JP6924210B2 - 試料中の標的細胞をエンリッチするシステムおよび方法 - Google Patents

Description

本発明の実施形態は、腫瘍検査および診断検査の分野に関する。より具体的には、本発明の実施形態は、試料から標的細胞をエンリッチおよび同定するシステムおよび方法に関する。

癌細胞は、原発腫瘍から血液を通じて循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）として広がり、遠隔部位を侵して転移性病巣を形成する。他の媒体における癌細胞の広がりまたは蓄積の他の手段としては、胸膜の流出、腹膜液、尿、またはそれらの組み合わせが挙げられる。癌に関連した全ての死のうち９０％程度は、遠隔部位への癌の広がりである転移によると考えられる。循環悪性腫瘍細胞は、転移性侵襲に関する情報、および原発腫瘍への分子的洞察、または転移性病巣の予感をもたらす。これらの悪性細胞は、極めて低い周波数で存在し、約１〜１０個のＣＴＣが、１０億（１０^９）個の血液細胞中で見つけられる。したがって、非常に異質な性質と結び付けられたその希少さにより、臨床モニタリングおよび癌治療のためのＣＴＣの使用は非常に制限されてきた。

ＣＴＣをエンリッチする方法の１つは、物理的または機械的性質に基づいた細胞懸濁バッファ中の標的細胞の選別／エンリッチメントを伴う慣性マイクロ流体技術に基づくバイオチップ設計を使用することである。これらの技術は、様々な下流分析技法を用いた悪性腫瘍細胞の首尾よい同定にとってたいていは汚濁物とみなされる試料の標的外の成分を激減させることができる。

マイクロ流体ベースのバイオチップの性能は、ポンピングモジュールの脈動、気泡、および圧力変化などの外部ファクタによって簡単に影響を受け得る。エンリッチメントプラットフォームの場合、圧力の変化および抵抗の変化が、エンリッチメントの品質に影響を及ぼし得る。

本発明の第１の態様によれば、試料中の標的細胞をエンリッチするシステムが提供される。このシステムは、試料入口、試料出口、廃棄物出口、およびマイクロ流体流路を備えるマイクロ流体チップであって、 試料入口はマイクロ流体流路の上流端に結合され、試料出口および廃棄物出口はマイクロ流体流路の下流端に結合され、マイクロ流体チップは標的細胞が試料出口に向けられるとともに非標的細胞が廃棄物出口に向けられるように構成される、マイクロ流体チップと、マイクロ流体チップの試料入口に試料を導入するように構成される試料入力ポンプと、マイクロ流体チップの試料出口および／または廃棄物出口で流量を測定するように構成される出力流量検出器と、マイクロ流体チップの試料出力が試料出力容器に結合されている第１の構成とマイクロ流体チップの試料出力が廃棄物出力容器に結合されている第２の構成との間で切り換え可能な構成を有する試料捕集切換弁と、出力流量検出器によって測定される流量を用いて試料捕集切換弁の構成を制御するように構成されているコントローラと、を備える。

例えば、２出力バイオチップについての標的細胞出力と廃棄物出力との間の流量比率は、エンリッチメントの品質を評価するためのパラメータとして使用することができる。この比率が設定値よりも低い場合、細胞が廃棄物により多く失われるにつれて、標的細胞（悪性腫瘍細胞）の回復は、低下し得る。反対に、この比率が設定値よりも高い場合、標的細胞を用いて捕集される汚れた非標的細胞がより多くなり、したがってエンリッチメントを低下させる。この比率は、出力管抵抗、および開口圧力がよく制御できないので、手動操作中にかなり変わり得る。

一実施形態では、コントローラは、出力流量検出器によって測定される流量を所定の流量値範囲と比較するように構成され、コントローラは、出力流量検出器によって測定される流量が所定の流量値範囲外である場合に、試料捕集切換弁を第２の構成に切り換えるようにさらに構成される。

所定の流量範囲は、所定の流量の１０％または５％内の範囲であり得る。

一実施形態では、コントローラは、試料出口と廃棄物出口との間の流量比率を決定するように構成され、流量比率を所定の流量比率範囲と比較し、流量比率が所定の流量比率範囲外である場合に、試料捕集切換弁を第２の構成に切り換えるようにさらに構成される。

一実施形態では、コントローラは、出力流量検出器によって測定される流量とマイクロ流体チップを通じての全流量とから流量比率を決定するように構成されている。

一実施形態では、システムは、試料出口における流量を測定するように構成された第１の出力流量検出器を備え、マイクロ流体チップの廃棄物出口における流量を測定するように構成された第２の出力流量検出器を備え、コントローラは、第１の流量検出器によって測定される第１の流量、および第２の流量検出器によって測定される第２の流量から流量比率を決定するように構成されている。

一実施形態では、試料は、標的細胞が試料中に均一に懸濁されるように選択される密度を有する密度適合液体を含む。

一実施形態では、マイクロ流体チップは、マイクロ流体流路の上流端に結合された希釈剤入口をさらに備え、システムは、希釈剤バッファを希釈剤入口に導入するように構成される希釈剤入口ポンプをさらに備える。

希釈剤バッファは、等張液および／または表面活性剤溶液を含むことができる。希釈剤バッファ中の等張液は、処理中に高い細胞完全性を維持するのを助けることができる。表面活性剤溶液は、細胞が受ける剪断力を減少させることができ、したがって細胞生存率を維持する。

一実施形態では、システムは、希釈剤バッファから気泡を除去するように配置された気泡除去器をさらに備える。

試料は、血液試料を含有することができる。標的細胞は、循環腫瘍細胞であり得る。

一実施形態では、マイクロ流体流路は、螺旋状または曲線状セクションを備える。

本発明の第２の態様によれば、マイクロ流体チップを用いて試料中の標的細胞をエンリッチする方法であって、マイクロ流体チップは、試料入口、試料出口、廃棄物出口、およびマイクロ流体流路を備え、試料入口はマイクロ流体流路の上流端に結合され、試料出口および廃棄物出口はマイクロ流体流路の下流端に結合され、マイクロ流体チップは標的細胞が試料出口に向けられるとともに非標的細胞が廃棄物出口に向けられるように構成される、方法が提供される。方法は、マイクロ流体チップの試料入口に試料を導入するステップと、マイクロ流体チップの試料出口および／または廃棄物出口で流量をモニタするステップと、モニタした流量を用いて試料捕集弁の構成を制御するステップであって、試料捕集切換弁は、マイクロ流体チップの試料出力が試料出力容器に結合されている第１の構成とマイクロ流体チップの試料出力が廃棄物出力容器に結合されている第２の構成との間で切り換え可能な構成を有する、ステップとを含む。

一実施形態では、方法は、マイクロ流体チップの試料入口に試料を導入する前に、密度適合液体中で試料を懸濁させるステップをさらに含み、密度適合液体は、標的細胞が試料中に均一に懸濁されるように選択される密度を有する。

一実施形態では、方法は、マイクロ流体チップの試料入口に試料を導入する前に、試料に対して遠心分離および／または血液溶解を実行するステップをさらに含む。

一実施形態では、方法は、モニタされる流量を所定の流量値範囲と比較し、出力流量検出器によって測定される流量が所定の流量値範囲外である場合に、試料捕集切換弁を第２の構成に切り換えるステップをさらに含む。

所定の流量範囲は、所定の流量の１０％または５％内の範囲であり得る。

一実施形態では、方法は、試料出口と廃棄物出口との間の流量比率を決定し、流量比率を所定の流量比率範囲と比較し、流量比率が所定の流量比率範囲外である場合に、試料捕集切換弁を第２の構成に切り換えるステップをさらに含む。

一実施形態では、流量比率を決定するステップは、マイクロ流体チップの試料出口または廃棄物出口の流量とマイクロ流体チップを通じての全流量から流量比率を決定するステップを含む。

一実施形態では、方法は、試料出口で第１の流量を測定し、マイクロ流体チップの廃棄物出口で第２の流量を測定するステップを含み、流量比率を決定することは、 第１の流量および第２の流量から流量比率を決定することを含む。

一実施形態では、マイクロ流体チップは、マイクロ流体流路の上流端に結合された希釈剤入口をさらに備え、方法は、希釈剤バッファを希釈剤入口に導入するステップをさらに含む。

希釈剤バッファは、等張液および／または表面活性剤溶液を含むことができる。
希釈剤バッファ中の等張液は、処理中に高い細胞完全性を維持するのを助けることができる。表面活性剤溶液は、細胞が受ける剪断力を減少させることができ、したがって細胞生存率を維持する。

一実施形態では、方法は、希釈剤バッファを希釈剤入口に導入する前に、希釈剤バッファから気泡を取り除くステップをさらに含む。

試料は、血液試料を含有することができる。標的細胞は、循環腫瘍細胞であり得る。

一実施形態では、マイクロ流体流路は、螺旋状または曲線状セクションを備える。

本発明の一実施形態による試料を分析する方法は、上述した方法を用いて試料中の標的細胞をエンリッチするステップと、エンリッチされた標的細胞を分析するステップと、を含む。

標的細胞の分析は、細胞内および／もしくは細胞外のタンパク質マーカーの検出、細胞および核の形態と構造の分析、ならびに／または次世代シーケンシング（ＮＧＳ）および／もしくはサンガーシーケンシング、および／もしくはデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および／もしくはドロップレットデジタルＰＣＲ、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、および／もしくは蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ならびに／または関心の核酸のコピー数多型による核酸のシーケンシングによる分子特徴付けを含むことができる。

以下に、添付図面を参照して、本発明の実施形態を非限定の例として説明する。

図１は、悪性腫瘍細胞の非侵襲的な同定および分析の方法を示す流れ図である。 図２Ａ〜２Ｄは、調製段階中の試料懸濁を示す図である。 図３は、本発明の一実施形態による標的細胞をエンリッチするシステムの概略図である。 図４は、本発明の実施形態と共に使用することができるマイクロ流体チップの一例を示す図である。 図５は、標的細胞の下流分析に使用され得るファクタを示す図である。 図６Ａ及び図６Ｂは、形態学的ベース及び免疫細胞化学手法を用いた悪性腫瘍細胞の同定を示す図である。 図７Ａ及び図７Ｂは、ＦＩＳＨベースやＰＣＲベースの手法などの分子ベースの手法を用いた腫瘍細胞の特徴付けを示す図である。 リキッドバイオプシーからエンリッチされる癌細胞が次世代シーケンシングのために処理され得る例を示す図である。 本発明の一実施形態による標的細胞をエンリッチするシステムを示す図である。

本発明の実施形態は、癌患者からの生体液から悪性腫瘍細胞の下流同定および特性評価を可能にする悪性腫瘍細胞のエンリッチメントについての方法に関する。

図１は、悪性腫瘍細胞の非侵襲的な同定および分析の方法を示す流れ図である。図１に示すように、この方法は、調製１０、エンリッチメント２０、および下流分析３０という３つの段階を含む。

一実施形態では、ディーン流れ動態と結び付いた慣性集束原理に基づく癌細胞エンリッチメント２０の方法は、細胞の均一な懸濁液を必要とし、この懸濁液は、続いて、自動化システムによって悪性腫瘍細胞と他の細胞を異なる捕集管に流すように処理される。細胞の出力の下流視覚または分子分析３０は、細胞が実際に腫瘍形成の性質であるとともに癌の研究または診断の使用に関連する分子情報を提供することを示す腫瘍の特徴を特定するために実行され得る。エンリッチメントプラットフォームは、下流特徴付け技法を癌の分析に適用することができるとともに、癌に関するより多くの情報を集めることができる試料調製方法として扱われ得る。

図１に示すように、調製段階１０は、プレエンリッチメント試料処理１２と、細胞の再懸濁１４とを含む。入力細胞試料は、処理のスループットおよびより高品質の標的細胞エンリッチメントを高めるために、いくつかの成分を激減させるようにプレエンリッチまたは前置フィルタ処理することができる。例えば、遠心分離または赤血球溶血が、人間の抹消血液試料内の赤血球を取り除くように実行することができ、それによって総細胞負荷を低減させるとともに、処理時間を減少させる。セルストレーナは、管または流路を詰まらせ得る、またはチップ内部のフローストリームを邪魔し得るある種の血塊／組織デブリを取り除くために使用され得る。次いで、試料は、ある体積の入力バッファ中で懸濁されるべきである。入力バッファは、細胞が沈殿しないまたは処理中の損失であることを確実にするように密度適合液体からなるべきである。例えば、処理時間がより長く必要とされる場合、図２に示すように、入力バッファの密度は、処理中に細胞がバッファの上層に流れるまたは容器の底への沈降するのを防ぐために、細胞の密度の近くに調整されるべきである。

全血からのＣＴＣエンリッチメントについての実施形態では、以下の試薬が、調製段階１０において使用され得る。ＲＢＣ溶解バッファまたは密度分離液が使用され得る。全血試料は、ＣＴＣを含む有核細胞分画を切り離すために、塩化アンモニウムベースの赤血球（ＲＢＣ）溶解バッファを用いて溶血させられ得る、または密度勾配遠心分離で処理され得る。
エンリッチメント段階２０は、試料が選別のためにバイオチップへ装填される試料装填２２と、例えば細胞サイズにしたがって細胞を分離するために慣性力を使用することによって試料の細胞が選別される自動細胞選別２４と、試料の標的細胞が捕集されるとともに非標的細胞が廃棄物として処分される試料捕集２６とを含む。

下流分析段階３０は、隔離された標的細胞の同定３２および特性評価３４と、次いで、同定および特性評価の結果の解釈３６とを含む。

図２Ａ〜図２Ｄは、調製段階における試料懸濁を示す。図２Ａに示すように、全ての細胞２０２は、試料が処理する用意が整っているとき均一に懸濁させられている。次いで、試料は、ある体積の入力バッファ内で再懸濁させられる。この入力バッファの密度は、密度適合液体を用いて制御される。

図２Ｂに示すように、細胞２０２の密度が周囲バッファ２０４の密度よりも低く、それによって細胞２０２が処理中に浮力によって浮き上がる場合、懸濁密度の均一性は失われる。図２Ｃに示すように、細胞２０２の密度が周囲バッファ２０６の密度よりも高く、それによって細胞が処理中に沈殿する場合、懸濁密度の均一性は失われる。

図２Ｄは、バッファの密度が細胞に適合している試料を示す。図２Ｄに示すように、細胞２０２は、処理ステージ全体の最中に密度整合バッファ２０８を用いて均一に懸濁される。

上述したように、沈殿作用による最小の細胞の損失を確実にするために、入力細胞試料バッファを使用して入力細胞試料を懸濁する。入力細胞試料バッファは、入力細胞を中性的に浮力のあるように維持し、入力細胞が長期にわたって処理されることを可能にする密度および粘性が整合した溶液からなる。

図３は、本発明の一実施形態による標的細胞をエンリッチするシステムの概略図である。システム３００は、マイクロ流体チップ３１０を備える。マイクロ流体チップ３１０は、カートリッジ内に収容され、慣性力を用いて細胞のサイズに応じて細胞を分離する少なくとも１つのマイクロ流体流路を備える。マイクロ流体チップ３１０は、慣性力およびディーン流れ（ディーンサイクル）の助けにより細胞のサイズおよび形態と構造に基づいて標的悪性腫瘍細胞をエンリッチすることができる。マイクロ流体チップの一例は、図４を参照して以下により詳細に説明される。

システム３００は、試料３２２を収容する試料容器３２０をさらに備える。試料３２２ は、入力バッファ中に懸濁される標的細胞を含む。図３に示した実施形態では、試料３２２は、２つのタイプの標的細胞、すなわち、第１の標的細胞３２４および第２の標的細胞３２６を含む。試料ポンプモジュール３２８は、試料容器３２０からマイクロ流体チップ３１０の試料入口３１２に試料３２２を一定の流量で供給するように構成されている。

入力細胞試料３２２は、処理のスループットおよびより高品質の標的細胞エンリッチメントを高めるために、いくつかの成分を激減させるようにプレエンリッチまたは前置フィルタ処理することができる。例えば、遠心分離または赤血球溶血が、人間の抹消血液試料内の赤血球を取り除くように実行することができ、それによって総細胞負荷を低減させるとともに、処理時間を減少させる。セルストレーナは、管または流路を詰まらせ得る、またはチップ内部のフローストリームを邪魔し得るある種の血塊／組織デブリを取り除くために使用され得る。次いで、試料は、ある体積の入力バッファ中で懸濁されるべきである。入力バッファは、細胞が沈殿しないまたは処理中の損失であることを確実にするように密度適合液体からなるべきである。図２を参照して上述したように、例えば、処理時間がより長く必要とされる場合、入力バッファの密度は、処理中に細胞がバッファの上層に流れるまたは容器の底への沈降するのを防ぐために、細胞の密度の近くに調整されるべきである。

システム３００は、希釈剤バッファ液３３２を収容する希釈剤バッファ容器３３０をさらに備える。希釈剤バッファポンプモジュール３３４は、希釈剤バッファ容器３３０からマイクロ流体チップ３１０の希釈剤バッファ入口３１４に希釈剤バッファ液３３２を一定の流量で供給するように構成されている。

図３に示した実施形態では、マイクロ流体チップ３１０は、３つの出力、すなわち、第１の試料出口３１６と、第２の試料出口３１７と、廃棄物出口３１８とを有する。システム３００は、３つの出力容器、すなわち、第１の試料出力容器３４０と、第２の試料出力容器３５０と、廃棄物出力容器３６０とをさらに備える。マイクロ流体チップ３１０の第１の試料出口３１６は、第１の捕集弁３４２に結合されている。第１の捕集弁３４２は、第１の試料出口からの出力が、第１の試料出力容器３４０に結合された第１の試料出力ブランチ３４４に接続されるか、廃棄物出力容器３６０に結合された廃棄物出力ブランチ３６２に接続されるかのどちらかを制御するように構成されている。マイクロ流体チップ３１０の第２の試料出口３１７は、第２の捕集弁３５２に結合されている。第２の捕集弁３５２は、第２の試料出口３１７からの出力が、第２の試料出力容器３５０に結合された第２の試料出力ブランチ３５４に結合されるか、廃棄物出力容器３６０に結合された廃棄物出力ブランチ３６２に結合されるかのどちらかを制御するように構成されている。マイクロ流体チップ３１０の廃棄物出口３１８は、廃棄物出力ブランチ３６２に結合されている。

コントローラ３７０は、第１の比率および第２の比率を監視するように構成されている。第１の比率は、第１の試料出口３１６からの流量の、廃棄物出口３１８からの流量に対する比率である。第２の比率は、第２の試料出口３１７からの流量の、廃棄物出口３１８からの流量に対する比率である。コントローラ３７０は、第１の規則にしたがって第１の比率を用いて第１の捕集弁３４２を制御するように構成されている。第１の規則は、以下の通りとすることができ、すなわち、第１の比率が第１の値範囲内である場合、第１の試料出力ブランチ３４４を介して第１の試料出口３１６からの流れを第１の試料出力容器３４０に向け、第１の比率が第１の値範囲外である場合、廃棄物出力ブランチ３６２を介して第１の試料出口３１６からの流れを廃棄物出力容器３６０に向ける。コントローラ３７０は、第２の規則にしたがって第２の比率を用いて第２の捕集弁３５２を制御するように構成されている。第２の規則は、以下の通りとすることができ、すなわち、第２の比率が第２の値範囲内である場合、第２の試料出力ブランチ３５４を介して第２の試料出口３１７からの流れを第２の試料出力容器３５０に向け、第２の比率が第２の値範囲外である場合、廃棄物出力ブランチ３６２を介して第２の試料出口３１７からの流れを廃棄物出力容器３６０に向ける。

システム３００の動作は、以下の通りである。試料が調製されると、試料ポンピングモジュール３２８が、細胞懸濁試料をマイクロ流体チップ３１０へ供給する。何らかの希釈剤バッファ液３３０が必要とされる場合、希釈剤バッファポンプモジュール３２４は、希釈剤バッファ液体を所定の流量で供給し、マイクロ流体チップ内部の流量は、平衡を保つように許可される。

コントローラ３７０は、入力流量を制御する。上記で説明したように、コントローラ３７０は、規則にしたがって第１の試料捕集弁３４２、および第２の試料捕集弁３５２も制御する。これらの規則は、第１の試料出口の流れの、廃棄物出口の流れに対する比率、および第２の試料出口の流れの、廃棄物出口の流れに対する比率に基づいている。これらの比率の一方が規則によって設定される範囲外である場合、コントローラ３７０は、第１の試料捕集弁３４２または第２の試料捕集弁３５２に、第１の試料出口３１６および／または第２の試料出口３１７からの流れを廃棄物出力ブランチ３６２へ切り換えさせる。流量比率が規則によって設定される範囲外であるとき、これは、マイクロ流体チップ３１０中のデブリまたは気泡によって引き起こされ得る異常が存在することを示す。そのような異常は、マイクロ流体チップ３１０による標的細胞の分離を妨げ、したがって出力は、流量比率が異常である間、廃棄物出力容器３６０へ切り換えられる。試料出力および廃棄物出力ブランチの抵抗を制御する（これらのブランチ間の等しい圧力降下を確実にする）ことによって、流量比率を一定にすることができる。抵抗は、試料出口および廃棄物出口を結合する経路（図４の１２４および１２８）、ならびに試料出力ブランチおよび廃棄物出力ブランチにおけるシステム内の管の寸法を設計することによって抵抗をマイクロ流体チップに設計することで設定することができる。

図３に示した実施形態では、マイクロ流体チップ３１０は、１つの試料入口３１２と、１つの希釈剤バッファ入口３１４と、２つの試料出口３１６、３１７と、１つの廃棄物出口３１８とを有する。入口および出口の個数の変更がなされてもよいことを理解されたい。例えば、実施形態は、試料入口を有するとともに希釈剤バッファ入口を有さないことが予見される。さらに、実施形態は、単一の試料出口または複数の試料出口を含むこともできる。ポンピングモジュールおよび試料捕集弁の個数は、マイクロ流体チップに関する入口および出口の個数にしたがって変更される。

図４は、本発明の実施形態と共に使用することができるマイクロ流体チップの一例を示す。図４に示したマイクロ流体チップは、１つの試料入口と、１つの希釈剤バッファ入口と、１つの試料出口と、１つの廃棄物出口とを有することに留意されたい。

図４は、本発明の実施形態と共に使用することができる国際特許出願ＰＣＴ／ＳＧ２０１３／０００４４２（ＷＯ２０１５／０５７１５９として公開済み）に記載されたバイオチップ設計の概略図を示す。マイクロ流体デバイス１００は、螺旋状曲線マイクロ流路１１０を備える。試料入口Ｓ_Ｉ１１２および希釈剤バッファ入口Ｂ_Ｉ１１４は、螺旋状曲線マイクロ流路１１０の中央領域に位置する。試料入口結合経路１１６は、試料入口を螺旋状曲線マイクロ流路１１０に結合する。バッファ入口結合経路１１８は、希釈剤バッファ入口１１４を螺旋状曲線マイクロ流路１１０に結合する。試料入口結合経路１１６および希釈剤バッファ入口結合経路１１８は、螺旋状曲線マイクロ流路１１０の上流端における合流点１２０で連結する。螺旋状曲線マイクロ流路１１０の下流端には、二叉分岐１２２が存在し、ここで流路は、試料出口結合経路１２４と廃棄物出口結合経路に分かれる。試料出口結合経路１２４は、試料出口Ｓ_Ｏ１２６に接続されているとともに、 廃棄物出口結合経路１２８は、廃棄物出口Ｗ_Ｏ１３０に接続されている。試料は、流路湾曲部の外側から螺旋状曲線マイクロ流路１１０に導入される。細胞は、希釈剤バッファの助けにより外側流路壁に並ぶ。曲線状螺旋マイクロ流路１１０は、ＣＴＣなどの大きい細胞をＷＢＣおよびＲＢＣなどの小さい細胞から分離するように構成されている。曲線状螺旋マイクロ流路１１０の寸法は、より小さい細胞がディーン力の影響下で流路を横切って移動する一方、大きい細胞が集中して単一の平衡位置を占めるようになされるように選択される。これは、ディーンサイクルの半分の後に、大きい細胞と小さい細胞の両方が流路の内側を占めることを意味する。曲線状セクションの端部までの長さは、より小さい細胞が１ディーンサイクルを終えているように選択される。したがって、曲線状セクションの端部において、より小さい細胞は、１ディーンサイクルを終了しており、流路の外側に移動していることになる。したがって、二叉分岐１２２において、より大きいＣＴＣは、内側流路壁に集められ、試料出口１２６から捕集されるのに対して、より小さい細胞は、外側流路壁で分離流にあり、廃棄物出口１３０から出て行く。

図５は、標的細胞の下流分析に使用され得るファクタを示す。標的細胞は、ＣＴＣなどの癌細胞であり得る。典型的には、癌細胞は、正常な細胞とは異なるサイズおよび形態と構造を示す。したがって、下流分析に使用されるファクタの１つは、細胞のサイズおよび形態と構造５１０である。体細胞一塩基突然変異、構造多型、および染色体融合などの遺伝子異常は、癌細胞においてはっきり見える。癌細胞の遺伝子およびタンパク質発現プロファイルは、その組織起源および悪性度に応じて、他の細胞タイプとはやはり異なる。癌細胞のこれらの異なった特徴に基づいて、試料出力容器内に捕集される細胞の下流分析は、癌細胞およびその分子プロファイルを同定するように実行され得る。

図５に示すように、細胞内５３０または膜表面上５６０のタンパク質マーカーの免疫染色５２０は、細胞のタイプまたは特徴を特定するために特定の標的タンパク質の発現を視覚的に評価するように実行され得る。核染色は、核酸蛍光標識化によって実行され、視覚的に観察することができる。核酸の分子特徴付けは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）またはサンガーシーケンシング、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ドロップレットデジタルＰＣＲ、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、および蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）による核酸のシーケンシングによって行うことができ、関心の核酸のコピー数は、これらの方法によって推測することもできる。循環腫瘍細胞の形態学的分析は、細胞５１０およびその核５４０のサイズおよび形状に基づいて実行することができる。

図６Ａおよび図６Ｂは、形態学的ベースの手法および免疫細胞化学手法を用いた悪性腫瘍細胞の同定を示す。図６Ａは、背景に対して細胞のコントラストを高め、悪性細胞の直接視覚化および同定を可能にするパパニコロウ染色法、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）、およびギムザ染色（Geimsa staining）などの形態学的ベースの手法を示す。

図６Ｂは、陰性マーカーとしてＣＤ４５抗体、および腫瘍細胞の陽性同定のための抗体カクテル（サイトケラチン８，１８，１９、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ１３３、ＴＴＦ−１、Ｎａｐｓｉｎ、ＥＧＦＲなど）を用いた使用などの免疫細胞化学の使用の例を示す。図６Ｂでは、循環腫瘍細胞は、核酸マーカー−ＤＡＰＩ、上皮マーカー−サイトケラチン８，１８，１９、および免疫チェックポイント回避マーカー−ＰＤ−Ｌ１について陽性に標識化され、一方、リンパ球マーカー−ＣＤ４５について陰性に標識化される。

図７Ａおよび図７Ｂは、それぞれ、ＦＩＳＨおよびＰＣＲベースの手法などの分子ベースの手法を用いた腫瘍細胞の特徴付けを示す。

図７Ａに示すように、染色体異常のＦＩＳＨ検出は、染色体増幅、多倍数性、異数性（左）、および遺伝子融合（右）などの遺伝子異常がしばしば存在する腫瘍細胞を同定するように実行することができる。

図７Ｂは、点突然変異の検出を示す。左のパネルは、腫瘍細胞のサンガーシーケンシングを用いてＫＲＡＳ腫瘍遺伝子における点突然変異（矢印で示されるピーク）の検出を示す。右のパネルは、アレル特異的ベースのｑＰＣＲアッセイを用いてＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ突然変異の蛍光検出を示す。

図８は、リキッドバイオプシーからエンリッチされる癌細胞が次世代シーケンシングのために処理され得る例を示す。工程８０２において、リキッドバイオプシーが行われる。工程８０４において、癌細胞は、本明細書に記載されるようなエンリッチメントシステムを用いてエンリッチされる。これにより、エンリッチされた癌細胞８０６を用意する。癌細胞エンリッチメント後に、核酸抽出が、ピュアＤＮＡまたはＲＮＡを得るために工程８０８において実行できる。工程８１２において、核酸標的領域は、適切なシーケンシングライブラリキットを用いて増幅またはエンリッチすることができる。これは、増幅された標的ＤＮＡまたはＲＮＡライブラリ８１４という結果になる。工程８１６において、シーケンシングライブラリテンプレートは、適切なシーケンサ上でさらにエンリッチおよび配列決定されてもよい。シーケンシング結果８１８は、（一塩基または構造の）突然変異、コピー数多型、遺伝子発現、およびスプライスバリアント８２２を含む任意の遺伝子パターンまたはトランスクリプトームパターンを見つけるために、工程８２０において分析される。

上述したように、視覚的および分子プロファイリングは、転移のリスク、予後、個別の治療決定をとる治療目標などの疾病情報を推測するために解釈することができる。例えば、ＦＩＳＨによって検出されるＡＬＫの染色体転位、サンガーシーケンシングによって検出されるＫＲＡＳ突然変異、およびＥＧＦＲ Ｌ８５８ＲのｑＰＣＲ検出は、特定のアンタゴニストについての治療目標をもたらす。エンリッチされた癌細胞の次世代シーケンシングは、癌の病因に関連し得る突然変異、コピー数の変化、遺伝子発現の変化、またはＲＮＡスプライスバリアントの検出に役立ち得る。加えて、ＣＴＣの分子プロファイリングは、治療戦略および新規なバイオマーカーの発見のために、転移および癌進行の進展および機構への研究およびより良い理解を可能にする。

図９は、本発明の一実施形態による標的細胞をエンリッチするシステムを示す。システム９００は、マイクロ流体チップ９１０を備える。マイクロ流体チップ９１０は、図４に関連して上述した形態であり得る。マイクロ流体チップ９１０は、試料入口９１２と、希釈剤バッファ入口９１４と、試料出口９１６と、廃棄物出口９１８とを有する。チップインタフェース９１１は、マイクロ流体チップ９１０とマイクロ流体チップの入口および出口と流体連通している管との間の漏れ止めシールを用いて結合を与える。

試料容器９２０は、エンリッチされる標的細胞を含む試料液を収容する。本実施形態においてシリンジである試料入力ポンプ９２８は、入力ポンプ切換弁ＩＰＶ９２３を介して試料容器９２０に結合されている。シリンジは、コントローラ９７０によって制御されるシリンジポンプに取り付けることができる。試料入力ポンプ９２８は、入力細胞試料を外部容器からエンリッチメントプラットフォームに吸い込み、マイクロ流体チップを通じてポンピングするように構成されている。入力ポンプ切換弁ＩＰＶ９２３は、入力細胞試料容器９２０とマイクロ流体チップ９１０の試料入口９１２との間で切り換わるように構成されている。管Ｔ９ａは、試料容器９２０と入力ポンプ切換弁ＩＰＶ９２３を接続する。入力検出器９２１は、管Ｔ９ａに配置されている。入力検出器９２１の目的は、何らかの空気または空気の気泡が試料入力ポンプ９２８に入るのを防ぐことである。空気の気泡は、多くのマイクロ流体チップの動作にとって破滅的であり得、流体流ラインを途絶させることによって分離品質に悪影響を及ぼし得る。したがって、空気が流体ネットワークに入らないことを確実にすることが重要である。

管Ｔ８は、試料入力ポンプ９２８を入力ポンプ切換弁ＩＰＶ９２３に接続する。入力圧力変換器９２５は、管Ｔ８に位置する。入力圧力変換器９２５は、試料入力ポンプ９２８が所望の速度でポンピングしていることを確実にするためにポンピング中に入力ポンプ圧力を測定する圧力変換器である。管Ｔ７は、入力ポンプ切換弁ＩＰＶ９２３をマイクロ流体チップ９１０の試料入口９１２に接続する。

希釈剤容器９３０は、希釈剤バッファ液を収容する。希釈剤バッファは、処理中に高い細胞完全性を維持するために等張液を含む。希釈剤バッファは、細胞が受ける剪断を低減し、生存率を保つために表面活性剤溶液と共に補足することもできる。マイクロ流体チップの小さい寸法により、これらのチップ内の剪断速度は、 とても高くなり得、細胞完全性（細胞は膨らむことができ）、および生存率（細胞の死）に悪影響を及ぼし得る。これらの剪断の影響を最小限にするために、希釈剤バッファおよび入力細胞試料バッファが、「細胞クッション材」の効果を提供するとともに細胞を無傷に保つ表面活性剤を含む。

本実施形態においてシリンジである希釈剤ポンプ９３４は、希釈剤ポンプ切換弁ＤＰＶ９３３を介して希釈剤容器９３０に結合されている。希釈剤ポンプ９３４は、希釈剤バッファ液を希釈剤容器９３０からエンリッチメント プラットフォームに吸い込んでポンピングし、マイクロ流体チップ９１０を通じてポンピングするように構成されている。希釈剤ポンプ切換弁ＤＰＶ９３３は、マイクロ流体チップ９１０の希釈剤容器９３０と希釈剤入口 ９１４との間で切り換わるように構成されている。管Ｔ６ａは、希釈剤容器９３０と希釈剤ポンプ切換弁ＤＰＶ９３３を接続する。希釈剤検出器９３１は、管Ｔ６ａに位置する。希釈剤検出器９３１は、何らかの空気または空気の気泡が希釈剤ポンプに入るのを防ぐ。空気の気泡は、多くのマイクロ流体チップの動作にとって破滅的であり得、流体流ラインを途絶させることによって分離品質に悪影響を及ぼし得る。したがって、空気が流体ネットワークに入らないことを確実にすることが重要である。希釈剤検出器９３１は、液体検出センサである。希釈剤検出器９３１が、管Ｔ６ａを流れる希釈剤を検出しない（すなわち、センサが起動される）場合、コントローラ９７０は、希釈剤容器９３０を希釈剤で補充する／入れ替えるようにユーザにメッセージを送信する。

管Ｔ５は、希釈剤ポンプ切換弁ＤＰＶ９３３と希釈剤ポンプ９２４を接続する。希釈剤圧力変換器９３５は、管Ｔ５に位置する。希釈剤圧力変換器９３５は、希釈剤ポンプ９２４が所望の速度でポンピングしていることを確実にするためにポンピング中に希釈剤バッファ圧力を測定する圧力変換器である。

管Ｔ４は、希釈剤ポンプ切換弁ＤＰＶ９３３を気泡除去器９３７に接続する。管Ｔ２は、気泡除去器９３７を逆止弁ＣＶ９３９に接続する。管Ｔ１は、逆止弁ＣＶ９３９をマイクロ流体チップ９１０の希釈剤入口９１４に接続する。希釈剤検出器９３１は、閾値限界を有し、これよりも上で、それは、空気の気泡を検出し、警告をトリガすることができる。しかしながら、より小さい気泡は、希釈剤検出器９３１を起動させることなくない通過することができる。次いで、これらの気泡は、気泡除去器９３７によって取り除くことができ、気泡除去器９３７は、空気の逃させる空気透過性膜を備えることができ、これによって空気の気泡を取り除く。別の実施形態では、気泡除去器９３７は、空気の気泡を希釈剤バッファから吸い出すために真空ポンプを備えてもよい。

マイクロ流体チップ９１０の試料出口９１６は、管Ｔ１１によって出力切換弁ＯＰＶ９４２に接続されている。出力切換弁ＯＰＶ９４２は、ＣＴＣ試料捕集容器９４０と廃棄物容器９６０との間で試料出口９１６の出力を切り換えるように構成されている。管Ｔ１０は、出力切換弁ＯＰＶ９４２の出力の一方をＣＴＣ試料捕集容器９４０に接続する。管Ｔ１２は、出力切換弁ＯＰＶ９４２の他方の出力を接続し、廃棄物出力ブランチ９６２の一部を形成する。廃棄物出力ブランチ９６２は、マイクロ流体チップ９１０の廃棄物出口９１８を接続する管Ｔ１３ａをさらに備える。管Ｔ１３ｂは、出力切換弁ＯＰＶ９４２から延びる管Ｔ１２およびマイクロ流体チップ９１０の廃棄物出口９１８から延びる管Ｔ１３ａを流量センサ９６１と接続する。さらなる管Ｔ１４ａは、流量センサ９６１から廃棄物容器９６０まで延びる。

流量センサ９６１は、Ｔ１１とＴ１３ａとの間の流量比率が分離段階中に獲得できることを確実にするために、出力側で流量をモニタする。例えば、２出力のバイオチップについての標的細胞出力と廃棄物出力との間の流量比率は、したがって、エンリッチメントの品質を評価するためのパラメータとして使用されている。この比率が設定値よりも低い場合、細胞が廃棄物により多く失われるにつれて、標的細胞（悪性腫瘍細胞）の回復は、低下し得る。反対に、この比率が設定値よりも高い場合、標的細胞を用いて捕集される汚れた非標的細胞がより多くなり、したがってエンリッチメントを低下させる。この比率は、出力管抵抗、および開口圧力がよく制御できないので、手動操作中にかなり変わり得る。

コントローラ９７０は、流量センサ９６１の出力をモニタし、出力切換弁ＯＰＶ９４２を制御する。したがって、出力切換弁ＯＰＶ９４２は、ＣＴＣ試料容器９４０と廃棄物容器９６０との間でマイクロ流体チップ９１０の試料出口９１６の切り換えを行う。出力切換弁ＯＰＶ９４２は流量センサ９６１と共に、信頼できるエンリッチメントを実現するのを助ける。例えば、Ｔ１１とＴ１３ａとの間の流量比率が所望の範囲から出ている場合、この弁は切り換えることができ、Ｔ１１からの全出力を廃棄物へ向け、それによってエンリッチされたＣＴＣ試料の品質を損なわない。流量比率が所望の範囲内に戻ると、ＯＰＶは、逆に切り換わり、エンリッチされた標的（ＣＴＣ）細胞をＣＴＣ容器内に捕集することができる。

新しい入力細胞試料がこの自動エンリッチメントプラットフォームに装填されるとき、コントローラ９７０は、以下のようにプロセスを制御することができる。ユーザは、入力試料およびマイクロ流体チップに基づいて所望の実行プロトコルを選択することができる。 開始されると、コントローラ９７０は、希釈剤ポンプ切換弁ＤＰＶ９３３が希釈剤バッファ容器９３０に切り換わり、希釈剤ポンプ９３４がこの試料を処理するのに必要な希釈剤バッファを吸い込むのを制御する。同様に、コントローラ９７０は、入力ポンプ切換弁ＩＰＶ９２３が切り換わり、入力ポンプ９２８が入力容器９２０から入力細胞試料を吸い込むのを制御する。２つのポンプが適切な量の希釈剤バッファおよび試料を吸い込むと、希釈剤ポンプ切換弁ＤＰＶ９３３および入力ポンプ切換弁ＩＰＶ９２３は、チップインタフェース９１１を介してポンプをマイクロ流体チップ９１０に切り換えて接続するために、コントローラ９７０によって制御される。

試料および希釈剤バッファがマイクロ流体チップ９１０を通じて流れるとき、標的細胞（ＣＴＣ）は、慣性力およびディーン流れを用いて残りの細胞から分離される。次いで、標的細胞は、試料出口９１６および管Ｔ１１に向けられ、ＣＴＣ試料容器９４０内に捕集され、一方、非標的細胞は、廃棄物出力ブランチ９６２を介して廃棄物容器９６０内に捕集される。流量センサ９６１は、所定の流量比率が実現されていることを確実にするために、分離プロセス全体にわたって流量をモニタする。マイクロ流体チップ９１０を通じての全流量が、入力ポンプ９２８および希釈剤ポンプ９３４を制御するコントローラ９７０によって制御されるとき、廃棄物出力ブランチを通じての流量を測定することによって、流量比率を計算することができる。任意の例において、所定の流量比率からの偏差が検出される場合、コントローラ９７０は、流れ変動期間中にＣＴＣ試料容器９４０内で出力が収集されないことを確実にするために、出力切換弁ＯＰＶ９４２にその出力を廃棄物出力ブランチ９６２に切り換えさせる。マイクロ流体チップ内の流れが再安定すると、出力切換弁ＯＰＶ９４２は、コントローラ９７０を逆に切り換えてマイクロ流体チップ９１０の試料出口９１６から ＣＴＣ試料容器９４０へ出力することによって制御される。許容範囲外の大きい流れの変動は、分離品質に悪影響を及ぼし得る。許容可能な流量変動の範囲は、９６１において測定される流量について、例えば５％または１０％の割合であり得る。

一実施形態では、システムは、マイクロ流体チップ９１０の試料出口９１６を出力切換弁ＯＰＶ９４２に接続する管Ｔ１１に配置されている第２の流量センサを備える。

当業者は、形態および細部の様々な修正および変更が、添付の特許請求の範囲によって定められる本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された実施形態になされてもよいことを理解するであろう。

Claims (27)

1. 試料中の標的細胞をエンリッチするシステムであって、
   試料入口、試料出口、廃棄物出口、およびマイクロ流体流路を備えるマイクロ流体チップであって、前記試料入口は前記マイクロ流体流路の上流端に結合され、前記試料出口および前記廃棄物出口は前記マイクロ流体流路の下流端に結合され、前記マイクロ流体チップは標的細胞が前記試料出口に向けられるとともに非標的細胞が前記廃棄物出口に向けられるように構成される、マイクロ流体チップと、
   前記マイクロ流体チップの前記試料入口に前記試料を導入するように構成される試料入力ポンプと、
   前記マイクロ流体チップの前記試料出口または前記廃棄物出口で流量を測定するように構成される第１の出力流量検出器と、
   前記マイクロ流体チップの試料出力が試料出力容器に結合されている第１の構成と前記マイクロ流体チップの前記試料出力が廃棄物出力容器に結合されている第２の構成との間で切り換え可能な構成を有する試料捕集切換弁と、
   前記第１の出力流量検出器によって測定される前記流量を用いて前記試料捕集切換弁の前記構成を制御するように構成されるコントローラであって、前記試料出口と前記廃棄物出口との間の流量比率を決定するように構成されるとともに、前記流量比率を所定の流量比率範囲と比較し、前記流量比率が前記所定の流量比率範囲外である場合に、前記試料捕集切換弁を前記第２の構成へ切り換えるようにさらに構成される、コントローラと、
   を備えるシステム。
2. 前記コントローラは、前記第１の出力流量検出器によって測定される前記流量を所定の流量値範囲と比較するように構成され、前記コントローラは、前記第１の出力流量検出器によって測定される前記流量が前記所定の流量値範囲外である場合に、前記試料捕集切換弁を前記第２の構成に切り換えるようにさらに構成される、請求項１に記載のシステム。
3. 前記コントローラは、前記第１の出力流量検出器によって測定される前記流量と前記マイクロ流体チップを通じての全流量とから前記流量比率を決定するように構成されている、請求項１に記載のシステム。
4. 前記第１の出力流量検出器は前記廃棄物出口における流量を測定するように構成され、さらに前記システムは、前記マイクロ流体チップの前記試料出口における流量を測定するように構成された第２の出力流量検出器と、を備え、前記コントローラは、前記第１の出力流量検出器によって測定される前記廃棄物出口における前記流量、および前記第２の出力流量検出器によって測定される前記試料出口における前記流量から前記流量比率を決定するように構成されている、請求項１に記載のシステム。
5. 前記試料は、処理中に前記標的細胞が前記試料中に均一に懸濁されるように選択される密度を有する密度適合液体を含む、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載のシステム。
6. 前記マイクロ流体チップは、さらに、前記マイクロ流体流路の上流端に結合された希釈剤入口を含み、前記システムは、さらに、希釈剤バッファを前記希釈剤入口に導入する希釈剤入口ポンプを含む、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載のシステム。
7. 前記希釈剤バッファは、等張液を含む、請求項６に記載のシステム。
8. 前記希釈剤バッファは、表面活性剤溶液を含む、請求項６又は請求項７に記載のシステム。
9. さらに、前記希釈剤バッファから気泡を除去するように配置された気泡除去器を含む、請求項６〜請求項８のいずれか一項に記載のシステム。
10. 前記試料は、血液試料または血液成分を含有する、請求項１〜請求項９のいずれか一項に記載のシステム。
11. 前記標的細胞は、循環腫瘍細胞である、請求項１〜請求項１０までのいずれか一項に記載のシステム。
12. 前記マイクロ流体流路は、螺旋状または曲線状セクションを備える、請求項１〜請求項１１までのいずれか一項に記載のシステム。
13. マイクロ流体チップを用いて試料中の標的細胞をエンリッチする方法であって、前記マイクロ流体チップは、試料入口、試料出口、廃棄物出口、およびマイクロ流体流路を備え、前記試料入口は前記マイクロ流体流路の上流端に結合され、前記試料出口および前記廃棄物出口は前記マイクロ流体流路の下流端に結合され、前記マイクロ流体チップは標的細胞が前記試料出口に向けられるとともに非標的細胞が前記廃棄物出口に向けられるように構成されており、
    前記マイクロ流体チップの前記試料入口に前記試料を導入するステップと、
    前記マイクロ流体チップの前記試料出口または前記廃棄物出口で流量をモニタするステップと、
    モニタした前記流量を用いて試料捕集切換弁の前記構成を制御するステップであって、前記試料捕集切換弁は、前記マイクロ流体チップの試料出力が試料出力容器に結合されている第１の構成と前記マイクロ流体チップの前記試料出力が廃棄物出力容器に結合されている第２の構成との間で切り換え可能な構成を有する、ステップと、
    前記試料出口と前記廃棄物出口との間の流量比率を決定し、前記流量比率を所定の流量比率範囲と比較し、前記流量比率が前記所定の流量比率範囲外である場合に、前記試料捕集切換弁を前記第２の構成に切り換えるステップである、ステップと、
    を含む方法。
14. 前記マイクロ流体チップの前記試料入口に前記試料を導入する前に、密度適合液体中で前記試料を懸濁させるステップをさらに含み、前記密度適合液体は、処理中に前記標的細胞が前記試料中に均一に懸濁されるように選択される密度を有する、請求項１３に記載の方法。
15. 前記マイクロ流体チップの前記試料入口に前記試料を導入する前に、前記試料に対して遠心分離および／または血液溶解を実行するステップをさらに含む、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
16. 前記モニタした前記流量を所定の流量値範囲と比較し、前記モニタした前記流量が前記所定の流量値範囲外である場合に、前記試料捕集切換弁を前記第２の構成に切り換えるステップをさらに含む、請求項１３〜請求項１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記流量比率を決定するステップは、前記モニタした前記流量と前記マイクロ流体チップを通じての全流量から前記流量比率を決定することを含む、請求項１３に記載の方法。
18. 前記モニタした前記流量が前記マイクロ流体チップの前記廃棄物出口における流量であって、前記方法は、さらに、前記試料出口における流量を測定するステップを含み、前記流量比率を決定するステップは、前記モニタしたした流量および前記測定した前記試料出口における前記流量から前記流量比率を決定するステップを含む、請求項１３に記載の方法。
19. 前記マイクロ流体チップは、さらに、前記マイクロ流体流路の上流端に結合された希釈剤入口を含み、前記方法は、さらに、希釈剤バッファを前記希釈剤入口に導入する工程を含む、請求項１３〜請求項１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記希釈剤バッファは、等張液を含む、請求項１９に記載の方法。
21. 前記希釈剤バッファは、表面活性剤溶液を含む、請求項１９又は請求項２０に記載の方法。
22. さらに、前記希釈剤バッファを前記希釈剤入口に導入する前に前記希釈剤バッファから気泡を除去する工程を含む、請求項１９〜請求項２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記試料は、血液試料または血液成分を含有する、請求項１３〜請求項２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記標的細胞は、循環腫瘍細胞である、請求項１３〜請求項２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記マイクロ流体流路は、螺旋状または曲線状セクションを備える、請求項１３〜請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 試料を分析する方法であって、
    請求項１３〜請求項２５のいずれか一項に記載の方法を用いて前記試料中の標的細胞をエンリッチするステップと、
    診断用途のためにエンリッチされた前記標的細胞を分析するステップと、を含む方法。
27. 診断用途のためにエンリッチされた前記標的細胞を分析するステップは、細胞内および／または細胞外のタンパク質マーカーの検出、細胞および核の形態と構造の分析、ならびに／または次世代シーケンシング（ＮＧＳ）および／またはサンガーシーケンシング、および／もしくはデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および／もしくはドロップレットデジタルＰＣＲ、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、および／もしくは蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ならびに／または関心の核酸のコピー数多型による核酸のシーケンシングによる分子特徴付けを含む、請求項２６に記載の方法。

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