WO2014017116A1 - マイクロウェルアレイチップおよび細胞の回収方法 - Google Patents

マイクロウェルアレイチップおよび細胞の回収方法 Download PDF

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WO2014017116A1
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Definitions

  • the present invention relates to a microwell array chip, a fluorescence observation method for cells contained in the chip, and a cell collection method using the chip.
  • Patent Documents 1 to 3 The inventor has developed various cell chips so far and has also developed an antibody screening system using these chips.
  • it can be used for screening cells by observing fluorescence such as fluorescently labeled antigen that binds to proteins such as antibodies on the chip surface and can accommodate cells in a small amount of sample efficiently in a short time.
  • fluorescence such as fluorescently labeled antigen that binds to proteins such as antibodies on the chip surface
  • a cell chip suitable for the same provided a cell chip suitable for the same (patent document 4).
  • Patent Reference 1 Japanese Patent No. 4069171
  • Patent Reference 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2006-122017
  • Patent Reference 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2008-303411
  • Patent Reference 4 Japanese Patent No. 4951144
  • Patent Documents 1 to 4 The entire description of Patent Documents 1 to 4 is specifically incorporated herein by reference.
  • the chip described in Patent Document 4 Since the chip described in Patent Document 4 has a light shielding layer for suppressing autofluorescence from the material constituting the microwell layer, it is used from the bottom side of the chip using an inverted microscope generally used in the medical industry. There was a problem that fluorescence observation of cells in the microwell could not be performed.
  • an object of the present invention is to provide a chip that has a function of forcibly arranging cells into a microwell by magnetism and that can observe fluorescence of cells in the microwell from the bottom side of the chip.
  • microwell layer On at least one main surface of a substrate having translucency;
  • the plurality of microwells included in the microwell layer have a shape and dimensions that accommodate only one living cell in one microwell,
  • the microwell has a bottom surface that is harmless to the living cells and has a translucent barrier member surface, Having a magnetic member between the bottom surface of the barrier member and the surface of the substrate;
  • the magnetic member has one or more openings when the bottom surface of the microwell is viewed in plan view, Microwell array chip.
  • microwell array chip according to [1] or [2], wherein a portion from the bottom surface of the microwell made of the barrier member to the bottom surface of the substrate through the opening of the magnetic member has translucency.
  • the base electrode layer is provided between the substrate and the microwell layer, and the magnetic member is any one of [1] to [4] positioned between the base electrode layer and the microwell layer. 2.
  • a microwell array chip according to 1.
  • [9] [1] to [8] A method for observing the contained specimen cell by accommodating the specimen cell in at least a part of the microwell of the microwell array according to any one of [1] to [8], Attaching magnetic beads to the sample cells; Supplying specimen cells with magnetic beads to the surface of the microwell layer of the microwell array chip, containing one cell in one microwell, and fluorescence emitted from the cells contained in the microwell Observing through the opening of the magnetic member from the bottom side of the substrate, Said method. [10] The method according to [9], wherein the fluorescence observation from the substrate bottom side is performed using an inverted microscope.
  • ADVANTAGE OF THE INVENTION it has the function to perform the forced arrangement
  • the target cell can be observed and specified using, for example, an inverted microscope.
  • a barrier member is interposed between the magnetic member and the microwell, so that the magnetic material is eluted when cells stimulated in the microwell, for example, when the pH of the well changes, causing damage to the cells. None give.
  • FIG. 1 is an explanatory perspective view of an example of the microwell array chip of the present invention.
  • FIG. 2 shows a cross-sectional view of an example of the microwell array chip of the present invention.
  • FIG. 3 is a plan view of a microwell array chip in which 25 ⁇ 25 microwells are regarded as one cluster and three clusters are arranged vertically and horizontally.
  • FIG. 4 shows an example of the shape of the magnetic member.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram of dimensions of the magnetic member and the like.
  • FIG. 6 is an explanatory diagram of the method for manufacturing the microwell array chip of the present invention.
  • FIG. 1 is an explanatory perspective view of an example of the microwell array chip of the present invention.
  • FIG. 2 shows a cross-sectional view of an example of the microwell array chip of the present invention.
  • FIG. 3 is a plan view of a microwell array chip in which 25 ⁇ 25 microwells are regarded as one cluster and three clusters are arranged vertically and
  • FIG. 7 is an explanatory view showing that the magnetic flux can be converged into the microwell by a magnetic member (localized only on the bottom of the microwell) provided on the bottom of the microwell.
  • FIG. 8 is an explanatory diagram of a method for manufacturing the microwell array chip of the first embodiment.
  • FIG. 9 is an explanatory diagram of a method for manufacturing the microwell array chip of the second embodiment.
  • FIG. 10 is an explanatory diagram of a method for manufacturing the microwell array chip of the third embodiment.
  • FIG. 11 (a) shows a fluorescent well accommodated in a microwell array chip according to the present invention and observed from the back side of the chip.
  • FIG. 11 (b) shows an observation with the fluorescent dye Cy3-attached antibody bound to the surface of the microwell array chip according to the present invention from the back side of the chip.
  • the microwell array chip of the present invention has a microwell layer on at least one main surface of a substrate having translucency,
  • the plurality of microwells included in the microwell layer have a shape and dimensions that accommodate only one living cell in one microwell,
  • the microwell has a bottom surface that is harmless to the living cells and has a translucent barrier member surface, Having a magnetic member between the bottom surface of the barrier member and the surface of the substrate;
  • the magnetic member has one or more openings when the bottom surface of the microwell is viewed in plan.
  • FIG. 1 is a perspective explanatory view of an example of the microwell array chip of the present invention
  • FIG. 2 is a sectional view thereof.
  • the substrate used for the microwell array chip of the present invention is a substrate having translucency.
  • the translucency means a property capable of transmitting fluorescence generated from a cell accommodated in a microwell or its periphery. Fluorescence usually has an emission wavelength peak in the wavelength range of 400 to 700 nm, which is in the visible light region, and thus the substrate having translucency has good transmittance for at least light in the visible light region. It is preferable because it is a substrate.
  • the light-transmitting substrate can be glass, for example, and can be a resin or the like.
  • the resin substrate examples include ABS resin, polycarbonate, COC (cycloolefin copolymer), acrylic, PVC, polystyrene, polyethylene, polyvinyl acetate, PET (polyethylene terephthalate), and PEN (polyethylene naphthalate).
  • the substrate does not emit autofluorescence or is weak even if emitted. It is appropriate to use a material that does not interfere with the fluorescence observation. Quartz glass can be mentioned as a material that has translucency and does not emit autofluorescence at all. Examples of materials that have weak autofluorescence and that do not hinder the fluorescence observation include low fluorescent glass, acrylic resin, and COC (cycloolefin copolymer).
  • the thickness and shape of the substrate are not particularly limited, and can be appropriately determined in consideration of the manner in which the chip is used.
  • the microwell array chip of the present invention has a microwell layer on at least one main surface of a light-transmitting substrate. In FIGS. 1 and 2, it is 2 g.
  • the microwell layer has a plurality of microwells 2h, and each microwell has a shape and size that accommodates only one living cell in one microwell.
  • the biological cell is not particularly limited as long as it is a cell whose activity state or the like is to be detected by fluorescence observation.
  • biological cells include lymphocytes, nucleated red blood cells, cancer cells, stem cells, and the like.
  • lymphocytes for example, antigen-specific lymphocytes can be detected by fluorescence observation in units of one by using the microwell array chip of the present invention.
  • the plurality of microwells are arranged vertically and horizontally at the same interval, and a marker is provided for each predetermined number of microwells. Furthermore, it may be provided on the main surface of the substrate in groups for each predetermined number of microwells.
  • FIG. 3 shows a plan view of a microwell array chip in which 25 ⁇ 25 microwells are defined as one cluster and three clusters are arranged vertically and horizontally.
  • the number of microwells constituting the cluster and the number of clusters arranged are not particularly limited, and can be, for example, 25 ⁇ 25 well / cluster or 10 ⁇ 10 cluster.
  • the number of microwells constituting one microwell group is not particularly limited, but can be, for example, in the range of 10 to 10,000.
  • the shape and dimensions of the microwell are not particularly limited, but the shape of the microwell can be, for example, a cylindrical shape.
  • a polyhedron composed of a plurality of surfaces (for example, a rectangular parallelepiped, a hexagonal column) , Octagonal prism, etc.), inverted cone, inverted pyramid (inverted triangular pyramid, inverted quadrangular pyramid, inverted pentagonal pyramid, inverted hexagonal pyramid, inverted polygonal pyramid with a heptagon or more), etc.
  • the shape may be a combination of two or more of these shapes. For example, some can be cylindrical and the rest can be inverted cones.
  • the bottom surface is the opening of the microwell, but a shape obtained by cutting a part from the top of the inverted cone shape or inverted pyramid shape (in this case, the bottom of the microwell is flat) Can also be).
  • the bottom of the microwell is usually flat, but it can be curved (convex or concave).
  • the bottom of the microwell can be curved as in the case of a shape obtained by cutting a part from the top of an inverted cone or inverted pyramid.
  • the shape and dimensions of the microwell are appropriately determined so that one living cell is accommodated in one microwell in consideration of the type of living cells to be accommodated in the microwell (such as the shape and dimensions of the living cells). It is determined.
  • the diameter of the largest circle inscribed in the planar shape of the microwell is 0.5 to 0.5 mm the diameter of the biological cell to be accommodated in the microwell.
  • a range of 2 times, preferably 0.8 to 1.9 times, more preferably 0.8 to 1.8 times is appropriate.
  • the depth of the microwell may be in the range of 0.5 to 4 times, preferably in the range of 0.8 to 1.9 times, more preferably in the range of 0.8 to 1.8 times the diameter of the living cells to be accommodated in the microwell. Is appropriate.
  • the size can be, for example, 3 to 100 ⁇ m in diameter, and when the living cell is a B lymphocyte, the diameter is preferably 4 to 15 ⁇ m.
  • the depth can be, for example, 3 to 100 ⁇ m.
  • the living cell is a B lymphocyte, the depth can be preferably 4 to 40 ⁇ m.
  • the size of the microwell is appropriately determined in consideration of a suitable ratio of the size of the microwell to the diameter of the living cell to be accommodated in the microwell as described above.
  • the number of microwells that one microwell array chip has is not particularly limited, but when the living cells are lymphocytes, about 500 when the frequency of antigen-specific lymphocytes is from 1 to 10 5 more. From the viewpoint of being, it can be in the range of, for example, 2,000 to 1,000,000 per cm 2 .
  • the microwell layer can be made of, for example, a resin.
  • a resin for example, a photosensitive resin or a thermoplastic resin can be used.
  • the photosensitive resin or thermoplastic resin like the substrate material, emits no or no autofluorescence from the viewpoint of providing a chip capable of observing fluorescence of cells in the microwell from the bottom side of the chip. It is appropriate to use a material that is weak and does not interfere with the fluorescence observation. From such a viewpoint, the microwell layer is preferably made of, for example, a silicone resin, an acrylic resin, or the like.
  • the barrier member constitutes at least the bottom surface of the microwell of the microwell layer.
  • the barrier member can be provided as a layer structure between the microwell layer and the substrate.
  • it can be provided individually corresponding to the bottom surface of each microwell or the magnetic member. In FIG. 2, it is 2e.
  • the barrier member is made of a material that is harmless to living cells and has translucency, and the translucency here is the same as that described for the substrate. Harmless to living cells means that the activity of the cells contained in the microwell whose bottom surface is the barrier member is not substantially affected during use of the chip.
  • barrier member material examples include a silica film, PDMS (polydimethylsiloxane), an acrylic resin, a transparent resist represented by Toray Dow Corning WL-5150 and WL-5153, and the like.
  • the thickness of the barrier member is not particularly limited, and can be appropriately determined as long as the influence on the living cells by the magnetic member can be substantially blocked. Although not limiting, the thickness of the barrier member can be, for example, in the range of 0.1 ⁇ m to 2 mm.
  • the microwell 2h has a magnetic member 2d partially or entirely below the bottom surface via a barrier member 2e.
  • the microwell array chip of the present invention does not have a magnetic member other than the magnetic member.
  • the shape of the magnetic member is not particularly limited except that it has one or more openings when the bottom surface of the microwell is viewed in plan. By having the said opening part, the biological cell accommodated in the microwell can be observed with an inverted microscope.
  • FIG. 4 shows an example of the planar shape of the magnetic member.
  • the illustrated magnetic member has one or two openings.
  • the outer contour can take various shapes such as a circle or a polygon (for example, a triangle or a quadrangle).
  • the outer contour and the shape of the opening may be substantially similar to the shape of the well bottom surface, or may not be similar at all.
  • the fluorescence in the well can be observed from the opposite side of the main surface of the chip as long as one or more openings are present when the bottom surface of the well is viewed in plan.
  • the part is aimed at attracting cells to the center of the opening of the magnetic member by forming a magnetic circuit in the magnetic member in both the facing type and the bridging type.
  • FIG. 5 shows an example of the dimensions of the magnetic member 2d and the like.
  • the diameter D of the microwell 2h is a size that allows just one cell to be accommodated, and the inner periphery of the ring-shaped magnetic member 2d is smaller than the diameter of the microwell 2h, and the magnetic member 2d. Is set to be larger than the diameter D of the microwell 2h.
  • the dimension A is, for example, 1 to 5 micrometers, and is appropriately selected so as not to disturb observation around the well.
  • the dimension B is 1 to less than D / 2 micrometers, and is appropriately selected so as not to obstruct the observation of the object to be inspected accommodated in the microwell.
  • the thickness L dimension of the magnetic ring is a value of A + B.
  • the magnetic member is made of a magnetic material, and examples of the magnetic material include nickel, ferrite, cobalt-based ferromagnetic materials, and the like. Specific examples of the magnetic material will be described later.
  • the thickness of the magnetic member can be appropriately determined according to the magnetic force required for the magnetic member, but is, for example, in the range of 0.1 to 5 ⁇ m.
  • These magnetic members can be produced, for example, by plating. Examples of the plating method include electroplating and electroless plating. In the case of electroplating, a base electrode to be an electrode is necessary, and in the case of electroless plating, it is not necessary. By placing the formed magnetic member in a magnetic field, the magnetic flux density in the magnetic member is increased.
  • the magnetic field is a so-called permanent magnet and is formed of samarium cobalt, neodymium, or the like or an electromagnet.
  • the base electrode layer 2b is provided between the substrate and the microwell layer, and the magnetic member is positioned between the base electrode layer and the microwell layer.
  • the base electrode is located at least between the substrate and the magnetic member.
  • the base electrode is used when a magnetic member is produced by an electroplating process, and is formed by vapor deposition or electroless plating.
  • the film thickness of the base electrode is not particularly limited, but is, for example, in the range of 50 nm to 300 nm, and more preferably 80 nm to 150 nm.
  • a method for manufacturing the microwell array chip of the present invention will be described.
  • a glass substrate is used as the substrate
  • a base electrode 2b is formed on the main surface of the glass substrate 2a by vapor deposition or the like.
  • the base electrode can be selected from materials having good adhesion to glass, such as transparent electrode materials such as ITO and ZnO, and transparent electrode materials such as conductive polymer films such as polyacetylene, polyaniline, and polythiophene.
  • a photosensitive resin 2c such as a positive resist THMR-iP5700 HP, for example, Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd.
  • the photosensitive member can be used to form the magnetic member pattern 2c ′ by photolithography.
  • the photosensitive member 2d is formed on the underlying electrode 2b exposed in the magnetic member pattern 2c ′ by electroplating or the like.
  • the magnetic member 2d is, for example, a nickel film, and can be formed by, for example, a nickel sulfamate bath.
  • the photosensitive resin is removed with, for example, acetone.
  • a transparent resin that becomes the barrier layer 2e such as Toray Dow Corning WL-5351, is applied to a thickness of, for example, about 0.5 to 5 ⁇ m and is sufficiently cured.
  • the barrier layer 2e can be a silica film, and can be formed to a thickness of, for example, about 0.1 to 1 ⁇ m by, for example, sputter deposition.
  • a transparent resin 2f that becomes the microwell layer 2g for example, WL-5351, Toray Dow Corning Co., Ltd.
  • the microwell layer 2e is processed using photolithography technology so as to be formed on the bottom of 2h.
  • Fig. 6 (6) (8)
  • the magnetic member 2d is produced by electroless plating, after pattern formation with a photoresist, sensitizing and activating are performed, and then the photoresist is peeled off and immersed in an electroless plating bath.
  • the magnetic member can be deposited only on the active portion. Further, when electroless Ni—P is deposited in the pattern opening and immersed in an electroless magnetic plating bath, it can be deposited only on the patterned electroless Ni—P plating film.
  • Fig. 6 (7) 9
  • the microwell array chip according to the present invention can be prepared by the above operation.
  • Electroplated films such as Ni-P, Ni-B, Co-Ni-P, Co-P alloys, Ni-Fe alloys, and Co-Ni-Fe alloys exhibit ferromagnetism as magnetic properties.
  • a nickel plating film containing, for example, 8% or more containing phosphorus is non-magnetic, and heat treatment or the like is required to generate magnetism, which is not an optimal technique for the present invention.
  • nickel electroplating is performed in a nickel sulfamate bath with low internal stress.
  • Watt baths mainly composed of nickel sulfate and wood baths mainly composed of nickel chloride are used.
  • the outline of the formation method of the magnetic member in this invention by the nickel sulfamate bath below is shown.
  • A) A substrate having a base electrode for forming a magnetic member is degreased.
  • B) A nickel sulfamate bath is heated to about 50 ° C., and a substrate having a nickel plate as an anode and a base electrode as a cathode is immersed in the bath.
  • a current of about 1 to 100 mA is passed between the electrodes for about 10 seconds to 60 minutes.
  • D) Remove the substrate from the bath and wash with water.
  • E) The plating thickness is 0.5 to 5 microns, preferably between 1 and 3 microns.
  • a watt bath is also used for the nickel electroplating method.
  • the magnetic member can also be formed by electroless plating.
  • Ni-P, Ni-B, Co-Ni-P, Co-P alloys, Ni-Fe alloys, Co-Ni-Fe alloys and the like can be mentioned.
  • Ni-P if the P content is 8% or more, it becomes nonmagnetic in the precipitated state. However, when heat treatment at 300 ° C. or higher is performed, it is magnetized even with a high P content.
  • the electroless nickel plating film can be produced, for example, with a nickel sulfate and sodium hypophosphite bath. By electroless plating, it is possible to perform plating directly on a glass substrate or a resin substrate.
  • the magnetic member of the microwell array chip of the present invention is magnetized, so that a biological sample containing magnetically modified cells can be aspirated and housed, and it can be recovered. Conventional methods can be used as the magnetization method.
  • the microwell array chip of the present invention can have a marking at the opening of the magnetic member.
  • the marking can be composed of letters, numbers, symbols, patterns, or the like that can be used to specify the opening, or a combination thereof, and may be any size or shape that does not hinder light transmission in the opening.
  • the present invention includes a method in which sample cells are accommodated in at least some of the microwells of the microwell array of the present invention, and the accommodated sample cells are observed.
  • This method Attaching magnetic beads to the sample cells; Supplying specimen cells with magnetic beads to the surface of the microwell layer of the microwell array chip, storing one cell in one microwell, and fluorescence emitted from the cells stored in the microwell Observing through the opening of the magnetic member from the bottom side of the substrate, including.
  • a known method can be used as appropriate.
  • a method is known in which magnetic beads are bound to a specimen cell via an antibody that specifically binds to a molecule present on the cell surface, such as a surface antigen.
  • a cell to which a magnetic bead is bound can be obtained by contacting a specimen cell with a magnetic bead on which an antibody specific to the surface molecule is immobilized.
  • the sample cell can be indirectly magnetically labeled by binding an antibody to which an arbitrary labeled molecule is bound to the surface molecule of the sample cell, and then contacting the molecule that binds to the labeling substance with the immobilized magnetic beads. it can.
  • the antibody labeling molecule and the molecule immobilized on the magnetic bead that binds to the antibody may be a combination that specifically binds, and includes a combination of biotin and streptavidin.
  • magnetic beads can be bound by using magnetic beads in which a ligand for a cell surface receptor is bound instead of an antibody and binding to a receptor on the target cell surface.
  • cells can be labeled with magnetic beads by introducing the magnetic beads into the cells instead of the cell surface by phagocytosing the magnetic beads.
  • the magnetic beads used can have a diameter of 10 nm to 10 ⁇ m.
  • the particle shape of the magnetic beads can be spherical or cluster.
  • CD19, CD20, CD21, CD23 etc. can be used for human B lymphocytes, CD38, CD138 for human plasma cells, CD2, CD3 etc. for human T lymphocytes can be used.
  • the cell surface ligand include an antigen that is a ligand for a cell surface antibody that functions as an antigen receptor for B lymphocytes, an MHC / peptide that is a ligand for an antigen receptor for T lymphocytes, and the like.
  • specimen cells such as antigen-specific lymphocytes can be easily accommodated in the microwells, and the specimen cells accommodated in the microwells can be easily used with a label that has been previously given to the specimen cells.
  • Target cells can be selected.
  • the specimen cells with the magnetic beads attached are supplied to the surface of the microwell layer of the microwell array chip, and one cell is accommodated in one microwell.
  • the specimen cells attached with the magnetic beads are supplied to the surface of the microwell layer in a state of being dispersed in, for example, a buffer solution or a culture solution.
  • the concentration of the sample cells in the dispersion is suitably in the range of 0.5 to 1.5 times the number of wells, for example, from the viewpoint of smooth accommodation in the microwells.
  • the operation of supplying the specimen cells to which the magnetic beads are attached to the surface of the microwell layer can be performed at room temperature, or can be performed under cooling or heating.
  • the microwell array chip may be allowed to stand still or an appropriate vibration may be applied during the supply operation of the sample cells to which the magnetic beads are attached to the microwell layer surface.
  • the microwell array chip of the present invention has a magnetic member, the specimen cells attached with the magnetic beads are attracted to the magnetic member at the bottom of the microwell, and the accommodation of the specimen cells into the microwell is promoted.
  • the surface magnetic flux density of the magnetic member is preferably about 100 mT to 500 mT.
  • an external magnet can be used in combination. It is appropriate that the external magnet covers at least a part of the bottom surface of the microwell array chip where the microwell array is present. From the viewpoint that the external magnet is attracted to the magnetic member at the bottom of the microwell and the accommodation of the sample cell with the magnetic beads in the microwell is promoted, the surface magnetic flux density may be about 100 mT to 800 mT. preferable.
  • the microwell array chip of the present invention has a magnetic member on the bottom surface of the microwell as shown in FIG.
  • This magnetic member is localized only on the bottom surface of the microwell, so that the magnetic flux can be converged into the microwell.
  • Its size is almost the same as the opening of the microwell, and it is composed of one or more magnetic spot patterns per microwell.
  • the shape can be a circle or a polygon or a combination thereof.
  • the sample cell is not particularly limited, but is a living cell such as an immune cell such as a lymphocyte, a cancer cell, a hybridoma, a cell line, or a stem cell, and is used for detecting these living cells in a single unit. It is.
  • the sample cell can be a cell population containing antigen-specific lymphocytes.
  • Sample cells are treated with a fluorescent label capable of specifically labeling target cells before being contained in a microwell, for example, and include target cells labeled with a fluorescent label capable of specifically labeling target cells.
  • the target cell may be fluorescently labeled in the microwell by contacting with a fluorescent label that can specifically label the target cell.
  • Fluorescence emitted from cells accommodated in the microwell can be observed from the bottom side of the substrate through the opening of the magnetic member using, for example, an inverted microscope. By this fluorescence observation, target cells that emit predetermined fluorescence can be identified.
  • the present invention also includes a method for recovering target cells, which comprises identifying target cells by fluorescence observation of cells accommodated in microwells by the above method and recovering the specified target cells from the wells.
  • the target cell is not particularly limited, and can be, for example, an immune cell such as a specific immunoglobulin-producing cell or a specific cytokine-producing cell.
  • the identification method by fluorescence observation of the target cell accommodated in the microwell is as described above.
  • the identification of the target cell accommodated in the microwell can be performed by a method for detecting (screening) immune cells such as antigen-specific antibody-secreting cells described in Patent Document 2.
  • At least a part of the main surface around the well of the microwell array chip of the present invention has a function of binding to at least a part of the substance produced by the target cell, for example, Toray
  • the target cell for example, Toray
  • sample cells are stored in the wells of this microwell array chip together with a cell culture solution, Immerse the well in the culture medium, and culture the cells in a state that allows diffusion of the substances contained in the culture liquid from the well to the surface of the microwell layer.
  • Microwell surface composed of a labeling substance that specifically binds to the substance produced by the target cell contained in the sample cell after removing the culture solution, or a substance that binds to the substance produced by the target cell Supplying a labeling substance that specifically binds to the surface of the microwell,
  • the target cell is screened by detecting the substance produced by the target cell bound to the substance on the surface of the microwell with the labeling substance and identifying the target cell.
  • Specified target cells are collected from the wells. Recovery of the target cell from the well can be performed, for example, as follows.
  • the magnetic member can be removed from the magnetic field, and the target cell can be sucked into the glass capillary with a micromanipulator together with the buffer solution or the culture solution, and discharged to an arbitrary container.
  • antigen-specific immunoglobulin gene mRNA can be recovered from the recovered target cells, and antibody cDNA can be expressed to produce an antigen-specific antibody protein.
  • T cell receptor protein is recovered by recovering T cell receptor gene mRNA expressed from cytokine-producing cells, collecting T cell receptor cDNA, and introducing it into another cell. Can be expressed.
  • target cells can be forcibly arranged, cultured, and recovered from all biological cells that can be magnetically modified, such as lymphocytes, cancer cells, and stem cells. It is also possible to screen for target cells from the blood.
  • Example 1 The microwell chip of the present invention was produced according to the following procedure (see FIG. 8).
  • Photoresist 8c (Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd. THMR-i5700HP) was applied to the transparent glass or resin substrate 8a main surface on which the transparent electrode 8b was formed.
  • Fig. 8 (1) 2. Photoresist 8c was exposed to a magnetic ring pattern and developed to expose base electrode 8b in a ring pattern shape.
  • Fig. 8 (2) 3.
  • a magnetic member 8d (Ni) was grown on the exposed transparent electrode 8b by 1 to 4 microns in a nickel sulfamate bath by electroplating. (Fig. 8 (3)) 4).
  • the photoresist 8c was removed with acetone or the like to leave the magnetic member 8d.
  • FIG. 8 (4) 5.
  • a transparent photoresist (Toray Dow Corning WL-5150) was spin coated on the main surface to a thickness of 1 to 5 microns.
  • the barrier layer 8e was formed through exposure, post-exposure baking, and post-baking.
  • Fig. 8 (5)) 6 A transparent resist (Toray Dow Corning WL-5150) was spin-coated with a thickness of 15 microns on the barrier layer 8e as a transparent layer 8f to be a well layer. (Fig. 8 (6)) 7).
  • the transparent layer 8g was subjected to alignment exposure of the magnetic member 8d and the microwell pattern, and post-exposure baking, development, and post-baking were performed to form a microwell 8h. (FIG. 8 (7)) This completes the chip of the embodiment of the present invention.
  • Example 2 The microwell chip of the present invention was produced according to the following procedure (see FIG. 9). 1. Photoresist 9c (Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd. positive resist THMR-i5700HP) was applied to the transparent glass or resin substrate 9a main surface on which the transparent electrode 9b was formed. (Fig. 9 (1)) 2. Photoresist 9c was exposed and developed to expose base electrode 9b in a ring pattern shape. (Fig. 9 (2)) 3. A magnetic member 9d (Ni) was grown on the exposed transparent electrode 9b by electroplating in a nickel sulfamate bath of 1 to 4 microns. (Fig. 9 (3)) 4). The photoresist 9c was removed with acetone or the like to leave the magnetic member 9d.
  • Photoresist 9c Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd. positive resist THMR-i5700HP
  • Fig. 9 (1) 2. Photoresist 9c was exposed and developed to expose base electrode 9b in a ring pattern shape.
  • FIG. 9 (4) 5.
  • a transparent photoresist (Toray Dow Corning WL-5150) was spin coated on the main surface to a thickness of 1 to 5 microns.
  • a barrier layer 9e was formed through exposure, post-exposure baking, and post-baking. The barrier layer 9e was formed so as to wrap the magnetic member 9d in a conformal manner.
  • a metal film 9j was formed on the barrier layer 9e by vacuum deposition. Aluminum, titanium, platinum, gold or the like can be used as the metal film 9j.
  • Fig. 9 (6)) 7 A photoresist pattern 9k was formed on the metal film 9j by photolithography. Methods other than photolithography can also be used. (Fig. 9 (7)) 8).
  • the metal film 9j was etched to leave the bottom of the photoresist pattern 9k.
  • Fig. 9 (8) 9.
  • the photoresist 9k was removed with acetone or the like to leave a metal film 9j pattern.
  • Fig. 9 (9) 10.
  • a transparent layer 9f (transparent resist WL-5150) serving as a well layer was spin-coated with a thickness of 15 microns on the transparent film layer 9e and the metal film 9j.
  • Fig. 9 (10) 11.
  • the transparent layer 9g was subjected to alignment exposure of the magnetic member 9d and the microwell pattern, followed by post-exposure baking, development, and post-baking to form a microwell 9h.
  • FIG. 9 (11) This completes the chip of the embodiment of the present invention.
  • the microwell array chip of the present invention obtained in Examples 1 and 2 is transparent, and the photosensitive resin used for the microwell layer generally exhibits a hydrophobic tendency, and thus has excellent protein binding properties on the surface.
  • autofluorescence from the resin is also suppressed, so that an inspection object can be observed with a fluorescence microscope.
  • the Toray Dow Corning photosensitive resins WL-5351 and WL-5150 show no autofluorescence in both B (Blue) excitation and G (Green) excitation.
  • B excitation means excitation with light having a wavelength in the range of about 460 to 495 nm
  • G excitation means excitation with light having a wavelength in the range of about 530 to 550 nm. Therefore, it has become possible to observe the sample on the chip, which has not been possible in the past, from under the chip.
  • Example 3 The second embodiment can be applied as shown in FIG.
  • a magnetic film 10d is formed on a transparent glass substrate 10a on which a transparent electrode 10b is formed, and a barrier member layer 10e is disposed thereon with a transparent photoresist.
  • electrodes, symbols, and the like can be formed on the barrier layer 10e.
  • an electrode pattern such as 10 m can be arranged.
  • a microwell layer 10g is further formed on the electrode pattern 10m with a transparent photoresist.
  • the barrier layer 10e may be the same as the transparent resist material for forming the mylowell, or an optimum material can be selected as appropriate, and may be a silica film formed by vacuum deposition.
  • Example 4 In order to show that it is possible to observe fluorescence on the chip under the chip that could not be performed conventionally, the fluorescent resin with magnetic beads accommodated in the microwell of the chip manufactured in Example 1 and the fluorescence on the upper surface of the chip are shown.
  • a photograph of the result of binding the labeled antibody observed from the back side of the chip is shown in FIG.
  • FIG. 11 (a) is a fluorescent image observed from the back side of the chip with the fluorescent beads contained in the microwells formed on the chip according to the present invention.
  • FIG. 11 (b) is a fluorescence image of the fluorescently labeled antibody bound on the chip surface according to the present invention, observed from the back side of the chip. Since there is no fluorescence from the microwell array chip itself, the sample signal can be clearly observed. From the above results, fluorescence observation from the back side of the chip, which was impossible with conventional chips, became possible, which is very advantageous for work using an inverted microscope such as fluorescence observation while manipulating cells. .
  • the present invention is useful in the technical field dealing with cells.

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Abstract

本発明は、磁気による細胞のマイクロウェルへの強制配列をおこなう機能を有し、かつチップの底部側からマイクロウェル内の細胞の蛍光観察ができるチップを提供する。本発明のチップは、透光性を有する基板の少なくとも一方の主表面にマイクロウェル層を有し、マイクロウェル層が有する複数のマイクロウェルは、１つのマイクロウェルに1つの生体細胞のみを収容する形状と寸法を有し、マイクロウェルは、その底面が生体細胞に無害で、かつ透光性を有するバリア部材の表面からなり、バリア部材からなる底面と基板の表面との間に、磁性部材を有し、磁性部材は、マイクロウェルの底面を平面視したときに、1または2以上の開口部を有する、マイクロウェルアレイチップである。本発明は、このマイクロウェルアレイの少なくとも一部のマイクロウェルに、検体細胞を収容し、収容した検体細胞を観察する方法であって、マイクロウェルに収容された細胞から発せられる蛍光を、基板底部側から磁性部材の開口部を介して観察する方法にも関する。

Description

マイクロウェルアレイチップおよび細胞の回収方法 関連出願の相互参照
　本出願は、２０１２年７月２４日出願の日本特願２０１２－１６３２８６号および２０１２年１２月３日出願の日本特願２０１２－２６４０１２号の優先権を主張し、それらの全記載は、ここに特に開示として援用される。
　本発明は、マイクロウェルアレイチップおよびこのチップへ収容した細胞の蛍光観察方法、このチップを用いる細胞の回収方法に関する。
　発明者は、これまでに種々の細胞チップを開発し、さらにこれらのチップを利用した抗体スクリーニングシステムも開発した(特許文献1～３)。特に、少量のサンプルで、短時間に効率よくサンプル中の細胞を収容でき、かつチップ表面の抗体などのタンパク質に結合する蛍光標識付抗原などの蛍光を観察することにより行う細胞のスクリーニングに用いるのに適した細胞チップを提供し、特許を取得した（特許文献４）。
［特許文献１］日本特許第４０６９１７１号公報
［特許文献２］日本特開２００６－１２２０１７号公報
［特許文献３］日本特開２００８－３０３４１２号公報
［特許文献４］日本特許第４９５１１４４号公報
　特許文献１～４の全記載は、ここに特に開示として援用される。
　特許文献４に記載のチップは、マイクロウェル層を構成する材料からの自家蛍光を抑えるために遮光層を有するため、医療業界で一般的に利用されている倒立顕微鏡を用いてチップの底部側からマイクロウェル内の細胞の蛍光観察ができないという問題があった。
　そこで発明の目的は、磁気による細胞のマイクロウェルへの強制配列をおこなう機能を有し、かつチップの底部側からマイクロウェル内の細胞の蛍光観察ができるチップを提供することを目的とする。
［１］
透光性を有する基板の少なくとも一方の主表面にマイクロウェル層を有し、
前記マイクロウェル層が有する複数のマイクロウェルは、１つのマイクロウェルに1つの生体細胞のみを収容する形状と寸法を有し、
前記マイクロウェルは、その底面が前記生体細胞に無害で、かつ透光性を有するバリア部材の表面からなり、
前記バリア部材からなる底面と前記基板の表面との間に、磁性部材を有し、
前記磁性部材は、前記マイクロウェルの底面を平面視したときに、1または2以上の開口部を有する、
マイクロウェルアレイチップ。
［２］
前記マイクロウェル層は、自家蛍光性を有さないか、自家蛍光性を有しても微弱である材料からなる、［１］に記載のマイクロウェルアレイチップ。
［３］
前記バリア部材からなる前記マイクロウェル底面から、前記磁性部材の開口部を経て前記基板の底部面までの部分は、透光性を有する［１］または［２］に記載のマイクロウェルアレイチップ。
［４］
前記自家蛍光性を有さない材料がB（Blue）励起及びG（Green）励起において自家蛍光が見られない材料である、［１］～［３］のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイチップ。
［５］
前記基板と前記マイクロウェル層との間に下地電極層を有し、前記磁性部材は、前記下地電極層と前記マイクロウェル層との間に位置する［１］～［４］のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイチップ。
［６］
前記下地電極層が下地透明電極層である［５］に記載のマイクロウェルアレイチップ。
［７］
前記磁性部材は、前記マイクロウェルの底面を平面視したときに、最大外径が、前記マイクロウェルの最大内径より大きい［１］～［６］のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイチップ。
［８］
前記磁性部材の開口部にマーキングを有する［１］～［７］のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイチップ。
［９］
［１］～［８］のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイの少なくとも一部のマイクロウェルに、検体細胞を収容し、収容した検体細胞を観察する方法であって、
前記検体細胞に磁気ビーズを取り付ける工程、
磁気ビーズを取り付けた検体細胞をマイクロウェルアレイチップのマイクロウェル層の表面に供給して、1つのマイクロウェルに1つの細胞を収容する工程、および
前記マイクロウェルに収容された細胞から発せられる蛍光を、基板底部側から前記磁性部材の開口部を介して観察する工程、
を含む、前記方法。
［１０］
前記基板底部側からの蛍光観察は、倒立顕微鏡を用いて行う［９］に記載の方法。
［１１］
細胞のマイクロウェルへの収容は、基板底部側から外部磁石で磁気ビーズを吸引することで促進する［９］または［１０］に記載の方法。
［１２］
前記検体細胞が免疫細胞、ガン細胞、ハイブリドーマ、幹細胞または細胞株である［９］～［１１］のいずれか１項に記載の方法。
［１３］
前記検体細胞が抗原特異的リンパ球を含む［９］～［１２］のいずれか１項に記載の方法。
［１４］
［９］～［１３］のいずれか１項に記載の方法でマイクロウェルに収容した細胞の中から蛍光観察により目的細胞を特定し、特定した目的細胞をウェルから回収することを含む目的細胞の回収方法。
［１５］
目的細胞が、抗原特異的抗体分泌細胞である［１４］に記載の回収方法。
［１６］
目的細胞が、特異的免疫グロブリン産生細胞または特異的サイトカイン産生細胞である［１４］または［１５］に記載の回収方法。
　本発明によれば、磁気による細胞のマイクロウェルへの強制配列をおこなう機能を有し、かつチップの底部側からマイクロウェル内の細胞の蛍光観察ができるチップを提供することができる。このチップを用いることで、目的細胞を例えば、倒立顕微鏡を用いて観察し特定することができる。さらに、チップを透明にすることにより、細胞やチップ上での反応をチップ上下両方の方向から観察することもできる。
　さらに、磁性部材とマイクロウェルとの間にバリア部材が介在することで、マイクロウェル内で刺激を受けた細胞によって例えばウェルのｐＨが変化する等々の際に磁性材料が溶出して、細胞にダメージを与えることもない。
図１に本発明のマイクロウェルアレイチップの一例の斜視説明図を示す。 図２に本発明のマイクロウェルアレイチップの一例の断面図を示す。 図３に、２５×２５のマイクロウェルを1つのクラスタとして、そのクラスタが縦横に3個ずつ配列されたマイクロウェルアレイチップの平面図を示す。 図４に磁性部材形状の例を示す。 図５に磁性部材等の寸法の説明図を示す。 図６は、本発明のマイクロウェルアレイチップの製造方法の説明図である。 図７に、マイクロウェルの底面に設けた磁性部材（マイクロウェル底面のみに局在）により、磁束をマイクロウェル内へ収束させることが可能であることを示す説明図である。 図８は、実施例１のマイクロウェルアレイチップの製造方法の説明図を示す。 図９は、実施例２のマイクロウェルアレイチップの製造方法の説明図を示す。 図１０は、実施例３のマイクロウェルアレイチップの製造方法の説明図を示す。 図１１(a)は本発明によるマイクロウェルアレイチップに蛍光ビーズを収容し、チップ裏側より観察した物である。図１１(b)は、本発明によるマイクロウェルアレイチップ表面に蛍光色素Cy3付抗体を結合させ、チップ裏側より観察したものである。
[マイクロウェルアレイチップ]
　本発明のマイクロウェルアレイチップは、透光性を有する基板の少なくとも一方の主表面にマイクロウェル層を有し、
　前記マイクロウェル層が有する複数のマイクロウェルは、１つのマイクロウェルに1つの生体細胞のみを収容する形状と寸法を有し、
　前記マイクロウェルは、その底面が前記生体細胞に無害で、かつ透光性を有するバリア部材の表面からなり、
　前記バリア部材からなる底面と前記基板の表面との間に、磁性部材を有し、
　前記磁性部材は、前記マイクロウェルの底面を平面視したときに、1または2以上の開口部を有する。
　以下、本発明のマイクロウェルアレイチップについて図面に基づいて説明する。本発明のマイクロウェルアレイチップの一例の斜視説明図を図１に、断面図を図２に示す。
＜基板＞
　本発明のマイクロウェルアレイチップに用いる基板は、透光性を有する基板である。図１及び２では２ａである。透光性とは、マイクロウェルに収容した細胞またはその周辺から発生する蛍光を透過できる性質を意味する。蛍光は、通常、可視光領域である４００～７００ｎｍの波長範囲に発光波長のピークを有することから、透光性を有する基板は、少なくとも上記可視光領域の光に対して良好な透過性を有する基板であることから好ましい。透光性を有する基板は、例えばガラスであることができ、樹脂などでもよい。樹脂基板は、例えばABS樹脂、ポリカーボネート、COC(シクロオレフィンコポリマー)、アクリル、PVC、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ酢酸ビニル、PET(ポリエチレンテレフタレート)、PEN(ポリエチレンナフタレート)などが挙げられる。但し、チップの底部側からマイクロウェル内の細胞の蛍光観察ができるチップを提供するという観点からは、基板は、透光性を有することに加えて、自家蛍光を発しないか、発しても微弱であり上記蛍光観察に支障がない素材からなることが適当である。透光性を有し、かつ自家蛍光を全く発しない素材としては、石英ガラスを挙げることができる。自家蛍光が微弱であり上記蛍光観察に支障がない素材としては、低蛍光ガラス、アクリル系樹脂、COC(シクロオレフィンコポリマー)などを挙げることができる。
　基板の厚みや形状には特に制限はなく、チップが使用される態様等を考慮して適宜決定することができる。
＜マイクロウェル層＞
　本発明のマイクロウェルアレイチップは、透光性を有する基板の少なくとも一方の主表面にマイクロウェル層を有する。図１及び２では２ｇである。マイクロウェル層は複数のマイクロウェル２ｈを有し、かつ各マイクロウェルは、１つのマイクロウェルに1つの生体細胞のみを収容する形状と寸法を有する。
　上記生体細胞は、蛍光観察により活動状態などを検出したい細胞であれば、特に制限はない。生体細胞としては、例えば、リンパ球、有核赤血球、ガン細胞、幹細胞等を挙げることができる。生体細胞が、例えば、リンパ球である場合、本発明のマイクロウェルアレイチップを用いることで、例えば、抗原特異的リンパ球を１個単位で蛍光観察により検出することができる。
　複数のマイクロウェルは同一間隔で縦横に配置されており、所定個数のマイクロウェル毎にマーカーが設けられていることが好ましい。さらに、所定個数のマイクロウェル毎にグループ分けして基板の主表面上に設けられることかもできる。例えば、図３に、２５×２５のマイクロウェルを１つのクラスタとして、そのクラスタが縦横に３個ずつ配列されたマイクロウェルアレイチップの平面図を示す。クラスタを構成するマイクロウェルの数やクラスタの配列数には特に制限はなく、例えば２５×２５ウェル/クラスタ、１０×１０クラスタであることができる。
　１つのマイクロウェルのグループを構成するマイクロウェルの数には特に制限はないが、例えば、10～10,000の範囲であることができる。
　マイクロウェルの形状や寸法には特に制限はないが、マイクロウェルの形状は、例えば、円筒形であることができ、円筒形以外に、複数の面により構成される多面体（例えば、直方体、六角柱、八角柱等）、逆円錐形、逆角錐形（逆三角錐形、逆四角錐形、逆五角錐形、逆六角錐形、七角以上の逆多角錐形）等であることもでき、これらの形状の二つ以上を組み合わせた形状であることもできる。例えば、一部が円筒形であり、残りが逆円錐形であることができる。また、逆円錐形、逆角錐形の場合、底面がマイクロウェルの開口となるが、逆円錐形、逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状である（その場合、マイクロウェルの底部は平坦になる）こともできる。円筒形、直方体は、マイクロウェルの底部は通常、平坦であるが、曲面（凸面や凹面）とすることもできる。マイクロウェルの底部を曲面とすることができるのは、逆円錐形、逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状の場合も同様である。
　マイクロウェルの形状や寸法は、マイクロウェルに収容されるべき生体細胞の種類（生体細胞の形状や寸法等）を考慮して、１つのマイクロウェルに１つの生体細胞が収容されるように、適宜決定される。
　１つのマイクロウェルに１つの生体細胞が収容されるようにするためには、例えば、マイクロウェルの平面形状に内接する最大円の直径が、マイクロウェルに収容しようとする生体細胞の直径の0.5～2倍の範囲、好ましくは0.8～1.9倍の範囲、より好ましくは0.8～1.8倍の範囲であることが適当である。
　また、マイクロウェルの深さは、マイクロウェルに収容しようとする生体細胞の直径の0.5～4倍の範囲、好ましくは0.8～1.9倍の範囲、より好ましくは0.8～1.8倍の範囲であることが適当である。
　マイクロウェルが円筒形の場合、その寸法は、例えば、直径3～100μｍであることができ、生体細胞がＢリンパ球の場合、好ましくは、直径は4～15μｍである。また、深さは、例えば、3～100μｍであることができ、生体細胞がＢリンパ球の場合、好ましくは、深さは4～40μｍであることができる。但し、マイクロウェルの寸法は、上述のように、マイクロウェルに収容しようとする生体細胞の直径とのマイクロウェルの寸法の好適な比を考慮して適宜決定する。
　１つのマイクロウェルアレイチップが有するマイクロウェルの数は、特に制限はないが、生体細胞がリンパ球の場合、抗原特異的リンパ球の頻度が105個に１個から多い場合には約500個であるという観点から、1cm2当たり、例えば、2,000～1,000,000個の範囲であることができる。
　マイクロウェル層は、例えば、樹脂により作製されることができ、樹脂としては、例えば、光感光性樹脂あるいは熱可塑性樹脂などが利用できる。光感光性樹脂あるいは熱可塑性樹脂は、基板の材料と同様に、チップの底部側からマイクロウェル内の細胞の蛍光観察ができるチップを提供するという観点から、自家蛍光を全く発しないか、発しても微弱であり上記蛍光観察に支障がない素材からなることが適当である。そのような観点から、マイクロウェル層は、例えば、シリコーン系樹脂、アクリル系樹脂などからなることが好ましい。
＜バリア部材＞
　バリア部材は、マイクロウェル層のマイクロウェルの底面を少なくとも構成するものであり、具体的には、例えば、マイクロウェル層と基板との間に層構造として設けられることができる。あるいは層構造ではなく、個々のマイクロウェルの底面または磁性部材に対応して個別に設けることもできる。図２では２ｅである。バリア部材は、生体細胞に無害で、かつ透光性を有する材料からなるものであり、ここでの透光性は基板で説明したものと同様である。生体細胞に無害とは、バリア部材の表面が底面となっているマイクロウェル中に収容された細胞の活動性が、チップの使用中に実質的な影響を受けないことを意味する。そのようなバリア部材の材料としては、例えば、シリカ膜、PDMS(ポリジメチルシロキサン)、アクリル系樹脂、東レ・ダウコーニングWL-5150およびWL-5153に代表される透明レジスト等を挙げることができる。バリア部材の厚みは、特に制限はなく、磁性部材による生体細胞への影響を実質的に遮断できる範囲で適宜決定できる。限定的な意味ではないが、バリア部材の厚みは、例えば、０．１μｍ～２ｍｍの範囲とすることができる。
＜磁性部材＞
　図２に示すように、マイクロウェル２ｈは、バリア部材２ｅを介してその底面下の一部または全部に磁性部材２ｄを有する。尚、本発明のマイクロウェルアレイチップは、前記磁性部材以外の磁性部材を有さない。磁性部材の形状は、マイクロウェルの底面を平面視したときに、1または2以上の開口部を有するものとし、それ以外には、特に制限はない。前記開口部を有することで、マイクロウェルに収容された生体細胞を倒立顕微鏡で観察することができる。図４に磁性部材の平面形状の例を示す。例示した磁性部材は、1個または2個の開口部を有する。外側の輪郭は、円形や多角形（例えば、三角形、四角形）など様々な形状をとることができる。磁性部材の平面形状は、外側の輪郭及び開口の形状は、ウェル底面の形状に対して略相似形であっても、全く類似しない形状であってもよい。どの場合でも、ウェル底面の底面を平面視したときに、1または2以上の開口部がある状態であれば、チップの主表面反対側からウェル内の蛍光観察は可能である。尚、図４に例示した磁性部材の平面形状中に、開口部内に突起部（対向するタイプ（(6)～(10)）と架橋タイプ（(3)、(4)）がある。これら突起部は、対向するタイプ及び架橋タイプの何れも、磁性部材に磁気回路を形成させることによって、細胞を磁性部材の開口部中心へ引き寄せることを目的としたものである。
　図５に磁性部材２ｄ等の寸法の一例を示す。図５に示す例では、マイクロウェル２ｈの直径Ｄは、細胞がちょうど1つ収まるサイズとなっており、リング状の磁気部材２ｄの内周は、マイクロウェル２ｈの直径より小さく、また磁気部材２ｄの外周はマイクロウェル２ｈの直径Ｄより大きく設定される。A寸法は、例えば、1～5マイクロメートルであり、ウェル周囲の観察を妨げないよう適宜選択される。B寸法は、1～D/2マイクロメートル未満であり、マイクロウェルに収容された被検査体の観察を妨げないような寸法が適宜選択される。磁気リングの太さL寸法は、A+Bの値である。
　磁性部材は磁性材料により構成され、磁性材料としては、例えば、ニッケルおよびフェライトやコバルト系などの強磁性体を挙げることができる。磁性材料の具体例は後述する。磁性部材の厚みは、磁性部材に求められる磁力に応じて適宜決定できるが、例えば、0.1～5μｍの範囲である。これら磁性部材は、例えばめっきにより作製することができる。めっき方法は、電気めっき、無電解めっきが挙げられる。電気めっきの場合は、電極となる下地電極が必要であり、無電解めっきの場合は必要ではない。形成された磁性部材を磁界にいれることにより、磁性部材中の磁束密度が高くなる。磁界は、いわゆる永久磁石と呼ばれるものでサマリウムコバルト、ネオジム等や電磁石により形成される。
　上記のように、磁性部材を電気めっきで作製する場合には、基板とマイクロウェル層との間に下地電極層２ｂを有し、磁性部材は、下地電極層とマイクロウェル層との間に位置する。本発明のマイクロウェルアレイチップが下地電極層を有する場合、下地電極は、少なくとも基板と磁性部材の間に位置する。下地電極は、磁性部材を電気めっき工程で作製する際に利用され、蒸着あるいは無電解めっきなどにより形成される。下地電極の膜厚は、特に限定はないが、例えば、50nm以上300nm以下の範囲であり、さらに80nm以上150nm以下であることが好ましい。
　本発明のマイクロウェルアレイチップの製造方法について説明をする。ここでは、基板としてガラス基板を用いる場合を例に、図６に基づいて説明する。
（１）ガラス基板2aの主表面上に下地電極2bを蒸着などにより形成する。下地電極は、ITO、ZnOなどの透明電極材料あるいはポリアセチレン、ポリアニリン、ポリチオフェンなどの導電性高分子膜などの透明電極材料などガラスと密着性のよい材料から選択することができる。（図６（１））
（２）ガラス基板2a上の下地電極2b上に感光性樹脂2c、例えば東京応化工業株式会社ポジレジストTHMR-iP5700 HPなどをスピンコートなどにより塗布することができる。（図６（１））
（３）この感光性樹脂をフォトリソグラフィにて磁性部材パターン2c'を形成することができる。（図６（２））
（４）磁性部材パターン2c'中に露出した下地電極2b上に電気めっきなどにて、磁性部材2dを成膜する。磁性部材2dは、例えば、ニッケル膜であり、例えば、スルファミン酸ニッケル浴などによって形成することができる。（図６（３））
（５）磁性部材2dを形成後、感光性樹脂を、例えば、アセトンなどで除去する。（図６（４））
（６）磁性部材2d上に、バリア層2eとなる透明樹脂、例えば、東レダウコーニング社WL-5351などを、例えば、0.5～5μm厚程度で塗布し、十分に硬化させる。またバリア層2eは、シリカ膜であることができ、例えばスパッタ蒸着などにより、例えば、0.1～1μm厚程度で成膜することができる。（図６（５））
（７）バリア層2e上に、マイクロウェル層2gとなる透明樹脂2f、例えば、東レダウコーニング社WL-5351などを、例えば、5～15μm厚程度で塗布し、磁性部材2dのパターンがマイクロウェル2hの底に形成されるようにフォトリソグラフィ技術を利用して、マイクロウェル層2eを加工する。（図６（６））
（８）上記磁性部材2dを無電解めっきにて作製する場合は、フォトレジストでパターン形成後に、センシタイジングとアクティベーティングを行い、その後、フォトレジストを剥離、無電解めっき浴に浸漬すれば、その活性部分のみに磁性部材を析出させることができる。また、無電解Ni-Pをパターン開口部に析出させて、無電解の磁性めっき浴に浸漬すれば、そのパターニングされた無電解Ni-Pめっき膜上にのみに析出させることができる。（図６（７））
（９）以上の操作により本発明によるマイクロウェルアレイチップを調製することができる。
（１）磁性部材のめっき
[電気めっき方法]
　Ni-P、Ni-B、Co-Ni-P、Co-P系合金、Ni-Fe系合金、Co-Ni-Fe系合金などの電気めっき膜は、磁気特性としては強磁性をしめす。しかしリンを含む例えば8%以上のニッケルめっき膜は、非磁性であり、磁性を発生させるためには熱処理などが必要となるため本発明には最適な手法ではない。
　例えばニッケル電気めっきは、内部応力の少ないスルファミン酸ニッケル浴にて行われる。そのほかには、硫酸ニッケルを主成分とするワット浴、塩化ニッケルを主成分とするウッド浴などが使われる。以下にスルファミン酸ニッケル浴による本発明における磁性部材の形成方法の概略を示す。
A) 磁性部材を形成するための下地電極を有する基板を脱脂処理する。
B) スルファミン酸ニッケル浴を約50℃に暖め、陽極としてニッケル板、陰極として下地電極を有する基板を浴内に浸漬させる。
C) 約1～100mAの電流を電極間に１０秒から６０分程度流す。
D) 基板を浴から取り出し、水で洗浄を行う。
E) めっき厚は、0.5ミクロンから5ミクロンであり、好ましくは1ミクロンから3ミクロンの間とする。
　ニッケル電気めっき法には、他にワット浴なども使用される。
[無電解めっき]
　無電解めっきによっても磁性部材を形成可能である。例えばNi-P、Ni-B、Co-Ni-P、Co-P系合金、Ni-Fe系合金、Co-Ni-Fe系合金などが挙げられる。Ni-Pの場合、Pの含有量が8%以上では析出状態では非磁性となってしまう。ただし、300℃以上の熱処理を行うと高いPの含有においても磁化される。無電解ニッケルめっき膜は、例えば硫酸ニッケルと次亜リン酸ナトリウムの浴で作製することが可能である。無電解めっきによるとガラス基板や樹脂基板に直接めっきを行うことが可能である。
　本発明のマイクロウェルアレイチップの磁性部材は磁化することで、磁気修飾した細胞を含む生体試料を吸引、収容することが可能で、さらにそれを回収することが可能である。磁化方法は常法を用いることができる。
　本発明のマイクロウェルアレイチップは、磁性部材の開口部にマーキングを有することができる。マーキングとは、開口部の特定に使用することができる文字、数字、記号、模様等またはこれらの組合せからなることができ、開口部における光透過を妨げない程度の大きさや形状であればよい。
＜検体細胞をマイクロウェルに収容する方法＞
　本発明は上記本発明のマイクロウェルアレイの少なくとも一部のマイクロウェルに、検体細胞を収容し、収容した検体細胞を観察する方法を包含する。
　この方法は、
　前記検体細胞に磁気ビーズを取り付ける工程、
　磁気ビーズを取り付けた検体細胞をマイクロウェルアレイチップのマイクロウェル層の表面に供給して、1つのマイクロウェルに1つの細胞を収容する工程、および
　前記マイクロウェルに収容された細胞から発せられる蛍光を、基板底部側から前記磁性部材の開口部を介して観察する工程、
　を含む。
　前記検体細胞に磁気ビーズを取り付ける方法は、公知の方法を適宜利用できる。例えば、細胞表面に存在する分子、例えば表面抗原等に特異的に結合する抗体を介して検体細胞に磁気ビーズを結合させる方法が知られている。検体細胞とその表面分子に特異的な抗体を固定化した磁気ビーズを接触させることにより磁気ビーズを結合させた細胞を得ることができる。また、任意の標識分子を結合させた抗体を検体細胞の表面分子に結合させ、次いで標識物質に結合する分子を固定化した磁気ビーズと接触させることにより検体細胞を間接的に磁気標識することができる。抗体の標識分子とそれに結合する磁気ビーズに固定化された分子は特異的に結合する組み合わせであればよく、ビオチンとストレプトアビジンの組み合わせ等が挙げられる。また、抗体の代わりに細胞表面の受容体のリガンドを結合させた磁気ビーズを用い、目的細胞表面の受容体に結合させることにより磁気ビーズを結合させることもできる。さらには、磁気ビーズを細胞に貪食させることで、細胞表面ではなく細胞内に磁気ビーズを導入することで、細胞を磁気ビーズで標識することも可能である。使用する磁気ビーズは直径10nm～10μmを使用することができる。磁気ビーズの粒子形状は球状やクラスタ状であることができる。
　表面抗原としては、ヒトBリンパ球であればCD19、CD20、CD21、CD23等、ヒト形質細胞であればCD38、CD138、ヒトTリンパ球であればCD2、CD3などが利用できる。また、細胞表面のリガンドとしては、Bリンパ球の抗原受容体として機能する細胞表面の抗体のリガンドである抗原、Tリンパ球の抗原受容体のリガンドであるMHC/peptide等をあげることができる。
　検体細胞に磁気ビーズを取り付け、その磁気ビーズを磁気吸引することで1つのマイクロウェルに1つの検体細胞を収容することが可能である。これにより、例えば、抗原特異的リンパ球などの検体細胞をマイクロウェルに容易に収容することができ、かつマイクロウェルに収容した検体細胞を検体細胞に予め付与しておいた標識を用いて容易に目的とする細胞を選別可能である。
　上記磁気ビーズを取り付けた検体細胞をマイクロウェルアレイチップのマイクロウェル層の表面に供給して、1つのマイクロウェルに1つの細胞を収容する。磁気ビーズを取り付けた検体細胞は、例えば、緩衝液または培養液に分散された状態で、マイクロウェル層の表面に供給される。上記分散液中の検体細胞の濃度は、マイクロウェルへの収容がスムーズであるとの観点からは、例えば、ウェル数の0.5～1.5倍の範囲であることが適当である。磁気ビーズを取り付けた検体細胞のマイクロウェル層表面への供給操作は、室温で実施することもできるが、冷却下または加温下で実施することもできる。さらに、磁気ビーズを取り付けた検体細胞のマイクロウェル層表面への供給操作の際に、マイクロウェルアレイチップを静置してもよくまたは適度な振動を加えてもよい。
　本発明のマイクロウェルアレイチップは磁性部材を有するため、磁気ビーズを取り付けた検体細胞が、マイクロウェル底部の磁性部材に引きつけられて、検体細胞のマイクロウェルへの収容が促進される。検体細胞のマイクロウェルへの収容を促進するという観点からは、磁性部材が有する表面磁束密度は100ｍT～500ｍT程度であることが好ましい。また、磁性部材の表面磁束密度が前記範囲に満たない場合には、外部の磁石を併用することか好ましい。磁性部材の表面磁束密度が前記範囲を満足する場合でも外部の磁石を併用することはできる。外部の磁石は、マイクロウェルアレイチップの底面の少なくともマイクロウェルアレイが存在する部分を全面または部分的にカバーするものであることが適当である。外部の磁石は、マイクロウェル底部の磁性部材に引きつけられて、磁気ビーズを取り付けた検体細胞のマイクロウェルへの収容が促進されるという観点からは、表面磁束密度は100ｍT～800ｍT程度であることが好ましい。
　本発明のマイクロウェルアレイチップは、図７に示すようにマイクロウェルの底面には、磁性部材を有している。本磁性部材はマイクロウェル底面のみに局在することで、磁束をマイクロウェル内へ収束させることが可能である。その大きさは、マイクロウェルの開口とほぼ同等であり、マイクロウェル1つにつき1つ以上の磁性スポットパターンにより構成される。その形状は円あるいは多角形あるいはそれらの複数の組み合わせであることができる。本磁性部材によって磁束をマイクロウェルに収束させることによって、磁気ビーズによって修飾された生体細胞は、マイクロウェル内に吸引され、収容される。これにより、チップ上に播種された生体細胞はほぼ1つのマイクロウェルに１細胞が収容されるが、仮に収容されるチップ表面に浮遊している場合は、洗浄作業を行う。洗浄の際も細胞はマイクロウェル底の磁性部材に安定して吸引されているため、ウェルから抜け出すことはない。さらに外部からの磁界を取り除くことによって、マイクロウェルに収容された細胞は容易に回収することも可能である。
　検体細胞には、特に限定はないが、例えばリンパ球などの免疫細胞、ガン細胞、ハイブリドーマ、細胞株、幹細胞などの生体細胞であり、これら生体細胞を1個単位で検出するために用いられるものである。検体細胞は、抗原特異的リンパ球を含む細胞集団であることができる。
　マイクロウェルに収容された細胞から発せられる蛍光を、基板底部側から前記磁性部材の開口部を介して観察する。検体細胞は、例えば、マイクロウェルに収容する前に、目的細胞を特異的に標識し得る蛍光標識で処理し、目的細胞を特異的に標識し得る蛍光標識で標識された目的細胞を含む状態とするか、または、マイクロウェルに収容した後に、目的細胞を特異的に標識し得る蛍光標識と接触させて、目的細胞がマイクロウェル内で蛍光標識されてもよい。
　マイクロウェルに収容された細胞から発せられる蛍光は、基板底部側から、例えば、倒立顕微鏡を用いて、磁性部材の開口部を介して観察することができる。この蛍光観察により、所定の蛍光を発する目的細胞を特定することができる。
＜目的細胞の回収方法＞
　本発明は、上記方法でマイクロウェルに収容した細胞の蛍光観察により目的細胞を特定し、特定した目的細胞をウェルから回収することを含む目的細胞の回収方法も包含する。
　目的細胞は、特に限定はないが、例えば、特異的免疫グロブリン産生細胞または特異的サイトカイン産生細胞などの免疫細胞であることができる。
　マイクロウェルに収容した目的細胞の蛍光観察による特定方法は、上記の通りである。
　あるいは、マイクロウェルに収容した目的細胞の特定は、特許文献２に記載の抗原特異的抗体分泌細胞等の免疫細胞の検出（スクリーニング）方法であることができる。
　即ち、本発明のマイクロウェルアレイチップのウェルの周辺の前記主表面の少なくとも一部に、目的細胞が産生する物質の少なくとも一部と結合性を有する機能を有するマイクロウェル構成材料、例えば、東レ・ダウコーニングWL-5150およびWL-5153に代表される透明レジスト等であるとき、このマイクロウェルアレイチップのウェルに検体細胞を細胞の培養液とともに収容し、
　ウェルを培養液に浸漬して、培養液に含まれる物質のウェルからマイクロウェル層表面への拡散が可能な状態で細胞を培養し、
　培養液を除去した後に、検体細胞に含まれる目的細胞によって産生される物質に特異的に結合する標識物質、又は、目的細胞によって産生される物質と結合性を有する物質で構成されるマイクロウェル表面に特異的に結合する標識物質を、前記マイクロウェル表面に供給し、
　前記マイクロウェル表面の物質に結合した、目的細胞によって産生された物質を、前記標識物質により検出して、目的細胞を特定することにより、目的細胞をスクリーニングする。
　特定した目的細胞はウェルから回収する。目的細胞のウェルからの回収は、例えば、以下のように実施できる。磁性部材を磁界から外し、マイクロマニピュレータによりガラスキャピラリ内に目的細胞を緩衝液または培養液と共に吸引し、任意の容器へ吐出することにより回収できる。
　本発明では、さらに、回収した目的細胞から、抗原特異的免疫グロブリン遺伝子のmRNAを回収し、抗体cDNAを発現させ、抗原特異的抗体タンパク質を作製することができる。また、サイトカインを産生した細胞よりその細胞が発現しているT細胞受容体遺伝子のmRNAを回収し、T細胞受容体cDNAを回収し、それを別の細胞に導入することによりT細胞受容体タンパク質を発現させることができる。
　本発明においては、ターゲットとなる細胞は、リンパ球をはじめガン細胞、幹細胞など磁気修飾可能な生体細胞はすべて、強制的に配列、培養、回収ができる。さらに血中からの目的細胞をスクリーニングすることも可能である。
　以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。但し、下記実施例は説明のための例示であり、本発明がこれらの実施例に限定的される意図ではない。
実施例１
　下記手順に従って、本発明のマイクロウェルチップを作製した（図８参照）。
１．透明電極8bが形成された透明なガラスや樹脂基板8a主表面に、フォトレジスト8c（東京応化工業株式会社THMR-i5700HP）を塗布した。（図８（１））
２．フォトレジスト8cを磁気リングパターンに露光、現像をおこない、リングパターン形状に下地電極8bを露出させた。（図８（２））
３．露出した透明電極8b上に磁性部材8d（Ni）を電気めっき法によりスルファミン酸ニッケル浴中で１～４ミクロン成長させた。（図８（３））
４．フォトレジスト8cをアセトンなどで除去し、磁性部材8dを残した。（図８（４））
５．主表面上に透明フォトレジスト（東レ・ダウコーニングWL-5150）を1～5ミクロンの厚みでスピンコートした。露光、ポストエクスポージャーベーク、ポストベークを経てバリア層8eを形成した。（図８（５））
６．バリア層8e上にウェル層となる透明層8fとして透明レジスト（東レ・ダウコーニングWL-5150）を15ミクロンの厚みでスピンコートした。（図８（６））
７．透明層8gに磁性部材8dとマイクロウェルのパターンをアライメント露光し、ポストエクスポージャーベーク、現像、ポストベークを行い、マイクロウェル8hを形成した。（図８（７））これで本発明の実施例のチップが完成した。
実施例２
　下記手順に従って、本発明のマイクロウェルチップを作製した（図９参照）。
１．透明電極9bが形成された透明なガラスまたは樹脂基板9a主表面に、フォトレジスト9c（東京応化工業株式会社ポジレジストTHMR-i5700HP）を塗布した。（図９（１））
２．フォトレジスト9cを露光、現像をおこない、リングパターン形状に下地電極9bを露出させた。（図９（２））
３．露出した透明電極9b上に磁性部材9d（Ni）を電気めっき法によりスルファミン酸ニッケル浴中で１～４ミクロン成長させた。（図９（３））
４．フォトレジスト9cをアセトンなどで除去し、磁性部材9dを残した。（図９（４））
５．主表面上に透明フォトレジスト（東レ・ダウコーニングWL-5150）を1～5ミクロンの厚みでスピンコートした。露光、ポストエクスポージャーベーク、ポストベークを経てバリア層9eを形成した。バリア層9eは、磁性部材9dをコンフォーマルに包み込むように形成された。（図９（５））
６．バリア層9e上に、真空蒸着で金属膜9jを成膜した。金属膜9jとしてはアルミ、チタン、白金、金などを使用できる。（図９（６））
７．金属膜9j上にフォトリソグラフィにより、フォトレジストパターン9kを形成した。フォトリソグラフィ以外の方法も利用できる。（図９（７））
８．金属膜9jをエッチングし、フォトレジストパターン9k下を残した。（図９（８））
９．フォトレジスト9kをアセトンなどで除去し、金属膜9jパターンを残した。（図９（９））
１０．透明膜層9eと金属膜9j上にウェル層となる透明層9f（透明レジストWL-5150）を15ミクロンの厚みでスピンコートした。（図９（１０））
１１．透明層9gに磁性部材9dとマイクロウェルのパターンをアライメント露光し、ポストエクスポージャーベーク、現像、ポストベークを行い、マイクロウェル9hを形成した。（図９（１１））これで本発明の実施例のチップが完成した。
　実施例１及び２で得た本発明のマイクロウェルアレイチップは、透明であり、マイクロウェル層にも用いる感光性樹脂は一般的に疎水傾向を示すため、表面のタンパク質結合性が優れる。また、感光性樹脂を適宜選択することで、樹脂からの自家蛍光も抑制されるため、蛍光顕微鏡による被検査体観察も可能である。例えば、東レダウコーニング社感光性樹脂WL-5351、WL－5150は、B（Blue）励起、G（Green）励起ともに自家蛍光が見られない。
　尚、B励起とは、約４６０～４９５ｎｍの範囲の波長を有する光での励起を意味し、G励起とは、約５３０～５５０ｎｍの範囲の波長を有する光での励起を意味する。よって、従来できなかったチップ上のサンプルをチップ下から蛍光観察することが可能となった。
実施例３
　実施例２により、例えば図１０のような応用が可能である。透明電極10bが成膜された透明なガラス基板10a上に磁性膜10dが形成され、その上に透明フォトレジストによってバリア部材層10eが配置されている。本実施例によるとこのバリア層10e上に、電極や記号などを形成することができる。例えば10mのような電極パターンを配置することができる。この電極パターン10m上にさらに透明フォトレジストによりマイクロウェル層10gが形成される。なおバリア層10eはマイロウェルを形成する透明レジスト材料と同じでもよいし、適宜最適なものを選択することが可能で、真空蒸着によるシリカ膜でもよい。
実施例４
　従来できなかったチップ上のサンプルをチップ下から蛍光観察することが可能であることを示すために、実施例１で作製したチップのマイクロウェルに、収容した磁気ビーズ付蛍光樹脂とチップ上面に蛍光標識付き抗体を結合させた結果をチップ裏側から観察した写真を図１１に示す。図１１(a)は、本発明によるチップに形成されたマイクロウェルに、蛍光ビーズを収容してチップ裏側方向から観察した蛍光画像である。また図１１(b)は、本発明によるチップ表面上に結合した蛍光標識付抗体について、チップ裏側方向から観察した蛍光画像である。マイクロウェルアレイチップそのものからの蛍光がないことから、サンプルの信号が明瞭に観測可能である。以上の結果より、従来のチップでは不可能であったチップ裏側からの蛍光観察が可能になったことから、細胞を操作しながら蛍光観察するなどの倒立顕微鏡を用いた作業に非常に有利である。
　本発明は、細胞を扱う技術分野において有用である。
２ａ、８ａ、９ａ、１０ａ　基板
２ｂ、８ｂ、９ｂ、１０ｂ　下地電極層
２ｃ、８ｃ、９ｃ　フォトレジスト(パターン)
２ｄ、８ｄ、９ｄ、１０ｄ　磁性部材
２ｅ、８ｅ、９ｅ、１０ｅ　バリア部材
２ｆ、８ｆ、９ｆ　マイクロウェル層となる透明層
２ｇ、８ｇ、９ｇ、１０ｇ　マイクロウェル層
２ｈ、８ｈ、９ｈ、１０ｈ　マイクロウェル
９ｊ　金属膜
９ｋ　フォトレジスト(パターン)
１０ｍ　電極パターン

Claims (16)

  1. 透光性を有する基板の少なくとも一方の主表面にマイクロウェル層を有し、
    前記マイクロウェル層が有する複数のマイクロウェルは、１つのマイクロウェルに1つの生体細胞のみを収容する形状と寸法を有し、
    前記マイクロウェルは、その底面が前記生体細胞に無害で、かつ透光性を有するバリア部材の表面からなり、
    前記バリア部材からなる底面と前記基板の表面との間に、磁性部材を有し、
    前記磁性部材は、前記マイクロウェルの底面を平面視したときに、1または2以上の開口部を有する、
    マイクロウェルアレイチップ。
  2. 前記マイクロウェル層は、自家蛍光性を有さないか、自家蛍光性を有しても微弱である材料からなる、請求項１に記載のマイクロウェルアレイチップ。
  3. 前記バリア部材からなる前記マイクロウェル底面から、前記磁性部材の開口部を経て前記基板の底部面までの部分は、透光性を有する請求項１または２に記載のマイクロウェルアレイチップ。
  4. 前記自家蛍光性を有さない材料がB（Blue）励起及びG（Green）励起において自家蛍光が見られない材料である、請求項１～３のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイチップ。
  5. 前記基板と前記マイクロウェル層との間に下地電極層を有し、前記磁性部材は、前記下地電極層と前記マイクロウェル層との間に位置する請求項１～４のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイチップ。
  6. 前記下地電極層が下地透明電極層である請求項５に記載のマイクロウェルアレイチップ。
  7. 前記磁性部材は、前記マイクロウェルの底面を平面視したときに、最大外径が、前記マイクロウェルの最大内径より大きい請求項１～６のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイチップ。
  8. 前記磁性部材の開口部にマーキングを有する請求項１～７のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイチップ。
  9. 請求項１～８のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイの少なくとも一部のマイクロウェルに、検体細胞を収容し、収容した検体細胞を観察する方法であって、
    前記検体細胞に磁気ビーズを取り付ける工程、
    磁気ビーズを取り付けた検体細胞をマイクロウェルアレイチップのマイクロウェル層の表面に供給して、1つのマイクロウェルに1つの細胞を収容する工程、および
    前記マイクロウェルに収容された細胞から発せられる蛍光を、基板底部側から前記磁性部材の開口部を介して観察する工程、
    を含む、前記方法。
  10. 前記基板底部側からの蛍光観察は、倒立顕微鏡を用いて行う請求項９に記載の方法。
  11. 細胞のマイクロウェルへの収容は、基板底部側から外部磁石で磁気ビーズを吸引することで促進する請求項９または１０に記載の方法。
  12. 前記検体細胞が免疫細胞、ガン細胞、ハイブリドーマ、幹細胞または細胞株である請求項９～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記検体細胞が抗原特異的リンパ球を含む請求項９～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 請求項９～１３のいずれか１項に記載の方法でマイクロウェルに収容した細胞の中から蛍光観察により目的細胞を特定し、特定した目的細胞をウェルから回収することを含む目的細胞の回収方法。
  15. 目的細胞が、抗原特異的抗体分泌細胞である請求項１４に記載の回収方法。
  16. 目的細胞が、特異的免疫グロブリン産生細胞または特異的サイトカイン産生細胞である請求項１４または１５に記載の回収方法。
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