CN102762712A - 稀有细胞的磁性分离 - Google Patents

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Abstract

一种配置为以定性定量的高产率使磁化细胞与细胞混合物分离的磁性分离系统，包括：至少一个电磁体，被构造成生成围绕多个分离区且足以吸引混合物中的大部分磁化细胞的磁场通量；和泵，用于以受控流速驱动细胞混合物通过设置在所述区域内的管道，从而使大部分磁化细胞与混合物分离。所述系统特别适用于如下情形；从稀有细胞的丰度相对于其余细胞较低的细胞流体混合物获得稀有细胞，且同时保持细胞活力。

Description

稀有细胞的磁性分离
技术领域
本发明涉及分离包括细胞的粒子。本发明的一些实施例涉及稀有细胞的磁性分离。
背景技术
在文献（例如美国专利4,710,472和其中引用的多个出版物）中描述了大量涉及生物细胞的磁性分离的申请。许多这样的申请不但需要分离一种或多种特殊类型的细胞（以下简称“靶细胞（target cell）”），还需要维护靶细胞和/或非靶细胞中细胞膜的品质。因此，在正向选择过程中，使靶细胞与用于检查或用于研究、诊断或临床目的的样品分离；而在去除过程中，该样品耗尽了用于检查的靶细胞或使用了非靶细胞。使靶细胞与非靶细胞分离，以及维护靶细胞和非靶细胞的薄膜，对目前正在利用淋巴细胞群处理的研究以及早期癌症检测是尤其重要的。
目前，用于分离生物细胞的一项技术使用MiniMACS分选柱（separation columns）（Miltenyi Biotec GmbH，德国美天旎生物技术有限公司）。该项技术使用极其小且直径大约为50nm（即与病毒尺寸相比体积比真核细胞小大约100万倍）的顺磁微珠。这样的磁微珠被制造具有某些细胞（即，靶细胞）的选择性亲和力，以便对靶细胞进行磁性标记或染色。将所述样品引入包括透水磁体的磁选柱中，例如，钢丝绵或钢丝网，并且向整个柱上施加磁场，使得将磁性染色细胞保持在柱的透水磁体中，同时未染色的细胞穿过该柱。然而在该已知过程中，发现细胞膜被透水磁体过度损坏，降低了研究或临床用技术的有效性。
在某些情况下，靶细胞在样品中很罕见，诸如，给分离过程带来挑战的癌细胞、干细胞或胎细胞。下面参照胎细胞，作为非限制实例。
人们对母体血液中存在胎细胞的了解已超过一个世纪，因为Schmorl（1）展示了在死于子痫的女性的肺循环中的滋养层细胞。从那以后，已经证明五种不同的胎细胞类型在母体血液中循环，包括滋养层细胞（1）、淋巴细胞（2）、有核红血球（NRBC）（3）、粒细胞（4）、干细胞（5）。胎细胞在母体循环中的频率很低，经定量PCR技术（6）检测，平均为每毫升母体血液具有1.2个细胞。在与母体血液隔离的所有胎细胞类型之中，NRBC作为用于无创性产前诊断（7）的最佳候选细胞。
研究人员一直试图利用荧光激活细胞分类术法（FACS）和磁珠细胞分选法（MACS）胎儿NRBC的分离和富集（enrichment），包括由NIH资助的大规模研究（NIFTY研究）。该项研究实现了低灵敏度的胎细胞检测，FACS的回收率为13%，MACS的回收率为44%（领先的磁选技术）（8），并得出这样的结论：当母体血液中胎儿NRBC的比例低，且现有分离技术的回收率低时，FNRBC并不适用于临床应用。由于分离这些细胞是极其困难的，所以采用基于不同遗传物质诸如DNA片段（9）的替代且不太有效的方法。这些物质必须利用PCR加倍，以对其进行有效分析，且不能提供与FNRBC可能具有的三体有关的决定性结果水平相同的水平。
对于本发明的某些发明人及其他人，美国专利6,482,328公开了一种使所选类型的靶粒子与样品磁性分离的方法和设备，以便浓缩样品中的靶粒子，或相对于靶粒子而耗尽样品，这是通过制造带有具有选择性亲和力的磁粒子的样品的样品混合物以对靶粒子进行磁性染色而实现的。
仍然迫切需要对高产率、高纯度的稀有活细胞进行快速、可靠的磁分离。
发明内容
本发明提供了一种快速、高效定性定量地使稀有细胞与流体样品磁性分离的系统，该流体样品具有相对于其余细胞的较低丰度的稀有细胞，同时，保持细胞活力。
例如，稀有细胞包括地中海贫血患者体内存在的有核红细胞（NRBC），或母体循环中存在的胎儿有核红细胞（FNRBC）、外周血中的癌细胞、胎儿或成体干细胞或在循环内由CD71，CD8，CD34或CD133表征的细胞。
在某些实施例中，该分离提供了足够浓度和/或数量的稀有细胞，以对所述细胞或其部分进行显著的可靠的临床分析、遗传分析、化学分析或其他分析。
例如，孕妇循环中的胎儿有核红细胞相对其他细胞来说极为罕见，大约100ppb或更少，阻碍了对胎儿细胞或DNA进行可靠的遗传分析。根据在本文中公开的方法，可以从常规血液样品中获得充分或足够数量的FNRBC，诸如，样品中存在的95%以上的FNRBC。因此，该方法能够进行有效分离，且所获得的细胞随后可以根据技术中已知的可用方法中的一种方法而用于遗传分析或诊断。
在典型实施例中，对包括靶细胞的初级样品（例如，血液样品）细胞进行处理以便使该细胞结合或偶联到磁珠上（该磁珠对初级样品中的靶细胞具有偶联或结合特异性），以便至少大体上形成其他非磁化细胞中的磁化细胞样品。在一些实施例中，结合到磁珠上的靶细胞在大部分不相关非磁化细胞中是稀有或极为少见的细胞类型。在一些实施例中，诸如，当要分离（或去除，depletion）活细胞时，处理所述细胞，使得细胞活力得以保存并在保持（维持）细胞活力的环境下分离所述细胞。下面对合适介质或载液的实例进行描述。
所述样品与载液混合，构成来维持活细胞，然后受驱通过管道，该管道在不考虑重力的情况下以受控速率在管道内传递混合物。所述管道穿过一个或多个具有由电磁体产生并主动控制的磁通量的磁化区（本文中也称为‘分离区’）。所述电磁体被构造成提供磁通量，该磁通量形成为实现对稀有磁性靶细胞进行有效磁分离。根据优选实施例，分离并恢复所述细胞，同时混合物以足够高的速率流动，防止为了维持细胞活力而长期暴露在不理想的条件下（诸如缺乏通气）的条件下，对细胞活力产生不利影响。
根据一些实施例，以最初存在于样品中的稀有细胞的至少50%，或者至少60%，或者至少70%，或者至少80%，或者至少90%或更高的效率保留或分离所述磁性靶细胞。在其他实施例中，所述磁性靶细胞包括大部分所采集的分离细胞。在各种实施例中，所述磁性靶细胞实现了所恢复的分离细胞的60%以上，或者70%以上，或者80%以上，或者90%以上，或者95%以上，诸如98%的比例。每种可能性均是本发明的独立实施例。
分离的磁性靶细胞聚集在和/或粘附在一个或多个磁分离区中的管壁上。然后，在阻止磁场以减少磁性细胞被吸引到管道，用载液（或其他液体）将分离的磁性靶细胞清洗（冲洗）到收集容器中。
本发明还提供了用于帮助从管壁上有效除去并释放分离细胞的机构，提高分离（细胞量）的定量产率（回收率）。在一些实施例中，通过使分离区消磁，消除剩磁并减少所分离的靶细胞对管壁的磁引力，来提高从管壁清洗所分离的磁性靶细胞的效率。在其他实施例中，通过以下至少一种操作来机械辅助进行清洗：使一个或多个气泡穿过管道、突然改变导致液体冲击的流速或使管道振动、向分离区或分离区附近的管道施加超声波。
所述电磁体被设计成利用充足的电力来提供并集中管道周围的磁通量，便于有效分离，同时避免可能会例如由于散热而对细胞或设备产生不利影响的不必要的或者过度的电力消耗。
此外，为了实现快速而高质量的分离，所述系统配置为，促使混合物以提供快速分离的足够高的速率（同时避免损害细胞）流过具有足够大内径或横截面的管道。
在一些实施例中，稀有细胞要达到90%以上的纯度以及大约或90%以上的回收率的典型分离的周期在几分钟内，诸如，在大约5分钟至大约15分钟内完成。
在一些实施例中，所述系统如此构成，使得所述管道基本上水平地穿过或设置在分离区，从而提供便携式设备，便携式设备在包括但不限于无菌室或通风柜的不同位置安装并操作。这样的密封空间优选水平配置，与垂直定向系统相对。
在分离区之间的分离、获取及清洗顺序、流速、分离区的磁场、载液及清洗液的化学和理化特性（例如粘度）、清洗率和/或气体参数和操作都是控制变量。这些变量适于提供预期的或充分的结果，同时维持细胞活力，基本上避免了非靶细胞与磁性靶细胞聚合和/或避免聚合在可以降低纯度和/或稀有细胞分离的产率的管壁上。在一些实施例中，对分离的工作环境进行控制，以便根据磁性靶细胞的磁响应性，在分离区中产生大致间歇式分离。这些实施例类似于分馏。
应注意，虽然本文举例说明了高效分离稀有细胞的上述分离技术，但该技术在分离和/或去除非稀有细胞时是有效的。
应注意，术语“分离”，反之及“去除”不一定是指全部分离靶细胞或相反地全部切除靶细胞，而是指实际上或足够高的定性定量分离，以及反之所对应的去除。
附图说明
在下列附图中对本发明的一些非限制示例性实施例进行说明。
一个或多个附图中出现的相同或重复或同等或类似的结构、元件或部件通常用相同附图标记表示，可选用一个额外字母或多个额外字母标记以对类似对象或对象变体进行区分，但不重复标记和/或描述。
选择图中所示的部件和装置的尺寸以便方便表达或清楚表达，且该尺寸不一定是按比例或真实的角度显示的。为了方便或清晰起见，未示出一些元件或结构或只示出了一部分和/或从不同角度或视角示出。
应注意，有些图被转化成了黑白底，从而通过减少某些细节或纹理或细度而降低了图片质量。
图1A示意性地示出了根据本发明的示例性实施例的稀有细胞分离系统；
图1B示意性地示出了根据本发明的示例性实施例的诸如图1A的系统的分离装置的透视图；
图1C示意性地示出了根据本发明的示例性实施例的诸如图1A的系统的分离装置的剖视图；
图1D示意性地示出了根据本发明的示例性实施例的诸如图1A的系统的磁化区的放大剖视图；
图1E示意性地示出了根据本发明的示例性实施例的诸如图1A的系统的磁化区的另一放大剖视图；
图1F示意性地示出了根据本发明的示例性实施例的另一稀有细胞分离系统；
图2A示意性地示出了根据本发明的示例性实施例的诸如图1A的分离系统的外部描述；
图2B示意性地示出了根据本发明的示例性实施例的诸如图1A的具有方便处理样品的机构的分离系统的外部描述。
具体实施方式
下列描述涉及本发明实施例的一个或多个非限制实例。本发明不受所述实施例或附图的限制，且可以按不同方式或配置或变更进行实践。本文所用的术语不应被理解为起限制作用，除非另有规定。
本文所用的非限制节标题仅是为了方便，不应被理解为限制本发明的范围。
通用术语
术语‘大约’，‘接近’，‘大致’及‘几乎’表示相对于所引用的术语或实施例或操作或本发明的范围无不良后果或影响的各个关系或尺度或数量或数目或程度。
术语‘垂直’，‘水平’，‘平行’，‘相对’，‘直线’及其他角度和几何关系表示近似但却具有功能性和/或实用性的各个关系。
术语‘优选的’，‘最优地’，‘典型的’，‘示例地’或‘可选地’不限制本发明或其实施例的范围。
术语‘基本的’，‘可观的’（或其同义词）表示针对上下文的尺度或范围或数量或程度，包含大部分或大多数所引用的实体，或相对于所引用的实体或针对所引用的主题至少适度或更多或更大或更有效或更重要的范围。
术语‘可忽略的’和‘轻微的’（或其同义词）表示足够小的各个关系或尺度或数量或数目或程度，以相对于所引用的术语或对本发明的范围产生实际后果。
术语‘可’表示包括或不包括和/或使用或不使用和/或实现或不实现和/或发生或不发生的选择或影响，而该选择构成了本发明的一些实施例或其后果的至少一部分，无需限制本发明的范围。
术语‘包括’，‘包含’，‘具有’及其词形变化及同根词表示‘包括但不限于’。
当列举一系列值时，仅是为了便利或简洁，包括所有可能的子范围以及该范围边界内或周围的单个数值。任何数值，除非另有规定，否则还包括实际近似值，且整数值不排除分数值。子范围值及实际近似值不应被视为专门公开的值。
除非上下文另有指示，参照单数形式的对象（例如“一件事（a thing）或“这件事（the thing）”）不排除复数形式（例如“这些事”）。
上下文相关术语
在本说明书和权利要求书中，下列术语及其派生词和词形变化是指下列各个非限制表征，除非另有规定或根据上下文变得显而易见。
磁化/磁性（细胞）—与铁磁材料偶联，诸如，与磁珠偶联。
靶细胞—通常是用于与其他细胞（例如用于检查或诊断的细胞）分离或集中的特定类型，或具有与其他细胞明显不同的特征（诸如选择性交互亲和力以与某些抗体或其他化合物或其他粒子耦合）的细胞。在特定实施例中，鲜明特征是选择性亲和力，以便与磁珠偶联或结合，形成磁性靶细胞。
分离—使靶细胞与周围散装液体隔离或收集积累靶细胞，其中，例如，散装液体是细胞乳液的流体混合物或悬浮物或其组合，也指相对于周围散装液体或所提供的细胞样品浓缩或富集靶细胞（获得类似于沉淀或离心分离的沉淀）。
去除—针对分离，从散装液体去除靶细胞（获得类似于沉淀或离心分离的上清液）。
高定性（分离、去除）—高纯度，分离基本上不包括其他细胞的靶细胞，或包括微量的其他细胞（诸如大约5%或大约1%或更少）的分离细胞，反之去除。
高定量（分离、去除）—高回收率，分离样品中几乎所有的靶细胞，或大量的靶细胞，诸如，大约95%或大约99%或更多，或分离细胞，反之去除。
磁珠—顺磁亚微米粒子，诸如，直径或横截面在纳米级范围内（例如20-100nm）的微珠或微球，适应选择性亲和力，以便与靶细胞偶联或结合。
稀有细胞—具有特定特征且在微生物源或其他环境中极为少见（“低丰度”）的细胞，诸如，在各个源或环境中相对于其他细胞来说每毫升大约或小于10个细胞（例如每毫升大约1个细胞）或小于1ppm（例如1ppb）。例如，胎儿有核红细胞（本文也称为NRBC，FNRBC）或干细胞。
磁化/磁性（细胞）—与铁磁材料偶联，诸如，与磁珠偶联。
细胞-生物细胞，还包括生物和其他粒子或化合物的组合，可选地，是诸如磁珠的非生物源，并包括，例如，血细胞、微生物及其部分，或生物源（诸如孢子或花粉）的其他粒子，但不排除非生物源的粒子。
（细胞的）初级样品—包括从细胞源（例如血液样品，污染的水或空气样品）采集的细胞的样品体积，诸如，利用离心机、试剂或抗体可能或可选进行物理、化学、生物浓缩。
（细胞的）样品—包括从细胞源（例如血液样品，污染的水或空气样品）采集的细胞的样品体积，可能或可选进行化学和/或生物和/或物理处理和/或改变（例如冷却、离心、稀释、与磁珠偶联）。
相当一部分—显著的相对量，诸如，所引用实体的25%至80%之间或更高。
‘ppm’，‘ppb’—分别为百万分之几（10-6），十亿分之几（10-9）。
应注意，每当本文描述附着或粘附在管壁上的细胞，或达到该效果的类似术语时，不一定是指细胞直接附着在管壁上，而是还可以通过细胞链或细胞群等连接至或链接至或间接附着在管壁上。
概述
下面对实践本发明的非限制概述进行介绍。本概述概括了本发明实施例的示例性实践，为变形和/或替换和/或扩充实施例提供了建设性基础，随后对这些实施例中的一些进行描述。
图1A示意性地示出了根据本发明的示例性实施例的使稀有细胞与其他细胞分离的系统100A。通常，系统100A包括在分离装置122中形成的磁化区124，包括磁性稀有细胞及其他非磁性细胞的样品混合物的流体在管道110中从样品混合物源106穿过（流过）该磁化区并排出到收集容器108。在下列讨论中，除非另有规定或根据上下文变得显而易见，术语‘靶细胞’是指‘磁性靶细胞’。
样品容器102盛放有包括生命维持流体中的磁性稀有靶细胞的样品细胞，载体容器（或库）104盛放有用于在分离系统100A中携带样品的载液（以下也称为‘载体’）。在一些实施例中，通常是分离活细胞时，所述载体是生命维持流体，诸如生理盐水，可选地，包括添加剂，诸如抗凝成分。
所述样品和载体分别通过泵112和114独立输送至进行混合的中间容器106（也称为‘混合物容器’）。具有独立控制的泵，允许调节样品与载体的比例，以便于对靶细胞进行充分或理想的分离，通常与系统100A的其他参数（例如磁化区的数量和磁场强度）有关。通过管段142从混合物容器106馈送样品和载体的流体混合物（以下简称‘混合物’），进一步经由示意性地示为144的连接件而送入管道110。
通常，用括号134表示的元件一般是竖直的，如箭头154所示。
为进一步参考，图1B示意性地示出了系统10A的分离装置122的透视图（与所示的横截面A-A和用箭头158表示的上表面一起示出），图1C示意性地示出了根据本发明的示例性实施例的分离装置122的截面A-A视图，其中图1D-1E示意性地示出了磁化区124的两个示例性变体的截面图A-A。
来自混合物容器106的混合物被提供到设置在一个或多个分离装置122大致水平上表面上的大致水平定向的管道110中，如平面坐标152所示。分离装置122包括分别具有内芯126a和外芯126b的电磁体，以及缠绕在内芯126a上的线圈128，构成磁化区124a及124b，其中，示意性地用箭头160u及160d表示磁场方向，同样如图1C中的各个磁场方向160所示。
从混合物容器106送入管道110的混合物在管道110中被泵116驱动（推进），该泵对流速进行调节，该调解与重力无关且与从样品容器102及载体容器104流入混合物容器106无关。当混合物穿过磁化区124时，形成由电磁体产生的磁场，以使磁化靶细胞吸引到管道110壁上，并使靶细胞与壁上的其余混合物分离并浓缩，同时阻止非靶细胞附着在壁上。
当混合物流过管道110且靶细胞粘附在管道110壁上时，去除混合物（基本上没有稀有靶细胞）经由与示意性地示为148的连接件连接的管段146排入收集容器108。通常，括号136表示的元件一般是竖直定向的，如箭头156所示。
一旦完成分离并且将去除混合物排到容器108中，则停止电磁体产生磁场，从而减少磁化靶细胞被吸引到管道，将靶细胞清洗（冲洗）到另一个收集容器，诸如另一容器108中。在一些实施例中，停止磁场还包括，使电磁体消磁，以便消除仍然可能拉动所分离的靶细胞并将该细胞粘附到管道110壁上的剩磁，例如，通过在电磁体中施加暂时衰减的交流电，从而有助于分离细胞从管壁上脱离下来。
为了提高分离靶细胞的产量（定量性地增加分离或回收），在一些实施例中，除消磁之外，还采取一项或多项措施来促使靶细胞从管道110壁上脱离下来。例如，使推动靶细胞的一个或多个气泡流动，和/或利用一个或多个压电元件等使管道振动，和/或至少在磁化区124周围向管道施加超声波，或突然改变流速以导致液体冲击。与应用脱离促进装置同时和/或先后地，可选设置或调节由载体或来自另一个容器的其他流体清洗掉的靶细胞，以及清洗液的成分（例如粘度）和/或流速，以便清洗掉几乎所有的分离靶细胞。
应注意，在各种实施例中，任何数量的分离装置122可以用于系统100A的实施例，包括单个装置，如阻断/连续指示138所示。
分离系统变型
图1F示意性地示出了根据本发明的示例性实施例的另一稀有细胞分离系统100B。
系统100B与系统100A类似，不同之处在于，系统100B中使用不同设计的分离装置182代替系统100A的分离装置122。
分离装置182包括电磁体，该电磁体包括铁芯186，铁芯186周围缠绕有线圈188a和188b，在磁化区184（诸如184a及184b）周围分别产生用箭头160p及160q表示的磁场的。任意数量的分离装置182可以用于系统100B的实施例，包括单个装置，如阻断/连续指示138所示。
图2A-2B示意性地示出了根据本发明的示例性实施例的诸如分离系统100A的外部描述200。所示的部分与针对图1A-1C所述的系统100A的那些部分相同或类似。系统200通常由一个或多个处理器或计算机进行控制，该处理器或计算机根据在计算机可读介质上存储的且通过触摸面板204和/或鼠标和/或键盘和/或任何其他人机接口设备（如诸如专用键盘或遥控器）等处理的一个或多个程序进行操作。
在一些实施例中，收集容器（诸如108）安装在一个机构（诸如转盘（表示为202））上，根据系统的操作程序，使合适的容器移至或转到引流管（排出管）110所在位置。例如，在分离过程中，设置用于收集去除混合物的容器，便于引流，在收集靶细胞的过程中，在引流管处设置另一个容器。
由于在受控环境下（诸如在无菌室或通风柜中）通常使用分离系统（诸如系统200），如果样品容器102（或其安装元件）固定设置在高处（相对于系统的其余部分，诸如磁化区124的水平），则进入以安装或拆除样品容器102或填充样品或向样品添加成分，在某些情况下是受限制的，或不合适的。在一些实施例中，实现一种方便访问样品容器102的机构。
图2B进一步示出了根据本发明的示例性实施例的方便处理样品容器102的机构206。该机构206被构造为平行四边形，其中，一边204固定安装在系统200的框架上，另一边可以在上位和下位之间移动，后者被描述为覆盖层，向上的方向由箭头208表示。
可选地，可以使用其他机构，包括方便访问系统（诸如系统200）的其他部分的机构。
设备/变化
一般来说，系统100A、100B及200（分别在图1A、1F及2A-2B中）有着如上所述的共同特征，一般在下列说明中提到，不限制地，也与系统100（也称‘系统’）一样。图1A-1F及2A-2B也在下列说明中提到。
电磁体和系统100A和100B中的磁化区124和184的构造，以及所述电磁体产生的磁场（例如，螺旋分布）的形状、方向及强度，以及磁化区的数量经配置、确定或调整，以实现管壁上稀有靶细胞的有效分离，每个磁化区可选具有不同磁场形状和/或强度。磁化区的场通量影响磁化细胞的分离，同时阻止非靶（及非磁化）细胞附着在管壁上，导致稀有细胞聚集在大约95%至大约99%或以上，诸如98%，几乎没有非靶细胞或其量可忽略。
在一些实施例中，通过阻止或延迟非靶细胞在流体混合物中向管壁流动，或可选通过考虑载体或混合物的性能（诸如粘度或弹性），来阻止非靶细胞。在一些实施例中，利用添加剂等对载体（或此物质的混合物）的组成进行设置，选择或调整，同时仍然允许磁化靶细胞在磁场的拉动下向管壁移动。
例如，通过铁芯（例如126或186）的形状和结构（例如结构、材料）、线圈（例如128或188）的形状和绕组、线圈中的电流强度（可选包括电流的时间变化）及设置管道（例如管道110）的构造（凹槽、夹具）中的一种或多种，对磁化区的磁通量形状和强度进行配置。在一些实施例中，为了实现如上所述的分离，电磁体的配置使得在每个磁化区中，将流动混合物中大量的磁化稀有细胞（例如50%或以上）吸引到具有微量的非靶细胞或几乎没有非靶细胞的管壁上。在一些实施例中，根据设计规则和/或专业技术设计并构建电磁体，并通过检查分离的有效性，例如利用技术方法（例如细胞计数法或MACS）比较稀有细胞在样品和单独收集中的浓缩或分布来确定是否改性。随后，调节或修整或调整所述电磁体或磁化区，以便提高该目标（例如，分离浓缩95%及以上）的结果。
应注意，从混合物容器106至收集容器108的路径基本上为连续导管或管道，其中，管道诸如110及管段，诸如142或146，并且连接件144和148的直径或横截面相同或不同。在一些实施例中，管道110的横截面可以随其长度改变，从而改变流速，可选地，使磁化区相关的直径或横截面适于促使靶细胞粘附到管壁上和/或防止非靶细胞粘附到管道110壁上或靶细胞上，和/或防止可能阻碍混合物流的非靶细胞凝结。
在一些实施例中，至少磁化区124或184周围的管道110的内径大约为或大于2mm，以获得足够流速，实现快速分离。
144和148表示的连接件是诸如弯管或膝状管的管段，通常为管道110中的弯头（例如，参见图2A-2B），并将大致竖直的管段142和146连接至大致水平的管道110。可选地或可替换地，所述分离系统被构造成使得从混合物容器106至收集容器108的管道或导管的管段可以处于其他方位，在大致水平的大方向（例如，样品容器102和混合物容器106大致一样高）与大致垂直的大方向之间，或具有任何其他变化。
通常，所述管道（诸如110或142或146）及连接件144和148由生物相容性材料制成，或涂覆有生物相容性材料，以保存活细胞，诸如，硅胶管。所述管道通常是柔软可弯曲的管道并且弹性可压缩（例如，弹性压缩）。
推进泵116可以设置在混合物容器106和收集容器108之间的路径上，诸如，在第一分离装置（诸如122或182）之前或在最后一个分离装置之后的任何实用段上。
在一些实施例中，可以使用任意数量的分离装置或磁化区或电磁体，如阻断/连续指示138所示，还指的是，少量的电磁体或装置或区域，可选地，只有一个元件，以及短管。可选地，多个泵（诸如泵116）通常是同步的，可以用来使混合物在管道110内流动。
在一些实施例中，泵112、114及116是保持细胞活力和/或提供调节流速的任意泵，诸如，蠕动泵。
应注意，虽然分离装置122或182分别包括两个磁化区124，但装置122或182或其他装置可以设计成具有一个或两个以上的磁化区，可选地，该磁化区具有不同结构和所产生的磁场。
在一些实施例中，样品容器102是一次性容器，容量大约为50ml，只用于一次分离，而在一些实施例中，载体容器104是更大的瓶子，或是为多次分离提供载液的其他容器。在一些实施例中，管道110（或实际上是包括管道110和管段142和146及连接件144和148的连续管道）是一次性管道，只用于一次分离，并由硅胶管1.98*3.18制成。通常，收集容器与试管类似并且是一次性的。
在细胞活力不是强制性的或样品是非生命粒子的情况下，流体（诸如载体或清洗液）不一定是维持生命的流体，且所述管道不一定生物相容，允许成分和组分具有更多的选择，用于特定性能（诸如粘度、弹性或流态）。
磁化区
所述电磁体被设计来提供并聚集磁化区的磁通量，以便通过避免可能对细胞或设备产生不利影响的过度或多余的电力消耗，利用功率效率进行有效分离。例如，过度散热可能会损坏细胞或使细胞凝结，或改变载体的粘度，或使电磁体变形。保持电力消耗基本上为最少值或标称值，同时提供用于分离的足够通量，也可以避免冷却机构，从而提供一种简单、紧凑、可靠的设备。
此外，为了实现快速而高质量的分离，所述系统配置为，促使混合物以提供快速分离同时避免损害细胞的足够高的速率（例如大约2ml/min），流过具有足够大内径或横截面（例如，大约2mm）的管道，如果速率不够低或所述管道不够窄（例如大约1mm或以下），则可能会损害细胞，导致流动流体中存在力，诸如，可能会对细胞产生不利影响（诸如细胞凝结）的剪切力。
图1D示意性地示出了分离装置（诸如装置122）的磁化区124p（诸如区域124）的放大剖视图，其中，一段管道示意性地示出了管道110的布置。磁化区124p被形成为由间隙隔开的大致平行的平坦表面（磁场的方向可以与如图1C中的磁化区124a和124b所示的方向相反），用于将一段管道110设置在箭头160表示的磁场通量中。在一些实施例中，该间隙大约为3mm或以上，允许放置足够宽的管道110，便于快速分离。
图1E示意性地示出了分离装置（诸如装置122）的磁化区124q（诸如区域124）的放大剖视图，其中，一段管道示意性地示出了管道110的布置。磁化区124q被形成为大致相对的圆形表面，用于进一步集中磁通量（诸如，相对于磁化区124p），基本上无需外加动力。该圆形表面由间隙隔开（磁场的方向可以与如图1C中的磁化区124a和124b所示的方向相反），用于将一段管道110设置在箭头160表示的磁场通量中。在一些实施例中，该间隙允许放置外径大约为3mm的足够宽的管道110，便于快速分离。
下列表1根据电流提供了在磁化区124产生并集中磁场通量的效率以及磁化区124q的圆形表面相对于磁化区124p的平坦表面的更高效率的实例。电磁体线圈（例如，分离装置124的线圈）由2000个1.1mm厚的钢丝绕组制成，产生9.1Ω的电阻。所描述和所列举的值为相当接近的近似值。
Figure BDA00001920350800181
表1
操作
为了实现以定性定量的高产率分离稀有细胞，在已编程处理器的作用下，根据某些程序和参数而可选至少部分地对系统100进行操作，下面对一些程序和参数进行了描述。
在使稀有靶细胞与磁珠（同样参见下文）偶联的过程中，一些细胞与磁珠偶联的数量通常要比其他细胞大，使磁性靶细胞具有不同的磁引力（给定磁场下的力）。为了更加清楚和简单，假设仅使用一个磁化区（例如，磁化区124），而使用足以吸引几乎所有的靶细胞的强磁场在某些情况下可以拉动细胞，使得细胞形成粘附在管壁上的块体（例如管道110，以下简称‘管道’），导致低产率定性分离。而且，可能或很有可能，当靶细胞漂向管壁时，该管壁会随着可能粘附在细胞块体上或隐藏在细胞块体中或在靶细胞上凝结或随靶细胞一起凝结的非靶细胞一同拉动靶细胞，导致更低的定性分离。另一方面，如果施加一个较弱的磁场，只分离具有强引力的靶细胞（与相对较多的磁珠偶联），其余的随着部分去除的混合物流出，导致低的定量分离。
因此，在一些实施例中，不同强度的磁场和/或不同空间分布的磁通量施加于不同的磁化区。然后调节磁场，使靶细胞分离并粘附到足以承受混合物流动的管壁上，轻微吸引或不吸引非靶细胞，同时，在终止磁场时，进行大幅度或整体（至少几乎整体地）冲洗并释放。例如，第一磁化区提供中强场，吸引具有少量磁珠的稀有靶细胞，使得非靶细胞几乎不被拉动且不被带到管壁上或与靶细胞凝结。在后续磁化区中，施加较低磁场，用较大的引力吸引靶细胞，但几乎不拉动非靶细胞。可以使用几个磁化区的方案，每个区域具有不同磁场强度和通量分布。
在一些实施例中，为了减少空间和成本，在一次或多次循环中，所述管道可以穿过指定数量的磁化区，并调整磁场强度以使稀有靶细胞略微分开，不拉动或几乎不拉动并俘获非靶细胞。可选地或替换地，在具有指定数量的磁化区（甚至可能为一个）的一些实施例中，中弱场用于高引力的靶细胞，随后，增强该场，并回收混合物以分离具有较高引力的靶细胞。可选地或替换地，在指定数量的磁化区中，利用一定的场强度分离一部分稀有靶细胞，清洗并收集所终止的场和所分离的靶细胞，再次利用不同的场强度重复循环，从而顺序分离部分稀有靶细胞。
在一些实施例中，磁通量形成不同强度（梯度）以吸引仅具有微量（如存在）非靶细胞或其聚积物的各种磁化稀有细胞。类似地，在一些实施例中，磁通量可随时改变（以相对于混合物流的速率）以吸引仅具有微量（如存在）非靶细胞或其凝结物的各种磁化稀有细胞。在一些实施例中，对空间变化和时间变化通量的组合进行调整，以实现高定性定量地分离稀有细胞。
可以调节磁化区的数量和/或分离周期的数量，允许将系统调到稀有靶细胞的细微分或分级分离，具有卓越的定性定量分离累积产率。
注意到，在前述说明中，定量术语，诸如强、弱、中、大、低或高仅仅是指相对数量或强度，以说明不同情况。
可选地或另外地，在一些实施例中，可能地或可选地，针对诸如磁场强度或空间分布或细胞类型等参数和/或温度等其他参数来调节其他参数。例如，可以调节混合物或载液的流速和/或粘度和/或弹性，以使靶细胞分离，但至少基本上防止非靶细胞凝结。在一些实施例中，载液用于清洗所分离的靶细胞，但在一些实施例中，清洗液与载液不同。可选地，调节清洗液的流态和流速，以促使靶细胞脱离所述管壁（例如促使去除或释放），突然改变流速，从而产生帮助侵蚀或打破管壁上的靶细胞的平衡的扰动或冲击。
在一些实施例中，稀有细胞在几分钟内（诸如大约15内）以大约2ml/min的吞吐量完成高定性定量分离产率的典型周期，其中，进一步调整操作参数和/或辅助设备（例如，用于利用多个管道几乎同时部分分离或同步分离的多个分离装置或磁化区）可以缩短分离周期时间。在一些实施例中，电磁体在磁化区中产生的磁场通量密度的量级为1特斯拉（T），而在一些实施例中，使相当一部分（诸如一半以上（例如大约80%）的靶细胞在头一个或头两个磁化区（第一分离装置，诸如装置122）中分离。
注意到，在一些实施例中，在清洗管道中的细胞之前和/或同时，进行促使分离细胞脱离管道（例如消磁、冒泡、振动）的操作。
应注意，当定制（indent）高质量或纯度贫化（purity depletion）（而不收集靶细胞）时，可以施加足够强的磁场，诸如，比用于收集的磁场强的磁场，以非靶细胞粘附在壁上和/或凝结为代价。
样品
通常从包括处理成专门与磁珠偶联的检查用稀有细胞（靶细胞）的初级样品获得所述样品。例如，期望存在来自孕妇的以稀有胎儿有红血细胞（FNRBC）为靶细胞的血液样品，或期望存在来自血液或羊水的干细胞。
在一些示例性情况下，初级样品源为其他生理液体，诸如，淋巴液或尿液，而在一些情况下，该源为非生物源，且细胞为细菌或其他生物粒子，诸如，从水源或空气源或其他环境中采集而来的花粉或孢子。
在一些实施例中，所述靶细胞实际上不是细胞，而是任何材料或成分的其他微粒子（例如大约或小于1μm），其中，靶粒子可以选择性地与磁珠偶联或结合。
操作程序概述
根据上述说明，在一些实施例中，所述系统用于以定性定量的高产率使磁化细胞与细胞流体混合物分离，通过下列操作实现：（a）提供包括磁化稀有细胞的细胞样品，以及（b）使载液中的细胞样品混合物在围绕磁化区设置的管道内流动，磁化区具有的磁通量由电磁体生成且足以从混合物中吸引大部分磁化细胞到所述管壁上，同时阻止其他细胞附着在所述管壁上，从而分离所述管壁上的磁化稀有细胞。
在一些实施例中，所述磁化细胞是丰度相对于其余细胞较低的稀有细胞。
在典型实施例中，一旦完成（或几乎完成）所述磁化细胞从混合物的分离，就终止磁通量（减少细胞的引力）并清洗管道内的分离磁化稀有细胞。
在一些实施例中，清洗分离细胞先于或伴随着激活机构，以通过消磁、冒泡或使管道振动等促使分离磁化稀有细胞脱离管壁。
示例性程序
从孕妇身上采集几毫升（例如5ml）初级血液样品。
制备该样品并使其与类似于或如http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/11331D-Dynal-CD4-Positive-Isolation-Kit-(rev003).pdf的试剂盒协议中所定义的磁珠偶联。
将所制备的样品置入一次性样品容器（例如，容器102）。
将大约3ml PBS+2mM EDTA+0.5%BSA的清洗缓冲剂（载液）置入载体容器（例如104）并启动对应的泵，使清洗液（载液）以大约2ml/min的流速流动，以填装管道（例如，管道110和连接段），以制备装置，包括填装用于分离的混合物容器（例如，容器106），然后关闭所述泵。
分离装置（装置122）中的磁场设置为大约450-800mT并启动推进泵（例如，泵116），以使混合物以大约1ml/min的流速流动。当只有几毫升（例如2ml）保留在混合物容器中时，关闭所述推进泵，并用大约15ml的清洗液以大约2ml/min的流速清洗所述系统。
关闭所述磁场，并使所述电磁体消磁。
用大约3ml的清洗液以大约2ml/min的流速将所述靶细胞清洗到收集容器（例如，容器108）中。
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Claims (39)

1.一种磁性分离系统，被构造成以定性定量的高产率使磁化细胞与非磁化细胞流体混合物分离，同时保持细胞的活力，所述磁性分离系统包括：
（a）多个电磁体，被构造成生成围绕多个区域且足以吸引所述混合物中的大部分磁化细胞的磁场通量；以及
（b）推进泵，以确定的和受控的流速在围绕所述区域设置的管道内驱动所述混合物，从而通过所生成的磁通量将大部分的磁化细胞从所述混合物分离到管壁上，同时阻止其他细胞附着在所述管壁上。
2.根据权利要求1所述的系统，其中，保持细胞的活力包括产生所述磁场，同时避免对细胞的活力不利的散热。
3.根据权利要求1所述的系统，所述系统配置为，使稀有细胞与细胞流体混合物分离，所述细胞流体混合物具有的稀有细胞的丰度相对于其余细胞较低。
4.根据权利要求1所述的系统，进一步包括：
（a）混合物容器，用于制备细胞流体混合物，以供应至所述管道；
（b）样品容器，用于盛放细胞样品；
（c）载体容器，用于盛放载液；
（d）泵，用于独立于所述推进泵而驱动所述细胞样品和所述载液进入所述混合物容器。
5.根据权利要求1所述的系统，其中，所述管道围绕所述区域而基本水平设置。
6.根据权利要求1所述的系统，其中，多个所述区域围绕基本水平的平面设置，以便围绕所述区域基本水平地设置所述管道。
7.根据权利要求1所述的系统，其中，所述管道围绕所述区域基本竖直设置。
8.根据权利要求1所述的系统，其中，所述多个区域围绕基本竖直平面设置，以围绕所述区域基本水平地设置所述管道。
9.根据权利要求1所述的系统，其中，配置电磁体，以围绕两个区域生成磁通量。
10.根据权利要求1所述的系统，其中，所述管道围绕多个连续区域接续地设置，每个区域配置为，连续地将残留在所述流动混合物中的大部分磁化稀有细胞吸引到所述管壁上，同时阻止其他细胞附着在所述管壁上。
11.根据权利要求1所述的系统，进一步包括用于促使分离的磁化细胞脱离所述管壁的至少一个机构。
12.根据权利要求11所述的系统，其中，所述机构包括，使所述电磁体和相应的区域消磁。
13.根据权利要求11所述的系统，其中，所述机构包括，使流体中的气泡在所述管道内流动的设备。
14.根据权利要求11所述的系统，其中，所述机构包括使所述管道振动的设备。
15.根据权利要求1所述的系统，其中，所述系统被构造成，使得提供包括初始存在于所述混合物中的磁化细胞的至少50%的磁化细胞分离。
16.根据权利要求1所述的系统，其中，所述系统被构造成，使得提供包括初始存在于所述混合物中的磁化细胞的至少60%的磁化细胞分离。
17.根据权利要求1所述的系统，其中，所述系统被构造成，使得提供包括初始存在于所述混合物中的磁化细胞的至少70%的磁化细胞分离。
18.根据权利要求1所述的系统，其中，所述系统被构造成，使得提供包括初始存在于所述混合物中的磁化细胞的至少80%的磁化细胞分离。
19.根据权利要求1所述的系统，其中，所述系统被构造成，使得提供包括初始存在于所述混合物中的磁化细胞的至少90%或更高的磁化细胞分离。
20.根据权利要求1所述的系统，其中，所述系统被构造成，浓缩从所述混合物中回收的分离细胞的60%以上的磁化细胞。
21.根据权利要求1所述的系统，其中，所述系统被构造成，浓缩从所述混合物中回收的分离细胞的70%以上的磁化细胞。
22.根据权利要求1所述的系统，其中，所述系统被构造成，浓缩从所述混合物中回收的分离细胞的80%以上的磁化细胞。
23.根据权利要求1所述的系统，其中，所述系统被构造成，浓缩从所述混合物中回收的分离细胞的90%以上的磁化细胞。
24.根据权利要求1所述的系统，其中，所述系统被构造成，浓缩从所述混合物中回收的分离细胞的95%以上的磁化细胞。
25.根据权利要求1所述的系统，其中，所述系统被构造成，浓缩从所述混合物中回收的分离细胞的大约98%的磁化细胞。
26.根据权利要求1所述的系统，其中，所述流体混合物适于阻止非磁化细胞朝所述管壁移动，同时允许磁化细胞在围绕所述区域的磁场通量的拉动下移动。
27.根据权利要求1所述的系统，其中，所述载液适于保持所述细胞的活力。
28.根据权利要求1所述的系统，其中，所述管道是生物相容的。
29.根据权利要求1所述的系统，其中，所述泵为蠕动泵。
30.根据权利要求1所述的系统，其中，所述磁通量为1特斯拉水平。
31.一种以定性定量的高产率使磁化细胞与细胞流体混合物分离且同时保持细胞的活力的方法，包括：
（a）提供包括磁化细胞的细胞样品；以及
（b）使载液中的细胞样品的混合物在围绕具有磁通量的磁化区设置的管道内流动，所述磁通量由电磁体生成，同时避免对所述细胞的活力不利的散热，且足以从所述混合物中吸引大部分磁化细胞到所述管壁上，同时阻止其他细胞附着在所述管壁上，从而分离所述管壁上的磁化细胞。
32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述磁化细胞是丰度相对于所述混合物中的其余细胞较低的稀有细胞。
33.根据权利要求31所述的方法，进一步包括，终止所述磁通量并冲洗所述管道内的分离的磁化细胞。
34.根据权利要求33所述的方法，进一步包括，同时地或提前地启动用于促使分离的磁化细胞脱离所述管壁的机构。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述机构包括使所述电磁体和相应的区域消磁。
36.根据权利要求34所述的方法，其中，所述机构包括使流体中的气泡在所述管道内流动的设备。
37.根据权利要求34所述的方法，其中，所述机构包括使所述管道振动的设备。
38.根据权利要求31所述的方法，其中，磁化区域包括多个区域。
39.根据权利要求31所述的方法，其中，区域包括多个连续区域，所述管道接续地设置在所述区域上，且每个区域配置为，连续地将残留在所述流动混合物中的大部分磁化细胞吸引到所述管壁上，同时阻止其他细胞附着在所述管壁上。
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