕获小细胞簇202b和大细胞簇202c。

在一个实施方案中，可以通过流体流通过入口端口引入靶标实体，并且当靶标实体基本上位于第一阵列上时，可以停止或减少流体流以防止较小的靶标实体向下游逃逸并意外进入随后的阵列的较大孔中。可以例如水平地以振荡形式移动磁体以确保小的靶标实体(或个体细胞)进入第一阵列的孔中。然后可以将磁体向下游移动以将更大的实体(或簇)引入下一个阵列的较大孔中。可以通过重新启动或增加流体流或者可替代地不使用任何流体流来辅助该过程。一旦完成在孔中捕获实体的过程，如果需要可以进行洗涤过程。在一个实施方案中，入口端口和出口端口可以固有地是微孔芯片110的一部分。

可以手动或自动地沿着微孔芯片下方的两个维度(例如，沿着图1A-1B中所描绘的x轴和y轴)在微孔芯片110下方移动磁体以遵循各种移动模式来改善微孔芯片110的微孔内的细胞捕获。例如，可以沿着单个轴以反复模式移动磁体以在微孔芯片110的一定区域上重复施加吸引力。在其他情况下，也可以使用其他模式，诸如圆形模式、Z形模式、光栅扫描、S形模式或其他模式。一些实施方案包括基于待捕获的细胞的特性使用更复杂的移动模式。例如，可以由用户从控制单元在外部限定和控制移动模式，该控制单元调节微孔芯片110下方的磁体的移动。在一个实施方案中，可以配置容纳微孔芯片110的外壳以具有与磁体连接的手柄。该手柄可以在外壳外延伸足够的量，以便能够手动移动磁体。

如本文所述的，还可以调整吸引力212的量级以增加或减少细胞202a、小细胞簇202b和大细胞簇202c进入微孔的磁性感应移动。例如，可以移动或控制磁体130以施加较小的吸引力以诱导个体细胞202a被捕获在微孔内，并且由于细胞簇的更大尺寸，可以移动或控制磁体130以施加更大的吸引力来诱导细胞簇被捕获在微孔内。在一些情况下，可以特定地调节吸引力212的量级以选择性地捕获特定尺寸或形状的细胞和/或细胞簇(例如，选择性捕获小细胞簇202b，但不选择性捕获大细胞簇202c)。例如，如果磁体130是永久磁体，则可以将磁体130更靠近微流体腔室移动，以增加施加的磁力的量级并进一步远离微流体腔室移动，以减小施加的磁力的量级。在一个实施方案中，磁体和芯片表面的底部之间的距离可以为10微米至2厘米，或者更窄地为0.5至2mm。在其他实例中，其中磁体130是电磁体，可以增加或减少提供给磁体130的能量的量以类似地增加，从而导致所施加的磁力的量级的相应增大或减小。在一个实施方案中，施加在单个有磁性的、顺磁性的或超顺磁性颗粒上的力可以为0.1pN至1nN或更窄地为1至100pN。

在一些实施方案中，微孔芯片110的表面能够在微流体腔室内产生电场，以调整微孔内捕获的细胞的移动。例如，微孔芯片110可以具有嵌入模态(例如，电磁体或发电机)，其在微孔的底面上产生电场，该电场排斥在微孔内捕获的带负电的细胞以引起捕获的细胞离开微孔。可以调节所产生的电场的量级以对捕获的细胞进行特定操作。例如，可以产生低量级的电场以调整微孔内的细胞的放置(例如，可以振动或搅动微孔中的细胞)以增强捕获后与被引入微孔中的化学品(诸如染料、污渍、裂解物等)的混合。在另一个实例中，可以产生高量级的电场以使细胞从微孔转移并通过微流体腔室的出口端口收集细胞。在一些实施方案中，用于与靶标实体结合的颗粒或珠可以以借助外部电场帮助吸引或排斥靶标实体的方式携带负电荷或正电荷。在一些实施方案中，由靶标实体上的电场产生的力的量级可以为0.01pN至1nN。

图2B示出了微孔芯片上的微孔阵列的实例。在所描绘的实例中，阵列被排列为连续的列，每个列偏移距离130，使得被包括在列中的微孔相对于前一列的微孔偏移。该距离130可以是例如1、5或10微米。可以将这种类型的排列用于增强跨微孔芯片表面的流体运动(例如，水平运动)期间在微孔中捕获靶标实体的概率，这在图2C中更详细地描绘。

图2C-1和2C-2示出了微孔阵列及其在水平流体流经微芯片表面期间对微孔内的靶标实体捕获的影响的两个实例。例如，芯片210包括网格状阵列，其中微孔相对于彼此水平和垂直地平行排列。利用这种类型的排列，如果微孔在芯片210的表面上稀疏地间隔开，则在由磁力和/或流体力引起的水平流体流动或水平运动期间可能无法捕获一些靶标实体，而与芯片表面接触，因为这些靶标实体沿着两个平行的微孔行之间是间隔开的表面的一部分流动。因此，微孔的这种排列可以降低当靶标实体流经芯片210的表面时微孔将被包括在靶标实体的水平路径中的总体可能性。

相反，图2C-2中所示的芯片220包括类似于图2B中所描绘的阵列的交替阵列，其中不同列的微孔垂直偏移最近列的微孔。利用这种类型的排列，与芯片210的表面上的可能性相比，降低了靶标实体将穿过芯片220的表面而不会遇到微孔的可能性。在这方面，可以将微孔阵列的排列用于提高捕获效率，而不必增加被放置在微孔芯片表面上的微孔密度。例如，在图2C中所描绘的实例中，尽管芯片220包括类似或更少数量的微孔，但是在水平路径期间靶标实体遇到微孔的概率增加可以导致捕获效率增加。可以基于偏移距离来进一步调整捕获效率，在各种实施方案中，可以在0％(例如，如在芯片210中所示的没有偏移)至100％(例如，等于微孔直径的偏移)或更多(例如距离为微孔直径的150％或200％)或更小(例如距离为微孔直径的约10％、25％、50％或75％)调整偏移距离。还可以使偏移尽可能小以最大化细胞与孔重叠的概率。例如，如图2C-2所示，如果偏移与微孔直径大致相同，则仍可能存在细胞的水平路径正好在微孔的连续行之间。如果发生这种情况，细胞可能仍然不会进入微孔，因为它将只会与微孔的入口部分重叠。

图2D示出了微孔阵列的实例，其中微孔的形状是正方形或矩形的。在该实例中，芯片230包括正方形或矩形形状的微孔，其可以有助于将经由非特异性吸附和/或磁性聚集而已经聚集的个体细胞分开。该排列可以包括不同尺寸的微孔，以当大簇沿着芯片230的表面移动时捕获个体靶标实体或部分的聚集体。例如，当大簇沿着芯片230的表面移动时，可以在芯片230的左侧附近的最小微孔中捕获与簇分开的个体靶标实体，而可以在芯片230的中心附近的中等尺寸的微孔中捕获被分开的中间尺寸的簇。可以将微孔之间的间隔用于增强微孔在分开簇中的影响。例如，可以最小化芯片230表面上的微孔边缘之间的距离，以增强对大簇的解聚影响。

图2E是示出矩形形状的微孔可以在簇240上具有的解聚效应的示意图。在该实例中，簇240包括暴露于由放置在两个微孔下面的磁体130产生的磁力的两个个体靶标实体。如所描绘的，当簇240朝向微孔芯片的表面行进时，由矩形形状的微孔形成的边缘可潜在地分离簇240的个体靶标实体并捕获不同微孔内的每个实体。这种解聚效应也可以发生在圆柱形微孔(即具有圆形开口的那些)上，但是用矩形形状的微孔是增强的。在一些实施方案中，孔的开口可以是五边形、六边形、八边形或三角形。

图2F是用于解聚和/或分离有磁性的或磁化靶标实体的技术的实例的示意图。在该实例中，围绕由三个靶标实体细胞组成的靶标实体簇252放置环形磁体250。由磁体250施加的向外磁力以帮助分离和/或解聚形成簇252的个体靶标实体。在一个实施方案中，磁体250位于微孔芯片下面以施加向下的磁力和向外径向磁力，其共同将磁化的靶标实体拉入微孔中，同时解聚簇(诸如簇252)。在其它实施方案中，磁体250可以与微孔芯片的表面基本共面，以主要施加向外径向磁力从而只能分离和/或解聚靶标实体，而不必施加朝向微孔芯片的表面的向下磁力。

图2G是具有对称的(例如圆形的)基板260的微孔阵列装置的示意图。圆形基板260包括围绕没有微孔的中心位置的同心圆阵列中的微孔。例如经由入口262a或通过移液器将流体样品添加到基板中间的中心位置，并且使流体样品从中心向外径向流经微孔到达装置边缘处的出口262b，例如当装置以正确的速度旋转以使液体样品流动和/或使靶标实体以适当的速率/速度移动时。可以将流体样品添加到干净的(例如干燥的)微孔阵列装置中，或者可以在将缓冲液或其他流体施加到基板表面之后添加流体样品，例如，以“填充”表面和微孔，例如，以去除微孔中的气泡。

可以通过排列在系统的入口和/或出口处的泵和/或真空产生流体样品中的靶标实体的流动，或者可以通过旋转对称的(例如圆形或八边形)基板来产生流动。例如，基板的直径可以在3mm至30cm的范围内，例如，2cm至10cm(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75或100mm或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30cm)。在一个实施方案中，基板的旋转速度可以在0.0001rpm至1000rpm的范围内，例如0.01rpm至20rpm(例如，0.0001、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、30、40、50、75、100、200、250、250、500、750或1000rpm)。

在该实施方案中，将微孔阵列排列为同心圆，其中将最小微孔266的一个圆(或多个圆)排列成最靠近装置的中心，并且将最大微孔264的一个圆(或多个圆)排列成最远离装置的中心。可以将一个磁体排列在基板下面，以使有磁性的靶标实体进入微孔并被保持在微孔中。可替代地，可以将一个或多个磁体与基板相邻(例如在下面)排列，并且配置和控制一个或多个磁体移动以使靶标实体朝向随后的微孔圆形阵列移动(例如径向向外)。在一些实施方案中，可以将电磁体(例如圆形电磁体或一系列圆形电磁体)排列在例如基板下面，并且依次触发以在径向向外方向上提供磁力以在装置的表面上移动靶标实体。

细胞捕获和分析系统

微孔芯片110可以包括各种特征，以使得能够捕获流经微孔芯片(例如流过微流体腔室，所述微流体腔室含有微孔芯片作为在微流体腔室的底部的单独且可移除的平板或者形成为腔室底壁的一部分)的流体样品内的靶标实体(诸如细胞)。例如，微孔芯片110可以包括结构特征，其调整流体样品的流动以使得能够捕获微流体腔室的特定位置内的细胞。作为一个实例，微孔芯片110可以包括呈预定排列的具有分支和/或阀门的流体回路，其有助于流体与细胞组件的分离。在其他情况下，可以将微孔芯片110的表面官能化以使用用于使微孔芯片表面官能化的特定化学品与在靶细胞表面上表达的受体之间的受体-配体结合来增强细胞捕获。在一些情况下，可以选择性地将微孔官能化以识别特定类型的细胞和分子。例如，可以用如本文所述的结合部分包被和/或官能化微孔的内壁，以帮助将靶标实体保持在微孔内。在一些实施方案中，将结构特征(例如，通道尺寸和通道排列)和官能特征(例如，与微孔的通道的表面和/或内表面结合的结合部分)的组合用于增强微孔芯片110内的细胞捕获。

微孔芯片制造

可以使用常用的硅微型品制造技术(诸如光刻和蚀刻)来制造微孔芯片110。在一些情况下，微孔芯片110是单表面结构，其位于流体腔室内，所述流体腔室具有允许观察和分析捕获的细胞的透明的上表面。在其他情况下，通过组合多个预制层来构造微孔芯片110，其中顶层(并且在一些实施方案中，底层)由透明材料(诸如诸如玻璃、石英或塑料(例如丙烯酸、聚氯乙烯、聚丙烯或聚苯乙烯))制成，或者包括透明材料(诸如玻璃、石英或塑料(例如丙烯酸、聚氯乙烯、聚丙烯或聚苯乙烯))的窗口。在此类情况下，微孔芯片110可以包括底层(所述底层包括如图1A所描绘的微孔排列)，形成微流体腔室的高壁或侧壁的间隔层，以及包围微流体的顶层。如更具体地关于图3A-3B所描述的，在一些情况下，微孔芯片110的顶层可以是可拆卸的，以能够提取捕获的细胞。在一些实施方案中，每个微孔的底部由透明材料制成或可以包括透明材料的窗口。

在一些实施方案中，通过首先在聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜中形成孔然后将膜应用到固体材料(诸如玻璃)的表面来构造微孔芯片110的微孔。在此类实施方案中，可以将PDMS膜放置在固体表面上以“盖住”固体材料底部上的通孔，从而形成用于捕获细胞的微孔。

在一个实施方案中，微孔芯片110可以由金属(诸如铝或不锈钢)制成，以使得能够有效地传导温度控制，以用于包括聚合酶链式反应(PCR)的应用。可以用金或铂或类似材料包被或图案化微孔芯片，使得能够用包括硫醇在内的其他分子官能化。

在一些实施方案中，微孔芯片110的表面积可以在100μm²至1000cm²的范围内或更窄地在0.01mm²至100mm²的范围内。在一个实施方案中，微孔芯片110的尺寸可以是15cm×10cm，使得其与成人手的尺寸相当。微孔芯片110可以由微孔构成，所述微孔具有30微米的入口直径，具有40微米的中心-至-中心间距。在该实施方案中，微孔芯片可以具有大约600万个微孔。在另一个实施方案中，微孔芯片110可以具有20cm×15cm的尺寸，并因此可以含有1200万个相同的微孔。

在其他实施方案中，微孔之间的间隔可以是不同的，并且范围从1微米(边缘-至-边缘)到200微米中心-至-中心(或者对于具有30微米入口直径的微孔，从边缘-至-边缘为170微米)。然后，聚集到微孔芯片110的表面上的微孔的数量可以相应地变化。例如，如果微孔的入口直径为1微米并且如果微孔彼此间距为1微米(边缘-至-边缘)，则在11cm×3.7cm的微孔芯片110中可存在约10亿个微孔。作为另一个实例，如果微孔的入口直径以及边缘-至-边缘间隔是5微米，则在17.7cm×6cm的微孔芯片110中可以存在1亿个微孔。在一些实施方案中，微孔入口的直径可以在10nm至500μm的范围内。

在一个实施方案中，含有微孔芯片的“盒”或外壳可以由注塑塑料制成。塑料可以含有透明的观察窗。在另一个实施方案中，外壳可以由丙烯酸或金属或木材制成。

在一个实施方案中，外壳的长度和宽度可以比微孔芯片110的长度和宽度大1毫米至5cm。外壳的厚度可以在1毫米至5厘米变化。

细胞接近和提取技术

通常，一旦已经在微孔芯片110的微孔内捕获了细胞，就可以使用不同技术观察、成像或接近捕获的细胞以进行进一步分析或处理。在一些实施方案中，可以调整流过微流体腔室的流体流动和/或由磁体施加的吸引力的量级，以从微孔中去除捕获的细胞。在一些实施方案中，如图3A-3B所描绘的微孔芯片110的一个或多个表面被拆开以直接观察或接近捕获的细胞。可替代地，在一些实施方案中，如图4A-4B和5所描绘的，在存在或不存在通过腔室的流体流动的情况下，使用单独的细胞提取模块来提取捕获的细胞。尽管下面的描述提供了此类技术的实例，但是在一些实施方案中，也使用其他提取技术。

可以用不同的系统(例如，荧光分析、聚合酶链式反应(PCR)模块、下一代DNA或RNA测序模块、平板读取器、2或3维细胞培养模块、高含量分析装置如Opera等)进一步分析被提取的细胞，收集以输送出微孔芯片110，或者接近被提取的细胞以在微孔芯片110上培养。如下面更具体地描述的，各种实施方案包括提供此类功能性的结构特征。

图3A-3B示出了具有可拆卸表面的微孔芯片的实例。首先参考图3A，在一个实施方案中，微孔芯片可以包括基底310，所述基底310包括如前面关于图1A、1B和2所述的微孔。间隔件320和顶板330可以堆叠在基底310的顶部上，使得堆叠的元件在基底310的表面310a和对应于微流体腔室的顶板330之间形成空间。在一些情况下，由PDMS构成间隔件320，并且由透明材料(诸如玻璃或塑料)构成顶板330。在其他情况下，间隔件320可以是另一种聚合物材料或O形环。在一个实施方案中，间隔件320的厚度可以为0.25至1mm。在其他实施方案中，间隔件320的厚度可以在0.01mm至10mm的范围内。在一些实施方案中，间隔件320的宽度可以在0.1mm至10cm的范围内。

将微流体腔室与入口302a和出口302b连接，入口302a使得流体样品能够进入微流体腔室中，并且出口302b使得流体样品能够离开微流体腔室。流体样品包括使用先前关于图1A、1B和2描述的技术在基底310的微孔中捕获的个体细胞202a和细胞簇202c。

在所描绘的实例中，一旦细胞202a和细胞簇202c已经被捕获在基底表面310的微孔内，则可以将间隔件320和顶板330从基底310拆卸，以使得能够直接接近捕获的细胞。例如，可以在视觉上接近捕获的细胞以用于光学分析和/或可以物理地接近捕获的细胞以进行提取。在拆卸之后，微流体腔室中的流体介质312可以保留在微孔内，使得捕获的细胞在拆卸后不会变干。这通过将微孔配置为具有足够的深度来实现，使得来自流体介质312上的顶板330的毛细力不会移除微孔内的所有流体介质。此外，可以将微孔的表面配置为具有一定程度的亲水性以保留尽可能多的水。在一个可替代的实施方案中，微孔可以是浅的，但是一旦移除顶板330，就可以添加更多的流体312以防止细胞干燥，或者可以当整个装置浸没在液体312浴中时，完成顶板330的移除。磁体可以存在于基底310下方，以防止在顶板330拆卸期间细胞从微孔中逃逸。

现在参考图3B，在可替代的实施方案中，微孔芯片包括基底340(其是载玻片，诸如在图像分析之前放置样品的普通显微镜载片)和多孔层350(其包括充当微孔以捕获细胞202a的孔)。

在一些实施方案中，用促进细胞粘附的分子官能化基底340的表面以提高细胞202a的捕获效率。一旦细胞202a被固定到基底340的表面，就可以移除多孔层350以提供直接接近固定化细胞。可以将具有固定化细胞的基底340浸入流体浴中或放置在流体腔室中以进行另外的分析(例如荧光显微术)。

在其他实施方案中，作为官能化表面的代替，基底340的表面可以替代地是自由表面或用防污剂(诸如牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEG)、两性离子材料或阻止非特异性结合的其他材料)封闭的表面。在此类实施方案中，当多孔层350从基底表面340拆卸时，可以通过基底340下方的磁体130施加吸引力以抑制细胞移动。

图3C-3D是示出细胞捕获系统300的实例的示意图，细胞捕获系统300使得能够接近在微孔内捕获的靶标实体。首先参考图3C，示出了细胞捕获系统300的横截面图。

系统300包括外350，所述外壳350保持在其表面上放置具有多个微孔的微孔芯片360。将间隔体370放置在微孔芯片360和透明片380之间以形成腔室，其中引入含有靶标实体的流体样品用于细胞提取操作。流体样品以与上面关于图3A-3B所讨论的类似方式通过入口302a进入腔室，并通过出口302b离开腔室。系统300还包括可移除且柔性的(例如，橡胶样的)层352，如图3C所描绘的，其能够形成密封并被剥离或拆卸以提供对腔室内容物的直接接近。在一个实施方案中，流体腔室的高度可以为0.1mm至1cm，或者更窄地为在0.5mm至2mm。在一些实施方案中，该高度可以由层370的厚度来限定。在一个实施方案中，流体腔室的长度和宽度可以由微孔芯片或者含有微孔阵列的微孔芯片的部分的长度和宽度来限定。在其他实施方案中，流体腔室的长度和宽度可以在100μm至20cm的范围内。

在一个特定的实施方案中，由丙烯酸构造外壳350，由PDMS构造间隔件370，并且可以由玻璃或任何其它适合的透明(或不透明)材料构造透明片352，以允许光传送到腔室中。层352可以是PDMS膜，其能够从透明片352的顶面上剥离。在其他实施方案中，可以将其他适合的材料用作构造系统300的替代物。

在典型的细胞捕获操作期间，层352最初被固定到透明片380的顶面上，以提供能够以最小的泄漏进行液体流动的密封腔室。然后将含有靶标实体的流体样品通过入口302a引入密封腔室中。当流体样品从入口302a流到出口302b时，如上所述，在芯片360的微孔中捕获靶标实体和/或细胞簇。然后可以如图3C所示移除层352，以便一旦一定体积的样品流体已经流过腔室，就可以直接接近已经在芯片360的微孔中捕获的细胞。例如，在移除层352之后，可以使用移液器手动提取微孔内捕获的细胞。在一些实施方案中，在剥离或移除层352之后，足够的流体保留在腔室中，使得孔中的靶标实体保持水合。在一些实施方案中，在移除层352之后仅微孔含有流体，使得每个微孔与其他微孔流体地断开。在其他实施方案中，在移除层352之后保留在腔室中的流体的量可以是腔室体积的100％。

当将样品流体通过入口302a引入腔室时，可以采用各种技术来确保层352足以维持无泄漏的流体流动。例如，在一些实施方案中，当流体流过腔室时，可以通过由放置在层352的顶部上的塑料结构(例如，丙烯酸)施加的机械压力来加强系统300的结构。

现在参考图3D，示出了细胞捕获系统300的示意图，其中流体控制装置366放置在微孔芯片360的下游。在该实例中，流体控制装置366施加“拉”力，其使得流体样品通过入口302从样品腔室360流到流体腔室(例如，如图3C所描绘的，由透明层380、间隔件370和微芯片微孔360形成的腔室)。然后拉力使流体样品通过出口302b流出流体腔室。拉力导致腔室内的压力降低，并因此通过使层352压下层380来增强密封。可以将这种类型的拉力用作确保无泄漏流体流动而无需如上所述的机械压力增强的替代手段。

图4A-4B示出了不同细胞提取模块的实例。参考图4A，可以将隧道提取模块410用于提取微孔芯片110的个体微孔内的捕获的细胞202a并将被提取的细胞传输到单独的位置以进行进一步分析或处理。参考图4B，在另一实施方案中，可以将封闭的提取模块420用于将捕获的细胞202a提取到收集隔室422中，该收集隔室422存储来自微孔芯片110的一个或多个不同微孔的一个或多个细胞。

隧道提取模块410可以具有入口，所述入口的直径大于微孔芯片110的表面上的微孔入口的直径。此外，可以配置隧道提取模块410的入口的直径使得入口可以被用于仅从单个微孔中提取捕获的细胞202a而不与另一个微孔的入口重叠。在一些情况下，用柔性橡胶样材料(例如诸如PDMS的聚合物)构造隧道提取模块410，以与微孔芯片110的表面一起围绕微孔入口形成密封。可替代地，提取模块410可以由塑料或金属(诸如不锈钢)制成，并且被配置为在其底面上具有聚合材料(诸如PDMS)片以围绕微孔形成密封。另外，也可以用液体(例如，介质流体)填充隧道提取模块410以在提取过程期间容纳捕获的细胞202a。在此类情况下，微孔的底部包括一个或多个入口，以允许液体通过微孔，用于由隧道提取模块410施加的吸取力。

在图4A所描绘的实例中，将磁体402放置在隧道提取模块410上方以施加吸引力，所述吸引力被用于将捕获的细胞202a从微孔飘浮并进入隧道提取模块410的入口。然后可以调整磁体402的放置以帮助捕获的细胞202a移动通过隧道提取模块410的隧道。隧道的另一端可以通向容纳捕获的细胞202a的单独容器。在已经提取捕获的细胞202a之后，然后可以调整隧道提取模块410并将其置于另一个微孔上方以重复另一个微孔的提取过程。

现在参考图4B，封闭的提取模块420可以具有直径大于微孔芯片110的表面上的微孔的入口的直径的入口，但是还包括直径小于捕获的细胞202a的有效直径的窄区域424。这要求捕获的细胞202a在进入窄区域424之前变形并进入收集腔室422中，从而防止捕获的细胞202a在完成提取过程之后离开收集腔室422。像隧道提取模块410一样，也可以由柔性橡胶样材料构造封闭的提取模块420，以与微孔芯片110的表面一起围绕微孔入口形成密封。可替代地，提取模块420可以由塑料或金属制成，并且被配置为在其底面上具有柔性材料片以围绕微孔形成密封。还可以使用单独的分配通道(图中未示出)用流体填充收集腔室422，以周期性地提供流体以容纳收集腔室422内的提取的细胞。

在图4B所描绘的实例中，可以将磁体404放置在封闭的提取模块420的顶部上以提供吸引力来帮助将捕获的细胞202a从微孔提取到收集腔室422中。与磁体402相比，磁体404能够提供具有引起变形所必需的更大量级的吸引力，所述变形为捕获的细胞202a在进入收集腔室422之前穿过窄区域424所需的。一旦完成提取程序，然后可以将封闭的提取模块420移动到另一个微孔。窄区域424可以帮助防止收集的细胞从腔室中逃逸。如在432和434处的虚线所示，在每次提取程序之后，收集腔室422内捕获的细胞的数量增加。一旦从微孔芯片110已经提取了所有所需的细胞，封闭的提取模块然后可以将收集腔室422内的所有捕获的细胞分配到单独的容器中。

在另一个实施方案中，可以将提取模块420配置为具有收集腔室420，但不具有窄入口424。

在一个实施方案中，腔室422和隧道202a从外部流体地接近以递送液体并与含有细胞的微孔建立流体连接。这可以通过在提取模块410或420中钻孔来实现。在另一个实施方案中，可以将提取模块420制造成具有从外部到腔室422的连接。这可以通过使用PDMS作为用于提取模块的材料并在PDMS固化之前的制造过程中将管放入PDMS中来实现。一旦固化完成，PDMS将围绕管固化，导致从外部连接到腔室422。类似地，可以将提取模块410制造成具有隧道202a的入口，但不是隧道的建立了与外部的连接的较长水平部分。然后，通过用针刺穿提取模块或在提取模块中钻孔并将管插入孔中，可以从外部流体地接近隧道的入口。

图4C是示出了在两个微孔芯片之间的靶标实体的转移操作的实例的横截面图。在该实例中，在微孔芯片110的微孔中捕获的靶标实体被转移到微孔芯片430的微孔。在转移操作期间，微孔芯片430的微孔与包括捕获的靶标实体的微孔芯片110的微孔对准。使用磁体404施加向上的磁力，以将捕获的靶标实体从微孔芯片110的微孔转移到微孔芯片430的微孔。在转移操作完成之后，可以转动微孔芯片430以便不再需要磁力来抵消靶标实体所经受的重力。

在各种其他配置中，可以在其他方向上进行转移操作。例如，可以将微孔芯片110和430放置在侧面以在微孔之间转移(例如，水平转移)捕获的靶标实体。在另一个实例中，可以放置微孔芯片110和430，使得将微孔芯片110放置在微孔芯片430的顶部上，使得可以使用重力将靶标实体从微孔芯片110的微孔转移至微孔芯片430的微孔。

在一些实施方案中，可以在将微孔芯片110和4320的微孔浸入液体中之后进行转移操作，以例如提供用于转移的流体界面、使靶标实体水合以及其他目的。在一些实施方案中，微孔芯片110和430可以具有不同孔深度的微孔。可替代地，在其他实施方案中，微孔芯片110和430可具有有相同孔深度的微孔。

图5示出了单细胞提取技术的实例。如所描绘的，微量移液器510可以具有附接的磁环520，其被用于从微孔芯片110的微孔中提取单细胞202a。可以将磁环520放置在距离微量移液器510的尖端足够的距离处，使得仅当单细胞202a已进入微量移液器510的尖端时才对单细胞202a施加吸引力。吸引力允许单细胞202a向上迁移微量移液器朝向磁环520，并以受控的方式保留在磁环520附近而不会在微量移液器510上方行进太远。在一些情况下，可以用流体预先填充微量移液器510以帮助单细胞202a向上迁移到微量移液器510的尖端。

在一些情况下，可以将微量移液器510配置为施加吸取力以促进单细胞202a运动至微量移液器510的尖端中。在此类情况下，吸取力最初被用于辅助单细胞202a进入微量移液器510的尖端，然后基于磁环520施加的吸引力向上迁移微量移液器510。可以手动或使用计算机控制的机械臂自动控制吸取力。

如本文关于磁体130所述的，可以调节由磁环520施加的吸引力的量级(例如，沿着移液器510上的垂直位置移动磁环520的位置，调整施加到作为电磁体的磁环520上的电流)以控制单细胞202a向上迁移到微量移液器510的尖端。在一些情况下，可以将吸引力的量级设定为特定值，使得单细胞202a在到达距离磁环520一定距离之后，保持在磁环520附近。例如，可以配置由磁环520施加的磁力的量级，使得在存在液体流出微量移液器510的尖端的情况下，细胞202a粘附到微量移液器510的侧面。在此类情况下，微量移液器510然后可以被用于通过使用来自微量移液器510的向外液压力将提取的细胞运输到精确位置，所述液压力的量级大于由磁环520施加的吸引力的量级。

在一个实施方案中，磁环可以是电磁体，其强度可以被调整或被接通和断开以将磁化实体保持在尖端内部或帮助从尖端射出它们。

在一个实施方案中，用一个或多个具有立方形状或矩形形状的磁体代替磁环，在距离尖端特定距离处将所述磁体放置在微量移液器的一侧或多侧上。可以对磁场强度进行定位，以防止其他细胞的扰动。

在用于细胞提取的不同实施方案中，直接通过常规微量移液器接近微孔芯片，所述微量移液器具有足够小以进入微孔的尖端。可以将微量移液器连接到计算机控制的平移台和流体流动控制模块以流体地提取细胞。此类实施方案对于其中微孔芯片在捕获细胞之后仅在其微孔中含有液体而在其整个表面上不含有液体的应用特别有用。该实施方案可能对于涉及将特定化学品或流体递送至个体微孔中而没有其他微孔的交叉污染的应用也是有用的。在该实施方案中，当使用移液器通过注射进行洗涤步骤时，从下面提供的磁力可以将细胞保持在适当位置。

在一个实施方案中，所使用的移液器的尖端大于微孔的入口直径。当以此类相同的流体接触大部分微孔的方式将微孔芯片放置在流体中时，该实施方案可能特别有用。然后，可以将由与移液器连接的泵产生的流体吸取配置为足以提取微孔的内容物而不会扰乱其他微孔的内容物。在一种情况下，可以将流体压力和微孔之间的间隔配置为足够大以防止此类扰动。可替代地，可以控制间隔和流体吸取压力以使得从多个相邻微孔提取而不会扰乱其他微孔。

在一个实施方案中，配置泵或注射器以产生从移液器的尖端延伸而不完全从移液器的尖端分离的微滴。然后可以将该微滴用于在移液器和微孔内的液体之间形成流体连接。然后，该流体连接可以借助泵或通过管与移液器连接的注射器能够将细胞‘吸’出微孔。这种实施方案可能对于其中微孔芯片不是整体上放置在流体中但在其微孔中含有液体的应用特别有用。

在一个实施方案中，通过微量移液器接近微孔芯片，所述微量移液器是弯曲的以防止从上方阻碍微孔芯片的微观观察。

在一个实施方案中，调整从微孔芯片下方施加的磁场，而不是完全关闭磁场，达到将允许使用移液提取磁化实体的水平。

图6是示出使用如本文所述的细胞分析系统捕获细胞的过程600的实例的流程图。简而言之，过程600包括将含有磁化细胞的流体注入微流体系统中(610)，使用磁体组件向微流体系统的腔室施加可变磁力(620)，调整磁体组件相对于微流体系统的腔室的放置(630)，并分析磁化细胞的光学性质(640)。

更详细地，过程600可以包括将含有磁化细胞的流体注入微流体系统中(610)。例如，可以使用流体控制装置120将包括靶细胞202a的样品流体注入微孔芯片110的微流体腔室中。

过程600可以包括使用磁体组件向微流体系统的腔室施加可变磁力(620)。例如，可以将磁体130用于在微孔芯片110下方产生吸引力212，使得靶细胞202a被捕获在微孔芯片110的表面上的微孔内。在一些情况下，可以调节吸引力212的量级以增加或减小施加在靶细胞202a上的力。

过程600可以包括调整磁体组件相对于微流体系统的腔室的放置(630)。例如，可以将磁体130沿着微孔芯片110的表面的x轴和y轴移动，使得将微孔芯片110的不同部分暴露于吸引力212。如先前所述，可以以某些模式(例如，圆形、Z字形、光栅或S形)进行调节，以提高微孔的捕获效率。

过程600可以包括分析磁化细胞的光学性质(640)。例如，可以将分析仪装置140用于评估或分析在微孔芯片110的微孔中捕获的靶细胞202a。在一些情况下，分析仪装置140可以是使用各种类型的成像模态以收集如本文所述的捕获的细胞的图像的显微镜。

实施例

在以下实施例中进一步描述本发明，这些实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。

实施例1–磁珠捕获装置

在一个实施例中，微孔芯片是具有微孔阵列的硅晶片，所述微孔的直径为8微米并且深度为大约10微米，其是使用蚀刻技术形成的。在该实施例中，没有测试细胞，但是测试了用于荧光测量的与生物素化的FITC缀合的2.8微米链霉亲和素包被的磁珠作为概念验证。将PDMS间隔体放置在微孔芯片周围，以便形成可容纳约200微升流体的样品池(即，不使用封闭的流体腔室)。

在初步实验期间，首先使用微量移液器将含有50微升珠悬浮液(大约350,000个磁珠)的200微升磷酸盐缓冲盐水-吐温(PBST)缓冲液作为微滴放置在微孔芯片上。然后在微孔芯片下方扫掠磁体以将磁珠捕获到8微米微孔中。然后将微孔芯片置于明场显微镜下方，并使用荧光显微镜分析微珠芯片上磁珠的捕获效率。

在磁体扫掠之前捕获相同微孔阵列的第一明场图像和荧光图像，并利用其作为微孔内的细胞捕获的对照测量。在进行磁体扫掠之后，捕获微孔阵列的第二明场图像和荧光图像以确定吸引力对微孔的捕获效率的影响。捕获图像的比较表明磁体扫掠提高了微孔的捕获效率(由微孔阵列内检测到的增加的荧光表示)，这表明微孔捕获了更多数量的磁珠。

实施例2–硅微孔中的KB细胞的捕获

在该实施例中，微孔芯片是具有微孔阵列的硅晶片，所述微孔的直径为30微米并且深度为大约40微米，具有使用光刻和深度反应离子蚀刻技术形成的200微米的中心-至-中心间隔。用含有BSA(牛血清白蛋白)的PBST缓冲液封闭微孔芯片表面，以防止或最小化细胞粘附到芯片表面或微孔上。

进行可行性实验以验证将磁化细胞引导入微孔中以及使用移液器提取它们的能力。以围绕含有微孔的区域的方式将PDMS间隔体/框架放置在微孔芯片上。PDMS框架用于计划的“样品池”，其能够保持200微升的最大流体体积。将具有预先用抗叶酸受体抗体缀合的磁珠和FITC缀合的叶酸同时标记的大约1000个KB细胞(培养的肿瘤细胞)的100微升样品流体引入样品池中。(珠是1微米链霉亲和素包被的超顺磁珠，其与抗叶酸受体的生物素化抗体缀合)。

然后将磁体放置在微流体腔室下方，并从微孔芯片的一侧扫掠过到微孔芯片的相对侧约10秒，以在磁体扫掠期间跨微孔芯片施加吸引力以将培养的肿瘤细胞捕获到微孔芯片的微孔中。然后使用明场以及荧光显微术两者对微孔芯片进行成像以用于分析。可以将磁体从一侧扫掠到一侧，但也可以以圆形或正弦曲线模式移动。

图7A和7B是表示显示该可行性实验结果的照片。图7A显示了具有有细胞的一些微孔以及一些空微孔的微孔芯片的一部分的明场图像。由于照射光的散射和吸收，在其中具有细胞的微孔看起来更暗，而由于照射光的反射，空微孔在其中心具有亮点。

在实验中，通过荧光显微术验证了细胞的存在(图7B)。图7B清楚地显示系统能够将细胞引导到微孔中以及清除表面(微孔之间的区域)的磁化细胞。实际上，人们可以在图7B中注意到，一块在性质上不太可能是有磁性的污垢保留在表面上，因为它没有被磁场移动。在图7B中还可以看到一些微孔比其他微孔更亮。这是因为在该特定实验中，微孔的尺寸大于靶向细胞的尺寸(KB细胞的尺寸为10-15微米)，这导致一些微孔保留比其他微孔更多的细胞。该实验证实，具有足够尺寸的微孔可以保留多个细胞和细胞簇，并且表明可能需要使用更小的微孔来捕获单细胞。

在一些实施方案中，可以将图7A-B中示出的这种光学效应用于快速识别空微孔以及容纳细胞的那些微孔。照片中明微孔和暗微孔之间的明显差异可以减少使用高放大率或高分辨率显微术来鉴定细胞捕获的需要。这是因为通常可以在较低放大率(例如，20x、10x、5x光学变焦或更低放大率)下检测到区别。

在一些实施方案中，将一种或多种计算机算法用于识别微孔中一个或多个靶标实体的存在，确定所鉴定的靶标实体的位置，并为微孔芯片的每个微孔分配特定坐标。在这些实施方案中，将位置和坐标信息用于以基本上自动的计算机实现的方式(例如，没有人为干预)提取微孔的内容物(例如，捕获的靶标实体)。例如，可以使用驱动装置将移液器移动到特定微孔的坐标位置，然后操作移液器以提取特定微孔的内容物，而无需使用显微术来可视化和/或鉴定特定微孔的位置。另外，也可以将微孔的指定坐标位置用于标准化提取技术，使得可以使用指定的坐标位置在不同的实验实验室中检查特定微孔芯片的内容物。

图8是表示显示实验结果的照片，其中通过使用微量移液器提取位于图7A-B中描绘的位于芯片区域中的细胞。在该实验期间，用由如上所讨论的PDMS框架保留的流体样品覆盖微孔芯片的表面。使用具有弯曲尖端的微量移液器使得能够从上方对该步骤进行微观观察。将移液器尖端连接到注射器上，该注射器固定在其运动可以被精确控制的平移台上。

图8显示透明弯曲移液器与微孔对齐。移液器的尖端直径约为50至60微米。在该实验中，通过微量移液器施加吸取来提取在图8中移液器所对准的微孔的内容物。然后，依次提取该微孔紧邻左侧的两个微孔的内容物。图8显示这三个微孔不是空的。注意，不旨在用于提取的微孔没有被显著扰动，并且它们的内容物仍然在相应的微孔中。在该图中，看起来具有深色的微孔被鉴定为捕获细胞的微孔，而看起来清澈的微孔代表空微孔。

实施例3–细胞提取技术的比较

图9A-D表示显示了比较在使用和不使用微孔的情况下的细胞提取的实验结果的照片。图9A和9B示出了平坦表面(例如，没有微孔)上的单细胞的提取步骤的明场图像，并且图9C和9D示出了已经捕获在微孔中的单细胞的提取步骤的明场图像。使用微量移液器进行提取步骤以施加吸取力来提取目标细胞。

图9A和9C描绘了在提取步骤开始之前(例如，在施加吸取力以验证微量移液器的尖端附近存在细胞之前)捕获的图像，并且图9B和9E描绘了在提取步骤完成之后(例如，在施加吸取力以鉴定提取细胞对提取的细胞附近的环境的影响之后)捕获的图像。

图9A和9B中所描绘的结果表明，在第一提取步骤期间，由微量移液器施加的吸取力最终捕获了显微镜视场内的目标细胞以及附近细胞。这表明这种类型的提取步骤将使选择性地靶向和捕获特定细胞而不捕获附近细胞具有挑战性。相反，图9C和9D中所描绘的结果说明，当从微孔中提取捕获的目标细胞时，不捕获位于附近微孔中的细胞并保留在它们的位置。例如，图9C表示在施加吸取力之前，细胞最初存在于微孔902中。最终在提取操作期间提取在微孔902中捕获的细胞，指示图9D中的空微孔902。图9D中所描绘的结果进一步表明，由于施加吸取力以提取微孔902中捕获的细胞，未捕获微孔906、908、910中存在的细胞。

实施例4–荧光引导的细胞提取

进行实验以验证是否可以从微孔芯片中提取单细胞而不扰动在附近微孔中捕获的细胞。在该实验中，芯片包括捕获不同种类的荧光标记细胞(磁化KB细胞和磁化MCF-7细胞)的微孔。将产生的荧光信号用作在微孔中捕获的细胞的指示物，并且在使用微量移液器施加吸取力之后视觉确认已从微孔中提取细胞。用发射绿色荧光信号的暴露抗叶酸受体抗体的FITC标记的磁珠标记KB细胞。用发射红色荧光信号的暴露抗EpCAM抗体的PE标记的磁珠标记MCF-7细胞。

在单个KB细胞(绿色)的提取步骤期间捕获荧光图像以确定提取是否影响在附近微孔中捕获的细胞。在提取之前捕获第一组图像以使用由KB细胞产生的绿色荧光信号来验证它在微孔中被捕获。也将这些图像用于验证MCF-7细胞(红色)即使在附近的微孔中也未被捕获。在提取步骤期间捕获第二组图像，以鉴定KB细胞在暴露于由放置在其中捕获KB细胞的微孔上方的微量移液器施加的吸取力之后的移动。在完成提取步骤之后，捕获第三组图像以表征提取步骤对附近细胞(诸如MCF-7细胞)的影响。

来自所收集的图像的结果表明，在其中捕获细胞的微孔上方施加吸取力之后，由微量移液器施加的吸取力使得KB细胞在微量移液器的尖端内行进。一旦提取操作完成，结果表明MCF-7细胞仍然存在于其位置(基于比较在提取步骤之前和之后收集的图像中存在的荧光信号而确定)。这些结果说明了使用微孔芯片将稀有细胞群分离至个体微孔中的益处，其中流体样品中的细胞数量显著小于微孔芯片表面上的微孔数量。

实施例5–细胞群的高通量分析

进行实验以确定在单个基板内具有多个细胞群对微孔芯片表面上微孔捕获能力的影响。基板包括两种荧光标记的细胞(磁化的KB细胞和磁化的MCF-7细胞)。用发射绿色荧光信号的暴露抗叶酸受体抗体的FITC标记的磁珠标记KB细胞。用发射红色荧光信号的暴露抗EpCAM抗体的PE标记的磁珠标记MCF-7细胞。

在实验期间，将微孔芯片置于封闭的流体腔室中，并且最初通过层式流体流动将混合物分布在微孔上方。然后停止流动并进行磁性扫掠以将磁化的细胞群吸引向微孔芯片的表面以诱导微孔内的细胞捕获。然后捕获微孔芯片表面的荧光图像，以基于微孔内存在的荧光信号鉴定细胞捕获。为了确定是否将细胞捕获定位于微孔芯片的特定区域，捕获各种视场并连接在一起以重建高视场图像，其共同表示微孔芯片的表面的大区域。

结果表明，在微孔芯片的微孔中捕获了超过1000个细胞。结果还表明两种类型的细胞(例如，KB细胞和MCF-7细胞)被捕获在微孔内，表明不同细胞类型的存在不会引起微孔内的优先细胞捕获。

实施例6–多个靶标分子检测

在另一个实施例中，可以将微孔芯片用于检测和分析在单个微流体腔室内的多个靶标实体(诸如不同类型的病毒或分子)。在该实施例中，可以将微孔芯片110构造成具有微孔排列图案，该微孔排列图案包括微孔芯片110的表面上的一组微孔入口尺寸，所述微孔入口尺寸对应于各自与不同靶标实体相缔合的一组个体磁珠。

例如，最初可以将每组磁珠(其中每组具有不同的尺寸)官能化以识别一种类型的靶标分子并特异性(例如，使用抗体)与一种类型的靶标分子结合。然后可以将磁珠暴露于含有不同类型靶标分子的流体样品。在磁珠已经与相应的靶标分子结合之后，可以将流体样品引入微孔芯片110的微流体腔室中，并且可以使用对应于各种磁珠的不同微孔入口尺寸来根据磁珠尺寸分离捕获的靶标分子(例如，较小的磁珠具有相应的在上游捕获的靶标实体)。然后，可以将微孔芯片110与单色荧光检测一起使用，以使用单色荧光显微镜或廉价的平板读取器获得读出。在该实施方案中，可以检测的靶标实体的类型包括DNA、RNA、蛋白质、抗体、酶、病毒、细胞外囊泡、外泌体、核小体、小分子和肽。

实施例7–使用环形磁体解聚磁化的细胞

图10A-C表示显示检查在微孔芯片的表面上使用环形磁体解聚和/或分离靶标实体的簇的实验结果的照片。图10A-C示出了解聚步骤的明场图像，其中使用放置在微孔芯片下方的环形磁体对微孔芯片表面上的细胞施加向外的磁力。

图10A描绘了用EpCAM暴露的超顺磁珠标记并被放置在微孔芯片的表面上的MCF-7细胞(在图中被标记为“a-m”)的图像。如图10B中所描绘的，使用环形磁体施加向外的磁力，这导致对细胞的分散效应。如所示，由于由环形磁体提供的向外磁力，细胞向外移动远离中心点。图10C描绘了在解聚步骤完成之后的图像。如所示，微孔芯片表面上的细胞完全从显微镜的视场中被移除。这些结果表明，可以将使用环形磁体施加的向外磁力用于防止靶标实体的非计划聚集或群集。

其它实施方案

已经描述了许多实施方案。然而，应该理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种修改。另外，图中所描绘的逻辑流程不需要所示的特定顺序或相继次序来实现期望的结果。另外，可以从所描述的流程中提供其他步骤，或者可以从所描述的流程中除去步骤，并且可以将其他组件添加到所描述的系统或从所描述系统中移除。因此，其他实施方案在以下权利要求的范围内。

Claims (40)

1.用于捕获有磁性的或被制成有磁性的第一靶标实体和第二靶标实体的微孔阵列装置，其中所述第二靶标实体比所述第一靶标实体大至少10%，所述装置包含：

基板，所述基板包括表面，所述表面包含排列在所述表面上的两个或更多个阵列中的多个微孔；

其中将微孔的第一阵列排列在所述表面上的第一位置处，所述第一位置处靠近所述表面的第一端；

其中将微孔的第二阵列排列在所述表面上的第二位置处，所述第二位置处比所述第一位置处更远离所述表面的第一端，其中当将液体样品添加到所述基板上并使其流动时，所述液体样品将首先流经所述第一阵列，然后以相继次序流经所述第二阵列；

其中在所述第一阵列中的微孔各自具有允许仅一个第一靶标实体进入所述微孔中且不允许所述第二靶标实体进入的尺寸，并且其中在所述第一阵列中的每个微孔具有大致相同的尺寸；

其中所述第二阵列中的微孔各自具有比所述第一阵列中的微孔的尺寸大至少10%并且允许仅一个第二靶标实体进入的尺寸，并且其中给定的随后阵列中的微孔具有比先前相邻阵列中的微孔的尺寸大至少10%的尺寸，以及在所述给定的随后阵列中的每个微孔具有大致相同的尺寸；以及

其中所述多个微孔全部具有以下尺寸：其足以使得在靶标实体进入所述微孔之后，当流体流经所述表面时、或当向所述微孔中的所述靶标实体施加磁力时、或流体流动并同时施加磁力时，至少一个靶标实体保留在微孔内。

2.如权利要求1所述的微孔阵列装置，其还包含与所述表面相邻排列的磁体组件，其中将所述磁体组件排列和配置为产生以下磁力：其足以在靶标实体进入所述微孔之后，将所述靶标实体吸引到所述微孔的阵列中，并且当流体流经所述表面时足以保持至少一个靶标实体在至少一个所述微孔中。

3.如权利要求2所述的微孔阵列装置，其中将所述磁体组件可调节地与所述表面相邻排列，其中将所述磁体组件排列和配置为产生足以在将所述磁体移动到与所述表面相邻时保持至少一个靶标实体在至少一个所述微孔中的磁力。

4.如权利要求1至3中任一项所述的微孔阵列装置，其中所述基板是径向对称的，并且所述微孔的第一阵列包含围绕没有微孔的所述基板的中心位置排列的微孔的一个或多个同心圆，并且所述微孔的第二阵列包含排列得比所述微孔的第一阵列更远离所述基板的中心位置的微孔的一个或多个同心圆。

5.如权利要求4所述的微孔阵列装置，其中所述基板是圆形或八边形。

6.如权利要求1所述的微孔阵列装置，其中所述多个微孔的尺寸是所述微孔的深度，所述尺寸足以使得在靶标实体进入所述微孔后，当流体流经所述表面时，至少一个靶标实体保留在微孔内。

7.用于捕获有磁性的或者被制成有磁性的第一靶标实体和第二靶标实体的微流体系统，其中所述第二靶标实体比所述第一靶标实体大至少10%，所述系统包含：

主体，其包含具有入口、出口和被配置为容纳前述权利要求中任一项所述的微孔阵列装置的腔室；和

磁体组件，其被可调节地与所述表面相邻排列，其中将所述磁体组件排列和配置为产生以下磁力：其足以沿着所述表面移动其尺寸适合进入所述第一阵列中的所述微孔的靶标实体并且进入所述第一阵列中的所述微孔中，和足以沿着所述表面移动更大的靶标实体并且进入所述微孔的第二阵列中，以及足以使得在靶标实体进入所述微孔之后，当流体流经所述表面时、或当向所述靶标实体施加磁力时、或流体流动并同时施加所述磁力时，至少一个靶标实体保留在微孔内。

8.如权利要求7所述的微流体系统，其中所述微流体系统还包含被配置为分析所述靶标实体的光学性质的检测器。

9.如权利要求7或8所述的微流体系统，其中将所述磁体组件配置为相对于所述表面沿着两个轴移动。

10.如权利要求7或8所述的微流体系统，其中在所述腔室上方的所述主体的一部分可从所述微流体系统的主体拆卸。

11.如权利要求7或8所述的微流体系统，其中所述微孔阵列装置是所述主体的整体部分，并且所述微孔阵列装置的表面形成所述腔室的一个壁。

12.如权利要求11所述的微流体系统，其中所述腔室的一个壁为所述腔室的底板。

13.如权利要求7或8所述的微流体系统，其还包含：

泵，其用于使所述流体以足以允许靶标实体到达所述微孔阵列的流动速率，从所述腔室的入口流到所述腔室的出口。

14.如权利要求7或8所述的微流体系统，其还包含：

靶标实体提取模块，其被配置为从多个微孔的至少一个中提取靶标实体；和

第二磁体组件，将其相对于与所述多个微孔相对的所述靶标实体提取模块可调节地排列，其中将所述第二磁体组件配置为产生以下可变磁力：其足以吸引有磁性的或者被制成有磁性的靶标实体从微孔进入所述靶标实体提取模块的入口通道。

15.如权利要求14所述的微流体系统，其中：

所述靶标实体提取模块包含微量移液器，和

所述第二磁体组件包含被放置在所述微量移液器尖端上的磁环。

16.如权利要求7或8所述的微流体系统，其中所述表面包含：

基底层；和

微孔层，其被排列在所述基底层的顶部并且接触所述基底层，其中所述微孔层包含多个通孔，其中所述多个通孔形成所述多个微孔。

17.如权利要求16所述的微流体系统，其中将所述基底层用一个或多个结合部分官能化，以增强所述靶标实体与基底层的结合。

18.如权利要求7或8所述的微流体系统，其中所述微孔的尺寸是直径、横截面积、深度、形状和总体积中的任一个或多个。

19.如权利要求7或8所述的微流体系统，其中在阵列之间变化的所述微孔的尺寸是直径、体积或横截面积，而所述多个微孔的深度在所有阵列中大致相同。

20.如权利要求7或8所述的微流体系统，其还包含一组磁珠，所述磁珠在其表面上包含与所述靶标实体表面上的分子特异性结合的一个或多个结合部分。

21.如权利要求7所述的微流体系统，其中所述多个微孔的尺寸是所述微孔的深度，所述尺寸足以使得在靶标实体进入所述微孔后，当流体流经所述表面时，至少一个靶标实体保留在微孔内。

22.捕获靶标实体的方法，所述方法包括：

将含有磁性靶标实体的流体样品添加到权利要求7-21中任一项所述的微流体系统的表面上；

使用被可调节地排列在所述表面下方的磁体组件向所述腔室施加可变磁力；

调整所述磁体组件相对于所述表面的位置，使得所施加的第一可变磁力将所述靶标实体吸引到所述微孔的第一和/或第二阵列中；和

在所述靶标实体被吸引到所述微孔的第一和/或第二阵列中之后：

进一步使用被可调节地排列在所述表面下方的磁体组件向所述腔室施加可变磁力；

进一步调整所述磁体组件相对于所述表面的位置，使得进一步所施加的可变磁力将另外的靶标实体吸引到所述微孔的第一和/或第二阵列中。

23.如权利要求22所述的方法，其还包括使用检测器组件分析所述靶标实体的性质。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述性质包括所述靶标实体内含有的分子、DNA、RNA、蛋白质、小分子和酶，或在所述靶标实体表面上含有的分子标志物，或从所述靶标实体分泌的分子的数量、尺寸、序列和/或构象。

25.如权利要求22所述的方法，其还包括：

在调整所述磁体组件相对于所述表面的位置之后，拆卸所述微流体系统的主体的盖子；和

从多个微孔的至少一个中提取所述靶标实体。

26.如权利要求25所述的方法，其中从所述多个微孔的至少一个中提取所述靶标实体包括将所述提取的靶标实体输送到所述微流体系统外的容器。

27.如权利要求23或24所述的方法，其中所述分析包括检测由所述靶标实体发射的荧光。

28.如权利要求22至26中任一项所述的方法，其中调整所述磁体组件的位置包括使所述磁体组件相对于所述表面沿至少一个轴移动。

29.如权利要求27所述的方法，其中调整所述磁体组件的位置包括使所述磁体组件相对于所述表面沿至少一个轴移动。

30.如权利要求22所述的方法，其包括：

在调整所述磁体组件相对于所述表面的放置之后，向所述微流体装置提供湍流；和

从所述多个微孔的至少一个中提取靶标实体。

31.如权利要求22所述的方法，其中调整所述磁体组件相对于所述表面的放置包括使所述磁体组件以一定模式移动，所述模式使得所述靶标实体沿着所述表面遵循所述模式。

32.如权利要求22所述的方法，其中将所述含有磁性靶标实体的流体样品添加到所述腔室中包括使所述流体样品经过包含所述多个微孔的表面从入口流到出口。

33.如权利要求22所述的方法，其中将所述含有磁性靶标实体的流体样品添加到所述腔室中包括将所述流体样品分配到包含所述多个微孔的腔室的表面上。

34.如权利要求22所述的方法，其中当将所述流体样品置入微流体腔室的腔室中时，向所述腔室施加所述可变磁力。

35.用于捕获有磁性或被制成有磁性的第一靶标实体和第二靶标的微流体系统，其中所述第二靶标实体比所述第一靶标实体大至少10%，所述系统包含：

主体，其包含具有入口、出口和从所述入口延伸到所述出口的表面的腔室，其中所述表面包含排列在所述表面上的两个或更多个阵列中的多个微孔，

其中将微孔的第一阵列排列在所述表面上的第一位置处，所述第一位置处靠近所述表面的第一端，

其中将微孔的第二阵列排列在所述表面上的第二位置处，所述第二位置处比所述第一位置处更远离所述表面的第一端，

其中当将液体样品添加到所述主体上并使其流动时，所述液体样品将首先流经所述第一阵列，然后以相继次序流经所述第二阵列；和

其中所述多个微孔全部具有为至少所述第一靶标实体的尺寸的深度，使得在所述第一靶标实体进入所述微孔之后，当流体流过所述腔室时，至少一个第一靶标实体保留在微孔内；和

磁体组件，其被可调节地与所述表面相邻排列，其中将所述磁体组件排列和配置为产生以下磁力：其足以沿着所述表面移动其尺寸适合进入所述第一阵列中的所述微孔的靶标实体并且进入所述第一阵列中的所述微孔中，和足以沿着所述表面移动更大的靶标实体并且进入所述微孔的第二阵列中，以及足以在靶标实体进入所述微孔之后，将所述靶标实体吸引到所述微孔的阵列中，当沿着所述表面移动磁体时，至少一个靶标实体保留在所述微孔中。

36.如权利要求35所述的微流体系统，其中所述微流体系统还包含被配置为分析所述靶标实体的光学性质的检测器。

37.如权利要求35或36所述的微流体系统，其中将所述磁体组件配置为相对于所述表面沿着至少一个轴移动。

38.如权利要求35或36所述的微流体系统，其中所述多个微孔的深度允许通过所述腔室中的液体湍流将所述靶标实体运载到所述多个微孔外。

39.如权利要求35或36所述的微流体系统，其中所述多个微孔被充分间隔开，使得当在第二微孔附近通过移液器施加吸取力时，在与所述第二微孔相邻的第一微孔中的靶标实体保留在所述第一微孔内。

40.如权利要求35或36所述的微流体系统，其中在所述腔室上方的所述主体的一部分可从所述微流体系统的主体拆卸，使得一旦拆卸所述主体的该部分，所述多个微孔的至少一部分可被微量移液器的尖端接近。

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