JP5365736B1 - マイクロウェルアレイチップおよび細胞の回収方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】磁気による細胞のマイクロウェルへの強制配列をおこなう機能を有し、かつチップの底部側からマイクロウェル内の細胞の蛍光観察ができるチップを提供する。
【解決手段】透光性を有する基板の少なくとも一方の主表面にマイクロウェル層を有し、マイクロウェル層が有する複数のマイクロウェルは、１つのマイクロウェルに1つの生体細胞のみを収容する形状と寸法を有し、マイクロウェルは、その底面が生体細胞に無害で、かつ透光性を有するバリア部材の表面からなり、バリア部材からなる底面と基板の表面との間に、磁性部材を有し、磁性部材は、マイクロウェルの底面を平面視したときに、1または2以上の開口部を有する、マイクロウェルアレイチップ。このマイクロウェルアレイの少なくとも一部のマイクロウェルに、検体細胞を収容し、収容した検体細胞を観察する方法であって、マイクロウェルに収容された細胞から発せられる蛍光を、基板底部側から磁性部材の開口部を介して観察する方法。
【選択図】図２
【解決手段】透光性を有する基板の少なくとも一方の主表面にマイクロウェル層を有し、マイクロウェル層が有する複数のマイクロウェルは、１つのマイクロウェルに1つの生体細胞のみを収容する形状と寸法を有し、マイクロウェルは、その底面が生体細胞に無害で、かつ透光性を有するバリア部材の表面からなり、バリア部材からなる底面と基板の表面との間に、磁性部材を有し、磁性部材は、マイクロウェルの底面を平面視したときに、1または2以上の開口部を有する、マイクロウェルアレイチップ。このマイクロウェルアレイの少なくとも一部のマイクロウェルに、検体細胞を収容し、収容した検体細胞を観察する方法であって、マイクロウェルに収容された細胞から発せられる蛍光を、基板底部側から磁性部材の開口部を介して観察する方法。
【選択図】図２
Description
本発明は、マイクロウェルアレイチップおよびこのチップへ収容した細胞の蛍光観察方法、このチップを用いる細胞の回収方法に関する。
発明者は、これまでに種々の細胞チップを開発し、さらにこれらのチップを利用した抗体スクリーニングシステムも開発した(特許文献1〜３)。特に、少量のサンプルで、短時間に効率よくサンプル中の細胞を収容でき、かつチップ表面の抗体などのタンパク質に結合する蛍光標識付抗原などの蛍光を観察することにより行う細胞のスクリーニングに用いるのに適した細胞チップを提供し、特許を取得した（特許文献４）。
特許文献４に記載のチップは、マイクロウェル層を構成する材料からの自家蛍光を抑えるために遮光層を有するため、医療業界で一般的に利用されている倒立顕微鏡を用いてチップの底部側からマイクロウェル内の細胞の蛍光観察ができないという問題があった。
そこで発明の目的は、磁気による細胞のマイクロウェルへの強制配列をおこなう機能を有し、かつチップの底部側からマイクロウェル内の細胞の蛍光観察ができるチップを提供することを目的とする。
［１］
透光性を有する基板の少なくとも一方の主表面にマイクロウェル層を有し、
前記マイクロウェル層は、可視光領域における自家蛍光性を有さない材料からなり、
前記マイクロウェル層が有する複数のマイクロウェルは、１つのマイクロウェルに1つの生体細胞のみを収容する形状と寸法を有し、
前記マイクロウェルは、その底面が前記生体細胞に無害で、かつ可視光領域における透光性を有するバリア部材の表面からなり、
前記バリア部材からなる底面と前記基板の表面との間に、磁性部材を有し、
前記磁性部材は、前記マイクロウェルの底面を平面視したときに、1または2以上の開口部を有し、
前記バリア部材からなる前記マイクロウェル底面から、前記磁性部材の開口部を経て前記基板の底部面まで可視光領域における透光性を有する、
前記マイクロウェルに収容された細胞から発せられる可視光領域に発光波長ピークを有する蛍光を、基板底部側から前記磁性部材の開口部を介して観察する方法に用いるためのマイクロウェルアレイチップ。
［２］
前記自家蛍光性を有さない材料がB励起及びG励起において自家蛍光が見られない材料である、［１］に記載のマイクロウェルアレイチップ。
［３］
前記基板と前記マイクロウェル層との間に下地透明電極層を有し、前記磁性部材は、前記下地透明電極層と前記マイクロウェル層との間に位置する［１］または［２］に記載のマイクロウェルアレイチップ。
［４］
前記磁性部材は、前記マイクロウェルの底面を平面視したときに、最大外径が、前記マイクロウェルの最大内径より大きい［１］〜［３］のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイチップ。
［５］
前記磁性部材の開口部にマーキングを有する［１］〜［４］のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイチップ。
［６］
［１］〜［５］のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイの少なくとも一部のマイクロウェルに、検体細胞を収容し、収容した検体細胞を観察する方法であって、
前記検体細胞に磁気ビーズを取り付ける工程、
磁気ビーズを取り付けた検体細胞をマイクロウェルアレイチップのマイクロウェル層の表面に供給して、1つのマイクロウェルに1つの細胞を収容する工程、および
前記マイクロウェルに収容された細胞から発せられる可視光領域に発光波長ピークを有する蛍光を、基板底部側から前記磁性部材の開口部を介して観察する工程、
を含む、前記方法。
［７］
前記基板底部側からの蛍光観察は、倒立顕微鏡を用いて行う［６］に記載の方法。
［８］
細胞のマイクロウェルへの収容は、基板底部側から外部磁石で磁気ビーズを吸引することで促進する［６］または［７］に記載の方法。
［９］
前記検体細胞が免疫細胞、ガン細胞、ハイブリドーマ、幹細胞または細胞株である［６］〜［８］のいずれか１項に記載の方法。
［１０］
前記検体細胞が抗原特異的リンパ球を含む［６］〜［８］のいずれか１項に記載の方法。
［１１］
［６］〜［１０］のいずれか１項に記載の方法でマイクロウェルに収容した細胞の中から蛍光観察により目的細胞を特定し、特定した目的細胞をウェルから回収することを含む目的細胞の回収方法。
［１２］
目的細胞が、抗原特異的抗体分泌細胞である［１１］に記載の回収方法。
［１３］
目的細胞が、特異的免疫グロブリン産生細胞または特異的サイトカイン産生細胞である［１１］または［１２］に記載の回収方法。
透光性を有する基板の少なくとも一方の主表面にマイクロウェル層を有し、
前記マイクロウェル層は、可視光領域における自家蛍光性を有さない材料からなり、
前記マイクロウェル層が有する複数のマイクロウェルは、１つのマイクロウェルに1つの生体細胞のみを収容する形状と寸法を有し、
前記マイクロウェルは、その底面が前記生体細胞に無害で、かつ可視光領域における透光性を有するバリア部材の表面からなり、
前記バリア部材からなる底面と前記基板の表面との間に、磁性部材を有し、
前記磁性部材は、前記マイクロウェルの底面を平面視したときに、1または2以上の開口部を有し、
前記バリア部材からなる前記マイクロウェル底面から、前記磁性部材の開口部を経て前記基板の底部面まで可視光領域における透光性を有する、
前記マイクロウェルに収容された細胞から発せられる可視光領域に発光波長ピークを有する蛍光を、基板底部側から前記磁性部材の開口部を介して観察する方法に用いるためのマイクロウェルアレイチップ。
［２］
前記自家蛍光性を有さない材料がB励起及びG励起において自家蛍光が見られない材料である、［１］に記載のマイクロウェルアレイチップ。
［３］
前記基板と前記マイクロウェル層との間に下地透明電極層を有し、前記磁性部材は、前記下地透明電極層と前記マイクロウェル層との間に位置する［１］または［２］に記載のマイクロウェルアレイチップ。
［４］
前記磁性部材は、前記マイクロウェルの底面を平面視したときに、最大外径が、前記マイクロウェルの最大内径より大きい［１］〜［３］のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイチップ。
［５］
前記磁性部材の開口部にマーキングを有する［１］〜［４］のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイチップ。
［６］
［１］〜［５］のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイの少なくとも一部のマイクロウェルに、検体細胞を収容し、収容した検体細胞を観察する方法であって、
前記検体細胞に磁気ビーズを取り付ける工程、
磁気ビーズを取り付けた検体細胞をマイクロウェルアレイチップのマイクロウェル層の表面に供給して、1つのマイクロウェルに1つの細胞を収容する工程、および
前記マイクロウェルに収容された細胞から発せられる可視光領域に発光波長ピークを有する蛍光を、基板底部側から前記磁性部材の開口部を介して観察する工程、
を含む、前記方法。
［７］
前記基板底部側からの蛍光観察は、倒立顕微鏡を用いて行う［６］に記載の方法。
［８］
細胞のマイクロウェルへの収容は、基板底部側から外部磁石で磁気ビーズを吸引することで促進する［６］または［７］に記載の方法。
［９］
前記検体細胞が免疫細胞、ガン細胞、ハイブリドーマ、幹細胞または細胞株である［６］〜［８］のいずれか１項に記載の方法。
［１０］
前記検体細胞が抗原特異的リンパ球を含む［６］〜［８］のいずれか１項に記載の方法。
［１１］
［６］〜［１０］のいずれか１項に記載の方法でマイクロウェルに収容した細胞の中から蛍光観察により目的細胞を特定し、特定した目的細胞をウェルから回収することを含む目的細胞の回収方法。
［１２］
目的細胞が、抗原特異的抗体分泌細胞である［１１］に記載の回収方法。
［１３］
目的細胞が、特異的免疫グロブリン産生細胞または特異的サイトカイン産生細胞である［１１］または［１２］に記載の回収方法。
本発明によれば、磁気による細胞のマイクロウェルへの強制配列をおこなう機能を有し、かつチップの底部側からマイクロウェル内の細胞の蛍光観察ができるチップを提供することができる。このチップを用いることで、目的細胞を例えば、倒立顕微鏡を用いて観察し特定することができる。さらに、チップを透明にすることにより、細胞やチップ上での反応をチップ上下両方の方向から観察することもできる。
さらに、磁性部材とマイクロウェルとの間にバリア部材が介在することで、マイクロウェル内で刺激を受けた細胞によって例えばウェルのｐＨが変化する等々の際に磁性材料が溶出して、細胞にダメージを与えることもない。
さらに、磁性部材とマイクロウェルとの間にバリア部材が介在することで、マイクロウェル内で刺激を受けた細胞によって例えばウェルのｐＨが変化する等々の際に磁性材料が溶出して、細胞にダメージを与えることもない。
[マイクロウェルアレイチップ]
本発明のマイクロウェルアレイチップは、透光性を有する基板の少なくとも一方の主表面にマイクロウェル層を有し、
前記マイクロウェル層が有する複数のマイクロウェルは、１つのマイクロウェルに1つの生体細胞のみを収容する形状と寸法を有し、
前記マイクロウェルは、その底面が前記生体細胞に無害で、かつ透光性を有するバリア部材の表面からなり、
前記バリア部材からなる底面と前記基板の表面との間に、磁性部材を有し、
前記磁性部材は、前記マイクロウェルの底面を平面視したときに、1または2以上の開口部を有する。
本発明のマイクロウェルアレイチップは、透光性を有する基板の少なくとも一方の主表面にマイクロウェル層を有し、
前記マイクロウェル層が有する複数のマイクロウェルは、１つのマイクロウェルに1つの生体細胞のみを収容する形状と寸法を有し、
前記マイクロウェルは、その底面が前記生体細胞に無害で、かつ透光性を有するバリア部材の表面からなり、
前記バリア部材からなる底面と前記基板の表面との間に、磁性部材を有し、
前記磁性部材は、前記マイクロウェルの底面を平面視したときに、1または2以上の開口部を有する。
以下、本発明のマイクロウェルアレイチップについて図面に基づいて説明する。本発明のマイクロウェルアレイチップの一例の斜視説明図を図１に、断面図を図２に示す。
＜基板＞
本発明のマイクロウェルアレイチップに用いる基板は、透光性を有する基板である。図１及び２では２ａである。透光性とは、マイクロウェルに収容した細胞またはその周辺から発生する蛍光を透過できる性質を意味する。蛍光は、通常、可視光領域である４００〜７００ｎｍの波長範囲に発光波長のピークを有することから、透光性を有する基板は、少なくとも上記可視光領域の光に対して良好な透過性を有する基板であることから好ましい。透光性を有する基板は、例えばガラスであることができ、樹脂などでもよい。樹脂基板は、例えばABS樹脂、ポリカーボネート、COC(シクロオレフィンコポリマー)、アクリル、PVC、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ酢酸ビニル、PET(ポリエチレンテレフタレート)、PEN(ポリエチレンナフタレート)などが挙げられる。但し、チップの底部側からマイクロウェル内の細胞の蛍光観察ができるチップを提供するという観点からは、基板は、透光性を有することに加えて、自家蛍光を発しないか、発しても微弱であり上記蛍光観察に支障がない素材からなることが適当である。透光性を有し、かつ自家蛍光を全く発しない素材としては、石英ガラスを挙げることができる。自家蛍光が微弱であり上記蛍光観察に支障がない素材としては、低蛍光ガラス、アクリル系樹脂、COC(シクロオレフィンコポリマー)などを挙げることができる。
本発明のマイクロウェルアレイチップに用いる基板は、透光性を有する基板である。図１及び２では２ａである。透光性とは、マイクロウェルに収容した細胞またはその周辺から発生する蛍光を透過できる性質を意味する。蛍光は、通常、可視光領域である４００〜７００ｎｍの波長範囲に発光波長のピークを有することから、透光性を有する基板は、少なくとも上記可視光領域の光に対して良好な透過性を有する基板であることから好ましい。透光性を有する基板は、例えばガラスであることができ、樹脂などでもよい。樹脂基板は、例えばABS樹脂、ポリカーボネート、COC(シクロオレフィンコポリマー)、アクリル、PVC、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ酢酸ビニル、PET(ポリエチレンテレフタレート)、PEN(ポリエチレンナフタレート)などが挙げられる。但し、チップの底部側からマイクロウェル内の細胞の蛍光観察ができるチップを提供するという観点からは、基板は、透光性を有することに加えて、自家蛍光を発しないか、発しても微弱であり上記蛍光観察に支障がない素材からなることが適当である。透光性を有し、かつ自家蛍光を全く発しない素材としては、石英ガラスを挙げることができる。自家蛍光が微弱であり上記蛍光観察に支障がない素材としては、低蛍光ガラス、アクリル系樹脂、COC(シクロオレフィンコポリマー)などを挙げることができる。
基板の厚みや形状には特に制限はなく、チップが使用される態様等を考慮して適宜決定することができる。
＜マイクロウェル層＞
本発明のマイクロウェルアレイチップは、透光性を有する基板の少なくとも一方の主表面にマイクロウェル層を有する。図１及び２では２ｇである。マイクロウェル層は複数のマイクロウェル２ｈを有し、かつ各マイクロウェルは、１つのマイクロウェルに1つの生体細胞のみを収容する形状と寸法を有する。
本発明のマイクロウェルアレイチップは、透光性を有する基板の少なくとも一方の主表面にマイクロウェル層を有する。図１及び２では２ｇである。マイクロウェル層は複数のマイクロウェル２ｈを有し、かつ各マイクロウェルは、１つのマイクロウェルに1つの生体細胞のみを収容する形状と寸法を有する。
上記生体細胞は、蛍光観察により活動状態などを検出したい細胞であれば、特に制限はない。生体細胞としては、例えば、リンパ球、有核赤血球、ガン細胞、幹細胞等を挙げることができる。生体細胞が、例えば、リンパ球である場合、本発明のマイクロウェルアレイチップを用いることで、例えば、抗原特異的リンパ球を１個単位で蛍光観察により検出することができる。
複数のマイクロウェルは同一間隔で縦横に配置されており、所定個数のマイクロウェル毎にマーカーが設けられていることが好ましい。さらに、所定個数のマイクロウェル毎にグループ分けして基板の主表面上に設けられることかもできる。例えば、図３に、２５×２５のマイクロウェルを１つのクラスタとして、そのクラスタが縦横に３個ずつ配列されたマイクロウェルアレイチップの平面図を示す。クラスタを構成するマイクロウェルの数やクラスタの配列数には特に制限はなく、例えば２５×２５ウェル/クラスタ、１０×１０クラスタであることができる。
１つのマイクロウェルのグループを構成するマイクロウェルの数には特に制限はないが、例えば、10〜10,000の範囲であることができる。
マイクロウェルの形状や寸法には特に制限はないが、マイクロウェルの形状は、例えば、円筒形であることができ、円筒形以外に、複数の面により構成される多面体（例えば、直方体、六角柱、八角柱等）、逆円錐形、逆角錐形（逆三角錐形、逆四角錐形、逆五角錐形、逆六角錐形、七角以上の逆多角錐形）等であることもでき、これらの形状の二つ以上を組み合わせた形状であることもできる。例えば、一部が円筒形であり、残りが逆円錐形であることができる。また、逆円錐形、逆角錐形の場合、底面がマイクロウェルの開口となるが、逆円錐形、逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状である（その場合、マイクロウェルの底部は平坦になる）こともできる。円筒形、直方体は、マイクロウェルの底部は通常、平坦であるが、曲面（凸面や凹面）とすることもできる。マイクロウェルの底部を曲面とすることができるのは、逆円錐形、逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状の場合も同様である。
マイクロウェルの形状や寸法は、マイクロウェルに収容されるべき生体細胞の種類（生体細胞の形状や寸法等）を考慮して、１つのマイクロウェルに１つの生体細胞が収容されるように、適宜決定される。
１つのマイクロウェルに１つの生体細胞が収容されるようにするためには、例えば、マイクロウェルの平面形状に内接する最大円の直径が、マイクロウェルに収容しようとする生体細胞の直径の0.5〜2倍の範囲、好ましくは0.8〜1.9倍の範囲、より好ましくは0.8〜1.8倍の範囲であることが適当である。
また、マイクロウェルの深さは、マイクロウェルに収容しようとする生体細胞の直径の0.5〜4倍の範囲、好ましくは0.8〜1.9倍の範囲、より好ましくは0.8〜1.8倍の範囲であることが適当である。
マイクロウェルが円筒形の場合、その寸法は、例えば、直径3〜100μｍであることができ、生体細胞がＢリンパ球の場合、好ましくは、直径は4〜15μｍである。また、深さは、例えば、3〜100μｍであることができ、生体細胞がＢリンパ球の場合、好ましくは、深さは4〜40μｍであることができる。但し、マイクロウェルの寸法は、上述のように、マイクロウェルに収容しようとする生体細胞の直径とのマイクロウェルの寸法の好適な比を考慮して適宜決定する。
１つのマイクロウェルアレイチップが有するマイクロウェルの数は、特に制限はないが、生体細胞がリンパ球の場合、抗原特異的リンパ球の頻度が105個に１個から多い場合には約500個であるという観点から、1cm2当たり、例えば、2,000〜1,000,000個の範囲であることができる。
マイクロウェル層は、例えば、樹脂により作製されることができ、樹脂としては、例えば、光感光性樹脂あるいは熱可塑性樹脂などが利用できる。光感光性樹脂あるいは熱可塑性樹脂は、基板の材料と同様に、チップの底部側からマイクロウェル内の細胞の蛍光観察ができるチップを提供するという観点から、自家蛍光を全く発しないか、発しても微弱であり上記蛍光観察に支障がない素材からなることが適当である。そのような観点から、マイクロウェル層は、例えば、シリコーン系樹脂、アクリル系樹脂などからなることが好ましい。
＜バリア部材＞
バリア部材は、マイクロウェル層のマイクロウェルの底面を少なくとも構成するものであり、具体的には、例えば、マイクロウェル層と基板との間に層構造として設けられることができる。あるいは層構造ではなく、個々のマイクロウェルの底面または磁性部材に対応して個別に設けることもできる。図２では２ｅである。バリア部材は、生体細胞に無害で、かつ透光性を有する材料からなるものであり、ここでの透光性は基板で説明したものと同様である。生体細胞に無害とは、バリア部材の表面が底面となっているマイクロウェル中に収容された細胞の活動性が、チップの使用中に実質的な影響を受けないことを意味する。そのようなバリア部材の材料としては、例えば、シリカ膜、PDMS(ポリジメチルシロキサン)、アクリル系樹脂、東レ・ダウコーニングWL-5150およびWL-5153に代表される透明レジスト等を挙げることができる。バリア部材の厚みは、特に制限はなく、磁性部材による生体細胞への影響を実質的に遮断できる範囲で適宜決定できる。限定的な意味ではないが、バリア部材の厚みは、例えば、０．１μｍ〜２ｍｍの範囲とすることができる。
バリア部材は、マイクロウェル層のマイクロウェルの底面を少なくとも構成するものであり、具体的には、例えば、マイクロウェル層と基板との間に層構造として設けられることができる。あるいは層構造ではなく、個々のマイクロウェルの底面または磁性部材に対応して個別に設けることもできる。図２では２ｅである。バリア部材は、生体細胞に無害で、かつ透光性を有する材料からなるものであり、ここでの透光性は基板で説明したものと同様である。生体細胞に無害とは、バリア部材の表面が底面となっているマイクロウェル中に収容された細胞の活動性が、チップの使用中に実質的な影響を受けないことを意味する。そのようなバリア部材の材料としては、例えば、シリカ膜、PDMS(ポリジメチルシロキサン)、アクリル系樹脂、東レ・ダウコーニングWL-5150およびWL-5153に代表される透明レジスト等を挙げることができる。バリア部材の厚みは、特に制限はなく、磁性部材による生体細胞への影響を実質的に遮断できる範囲で適宜決定できる。限定的な意味ではないが、バリア部材の厚みは、例えば、０．１μｍ〜２ｍｍの範囲とすることができる。
＜磁性部材＞
図２に示すように、マイクロウェル２ｈは、バリア部材２ｅを介してその底面下の一部または全部に磁性部材２ｄを有する。尚、本発明のマイクロウェルアレイチップは、前記磁性部材以外の磁性部材を有さない。磁性部材の形状は、マイクロウェルの底面を平面視したときに、1または2以上の開口部を有するものとし、それ以外には、特に制限はない。前記開口部を有することで、マイクロウェルに収容された生体細胞を倒立顕微鏡で観察することができる。図４に磁性部材の平面形状の例を示す。例示した磁性部材は、1個または2個の開口部を有する。外側の輪郭は、円形や多角形（例えば、三角形、四角形）など様々な形状をとることができる。磁性部材の平面形状は、外側の輪郭及び開口の形状は、ウェル底面の形状に対して略相似形であっても、全く類似しない形状であってもよい。どの場合でも、ウェル底面の底面を平面視したときに、1または2以上の開口部がある状態であれば、チップの主表面反対側からウェル内の蛍光観察は可能である。尚、図４に例示した磁性部材の平面形状中に、開口部内に突起部（対向するタイプ（(6)〜(10)）と架橋タイプ（(3)、(4)）がある。これら突起部は、対向するタイプ及び架橋タイプの何れも、磁性部材に磁気回路を形成させることによって、細胞を磁性部材の開口部中心へ引き寄せることを目的としたものである。
図２に示すように、マイクロウェル２ｈは、バリア部材２ｅを介してその底面下の一部または全部に磁性部材２ｄを有する。尚、本発明のマイクロウェルアレイチップは、前記磁性部材以外の磁性部材を有さない。磁性部材の形状は、マイクロウェルの底面を平面視したときに、1または2以上の開口部を有するものとし、それ以外には、特に制限はない。前記開口部を有することで、マイクロウェルに収容された生体細胞を倒立顕微鏡で観察することができる。図４に磁性部材の平面形状の例を示す。例示した磁性部材は、1個または2個の開口部を有する。外側の輪郭は、円形や多角形（例えば、三角形、四角形）など様々な形状をとることができる。磁性部材の平面形状は、外側の輪郭及び開口の形状は、ウェル底面の形状に対して略相似形であっても、全く類似しない形状であってもよい。どの場合でも、ウェル底面の底面を平面視したときに、1または2以上の開口部がある状態であれば、チップの主表面反対側からウェル内の蛍光観察は可能である。尚、図４に例示した磁性部材の平面形状中に、開口部内に突起部（対向するタイプ（(6)〜(10)）と架橋タイプ（(3)、(4)）がある。これら突起部は、対向するタイプ及び架橋タイプの何れも、磁性部材に磁気回路を形成させることによって、細胞を磁性部材の開口部中心へ引き寄せることを目的としたものである。
図５に磁性部材２ｄ等の寸法の一例を示す。図５に示す例では、マイクロウェル２ｈの直径Ｄは、細胞がちょうど1つ収まるサイズとなっており、リング状の磁気部材２ｄの内周は、マイクロウェル２ｈの直径より小さく、また磁気部材２ｄの外周はマイクロウェル２ｈの直径Ｄより大きく設定される。A寸法は、例えば、1〜5マイクロメートルであり、ウェル周囲の観察を妨げないよう適宜選択される。B寸法は、1〜D/2マイクロメートル未満であり、マイクロウェルに収容された被検査体の観察を妨げないような寸法が適宜選択される。磁気リングの太さL寸法は、A+Bの値である。
磁性部材は磁性材料により構成され、磁性材料としては、例えば、ニッケルおよびフェライトやコバルト系などの強磁性体を挙げることができる。磁性材料の具体例は後述する。磁性部材の厚みは、磁性部材に求められる磁力に応じて適宜決定できるが、例えば、0.1〜5μｍの範囲である。これら磁性部材は、例えばめっきにより作製することができる。めっき方法は、電気めっき、無電解めっきが挙げられる。電気めっきの場合は、電極となる下地電極が必要であり、無電解めっきの場合は必要ではない。形成された磁性部材を磁界にいれることにより、磁性部材中の磁束密度が高くなる。磁界は、いわゆる永久磁石と呼ばれるものでサマリウムコバルト、ネオジム等や電磁石により形成される。
上記のように、磁性部材を電気めっきで作製する場合には、基板とマイクロウェル層との間に下地電極層２ｂを有し、磁性部材は、下地電極層とマイクロウェル層との間に位置する。本発明のマイクロウェルアレイチップが下地電極層を有する場合、下地電極は、少なくとも基板と磁性部材の間に位置する。下地電極は、磁性部材を電気めっき工程で作製する際に利用され、蒸着あるいは無電解めっきなどにより形成される。下地電極の膜厚は、特に限定はないが、例えば、50nm以上300nm以下の範囲であり、さらに80nm以上150nm以下であることが好ましい。
本発明のマイクロウェルアレイチップの製造方法について説明をする。ここでは、基板としてガラス基板を用いる場合を例に、図６に基づいて説明する。
（１）ガラス基板2aの主表面上に下地電極2bを蒸着などにより形成する。下地電極は、ITO、ZnOなどの透明電極材料あるいはポリアセチレン、ポリアニリン、ポリチオフェンなどの導電性高分子膜などの透明電極材料などガラスと密着性のよい材料から選択することができる。（図６（１））
（２）ガラス基板2a上の下地電極2b上に感光性樹脂2c、例えば東京応化工業株式会社ポジレジストTHMR-iP5700 HPなどをスピンコートなどにより塗布することができる。（図６（１））
（３）この感光性樹脂をフォトリソグラフィにて磁性部材パターン2c'を形成することができる。（図６（２））
（４）磁性部材パターン2c'中に露出した下地電極2b上に電気めっきなどにて、磁性部材2dを成膜する。磁性部材2dは、例えば、ニッケル膜であり、例えば、スルファミン酸ニッケル浴などによって形成することができる。（図６（３））
（５）磁性部材2dを形成後、感光性樹脂を、例えば、アセトンなどで除去する。（図６（４））
（６）磁性部材2d上に、バリア層2eとなる透明樹脂、例えば、東レダウコーニング社WL-5351などを、例えば、0.5〜5μm厚程度で塗布し、十分に硬化させる。またバリア層2eは、シリカ膜であることができ、例えばスパッタ蒸着などにより、例えば、0.1〜1μm厚程度で成膜することができる。（図６（５））
（７）バリア層2e上に、マイクロウェル層2gとなる透明樹脂2f、例えば、東レダウコーニング社WL-5351などを、例えば、5〜15μm厚程度で塗布し、磁性部材2dのパターンがマイクロウェル2hの底に形成されるようにフォトリソグラフィ技術を利用して、マイクロウェル層2eを加工する。（図６（６））
（８）上記磁性部材2dを無電解めっきにて作製する場合は、フォトレジストでパターン形成後に、センシタイジングとアクティベーティングを行い、その後、フォトレジストを剥離、無電解めっき浴に浸漬すれば、その活性部分のみに磁性部材を析出させることができる。また、無電解Ni-Pをパターン開口部に析出させて、無電解の磁性めっき浴に浸漬すれば、そのパターニングされた無電解Ni-Pめっき膜上にのみに析出させることができる。（図６（７））
（９）以上の操作により本発明によるマイクロウェルアレイチップを調製することができる。
（１）ガラス基板2aの主表面上に下地電極2bを蒸着などにより形成する。下地電極は、ITO、ZnOなどの透明電極材料あるいはポリアセチレン、ポリアニリン、ポリチオフェンなどの導電性高分子膜などの透明電極材料などガラスと密着性のよい材料から選択することができる。（図６（１））
（２）ガラス基板2a上の下地電極2b上に感光性樹脂2c、例えば東京応化工業株式会社ポジレジストTHMR-iP5700 HPなどをスピンコートなどにより塗布することができる。（図６（１））
（３）この感光性樹脂をフォトリソグラフィにて磁性部材パターン2c'を形成することができる。（図６（２））
（４）磁性部材パターン2c'中に露出した下地電極2b上に電気めっきなどにて、磁性部材2dを成膜する。磁性部材2dは、例えば、ニッケル膜であり、例えば、スルファミン酸ニッケル浴などによって形成することができる。（図６（３））
（５）磁性部材2dを形成後、感光性樹脂を、例えば、アセトンなどで除去する。（図６（４））
（６）磁性部材2d上に、バリア層2eとなる透明樹脂、例えば、東レダウコーニング社WL-5351などを、例えば、0.5〜5μm厚程度で塗布し、十分に硬化させる。またバリア層2eは、シリカ膜であることができ、例えばスパッタ蒸着などにより、例えば、0.1〜1μm厚程度で成膜することができる。（図６（５））
（７）バリア層2e上に、マイクロウェル層2gとなる透明樹脂2f、例えば、東レダウコーニング社WL-5351などを、例えば、5〜15μm厚程度で塗布し、磁性部材2dのパターンがマイクロウェル2hの底に形成されるようにフォトリソグラフィ技術を利用して、マイクロウェル層2eを加工する。（図６（６））
（８）上記磁性部材2dを無電解めっきにて作製する場合は、フォトレジストでパターン形成後に、センシタイジングとアクティベーティングを行い、その後、フォトレジストを剥離、無電解めっき浴に浸漬すれば、その活性部分のみに磁性部材を析出させることができる。また、無電解Ni-Pをパターン開口部に析出させて、無電解の磁性めっき浴に浸漬すれば、そのパターニングされた無電解Ni-Pめっき膜上にのみに析出させることができる。（図６（７））
（９）以上の操作により本発明によるマイクロウェルアレイチップを調製することができる。
（１）磁性部材のめっき
[電気めっき方法]
Ni-P、Ni-B、Co-Ni-P、Co-P系合金、Ni-Fe系合金、Co-Ni-Fe系合金などの電気めっき膜は、磁気特性としては強磁性をしめす。しかしリンを含む例えば8%以上のニッケルめっき膜は、非磁性であり、磁性を発生させるためには熱処理などが必要となるため本発明には最適な手法ではない。
[電気めっき方法]
Ni-P、Ni-B、Co-Ni-P、Co-P系合金、Ni-Fe系合金、Co-Ni-Fe系合金などの電気めっき膜は、磁気特性としては強磁性をしめす。しかしリンを含む例えば8%以上のニッケルめっき膜は、非磁性であり、磁性を発生させるためには熱処理などが必要となるため本発明には最適な手法ではない。
例えばニッケル電気めっきは、内部応力の少ないスルファミン酸ニッケル浴にて行われる。そのほかには、硫酸ニッケルを主成分とするワット浴、塩化ニッケルを主成分とするウッド浴などが使われる。以下にスルファミン酸ニッケル浴による本発明における磁性部材の形成方法の概略を示す。
A) 磁性部材を形成するための下地電極を有する基板を脱脂処理する。
B) スルファミン酸ニッケル浴を約50℃に暖め、陽極としてニッケル板、陰極として下地電極を有する基板を浴内に浸漬させる。
C) 約1〜100mAの電流を電極間に１０秒から６０分程度流す。
D) 基板を浴から取り出し、水で洗浄を行う。
E) めっき厚は、0.5ミクロンから5ミクロンであり、好ましくは1ミクロンから3ミクロンの間とする。
ニッケル電気めっき法には、他にワット浴なども使用される。
A) 磁性部材を形成するための下地電極を有する基板を脱脂処理する。
B) スルファミン酸ニッケル浴を約50℃に暖め、陽極としてニッケル板、陰極として下地電極を有する基板を浴内に浸漬させる。
C) 約1〜100mAの電流を電極間に１０秒から６０分程度流す。
D) 基板を浴から取り出し、水で洗浄を行う。
E) めっき厚は、0.5ミクロンから5ミクロンであり、好ましくは1ミクロンから3ミクロンの間とする。
ニッケル電気めっき法には、他にワット浴なども使用される。
[無電解めっき]
無電解めっきによっても磁性部材を形成可能である。例えばNi-P、Ni-B、Co-Ni-P、Co-P系合金、Ni-Fe系合金、Co-Ni-Fe系合金などが挙げられる。Ni-Pの場合、Pの含有量が8%以上では析出状態では非磁性となってしまう。ただし、300℃以上の熱処理を行うと高いPの含有においても磁化される。無電解ニッケルめっき膜は、例えば硫酸ニッケルと次亜リン酸ナトリウムの浴で作製することが可能である。無電解めっきによるとガラス基板や樹脂基板に直接めっきを行うことが可能である。
無電解めっきによっても磁性部材を形成可能である。例えばNi-P、Ni-B、Co-Ni-P、Co-P系合金、Ni-Fe系合金、Co-Ni-Fe系合金などが挙げられる。Ni-Pの場合、Pの含有量が8%以上では析出状態では非磁性となってしまう。ただし、300℃以上の熱処理を行うと高いPの含有においても磁化される。無電解ニッケルめっき膜は、例えば硫酸ニッケルと次亜リン酸ナトリウムの浴で作製することが可能である。無電解めっきによるとガラス基板や樹脂基板に直接めっきを行うことが可能である。
本発明のマイクロウェルアレイチップの磁性部材は磁化することで、磁気修飾した細胞を含む生体試料を吸引、収容することが可能で、さらにそれを回収することが可能である。磁化方法は常法を用いることができる。
本発明のマイクロウェルアレイチップは、磁性部材の開口部にマーキングを有することができる。マーキングとは、開口部の特定に使用することができる文字、数字、記号、模様等またはこれらの組合せからなることができ、開口部における光透過を妨げない程度の大きさや形状であればよい。
＜検体細胞をマイクロウェルに収容する方法＞
本発明は上記本発明のマイクロウェルアレイの少なくとも一部のマイクロウェルに、検体細胞を収容し、収容した検体細胞を観察する方法を包含する。
この方法は、
前記検体細胞に磁気ビーズを取り付ける工程、
磁気ビーズを取り付けた検体細胞をマイクロウェルアレイチップのマイクロウェル層の表面に供給して、1つのマイクロウェルに1つの細胞を収容する工程、および
前記マイクロウェルに収容された細胞から発せられる蛍光を、基板底部側から前記磁性部材の開口部を介して観察する工程、
を含む。
本発明は上記本発明のマイクロウェルアレイの少なくとも一部のマイクロウェルに、検体細胞を収容し、収容した検体細胞を観察する方法を包含する。
この方法は、
前記検体細胞に磁気ビーズを取り付ける工程、
磁気ビーズを取り付けた検体細胞をマイクロウェルアレイチップのマイクロウェル層の表面に供給して、1つのマイクロウェルに1つの細胞を収容する工程、および
前記マイクロウェルに収容された細胞から発せられる蛍光を、基板底部側から前記磁性部材の開口部を介して観察する工程、
を含む。
前記検体細胞に磁気ビーズを取り付ける方法は、公知の方法を適宜利用できる。例えば、細胞表面に存在する分子、例えば表面抗原等に特異的に結合する抗体を介して検体細胞に磁気ビーズを結合させる方法が知られている。検体細胞とその表面分子に特異的な抗体を固定化した磁気ビーズを接触させることにより磁気ビーズを結合させた細胞を得ることができる。また、任意の標識分子を結合させた抗体を検体細胞の表面分子に結合させ、次いで標識物質に結合する分子を固定化した磁気ビーズと接触させることにより検体細胞を間接的に磁気標識することができる。抗体の標識分子とそれに結合する磁気ビーズに固定化された分子は特異的に結合する組み合わせであればよく、ビオチンとストレプトアビジンの組み合わせ等が挙げられる。また、抗体の代わりに細胞表面の受容体のリガンドを結合させた磁気ビーズを用い、目的細胞表面の受容体に結合させることにより磁気ビーズを結合させることもできる。さらには、磁気ビーズを細胞に貪食させることで、細胞表面ではなく細胞内に磁気ビーズを導入することで、細胞を磁気ビーズで標識することも可能である。使用する磁気ビーズは直径10nm〜10μmを使用することができる。磁気ビーズの粒子形状は球状やクラスタ状であることができる。
表面抗原としては、ヒトBリンパ球であればCD19、CD20、CD21、CD23等、ヒト形質細胞であればCD38、CD138、ヒトTリンパ球であればCD2、CD3などが利用できる。また、細胞表面のリガンドとしては、Bリンパ球の抗原受容体として機能する細胞表面の抗体のリガンドである抗原、Tリンパ球の抗原受容体のリガンドであるMHC/peptide等をあげることができる。
検体細胞に磁気ビーズを取り付け、その磁気ビーズを磁気吸引することで1つのマイクロウェルに1つの検体細胞を収容することが可能である。これにより、例えば、抗原特異的リンパ球などの検体細胞をマイクロウェルに容易に収容することができ、かつマイクロウェルに収容した検体細胞を検体細胞に予め付与しておいた標識を用いて容易に目的とする細胞を選別可能である。
上記磁気ビーズを取り付けた検体細胞をマイクロウェルアレイチップのマイクロウェル層の表面に供給して、1つのマイクロウェルに1つの細胞を収容する。磁気ビーズを取り付けた検体細胞は、例えば、緩衝液または培養液に分散された状態で、マイクロウェル層の表面に供給される。上記分散液中の検体細胞の濃度は、マイクロウェルへの収容がスムーズであるとの観点からは、例えば、ウェル数の0.5〜1.5倍の範囲であることが適当である。磁気ビーズを取り付けた検体細胞のマイクロウェル層表面への供給操作は、室温で実施することもできるが、冷却下または加温下で実施することもできる。さらに、磁気ビーズを取り付けた検体細胞のマイクロウェル層表面への供給操作の際に、マイクロウェルアレイチップを静置してもよくまたは適度な振動を加えてもよい。
本発明のマイクロウェルアレイチップは磁性部材を有するため、磁気ビーズを取り付けた検体細胞が、マイクロウェル底部の磁性部材に引きつけられて、検体細胞のマイクロウェルへの収容が促進される。検体細胞のマイクロウェルへの収容を促進するという観点からは、磁性部材が有する表面磁束密度は100ｍT〜500ｍT程度であることが好ましい。また、磁性部材の表面磁束密度が前記範囲に満たない場合には、外部の磁石を併用することか好ましい。磁性部材の表面磁束密度が前記範囲を満足する場合でも外部の磁石を併用することはできる。外部の磁石は、マイクロウェルアレイチップの底面の少なくともマイクロウェルアレイが存在する部分を全面または部分的にカバーするものであることが適当である。外部の磁石は、マイクロウェル底部の磁性部材に引きつけられて、磁気ビーズを取り付けた検体細胞のマイクロウェルへの収容が促進されるという観点からは、表面磁束密度は100ｍT〜800ｍT程度であることが好ましい。
本発明のマイクロウェルアレイチップは、図７に示すようにマイクロウェルの底面には、磁性部材を有している。本磁性部材はマイクロウェル底面のみに局在することで、磁束をマイクロウェル内へ収束させることが可能である。その大きさは、マイクロウェルの開口とほぼ同等であり、マイクロウェル1つにつき1つ以上の磁性スポットパターンにより構成される。その形状は円あるいは多角形あるいはそれらの複数の組み合わせであることができる。本磁性部材によって磁束をマイクロウェルに収束させることによって、磁気ビーズによって修飾された生体細胞は、マイクロウェル内に吸引され、収容される。これにより、チップ上に播種された生体細胞はほぼ1つのマイクロウェルに１細胞が収容されるが、仮に収容されるチップ表面に浮遊している場合は、洗浄作業を行う。洗浄の際も細胞はマイクロウェル底の磁性部材に安定して吸引されているため、ウェルから抜け出すことはない。さらに外部からの磁界を取り除くことによって、マイクロウェルに収容された細胞は容易に回収することも可能である。
検体細胞には、特に限定はないが、例えばリンパ球などの免疫細胞、ガン細胞、ハイブリドーマ、細胞株、幹細胞などの生体細胞であり、これら生体細胞を1個単位で検出するために用いられるものである。検体細胞は、抗原特異的リンパ球を含む細胞集団であることができる。
マイクロウェルに収容された細胞から発せられる蛍光を、基板底部側から前記磁性部材の開口部を介して観察する。検体細胞は、例えば、マイクロウェルに収容する前に、目的細胞を特異的に標識し得る蛍光標識で処理し、目的細胞を特異的に標識し得る蛍光標識で標識された目的細胞を含む状態とするか、または、マイクロウェルに収容した後に、目的細胞を特異的に標識し得る蛍光標識と接触させて、目的細胞がマイクロウェル内で蛍光標識されてもよい。
マイクロウェルに収容された細胞から発せられる蛍光は、基板底部側から、例えば、倒立顕微鏡を用いて、磁性部材の開口部を介して観察することができる。この蛍光観察により、所定の蛍光を発する目的細胞を特定することができる。
＜目的細胞の回収方法＞
本発明は、上記方法でマイクロウェルに収容した細胞の蛍光観察により目的細胞を特定し、特定した目的細胞をウェルから回収することを含む目的細胞の回収方法も包含する。
本発明は、上記方法でマイクロウェルに収容した細胞の蛍光観察により目的細胞を特定し、特定した目的細胞をウェルから回収することを含む目的細胞の回収方法も包含する。
目的細胞は、特に限定はないが、例えば、特異的免疫グロブリン産生細胞または特異的サイトカイン産生細胞などの免疫細胞であることができる。
マイクロウェルに収容した目的細胞の蛍光観察による特定方法は、上記の通りである。
あるいは、マイクロウェルに収容した目的細胞の特定は、特許文献２に記載の抗原特異的抗体分泌細胞等の免疫細胞の検出（スクリーニング）方法であることができる。
あるいは、マイクロウェルに収容した目的細胞の特定は、特許文献２に記載の抗原特異的抗体分泌細胞等の免疫細胞の検出（スクリーニング）方法であることができる。
即ち、本発明のマイクロウェルアレイチップのウェルの周辺の前記主表面の少なくとも一部に、目的細胞が産生する物質の少なくとも一部と結合性を有する機能を有するマイクロウェル構成材料、例えば、東レ・ダウコーニングWL-5150およびWL-5153に代表される透明レジスト等であるとき、このマイクロウェルアレイチップのウェルに検体細胞を細胞の培養液とともに収容し、
ウェルを培養液に浸漬して、培養液に含まれる物質のウェルからマイクロウェル層表面への拡散が可能な状態で細胞を培養し、
培養液を除去した後に、検体細胞に含まれる目的細胞によって産生される物質に特異的に結合する標識物質、又は、目的細胞によって産生される物質と結合性を有する物質で構成されるマイクロウェル表面に特異的に結合する標識物質を、前記マイクロウェル表面に供給し、
前記マイクロウェル表面の物質に結合した、目的細胞によって産生された物質を、前記標識物質により検出して、目的細胞を特定することにより、目的細胞をスクリーニングする。
ウェルを培養液に浸漬して、培養液に含まれる物質のウェルからマイクロウェル層表面への拡散が可能な状態で細胞を培養し、
培養液を除去した後に、検体細胞に含まれる目的細胞によって産生される物質に特異的に結合する標識物質、又は、目的細胞によって産生される物質と結合性を有する物質で構成されるマイクロウェル表面に特異的に結合する標識物質を、前記マイクロウェル表面に供給し、
前記マイクロウェル表面の物質に結合した、目的細胞によって産生された物質を、前記標識物質により検出して、目的細胞を特定することにより、目的細胞をスクリーニングする。
特定した目的細胞はウェルから回収する。目的細胞のウェルからの回収は、例えば、以下のように実施できる。磁性部材を磁界から外し、マイクロマニピュレータによりガラスキャピラリ内に目的細胞を緩衝液または培養液と共に吸引し、任意の容器へ吐出することにより回収できる。
本発明では、さらに、回収した目的細胞から、抗原特異的免疫グロブリン遺伝子のmRNAを回収し、抗体cDNAを発現させ、抗原特異的抗体タンパク質を作製することができる。また、サイトカインを産生した細胞よりその細胞が発現しているT細胞受容体遺伝子のmRNAを回収し、T細胞受容体cDNAを回収し、それを別の細胞に導入することによりT細胞受容体タンパク質を発現させることができる。
本発明においては、ターゲットとなる細胞は、リンパ球をはじめガン細胞、幹細胞など磁気修飾可能な生体細胞はすべて、強制的に配列、培養、回収ができる。さらに血中からの目的細胞をスクリーニングすることも可能である。
本発明においては、ターゲットとなる細胞は、リンパ球をはじめガン細胞、幹細胞など磁気修飾可能な生体細胞はすべて、強制的に配列、培養、回収ができる。さらに血中からの目的細胞をスクリーニングすることも可能である。
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。但し、下記実施例は説明のための例示であり、本発明がこれらの実施例に限定的される意図ではない。
実施例１
下記手順に従って、本発明のマイクロウェルチップを作製した（図８参照）。
１．透明電極8bが形成された透明なガラスや樹脂基板8a主表面に、フォトレジスト8c（東京応化工業株式会社THMR-i5700HP）を塗布した。（図８（１））
２．フォトレジスト8cを磁気リングパターンに露光、現像をおこない、リングパターン形状に下地電極8bを露出させた。（図８（２））
３．露出した透明電極8b上に磁性部材8d（Ni）を電気めっき法によりスルファミン酸ニッケル浴中で１〜４ミクロン成長させた。（図８（３））
４．フォトレジスト8cをアセトンなどで除去し、磁性部材8dを残した。（図８（４））
５．主表面上に透明フォトレジスト（東レ・ダウコーニングWL-5150）を1〜5ミクロンの厚みでスピンコートした。露光、ポストエクスポージャーベーク、ポストベークを経てバリア層8eを形成した。（図８（５））
６．バリア層8e上にウェル層となる透明層8fとして透明レジスト（東レ・ダウコーニングWL-5150）を15ミクロンの厚みでスピンコートした。（図８（６））
７．透明層8gに磁性部材8dとマイクロウェルのパターンをアライメント露光し、ポストエクスポージャーベーク、現像、ポストベークを行い、マイクロウェル8hを形成した。（図８（７））これで本発明の実施例のチップが完成した。
下記手順に従って、本発明のマイクロウェルチップを作製した（図８参照）。
１．透明電極8bが形成された透明なガラスや樹脂基板8a主表面に、フォトレジスト8c（東京応化工業株式会社THMR-i5700HP）を塗布した。（図８（１））
２．フォトレジスト8cを磁気リングパターンに露光、現像をおこない、リングパターン形状に下地電極8bを露出させた。（図８（２））
３．露出した透明電極8b上に磁性部材8d（Ni）を電気めっき法によりスルファミン酸ニッケル浴中で１〜４ミクロン成長させた。（図８（３））
４．フォトレジスト8cをアセトンなどで除去し、磁性部材8dを残した。（図８（４））
５．主表面上に透明フォトレジスト（東レ・ダウコーニングWL-5150）を1〜5ミクロンの厚みでスピンコートした。露光、ポストエクスポージャーベーク、ポストベークを経てバリア層8eを形成した。（図８（５））
６．バリア層8e上にウェル層となる透明層8fとして透明レジスト（東レ・ダウコーニングWL-5150）を15ミクロンの厚みでスピンコートした。（図８（６））
７．透明層8gに磁性部材8dとマイクロウェルのパターンをアライメント露光し、ポストエクスポージャーベーク、現像、ポストベークを行い、マイクロウェル8hを形成した。（図８（７））これで本発明の実施例のチップが完成した。
実施例２
下記手順に従って、本発明のマイクロウェルチップを作製した（図９参照）。
１．透明電極9bが形成された透明なガラスまたは樹脂基板9a主表面に、フォトレジスト9c（東京応化工業株式会社ポジレジストTHMR-i5700HP）を塗布した。（図９（１））
２．フォトレジスト9cを露光、現像をおこない、リングパターン形状に下地電極9bを露出させた。（図９（２））
３．露出した透明電極9b上に磁性部材9d（Ni）を電気めっき法によりスルファミン酸ニッケル浴中で１〜４ミクロン成長させた。（図９（３））
４．フォトレジスト9cをアセトンなどで除去し、磁性部材9dを残した。（図９（４））
５．主表面上に透明フォトレジスト（東レ・ダウコーニングWL-5150）を1〜5ミクロンの厚みでスピンコートした。露光、ポストエクスポージャーベーク、ポストベークを経てバリア層9eを形成した。バリア層9eは、磁性部材9dをコンフォーマルに包み込むように形成された。（図９（５））
６．バリア層9e上に、真空蒸着で金属膜9jを成膜した。金属膜9jとしてはアルミ、チタン、白金、金などを使用できる。（図９（６））
７．金属膜9j上にフォトリソグラフィにより、フォトレジストパターン9kを形成した。フォトリソグラフィ以外の方法も利用できる。（図９（７））
８．金属膜9jをエッチングし、フォトレジストパターン9k下を残した。（図９（８））
９．フォトレジスト9kをアセトンなどで除去し、金属膜9jパターンを残した。（図９（９））
１０．透明膜層9eと金属膜9j上にウェル層となる透明層9f（透明レジストWL-5150）を15ミクロンの厚みでスピンコートした。（図９（１０））
１１．透明層9gに磁性部材9dとマイクロウェルのパターンをアライメント露光し、ポストエクスポージャーベーク、現像、ポストベークを行い、マイクロウェル9hを形成した。（図９（１１））これで本発明の実施例のチップが完成した。
下記手順に従って、本発明のマイクロウェルチップを作製した（図９参照）。
１．透明電極9bが形成された透明なガラスまたは樹脂基板9a主表面に、フォトレジスト9c（東京応化工業株式会社ポジレジストTHMR-i5700HP）を塗布した。（図９（１））
２．フォトレジスト9cを露光、現像をおこない、リングパターン形状に下地電極9bを露出させた。（図９（２））
３．露出した透明電極9b上に磁性部材9d（Ni）を電気めっき法によりスルファミン酸ニッケル浴中で１〜４ミクロン成長させた。（図９（３））
４．フォトレジスト9cをアセトンなどで除去し、磁性部材9dを残した。（図９（４））
５．主表面上に透明フォトレジスト（東レ・ダウコーニングWL-5150）を1〜5ミクロンの厚みでスピンコートした。露光、ポストエクスポージャーベーク、ポストベークを経てバリア層9eを形成した。バリア層9eは、磁性部材9dをコンフォーマルに包み込むように形成された。（図９（５））
６．バリア層9e上に、真空蒸着で金属膜9jを成膜した。金属膜9jとしてはアルミ、チタン、白金、金などを使用できる。（図９（６））
７．金属膜9j上にフォトリソグラフィにより、フォトレジストパターン9kを形成した。フォトリソグラフィ以外の方法も利用できる。（図９（７））
８．金属膜9jをエッチングし、フォトレジストパターン9k下を残した。（図９（８））
９．フォトレジスト9kをアセトンなどで除去し、金属膜9jパターンを残した。（図９（９））
１０．透明膜層9eと金属膜9j上にウェル層となる透明層9f（透明レジストWL-5150）を15ミクロンの厚みでスピンコートした。（図９（１０））
１１．透明層9gに磁性部材9dとマイクロウェルのパターンをアライメント露光し、ポストエクスポージャーベーク、現像、ポストベークを行い、マイクロウェル9hを形成した。（図９（１１））これで本発明の実施例のチップが完成した。
実施例１及び２で得た本発明のマイクロウェルアレイチップは、透明であり、マイクロウェル層にも用いる感光性樹脂は一般的に疎水傾向を示すため、表面のタンパク質結合性が優れる。また、感光性樹脂を適宜選択することで、樹脂からの自家蛍光も抑制されるため、蛍光顕微鏡による被検査体観察も可能である。例えば、東レダウコーニング社感光性樹脂WL-5351、WL−5150は、B励起、G励起ともに自家蛍光が見られない。よって、従来できなかったチップ上のサンプルをチップ下から蛍光観察することが可能となった。
実施例３
実施例２により、例えば図１０のような応用が可能である。透明電極10bが成膜された透明なガラス基板10a上に磁性膜10dが形成され、その上に透明フォトレジストによってバリア部材層10eが配置されている。本実施例によるとこのバリア層10e上に、電極や記号などを形成することができる。例えば10mのような電極パターンを配置することができる。この電極パターン10m上にさらに透明フォトレジストによりマイクロウェル層10gが形成される。なおバリア層10eはマイロウェルを形成する透明レジスト材料と同じでもよいし、適宜最適なものを選択することが可能で、真空蒸着によるシリカ膜でもよい。
実施例２により、例えば図１０のような応用が可能である。透明電極10bが成膜された透明なガラス基板10a上に磁性膜10dが形成され、その上に透明フォトレジストによってバリア部材層10eが配置されている。本実施例によるとこのバリア層10e上に、電極や記号などを形成することができる。例えば10mのような電極パターンを配置することができる。この電極パターン10m上にさらに透明フォトレジストによりマイクロウェル層10gが形成される。なおバリア層10eはマイロウェルを形成する透明レジスト材料と同じでもよいし、適宜最適なものを選択することが可能で、真空蒸着によるシリカ膜でもよい。
実施例４
従来できなかったチップ上のサンプルをチップ下から蛍光観察することが可能であることを示すために、実施例１で作製したチップのマイクロウェルに、収容した磁気ビーズ付蛍光樹脂とチップ上面に蛍光標識付き抗体を結合させた結果をチップ裏側から観察した写真を図１１に示す。図１１(a)は、本発明によるチップに形成されたマイクロウェルに、蛍光ビーズを収容してチップ裏側方向から観察した蛍光画像である。また図１１(b)は、本発明によるチップ表面上に結合した蛍光標識付抗体について、チップ裏側方向から観察した蛍光画像である。マイクロウェルアレイチップそのものからの蛍光がないことから、サンプルの信号が明瞭に観測可能である。以上の結果より、従来のチップでは不可能であったチップ裏側からの蛍光観察が可能になったことから、細胞を操作しながら蛍光観察するなどの倒立顕微鏡を用いた作業に非常に有利である。
従来できなかったチップ上のサンプルをチップ下から蛍光観察することが可能であることを示すために、実施例１で作製したチップのマイクロウェルに、収容した磁気ビーズ付蛍光樹脂とチップ上面に蛍光標識付き抗体を結合させた結果をチップ裏側から観察した写真を図１１に示す。図１１(a)は、本発明によるチップに形成されたマイクロウェルに、蛍光ビーズを収容してチップ裏側方向から観察した蛍光画像である。また図１１(b)は、本発明によるチップ表面上に結合した蛍光標識付抗体について、チップ裏側方向から観察した蛍光画像である。マイクロウェルアレイチップそのものからの蛍光がないことから、サンプルの信号が明瞭に観測可能である。以上の結果より、従来のチップでは不可能であったチップ裏側からの蛍光観察が可能になったことから、細胞を操作しながら蛍光観察するなどの倒立顕微鏡を用いた作業に非常に有利である。
本発明は、細胞を扱う技術分野において有用である。
２ａ、８ａ、９ａ、１０ａ 基板
２ｂ、８ｂ、９ｂ、１０ｂ 下地電極層
２ｃ、８ｃ、９ｃ フォトレジスト(パターン)
２ｄ、８ｄ、９ｄ、１０ｄ 磁性部材
２ｅ、８ｅ、９ｅ、１０ｅ バリア部材
２ｆ、８ｆ、９ｆ マイクロウェル層となる透明層
２ｇ、８ｇ、９ｇ、１０ｇ マイクロウェル層
２ｈ、８ｈ、９ｈ、１０ｈ マイクロウェル
９ｊ 金属膜
９ｋ フォトレジスト(パターン)
１０ｍ 電極パターン
２ｂ、８ｂ、９ｂ、１０ｂ 下地電極層
２ｃ、８ｃ、９ｃ フォトレジスト(パターン)
２ｄ、８ｄ、９ｄ、１０ｄ 磁性部材
２ｅ、８ｅ、９ｅ、１０ｅ バリア部材
２ｆ、８ｆ、９ｆ マイクロウェル層となる透明層
２ｇ、８ｇ、９ｇ、１０ｇ マイクロウェル層
２ｈ、８ｈ、９ｈ、１０ｈ マイクロウェル
９ｊ 金属膜
９ｋ フォトレジスト(パターン)
１０ｍ 電極パターン
Claims (13)
- 透光性を有する基板の少なくとも一方の主表面にマイクロウェル層を有し、
前記マイクロウェル層は、可視光領域における自家蛍光性を有さない材料からなり、
前記マイクロウェル層が有する複数のマイクロウェルは、１つのマイクロウェルに1つの生体細胞のみを収容する形状と寸法を有し、
前記マイクロウェルは、その底面が前記生体細胞に無害で、かつ可視光領域における透光性を有するバリア部材の表面からなり、
前記バリア部材からなる底面と前記基板の表面との間に、磁性部材を有し、
前記磁性部材は、前記マイクロウェルの底面を平面視したときに、1または2以上の開口部を有し、
前記バリア部材からなる前記マイクロウェル底面から、前記磁性部材の開口部を経て前記基板の底部面までの部分は、可視光領域における透光性を有する、
前記マイクロウェルに収容された細胞から発せられる可視光領域に発光波長ピークを有する蛍光を、基板底部側から前記磁性部材の開口部を介して観察する方法に用いるためのマイクロウェルアレイチップ。 - 前記自家蛍光性を有さない材料がB励起及びG励起において自家蛍光が見られない材料である、請求項１に記載のマイクロウェルアレイチップ。
- 前記基板と前記マイクロウェル層との間に下地透明電極層を有し、前記磁性部材は、前記下地透明電極層と前記マイクロウェル層との間に位置する請求項１または２に記載のマイクロウェルアレイチップ。
- 前記磁性部材は、前記マイクロウェルの底面を平面視したときに、最大外径が、前記マイクロウェルの最大内径より大きい請求項１〜３のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイチップ。
- 前記磁性部材の開口部にマーキングを有する請求項１〜４のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイチップ。
- 請求項１〜５のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイの少なくとも一部のマイクロウェルに、検体細胞を収容し、収容した検体細胞を観察する方法であって、
前記検体細胞に磁気ビーズを取り付ける工程、
磁気ビーズを取り付けた検体細胞をマイクロウェルアレイチップのマイクロウェル層の表面に供給して、1つのマイクロウェルに1つの細胞を収容する工程、および
前記マイクロウェルに収容された細胞から発せられる可視光領域に発光波長ピークを有する蛍光を、基板底部側から前記磁性部材の開口部を介して観察する工程、
を含む、前記方法。 - 前記基板底部側からの蛍光観察は、倒立顕微鏡を用いて行う請求項６に記載の方法。
- 細胞のマイクロウェルへの収容は、基板底部側から外部磁石で磁気ビーズを吸引することで促進する請求項６または７に記載の方法。
- 前記検体細胞が免疫細胞、ガン細胞、ハイブリドーマ、幹細胞または細胞株である請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記検体細胞が抗原特異的リンパ球を含む請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法でマイクロウェルに収容した細胞の中から蛍光観察により目的細胞を特定し、特定した目的細胞をウェルから回収することを含む目的細胞の回収方法。
- 目的細胞が、抗原特異的抗体分泌細胞である請求項１１に記載の回収方法。
- 目的細胞が、特異的免疫グロブリン産生細胞または特異的サイトカイン産生細胞である請求項１１または１２に記載の回収方法。
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