JP2013517763A - 希少細胞の磁気分離 - Google Patents

Abstract

細胞混合物から、磁化された細胞を高定性的且つ高定量的な収率で分離するように構成された磁気分離システムであって、複数の分離区域周辺に磁束を生成し、混合物中の大部分の磁性細胞を引き付けるのに十分であるように構成された少なくとも一つの電磁石と、区域中に配置された管を介して管理した流速で細胞混合物を駆動するためのポンプとを含み、それによって、混合物から大部分の磁性細胞を分離する、磁気分離システム。前記システムは、細胞の活力を維持しながら、細胞の残りの部分に対して低濃度の希少細胞を有する細胞の流体混合物から希少細胞を回収するのに、特に有用である。
【選択図】図１Ａ

Description

本発明は、細胞を含む粒子の分離に関する。本発明のいくつかの実施形態は、希少細胞の磁気分離に関する。

従来より、生物細胞の磁気分離に関わる多くの応用が文献中に記述されてきた。例としては、米国特許第４７１０４７２号およびそこに引用されている多くの刊行物中に記載されている。このような多くの応用では、一つもしくは複数の特異的な細胞（以下標的細胞と呼ぶ）の分離だけではなく、標的細胞および／もしくは非標的細胞中の細胞膜の質を維持することも求められる。確かに、正の選択の過程では、標的細胞は、研究や診断、治療の目的のための検査もしくは利用のための試料から分離され、一方で、消耗過程においては、その試料は、非標的細胞の検査もしくは利用のために標的細胞を枯渇させられる。非標的細胞から標的細胞を分離することおよび標的細胞と非標的細胞の両方の膜を維持することは、癌の早期に検出する役割を持つリンパ球数を利用して現在行われている研究では、特に重要なことである。

生物細胞の分離のための現在利用されている技術の一つは、ＭｉｎｉＭＡＣＳ分離カラム（ミルテニーバイオテク有限会社）である。この技術は、直径約５０ｎｍの特に小さい、言い換えると、真核細胞よりも体積が約１００万倍も小さく、ウイルスとサイズを比較される、常磁性のマイクロビーズを使用する。このような磁気性のマイクロビーズは、ある細胞、すなわち標的細胞を磁気的に標識化もしくは染色する選択的親和性を持つように作製される。試料は、例として、鋼綿、鋼網のような液体透過磁性体を含む磁気分離カラムへと導かれ、磁場は、磁気的に染色された細胞は、カラムの液体透過磁性体に留まり、非標的細胞はカラムを通過するように印加される。
しかしながら、この既知の工程では、細胞膜が液体透過磁性体により過度に損傷することが分かっており、研究もしくは臨床目的の技術の効果を下げている。

場合によっては、分離の方法に課題の残る癌細胞、幹細胞もしくは胎児細胞など、試料中の標的細胞は希少である。限定されない例として、胎児細胞が下記に参照される。

シュモール（１）が子癇により死亡した女性の肺循環中の栄養芽細胞を立証してから１世紀以上の間、母体血液中の胎児細胞の存在は公知であった。その後、栄養芽細胞（１）、リンパ球（２）、有核赤血球（ＮＲＢＣｓ）（３）、顆粒白血球（４）および幹細胞（５）を含む５種の異なる胎児細胞が、母体血液中を循環していることが立証された。母体を循環する胎児細胞の割合はとても低く、定量的ＰＣＲ法（６）によって検出される場合、母体血液１ｍｌあたり平均１．２細胞数である。母体血液から分離された全ての胎児細胞の種類の中で、ＮＲＢＣｓは、非観血的出生前診断（７）での使用に最良の候補の細胞として明らかになっている。

研究者たちは、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）法および磁性細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）法を用い、ＮＩＨの資金提供による大規模な研究（ＮＩＦＴＹの研究）を含む、胎児期のＮＲＢＣの分離および濃縮の研究を試みてきた。この研究は、ＦＡＣＳの１３％およびＭＡＣＳ（主要な磁気分離技術）の４４％の回収という胎児細胞の検出感度が低いという結果であり、母体血液中の胎児期のＮＲＢＣの割合が低く、現在の分離技術が低い回収率であることから、ＦＮＲＢＣの利用は、臨床適用が不可能であるという結論に達した。これらの細胞を分離することは極めて困難であるため、ＤＮＡ断片（９）のような、異なる遺伝材料に基づいた代替的および効果の少ない方法が探られている。これらの材料は、効果的に分析するためにＰＣＲを用いて増幅させなければならなく、トリソミーに関して、ＦＮＲＢＳでは得られるであろうレベルと同じ確実な結果を提供することができないのである。

本発明者達の一部および他の発明者達に与えられた米国特許第６４８２３２８号は、標的細胞を磁気的に染色するための選択的親和性を持つ磁性粒子と試料の試料混合物を作製することにより、試料中の標的細粒子の濃縮、もしくは標的粒子に関しての試料からの枯渇を目的として、試料から選択された種類の標的粒子を磁気的に分離する方法および装置を開示している。

高収率かつ高純度で、生存希少細胞を迅速かつ確実に磁気分離するという要求が依然として対処されていないままである。

本発明は、細胞の生存活性を保持したまま、液体試料中の他の細胞と比較して低含量の希少細胞を含む液体試料から希少細胞を高定量的および高定性的に短時間で磁気分離するシステムを提供する。

希少細胞は、例として、地中海性貧血症患者の有核赤血球細胞（ＮＲＢＣ）、母体循環での胎児有核赤血球細胞（ＦＮＲＢＣ）、末梢血液中の癌細胞、胎児もしくは成体幹細胞、または循環中にＣＤ７１、ＣＤ８、ＣＤ３４、もしくはＣＤ１３３によって特定された細胞を含む。

いくつかの実施形態では、分離は、細胞もしくは細胞の一部の、十分に信頼できる臨床学的、遺伝学的、化学的、もしくは他の分析を得るための、希少細胞の十分な濃度および／もしくは量を提供する。

例として、妊娠中の女性の循環内での胎児有核赤血球細胞は、他の細胞と比べて非常に少なく、１００ｐｐｂのオーダーもしくはそれより少なく、確固たる胎児性細胞もしくは胎児ＤＮＡの遺伝子解析を妨げている。本明細書に開示されている方法によると、通常の母体血液試料から、試料中に存在するＦＮＲＢＣの９５％超など、適切なまたは十分な量のＦＮＲＢＣを得ることが可能である。従って、本発明の方法は、効果的な分離を可能とし、得られた細胞は、続いて、当分野で公知の利用可能な方法のいずれかに従う遺伝解析、もしくは診断に使用することができる。

典型的な実施形態では、標的細胞を含む一次試料（例えば血液試料）が、少なくとも実質的に他の非磁性化細胞中の磁性化細胞の試料を形成するように、一次試料中の標的細胞への連結もしくは結合特異性を持つ磁気ビーズへ細胞を結合もしくは連結するよう処理される。いくつかの実施形態では、磁気ビーズと結合する標的細胞は、大部分の無関係な非磁性細胞中の希少もしくは少ない細胞である。生存細胞が分離（もしくは枯渇）される場合などのいくつかの実施形態では、細胞は、その生存活性が保存されるように処理され、細胞は、その生存活性を維持（持続）する環境中で分離される。適切な培養液もしくは担体液の例は下記に記載される。

試料は、生存細胞を維持するように作られた担体液と混合され、管内にて重量とは関係なく制御された流速で混合物を通過させる管を通して流される。管は、電磁石によって発生、および能動的に調節される磁束を持つ、一つもしくはそれ以上の磁化区域（本明細書中では、分離区域も同様）を通過する。電磁石は、希少磁性標的細胞を効果的に磁気分離するために形成された磁束を供給するために作られる。好ましい実施形態において、細胞は、混合物が、空気がないなどの細胞の生存活性を維持する最適以下の条件への長期の暴露に起因する細胞の生存活性への有害な影響を防ぐため、十分に高い流速で流れている間に分離および回収される。

いくつかの実施形態によると、磁性標的細胞は、試料中の元の希少細胞の現存数の少なくとも５０％、あるいは少なくとも６０％、あるいは少なくとも７０％、あるいは少なくとも８０％、あるいは少なくとも９０％、もしくはそれよりも多い効率で、保持もしくは分離される。他の実施形態では、磁性標的細胞は、大半を集められた分離細胞から構成される。多様な実施形態では、磁性標的細胞は、回収された分離細胞の６０％以上、あるいは７０％以上、あるいは８０％以上、あるいは９８％のような９５％以上の割合で得られる。各実現可能性は、本発明の個々の実施形態のものである。

分離された磁性標的細胞は、一つもしくはそれ以上の磁気分離区域の管壁へ集められおよび／もしくは付着する。それらは、磁場が管への磁性細胞の吸引低下させるために停止された後、回収容器内へ、担体液（もしくは他の液体）によって洗浄される（ゆすがれる）。

本発明は、（細胞の量において）分離の定量的収（回収）率が増加するような、管壁から分離細胞の除去および放出を効果的に補助する機構を同様に提供する。いくつかの実施形態では、分離区域を消磁し、残留磁気を除去し、管壁上の分離標的細胞の磁気吸引を減少させることによって、管壁から分離磁性標的細胞を洗浄する効率が増加する。他の実施形態では、洗浄は、一つもしくは複数の気泡を管内に通すこと、急激に流速を変化させて液体内に衝撃を誘発すること、または、分離区域もしくはその近傍にて、管を振動させるか、もしくは管へ超音波を適用すること、のうちの少なくとも一つによって、機械的に補助される。

電磁石は、例として熱放散に起因する、細胞もしくは装置に悪影響を持つ恐れのある過度もしくは過剰の消費電力を避けながら、効果的に分離するために十分な力を持つ管周辺の磁束を提供および集約するために設計される。

さらに、短時間だが高品質の分離を行うために、システムは、細胞の損傷を避けつつ、急速な分離を提供十分に高い速度で、十分に大きな内径もしくは断面を持つ管を通して混合物が流れやすいように構成されている。

いくつかの実施形態では、９０％以上の純度および約９０％もしくはそれ以上の回収率での希少細胞の典型的な分離サイクルは、約５分から約１５分の間のような数分間の内に完了する。

いくつかの実施形態では、システムは、管が分離区域を実質的には水平に通過しもしくは配置されるように構築されることで、これらに限定されないが、無菌の区画もしくはドラフトを含む様々な場所にて設置もしくは運転するための手軽な装置が提供される。水平に配置することは、垂直方向のシステムとは対照的に、そのような限られたスペースでは好ましい。

分離区域間の分離、回収、および洗浄の順序、流速、分離区域中の磁場、担体液および洗浄液の化学的および物理化学的特徴（例として粘性）、洗浄の割合、および／もしくは他の変数および手法は、全て制御される変数である。これらの変数は、細胞の生存活性を維持し、希少細胞の分離の純度および／もしくは収率を下げ得る磁性標的細胞とのおよび／もしくは管壁上での非標的細胞の凝集を実質的に回避しつつ、所望されるもしくは十分な結果を提供するよう調節される。いくつかの実施形態では、分離の作用条件は、磁性標的細胞の磁性応答性に従って、分離区域中にて実質的に分別分離が得られるよう制御されている。これらの実施形態は、分留に類似している。

上記で概説した分離技術は、希少細胞の効果的な分離に関して本明細書にて例示されているが、非希少細胞の分離および／または枯渇にも効果的であることには注意されたい。

「分離」および逆関係の「枯渇」という用語は、必ずしも標的細胞の完全な分離および逆関係の完全な除去を意味するものではないが、実質的にもしくは十分に高い定性的および定量的な分離であり、逆関係のそれに対応する枯渇であることを意味することには注意されたい。

制限するものではないが、いくつかの例示的な本発明の実施形態を下記の図に示す。

一つもしくはそれ以上の図に存在している、同一もしくは重複しているもしくは同等もしくは類似している構造、要素もしくは部分は、概して、同一の符号が付され、必要に応じて、類似している物体もしくは物体の変化形の間を区別するために、１もしくは複数の追加的な文字が付されており、繰り返し付され、もしくは記載されていない場合もある。

図に示されている構成要素および形体の規模は、発表の利便性や明確さのために選択されており、必ずしも本当の寸法を測定するために示されているのではない。利便性や明確さのために、いくつかの要素もしくは構造は、示されていないか、または部分的および／もしくは異なる見方、もしくは異なる観点から示されている。

いくつかの図は、白黒に変換されており、それによって詳細もしくはテクスチャもしくは微細さの度合いが下がることなどにより、図面の質が下がっていることには注意されたい。
図１Ａは、本発明の例示的な実施形態に従って、希少細胞の分離システムを模式的に示している。 図１Ｂは、本発明の例示的な実施形態に従って、図１Ａのようなシステムの分離装置の透視図を模式的に示している。 図１Ｃは、本発明の例示的な実施形態に従って、図１Ａのようなシステムの分離装置の横断面図を模式的に示している。 図１Ｄは、本発明の例示的な実施形態に従って、図１Ａのようなシステムの磁化区域の拡大横断面図を模式的に示している。 図１Ｅは、本発明の例示的な実施形態に従って、図１Ａのようなシステムの磁化区域の拡大した別の横断面図を模式的に示している。 図１Ｆは、本発明の例示的な実施形態に従って、希少細胞の分離に関する別のシステムを模式的に示している。 図２Ａは、本発明の例示的な実施形態に従って、図１Ａのような分離システムの外部の描写を模式的に示している。 図２Ｂは、本発明の例示的な実施形態に従って、試料を取り扱いやすい機構を有する、図１Ａのような分離システムの外部の描写を模式的に示している。

以下の説明は、本発明の実施形態の一つ以上の非限定的な例に関する。本発明は、説明された実施形態、または図面に限定されず、また、様々な様式や構成や変化形で実施することができる。本明細書中で使用される用語は、特別な言及が無い限り、限定するものとして理解すべきではない。

本明細書中で使用される非限定的な節の見出しは、利便性のためにのみ意図されており、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

一般的な用語
用語「約」、「近く」、「おおよそ」、「実際に」は、参照される用語または実施の形態や動作、または本発明の範囲に対して相対的に有害な結果または影響の無い、それぞれの関係または数値データまたは量または数量または程度を示す。

用語「垂直」、「水平」、「平行」、「反対」、「直線」および他の角度および幾何学的関係性はまた、おおよそのしかし機能的および／または実際的なそれぞれの関係性を更に示す。

用語「好ましい」、「好ましくは」、「典型的な」、「典型的に」、または「必要に応じて」は、本発明の範囲も、その実施形態も限定するものでは無い。

用語「相当な」、「かなりの」（または、その同義語）は、文脈に関して、参照先の実態の大部分またはほとんどの部分を包含する、測定値または範囲または量または程度を示すか、参照先の実態または参照先の対象物に対して、少なくとも中程度または非常により大きいまたはより大きいまたはより効果的またはより重要である範囲を示す。

用語「微々たる」および「僅かに」（または、その同義語）は、参照される用語および本発明の範囲に対して実用的な結果有するには十分に小さいそれぞれの関係または測定または量または数量または程度を表す。

用語「〜であり得る（ｍａｙ）」は、含まれるもしくは含まれない、および／または、使用されるもしくは使用されない、および／または、実施されるもしくは実施されない、および／または、発生するもしくは発生しない選択肢または効果であるが、その選択肢は、本発明の範囲を制限することなく、本発明の実施形態またはその結果のいくつかの少なくとも一部を構成するものである選択肢または効果を示す。

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」並びに、その語形変化および複合体は、「含むが、それには限定されない」ことを示す。

数値範囲を引用する場合、それは単に利便性や簡潔にする目的のためであり、可能性のあるすべての副範囲だけでなく、その範囲の境界の内部および周囲の個々の数値も含まれている。任意の数値は、特に指定のない限り、実際的な近似値を含み、整数値は少数値を除外しない。副範囲の値および実際的な近似値は、具体的に開示された値として考慮されるべきである。

文脈上でそうでないことが示されない限り、単数形の対象（例えば、「１つのこと（ａ ｔｈｉｎｇ」またはそのこと「ｔｈｅ ｔｈｉｎｇ」）への参照は、複数形（例えば、「そのこと（ｔｈｅ ｔｈｉｎｇｓ）」）を排除しない。

文脈上の用語
明細書および特許請求の範囲において、以下の用語並びに、その派生語および語形変化は、文脈からそれ以外が指定されておらず、明らかでもない場合、それぞれの非限定的な以下の特徴づけを意味する。

磁化／磁性（細胞）−磁性ビーズなどの、強磁性体と連結している。

標的細胞−細胞は、典型的に、他の細胞から分離または濃縮することを意図されており（例えば、検査または診断用）、特定の型であるか、または特定の抗体もしくは他の化合物もしくは他の粒子との連結のための選択的な相互の親和性など、他の細胞にとは異なった特性を有している。特定の実施形態において、異なる特性は、磁性標的細胞を形成するために磁性ビーズと連結または結合するための選択的親和性である。

分離−周囲流体のバルクからの標的細胞の単離または収集蓄積であり、ここで、バルクは、例えば、細胞の流体混合物またはエマルジョン懸濁液またはそれらの組み合わせであり、また、周囲のバルクまたは提供されている細胞の試料に対する標的細胞の濃縮または高濃度化を示唆している（沈殿や遠心分離と同様にして沈殿物を得る）。

枯渇−分離について、バルクから標的細胞を取り除くこと（沈殿や遠心分離と同様にして上清を得る）。

高定性的（分離、枯渇）−高純度であり、他の細胞の実質的に排他的な、または分離された細胞の約５％〜約１％もしくはそれ未満などの微々たる量の他の細胞を含む標的細胞の分離、および逆関係的に枯渇。

高定量的（分離、枯渇）−高回収率であり、実質的に全ての標的細胞の分離または、分離された細胞の約９５％〜約９９％もしくはそれ以上などの、試料からの高い量の標的細胞の分離、および逆関係的に枯渇。

磁性ビーズ−ナノメートル範囲（例えば、２０〜１００ｎｍ）の直径または断面を有し、標的細胞と連結または結合するための選択的親和性のために適合された、マイクロビーズまたはミクロスフェアなどの、常磁性体サブミクロン粒子。

希少細胞−それぞれのソースや環境における他の細胞に対して、約１０細胞／ｍｌもしくはそれ未満（例えば、１細胞／ｍｌ）、または１ｐｐｍ未満（例えば、１ｐｐｂ）など、生物やその他の環境としてのソース内で、少ない量である（低存在量）特定の特性の細胞。例えば、胎児有核赤血球（本明細書にてＮＲＢＣ、ＦＮＲＢＣとも）、または幹細胞。

磁化／磁性（細胞）−磁性ビーズなどの、強磁性体と連結している。

細胞−生物学的な、および必要に応じて磁気ビーズなどの非生物起源であってもよいその他の粒子または化合物の組み合わせも含む生物細胞であり、例えば、血液細胞、微生物およびその一部、または胞子や花粉などの生物学的起源の他の粒子を含むが、非生物起源の粒子を排除しない。

一次試料（細胞の）−細胞のソース（例えば、血液試料、汚染された水や空気の試料）から取得した細胞を含むボリュームであり、遠心分離や試薬や抗体などによって、可能性としてまたは必要に応じて、物理学的に、または化学的に、または生物学的に濃縮されてよい。

試料（細胞の）−細胞のソース（例えば、血液試料、汚染された水や空気の試料）から取得した細胞を含むボリュームであり、可能性としてまたは必要に応じて、化学的に、および／または生物学的に、および／または物理学的に処理、および／または改変されてよい（例えば、冷却した、濃縮した、希釈した、磁性ビーズと連結した）。

相当（一部または部分）−参照される実体の約２５％〜８０％またはそれ以上などの、顕著な相対的量または数量。

「ｐｐｍ」、「ｐｐｂ」−それぞれ、百万分の一（１０^−６）、十億分の一（１０^−９）である。

本明細書において、細胞が管の壁に、付着している、または貼り付いている、または接着しているという参照がなされている場合、またはそのような効果についての同様の用語は、細胞が直接的に壁に付着している必要は無く、むしろ、細胞が、細胞の鎖または細胞群などによって、間接的に壁に接続または連結または吸引されることも指すことを理解すべきである。

概要
本発明の実施の一般的な非制限的な概要を、以下に示す。概要は、本発明の実施形態の例示的な実践の概要を説明し、変化形および／または代替および／または分岐の実施形態の建設的な基盤を提供し、その中のいくつかをこの後に記載する。

図１Ａは、本発明の例示的な実施形態による、他の細胞からの希少細胞の分離のためのシステム１００Ａを模式的に示す。一般的に、システム１００Ａは、分離ユニット１２２中に形成された磁化区域１２４を含み、その中を、磁性希少細胞および他の非磁性細胞の試料混合物を含む流体は、試料混合物源１０６から管１１０内を通り（流れ）、回収容器１０８へ排出される。以下の議論において文脈から指定されるか、または、はっきりと明らかである場合以外は、用語「標的細胞」は「磁性標的細胞」を意味する。

試料容器１０２は、生命維持液中に磁性標的希少細胞を含む試料細胞を含有し、担体容器（またはリザーバ）１０４は、分離システム１００Ａ中に試料を運搬するための担体流体（本明細書の以下では、「担体」とも言う）を含む。いくつかの実施形態において、典型的に、生きている細胞が分離される場合、担体は、生理食塩水など、必要に応じて抗凝固成分などの添加剤を含んでいてよい生命維持流体である。

試料および担体は、独立的に、ポンプ１１２および１１４からそれぞれ供給され、それらが混合される中間容器１０６へ送られる（「混合容器」とも言う）。独立的にポンプを管理できることによって、典型的に、システム１００Ａの他のパラメータ（例えば、磁化区域の数および磁場の強度）について、標的細胞の十分なまたは所望の分離を促進するために、担体に対する試料の率を調整することが可能である。試料および担体の流体混合物（以下、「混合物」と言う）は、管部１４２を介して、混合容器１０６から供給され、更に、１４４として模式的に示されている接続を介して、管１１０へ供給される。

典型的に、ブラケット１３４によって示された要素は、矢印１５４によって示されるように、一般的に垂直である。

更に参照すると、図１Ｂは、システム１０Ａの分離ユニット１２２の斜視図を、模式的に示し（断面の平面Ａ−Ａおよび、矢印１５８によって示される上面で示されている）、図１Ｃは、本発明の例示的な実施形態による、分離ユニット１２２の断面Ａ−Ａの図を模式的に示しており、ここで、図１Ｄ〜Ｅは、磁化区域１２４の２つの例示的な変化形の断面Ａ−Ａを模式的に示している。

混合容器１０６からの混合物は、平面座標１５２によって示されるように、一般的に水平方向に向かって、一つ以上の分離ユニット１２２の一般的に水平な上面上に配置された管１１０へ供給される。分離ユニット１２２は、それぞれ、内部および外部コアの１２６ａおよび１２６ｂを有する電磁石、並びに、内部コア１２６ａ上に巻かれたコイル１２８を含み、場の方向が模式的に矢印１６０ｕおよび１６０ｄによって示され、また、それぞれの場の方向１６０によって図１Ｃにも示されるように、磁化区域１２４ａおよび１２４ｂを提供する。

混合容器１０６から管１１０へ供給された混合物は、重力に独立的に、且つ、試料１０２および担体容器１０４から混合容器１０６への流れに独立的に流速を調節するポンプ１１６によって管１１０へ流される（押し進められる）。混合物が磁化区域１２４を通過すると、電磁石によって生成された磁場は、非標的細胞が壁面に引き付けされるのを阻害しながら、管１１０の壁に向かって磁化された標的細胞を引き付け、壁面に、混合物の残りからの標的細胞を分離し、濃縮するように形成される。

混合物が管１１０を介して流れ、標的細胞が管１１０の壁へ付着すると、枯渇された混合物（実質的に、希少標的細胞を含まない）は、模式的に１４８として示される接続を介して管１１０に接続する管部１４６を介して収集容器１０８へ排出される。典型的に、ブラケット１３６によって示される構成要素は、一般的に、矢印１５６によって示されるように垂直に向けられる。

一旦分離が完了し、枯渇された混合物が容器１０８へ排出されると、電磁場の生成は停止し、それによって、管への磁化された標的細胞の引き付けを減少させ、標的細胞を、別の容器１０８などの別の収集容器中へ洗い流す（ゆすぐ）。いくつかの実施形態において、磁場を停止することは、例えば、電磁石内に一時的に減衰交流電流を印加することによって、分離された標的細胞を依然として管１１０の壁へ引き付けるかまたは付着させている可能性のある残留磁気を除去するために電磁石を消磁することも含み、それによって、分離した細胞を管壁から解放することを補助する。

分離した標的細胞の収率を向上するために（分離または回収の量的な増加）、いくつかの実施形態では、消磁に加えてまたはその代替として、一つ以上の手段が、管１１０の壁からの標的細胞の解放を促進するために取られる。例えば、標的細胞を押し込む一つ以上の空気泡を流すこと、および／または、一つ以上の圧電素子などによって管を振動させること、および／または、少なくとも磁化区域１２４周辺において、管上に超音波を印加すること、もしくは、流速を突然変更することによって流体内に衝撃を誘発すること。取り外し促進手段の適用と同時またはその後に、担体によって、または他の容器由来などの他の流体によって洗い流された標的細胞、および、洗浄流体の構成要素（例えば粘度）および／または流速は、必要に応じて、実質的に全ての分離された標的細胞を洗い流すように、設定または調節される。

様々な実施形態において、シングルユニットを含む任意の数の分離ユニット１２２が、破線／実線１３８によって示されるように、システム１００Ａの実施形態において使用され得ることに注意されたい。

分離システム変化形
図１Ｆは、本発明の例示的な実施形態による、希少細胞の分離のための他のシステム１００Ｂを模式的に示す。

システム１００Ｂは、システム１００Ａの分離ユニット１２２の代わりに、異なる設計の分離ユニット１８２がシステム１００Ｂにおいて使用されていることを除き、システム１００Ａと同じである。

分離ユニット１８２は、コア１８６およびその周囲に巻きつけられた１８８ａおよび１８８ｂなどのコイルを有する電磁石を含み、これは、それぞれ、１８４ａおよび１８４ｂなど、磁化区域１８４の周辺に矢印１６０ｐおよび１６０ｑによって示される磁場を生成する。シングルユニットを含む任意の数の分離ユニット１８２が、破線／実線１３８によって示されるように、システム１００Ｂの実施形態において使用され得る。

図２Ａ〜Ｂは、本発明の例示的な実施形態による、１００Ａなどの分離システムの外部描写２００を示す。指定された部品は、図１Ａ〜Ｃについて記載されたシステム１００Ａの部品と、同じか同様である。システム２００は、典型的には、例えば、タッチパネル２０４および／またはマウスおよび／またはキーボードおよび／または専用のキーパッドもしくは遠隔操作ユニットなどの任意の他のヒューマンインターフェイスデバイスを介して操作され、コンピュータ可読媒体上に保存された一つ以上のプログラムに従って作動する、一つ以上のプロセッサまたはコンピュータによって制御される。

いくつかの実施形態において、１０８などの収集容器は、カルーセル（２０２として示されている）などの機構の上に搭載され、システム操作手順によって、排出管１１０についての位置へ適切な容器を移行するか回転させる。例えば、分離の間は枯渇された混合物を収集するための容器が、排出のために配置され、標的細胞を収集する間は別の容器が排出の場所に配置される。

システム２００などの分離システムは、典型的に、無菌コンパートメントまたはドラフト・チャンバーなどの管理された環境で使用されることから、試料容器１０２を搭載もしくは除去するため、または試料を充填するため、または成分を試料へ追加するためのアクセスは、試料容器１０２（またはそこに搭載されている要素）が、固定的に高い位置（磁化区域１２４のレベルなどの、システムの残りの部分と比較して）に配置されていると、いくつかの場合、制限さたり、扱いにくかったりし得る。いくつかの実施形態において、試料容器１０２への便利なアクセスを提供する機構が実装されている。

図２Ｂは、更に、本発明の例示的な実施形態による、試料容器１０２の便利な取扱いのための機構２０６を示す。機構２０６は、一側面２０４が固定的にシステム２００の枠組み上に搭載され、他の面は、上方位置および下方位置の間で移動可能である、平方四辺形のような構造をしており、後者は重ねて描かれており、上向きの方向は矢印２０８によって示されている。

必要に応じて、他の機構も使用され得、システム２００などのシステムの他の部分への便利なアクセスを提供するための機構も含む。

機器／変化形
一般的に、システム１００Ａ、１００Ｂ、および２００（それぞれ、図１Ａ、１Ｆおよび２Ａ〜Ｂ）は、上記のように共通の特性を共有し、一般的に以下の説明において、以下には限定されず、システム１００（「システム」としても）としても言及される。図１Ａ〜Ｆおよび２Ａ〜Ｂも、以下の説明にも言及される。

それぞれシステム１００Ａおよび１００Ｂ中の電磁石および各磁化区域１２４および１８４の構造、および形状、方向、および電磁石によって生成された磁場の強度（例えば、空間分布）だけではなく、必要に応じて、それぞれが異なる場の形状および／または強度を有していてもよい磁化区域の数が、管壁上の希少標的細胞の効果的な分離を達成するために、構成され、または決定され、または調整される。磁化区域の磁束は、非標的（および、非磁性）細胞が管壁に引き寄せされるのを妨害しながら磁性細胞の分離を行い、その結果、９８％などの約９５％〜約９９％またはそれ以上の範囲の希少細胞の濃度となり、実際には、非標的細胞が含まれないか、無視できる量である。

いくつかの実施形態において、必要に応じて、粘度や弾性などの担体または混合物の特性を考慮することによって、非標的細胞は、管壁へ向かっての流体混合物中における動きを妨げる、または遅らせることによって阻害されている。いくつかの実施形態において、磁場の引力下では、磁性標的細胞が管壁へ向かって動くのを可能にしている一方、担体（件の混合物）の組成は、添加剤などによって、適切な妨害の特性を得るように設定され、または選択され、または調整されている。

磁化区域における、磁束の形状および強度は、例えば、コア（例えば１２６または１８６）の形状および構成（例えば、構造、材料）、コイル（例えば１２８または１８８）の形状および巻き、コイル中の電流強度（必要に応じて、電流の時間変化を含む）、および管（例えば管１１０）が配置されている形式（例えば、溝、取り付け具）の一つ以上によって、設定される。いくつかの実施形態において、上述のような分離を達成するために、電磁石は、それぞれの磁化区域において、流れている混合物中の相当量の磁化された希少細胞（例えば、５０％以上）を、非標的細胞が無視できる量であるか実質的に無い状態で、管壁へ引き付けるように、構成される。いくつかの実施形態において、電磁石は、設計規則および／または専門知識に従って設計され、変化形は、例えば、試料中および分離した収集物中の希少細胞の濃度または割合を、本技術分野の方法（例えば、サイトメトリーまたはＭＡＣＳ）によって比較することなどによって分離の有効性を確認することによって決定する。その後、電磁石または磁化区域は、９５％以上の分離濃度などの目標に向かって結果を改善するように、調節され、または整えられ、調整される。

混合容器１０６から収集容器１０８への経路は、基本的に連続した導管または管であり、１１０などの管および１４２または１４６などの管部および接続部１４４および１４８は、同じまたは異なる直径または断面であることに注意されたい。いくつかの実施形態において、管１１０の断面は、その長さに沿って変化し得、それによって流速が変化し、必要に応じて、管壁への標的細胞の付着を促進するように、および／または、管１１０の壁または標的細胞への非標的細胞の付着を阻害するように、および／または、混合物の流れを妨げ得る非標的細胞の凝集を阻害するように調整された磁化区域周辺の直径または断面を有していてもよい。

いくつかの実施形態において、管１１０の内径は、少なくとも磁化区域１２４または１８４の周辺にて、迅速な分離を達成するための十分な流れを可能にするために、約２ｍｍ以上である。

１４４および１４８によって示される接続部は、曲線の管または膝状管などの管部であり、典型的に、管１１０において曲がっており（例えば、図２Ａ〜Ｂを参照のこと）、一般的に垂直な管部１４２および１４６を、一般的に水平な管１１０へ接続する。必要に応じて、または代替的に、分離システムは、混合容器１０６から収集容器１０８までの管又は導管の区域が、実質的に水平方向の一般的な方向（たとえな、試料容器１０２および混合容器１０６がほぼ同じ高さに存在する）から実質的に垂直な一般的な方向の間、または任意の他の変化形などの、他の方向であり得るように構成され得る。

典型的に、１１０または１４２または１４６などの管、並びに、接続１４４および１４８は、シリコーン管などのように、生細胞を維持するために生体適合性材料から作られているか被覆されている。典型的に、管は柔軟性で屈曲可能であり、且つ、弾性的に圧縮可能である（例えば、圧縮への弾力性がある）。

駆動ポンプ１１６は、１２２または１８２などの第１の分離ユニットの前、もしくは、最後の分離ユニットの後などの、混合容器１０６から収集容器１０８までの間の経路上で任意の区画に配置され得る。

いくつかの実施形態において、破線／実線１３８によって示されるように任意の数の分離ユニットまたは磁化区域または電磁石が使用され得、必要に応じて、それらの内の一つのみの要素およびより短い管などの、より少ない数の電磁石またはユニットまたは区域も示唆する。必要に応じて、ポンプ１１６などの複数のポンプは、典型的に同期され、混合物を管１１０に流すために使用され得る。

いくつかの実施形態において、ポンプ１１２、１１４および１１６は、蠕動ポンプなどの、細胞の活性を維持し、および／または安定的な流れを提供する任意のポンプであり得る。

分離ユニット１２２または１８２は、それぞれ２つの磁化区域１２４を含むが、それでもユニット１２２または１８２または他のユニットは、一つまたは三つ以上の磁化区域を有するように設計され得、必要に応じて異なる構成および生成された磁場を有するように設計され得ることに注意すべきである。

いくつかの実施形態において、試料容器１０２は、使い捨て可能であり、約５０ｍＬの容量を有しており、一回の分離にのみ使用され、一方、いくつかの実施形態において、担体容器１０４は、多数の分離のための担体流体を提供するための、より大きな瓶または他の容器である。いくつかの実施形態において、管１１０（または、実際には、管１１０および区域１４２および１４６、並びに、接続１４４および１４８を含む連続的な管）は、使い捨て可能に作られており、一回のみの分離に使用され、シリコーンチューブ１．９８＊３．１８で作られている。典型的に、収集容器は、試験管と同じであり、使い捨て可能である。

細胞の活性が必須ではない、または、試料が非生物粒子であるいくつかの場合において、担体または洗浄流体などの流体は、生命維持溶液である必要は無く、管は生体適合性である必要は無く、これによって、粘性、弾性、または流動性などの特定の特性についての構成要素および、要素のより大きな選択が可能となる。

磁化区域
電磁石は、細胞や装置に悪影響を及ぼす可能性がある、過剰または不要な電力消費を避けることで効率的な電力による効果的な分離のために、磁化区域において、磁束を提供し、集中するように設計される。例えば、過度の熱放散は、細胞を損傷する、または細胞を凝集する、または担体の粘性を変化させる、または電磁石を変形させる可能性がある。分離のための適切な磁束を提供しながら、実質的に最小の値または公称値に消費電力を維持することは、冷却機構を回避することによって、シンプル且つコンパクト且つ信頼性の高い装置を提供することも可能とする。

更に、迅速だが質の高い分離を達成するために、システムは、例えば約２ｍｍなどの十分に広い内径または断面を有する管内で、例えば約２ｍｌ／分などの十分に高い流速で混合物を流すように促し、細胞の凝集など細胞にとって有害であり得るせん断力などの力を流れている流体中に生じる結果となる、流速が不適切に低い又は管が不適切に狭い（例えば約１ｍｍ以下）の場合に生じ得る細胞の損傷を避けながら、迅速な分離を提供するように構成される。従って、電磁石は、記載したように高い流速及び広い管において流れる生きた希少細胞を十分に分離するように、構成され、制御される。

図１Ｄは、ユニット１２２などの分離ユニットの、区域１２４などの磁化区域１２４ｐの拡大断面図を模式的に表し、管１１０の配置を模式的に管区分によって示す。磁化区域１２４ｐは、一般的に、矢印１６０によって示される磁場束において、管１１０の区分を配置するためのギャップによって分離された平行平面として形成される（図１Ｃにおける磁化区域１２４ａおよび１２４ｂにおいて示すように、磁場の方向は反対であり得る）。いくつかの実施形態において、迅速な分離を容易にするために十分に広い管１１０を配置できるようにするために、ギャップは約３ｍｍまたはそれ以上である。

図１Ｅは、ユニット１２２などの分離ユニットの区域１２４などの磁化区域１２４ｑの拡大断面図を模式的に表し、管１１０の配置を模式的に管区分によって示す。実質的に追加の電源無しでの、磁束の更なる濃縮（例えば、磁化区域１２４ｐに対して）のために、磁化区域１２４ｑは、一般的に丸みを帯びた対向する面として形成されている。丸みを帯びた面は、矢印１６０で示された磁束（図１Ｃにおける磁化区域１２４ａおよび１２４ｂ中に示されるように、磁場の方向は、反対であり得る）中に管１１０の区分を配置するためのギャップによって分離されている。いくつかの実施形態において、ギャップは、外側の直径が約３ｍｍなどの十分に広い管１１０を配置することによって、迅速な分離を可能にしている。

以下の表１は、磁化区域１２４における、生成され、濃縮された磁束の効率の例を電流の関数として提供し、磁化区域１２４ｐの平面と比較して、磁化区域１２４ｑの丸みを帯びた面の効率がより良くなっている。電磁石のコイル（例えば、分離ユニット１２４のコイル１２８）は、１．１ｍｍの太さのワイヤの２０００巻で作られ、９．１Ωの抵抗が生じる。説明し、記載した値は、近似値である。

操作
希少細胞の高定性的、高定量的分離収率を達成するために、システム１００を操作し、必要に応じて、特定の手順およびパラメータに従ってプログラムされたプロセッサの下で少なくとも部分的に操作し、そのうちのいくつかを以下に記載する。

標的希少細胞を磁性ビーズと連結させるプロセスにおいて（以下を参照）、いくつかの細胞は、典型的に他よりも多くのビーズと連結し、結果として異なる磁力（与えられた磁場の下での力）を有する磁性標的細胞を得る。明確および簡潔のために、一つのみの磁化区域（たとえば、磁化区域１２４）が使用されるとすると、実質的にすべての標的細胞を引き付けるのに十分強い磁場を適用することは、いくつかの場合において、管（たとえば管１１０、以下「管」）の壁に付着するチャンクや塊を形成するように細胞を引きつけ、結果として低定性的分離収率となる。更に、可能性としておよびおそらくは、標的細胞が管壁面に向けてドリフトすると、それらは、細胞の塊に付着したりもしくは隠されたり、または標的細胞の上にもしくはそれと一緒に凝固する可能性のある非標的細胞を一緒に引き付け、結果として低定性的分離となる。他方、弱い磁場を印加する場合、強い引き付け（比較的多い量のビーズと連結した）を有する標的細胞のみが分離され、残りは部分的に枯渇された混合物とともに流出し、結果として低定量的分離となる。

従って、いくつかの実施形態において、磁場の異なる強度および／または磁束の異なる空間分布が、異なる磁化区域に印加される。磁場は、次に、十分に混合物の流れに耐えるように標的細胞が分離され管壁に付着し、非標的細胞が無視できる程度か又は引き付けられないように調整され、一方、磁場が終了すると、実質的に又は完全に（少なくとも実際的に）洗い流され、放出される。例えば、第一の磁化区域がやや強い磁場を提供し、非標的細胞が、実際には引かれず、壁面へ運ばれず、または標的細胞と凝固しないように、少ない量の磁性ビーズを有する標的細胞を引き付ける。その後の磁化区域において、より低い磁場が印加され、標的細胞がより多く引き付けられるが、非標的細胞を引くことは無い。そのようないくつかの磁化区域を備えるスキームが使用され得、それぞれ異なった磁場強度及び磁束分布を備えている。

いくつかの実施形態において、空間および費用を削減するために、管は、指定された数の磁化区域を介して通すことができ、一つ以上の環である可能性があり、磁場強度は、非標的細胞を、引いたり捕まえたりすることなく、または実際的にそのようなことがなく、希少な標的細胞を分別的に分離するように調整される。必要に応じてまたは代替的に、いくつかの実施形態において、指定された数の磁化区域（一つである可能性もある）を用いて、適度に弱い磁場が、高い引き付けの標的細胞に使用され、その後、磁場を増加させ、混合物を、より高い引き付けの標的細胞の分離するために、再利用される。必要に応じてまたは代替的に、指定された数の磁化区域を用いて、希少な標的細胞の画分を、特定の磁場強度を用いて分離し、磁場を終了させ、分離した標的細胞を洗浄し収集し、そのサイクルを異なる磁場強度で繰り返し、従って、希少な標的細胞の部分を連続して分離する。

いくつかの実施形態において、磁束は、もしあれば、非標的細胞およびその蓄積が無視できる程度のみである状態で、様々な磁性希少細胞を引き付けるように、様々な強度（グラジエント）で形成される。同様に、いくつかの実施形態において、もしあれば、非標的細胞およびその蓄積が無視できる程度のみである状態で、様々な磁性希少細胞を引き付けるように、磁束は（混合物の流れに対して）一時的に可変である。いくつかの実施形態において、空間的に変化する磁束および時間的に変化する磁束の組み合わせは、高定性的および高定量的な希少細胞分離を達成するために調整される。

磁化区域の数および／または分離サイクルの数は調整され得、システムを累積的な優れた定性的および定量的な分離の収率で微細な差動または希少標的細胞の分別的な分離へ調整することを可能にする。

上記の説明において、強い、弱い、適度に、大きい、低いまたは高いなどの修飾語は、単に別の例を説明するために相対的な量または強度を示しているに過ぎないことに注意されたい。

必要に応じてまたは代替的に、いくつかの実施形態において、可能にまたは必要に応じて、磁場強度または空間分布または細胞の型などのパラメータ、および／または温度などの他のパラメータについて、他のパラメータは調整される。例えば、流量および／または粘度および／または混合物や担体流体の弾性は、少なくとも非標的細胞の凝集が実質的に妨害され、標的細胞の分離を可能にするように調整され得る。いくつかの実施形態において、担体流体は、分離された標的細胞を洗浄するために使用され、更にいくつかの実施形態において、洗浄流体は、担体流体と異なっている。流動様式および洗浄流体の速度は、必要に応じて、管壁から標的細胞を外すのを促進するように（例えば、除去または遊離を促進する）調整され、そのような流れを突然変えることによって、乱流または、侵食を助け、管壁上の標的細胞を不安定化させる衝撃を誘発する。

いくつかの実施形態において、高い定性的および定量的な希少細胞の分離率のための典型的なサイクルは、約２ｍｌ／分の処理能力で、約１５分などの数分以内に完了し、操作パラメータおよび／または追加の機器（実質的に同時分別的な分離または同時に複数の管を使用して、例えばより多くの分離ユニットまたは磁化区域）の調整は、分離サイクル時間を削減し得る。いくつかの実施形態において、磁化区域内の電磁石によって生成される磁束密度の大きさの桁は、１Ｔ（テスラ）であり、いくつかの実施形態において、標的細胞の半分以上（例えば、約８０％）などの相当の部分は、第１の一つまたは二つの磁化区域（ユニット１２２などの第１の分離ユニット）において分離される。

いくつかの実施形態において、管から分離した細胞の遊離の促進（例えば、消磁、バブリング、振動）は、細胞を管から洗い流す前、および／またはそれと同時に実行することには注意されたい。

質または純度の高い枯渇が企図される場合（標的細胞の収集ではなく）、非標的細胞の壁への付着および／またはその凝固を代償として、収集のために使用されるよりも強い磁場などの十分に強い磁場が印加され得る。

試料
試料は、典型的には、磁性ビーズと特異的に連結するように処理された、試験のための希少細胞（標的細胞）を含む一次試料から得られる。例えば、妊娠中の女性からの血液試料は、標的細胞として希少な胎児有核赤血球（ＦＮＲＢＣ）が存在すること、あるいは血液や羊水からの幹細胞が期待されている。

いくつかの例示的な場合において、一次試料源はリンパ液や尿などの他の生理的流体であり、一方いくつかの場合において源は、非生物学的であり、細胞は、水や空気や他の環境などのソースから収集された細菌や、花粉や胞子などの他の生物学的粒子である。

いくつかの実施形態において、標的細胞は、実際には、細胞ではなく他の任意の材料または組成物の微小粒子（例えば、約１μｍまたはそれ未満）であり、標的粒子は、磁気ビーズと選択的に連結、結合することができる。

操作手順の概要
いくつかの実施形態における記載によると、システムは、（ａ）磁性希少細胞を含む細胞試料を提供することと、（ｂ）管の内側の担体中の細胞試料の混合物を流すこと、および（ｂ）他の細胞を管壁へ引き付けるのを妨害し、それによって磁性希少細胞を管壁上へ分離する一方、混合物から管壁上へ磁性希少細胞の大部分を十分に引き付けるように、電磁石によって生成された磁束を有する磁化区域周辺に配置された管の内側の担体流体中の、細胞試料の混合物を流すことによって、細胞の流体混合物から磁性細胞を高い定性的および定量的収率で分離するために使用される。

いくつかの実施形態において、磁化された細胞は、細胞の残りの部分に対して低い存在量の希少細胞である。

典型的な実施形態において、磁化された希少細胞の混合物からの分離が完了すると（または実際的に完了する）、磁束は、終了し（細胞の引き付けが低下）、分離された磁性希少細胞は管の外側へ洗浄される。

いくつかの実施形態において、分離された細胞の洗浄は、消磁、バブリングまたは管の振動などの、管壁からの磁性希少細胞の分離を促進するための機構の活性化の前に実行されるか、または同時に行われる。

例示的な手順
数ｍｌ（例えば、５ｍｌ）の一次血液試料を、妊娠中の女性から得る。試料は、ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／１１３３１Ｄ−Ｄｙｎａｌ−ＣＤ４−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ−Ｋｉｔ−（ｒｅｖ００３）．ｐｄｆ中のキット手順と類似して、またはそこに画定された通りに、調製され、かつ、磁性ビーズと連結される。

調製した試料は、使い捨て可能な試料容器（例えば、容器１０２）に配置する。

約３ｍｌのＰＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．５％ＢＳＡの洗浄バッファ（担体流体）を担体容器（例えば、１０４）に配置し、対応するポンプ（例えば、ポンプ１１４）は、デバイスを準備するために、管（例えば、管１１０および接続部）を充填するように、分離のために混合容器（例えば、容器１０６）を充填することを含めて、約２ｍｌ／分で、洗浄流体（担体流体）を流すようにスイッチを入れ、その後のポンプのスイッチを切る。

分離ユニット（ユニット１２２）における磁場は、約４５０〜８００ｍＴで設定し、推進ポンプ（例えば、ポンプ１１６）は、約１ｍｌ／分で、混合物を流すようにスイッチを入れる。数ｍｌ（例えば、２ｍｌ）のみが混合容器中に残っている場合、推進ポンプは、スイッチオフされ、システムは、約２ｍｌ／分の流速で、約１５ｍｌの洗浄液によって洗浄される。

磁場は、スイッチオフされ、かつ、電磁石が消磁される

標的細胞は、約２ｍｌ／分の流速で、３ｍＬの洗浄液によって洗浄収集瓶（例えば、瓶１０８）へ洗浄される。

参照
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（３）Ｂｉａｎｃｈｉ ＤＷ，Ｆｌｉｎｔ ＡＦ，Ｐｉｚｚｉｍｅｎｔｉ ＭＦ，Ｋｎｏｌｌ ＪＨＭ，Ｌａｔｔ ＳＡ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｔａｌ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｍａｔｅｒｎａｌ ｂｌｏｏｄ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １９９０；８７：３２７９−３２８３．
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（６）Ｂｉａｎｃｈｉ ＤＷ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＪＭ，Ｓｕｌｌｉｖａｎ ＬＭ，Ｈａｎｓｏｎ ＦＷ，Ｋｌｉｎｇｅｒ ＫＷ，Ｓｈｕｂｅｒ ＡＰ．ＰＣＲ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｔａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍａｔｅｒｎａｌ ｂｌｏｏｄ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ａｎｅｕｐｌｏｉｄ ｐｒｅｇｎａｎｃｉｅｓ． Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９９７； ６１：８２２−８２９．
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（８）Ｂｉａｎｃｈｉ ＤＷ，Ｓｉｍｐｓｏｎ ＪＬ，Ｊａｃｋｓｏｎ ＬＧ，ｅｔ ａｌ．２００２．Ｆｅｔａｌ ｇｅｎｄｅｒ ａｎｄ ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｆｅｔａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍａｔｅｒｎａｌ ｂｌｏｏｄ： ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＮＩＦＴＹ Ｉ ｄａｔａ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｆｅｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｔｕｄｙ．Ｐｒｅｎａｔ Ｄｉａｇｎ ２２：６０９−６１５．
（９）Ｃｈｕｉ ＲＷ， ｅｔ ａｌ．２００８．Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｒｅｎａｔａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｆｅｔａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ ｂｙ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ ｍａｔｅｒｎａｌ ｐｌａｓｍａ．ＰＮＡＳ １０５（５１）：２０４５８−６３．

Claims (39)

1. 細胞生存率を維持しつつ、高定性的および高定量的収率で、非磁性細胞の混合流体から磁性細胞を分離するように構成された、磁気分離システムであって、
   （ａ）複数の区域の周辺に、前記混合物中の前記磁性細胞の大部分を引き付けるのに十分な磁束を生成するように構成された複数の電磁石と、
   （ｂ）前記区域の周辺に配置された管内で、決定し、管理された流速で、混合物を駆動するための駆動ポンプであって、それによって、他の細胞が前記管壁上に引き付けられるのを妨害しながら、前記生成された磁束によって、前記管壁上へ、前記混合物から前記磁性細胞の大部分を分離する、駆動ポンプ
   とを含む、磁気分離システム。
2. 前記細胞の生存率の維持が、前記細胞の生存率に有害な熱放散を回避しながら、前記磁場を生成することを含む、請求項１に記載のシステム。
3. 前記残りの細胞と比較して、低濃度の前記希少細胞を有する細胞の流体混合物から、希少細胞を分離するように構成された、請求項１に記載のシステム。
4. （ａ）前記管へ供給するための、前記細胞の流体混合物を調製するための混合容器と、
   （ｂ）細胞試料を保持するための試料容器と、
   （ｃ）担体流体を保持するための担体容器と、
   （ｄ）前記駆動ポンプに独立的に、前記細胞試料および前記担体流体を前記混合容器内へ駆動するためのポンプ
   を更に含む、請求項１に記載のシステム。
5. 前記管が、一般的に前記区域周辺にて水平に配置される、請求項１に記載のシステム。
6. 前記複数の区域が、前記磁化区域周辺に一般的に水平に前記管を配置するために、一般的に水平な面周辺に配置される、請求項１に記載のシステム。
7. 前記管が、一般的に前記区域周辺に垂直に配置される、請求項１に記載のシステム。
8. 前記複数の区域が、前記区域周辺に一般的に水平に前記管を配置するために、一般的に垂直な平面周辺に配置される、請求項１に記載のシステム。
9. 電磁石が、２つの区域周辺に磁束を生成するように構成される、請求項１に記載のシステム。
10. 前記管が順次連続した複数の区域周辺に配置され、前記他の細胞が前記管壁上に引き付けられるのを妨害する一方、前記流れている混合物中に残っている大部分の前記磁性希少細胞を、順次前記管壁上へ引き付けるように、各区域が構成されている、請求項１に記載のシステム。
11. 前記分離された磁性細胞を、前記管壁から取り外すことを促進するための、少なくとも一つの機構を更に含む、請求項１に記載のシステム。
12. 前記機構が、前記電磁石およびそれぞれの区域を消磁することを含む、請求項１１に記載のシステム。
13. 前記機構が、前記管の内側の流体内に空気泡を流すための装置を含む、請求項１１に記載のシステム。
14. 前記機構が、前記管を振動させる装置を含む、請求項１１に記載のシステム。
15. 前記システムが、前記混合物中に元々存在していた前記磁性細胞の少なくとも５０％を含む、前記磁性細胞の分離を提供するように構成される、請求項１に記載のシステム。
16. 前記システムが、前記混合物中に元々存在していた前記磁性細胞の少なくとも６０％を含む、前記磁性細胞の分離を提供するように構成される、請求項１に記載のシステム。
17. 前記システムが、前記混合物中に元々存在していた前記磁性細胞の少なくとも７０％を含む、前記磁性細胞の分離を提供するように構成される、請求項１に記載のシステム。
18. 前記システムが、前記混合物中に元々存在していた前記磁性細胞の少なくとも８０％を含む、前記磁性細胞の分離を提供するように構成される、請求項１に記載のシステム。
19. 前記システムが、前記混合物中に元々存在していた前記磁性細胞の少なくとも９０％を含む、前記磁性細胞の分離を提供するように構成される、請求項１に記載のシステム。
20. 前記システムが、前記混合物から回収された前記分離された細胞の６０％以上の、磁性細胞の濃度を提供するように構成される、請求項１に記載のシステム。
21. 前記システムが、前記混合物から回収された前記分離された細胞の７０％以上の、磁性細胞の濃度を提供するように構成される、請求項１に記載のシステム。
22. 前記システムが、前記混合物から回収された前記分離された細胞の８０％以上の、磁性細胞の濃度を提供するように構成される、請求項１に記載のシステム。
23. 前記システムが、前記混合物から回収された前記分離された細胞の９０％以上の、磁性細胞の濃度を提供するように構成される、請求項１に記載のシステム。
24. 前記システムが、前記混合物から回収された前記分離された細胞の９５％以上の、磁性細胞の濃度を提供するように構成される、請求項１に記載のシステム。
25. 前記システムが、前記混合物から回収された前記分離された細胞の９８％以上の、磁性細胞の濃度を提供するように構成される、請求項１に記載のシステム。
26. 前記流体混合物が、前記区域周辺の前記磁束の引力下で、磁性細胞の動きを許可する一方、非磁化細胞の前記管壁への動きを妨害するように調整される、請求項１に記載のシステム。
27. 前記担体流体が、前記細胞の活力を維持するように調整されている、請求項１に記載のシステム。
28. 前記管が生体適合性である、請求項１に記載のシステム。
29. 前記ポンプが蠕動ポンプである、請求項１に記載のシステム。
30. 前記磁束が、１テスラの桁である、請求項１に記載のシステム。
31. 前記細胞の活力を維持しながら、細胞の流体混合物から、高定性的且つ高定量的な磁性細胞を分離する為の方法であって、
    （ａ）磁性細胞を含む細胞試料を提供することと、
    （ｂ）細胞試料の混合物を、磁束を有する磁化区域周辺に配置された管の内側の担体流体中に流すこととを含み、前記磁束は、前記細胞への有害な熱放散を回避しながら電磁石によって生成され、他の細胞が前記管壁に接着するのを妨害する一方、前記混合物由来の前記磁化細胞の大部分を引き付けるのに十分であり、それによって前記管壁上の磁化細胞を分離する、方法。
32. 前記磁化された細胞が、前記混合物中の前記細胞の残部と比較して低濃度を有する希少細胞である、請求項３１に記載の方法。
33. 前記磁束を終了すること、および前記管から前記分離された磁性細胞を洗い流すことを更に含む、請求項３１に記載の方法。
34. 前記管壁から、前記分離された磁性細胞を外すことを促進するための機構を、同時にまたは先行して活性化することを更に含む、請求項３３に記載の方法。
35. 前記機構が、前記電磁石およびそれぞれの区域を消磁することを含む、請求項３４に記載の方法。
36. 前記機構が、前記管の内側の流体内に気泡を流す装置を含む、請求項３４に記載の方法。
37. 前記機構が、前記管を振動させる装置を含む、請求項３４に記載の方法。
38. 磁化区域が複数の区域を含む、請求項３１に記載の方法。
39. 区域は複数の連続的な複数の区域を含み、その上の前記管は連続的に配置され、且つ、各区域は、前記管壁上へ前記他の細胞が接着するのを妨害する一方、前記流れている混合物中に連続的に存在する大部分の前記磁性細胞を前記管壁へ引き付けるように構成される、請求項３１に記載の方法。
    

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