CN106190832B

CN106190832B - 具有高纯度细胞回收的多重磁激活分选结构微流控芯片

Info

Publication number: CN106190832B
Application number: CN201610695560.2A
Authority: CN
Inventors: 陈迪; 林树靖; 郅晓; 仇三铭; 韦黔; 崔大祥
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2016-08-19
Filing date: 2016-08-19
Publication date: 2021-04-02
Anticipated expiration: 2036-08-19
Also published as: CN106190832A

Abstract

本发明提供了一种具有高纯度细胞回收的多重磁激活分选结构微流控芯片，包括依次连接的进口单元、第一级磁激活分选单元、第二级磁激活分选单元和出口单元；所述第一级磁激活分选单元包括第一微流道、第二微流道和第一级磁体，所述第一微流道设置在第二微流道与第一级磁体之间；所述第二级磁激活分选单元包括第三微流道、第四微流道和第二级磁体，所述第三微流道设置在第四微流道与第二级磁体之间。与现有技术相比，本发明具有集成化高、操作简单、细胞回收率高、细胞分选纯度高和制作工艺简单的优点。

Description

具有高纯度细胞回收的多重磁激活分选结构微流控芯片

技术领域

本发明涉及一种具有高纯度细胞回收的多重磁激活分选结构微流控芯片，适用于细胞分离捕获和培养分析、临床试验、医疗诊断等领域，尤其是在从细胞混合液中分离出特定细胞的细胞分离、分选和操控领域。

背景技术

从古至今，人类经受各种疾病的威胁。现今，艾滋病、癌症和糖尿病等严重威胁着人类的健康。据研究表明，对高纯度的细胞群或特定细胞进行单细胞分析研究对研究和攻克艾滋病、癌症和糖尿病等重大疾病具有非常重要的贡献。为此，提供一种具有高纯度细胞回收且方便快捷的细胞分选方法和芯片将在很大程度上可促进细胞生物学的发展。因此，从多种细胞悬浮液中分离一种或多种细胞的技术，对药物效果评估、癌细胞转移、术后判断和细胞刺激反应研究都具有重要意义。

自从微流控芯片出现以来，基于其微结构在细胞分选领域有着特有的优势，通过融合微流控技术，细胞分离技术有了长足的发展。据检索现有文献可知，依照细胞分离作用力产生原理不同，可将细胞分选技术分为光学力分选技术、电学力分选技术、磁学力分选技术、声波学力分选技术和机械力分选技术。自A.Ashkin等在Science,1987,235(4795):1517-1520中利用光镊技术用于操控病毒、细菌以来，K.C.Kim等在Analytical Chemistry,2008,80(7):2628-2630中利用光镊完成了细胞分选。现今，也有大量产品化的光镊系统如ElliotE3500和Tweez200si等，可以实现细胞分离和多点捕获等操作。但是光镊系统也存在着细胞损伤、设备复杂、安装精度要求高、价格昂贵、需要专业人员操作等缺点。

在实验室环境下，电学力细胞分选技术已经能够实现小规模的单个目标细胞的分离和捕获功能。M.Bocchi等利用电学力分选技术在Biosensors&Bioelectronics,2009,24(5):1177-1183中完成了单细胞和微颗粒聚集体的分离工作，但是其分选纯度和细胞回收率都有待提高。意大利的Silicon Biosystems公司基于此原理研发的DEPArray^TM系统可获得100％纯度的单个或单一种类的细胞。但由于该设备价格昂贵且用于细胞纯化提取的微流控芯片为一次性耗材，导致每次细胞提取回收的成本极高，现阶段全球仅有几所大学和研究机构能够支付如此昂贵的费用(国内还未见报道)。而且，现阶段的电学力分选技术存在着设备复杂、昂贵和细胞潜在的损伤可能性。

尽管磁学力细胞分选技术较光学力细胞分选技术和电学力细胞分选技术起步晚，但由于其特有的优势，近年来发展迅速，在单细胞操控技术上已成为了研究的热点之一。K.Hyun等Biosensors&Bioelectronics,2015,67:86-92在设计了一种用于循环肿瘤细胞选择性分离的两级微流控芯片。第一级利用磁铁阵列产生磁场梯度将经过磁标记的白细胞吸附于微流道壁上，但是这种吸附方式吸附的白细胞存在吸附不稳定和吸附面积有限的问题，无法保证细胞捕获稳定性和无法用于大量细胞分离的情况；第二级将特定抗体修饰与微流道壁上，利用抗原抗体反应的方式将细胞吸附在微流道中，这也存在吸附面积有限的问题，无法用于大量细胞分离，而且抗原抗体结合需要一定的时间，这也无法确保此类细胞被完全捕获；最终，未被捕获与微流控芯片的细胞从细胞回收出口回收。因此，此细胞分离芯片对循环肿瘤细胞分离率仅为10.19％-22.91％，且存在纯度不高的问题。

另外，J.Shi等在Lab Chip,2009，9(23):3354-3359中利用声波学力分选技术实现了微粒在微流道中连续分选的工作，但分选效率大约为80％，依旧存在分选效率低的问题，同时声波具有潜在细胞损伤的可能性。Y.Anis等在Biomedical microdevice,2011,13(4):651-659中提出了一种利用机械吸力原理分离细胞的单细胞分离仪，该系统利用六轴机械对准系统将毛细管对准目标细胞，然后启动皮升泵将目标细胞吸入细胞回收腔，实现单个细胞分离。系统存在对准系统复杂、难于对准和通量低的缺点。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提供了一种具有高纯度细胞回收的多重磁激活分选结构微流控芯片，为一种集成化高、制造工艺简单、细胞回收率高、细胞回收纯度高和通量大的多重磁激活分选结构微流控芯片。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种具有高纯度细胞回收的多重磁激活分选结构微流控芯片，包括依次连接的进口单元、第一级磁激活分选单元、第二级磁激活分选单元和出口单元；所述第一级磁激活分选单元包括第一微流道、第二微流道和第一级磁体，所述第一微流道设置在第二微流道与第一级磁体之间；所述第二级磁激活分选单元包括第三微流道、第四微流道和第二级磁体，所述第三微流道设置在第四微流道与第二级磁体之间。

优选地，所述第一微流道和第二微流道均与进口单元连通；所述第三微流道和第四微流道的一端均分别与第一微流道和第二微流道连通，另一端均与出口单元连通。

优选地，所述进口单元包括细胞悬浮液进口和缓冲液进口，所述出口单元包括细胞回收出口和废液出口。

优选地，所述括细胞悬浮液进口、缓冲液进口、细胞回收出口和废液出口均各自为圆形、方形或六边形。

优选地，所述第一级磁体下方设置有软磁性局部磁场增强结构。

优选地，所述软磁性局部磁场增强结构靠近第一微流道的一侧设置有齿状结构。

更优选地，所述齿状结构包括锯齿状结构或梳状结构。

优选地，所述软磁性局部磁场增强结构由镍或镍合金制备。

更优选地，所述镍合金为铁镍合金。

优选地，所述软磁性局部磁场增强结构在局部的磁感应强度增强倍数为10～100倍。

本发明在第一级磁体下方增加了一软磁性局部磁场增强结构，该结构的作用是利用软磁性材料的高磁导率的特性，使得大部分磁力线从软磁性局部磁增强结构中通过，达到局部磁场增强的作用；且该结构的一端设置齿状或梳齿结构，将磁场线进一步的聚集，从而形成很高的磁场梯度。

优选地，所述第一级磁体与第二级磁体并排设置，间距大于10mm。避免两磁体的磁场相互影响改变分离区域的磁场梯度分布。

优选地，所述第一级磁体与第一微流道、第二级磁体与第三微流道的间距均为3-5mm，确保磁场强度达到要求。

优选地，所述第一微流道与第二微流道的宽度比为11:25，第三微流道与第四微流道的宽度比为1:1。确保液体在微流道中压力平衡。如果微流道过宽或窄会导致压力不均衡，液体在分流时，无法达到预期的分流比，甚至影响细胞分选的效果。例如第一微流道过宽，会导致绝大部分的缓冲液分流到第一微流道，而第二微流道由于尺寸小流阻大，只有很少的一部分缓冲液流过，这将导致第二级磁激活流入的缓冲液过少，无法保证细胞分选纯度；若第一微流道过窄，会导致只有少部分或者没有缓冲液流入第一微流道，甚至有可能会有一部分细胞悬浮液流入第二微流道，直接影响细胞分选纯度。

优选地，所述第一级磁体与第二级磁体各自为永磁体或电磁体。

优选地，第一级磁体与第二级磁体各自为长方体或正方体。

优选地，所述第一级磁体表面的磁感应强度为0.5～1特斯拉、第二级磁体表面的磁感应强度为0.3～0.8特斯拉；所述第一级体表面的磁感应强度大于第二级磁体表面的磁感应强度。

采用本发明的微流控芯片分离细胞，经免疫磁标记的混合细胞悬浮液和缓冲液分别从不同进口注入；在混合细胞悬浮液流经第一级磁激活分选单元时，绝大部分的经免疫磁标记细胞和很小一部分未经免疫磁标记细胞在局部增强的磁场的作用下从混合细胞悬浮液中被移动至缓冲液中，保证了较高的细胞回收率；经第一级磁激活分选单元分离的细胞在流经第二级磁激活分选单元时，在磁场的作用下，经免疫磁标记的细胞被移动至磁场梯度大的缓冲液流层，这保证了高纯度的细胞回收；最终，废液和高纯度的经免疫磁标记的细胞分别从废液出口和细胞回收出口流出，达到高纯度细胞分离的目的。所述经免疫磁标记细胞从细胞悬浮液进口进入，在磁场作用下，先进入第二微流道，然后进入第三微流道，最后从细胞回收出口流出。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1.高度集成的多重磁激活分选结构微流控芯片，通过多次分选的方式现实细胞高回收率和高纯度回收。

2.使用磁学力分选技术，最大程度降低了细胞在分选时受到的损伤。

3.在设计上综合考虑MEMS制备工艺，做到了芯片制备工艺兼容，制造工艺简单，易于批量化生成，且价格低廉。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明的俯视图；

图2为本发明的三维结构示意图；

图3为本发明第一级磁激活分选单元的横截面示意图；

图4为本发明微流道结构示意图；

图5为本发明的软磁性局部磁场增强结构示意图；

其中，1为进口单元，2为第一级磁激活分选单元，3为第二级磁激活分选单元，4为出口单元，5为细胞悬浮液进口，6为缓冲液进口，7为第二微流道，8为第一微流道，9为软磁性局部磁场增强结构，10为第一磁体，11为第四流道，12为第三微流道，13为第二磁体，14为废液出口，15为细胞回收出口。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

以下实施例提供了一种具有高纯度细胞回收的多重磁激活分选结构微流控芯片，包括依次连接的进口单元、第一级磁激活分选单元、第二级磁激活分选单元和出口单元；所述第一级磁激活分选单元包括第一微流道、第二微流道和第一级磁体，所述第一微流道设置在第二微流道与第一级磁体之间；所述第二级磁激活分选单元包括第三微流道、第四微流道和第二级磁体，所述第三微流道设置在第四微流道与第二级磁体之间。

所述第一微流道和第二微流道均与进口单元连通；所述第三微流道和第四微流道的一端均分别与第一微流道和第二微流道连通，另一端均与出口单元连通。

所述进口单元包括细胞悬浮液进口和缓冲液进口，所述出口单元包括细胞回收出口和废液出口。

所述括细胞悬浮液进口、缓冲液进口、细胞回收出口和废液出口均各自为圆形、方形或六边形。

所述第一级磁体下方设置有软磁性局部磁场增强结构。

所述软磁性局部磁场增强结构靠近第一微流道的一侧设置有齿状结构。

所述齿状结构包括锯齿状结构或梳状结构。

所述软磁性局部磁场增强结构由镍或镍合金制备。

所述镍合金为铁镍合金。

所述软磁性局部磁场增强结构在局部的磁感应强度增强倍数为10～100倍。

所述第一级磁体与第二级磁体并排设置，间距大于10mm。

所述第一级磁体与第一微流道、第二级磁体与第三微流道的间距均为3-5mm，确保磁场强度达到要求。

所述第一微流道与第二微流道的宽度比为11:25，第三微流道与第四微流道的宽度比为1:1。

所述第一级磁体与第二级磁体各自为永磁体或电磁体。

第一级磁体与第二级磁体各自为长方体或正方体。

所述第一级磁体表面的磁感应强度为0.5～1特斯拉、第二级磁体表面的磁感应强度为0.3～0.8特斯拉；所述第一级体表面的磁感应强度大于第二级磁体表面的磁感应强度。

实施例1

本实施例涉及一种具有高纯度细胞回收的多重磁激活分选结构微流控芯片，如图1所示，由依次连接的进口单元1、第一级磁激活分选单元2、第二级磁激活分选单元3和出口单元4构成。

所述的进口单元1包含两个进口，分别为细胞悬浮液进口5和缓冲液进口6。

所述的第一级磁激活分选单元2(如图3所示)，由第一微流道8、第二微流道7、软磁性局部磁场增强结构9和第一磁体10组成。缓冲液由缓冲液进口6注入后，一部分缓冲液流入第二微流道7中，另一部分缓冲液分流至第一液微流道8中。在软磁性局部磁场增强结构9和磁体10的作用下，绝大部分经免疫磁珠标记细胞和很小一部分未经标记的细胞被移动到第二微流道7的缓冲液层，确保了较高的细胞回收率。

所述的第一磁体10为正方体结构的永磁体，边长为10mm。

所述的第二级磁激活分选单元3，由第四微流道11、第三微流道12和第二磁体13经第一级磁激活分选单元2分选出来的细胞从第二微流道7流至第三微流道12，再次进行磁激活分选确保了细胞分选的高纯度。

所述的第二磁体13为正方体结构的永磁体，边长为10mm。

所述的出口单元4包含两个出口，分别为废液出口14和细胞回收出口15。

所述的用于制备微流道的聚合物材料为聚二甲基硅氧烷。

如图2所示，该装置中所有管道均为长方形管。所述的细胞悬浮液进口5和缓冲液进口6为聚二甲基硅氧烷的圆柱形口腔结构，直径为1mm，高为3mm。

所述的废液出口14和胞回收出口15为聚二甲基硅氧烷的圆柱形口腔结构，直径为1mm，高为3mm。

如图4所示，所述的细胞悬浮液进口5与缓冲液进口6间距W₃为8mm；所述进口5与第一级磁激活单元连接的管道的宽为200μm，高为100μm；所述进口6与第一级磁激活单元连接的管道的宽为400μm，高为100μm。

所述的缓冲液进口6与细胞回收出口15的间距W₄为38mm。

所述第一微流道、第二微流道、第三微流道、第四微流道均为长方形管道。

所述的第一级磁激活分选单元2中第二微流道7长度为15mm。

所述的第二微流道7宽500μm，高度为100μm。

所述的第一微流道8宽220μm，高度为100μm。

所述的第二级磁激活分选单元3中第三微流道12长度为15mm。

所述的第四微流道11宽500μm，高度为100μm。

所述的第三微流道12宽500μm，高度为100μm。

所述的废液出口14管道宽400μm，高度为100μm。

所述的细胞回收出口15宽200μm，高度为100μm。

如图5所示，所述的软磁性局部磁场增强结构9的材料为金属镍，形状为长方体单边锯齿状结构。

所述的软磁性局部磁场增强结构9长Y为12mm，宽X为10mm，厚T为100μm。

所述的软磁性局部磁场增强结构9锯齿宽W₁为500μm，高W₂为500μm。

采用本实施例的芯片分离细胞，细胞回收率为90.7％，纯度为93.9％。

实施例2

本实施例涉及一种具有高纯度细胞回收的多重磁激活分选结构微流控芯片，同实施例1，所不同之处在于：进口单元1的进口形状为方形，边长为1mm；出口单元4的进口形状为方形，边长为1mm；软磁性局部磁场增强结构9的材料为铁镍合金，形状为长方体单边锯齿状结构。软磁性局部磁场增强结构9锯齿宽W₁为100μm，高W₂为500μm；第一磁体10和第二磁体13为正方体电磁铁，边长为10mm。

采用本实施例的芯片分离细胞，细胞回收率为85.3％，纯度为86.2％。

实施例3

本实施例涉及一种具有高纯度细胞回收的多重磁激活分选结构微流控芯片，同实施例1，所不同之处在于：用于制备微流道的材料16为聚甲基丙烯酸甲酯；进口单元1的进口形状为等边六边形，边长为0.8mm；出口单元4的进口形状为等边六边形，边长为0.8mm；软磁性局部磁场增强结构9形状为梳状结构。软磁性局部磁场增强结构9梳齿W₁为100μm，高W₂为500μm；第一磁体10为正方体永磁体，边长为10mm；第二磁体13为正方体电磁铁，边长为10mm。

采用本实施例的芯片分离细胞，细胞回收率为84.8％，纯度为85.6％。

对比例1

本对比例涉及一种具有高纯度细胞回收的多重磁激活分选结构微流控芯片，同实施例1，所不同之处在于：本对比例的第一磁体下方未设置软磁性局部磁场增强结构。采用本对比例的芯片分离细胞，细胞回收率为67.4％，纯度为73.6％。

本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种具有高纯度细胞回收的多重磁激活分选结构微流控芯片，其特征在于，包括依次连接的进口单元、第一级磁激活分选单元、第二级磁激活分选单元和出口单元；所述第一级磁激活分选单元包括第一微流道、第二微流道和第一级磁体，所述第一微流道设置在第二微流道与第一级磁体之间；所述第二级磁激活分选单元包括第三微流道、第四微流道和第二级磁体，所述第三微流道设置在第四微流道与第二级磁体之间；

所述第一级磁体下方设置有软磁性局部磁场增强结构；所述软磁性局部磁场增强结构靠近第一微流道的一侧设置有齿状结构；

所述第一微流道和第二微流道均与进口单元连通；所述第三微流道和第四微流道的一端均分别与第一微流道和第二微流道连通，另一端均与出口单元连通；

所述第一级磁体与第二级磁体并排设置，间距大于10mm以上；

所述第一级磁体与第一微流道、第二级磁体与第三微流道的间距均为3-5mm；

所述第一微流道与第二微流道的宽度比为11:25，第三微流道与第四微流道的宽度比为1:1；

2.如权利要求1所述的具有高纯度细胞回收的多重磁激活分选结构微流控芯片，其特征在于，所述进口单元包括细胞悬浮液进口和缓冲液进口，所述出口单元包括细胞回收出口和废液出口。

3.如权利要求1所述的具有高纯度细胞回收的多重磁激活分选结构微流控芯片，其特征在于，所述软磁性局部磁场增强结构由镍或镍合金制备。