JP2005534306A - 生体材料の改善された選択のための方法および試薬 - Google Patents
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Abstract
Description
発明の分野
一般に、本発明は、細胞選択の分野におけるヒトおよび動物ヘルスケアのリサーチ、診断および治療的適用に特に有用である新規な粒子に関する。より具体的には、本発明は、細胞、細胞成分、細菌、ウィルス、毒素、核酸、ホルモン、蛋白質、受容体−リガンド複合体、他の複合体分子またはそのいずれかの組合せの選択を含む適用における、新規な強磁性高密度粒子(FDP)、およびその調製および使用の方法に関する。加えて、該粒子は、分子生物および蛋白質精製手順において適用を有することもある。
ヒトまたは動物対象からの液体中の細胞または細胞性様物質の集団またはサブ集団の、ポジティブ選択または欠乏を介する促進は、多くの適用に利用することができる。例えば、細胞療法の領域において、自家幹細胞移植前の腫瘍細胞の欠乏または同種間幹細胞移植前の特定の免疫細胞の欠乏は、患者にとって有益であり得る。診断において、特異的細胞の豊富化は、転移性疾患の初期診断に有用であり得る(例えば、米国特許第6,365,362号;04/2002;Terstappen, L.ら参照)。リサーチの場において、ポジティブおよびネガティブ選択手順の両方は、細胞ベースの研究にとって強力なツールであり、分子生物の場では、特異的遺伝子またはmRNAの検出が可能な選択ツールは、遺伝子発見にとって、およびリサーチツールとして非常に重要である。
当該分野でよく知られるように、いくつかのタイプの磁性粒子は、超常磁性および強磁性(を含むがこれらに限定されるものではない)に調製され得る。米国特許第5,411,863号および同第5,466,574号(それぞれ、05/1995; Miltenyi, S.および11/1995; Liberti, P.ら,)は、超常磁性粒子は生物学的選択適用のための選択の粒子であることを教示する。超常磁性物質は、ここ数年で、様々なヘルスケアおよびバイオプロセッシング適用において、磁性選択技術の重要要素となっている。超常磁性物質は、非常に磁力的に感受性であり、つまり、それらは磁場に置かれた時、強力に磁性になるが、磁場が除去されると、すぐにその磁性を失う。この特質によって、容易に細胞集団を単離し、磁場が除去される時に細胞を再懸濁することが可能になる。超常磁性は、結晶直径が臨界値を下回るほど減少した時に、強磁性物質において起こる。それらの直径に拘わらず(約25nmないし約100ミクロン)、そのような物質は磁場に置かれた時にのみ磁性であるという特質を有する。超常磁性作用の基本は、そのような物質が、磁性領域のサイズ以下であると推定される約20ないし25nm以下のサイズ単位で、磁性物質を含有することである。磁性領域は、存在する永久磁石双極子の最小容量である。他方で、強磁性物質は、磁場に対して強力に感受性であり、磁場が除去される時、磁性特質を維持することができる。強磁性は、物質中の不対電子が結晶格子内に含有され、すなわち、不対電子の結合が可能になる時にのみ起こる。先行技術は、永久磁石を持つ強磁性粒子が、これらの粒子の懸濁液が、それらのお互いに対する高磁性引力のため、磁場への暴露に引き続き容易に凝集するため、生物学的物質選択での適用に対して、かなりの不利益を有すると教示する(例えば、米国特許第5,411,863号;05/1995;Miltenyi, S.および同第5,466,574号;11/1995;Liberti, P.ら参照)。この理由のため、強磁性粒子は、当該分野において、生物学的(細胞選択/核酸)適用に使用されてこなかった。
磁力よりもむしろ重力に基づく非標的集団から標的を分離する固相微粒子が記載されている(例えば、米国特許第5,576,185号;11/1996; Coulter, W.らおよびZwerner,ら J. Imm. Methods (1997) 14:31-34)。現在、重力に基づき分離される粒子は、比較的高密度であり、約3ないし10ミクロンの範囲内の直径を持つ大きさである。これらの粒子の既知の特徴は、粒子および細胞の間の密度差のため、回転しながらの混転によって、粒子が液体試料の実質的部分を通過することができることである。粒子は関心のある細胞を横切り、そうすることで、非標的細胞に非特異的に結合せずに、標的細胞集団に結合する。これにより、効率的な分離および非標的細胞の高回収が可能になる。非標的細胞の分離および回収は、超常磁性選択のみで発見されるものより優れている。これらの高密度粒子は、混合様式(上記記載)として、および細胞懸濁液の残部から細胞の所望の集団を分離する様式としての両方で、重力によって沈降するように構築される。事実、先の記載(例えば、米国特許第5,576,185号;11/1996; Coulter, W.ら)は、重力選択におけるより小さい粒子の使用から離れて教示する。例えば、この特許の開示は、超常磁性粒子が試料中の懸濁液中に維持され、結果的に、試料懸濁液における重力沈降の非常に遅いまたは実質的な排除用に構築されるように意図される。典型的には、150nm未満の上手く覆われた物質は、6ヶ月およびさらにより長い期間、沈降の徴候を全く示さないだろう(米国特許第5,622,831号;04/1997; Liberti, P.ら参照)。従って、超常磁性粒子は、重力選択技術または密度差混合において適用できない。両方の手順は、細胞を捕獲し重力によって沈降する時の粒子および標的生体材料の間の密度差が少なくとも2−3倍である時に、最適に機能する。
本発明は、生物学的物質を選択するための改善された方法、装置、および組成物を提供する。この選択は、ある程度、混合および分離構成成分よりなる。本発明の目的のために定義された分離は、関与する粒子の物理的特質に依存するいずれのメカニズムも含む。例えば、これは、粒子の密度または磁性特質を含むだろう。具体的には、本発明は、十分に高密度な粒子の特質に基づく改善された選択手順を提供する。これらの粒子は、適した結合剤に結合した時、超常磁性粒子と比較して優れた磁性特質および無視できるキャリオーバのため、先行技術を超えるユニークな利点を提供する。これらの同一の粒子は、重力によって分離可能であり、より大きい粒子に似ているが、高密度標的に選択を制限しない利点を提供する。
好ましい具体例によると、本発明は、液体試料中の標的集団またはサブ集団の迅速かつ効率的な選択のための方法、装置、および粒子組成物を網羅する。この選択は、標的生体材料上の低密度部位および高密度部位の両方を認識するだろう。
1.4.0gm水酸化ナトリウムを計量し、ビーカーがパラフィルムで覆われている間撹拌することによって、100mlビーカー中に完全に溶解する。
2.2.04gm塩化ニッケルを計量し、200mlビーカー中の100mlの蒸留水中に溶解する。
3.200mlの蒸留水を、室温にて、清潔な反応容器に注ぐ。
4.塩化ニッケル溶液が20分間混合された後、検査して、溶液の表面上に夾雑物が漂っているかどうかを決定する。もし夾雑物が存在すれば、液体を捨て、夾雑物を残す。
5.14mlトリエタノールアミンを測量する。フードの下で、トリエタノールアミンを塩化ニッケル溶液に添加する。アクアグリーンへの予測される色変化を観察する。
6.38.5mlのヒドラジンを測定する。
7.磁気攪拌機で撹拌し続けつつ、塩化ニッケル−トリエタノールアミン溶液に、水酸化ナトリウム溶液を添加する。暗黄緑色への色変化を観察する。
8.完全な混合の後、漏斗を介して、塩化ニッケル−トリエタノールアミン溶液を反応容器に注ぐ。反応容器は、物質を添加する穴を有する蓋を含有する。穴は、反応の間、蓋をされる。また、濃縮器は蓋に設けられ、外側へ穴が開いている。濃縮器の中には、室温の水が流れている。粒子の生成は、化学的フードの中で起こる。
9.測定されたヒドラジンを反応容器に添加する。漏斗を除去し、プラグで栓をする。
10.熱を105℃まで上昇させ、撹拌する。
11.反応容器を観察して、反応が激しすぎないか確認する。もし気泡が濃縮器へとあまりにも高く上昇するなら、約200ulのブチルアルコールを添加して気泡を減少させる。
12.一旦、反応が起こると−約105℃にて、反応容器中の溶液は緑色から黒色へと変化するだろう。
13.反応を完了まで進める(約2.5時間)
14.過剰なヒドラジンの存在をチェックすることによって、反応が完了しているか確認する。攪拌機を止め、気泡のレベルが上昇するか否か決定する。もしレベルが上昇すれば、撹拌を再開して、素速く続けて、過剰なヒドラジンを消費する。もしレベルが上昇しなければ、反応は完了である。
15.反応が完了すると、加熱を止め、撹拌し続けて、冷却を早める。
16.粒子から上澄みを捨て、中和用に保存する。
17.濯ぎ、粒子を蒸留水中で懸濁する。
18.6回濯ぐ。
19.アルミホイルで覆われたビーカー中に最終的な粒子ペレットを入れ、250℃のオーブンに48時間置く。
20.ビーカーをオーブンから除去し、粒子を放冷する。
顆粒球は、本発明の抗体標識された強磁性高密度粒子を用いて、全血から効率的に分離される。
CD15は、白血球の主要なサブ集団である顆粒球の大部分(>99%)において存在する。抗−CD15−ニッケル粒子を使用して、標的細胞の特異的選択および非特異的に、非標識細胞を除去する際の粒子の効果をテストした。ニッケル粒子を、抗−CD15モノクローナル抗体(Beckman Coulter, Miami, FL)で、吸収によって標識した。CD15−ニッケル粒子の20重量%/容量の100ulを、12x75mmガラス試験管中の1ml全血に添加した。試料を、5分間、30rpmにて回転しながら混合し、次いで、直ぐに、さらなる5分間、磁石中に置くことによって分離した。上澄みを除去し、顆粒球の欠乏につき、血液学分析器で分析した(Sysmex KX-21, Roche Diagnostics Corp.)。図3Aは、全血中の白血球(白血球)集団を構成する3つの主要なサブ集団(リンパ球、単球および顆粒球)を示す。図3Bは、試料からの顆粒球のCD15−ニッケル粒子による効果的な選択を示す。リンパ球数(1.6x103細胞/ul選択前−対−2x103細胞/ul選択後)および赤血球数(4.8x106/ul選択前および後)は変化せず、非標的細胞は非特異的に選択されなかったことを示した。
白血球集団およびサブ集団を、異なる分子に特異的な複数の結合剤を用いて選択する。
本発明の強磁性高密度粒子は、関心のある全集団を効果的に選択するために、粒子に結合した1つの抗体または単一の粒子に結合した複数の抗体と使用することができる。この実施例において、実施例1で示されるように、CD15−強磁性高密度粒子(1ml全血;5分間、30rpmにて回転しながら混合;磁場で5分間分離)は、顆粒球につき効果的に選択した。再び、顆粒球の選択は、対照(図4A)と比較して、白血球の喪失なしで(表1;図4B)99%以上であり、非標的細胞の非特異的喪失なしの標的細胞の特異的選択を示した。CD15は単球に発現するが、抗原密度/細胞は、顆粒球上の抗原密度より少なくともlog低い。すなわち、CD15は、単球の17%を選択しただけであった。単球の選択を改善し、リンパ球を選択するために、第2の粒子を、CD15−強磁性高密度粒子と組合せた。粒子は、単一の粒子上に、CD45およびCD4を含有した(CD4は単球上で発現することが知られている)。標準の混合/分離条件(CD15に対する上記のように)に引き続き、CD15粒子およびCD45/CD4粒子の組合せは、10分間に、白血球の99%以上を効果的に選択した(下記表1;図4C)。図4Aは、選択前のリンパ球、単球および顆粒球の出発集団を示す。前方光拡散器−対−90℃光拡散器によって分析した。分析を、FACS Calibur(Becton Dickinson)で実施した。
本発明の粒子は、コロイド超常磁性粒子と比較して、劇的に減少した混合時間および磁気分離を有する。
コロイド超常磁性粒子は効果的に所望の集団を選択するが、粒子の超常磁気性質のため、当該分野において、混合時間および磁気分離が比較的長いことが知られている。CD45−超常磁性粒子を使用して、全血から白血球を選択した。製造者の指導によると、混合時間は15分で、磁気分離時間は15分であった。表2で選択される時間のパラメーターは、製造者の値の上および下である。
強磁性高密度粒子は、複数のサイズの超常磁性粒子と比較すると、減少された磁気分離時間を有する。
直径200nmないし4500nmの範囲の様々な超常磁性粒子および本発明の粒子の磁気分離時間は、表3にリストする。粒子を1mlのリン酸緩衝食塩水中に希釈し、分光光度計キュベットに入れた。キュベットの各側面に隣接した磁石を有する修飾されたホルダーに、キュベットを入れた。粒子が磁石によってキュベットの側面に引かれると、光は600nmにて拡散し、ベースラインまで減少した。表3にリストされた時間は、ベースラインに達するのに要した時間である。
本発明の強磁性高密度粒子を、磁場への暴露に引き続いて再懸濁する。
開示された発明に記載された強磁性高密度粒子(1mlのリン酸緩衝食塩水中に入れられた100ul)は、Coulter N4(Beckman Coulter, Miami, FL)を用いてサイズを計測した。磁場への暴露(点源または四極子)に引き続いて、第3の試料を渦処理によって再懸濁している間、第2の試料を単に反転させることによって再懸濁した。表4の結果は、単に反転させることは粒子を脱凝集するのに十分ではないが、渦処理すると粒子がそれらの元の非凝集した状態に戻ることを示す。従って、磁場は、超常磁性粒子に似た様式で、強磁性高密度粒子をもって、作業可能に克服され得る。
白血球選択は、強磁性高密度粒子の直径が減少するにつれて、抗原に富んだサブ集団に対して、より効率的になり、より選択的でなくなる。
3つの異なる粒子(直径、>3.5ミクロン;2.4ミクロンおよび1.45ミクロン)を抗−CD45、パン白血球マーカーで標識した。白血球選択を、次の様式で、全血の1ml試料で実施した:100ulの各粒子溶液を3つの異なるガラス試験管(容量5ml)に添加した。管をペレットに分離し、粒子および上澄みを除去した。1mlの全血を各管に添加した。管に蓋をし、5分間、30rpmにて回転しながら混合した。管をロッカーから除去し、すぐに5分間、四極子磁石(Immunicon Corp. Huntingdon Valley, PA)に置いた。磁気分離の終わりにて、試料を除去し、血液学分析器(Sysmex KX-21, Roche Diagnostic Corp.)を用いて、白血球の存在につき分析した。結果(表6)は、白血球のCD45-粒子との選択は粒子サイズによって決まることを示す。全血中の白血球集団は、3つの主な集団よりなる:リンパ球、単球および顆粒球。3つの白血球集団上のCD45抗原密度は、規模の約1桁にわたり変動する。さらなる分析は(図6)、異なる直径の粒子と見受けられた選択における差は、抗原密度と相関していることを示した。
大きい強磁性高密度粒子は、好ましくは、同一の抗体に対して、高および低抗原密度の混合物を有する集団から、高抗原高密度細胞を除去する。
細胞を除去する能力は、抗原密度および粒子直径によって決まるため(実施例6参照)、より大きい粒子を使用して、より抗原高密度標的を選択することができる。特定の抗原に対する密度の範囲を有する細胞の集団内において、高抗原密度細胞の相対的な除去を可能にする直径を持つ粒子を選ぶことが可能である。例えば、PC3細胞、ATCCから入手可能な前立腺癌細胞線は、上皮細胞接着分子(EpCAM)を発現する。2つのサブ集団は、EpCAM抗原密度に基づき識別可能である。比較的低いEpCAM抗原密度にて、EpCAMを発現するPC3細胞を入手することが望ましかった。出発PC3集団は、それぞれ高抗原密度につき70,000−80,000分子/細胞および低抗原密度につき15,000−20,000分子/細胞を有する25%高EpCAM密度細胞および75%低EpCAM密度細胞で構成された。これらの細胞を約2.5ミクロン以上の直径を有する粒子で処理し、それに結合した抗−EpCAMモノクローナル抗体に連結させた。混合および磁気分離に引き続いて、液体試料に残っている得られた細胞サブ集団は、98.5%低EpCAM抗原密度細胞で構成された(図示せず)。
本発明の強磁性高密度粒子を使用して、遺伝子発見研究で使用される細胞の集団を選択的に豊富化することができる。
癌の初期検知用のより良い診断ツールを得るために、癌細胞の遺伝子プロファイル(つまり循環中の上皮癌細胞)を決定し、正常な/良性の細胞遺伝子プロファイルから癌細胞遺伝子プロファイルを識別できることが重要である。しばしば、液体試料(つまり、正常な/癌細胞の遺伝子プロファイルを決定するのに使用される全血)は、白血球でひどく汚染されている。従って、しばしば白血球より100万倍低いレベルで存在する癌細胞を欠乏せずに、汚染する白血球を効果的に選択する必要性が当該分野に存在する。超常磁性粒子を超える強磁性高密度粒子のより大きい磁気誘引特質、および標的細胞の最小のキャリオーバのため、強磁性高密度粒子技術はこの適用に特に適している。CD45−強磁性高密度粒子を使用して、820白血球/mlないし44白血球/mlの特定の試料の白血球汚染を効果的に選択した。別個の実験において、上皮癌細胞を、CellPrep/Cell Spotter System(Kagan,ら, J. Clinical Ligand Assay, 2002, 25:105-110)によって検出されるように、前立腺癌患者からの7.5ml全血試料から豊富化した。試料は、血液の40前立腺癌細胞/7.5mlを有した。CD45−強磁性高密度粒子による80%白血球選択に引き続き、試料は血液の35前立腺癌細胞/7.5mlを有し、白血球減少は癌細胞の数を有意に改変しなかったことを示す(図示されず)。
CD15と複合化された高密度粒子は、細胞を含有するCD15抗原の非常に迅速な選択を提供する。
CD15に対して抗原を含有する細胞の選択に、全血を使用した。様々な時間、150ulの全血を50ulのCD15−FDPで混合した。高速渦処理または上下にピペッティングすることによって混合した後、試料を約1分間、磁場に置いた。血液学分析器(Sysnex KX-21, Roche Diagnostic Corp.)での分析は、約2秒ないし約2分の混合時間に対して、CD15抗原を含有する顆粒球につき、>99%選択であった。特異的な細胞集団のそのような高速選択は、当該分野において示されていない(図7)。
本発明の高密度粒子は、重力によって分離するだろう。
重力、粒子分離用の2つの原理具体例のうちの1つは、白血球に対して効率的な選択を示した(表7)。十分な混合に引き続いて、高密度粒子、直径約1ミクロンを、(4ないし5分)間、重力によって沈降させた。表7はこの分離の結果を示す。一般に、重力分離は磁気分離より長い時間を要するが、両方の分離手順は、赤い細胞数に対する無いに等しい影響での選択後、同等量の白血球を得る(データ示さず)。
Claims (134)
- 液体試料から、細胞または細胞様物質の所定の標的集団またはサブ集団を選択する方法であって:
a.該標的集団またはサブ集団に特異的に結合する結合剤がそこに結合した複数の強磁性粒子を供し、該粒子は該粒子による選択を可能にするのに十分に該標的集団とは異なる密度を有し;
b.該粒子が該試料の実質的部分を通過するように、該試料と該粒子を混合して、粒子−標的集団複合体の形成に十分な時間を可能にし;次いで
c.磁場中に該試料を置くことによって、該粒子−標的複合体から、非標的集団またはサブ集団を含む該試料の少なくとも一部を分離することを特徴とする該方法。 - 該分離工程が、該粒子を動かせる磁気配置にて、該試料を磁場中に置くことによって達成される請求項1記載の方法。
- 封じ込め容器が該試料用に供され、該磁場が、該粒子−標的複合体が該封じ込め容器の壁に沿って、実質的に単一の層として形成することを可能にする該磁気配置にて作り出される請求項2記載の方法。
- 消磁することによって、該磁場を除去するさらなる工程を含む請求項2記載の方法。
- 該粒子−標的複合体の凝集が緩やかな渦形成を介して克服される請求項2記載の方法。
- 該標的集団またはサブ集団が、該緩やかな渦形成を介して、該粒子−標的複合体から放出される請求項2記載の方法。
- 該標的集団またはサブ集団の該放出が、マウスIgGとのインキュベーションによって達成される請求項2記載の方法。
- 該標的集団またはサブ集団が、該粒子−標的複合体から、当該分野で知られるいずれかの方法によって放出される請求項2記載の方法。
- 該標的集団またはサブ集団が、細胞夾雑物または細胞成分を含む細胞様物質である請求項2記載の方法。
- 該標的集団またはサブ集団が、生物学的細胞である請求項2記載の方法。
- 該標的集団またはサブ集団が、ヒト癌細胞、ヒト白血球、ヒト血小板、およびヒト免疫細胞よりなる群のうちの少なくとも1つから選択される請求項2記載の方法。
- 該強磁性金属が、鉄、コバルト、ニッケルおよびその合金よりなる群から選択される請求項2記載の方法。
- 該強磁性金属がニッケルである請求項2記載の方法。
- 該粒子が、約50ナノメートルから該粒子−標的複合体を脱凝集させることができない直径までの直径範囲を有する請求項2記載の方法。
- 該直径が約500ナノメートルないし約1500ナノメートルである請求項14記載の方法。
- 該直径が約800ナノメートルないし約1200ナノメートルである請求項14記載の方法。
- 該粒子が、該標的生体材料より少なくとも2倍の該密度差を有する請求項2記載の方法。
- 該密度が、約7g/ccないし約9g/ccの間である請求項17記載の方法。
- 該密度が約9g/ccである請求項17記載の方法。
- 該混合が、該容量が少なくとも0.01mlである時に、該試料を該粒子と渦処理することによって達成される請求項2記載の方法。
- 該渦処理が、約2秒ないし約4分間である請求項20記載の方法。
- 該混合が、該試料容量が少なくとも0.5mlである時に、該試料を該粒子と回転しながら混転することによって達成される請求項2記載の方法。
- 該混転が、約5回転/分ないし30回転/分ほどである請求項22記載の方法。
- 該混合時間が約30秒ないし約20分の範囲内である請求項22記載の方法。
- 該混合時間が約1分ないし約5分である請求項22記載の方法。
- 該混合時間が約4分ないし約5分である請求項22記載の方法。
- 該磁気配置が、キャビティーを規定して該容器を収容するように配された2ないし6つの永久磁石または電磁石で形成される請求項2記載の方法。
- 該磁気配置が、該キャビティーを規定して該容器を収容するように配された3つの永久磁石で形成された請求項2記載の方法。
- 該磁気配置が、円柱状強磁性ヨーク内に収容される請求項2記載の方法。
- 該試料が、少なくとも約3秒間、該磁場に暴露される請求項2記載の方法。
- 該試料が、約1分ないし約5分間、該磁場に暴露される請求項2記載の方法。
- 該結合剤が、抗体、薬物、ホルモン、成長因子、レクチン、酵素および核酸配列のうちの少なくとも1つである請求項2記載の方法。
- 該結合剤が、細胞表面抗原に特異的に結合する抗体である請求項2記載の方法。
- 該抗体が、該粒子に連結したモノクローナル抗体である請求項2記載の方法。
- 該結合剤が、ビオチン標識され、ストレプトアビジンを介して該粒子に連結される請求項2記載の方法。
- 液体試料からの細胞または細胞様物質の所定の標的集団またはそのサブ集団を選択する方法であって:
a.標的集団またはサブ集団に特異的に結合する結合剤がそこに結合された複数の高密度粒子を供し、該粒子は、該粒子による選択を可能にするのに十分に該標的集団とは異なる密度を有し;
d.該粒子が該試料の実質的部分を通過し、粒子−標的複合体の形成に十分な時間を可能にするように、該試料を該粒子と混合し;次いで
c.該試料を沈降させることによって、該粒子−標的複合体から、非標的集団またはサブ集団を含む該試料の少なくとも一部を分離することを特徴とする該方法。 - 該粒子−標的複合体が該非標的集団を含有する該試料から分離される時に、該沈降が完了する請求項36記載の方法。
- 該粒子−標的複合体に対する重力の効果によって、該沈降が決定される請求項37記載の方法。
- 該粒子−標的複合体の浮力の効果によって、該沈降が決定される請求項37記載の方法。
- 該粒子−標的複合体の遠心の効果によって、該沈降が決定される請求項37記載の方法。
- 該標的集団またはサブ集団が、該緩やかな渦形成を介して、該粒子−標的複合体から放出される請求項37記載の方法。
- 該標的集団またはサブ集団の該放出が、マウスIgGとのインキュベーションによって達成される請求項37記載の方法。
- 該標的集団またはサブ集団が、当該分野で知られるいずれかの方法を介して、該粒子−標的複合体から放出される請求項37記載の方法。
- 該標的集団またはサブ集団が、細胞夾雑物または細胞成分を含む細胞様物質である請求項37記載の方法。
- 該標的集団またはサブ集団が生物学的細胞である請求項37記載の方法。
- 該標的集団またはサブ集団が、ヒト癌細胞、ヒト白血球、ヒト血小板、およびヒト免疫細胞よりなる群のうちの少なくとも1つから選択される請求項37記載の方法。
- 該直径が、約100ナノメートルないし約1500ナノメートルである請求項37記載の方法。
- 該粒子が、該標的生体材料より少なくとも2倍以上の該密度差を有する請求項37記載の方法。
- 該密度が、約7g/ccおよび約9g/ccの間である請求項37記載の方法。
- 該密度が約9g/ccである請求項37記載の方法。
- 該容量が少なくとも0.01mlである時に、該試料を該粒子と渦処理することによって、該混合が達成される請求項37記載の方法。
- 該渦処理が約2秒ないし約4分である請求項51記載の方法。
- 該試料容量が少なくとも0.5mlである時、該試料を該粒子と回転しながら混転させることによって、該混合が達成される請求項37記載の方法。
- 該混転が約5回転/分ないし30回転/分ほどである請求項53記載の方法。
- 該混合時間が約30秒ないし約20分の範囲内である請求項37記載の方法。
- 該混合時間が約1分ないし約5分である請求項37記載の方法。
- 該混合時間が約4分ないし約5分である請求項37記載の方法。
- 該結合剤が、該抗体、薬物、ホルモン、成長因子、レクチン、酵素および核酸配列のうちの少なくとも1つである請求項37記載の方法。
- 該結合剤が、該細胞表面抗原に特異的に結合する該抗体である請求項37記載の方法。
- 該抗体が、該粒子に連結した該モノクローナル抗体である請求項37記載の方法。
- 該結合剤が、ビオチン標識され、該ストレプトアビジンを介して、該粒子に連結される請求項37記載の方法。
- 液体試料から、細胞または細胞様物質の所定の標的集団またはそのサブ集団を選択するための粒子の懸濁液であって、
a.約50ナノメートルないし直径約2.5ミクロンのサイズ範囲を有する複数の粒子、ここに該粒子は該粒子による選択を可能にするのに十分に標的集団とは異なる密度差を有し;および
b.該結合剤が該標的集団に特異的に結合するように該粒子に結合した結合剤を含む該懸濁液。 - 該粒子が強磁性物質から形成される請求項62記載の粒子の懸濁液。
- 該強磁性金属が、鉄、コバルト、ニッケル、およびその合金よりなる群から選択される請求項63記載の粒子の懸濁液。
- 該強磁性金属がニッケルである請求項63記載の粒子の懸濁液。
- 該直径が約500ナノメートルないし約1500ナノメートルである請求項62記載の粒子の懸濁液。
- 該直径が約800ナノメートルないし約1200ナノメートルである請求項62記載の粒子の懸濁液。
- 該密度が約7g/ccおよび約9g/ccの間である請求項62記載の粒子の懸濁液。
- 該密度が約9g/ccである請求項62記載の粒子の懸濁液。
- 該結合剤が、抗体、薬物、ホルモン、成長因子、レクチン、酵素および核酸配列のうちの少なくとも1つである請求項62記載の粒子の懸濁液。
- 該結合剤が細胞表面抗原に特異的に結合する抗体である請求項62記載の粒子の懸濁液。
- 該結合剤がモノクローナル抗体である請求項62記載の粒子の懸濁液。
- 該結合剤が、ビオチン標識され、ストレプトアビジンを介して、該粒子に連結される請求項62記載の粒子の懸濁液。
- 液体試料から、細胞または細胞様物質の所定の標的集団またはそのサブ集団を選択するための装置であって:
a.標的集団またはサブ集団に特異的に結合する結合剤に結合した複数の強磁性粒子、ここに該粒子は、該粒子の選択を可能にするのに該標的集団とは十分に異なる密度を有し;
b.該粒子が該試料の実質的部分を通過し、粒子−標的集団複合体の形成に十分な時間を可能にするように、該粒子と該試料を混合するための手段;および
c.該試料を磁場中に置くことによって、該粒子−標的複合体から、非標的集団またはサブ集団を含む該試料の少なくとも一部を分離するための手段を含む該装置。 - 該分離工程用の手段が、該試料を該磁場中に該磁気配置にて置いて該粒子を動かすための手段によって達成される請求項74記載の装置。
- 封じ込め容器用の手段が該試料に供され、該磁場が、該粒子−標的複合体が該封じ込め容器の該壁に沿って実質的に単一層として形成することができる磁気配置にて作られる請求項75記載の装置。
- 消磁によって、該磁場を除去するさらなる工程を含む請求項75記載の装置。
- 該粒子−標的複合体の該凝集を克服する手段が、該緩やかな渦形成手段を介する請求項75記載の装置。
- 該粒子−標的複合体から該標的集団またはサブ集団を放出するための手段が、該緩やかな渦形成用の手段を介する請求項75記載の装置。
- 該粒子−標的複合体から該標的集団またはサブ集団を放出するための手段が、該マウスIgGとのインキュベーション用の手段を介する請求項75記載の装置。
- 該粒子−標的複合体から該標的集団またはサブ集団を放出するための手段が、当該分野で知られるいずれかの手段を介する請求項75記載の装置。
- 該標的集団またはサブ集団のための手段が、細胞夾雑物を含む細胞様物質または該細胞成分の手段である請求項75記載の装置。
- 該標的集団またはサブ集団のための手段が、生物学的細胞である請求項75記載の装置。
- 該標的集団またはサブ集団のための手段が、該ヒト癌細胞、該ヒト白血球、該ヒト血小板、および該ヒト免疫細胞よりなる該群のうちの少なくとも1つから選択される請求項75記載の装置。
- 該強磁性金属のための手段が、該鉄用の手段、該コバルト用の手段、該ニッケル用の手段、およびその該合金用の手段よりなる群から選択される請求項75記載の装置。
- 該強磁性金属用の手段が、該ニッケル用の手段である請求項75記載の装置。
- 該粒子用の手段が、約50ナノメートルないし該粒子−標的を脱凝集できない直径までの直径範囲を有する請求項75記載の装置。
- 該直径用の手段が、約500ナノメートルないし約1500ナノメートルである請求項87記載の装置。
- 該直径用の手段が、約800ナノメートルないし約1200ナノメートルである請求項87記載の装置。
- 該粒子用の手段が、該標的生体材料の少なくとも2倍以上の密度差を有する請求項87記載の装置。
- 該密度用の手段が、約7g/ccおよび約9g/ccの間である請求項90記載の装置。
- 該密度用の手段が、約9g/ccである請求項90記載の装置。
- 該混合手段が、該試料が0.5ml未満である時に、該試料を該粒子と共に渦処理する手段によって達成される請求項75記載の装置。
- 該渦処理手段が、約2秒ないし約4分である請求項93記載の装置。
- 該混合手段が、該試料容量が少なくとも0.5mlである時に、該試料を該粒子と回転しながら混転する手段によって達成される請求項75記載の装置。
- 該混転手段が、約5回転/分ないし30回転/分ほどである請求項95記載の装置。
- 該混合時間手段が、約30秒ないし約20分の範囲内である請求項75記載の装置。
- 該混合時間手段が、約1分ないし約5分である請求項75記載の装置。
- 該混合時間手段が、約4分ないし約5分である請求項75記載の装置。
- 該磁気配置用の手段が、該キャビティーを規定して該容器を収容するように配された該2ないし6つの永久磁石または該電磁石による請求項75記載の装置。
- 該磁気配置用の手段が、該キャビティーを規定して該容器を収容するように配された該3つの永久磁石による請求項75記載の装置。
- 該磁気配置を収容する手段が、該円柱状強磁性ヨーク内である請求項75記載の装置。
- 該試料を該磁場に暴露する手段が、少なくとも約3秒間である請求項75記載の装置。
- 該液体試料を該磁場に暴露する手段が、約1分ないし約5分である請求項75記載の装置。
- 該結合剤用の手段が、該抗体、該薬物、該ホルモン、該成長因子、該レクチン、該酵素および該核酸配列用の手段のうち少なくとも1つである請求項75記載の装置。
- 該結合剤用の手段が、該細胞表面抗原に特異的に結合する該抗体用の手段である請求項105記載の装置。
- 該抗体用の手段が、該粒子に連結された該モノクローナル抗体用の手段である請求項75記載の装置。
- 該結合剤用の手段が、該ストレプトアビジンを介して、該粒子の連結手段を有する該ビオチン標識された手段である請求項75記載の装置。
- 液体試料から、細胞または細胞様物質の所定の標的集団あるいはそのサブ集団を選択するための装置であって:
a.該標的集団とは十分に異なる密度を有して該粒子の選択を可能にする、該標的集団またはサブ集団に特異的に結合する結合剤に結合した複数の高密度粒子;
b.該粒子が該試料の実質的部分を通過して、粒子−標的複合体の形成のための十分な時間を可能にする該粒子と該試料を混合する手段;および
c.該試料を沈降させることによって、該粒子−標的複合体から、非標的集団またはサブ集団を含む該試料の少なくとも一部を分離する手段を含む該装置。 - 完了沈降が該粒子−標的複合体が該標的集団を含有する該試料から分離される時である該完了沈降用の手段である請求項109記載の装置。
- 該沈降が該粒子−標的複合体に対する重力の効果によって決定される該沈降用の手段である請求項110記載の装置。
- 該沈降が該粒子−標的複合体に対する浮力の効果によって決定される該沈降用の手段である請求項110記載の装置。
- 該沈降が該粒子−標的複合体に対する遠心の効果によって決定される該沈降用の手段である請求項110記載の装置。
- 該緩やかな渦処理用の手段を介して、該粒子−標的複合体から該標的集団またはサブ集団を放出するための手段である請求項110記載の装置。
- 該マウスIgGによるインキュベーション用の手段を介して、該粒子−標的複合体から該標的集団またはサブ集団を放出するための手段である請求項110記載の装置。
- 当該分野で知られるいずれかの方法を介する該粒子−標的複合体から該標的集団またはサブ集団を放出するための手段である請求項110記載の装置。
- 該標的集団またはサブ集団用の手段が、細胞夾雑物を含む細胞様物質または該細胞成分用の手段である請求項110記載の装置。
- 該標的集団またはサブ集団用の手段が生物学的細胞である請求項110記載の装置。
- 該標的集団またはサブ集団用の手段が、該ヒト癌細胞、該ヒト白血球、該ヒト血小板、および該ヒト免疫細胞よりなる該群のうち少なくとも1つから選択される請求項110記載の装置。
- 該直径用の手段が、約500ナノメートルないし約1500ナノメートルである請求項110記載の装置。
- 該粒子用の手段が、該標的生体材料より少なくとも2倍以上の密度差を有する請求項110記載の装置。
- 該密度用の手段が、約7g/ccおよび約9g/ccの間である請求項110記載の装置。
- 該密度用の手段が約9g/ccである請求項110記載の装置。
- 該混合手段が、該試料が0.5ml未満である時に、該試料を該粒子と共に渦処理するための手段によって達成される請求項110記載の装置。
- 該渦処理手段が、約2秒ないし約4分である請求項124記載の装置。
- 該混合手段が、該試料容量が少なくとも0.5mlである時に、該試料を該粒子と回転しながら該混転するための手段によって達成される請求項110記載の装置。
- 該混転手段が、約5回転/分ないし30回転/分である請求項126記載の装置。
- 該混合時間手段が、約30秒ないし約20分の範囲内である請求項110記載の装置。
- 該混合時間が約1分ないし約5分である請求項110記載の装置。
- 該混合時間手段が約4分ないし約5分である請求項110記載の装置。
- 該結合剤用の手段が、該抗体、該薬物、該ホルモン、該成長因子、該レクチン、該酵素および該核酸配列用の手段のうち少なくとも1つである請求項110記載の装置。
- 該結合剤用の手段が、該細胞表面抗原に特異的に結合する該抗体用の手段である請求項110記載の装置。
- 該抗体用の手段が、該粒子に連結された該モノクローナル抗体用の手段である請求項110記載の装置。
- 該結合剤用の手段が、該ストレプトアビジンを介して、該粒子の連結手段を有する該ビオチン標識された手段である請求項110記載の装置。
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