CN109072149B - 用于富集样本中的靶细胞的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

揭示了一种用于富集样本中的靶细胞的系统。该系统包括微流体芯片，其包括样本入口、样本出口、废物出口和微流体通道，样本入口耦合至微流体通道的上游端，而样本出口和废物出口耦合至微流体通道的下游端，微流体芯片被配置成使得靶细胞被定向至样本出口而非靶细胞被定向至废物出口；样本输入泵，其被配置成将样本引入到微流体芯片的样本入口中；输出流速检测器，其被配置成测量微流体芯片的样本出口和/或废物出口处的流速；样本收集开关阀，其具有可在第一配置与第二配置之间切换的配置，在第一配置中，微流体芯片的样本输出耦合至样本输出容器，而在第二配置中，微流体芯片的样本输出耦合至废物输出容器；以及控制器，其被配置成使用由输出流速检测器测量的流速来控制样本收集开关阀的配置。

Description

用于富集样本中的靶细胞的系统和方法
发明领域
本发明的实施例涉及肿瘤学和诊断测试领域。更具体地，本发明的实施例涉及用于来对自样本的靶细胞的富集和识别的系统和方法。
背景
癌细胞通过作为循环肿瘤细胞(CTC)的血液从原发肿瘤扩散，并侵袭远处形成转移性病变。癌细胞在其它培养基中扩散或积累的其他方式包括胸腔积液、腹膜液、尿或其组合。高达90％的癌症相关死亡是归因于转移，癌症扩散到远处。循环中的恶性肿瘤细胞提供了关于转移侵袭性的信息和对原发肿瘤或预兆转移病变的分子洞察力。这些恶性细胞以极低的频率存在；在十亿(109)个血细胞中可发现约1-10个CTC。它们的稀有性，加上高度异质性，迄今限制了CTC对于临床监测和癌症管理的使用。
富集CTC的一种方法是使用基于惯性微流控技术的生物芯片设计，包括基于靶细胞的物理或机械特性在细胞悬浮缓冲液中分选/富集靶细胞。这些技术能够耗尽样本的非靶向成分，这些成分大多被认为是使用各种下游分析技术成功识别恶性肿瘤细胞的污染物。
基于微流体的生物芯片的性能容易受到外部因素的影响,诸如泵送模块中的脉动、气泡和压力变化。在富集平台的情况下，压力和阻力的变化会影响富集的质量。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了一种用于富集样本中的靶细胞的系统。该系统包括微流体芯片，其包括样本入口、样本出口、废物出口和微流体通道，样本入口耦合至微流体通道的上游端，而样本出口和废物出口耦合至微流体通道的下游端，微流体芯片被配置成使得靶细胞被定向至样本出口而非靶细胞被定向至废物出口；样本输入泵，其被配置成将样本引入到微流体芯片的样本入口中；输出流速检测器，其被配置成测量微流体芯片的样本出口和/或废物出口处的流速；样本收集开关阀，其具有可在第一配置与第二配置之间切换的配置，在第一配置中，微流体芯片的样本输出耦合至样本输出容器，而在第二配置中，微流体芯片的样本输出耦合至废物输出容器；以及控制器，其被配置成使用由输出流速检测器测量的流速来控制样本收集开关阀的配置。
例如，两个输出生物芯片的靶细胞输出与废物输出之间的流速比可被用作评估富集质量的参数。如果该比低于设定值，则靶细胞(恶性肿瘤细胞)的恢复可能随着更多的细胞丢失到废物而减少。相反，如果所述比高于设定值，则将有更多污染的非靶细胞将与靶细胞一起被收集，从而减少富集。在手动操作过程中，该比可能因输出管阻力而显著变化，而开启压力可能无法被很好地控制。
在一实施例中，控制器被配置成将由输出流速检测器测量的流速与预定范围的流速值进行比较，并且控制器被进一步配置成如果由输出流速检测器测量的流速在预定流速值范围以外，则将样本收集开关阀切换到第二配置。
预定范围的流速可以是预定流速的10％或5％内的范围。
在一实施例中，控制器被配置成确定样本出口与废物出口之间的流量比，并且被进一步配置成将该流量比与预定范围的流量比作比较并且如果该流量比在预定范围的流量比以外，则将样本收集开关阀切换到第二配置。
在一实施例中，控制器被配置成根据由输出流速检测器测量的流速和通过微流体芯片的总流速来确定流量比。
在一实施例中，系统包括配置成测量样本出口处的流速的第一输出流速检测器和配置成测量微流体芯片的废物出口处的流速的第二输出流速检测器，其中控制器被配置成根据由第一流速检测器测量的第一流速和由第二流速检测器测量的第二流速来确定流量比。
在一实施例中，样本包括密度匹配液体，其具有选择成使得靶细胞均匀悬浮在样本中的密度。
在一实施例中，微流体芯片进一步包括耦合至微流体通道的上游端的稀释剂入口并且该系统进一步包括配置成将稀释剂缓冲液引入到稀释剂入口的稀释剂入口泵。
稀释剂缓冲液可包括等渗溶液；和/或表面活性剂溶液。稀释剂缓冲液中的等渗溶液可在工艺期间帮助维护高细胞完整性。表面活性剂溶液可降低细胞所经历的剪切力，并且因此维持细胞活力。
在一实施例中，系统进一步包括安排成从稀释剂缓冲液去除气泡的除泡器。
样本可包括血液样本。靶细胞可以是循环肿瘤细胞。
在一实施例中，微流体通道包括螺旋形或曲线形截面。
根据本发明的第二方面，提供了一种使用微流体芯片来富集样本中的靶细胞的方法。该微流体芯片包括样本入口、样本出口、废物出口和微流体通道，样本入口被耦合至微流体通道的上游端，而样本出口和废物出口被耦合至微流体通道的下游端，微流体芯片被配置成使得靶细胞被定向至样本出口而非靶细胞被定向至废物出口。该方法包括：将样本引入到微流体芯片的样本入口中；监视微流体芯片的样本出口和/或废物出口处的流速；使用所监视的流速来控制样本收集阀的配置，样本收集开关阀具有可在第一配置与第二配置之间切换的配置，在第一配置中，微流体芯片的样本输出耦合至样本输出容器，而在第二配置中，微流体芯片的样本输出耦合至废物输出容器。
在一实施例中，该方法进一步包括在将样本引入到微流体芯片的样本入口中之前，将样本悬浮在密度匹配液体中，该密度匹配液体具有选择成使得靶细胞均匀地悬浮在样本中的密度。
在一实施例中，该方法进一步包括在将样本引入到微流体芯片的样本入口中之前对样本执行离心和或血液溶解。
在一实施例中，该方法进一步包括将所监视的流速与预定范围的流速值作比较，并且在由输出流速检测器测量的流速在预定范围的流速值以外时将样本收集开关阀切换至第二配置。
预定范围的流量可以是预定流量的10％或5％内的范围。
在一实施例中，该方法进一步包括确定样本出口与废物出口之间的流量比，将该流量比与预定范围的流量比作比较并且如果该流量比在预定范围的流量比以外，则将样本收集开关阀切换到第二配置。
在一实施例中，确定流量比包括根据微流体芯片的样本出口或废物出口的流速与通过微流体芯片的总流速来确定流量比。
在一实施例中，该方法包括测量样本出口处的第一流速以及测量微流体芯片的废物出口处的第二流速，其中确定流量比包括根据第一流速和第二流速确定流量比。
在一实施例中，微流体芯片进一步包括耦合至微流体通道的上游端的稀释剂入口并且该方法进一步包括将稀释剂缓冲液引入到稀释剂入口中。
稀释剂缓冲液可包括等渗溶液；和/或表面活性剂溶液。稀释剂缓冲液器中的等渗溶液可在工艺期间帮助维护高细胞完整性。表面活性剂溶液可降低细胞所经历的剪切力，并且因此维持细胞活力。
在一实施例中，该方法进一步包括在将稀释剂缓冲液引入到稀释剂入口之前从稀释剂缓冲液中去除气泡。
样本可包括血液样本。靶细胞可以是循环肿瘤细胞。
在一实施例中，微流体通道包括螺旋形或曲线形截面。
根据本发明的实施例，分析样本的方法包括使用上述方法富集样本中的靶细胞；以及分析经富集的靶细胞。
靶细胞的分析可包括检测细胞内和/或细胞外蛋白质标记物；分析细胞和核形态学；和/或通过下一代测序(NGS)和/或Sanger测序、和/或数字聚合酶链反应(PCR)、和/或液滴数字PCR、定量PCR(qPCR)和/或荧光原位杂交(FISH)对核酸测序进行分子表征；和/或感兴趣的核酸拷贝数变化。
附图的简要说明
以下，将参照附图作为非限定示例来描述本发明的实施例，其中：
图1是示出恶性肿瘤细胞的非侵入识别和分析的方法的流程图；
图2A到2D示出了制备阶段的样本悬浮液；
图3是根据本发明的实施例的用于富集靶细胞的系统的示意表示；
图4示出了可与本发明的实施例一起使用的微流体芯片的示例；
图5解说了可在靶细胞的下游分析中使用的因素；
图6A和6B示出了采用基于形态学和免疫细胞化学办法的恶性肿瘤细胞的识别；
图7A和7B示出了采用基于分子的办法(诸如基于FISH和PCR的办法)对肿瘤细胞的表征；
图8示出了从液体活检中富集的处理癌细胞可被处理用于下一代测序的示例；以及
图9示出了根据本发明实施例的用于富集靶细胞的系统。
详细描述
本发明的实施例涉及用于恶性肿瘤细胞的富集的方法，允许从癌症患者的生物流体中对这些恶性肿瘤细胞进行其下游识别和表征。
图1是示出恶性肿瘤细胞的非侵入标识和分析的方法的流程图。如图1中所示，该方法包括三个阶段：制备10；富集20；和下游分析30。
在一实施例中，基于与Dean流动力学结合的惯性集中原理的癌细胞富集方法20要求细胞的均匀悬浮，其随后由自动化系统处理以将恶性肿瘤细胞和其他细胞流入不同的收集管。细胞输出的下游视觉或分子分析30可被执行以识别肿瘤的特性，该肿瘤的特性指示该细胞确实是肿瘤性质并提供与癌症研究或诊断使用有关的分子信息。富集平台可被视为样本制备方法，该方法允许各种下游的表征技术被用于分析和收集有关癌症的更多信息。
如图1中所示，制备阶段10包括预富集样本处理12和细胞的再悬浮14。输入细胞样本可以是预富集或预过滤的以耗尽某些成分以提升处理吞吐量和更高质量的靶细胞富集。例如，可以执行离心或红细胞溶解以去除人外周血样本中的红细胞，以降低总细胞负荷并减少处理时间。细胞过滤器可用于去除某些凝块/组织碎片，这些凝块/组织碎片可能堵塞管道或通道，或干扰芯片内部的流动流。样本随后应被悬浮在某个容量的输入缓冲液中。输入缓冲液应包括密度匹配液体，以确保细胞在处理过程中不会沉淀或丢失。例如，如果要求较长的处理时间，则输入缓冲液的密度则应该被调整为接近细胞的密度以防止在处理期间细胞流入缓冲液的顶层或沉淀下降到容器底部，如图2所示。
在针对来自全血的CTC富集的实施例中，可以在制备阶段10中使用下列试剂。可使用RBC裂解缓冲液或密度分离液。全血样品可以使用基于氯化铵的红细胞(RBC)裂解缓冲液进行溶血或用密度梯度离心处理以分离有核细胞部分，包括CTC。
富集阶段20包括样本加载22，其中样本被加载到生物芯片上以供分选；自动细胞分选24，其中样本的细胞被分选，例如通过使用惯性力以根据细胞大小来分离细胞；以及样本收集26，其中样本的靶细胞被收集并且非靶细胞作为废物被丢弃。
下游分析阶段30包括隔离的靶细胞的识别32和表征34，以及随后识别和表征的结果的解读36。
图2A到2D示出了制备阶段的样本悬浮液。如图2A中所示，当样本准备好处理时，所有细胞202被均匀悬浮。样本随后被再悬浮在某个容量的输入缓冲液中。输入缓冲液的密度用密度匹配液体来控制。
如果如图2B中所示，细胞202的密度低于周围缓冲液204的密度，从而细胞202将由于浮力在处理期间浮起，则悬浮密度的均匀性丢失。如果如图2C中所示，细胞202的密度高于周围缓冲液206的密度，从而细胞在处理期间沉淀，悬浮密度的均匀性丢失。
图2D示出了具有与细胞匹配的密度的缓冲液的样本。如图2D中所示，在整个处理阶段期间使用密度匹配的缓冲液208均匀地悬浮细胞202。
如上所述，输入细胞样本缓冲液被用于悬浮输入细胞样本以确保因沉淀效应导致的细胞丢失最小。输入细胞样本缓冲液包括保持输入细胞中性浮力的密度和粘度匹配的溶液，从而允许它们能够被长时间处理。
图3是根据本发明的实施例的用于富集靶细胞的系统的示意表示。系统300包括微流体芯片310。微流体芯片310包括在盒内，并且包括至少一个微流体通道，用于使用惯性力根据细胞的大小来分离细胞。微流体芯片310可在惯性力和Dean流(Dean循环)的帮助下基于细胞的大小和形态来富集靶恶性肿瘤细胞。以下参照图4更详细地描述微流体芯片的示例。
系统300进一步包括包含样本322的样本容器320。样本322包括悬浮在输入缓冲液中的靶细胞。在图3中示出的实施例中，样本322包括两种类型的靶细胞：第一靶细胞324和第二靶细胞326。样本泵模块328被配置成以恒定流速将样本322从样本容器320馈入到微流体芯片310的样本入口312中。
输入细胞样本322可以是预富集或预过滤的以耗尽某些成分以提升处理吞吐量和更高质量的靶细胞富集。例如，可以执行离心或红细胞溶解以去除人外周血样本中的红细胞，以降低总细胞负荷并减少处理时间。细胞过滤器可用于去除某些凝块/组织碎片，这些凝块/组织碎片可能堵塞管道或通道，或干扰芯片内部的流动流。样本随后应被悬浮在某个容量的输入缓冲液中。输入缓冲液应包括密度匹配液体，以确保细胞在处理过程中不会沉淀或丢失。例如，如果要求较长的处理时间，则输入缓冲液的密度则应该被调整为接近细胞的密度以防止在处理期间细胞流入缓冲液的顶层或者沉淀下降到容器底部，如以上参照图2所述。
系统300进一步包括包含稀释剂缓冲液流体332的稀释剂缓冲液容器330。稀释剂缓冲液泵模块334被配置成以恒定流速将稀释剂缓冲液流体332从稀释剂缓冲液容器330馈入到微流体芯片310的稀释剂缓冲液入口314中。
在图3中示出的实施例中，微流体芯片310具有三个输出：第一样本出口316；第二样本出口317和废物出口318。系统300进一步包括三个输出容器：第一样本输出容器340；第二样本输出容器350和废物输出容器360。微流体芯片310的第一样本出口316耦合至第一收集阀342。第一收集阀342被配置成控制来自第一样本出口的输出被连接至耦合至第一样本输出容器340的第一样本输出分支344还是耦合至废物输出容器360的废物输出分支362。微流体芯片310的第二样本出口317耦合至第二收集阀352。第二收集阀352被配置成控制来自第二样本出口317的输出被耦合至耦合至第二样本输出容器350的第二样本输出分支354还是耦合至废物输出容器360的废物输出分支362。微流体芯片310的废物出口318耦合至废物输出分支362。
控制器370被配置成监视第一比率和第二比率。第一比率是来自第一样本出口316的流速与来自废物出口318的流速的比率。第二比率是来自第二样本出口317的流速与来自废物出口318的流速的比率。控制器370被配置成根据第一规则使用第一比率来控制第一收集阀342。第一规则可为如下：如果第一比率在第一范围的值内，则将来自第一样本出口316的流经由第一样本输出分支344定向至第一样本输出容器340，并且如果第一比率在第一范围的值以外，则将来自第一样本出口316的流经由废物输出分支362定向至废物输出容器360。控制器370被配置成根据第二规则使用第二比率来控制第二收集阀352。第二规则可为如下：如果第二比率在第二范围的值内，则将来自第二样本出口317的流经由第二样本输出分支354定向至第二样本输出容器350，并且如果第二比率在第二范围的值以外，则将来自第二样本出口317的流经由废物输出分支362定向至废物输出容器360。
系统300的操作如下。一旦样本被制备，则样本泵送模块328将细胞悬浮样本馈送至微流体芯片310。如果需要任何稀释剂缓冲液流体330，则稀释剂缓冲液泵模块324以预定流速馈送稀释剂缓冲液液体，并且允许微流体芯片内部的流速平衡。
控制器370控制输入流速。如上所讨论的，控制器370还根据规则控制第一样本收集阀342和第二样本收集阀352。这些规则基于第一样本出口流与废物出口流的比率以及第二样本出口流与废物出口流的比率。如果这些比率之一在由规则设定的范围以外，则控制器370致使第一样本收集阀342或第二样本收集阀352将流从第一样本出口316和/或第二样本出口317切换至废物输出分支362。当流量比在由规则设定的范围以外时，这指示在微流体芯片310中存在可能由碎片或气泡导致的异常。此种异常将干扰微流体芯片310对靶细胞的分离，并且因此当流量比异常时，输出被切换至废物输出容器360。流量比可通过控制样本输出和废物输出分支的电阻(确保跨这些分支的相相等压力降)来固定。通过设计样本和废物出口耦合路径(图4的124和128)的尺寸以及样本和废物输出分支处的系统中的管道，通过将这些电阻设计成微流体芯片中来设定这些电阻。
在图3中示出的实施例中，微流体芯片310具有一个样本入口312、一个稀释剂缓冲液入口314、两个样本出口316、317和一个废物出口318。应理解，可对入口和出口数量作出变化。例如，构想了具有样本入口但没有稀释剂缓冲液入口的实施例。此外，各实施例还可包括单个样本出口或多个样本出口。泵送模块和样本收集阀的数量将根据微流体芯片上的入口和出口的数量而变。
图4示出了可与本发明的实施例一起使用的微流体芯片的示例。注意，图4中示出的微流体芯片具有一个样本入口、一个稀释剂缓冲液入口、一个样本出口和一个废物出口。
图4显示了在国际专利申请PCT/SG2013/000442(公布为WO2015/057159)中描述的生物芯片设计的示意图，其可与本发明的实施例联用。微流体设备100包括螺旋弯曲微通道110。样本入口SI 112和稀释剂缓冲液入口BI 114位于螺旋弯曲微通道110的中心区域中。样本入口耦合路径116将样本入口耦合至螺旋弯曲微通道110。缓冲液入口耦合路径118将稀释剂缓冲液入口114耦合至螺旋弯曲微通道110。样本入口耦合路径116和稀释剂缓冲液入口耦合路径118在螺旋弯曲微通道110的上游端处的汇合120处加入。在螺旋弯曲微通道110的下游端处，存在分叉120，其中通道分为样本出口耦合路径124和废物出口耦合路径。样本出口耦合路径124连接至样本出口SO 126并且废物出口耦合路径128连接至废物出口WO130。将样本从通道曲率的外侧引入到螺旋弯曲微通道110中。在稀释剂缓冲液的帮助下，细胞将与外部通道壁对齐。弯曲螺旋微通道110被配置成将诸如CTC之类的的大细胞与诸如WBC和RBC之类的较小细胞分离。选择弯曲螺旋微通道110的尺寸，使得较小的细胞在Dean力的影响下穿过通道迁移，而大的细胞被导致集中并占据单个平衡位置。这意味着在Dean循环的一半之后，大的和小的细胞都将占据通道的内侧。选择到弯曲截面的末端的长度，以便较小的细胞将完成一个Dean循环。因此，在弯曲截面的末端，较小的细胞已经完成了一个Dean循环，并将迁移到通道的外侧。因此，在分叉122处，较大的CTC被集中在内通道壁处并从样本出口126收集，而较小的细胞在外通道壁处处于分开的流中，并从废物出口130排出。
图5解说了可在靶细胞的下游分析中使用的因素。靶细胞可以是诸如CTC之类的癌细胞。癌细胞通常显示与正常细胞不同的大小和形态。因此，下游分析中使用的一个因素是细胞大小和形态510。癌细胞中存在明显的遗传变异，包括体细胞单核苷酸突变、结构变异和染色质融合。取决于癌细胞的组织来源和恶性，癌细胞的基因和蛋白质表达谱也不同于其他细胞类型。基于癌细胞的这些不同特征，可执行对(诸)样本输出容器中收集的细胞的下游分析以识别癌细胞及其分子谱。
如图5中所示，可执行细胞内530或膜表面560上的蛋白标志物的免疫染色520以在视觉上评价特定靶向蛋白表达以识别细胞类型或特征。细胞核染色可通过核酸荧光标记来执行并可视觉上被观察。通过下一代测序(NGS)或Sanger测序、数字聚合酶链反应(PCR)、液滴数字PCR、定量PCR(qPCR)和荧光原位杂交(FISH)对核酸进行测序，可以完成核酸的分子表征；感兴趣的核酸的拷贝数也可以通过这些方法推断出来。基于循环肿瘤细胞的大小和细胞510的形状及其细胞核540，可以进行对循环肿瘤细胞的形态分析。
图6A和6B示出了基于形态学和免疫细胞化学办法的恶性肿瘤细胞的识别。图6A示出了基于形态学的办法，诸如木瓜凝集素染色、苏木精和曙红染色(H&E)和Geimsa染色，它们增强了细胞与背景的对比度，从而允许恶性细胞的直接可视化和识别。
图6B示出了使用免疫细胞化学，诸如使用CD45抗体作为阴性标记，以及抗体鸡尾酒用于肿瘤细胞的阳性鉴定(细胞角蛋白8、18、19、EpCAM、CD133、TTF-1、Na.、EGFR等)的示例。在图6B中，循环肿瘤细胞被标记为对于核酸标记物-DAPI、上皮标记物-细胞角蛋白8、18、19和免疫检查点逃避标记物-PD-L1为阳性，而对于淋巴细胞标记物-CD45为阴性。
图7A和7B分别示出了采用基于分子的办法，诸如基于FISH和PCR的办法，对肿瘤细胞的表征。
如图7A中所示，可执行染色体畸变的FISH检测以识别经常出现遗传畸变，诸如染色体扩增、多倍体、非整倍体(左)和基因融合(右)的肿瘤细胞。
图7B示出了点突变的检测。左边的面板示出了使用肿瘤细胞的Sanger测序检测KRAS癌基因中的点突变(由箭头指示的峰值)。右边的面板示出使用基于因等位基因而异的qPCR测定的EGFR L858R突变的荧光检测。
图8示出了从液体活检中富集的处理癌细胞可被处理用于下一代测序的示例。在步骤802中，进行液体活检。在步骤804中，使用如本文中所述的富集系统来富集癌细胞。这提供了经富集的癌细胞806。在癌细胞富集之后，可在步骤808中执行核酸提取以获得纯DNA或RNA 810。在步骤812中，可以使用适当的测序库试剂盒来扩增或富集核酸靶区。这产生经扩增的靶DNA或RNA库814。测序库模板可在步骤816中在合适的测序仪上被进一步富集和测序。在步骤820中分析测序结果818以发现任何基因组或转录组模式，包括突变(单核苷酸或结构)、拷贝数变异、基因表达和剪接变异体822。
如上所述，视觉和分子概况可被解读为推断疾病信息，诸如转移的风险、预后、指导个性化治疗决策的治疗目标。例如，由FISH检测的ALK染色体易位、由Sanger测序检测的KRAS突变和EGFR L858R的qPCR检测为特异性拮抗剂提供了治疗靶点。富集的癌细胞的下一代测序可用于检测突变、拷贝数变化、基因表达变化或RNA剪接变异体，这些变异可能与癌症发病机制有关。另外，CTC的分子谱允许研究和更好地理解转移和癌症进展的演变和机制，以便发现治疗策略和新的生物标志物。
图9示出了根据本发明实施例的用于富集靶细胞的系统。系统900包括微流体芯片910。微流体芯片910可以具有与图4有关的上述形式。微流体芯片910具有样本入口912、稀释剂缓冲液入口914、样本出口916和废物出口918。芯片接口911提供与微流体芯片910与管道之间的防漏密封的耦合，所述管道与微流体芯片的入口和出口处于流体连通。
样本容器920包含样本流体，该样本流体包括要被富集的靶细胞。在该实施例中是注射器的样本输入泵928经由输入泵开关阀IPV 923耦合至样本容器920。注射器可被安装到由控制器970控制的注射器泵上。样本输入泵928被配置成将输入细胞样本从外部容器吸入到富集平台中并通过微流控芯片泵送。输入泵开关阀IPV 923被配置成在输入细胞样本容器920与微流体芯片910的样本入口912之间切换。管道T9a将样本容器920与输入泵开关阀IPV 923连接。输入检测器921被布置在管道T9a上。输入检测器921的目的是为了防止任何空气或气泡被加载到样本输入泵928中。气泡对许多微流体芯片操作可能是灾难性的，并且通过破坏流体流动线来影响分离质量。因此，确保没有空气进入流体网络是重要的。
管道T8将样本输入泵928连接至输入泵开关阀IPV 923。输入压力换能器925位于管道T8上。输入压力换能器925是在泵送期间测量输入泵压力以确保样本输入泵928正以期望速率泵送的压力换能器。管道T7将输入泵开关阀IPV 923连接至微流体芯片910的样本入口912。
稀释剂容器930包含稀释剂缓冲液流体。稀释剂缓冲液包括用于在处理期间保持高细胞完整性的等渗溶液。稀释剂缓冲液还可以补充有表面活性剂溶液以减少细胞经历的剪切并保持活力。由于微流体芯片的小尺寸，这些芯片内的剪切速率可能非常高，并影响细胞完整性(细胞可能被炸毁)和生存能力(细胞死亡)。为了使这些剪切效应最小化，稀释剂缓冲液和输入细胞样本缓冲液包含表面活性剂，其提供“细胞缓冲”效应并保持细胞完整。
在该实施例中是注射器的稀释剂泵934经由稀释剂泵开关阀DPV 933耦合至稀释剂容器930。稀释剂泵934被配置成从稀释剂容器930抽吸稀释剂缓冲液流体并将其泵入到富集平台中，并通过微流体芯片910进行泵送。稀释剂泵开关阀DPV 933被配置成在稀释剂容器930与微流体芯片910的稀释剂入口914之间切换。管道T6a将稀释剂容器930与稀释剂泵开关阀DPV 933连接。稀释剂检测器931位于管道T6a上。稀释剂检测器931防止任何空气或气泡加载到稀释剂泵中。气泡对许多微流体芯片操作可能是灾难性的，并且通过破坏流体流动线影响分离质量。因此，确保没有空气进入流体网络是重要的。稀释剂检测器931是液体检测传感器。如果稀释剂检测器931检测到没有稀释剂流经管道T6a(即，传感器被激活)，则控制器970向用户发送消息以用稀释剂重新填充/代替稀释剂容器930。
管道T5将稀释剂泵开关阀DPV 933与稀释剂泵924连接。稀释剂压力换能器935位于管道T5上。稀释剂压力换能器935是用于在泵送期间测量稀释剂缓冲液压力以确保稀释剂泵924正以期望速率泵送的压力换能器。
管道T4将稀释剂泵开关阀DPV 933与除泡器933连接。管道T2将除泡器933与检查阀CV 939连接。管道T1将检查阀CV 939连接至微流体芯片910的稀释剂入口914。稀释剂检测器931具有阈值上限，在该阈值上限以上它可检测气泡并触发警报。然而，较小的气泡仍可通过而不激活稀释剂检测器931。这些气泡随后可由除泡器933去除，除泡器933可包括使空气逸出从而除去气泡的透气膜。在另一实施例中，除泡器931可包括从稀释剂缓冲液中抽出气泡的真空泵。
微流体芯片910的样本出口916通过管道T11连接至输出开关阀OPV942。输出开关阀OPV 942被配置成在CTC样本收集容器940与废物容器960之间切换样本出口916的输出。管道T10将输出开关阀OPV 942的一个输出连接至CTC样本收集容器940。管道T12连接至输出开关阀OPV 942的另一输出并形成废物输出分支962的一部分。废物输出分支962进一步包括管道T13a，其连接至微流体芯片910的废物出口918。管道T13b将从输出开关阀OPV 942延伸的管道T12和从微流体芯片910的废物出口918延伸的管道T13a与流速传感器961连接。又一管道T14a从流速传感器961延伸至废物容器960。
流速传感器961监视输出侧处的流速以确保T11与T13a之间的流量比可在分离阶段期间被轮询。例如，两个输出生物芯片的靶细胞输出与废物输出之间的流速比可因此被用作评估富集质量的参数。如果该比低于设定值，则靶细胞(恶性肿瘤细胞)的恢复可能随着更多的细胞丢失到废物而减少。相反，如果所述比高于设定值，则将有更多污染的非靶细胞将与靶细胞一起被收集，从而减少富集。在手动操作过程中，该比可能因输出管阻力而显著变化，而开启压力可能无法被很好地控制。
控制器970监视流速传感器961的输出并控制输出开关阀OPV 942。因此，输出开关阀OPV 942提供微流体芯片910的样本出口916在CTC样本容器940与废物容器960之间的切换。输出开关阀OPV 942连同流速传感器961有助于达成可靠的富集。例如，如果T11与T13a之间的流量比在期望范围以外，则该阀可切换并将来自T11的所有输出定向至废物，由此不损害经富集的CTC样本的质量。一旦流量比返回至期望范围内，OPV就可切换回去并收集CTC容器中的经富集的靶(CTC)细胞。
当新输入细胞样本被加载到该自动化富集平台上时，控制器970就可如下控制过程。用户可基于输入样本和微流体芯片来选择期望的运行协议。一旦被启动，控制器970就可控制稀释剂泵开关阀DPV 933将切换至稀释剂缓冲液容器930并且稀释剂泵934将抽吸处理该样本所需的稀释剂缓冲液。类似地，控制器970将控制输入泵开关阀IPV 923切换并且输入泵928将从输入容器920抽吸输入细胞样本。一旦两个泵已经抽吸了适量的稀释剂缓冲液和样本，稀释剂泵开关阀DPV 933和输入泵开关阀IPV 923就将由控制器970控制，以经由芯片接口911将泵切换和连接到微流体芯片910。
当样本和稀释剂缓冲液流经微流体芯片910时，使用惯性力和Dean流将靶细胞(CTC)与其余细胞分离。靶细胞随后被定向至样本出口916和管道T11并且被收集到CTC样本容器940中，而非靶细胞将经由废物输出分支962被收集到废物容器960中。流速传感器961监视通过整个分离过程的流速以确保达成预定流量比。由于通过微流体芯片910的总流速由控制输入泵928和稀释剂泵934的控制器970控制，因此通过测量通过废物输出分支的流速，我们可以计算流量比。如果在任何情况下检测到与预定流量比的偏差，则控制器970使输出开关阀OPV 942将其输出切换到废物输出分支962，从而确保在流量波动时段期间没有输出被收集到CTC样本容器940中。一旦微流体芯片中的流动重新稳定，输出开关阀OPV 942就由控制器970控制以切换回去，并且从微流体芯片910的样本出口916输出到CTC样本容器940。在可接受范围外的大流量波动会影响分离质量。可接受的流速波动范围可以是在961处测量的流速的百分比，例如5％或10％。
在一实施例中，系统包括布置在管道T11上的第二流速传感器，管道T11将微流体芯片910的样本出口916连接至输出开关阀OPV 942。
本领域技术人员将领会，可对本文中所描述的实施例作出各种形式和细节的修改和改变，而不背离如所附权利要求中所定义的本发明的范围。

Claims (25)

1.一种用于富集样本中的靶细胞的系统，所述系统包括：
微流体芯片，其包括样本入口、样本出口、废物出口和微流体通道，所述样本入口耦合至所述微流体通道的上游端，而所述样本出口和所述废物出口耦合至所述微流体通道的下游端，所述微流体芯片被配置成使得靶细胞被定向至所述样本出口而非靶细胞被定向至所述废物出口；
样本输入泵，其被配置成将所述样本引入到所述微流体芯片的所述样本入口中；第一输出流速检测器，其被配置成测量所述微流体芯片的所述样本出口或所述废物出口处的流速；
样本收集开关阀，其具有能在第一配置与第二配置之间切换的配置，在所述第一配置中，所述微流体芯片的所述样本输出耦合至样本输出容器，而在所述第二配置中，所述微流体芯片的所述样本输出耦合至废物输出容器；以及
控制器，其被配置成使用由所述第一输出流速检测器测量的流速来控制所述样本收集开关阀的配置，其中所述控制器被配置成确定所述样本出口与所述废物出口之间的流量比，并且被进一步配置成将所述流量比与预定范围的流量比作比较并且如果所述流量比在所述预定范围的流量比以外，则将所述样本收集开关阀切换到所述第二配置，所述预定范围的流量比通过控制所述样本输出和所述废物输出的管道的电阻来固定。
2.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述控制器被配置成将由所述第一输出流速检测器测量的流速与预定范围的流速值进行比较，并且所述控制器被进一步配置成如果由所述第一输出流速检测器测量的流速在所述范围的流速值以外，则将所述样本收集开关阀切换到所述第二配置。
3.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述控制器被配置成根据由所述第一输出流速检测器测量的流速和通过所述微流体芯片的总流速来确定所述流量比。
4.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述第一输出流速检测器被配置成测量所述废物出口处的流速，所述系统进一步包括配置成测量所述微流体芯片的所述样本出口处的流速的第二输出流速检测器，其中所述控制器被配置成根据由所述第一输出流速检测器在所述废物出口处测量的所述流速和由所述第二输出流速检测器在所述样本出口处测量的所述流速来确定所述流量比。
5.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述样本包括密度匹配液体，其具有被选择成使得在处理期间所述靶细胞被均匀悬浮在所述样本中的密度。
6.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述微流体芯片进一步包括耦合至所述微流体通道的所述上游端的稀释剂入口并且所述系统进一步包括配置成将稀释剂缓冲液引入到所述稀释剂入口的稀释剂入口泵。
7.如权利要求6所述的系统，其特征在于，所述稀释剂缓冲液包括等渗溶液。
8.如权利要求6所述的系统，其特征在于，所述稀释剂缓冲液包括表面活性剂溶液。
9.如权利要求6所述的系统，其特征在于，进一步包括布置成从稀释剂缓冲液中去除气泡的除泡器。
10.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述样本包括血液样本或血液成分。
11.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述靶细胞是循环肿瘤细胞。
12.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述微流体通道包括螺旋形或曲线形截面。
13.一种使用微流体芯片来富集样本中的靶细胞的方法，所述微流体芯片包括样本入口、样本出口、废物出口和微流体通道，所述样本入口被耦合至所述微流体通道的上游端，而所述样本出口和所述废物出口被耦合至所述微流体通道的下游端，所述微流体芯片被配置成使得所述靶细胞被定向至所述样本出口而非靶细胞被定向至所述废物出口；所述方法包括：
将所述样本引入到所述微流体芯片的所述样本入口中；
监视所述微流体芯片的所述样本出口或所述废物出口处的流速；
使用所监视的流速来控制样本收集开关阀的配置，所述样本收集开关阀具有能在第一配置与第二配置之间切换的配置，在所述第一配置中，所述微流体芯片的所述样本输出耦合至样本输出容器，而在所述第二配置中，所述微流体芯片的所述样本输出耦合至废物输出容器，以及
确定所述样本出口与所述废物出口之间的流量比，将所述流量比与预定范围的流量比作比较并且如果所述流量比在所述预定范围的流量比以外，则将所述样本收集开关阀切换到所述第二配置，所述预定范围的流量比通过控制所述样本输出和所述废物输出的管道的电阻来固定。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，进一步包括在将所述样本引入到所述微流体芯片的所述样本入口中之前，将所述样本悬浮在密度匹配液体中，所述密度匹配液体具有被选择成使得所述靶细胞在处理期间被均匀地悬浮在所述样本中的密度。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，进一步包括在将所述样本引入到所述微流体芯片的所述样本入口中之前对所述样本执行离心和或血液溶解。
16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，进一步包括将所监视的流速与预定范围的流速值作比较，并且在所监视的流速在所述预定范围的流速值以外时将所述样本收集开关阀切换至所述第二配置。
17.如权利要求13所述的方法，其特征在于，确定所述流量比包括根据所监视的流速与通过所述微流体芯片的总流速来确定所述流量比。
18.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所监视的流速是所述微流体芯片的所述废物出口处的所述流速，所述方法进一步包括测量所述样本出口处的流速，其中确定所述流量比包括根据所监视的流速和在所述样本出口处测量的流速来确定所述流量比。
19.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述微流体芯片进一步包括耦合至所述微流体通道的上游端的稀释剂入口并且所述方法进一步包括将稀释剂缓冲液引入到所述稀释剂入口中。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述稀释剂缓冲液包括等渗溶液。
21.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述稀释剂缓冲液包括表面活性剂溶液。
22.如权利要求19所述的方法，其特征在于，进一步包括在所述将稀释剂缓冲液引入到所述稀释剂入口之前从所述稀释剂缓冲液体中去除气泡。
23.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述样本包括血液样本或血液成分。
24.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述靶细胞是循环肿瘤细胞。
25.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述微流体通道包括螺旋形或曲线形截面。
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