JP2018534588A - 稀少細胞の遠心分離なしの単離および検出 - Google Patents

Abstract

流体試料中の標的物質を単離するための、直接希釈法および直接インキュベーション法を含む付加的技術が記載されている。いくつかの実行形態では、ある体積の希釈剤が流体試料に添加されて、第１の混合物を生成する。添加される希釈剤の体積は、流体試料の粘度よりも低い第１の混合物の特定の粘度を得るのに十分であり得る。多数の結合部分コンジュゲート磁気ビーズを第１の混合物に添加して第２の混合物を生成する。第２の混合物は、結合部分コンジュゲート磁気ビーズが第２の混合物中の稀少標的物質に結合するのに十分な時間インキュベートされる。第２の混合物の一部を流体チャンバ内に注入する。磁力が印加されて、第２の混合物中の磁化された稀少標的物質を流体チャンバ内の単離面に引き付ける。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１５年９月２２日に出願され、「全血からの細胞の遠心分離なしの単離および検出のための方法」と題された米国仮特許出願第６２／２２２，１９３号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に援用される。

技術分野
本出願は、生物学的流体試料中の標的粒子（例えば、細胞）を単離する方法に関する。

背景
流体試料（例えば、体液（例えば、全血））中に存在する標的物質（例えば、細胞）の単離、検出、および／または捕捉は、捕捉された細胞が、病理学的状態または疾患の兆候である可能性があるので、非常に重要である。細胞は、疾患状態との相関のために列挙され、遺伝子分析を受け、または培養され、薬物の組み合わせを試験するために、または新薬を発見するために使用され得る。特に、体液（例えば、血液）中の稀少細胞の単離および検出は特に重要であるが、流体試料中のこのような稀少細胞の数は非常に少ないため困難である。

胎児有核赤血球、胎児白血球、および胎児栄養膜を含む、母体血液中の患者の血液および胎児細胞における循環腫瘍細胞（すなわちＣＴＣ）は、そのような稀少細胞の例である。癌関連死亡の大部分は、原発腫瘍から離れている可能性がある様々な他の組織および器官構造への腫瘍細胞の転移によるものである。ＣＴＣは、原発性および転移性腫瘍から分離し、血管系に入ることができる。ＣＴＣの早期発見は、生存率を改善する上で重要な役割を果たす可能性がある。

ＣＴＣの検出はさらに、例えば化学療法、放射線、外科手術などの治療の有効性を確認するために使用することができる。このような治療後のＣＴＣの存在は、癌の再発を示すことができる。ＣＴＣや他の稀少細胞は、稀少な事象を示す可能性があり、未解決の生物学的および医学的課題の鍵を握っている。稀少細胞はまた、検出および列挙後にさらに下流の試験および分析を受けることもできる。例えば、それらは、転移モデルを研究するために動物に（例えば、移植によって）導入することができ、また突然変異を明らかにし、遺伝子発現を定量化することができるゲノムおよびトランスクリプトームを調べるために配列決定することができる。さらに、ＣＴＣは、転移の生物学を理解し、並びに個人化された医学への道を切り開く薬物を試験するために培養、成長、および使用される可能性を秘めている。

ＣＴＣおよび他の稀少細胞、および通常は稀少であるとは考えられない他の細胞を抽出するための従来の技術は、類似のサイズの他の細胞（例えば、白血球（ＷＢＣ）およびＣＴＣ）および血漿から赤血球（ＲＢＣ）を全血中の各成分に関連する質量に基づいて別個の層に分離するために、遠心分離または他の減法的技術を用いることをしばしば含む。そのような技術はしばしば、血漿は大部分が細胞を欠いていると仮定し、したがって、非特異的結合を防ぐために血漿を除去する。血漿はしばしば、アスピレーターを使用して除去され、遠心分離された試料容器から血漿を吸引するために陰圧を印加する。

ＣＴＣおよび他の稀少細胞はしばしば、それらの濃度がしばしば全血１ミリリットルあたり１細胞と低いため、少量の全血で検出することが困難である。したがって、血漿を除去するために遠心分離を用いる抽出プロトコルは、分析および／または採取するのに十分な数のＣＴＣを捕捉して抽出するために、しばしば大量の全血を必要とする。ＣＴＣ細胞の信頼性の高い解析では、ほぼ数千万個のＷＢＣおよび数億個のＲＢＣを含む試料から数百個のＣＴＣを抽出することがしばしば必要になる。結果として、ＣＴＣの検出および定量化は、より小さい試料量を用いてはしばしば困難である。

遠心分離（および他の減法的技術）を含む試料処理は、全血内のＣＴＣおよび他の稀少細胞の検出および収集において、ＣＴＣが遠心分離された試料体積の他の細胞成分と接触している血漿の底部領域に不注意に残っている可能性があるので、追加の複雑な事態をしばしば引き起こす可能性がある。例えば、血漿を吸引する間にＣＴＣが失われ、遠心分離が完了した後のＣＴＣの全体的な捕捉効率が低下する可能性がある。しかしながら、体液中の濃度がより高い他のタイプの細胞については一般的にそうではない。したがって、細胞成分を分離するために減法的技術を利用する場合、全血のより小さい試料体積からのＣＴＣおよび他の稀少細胞の高収率の一貫した抽出は、しばしば達成することが困難である。

概要
本明細書に記載の新しい付加的流体試料処理方法のいくつかの実行形態では、減法的試料処理を代替手段で置き換える技術を、標的物質（例えば、細胞（例えば、稀少細胞））の磁気標識化および分離に組み込み、標的効率に大きな影響を与えることなく、小さな試料体積から標的物質（例えば、ＣＴＣおよび他の細胞）の捕捉効率を改善することができる。一例では、細胞および／または稀少細胞を含む新鮮な試料体積を希釈剤と組み合わせて、コンジュゲートされた磁気ビーズの導入前に試料の粘度を低下させることができる。この例では、試料体積の粘度低下を用いて、遠心分離ステップを必要とせずにコンジュゲートされた磁気ビーズの非特異的結合を減少させることができる。別の一例では、コンジュゲートされた磁気ビーズを最初に導入した後、希釈剤と組み合わせることができる。この例では、粘度低下を用いて、稀少細胞の捕捉に使用される検出表面との非特異的相互作用を減少させることができる。新しい付加的試料処理方法のこれらの例の両方において、試料体積から抽出された標的物質（例えば、細胞（例えば、稀少細胞））の総数は、稀少細胞を含む可能性のある試料の一部が、検出および抽出前の試料調製プロセス中に除去されないので、従来の減法的技術の使用と比較して著しく増加させることができる。

本明細書に記載の付加的試料処理技術のさらなる利点は、追加の装置を使用する必要性を排除し、細胞分析に必要な全体の時間を短縮することを含む。例えば、従来の遠心分離に基づく検出プロトコルでは、流体試料７．５ｍＬ（遠心分離および吸引後に１．５〜２ｍＬが除去される）の試料調製を行い、続いて流体エンクロージャ上で信号を捕捉するのにしばしば９０〜１００分必要とする。比較すると、付加的技術は、より小さい試料体積を用いて６０〜７０分以内に細胞検出を可能にする。また、付加的試料処理技術は、元の流体試料のいかなる体積も除去しないので、遠心分離に基づく検出プロトコルを使用して得られた検出結果と比較して、より高いレベルの純度で（すなわち、コンジュゲートされた磁気ビーズの抗体と不要な細胞との間の非特異的結合をより低いレベルで）検出結果を得ることができる。

１つの一般的な態様において、本開示は、流体試料中の標的物質（例えば、細胞（例えば、稀少細胞））を単離するための付加的直接希釈法を含む。この方法は、流体試料の体積の少なくとも０．５倍の体積の希釈剤を流体試料に添加して第１の混合物を生成するステップであって、希釈剤の体積は、流体試料の粘度よりも低い第１の混合物の特定の粘度を得るのに十分であるステップと、多数の結合部分コンジュゲート磁気ビーズを第１の混合物に添加して第２の混合物を生成するステップであって、結合部分コンジュゲート磁気ビーズの結合部分は、標的物質（例えば、稀少標的物質）上に発現される１つ以上のリガンドに特異的に結合することができ、第１の混合物に添加される多数の結合部分コンジュゲート磁気ビーズは、標的物質を磁化するのに十分であるステップと、少なくとも５〜１２０分であり、第２の混合物中で結合部分コンジュゲート磁気ビーズが標的物質に結合するのに十分である時間の間、第２の混合物をインキュベートするステップであって、第２の混合物の粘度は、第１の混合物の粘度と実質的に同じであり、第２の混合物の粘度は、流体試料中の非標的物質への結合部分コンジュゲート磁気ビーズの非特異的結合を阻害するのに十分低いステップと、１．０ｍＬ／分よりも大きな流量を用いて第２の混合物の一部を流体チャンバ内に流すステップと、磁力を印加して第２の混合物中の磁化された標的物質を流体チャンバ内の単離面に引き付け、それによって元の流体試料のいずれの部分も除去することなく標的物質を付加的方法で単離するステップとを含み、この順序で実施することができる。

別の一般的な一態様では、本開示は、流体試料中の標的物質（例えば、稀少標的物質）を単離するための付加的直接インキュベーション法を含む。この方法は、多数の結合部分コンジュゲート磁気ビーズを流体試料に添加して第１の混合物を生成するステップであって、結合部分コンジュゲート磁気ビーズの結合部分は、標的物質上に発現される１つ以上のリガンドに特異的に結合することができ、流体試料に添加される多数の結合部分コンジュゲート磁気ビーズは、標的物質を磁化するのに十分であるステップと、少なくとも５〜１２０分であり、第１の混合物中で結合部分コンジュゲート磁気ビーズが標的物質に結合するのに十分である時間の間、第１の混合物をインキュベートするステップと、流体試料の体積の少なくとも０．５倍の体積の希釈剤をインキュベートされた第１の混合物に添加して第２の混合物を生成するステップであって、希釈剤の体積は、第１の混合物の粘度よりも低い第２の混合物の特定の粘度を得るのに十分であるステップと、１．０ｍＬ／分よりも大きな流量を用いて第２の混合物の一部を流体チャンバ内に流すステップと、磁力を印加して第２の混合物中の磁化された標的物質を流体チャンバ内の単離面に引き付けるステップであって、第２の混合物の粘度は、単離面との流体試料内の非標的物質の非特異的相互作用を阻害するのに十分低く、それによって元の流体試料のいずれの部分も除去することなく標的物質を付加的方法で単離するステップとを含み、この順序で実施することができる。

他のバージョンは、方法の動作を実行するように構成された対応するシステムおよび装置を含む。本明細書に記載の方法の１つ以上の実行形態は、以下のオプション構成を含むことができる。例えば、いくつかの実行形態では、結合部分は１つ以上の異なる抗体であり、リガンドは抗体が特異的に結合する１つ以上の抗原である。標的物質は、細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、白血球、または白血球のサブセット）とすることができる、または稀少細胞（例えば、ＣＴＣまたは母体の血液中に見出される胎児の血液細胞）とすることができる。標的物質はまた、細菌、寄生虫、単細胞生物、または特異的結合部分によって結合され得る特定のタンパク質または他の化合物および組成物とすることができる。

いくつかの実行形態では、直接希釈法および／または直接インキュベーション法は、第２の混合物を流体チャンバ内に注入した後に洗浄液を流体チャンバ内に流すステップを含む。

いくつかの実施形態では、直接希釈法および／または直接インキュベーション法は、洗浄液を流体チャンバ内に流した後に緩衝液を流体チャンバ内に流すステップを含む。

いくつかの実行形態では、直接希釈法および／または直接インキュベーション法は、第２の混合物を流体チャンバ内に注入する前に、流体チャンバの検出面または単離面を不動態化するステップを含む。

いくつかの実行形態では、流体試料は血液試料（例えば、全血試料）を含み、標的物質は赤血球以外の細胞であり、この方法は、単離面から赤血球細胞を除去するために少なくとも１．０ｍｌ／分の流量を用いて流体チャンバを通して赤血球溶解緩衝液を流すステップをさらに含む。

いくつかの実行形態では、赤血球溶解緩衝液は、１〜１０分の時間の間、流体チャンバを通って流れる。

本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態において、希釈剤は、リン酸緩衝化生理食塩水の溶液を含み、希釈剤は、希釈剤の体積の流体試料の体積に対する１：１〜１：４の範囲の希釈比を有する。

いくつかの実行形態では、結合部分コンジュゲート磁気ビーズの直径は、１０ナノメートル〜５０マイクロメートルの範囲にある。

いくつかの実行態様では、結合部分コンジュゲート磁気ビーズは、ＥｐＣＡＭ抗体とコンジュゲートしている。

本明細書に記載されているように、「稀少標的物質」とは、流体試料の１ミリメートル当り１０００個以下の最大濃度を有する標的物質（例えば、細胞）を指す。標的物質は、流体試料（例えば、全血（例えば、赤血球、白血球、血小板）中の他のタイプの細胞よりも低い濃度を有する細胞（例えば、循環腫瘍細胞、母細胞中の胎児赤血球）とすることができる。稀少標的物質は、例えば、稀少標的物質の表面上に発現される抗原に特異的な特異的結合部分（例えば、抗体）とコンジュゲートした磁気ビーズを使用した異なる技術を用いて磁化することができる。いくつかの実行形態では、標的物質は、本明細書で定義される「稀少」ではなく、Ｔ細胞、Ｂ細胞、白血球、白血球のサブセット、細菌、および流体試料から単離され、検出され、および／または捕捉され得る他の化合物または組成物を含むことができる。

本明細書に記載されているように、「付加的」技術または方法は、細胞抽出および検出手順を実施する前に元の試料のいずれの部分も除去しない液体または流体試料処理技術を指す。付加的技術は、元の試料の体積を分析前に減少させる技術（例えば、遠心分離、濾過、または抽出）を含まない。付加的技術の一例は、希釈剤を試料体積に添加して希釈された混合物を生成することである。付加的技術の別の一例は、流体試料に結合部分コンジュゲート磁気ビーズを添加することである。

本明細書中で使用される場合、用語「特異的に結合する」は、結合部分（例えば、抗体）が、対応するリガンド（例えば、抗原）に、流体試料中の他の任意の非リガンドに結合するよりもかなり大きな程度で結合することを意味する。

他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法、および実施例は例示的なものに過ぎず、限定することを意図するものではない。

１つ以上の実行形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載されている。他の潜在的な特徴および利点は、説明、図面、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。

本開示の原理の理解を促進する目的で、以下において図面に示された実施形態および実行形態を参照し、具体的な記述を使用してこれを説明する。それにもかかわらず、本開示の範囲の限定はこれによって意図されないことが理解されるであろう。

細胞抽出システムの一例を示すブロック図である。 細胞抽出システムの別の一例の概略図である。 直接希釈プロトコルの例を示すフローチャートである。 直接インキュベーションプロトコルの一例を示すフローチャートである。

図面内において、同様の参照番号は、全体を通して対応する部分を表す。
詳細な説明
本明細書中に記載される新規の付加的試料処理方法は、標的化効率に著しく影響を及ぼすことなく、比較的小さな試料体積から標的抗原を単離、検出および／または捕捉する効率を改善するために、減法的試料処理ステップを標的抗原（例えば、細胞または稀少細胞）の磁気標識化および分離における代替手段で置き換える技術を含む。いわゆる「直接希釈」法の一例では、稀少細胞を含む新鮮な試料体積を希釈剤に加えて、コンジュゲートされた磁気ビーズの導入前に試料の粘度を低下させる。この方法では、試料体積の粘度低下を使用して、遠心分離ステップを必要とせずにコンジュゲートされた磁気ビーズの非特異的結合を減少させる。いわゆる「直接インキュベーション」法の一例では、最初にコンジュゲートされた磁気ビーズを試料流体に添加し、試料流体とインキュベートした後、希釈剤を添加する。この例では、標的物質（例えば、稀少細胞）を捕捉するために使用される単離面との非特異的相互作用を低減するために、粘度の低下が使用される。これらの付加的処理方法の両方において、稀少細胞を含み得る試料の部分は、検出および抽出の前の試料調製プロセスの間に除去されないため、従来の減法的技術の使用と比較して、試料体積からの抽出される稀少細胞の総数を増加させることができる。

本明細書に記載されるように、「直接希釈法」とは、元の流体試料の一部を除去することなく、流体試料中の稀少標的物質を単離し捕捉するための付加的技術の使用を指す。例えば、直接希釈法の間に、最初にある体積の希釈剤を流体試料に添加して、特定の粘度レベルに設定された低下された粘度を有する混合物を生成する。結合部分コンジュゲート磁気ビーズを次に混合物に添加して、目的の稀少細胞を磁気的に標識化する。次いで、流体試料およびコンジュゲートされた磁気ビーズを含む混合物を特定の時間インキュベートして、磁気ビーズの抗体を目的の稀少細胞の表面上に発現する特異的抗原に結合させる。次に、混合物を流体チャンバ（例えば、マイクロ流体チャンバ）内に流すことができる。次いで、例えば、マイクロ流体チャンバの下に配置された磁石を使用して、マイクロ流体チャンバ内の磁気的に標識化された稀少標的物質を捕捉するために磁力が印加される。

本明細書に記載されるように、「直接インキュベーション法」は、元の流体試料に希釈剤を添加する前に、結合部分コンジュゲート磁気ビーズが流体試料に添加される直接希釈プロトコルの代替技術を指す。流体試料およびコンジュゲートされた磁気ビーズを含む混合物を、最初に特定の時間インキュベートして、磁気ビーズの抗体を目的の稀少細胞の表面上に発現する特異的抗原に結合させる。その後、ある体積の希釈剤を混合物に添加して、特定の粘度レベルに設定された低減された粘度を有する希釈混合物を生成する。次いで、混合物は、流体チャンバ（例えば、マイクロ流体チャンバ）内に注入される。次いで、マイクロ流体チャンバの下に配置された磁石を使用して、マイクロ流体チャンバ内の磁気的に標識化された稀少細胞を捕捉するために磁力が印加される。

図１Ａは、基本的な細胞抽出システム１００Ａのブロック図である。システム１００Ａは、以下により詳細に記載される直接希釈法または直接インキュベーション法のいずれかを用いて生成された混合物を貯蔵する試料容器１１０を含む。この混合物は、流体試料、希釈剤、およびリガンド結合部分（例えば、抗体）とコンジュゲートされた磁気ビーズを含む。流体試料は、コンジュゲートされた磁気ビーズの抗体と稀少標的物質の表面上に発現される抗原との特異的結合に基づいて磁化される稀少標的物質を含む。混合物は、流体エンクロージャ１２０を通って流れ、磁石１４０によって供給される磁力を用いて磁化された稀少標的物質を捕捉し、磁化された標的物質を流体エンクロージャ１２０の単離面上に引き付ける。混合物内の流体は、蠕動ポンプ１３０の使用により流体エンクロージャ１２０を通って流れる。流体エンクロージャ１２０を出る混合物は、廃棄物容器１５０内に廃棄されるか、または試料容器１１０に戻して再循環させることができる。いくつかの実施形態では、試料容器１１０に戻って再循環される混合物の部分は、混合物が最初に通過したときに流体エンクロージャ１２０内で以前に捕捉されなかった残留標的物質を捕捉するために、流体エンクロージャ１２０を通って再び流すことができる。

図１Ｂは、細胞抽出システム１００Ｂの別の一例を示す概略図である。システム１００Ｂは、流体試料１０１を保持する試料容器１１０と、流体チャンバ１２０ａを含む流体エンクロージャ１２０と、蠕動ポンプ１３０と、流体エンクロージャ１２０の下に配置された磁石コンポーネント１４０と、廃棄物容器１５０とを含む。流体エンクロージャ１２０は、流体回路を介して流体を送達するための蠕動ポンプ１３０または別の装置または構成に接続することができる。流体システムを通って再循環するためにポンプ１３０が廃棄物容器１５０または試料チューブ１１０のいずれかに流体を導くことができるように、バルブシステムまたは複数のバルブを使用することもできる。本発明の方法はまた、システム（例えば、米国特許出願第１２／６０１，９８６号、第１４／００１，９６３号、および第１４／０３７，４７８号に記載されるもの）でも使用することができ、その内容はすべて、参照によりその全体が本明細書に援用される。

流体エンクロージャ１２０は、試料がチューブ１１０に接続された入口ポートからポンプ１３０に接続された出口ポートに流れる流体チャネルを画定する本体１２２および１２８を含む。下部本体１２８は、流体試料１０１内の磁化された稀少標的物質１０２と相互作用する単離面１２４を含む。磁化された稀少標的物質１０２と単離面１２４との間の相互作用により、以下でより詳細に説明されるような稀少標的物質の分離および捕捉が可能になる。

流体エンクロージャ１２０の下部本体１２８は、固体表面（例えば、ガラススライド、またはシリコン、二酸化シリコン、窒化シリコン、ガラス、ＰＤＭＳ、ＳＵ−８、またはプラスチックを含む他の材料）とすることができる。流体エンクロージャ１２０は、オプションとして、本体１２２および１２４と接触するＰＤＭＳスペーサ、表面１２４の下の別のＰＤＭＳ／透明フィルムシート、ならびに入口および出口配管を収容するガラスカバースライドと、底部に別のスライドガラスを含むことができるアセンブリと共にアセンブリを保持する外側ケースからなることができる。単離面１２４は、１００μｍ^２〜５０ｃｍ^２の範囲（例えば、５００μｍ^２、１ｃｍ^２、５．０ｃｍ^２、１０ｃｍ^２、または２０ｃｍ^２）の表面積、および１０μｍの最小有効寸法（幅、長さ、直径または厚さ）を有することができる。

磁石コンポーネント１４０は、流体エンクロージャ１２０内部の単離面１２４に向かって磁気ビーズを引き付けることによって磁気ビーズおよび磁気ビーズに結合された物質（例えば、磁化された稀少標的物質１０２）に捕捉されるように流体エンクロージャ１２０の内部または外部から（体積を１ｍｍ^３〜１００００ｍｍ^３の範囲とすることができる）流体エンクロージャ１２０内に（０．０１テスラ〜１００テスラの範囲（例えば、１．０、１０、２５、５０、７５、または１００テスラ）の磁束密度を有する）磁場を生成するために使用することができる。これは、１つまたは複数の永久磁石または電磁石をエンクロージャ１２０の下部本体１２８に挿入／取り付けすることによって、または磁性、常磁性、または超常磁性材料および磁場を発生させる電子回路でできた磁石パターンを組み込むことによって達成することができる。

稀少標的物質１０２（または「稀少細胞」）は、流体試料１０１内にＣＴＣを含むことができ、抗体抗原結合を用いて稀少標的物質１０２を磁気的に標識化するために結合部分コンジュゲート磁気ビーズを使用することに基づいて単離および検出することができる。例えば、稀少標的物質１０２は、特異的な表面抗原を認識する抗体で官能化された磁気ビーズに結合することができる。稀少標的物質１０２が磁気的に標識化されると、流体試料１０１を流体エンクロージャ１２０内に注入し、単離面１２４を収容する流体チャンバ１２０ａを通して流すことができる。磁性粒子に取り付けられた稀少標的物質１０２は、次いで、上述のように磁石１４０によって提供される磁力によって単離面１２８に運ばれることができる。例示的なシステムは、米国特許出願第１２／６０１，９８６（Ｓａｖｒａｎらの米国特許出願公開第２０１０／０３３０７０２号）に開示される。いくつかの実施形態では、標的物質１０２は、本明細書で定義されるように「稀少」ではなく、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、白血球、または白血球のサブセットを含むことができる。

流体試料１０１を導入する前に、まず、チャンバ１２０ａにリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）中の緩衝液（例えば、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を満たし、室温（ＲＴ）または４℃で少なくとも約５分間（例えば、１５、３０、４５、または６０分、最大９０または１２０分以上）の間、インキュベートし、チャンバ１２０ａおよび付随する単離面１２４を不動態化して、稀少標的物質１０２ではない細胞、ビーズ、および他の物質からの非特異的結合を減少させる。いくつかの例では、ＰＢＳ溶液に加えて、他の緩衝液（例えば、トリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ））も使用することができる。ＢＳＡの濃度は、０〜１０％（１００ｍｇ／ｍＬ）またはより狭くは０．１％（１ｍｇ／ｍＬ）〜５％（５０ｍｇ／ｍＬ）の範囲とすることができる。不動態化されたチャンバ１２０ａは、過剰のＢＳＡを除去するために流体試料１０１の導入の前に緩衝液で洗浄される。一実行形態では、表面ブロッキングは、ＢＳＡ以外の薬剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸マレイン酸、ヘキサデカン酸、または種々の形態の双性物質）で達成することができる。あるいはまた、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（具体的にはＴｗｅｅｎ−２０）およびＴｒｉｔｏｎ（具体的にはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００））を用いて表面をブロックし、非特異的結合を減少させるのに役立てることもできる。

図２Ａは、流体試料中の稀少標的物質を単離するための直接希釈法２００Ａの一例を示すフローチャートである。簡潔に述べると、方法２００Ａは、流体試料の体積の少なくとも０．５倍の体積の希釈剤を添加して第１の混合物を生成するステップ（２１０）と、多数の結合部分コンジュゲート磁気ビーズを第１の混合物に添加して第２の混合物を生成するステップ（２２０）と、少なくとも５〜１２０分であり、第２の混合物中で結合部分コンジュゲート磁気ビーズが稀少標的物質に結合するのに十分である時間の間、第２の混合物をインキュベートするステップ（２３０）と、１．０ｍＬ／分よりも大きな流量を用いて第２の混合物の一部をマイクロ流体チャンバ内に流すステップ（２４０）と、磁力を印加して第２の混合物中の磁化された稀少標的物質を引き付けるステップ（２５０）とを含む。

上述のように、直接希釈法２００Ａは、流体試料１０１を抗体コンジュゲート磁気ビーズと共にインキュベートする前に、流体試料１０１を最初に希釈する付加的試料処理技術を指す。流体試料１０１は、一例としてＣＴＣを含む稀少標的物質１０２を含む。直接希釈法２００Ａは、全血を処理して磁気ビーズに結合した抗体と稀少標的物質１０２の表面上に発現された標的抗原との間の特異的結合を可能にするための遠心分離を実行する必要を除去するために行うことができる。

より詳細には、方法２００Ａは、流体試料の体積の少なくとも０．５倍の体積の希釈剤を添加して、第１の混合物（２１０）を生成するステップを含む。流体試料１０１（例えば、被験体（例えば、ＣＴＣを含む癌患者）から、または健康なドナーから得られ、その後、培養細胞株で増加されて得られた全血）を、最初に１：１の希釈比でＰＢＳ溶液によって希釈し、第１の流体混合物を生成する。いくつかの場合は、希釈比は、１：０．１〜１：１０（流体：ＰＢＳ）またはより狭くは１：０．５〜１：４（流体：ＰＢＳ）の範囲とすることができる。いくつかの実施形態では、ＰＢＳを他の緩衝液または溶液と交換するかまたは組み合わせることができ、並びにＲＢＣ溶解緩衝液を代わりに使用して流体試料１０１を希釈することもできる。

希釈は、流体混合物が固体表面（すなわち、流体エンクロージャ１２０内の単離面１２４）に曝された場合に、単離面１２４のすぐ近くにある物質の数が低減されるように、流体混合物の粘度および全密度を全血に対して低下させる。その結果、粒子状物質（例えば、希釈混合物内の細胞や分子）が互いに遭遇する確率が低下する。その結果、物質の非特異的結合、並びに流体混合物が流体チャンバ１２０ａを通って流れる際の流体混合物の流体抗力も低下する。

いくつかの実行形態では、流体試料１０１は、全血とは異なる流体であってもよい。例えば、血液の代わりに、細胞を含む他のタイプの体液（例えば、腹水、胸水、粘液、唾液、または尿）を分析することができる。そのような実行形態では、希釈が処理される必要のある全体積も増加させるとしても、流体エンクロージャ１２０は、そのような大きな試料体積（１ｍＬ〜１リットル）に対応するための高い体積スループットを提供する技術を使用することができる。

方法２００Ａは、第１の混合物に多数の結合部分コンジュゲート磁気ビーズを加えて第２の混合物を生成するステップ（２２０）を含む。結合部分は、稀少標的物質１０２（例えば、上皮細胞接着分子、ＥｐＣＡＭ、および上皮成長因子レセプター、ＥＧＦＲ）上に過剰発現された標的抗原に対する抗体とすることができ、最初に磁気ビーズにコンジュゲートされる。使用される磁気ビーズの直径は、１０ｎｍ〜５０μｍまたはそれより狭くは１００ｎｍ〜５μｍの範囲で変化させることができる。抗体は、ビオチンとストレプトアビジンとの相互作用を介して磁気ビーズとコンジュゲートさせることができるが、他の共有結合相互作用（例えば、アミンベースのコンジュゲート）または非共有結合相互作用によってもコンジュゲートさせることができる。他の標準的コンジュゲート技術も使用することができる。次に、抗体コンジュゲート磁気ビーズを、ステップ２１０で生成された希釈流体試料に添加する。

一実行形態では、ＰＢＳ溶液中の過剰量のビオチン化抗体（１０μＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ）で２０μＬのストレプトアビジンがコンジュゲートされた超常磁気ビーズ（１０ｍｇ／ｍＬ）を飽和させ、室温（ＲＴ：２０℃〜２５℃）で１時間インキュベートし、続いて磁気スタンド上でＰＢＳ溶液を用いて３回すすぎ、ＰＢＳ中に再懸濁させる。使用した磁気ビーズの数および磁気ビーズの結合能力、並びに分析される流体試料１０１に応じて、ビオチン化抗体（０．２ｍｇ／ｍＬ）に対するストレプトアビジン磁気ビーズ（１０ｍｇ／ｍＬ）の体積比は、１０：１〜１：１０の範囲とすることができ、インキュベーション期間は、５分〜２時間の範囲とすることができる。インキュベーションの間、抗体コンジュゲート磁気ビーズおよび希釈された流体試料を含有する流体は、混合物の揺動、回転、振盪、または攪拌、またはこれらの技術のいくつかまたは全ての組み合わせを介して混合を促進する装置上に配置することができる。

方法２００Ａは、少なくとも５〜１２０分であり、第２の混合物中で結合部分コンジュゲート磁気ビーズが稀少標的物質に結合するのに十分である時間の間、第２の混合物をインキュベートするステップ（２３０）を含む。希釈後、抗体コンジュゲート磁気ビーズおよび希釈された流体試料を含む流体混合物を室温で５分〜５時間、またはより典型的には１５分〜１時間インキュベートする。抗ＥｐＣＡＭ（抗ＥｐＣＡＭビーズ）とコンジュゲートした磁気ビーズは、使用される最も一般的な抗体ビーズ（ａｂビーズ）であるが、表皮成長因子（ＥＧＦＲ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳｍＡ）、葉酸受容体（ＦＲ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、およびビメンチンに対する抗体を含む異なる抗体を使用することもできる。抗体コンジュゲート磁気ビーズはまた、他の種類の抗体（例えば、ａｂビーズのカクテル）とコンジュゲートした磁気ビーズと共に、またはそれと組み合わせて、希釈された流体試料混合物と共にインキュベートすることができる。使用されるａｂビーズの総量は、試料混合物の全体積に依存し、希釈血液１ｍＬ当たり０．１μＬ（１μｇ）〜１０μＬ（１００μｇ）、またはより狭くは希釈血液１ｍＬ当たり１μＬ（１０μｇ）〜４μＬ（４０μｇ）の範囲とすることができる。インキュベーションの間、流体混合物は、試料１０１の揺動、回転、振盪、または攪拌、またはそれらのいくつかまたは全ての組み合わせを介して混合を促進する装置上に配置することができる。一実施形態では、抗体は、他の分子（例えば、アプタマー、ペプチド、タンパク質、小分子、ＤＮＡ、またはＲＮＡ）で置換することができる。

方法２００Ａは、１．０ｍＬ／分よりも大きな流量を用いて第２の混合物の一部をマイクロ流体チャンバ内に流すステップ（２４０）を含む。インキュベーション後、ａｂビーズおよび希釈された流体混合物を含有する混合物を次に流体エンクロージャ１２０内に導入して、稀少標的物質１０２（例えば、ＣＴＣ）の検出を可能にする。混合物は、流体チャンバ１２０ａ内に注入され、流体チャンバ１２０ａの入口から流体チャンバ１２０ａの出口へ、ある特定の流量で流される。

方法２００Ａは、磁力を印加して第２の混合物中の磁化された稀少標的物質を引き付けるステップ（２５０）を含む。磁石コンポーネント１４０は、概して、流体エンクロージャ１２０の下に、または流体エンクロージャ１２０の外部ハウジング内のチャンバ１２０ａの下に配置される。磁石コンポーネント１４０は、流体がマイクロ流体チャンバ１２０を通って入口ポートから出口ポートへ（例えば、洗浄ステップの間に）流れるときに、磁化された稀少標的物質１０２を単離面１２４へと引き付け、表面１２４上の位置に磁化された標的物質１０２を保持するのに十分な磁力を発揮するように較正される。一例として、磁石１３０は、測定された表面磁束密度及び勾配がそれぞれ０．４Ｔ及び１００Ｔ／ｍであるＮｄＦｅＢ立方体磁石（約５×５×５ｍｍ）である。他の例では、様々な材料で作られたより大きいまたはより小さい永久磁石、および市販されているか、または標準的または微細加工手順を用いて製造され、時間変化する磁場を生成可能な電磁石を含むがこれに限定されない他の磁石を使用することもできる。

細胞捕捉プロセスの終わりに、チャンバ１２０ａを１〜１０ｍＬのＰＢＳ溶液（またはより狭くは２〜５ｍＬのＰＢＳ溶液）を用いて操作可能な流量で洗浄し、続いてＲＢＣ溶解緩衝液を導入し、最高５分間インキュベートして、チャンバ１２０ａ内に残ったＲＢＣを除去する。一実行形態では、ＲＢＣ溶解緩衝液は、０．０１〜２０ｍＬ／分の流量を用いて流体エンクロージャ１２０を介して循環させる。次いで、チャンバ１２０ａをＰＢＳ溶液１〜１０ｍＬ（またはより狭くは２ｍＬ）で洗浄し、免疫蛍光分析に供する。

いくつかの実行形態では、流体チャンバ１２０を出る流体混合物の一部は、廃棄物容器１５０を迂回し、例えば、蠕動ポンプ１３０、重力、またはいくつかの他のポンプを使用して試料容器１１０に戻って再循環される。特定の実施形態では、最適流量は２ｍＬ／分とすることができる。しかしながら、操作可能な流量は、０．０１〜２０ｍＬ／分の範囲（例えば、０．０５、０．１、１．０、２．５、５．０、７，５、１０．０、１２．５、１５．０、１７．５、または２０．０ｍＬ／分）とすることができる。循環時間は、試料混合物の全体積に依存し、５秒〜１５分の範囲（例えば、１０、２０、または６０秒、または２、５、７、１０、１２、または１５分）とすることができる。結果として、流体チャンバ１２０ａを通って流れる混合物は、以前の循環を介して最初に捕捉されなかった任意の残留標的物質１０２を捕捉するために、複数回にわたって再循環させることができる。あるいはまた、混合物は、再循環を伴わずに流体エンクロージャを一度通過させることもできる。

一実行態様では、単離面上に捕捉された磁化された稀少標的物質１０２を分析することができる。磁化された稀少標的物質１０２は、最初にＰＢＳ中で４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）溶液を用いて１０〜１５分間固定され、その後、マイクロチップを流体チャンバ１２０ａ内に置きながら、ＰＢＳ中で０．１〜０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液を用いて１０分間透過処理される。続いて、蛍光色素と結合した抗体を導入して、単離面１２４上に捕捉された磁化標的物質１０２を標識化する。一実行形態では、有核細胞を確認するために、ＦＩＴＣ（抗ＣＫ−ＦＩＴＣ）とコンジュゲートした抗サイトケラチンモノクローナル抗体、フィコエリトリン（抗ＣＤ４５−ＰＥ）とコンジュゲートした（ＷＢＣを除外するための）抗ＣＤ４５モノクローナル抗体、および４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）が、同時にチャンバ１２０ａ内に導入され、室温で１５分間インキュベートされて細胞を標識化する。捕捉された磁化標的物質１０２の生存能力を維持するために、蛍光染色前の固定および浸透化ステップをオプションとして行うことができる。しかしながら、蛍光染色時間は、概して、固定を使用しない場合には３０分まで延長する必要がある。

単離面１２４上に捕捉された磁化標的物質１０２は、その後、識別および列挙のためにチャンバ１２０ａ中に依然として存在しながら蛍光顕微鏡検査を受けることができる。磁化標的物質１０２が腫瘍細胞である場合、それらは、細胞のサイズ（１０〜３０μｍ）および形状（円形に近い）および蛍光放出（ＣＫ＋、ＤＡＰＩ＋、およびＣＤ４５−）を含む要因の組み合わせに基づいて識別される。この記述に適合しない物質は、ビーズおよび／またはチップ表面のいずれかに非特異的に結合する場合があり、したがって腫瘍細胞として記録されない。他の技術を用いて、蛍光の使用を伴わないことが可能な細胞表面内または細胞表面上の他のマーカーを染色または認識することができる。

図２Ｂは、流体試料中の稀少標的物質を単離するための方向インキュベーション法２００Ｂの一例を示すフローチャートである。簡単に述べると、方法２００Ｂは、流体試料に多数の結合部分コンジュゲート磁気ビーズを添加して第１の混合物を生成するステップ（２１２）と、少なくとも５〜１２０分であり、第１の混合物中で部分コンジュゲート磁気ビーズが稀少標的物質に結合するのに十分である時間の間、第１の混合物をインキュベートするステップ（２２２）と、流体試料の少なくとも約０．５倍の体積の希釈剤の体積を添加して第２の混合物を生成するステップ（２３２）と、第２の混合物をマイクロ流体チャンバ内に流すステップ（２４２）と、磁力を印加して第２の混合物中の磁化された稀少標的物質を引き付けるステップ（２５２）とを含む。

上述したように、直接インキュベーション法２００Ｂは、流体試料１０１を抗体コンジュゲート磁気ビーズと共にインキュベートした後に流体試料１０１を希釈する付加的試料処理技術を指す。直接希釈法２００Ａと同様に、直接インキュベーション法２００Ｂを実行して、磁気ビーズにコンジュゲートした抗体と稀少標的物質１０２の表面上で発現する標的抗原との間の特異的結合を可能にするための全血を処理するために遠心分離を行う必要を取り除くことができる。

より詳細には、方法２００Ｂは、流体試料に多数の結合部分コンジュゲート磁気ビーズを添加して、第１の混合物を生成するステップ（２１２）を含む。ａｂビーズは、流体試料１０１内に最初に導入され、磁気ビーズにコンジュゲートした抗体が稀少標的物質１０２の表面上に発現される抗原に特異的に結合する混合物を生成する。例えば、ａｂビーズは、ステップ２２０に関して上述した技術と同様の方法で、流体試料１０１内に直接添加される。使用されるａｂビーズの総量は、血液１ｍＬ当たり０．１μＬ（１μｇ）〜１０μＬ（１００μｇ）の範囲、より狭くは、血液１ｍＬ当たり０．５μＬ（５μｇ）〜４μＬ（４０μｇ）の範囲とすることができる。

方法２００Ｂは、少なくとも５〜１２０分であり、第１の混合物中で部分コンジュゲート磁気ビーズが稀少標的物質に結合するのに十分である時間の間、第１の混合物をインキュベートするステップ（２２２）を含む。ａｂビーズおよび流体試料１０１を含有する混合物は、分析された試料体積およびステップ２３０に関して上記した技術と同様の方法で使用されるａｂビーズの量に応じて、５分〜２時間インキュベートすることができる。

方法２００Ｂは、流体試料の体積の少なくとも約０．５倍の体積の希釈剤を添加して第２の混合物を生成するステップ（２３２）を含む。ａｂビーズおよび流体試料１０１を含むインキュベートした混合物を、ステップ２１０に関して上記した技術と同様の方法で、緩衝溶液（例えば、ＰＢＳ溶液）を用いて１：１の比で希釈する。希釈比は、１：０．１〜１：１０（混合物：ＰＢＳ）またはより狭くは１：０．５〜１：４（混合物：ＰＢＳ）の範囲とすることができる。

方法２００Ｂは、１．０ｍＬ／分より大きな流量を使用して、第２の混合物の一部をマイクロ流体チャンバ内に流すステップ（２４２）を含む。ａｂビーズ、流体試料１０１、および希釈剤を含む希釈混合物は、ステップ２４０に関して上記した技術と同様の方法で、マイクロ流体チャンバ１２０ａ内に注入される。

方法２００Ｂは、磁力を印加して第２の混合物中の磁化された稀少標的物質を引き付けるステップ（２５２）を含む。磁石１４０は、ステップ２５０に関して上記した技術と同様の方法で、希薄混合物内の磁化された稀少標的物質１０２を単離面１２４に引き付けるのに十分な磁力を発揮するために使用することができる。

実施例
以下の実施例は、本明細書に記載の新規の付加的処理方法を限定するものではない。

上記の直接希釈法２００Ａおよび方向希釈法２００Ｂを用いて稀少標的物質の捕捉効率を評価する実験を行った。上記のように、以前に同定された癌細胞株が、健康なヒトの血液中にまず添加された。１つの例示的なプロセスにおいて、既知の数（例えば、２５〜８５細胞の間）のＭＣＦ−７細胞（乳癌細胞株）を最初に１ｍＬの健康な血液に加え、ＰＢＳ溶液で２ｍＬに希釈し、次いで、４μＬ（４０μｇ）の抗ＥｐＣＡＭビーズを希釈した試料に加え、室温で少なくとも７５分間インキュベートした。続いて、試料混合物を２ｍＬ／分の流量で２分間、流体エンクロージャ１２０内に循環させ、同時に、磁石を流体エンクロージャ１２０の下に配置して、磁性粒子並びに磁性粒子結合細胞を流体エンクロージャ１２０の内部に配置された固体表面に引き付け、その後、３ｍＬのＰＢＳ溶液で洗浄した。次に、ＲＢＣ（赤血球）溶解緩衝液を流体エンクロージャ１２０内に導入し、５分間インキュベートし、再びチャンバ１２０ａを２ｍＬのＰＢＳ溶液で洗浄した。次に、マイクロチップ上に捕捉された細胞を固定し、透過処理し、前のセクションで説明したプロトコルに従って蛍光染色した。次いで、検出された細胞を同定し、蛍光顕微鏡下で計数した。

実験の結果は、直接希釈法２００Ａおよび直接インキュベーション法２００Ｂの両方が、遠心分離を含む従来の試料処理技術と比較して、稀少標的物質の検出収率を一貫して高めることができることを示している。これは、遠心分離およびその後の吸引ステップ（試料と吸引を実行する使用者との間でしばしば変化する）が、細胞検出および分析のための流体試料を調製するために必要ではないためである。

全体を通して説明した付加的試料処理技術のさらなる利点は、追加の装置を使用する必要性を排除し、細胞分析に必要な全体の時間を短縮することを含む。例えば、従来の遠心分離ベースの検出プロトコルでは、流体試料７．５ｍＬ（遠心分離および吸引後に１．５〜２ｍＬが除去される）の試料調製を行い、続いて流体エンクロージャ上で信号を捕捉するのにしばしば９０〜１００分必要とする。比較すると、付加的技術は、より小さい試料体積を用いて６０〜７０分以内に細胞検出を可能にする。また、付加的試料処理技術は、元の流体試料のいかなる体積も除去しないので、遠心分離に基づく検出プロトコルを使用して得られた検出結果と比較して、より高いレベルの純度で（すなわち、コンジュゲートされた磁気ビーズの抗体と不要な細胞との間の非特異的結合をより低いレベルで）検出結果を得ることができる。

例えば、付加的試料処理技術と遠心分離に基づく検出技術との間の捕捉効率を比較するために、実験が行われた。結果は、遠心分離に基づく技術を使用することにより、７．５ｍＬの全血で流体エンクロージャに捕捉される非標的細胞の総数が８００〜１９９００（推定平均４０００細胞）に達することを示した。これと比較して、付加的技術の使用は、同じ体積の全血で流体エンクロージャ上にたった１０〜１５００個の非標的細胞（推定平均４００細胞）により、純度を１０倍増加させた。

他の実施形態
多数の実施形態および実行形態について説明した。それにもかかわらず、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な変更が可能であることが理解されるであろう。また、他のステップを設けることができる、または記載された方法からステップを省略することができ、記載されたシステムに他のコンポーネントを追加する、または記載されたシステムから他のコンポーネントを除去することができる。したがって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。

Claims (23)

1. 流体試料中の標的物質を単離するための付加的直接希釈法であって、前記方法は、
   前記流体試料の体積の少なくとも０．５倍の体積の希釈剤を前記流体試料に添加して第１の混合物を生成するステップであって、前記希釈剤の体積は、前記流体試料の粘度よりも低い前記第１の混合物の特定の粘度を得るのに十分であるステップと、
   多数の結合部分コンジュゲート磁気ビーズを前記第１の混合物に添加して第２の混合物を生成するステップであって、前記結合部分コンジュゲート磁気ビーズの結合部分は、前記標的物質上に発現される１つ以上のリガンドに特異的に結合することができ、前記第１の混合物に添加される前記多数の結合部分コンジュゲート磁気ビーズは、前記標的物質を磁化するのに十分であるステップと、
   少なくとも５〜１２０分であり、前記第２の混合物中で前記結合部分コンジュゲート磁気ビーズが標的物質に結合するのに十分である時間の間、前記第２の混合物をインキュベートするステップであって、前記第２の混合物の粘度は、前記第１の混合物の特定の粘度と実質的に同じであり、前記第２の混合物の粘度は、前記流体試料中の非標的物質への前記結合部分コンジュゲート磁気ビーズの非特異的結合を阻害するのに十分低いステップと、
   １．０ｍＬ／分よりも大きな流量で前記第２の混合物の一部を流体チャンバ内に流すステップと、
   磁力を印加して前記第２の混合物中の前記磁化された稀少標的物質を前記流体チャンバ内の単離面に引き付け、それによって前記元の流体試料のいずれの部分も除去することなく稀少標的物質を付加的方法で単離するステップとを含み、この順序で実施される方法。
2. 前記標的物質は稀少細胞である、請求項１に記載の方法。
3. 前記希釈剤は緩衝液を含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
4. 前記結合部分は１つ以上の異なる抗体であり、前記リガンドは前記抗体が特異的に結合する１つ以上の抗原である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記第２の混合物を前記流体チャンバ内に流した後に洗浄液を前記流体チャンバ内に流すステップをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記洗浄液を前記流体チャンバ内に注入した後、緩衝液を前記流体チャンバ内に流すステップをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記第２の混合物を前記流体チャンバ内に流す前に、前記流体チャンバの検出面を不動態化するステップをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記流体試料は血液を含み、前記方法は、
   少なくとも１．０ｍｌ／分の流量を用いて前記流体チャンバに赤血球溶解緩衝液を流して前記単離面から血液細胞を除去するステップをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記赤血球溶解緩衝液は、１〜１０分の時間の間、前記流体チャンバを通って流れる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記希釈剤は、リン酸緩衝化生理食塩水の溶液を含み、前記希釈剤は、前記希釈剤の体積の前記流体試料の体積に対する１：１〜１：４の範囲の希釈比を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記結合部分コンジュゲート磁気ビーズの直径は、１０ナノメートル〜５０マイクロメートルの範囲にある、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記結合部分コンジュゲート磁気ビーズは、ＥｐＣＡＭ抗体とコンジュゲートしている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記第２の混合物を前記流体チャンバ内に流すステップは、
    前記流体チャンバを出る前記第２の混合物の少なくとも一部を、前記第２の混合物の前記一部を保持する容器または搬送する導管に向け直すステップと、
    前記第２の混合物の前記一部を前記容器からまたは前記導管を通って前記流体チャンバの入口内に流すステップとを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 流体試料中の標的物質を単離するための付加的直接インキュベーション法であって、前記方法は、
    多数の結合部分コンジュゲート磁気ビーズを前記流体試料に添加して第１の混合物を生成するステップであって、前記結合部分コンジュゲート磁気ビーズの結合部分は、前記標的物質上に発現される１つ以上のリガンドに特異的に結合することができ、前記流体試料に添加される前記多数の結合部分コンジュゲート磁気ビーズは、前記標的物質を磁化するのに十分であるステップと、
    少なくとも５〜１２０分であり、前記第１の混合物中で前記結合部分コンジュゲート磁気ビーズが標的物質に結合するのに十分である時間の間、前記第１の混合物をインキュベートするステップと、
    前記流体試料の体積の少なくとも０．５倍の体積の希釈剤を前記インキュベートされた第１の混合物に添加して第２の混合物を生成するステップであって、前記希釈剤の体積は、前記第１の混合物の粘度よりも低い前記第２の混合物の特定の粘度を得るのに十分であるステップと、
    １．０ｍＬ／分よりも大きな流量を用いて前記第２の混合物の一部を流体チャンバ内に流すステップと、
    磁力を印加して前記第２の混合物中の前記磁化された稀少標的物質を前記流体チャンバ内の単離面に引き付けるステップであって、前記第２の混合物の前記粘度は、前記単離面との前記流体試料内の非標的物質の非特異的相互作用を阻害するのに十分低く、それによって前記元の流体試料のいずれの部分も除去することなく稀少標的物質を付加的方法で単離するステップとを含み、この順序で実施される方法。
15. 前記結合部分は１つ以上の異なる抗体であり、前記リガンドは前記抗体が特異的に結合する１つ以上の抗原である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記第２の混合物を前記流体チャンバ内に流した後に洗浄液を前記流体チャンバ内に流すステップをさらに含む、請求項１４〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記洗浄液を前記流体チャンバ内に流した後、緩衝液を前記流体チャンバ内に流すステップをさらに含む、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記第２の混合物を前記流体チャンバ内に流す前に、前記流体チャンバの検出面を不動態化するステップをさらに含む、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記流体試料は血液を含み、前記方法は、
    前記第２の混合物を流体チャンバ内に流した後に、前記流体チャンバ内に溶解溶液を流すステップをさらに含み、前記溶解溶液は、前記流体チャンバの前記検出面と接触する前記第２の混合物中の赤血球を溶解させる、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記希釈剤は、リン酸緩衝化生理食塩水の溶液を含み、前記希釈剤は、前記希釈剤の体積の前記流体試料の体積に対する１：１〜１：４の範囲の希釈比を有する、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記第２の混合物を前記流体チャンバ内に流すステップは、
    前記流体チャンバを出る前記第２の混合物の少なくとも一部を、前記第２の混合物の前記一部を保持する容器または搬送する導管に向け直すステップと、
    前記第２の混合物の前記一部を前記容器からまたは前記導管を通って前記流体チャンバの入口内に流すステップとを含む、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記結合部分コンジュゲート磁気ビーズの直径は、１０ナノメートル〜５０マイクロメートルの範囲にある、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の方法。
23. 前記結合部分コンジュゲート磁気ビーズは、ＥｐＣＡＭ抗体とコンジュゲートしている、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の方法。