CN104195028A - 用于对特异性细胞进行筛选的微流控芯片及细胞筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于对特异性细胞进行筛选的微流控芯片及细胞筛选方法。其中，芯片包括基底和腔道以及声波激励源；腔道包括中间通道、入口和出口；声波激励源位于基底上且位于中间通道的两侧，声波激励源包括沿中心通道并向出口方向延伸的两部分，靠近出口的第二部分对应的声波共振频率是远离出口的第一部分对应的声波共振频率的整数倍。通过靶向微泡及非对称声场形成的声流效应，使微泡粘附于特异性特异性细胞表面，由于微流体的层流特性，富集的细胞在流过第一部分后仍然会在一条直线中移动不会扩散，而由于第二部分的声波共振频率不同于第一部分，使得粘附靶向微泡的特异性特异性细胞发生偏移，从而实现在血液中筛选特异性细胞特异性的目的。

Description

用于对特异性细胞进行筛选的微流控芯片及细胞筛选方法

技术领域

本发明涉及细胞分析技术领域，具体涉及一种用于对特异性细胞进行筛选的微流控芯片及细胞筛选方法。

背景技术

分子生物学和临床研究表明，部分诊断为早期的癌症实际上已有远处转移，即肿瘤微转移，而常规影像学、组织学或细胞学方法难以发现。肿瘤微转移可通过血行及淋巴途径在全身组织和器官中形成微小转移病灶，而淋巴结转移发展最终也要进入血液循环中形成循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)，导致原发肿瘤转移的全身化倾向。CTCs的检测有助于早期发现肿瘤微转移、监测术后复发、评估疗效及预后或选择合适的个体化治疗。

在对肺癌发生机制不断深入认识以及分子生物学方法发展的基础上，CTCs的检测方法也有了较大的进展。免疫磁珠法、反转录多聚酶链式反应(RT-PCR，Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction)及流式细胞分析技术(FlowCytometry，FCM)是目前常用的检测恶性肿瘤患者血液和骨髓液中隐匿肿瘤细胞的方法。免疫磁珠法利用免疫磁珠(一种人工合成的微米级含铁小微粒)的功能层的特点(功能层既可以结合生物分子，同时又能被磁力所吸引)，使免疫磁珠在磁力作用下发生力学移动，使复合物与其它物质分离，从而达到分离特异性抗原的目的；然而，免疫磁珠法的缺点是，磁珠密度过大，容易导致磁珠的聚集和沉降，而使富集效率降低，磁珠与细胞偶联后不易从细胞表面脱附，还常常夹杂非相关的细胞，从而影响分离的效果。RT-PCR检测法是通过设计肿瘤细胞标志性基因或靶RNA的特异性引物，通过对外周血样本进行RT-PCR来检测外周血是否含有肿瘤细胞；但是这种方法同时因受实验污染、非常规转录等限制，导致存在假阳性率过高的缺点而限制了其在外周血检测癌细胞中的应用。FCM法能将处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数的、快速的定量分析和分选，且研究发现FCM法检测外周血肿瘤细胞的敏感性为每1000个外周血淋巴细胞中可检测出一个肿瘤细胞，但由于流式细胞仪设备昂贵，且缺乏特异性抗原，因此也限制了该技术的推广。

另一方面，随着微纳加工技术的不断发展，基于微流控芯片的细胞筛选技术得到了广泛的关注和认可。微流控芯片的腔道结构可以任意设计，提高了细胞筛选的灵活性和可靠性，而腔道的尺寸与细胞大小相匹配，可更有效的分选细胞。目前，基于微流控筛选细胞的方法主要包括：

(1)介电电泳方法(DEP，Dielectrophoresis)法。其中，介电电泳指在空间非均一电场下的细胞，由于其相对于周边介质的诱导偶极距不同而产生的电迁移，从而受到介电力的作用。这种方法需要较强的电场，而电场引起的热效应有可能会对细胞造成损伤。

(2)水流动力学方法。这种方法通过特殊设计的通道结构可以改变流体的流场，可以用来进行层流混合、富集和筛选，利用流体引起的拽力，实现CTCs的分离。然而，水流动力学方法只适用于一定尺寸的细胞，并且容易堵塞腔道。

(3)光学方法。当光被细胞表面反射吸收以及发生折射时，它的传播方向会发生改变，动量也随之改变，根据动量守恒定律，细胞会获得光子损失的动量，进而表现为受到光的作用力，因此，利用光镊可有效分离CTCs。然而这种方法通常是适用于单个细胞，很难对大量细胞进行同时筛选，降低了细胞筛选的通量。

(4)声学方法。声波，作为一种机械波，携带动能和能量同样可对细胞进行分选。然而声学的方法缺少特异性，而CTCs的粒径大小与血液中细胞粒径存在混叠(如图1所示)，很难对CTCs细胞进行筛选。

综上所述，目前虽有多种方法可实现CTCs的筛选，但每种方法均存在一定的缺点与不足，直接影响了细胞筛选的效率和细胞的活性，难以达到对癌症转移的早期诊断。因此，还需要开发一种高效、准确、并行、无损伤的分选方法。

发明内容

本发明提供一种新的用于对特异性细胞进行筛选的微流控芯片及相关的筛选方法。

根据本发明的第一方面，本发明提供一种用于对特异性细胞进行筛选的微流控芯片，包括基底和附着于所述基底上的腔道，还包括声波激励源；所述腔道包括中间通道、位于所述中间通道一端的用于供靶向微泡和含有特异性细胞的血液注入的入口和位于所述中间通道另一端的用于供分离出的特异性细胞和血细胞输出的出口；所述声波激励源位于基底上且位于所述中间通道的两侧，所述声波激励源包括沿所述中心通道并向出口方向延伸的两部分，其中靠近出口的第二部分对应的声波共振频率是远离出口的第一部分对应的声波共振频率的整数倍。

优选地，所述声波激励源包括一对叉指换能器，所述叉指换能器位于基底上且位于所述中间通道的两侧，所述叉指换能器包括第一电极部分、第二电极部分和用于连接所述第一电极部分和所述第二电极部分的过滤带(222)，所述第一电极部分对应所述远离出口的第一部分，所述第二电极部分对应所述靠近出口的第二部分。进一步地，所述第一电极部分的指条宽度为所述第二电极部分的指条宽度的整数倍。

优选地，所述基底为128度YX双面抛光的铌酸锂晶体；所述腔道由聚二甲基硅氧烷材质制作；所述入口包括用于供靶向微泡注入的第一入口和用于供血液注入的第二入口，所述出口包括用于供分离出的特异性细胞输出的第三出口、第五出口和用于供血细胞输出的第四出口，且所述第四出口位于所述第三出口和所述第五出口之间。

优选地，所述声波激励源包括基于体声波的激励源。

优选地，所述特异性细胞包括循环肿瘤细胞；所述特异性细胞与所述靶向微泡的特异性不同，且所述靶向微泡在声波激励源的作用下粘附于所述特异性细胞。

优选地，所述腔道采用软光刻工艺制作。

根据本发明的第二方面，本发明提供一种用于对特异性细胞进行筛选的方法，包括：细胞富集步骤，即将含有特异性细胞的血液和已制备的靶向微泡注入如上所述的微流控芯片，当所述血液和所述靶向微泡移动到与所述第一部分相对应的位置时，对所述微流控芯片施加信号以在所述腔道内形成驻波声场，且使得血液中的血细胞以及与靶向微泡充分接触的特异性细胞沿所述中心通道并朝向出口方向移动；和细胞分选步骤，即当所述血液和所述靶向微泡移动到与所述第二部分相对应的位置时，调整所述信号的频率或相位，从而使得靶向微泡及与其充分接触的特异性细胞的移动速度大于血细胞的移动速度。

优选地，所述特异性细胞为循环肿瘤细胞；所述靶向微泡的制备包括：步骤A，即在容器中按一定比例将一定量的二硬脂酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇2000修饰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺溶解在三氯甲烷中且在涡旋混合器上混匀，通入氮气除去三氯甲烷并使磷脂在容器壁上形成一层均匀的薄膜，真空干燥若干小时；步骤B，即在含有干燥磷脂薄膜的容器中加入经脱气处理的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，所述缓冲溶液含有10％体积的甘油和10％体积的丙二醇，加热所述缓冲溶液到相转变温度以上，水浴超声震荡使磷脂溶液分散彻底直至透明；步骤C，即将透明的磷脂溶液分装置西林瓶中，并将西林瓶中的空气置换为生物惰性气体；步骤D，即震荡西林瓶从而制备出微泡。

优选地，所述微流控芯片的声波激励源为位于基底上且位于所述中间通道的两侧的一对叉指换能器，所述叉指换能器包括第一电极部分、第二电极部分和用于连接所述第一电极部分和所述第二电极部分的过滤带，所述第一电极部分对应的声波共振频率为所述第二电极部分对应的声波共振频率的整数倍。

本发明的有益效果是：通过注入的靶向微泡以及采用的非对称声场形成的声流效应，使微泡与血液中的特异性细胞结合，使微泡粘附于特异性细胞表面，由于微流体的层流特性，富集的细胞在流过第一部分的驻波声场后，这些细胞仍然会在一条直线中移动，而由于第二部分的声波共振频率不同于第一部分，使得粘附靶向微泡的特异性细胞发生偏移，特异性细胞将移动到第二部分的声波共振频率的声场中的节点位置，而血液中其它血细胞仍然在层流拽力的作用下依旧在第一部分的声波共振频率的声场中的节点位置移动，从而实现在血液中筛选特异性的目的。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，其中相同参考标号表示相同部分。

图1示意性地示出了血液中白细胞、红细胞与CTCs粒径大小，其中白细胞与CTCs粒径存在混叠；

图2示意性地示出了本发明一种实施方式的微流控芯片的结构示意图；

图3和图4示意性地示出了靶向微泡与小鼠淋巴细胞的黏附，其中A为非靶向微泡，B为Lyp-1靶向微泡，图示中非靶向微泡基本不能与细胞粘附，而大量靶向微泡可与细胞紧密粘附。

具体实施方式

随着微机电系统(MEMS)工艺的不断进步，微流控芯片(microfluidic device)得到了迅速发展，本发明是在此技术基础上，提出了一种用于特异性细胞筛选的微流控芯片及其相关方法。以下通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中，以特异性细胞为CTCs为例进行说明，当然，本发明同样适用于其它类型细胞，只要细胞之间的声阻抗有差异，例如将血小板在血细胞中分离。

[实施例1]

如图2所示，本实施例提供一种用于对特异性细胞进行筛选的微流控芯片，包括基底21、附着于基底21上的腔道23、以及声波激励源。

一种具体实现中，为获得较大的机电耦合系数，基底为128°YX双面抛光的铌酸锂晶体。

又一种具体实现中，腔道由聚二甲基硅氧烷(PDMS)材质制作。腔道23包括中间通道、位于中间通道一端的入口231、232以及位于中间通道另一端的出口233、234、235。其中，入口231用于供靶向微泡33注入，入口232用于供含有特异性细胞31及血细胞32(包括红细胞、白细胞和血小板)的血液注入，出口233、235用于供分离出的特异性细胞及粘附于其表面的微泡输出，出口234用于供血细胞输出，并且出口234位于出口233和出口235之间。

声波激励源位于基底21上且位于中间通道的两侧，声波激励源包括沿所述中心通道并向出口方向延伸的两部分，其中靠近出口的第二部分对应的声波共振频率是远离出口的第一部分对应的声波共振频率的整数倍。一种具体实现中，声波激励源基于声表面波，其具体为一对叉指换能器22。叉指换能器是指在压电基底上溅射周期性的叉指电极，对叉指电极施加射频输入信号，利用逆压电效应使得基底产生振动并产生声表面波。叉指换能器22位于基底21上且位于中间通道的两侧，叉指换能器22包括第一电极部分221、第二电极部分223和用于连接第一电极部分221和第二电极部分223的过滤带222，第一电极部分221对应前述的远离出口的第一部分，第二电极部分223对应前述的靠近出口的第二部分，如图2所示。一种具体实现中，第一电极部分221的指条宽度为第二电极部分223的指条宽度的整数倍。另一种具体实现中，声波激励源基于体声波，即利用压电陶瓷为激励源实现细胞筛选。

本实施例的微流控芯片由于声波激励源的两部分的声波共振频率不相同，即可得到非对称声场，藉此通过形成的声流效应可以实现对特异性细胞例如CTCs的分离。

采用本实施例的微流控芯片分选细胞具有以下特点：

(1)微流控芯片不需要鞘流，不会稀释细胞，以及鞘流引起的剪切应力损伤细胞带来的负面效应，本发明仅依靠声波富集，富集效率高，速度快。

(2)分选效率高：由于CTCs表面充分粘附着靶向微泡，CTCs具有较高的声学敏感性，只需要较小的声压，便可将CTCs从血液中分选，得到较高的分选效率。

(3)细胞生物活性：分选后CTCs表面粘附这微泡，而微泡可在常压的破碎，不需要其他生化手段将微泡与细胞分离，从而保证了细胞的生物活性。

(4)微流控芯片性能具有良好的一致性。由于MEMS工艺具有标准化流程，利用MEMS工艺制备的声表面波微流控芯片能够保证器件的可靠性和一致性。

(5)具有普遍适用性。细胞的富集与分选仅仅依靠调节输入到叉指换能器的射频信号，不需要改变声表面波微流控芯片的结构，只要靶向微泡的配体与CTCs细胞的抗体能够牢固结合，CTCs便可实现分选，具有较好的普遍适用性。

(6)芯片成本低。芯片制备工艺为标准的MEMS技术，工艺成熟器件的性能一致性良好，并且成本低廉，可大量生产。

这些特点可通过如下实施例2及其示例予以体现。

[实施例2]

本实施例提供一种对特异性细胞进行筛选的方法，其采用实施例1提供的微流控芯片为实验平台，在声波的作用下将CTCs富集，借助靶向微泡与CTCs的粘附，增强CTCs的声阻抗差异，通过调控声波的幅值与频率，实现细胞的筛选，并且细胞的生物活性不会受到影响，为CTCs的筛选提出了一种新的途径。

本实施例的细胞筛选方法的过程包括如下步骤S1～S4：

步骤S1，制备靶向微泡。微泡通常称为超声造影剂，是一种含有惰性气体的包膜微气泡，最初主要作用是增强超声图像的对比度，提高图像质量。最近研究表明，可对微泡的表面进行化学修饰，将带有特异性配体的微泡与靶细胞结合，使微泡沾附在细胞表面，进一步实现分子影像以及靶向给药的目的。本发明将研究配体与微泡的不同修饰方式，确保微泡能够稳定的、特异性的结合CTCs，而不会与血液中正常细胞结合。

一种具体实现中，靶向微泡的制备过程包括：

A.按一定比例将一定量的二硬脂酰磷脂酰胆碱(distearoylphosphatidylcholine,DSPC)、聚乙二醇2000修饰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEK-2k)溶解在三氯甲烷中在涡旋混合器上混匀。在干燥的N2气流作用下除去三氯甲烷使磷脂在试管壁上形成一层均匀的薄膜，用石蜡膜封上试管口，并用针戳几个孔作为气体出口，将试管置于真空烘箱中干燥若干小时(例如2小时)以上，除去残余的溶剂三氯甲烷。

B.在含有干燥磷脂薄膜的试管中加入一定体积脱气的三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲溶液(例如其pH值为7.4)，缓冲溶液中含有10％体积比的甘油和10％体积比的丙二醇。加热缓冲溶液到所含磷脂的相转变温度(例如55-60℃)以上，将试管置于水浴式超声振荡器中震荡并不停的转动，使牛奶状的磷脂彻底分散在缓冲溶液中直至得到透明的磷脂溶液。

C.将透明的磷脂溶液转移到西林瓶中(例如按每瓶1ml转移到2ml的西林瓶中)，盖上橡胶塞，将瓶中的空气置换成生物惰性气体(例如六氟化硫或者全氟丙烷)，然后用铝塑盖和手握式压盖机密封，贴上标签(例如4℃下)存储备用。

D.将西林瓶从冰箱取出待其温度恢复到室温，用机械振荡器制备微泡，静置若干时间(例如10分钟)待其稳定后即可使用。

步骤S2，制备实施例1述及的微流控芯片。其中，制备一对叉指换能器，每个叉指换能器有两个共振频率，其中一个共振频率为另一个共振频率的整数倍，例如分别为15MHz和30MHz。将叉指换能器与PDMS腔道通过等离子处理的方法绑定，使其成为声表面波微流控芯片，此外还可以研究芯片的加工工艺，探索最佳涂胶厚度、曝光时间、以及镀膜厚度；还可以研究金属膜材料、指条对数、声孔径尺寸对器件插入损耗及器件带宽的影响。

在制备这一对叉指换能器时，每个叉指换能器分为三部分：第一部分的叉指电极对应的声表面波共振频率为例如15MHz，对应的指条宽度为65微米，在系统中主要起到富集CTCs、血细胞的作用；第二部分为过渡带，由于第一部分与第二部分的指条宽度不同，需要过渡带进行连接，但由于过渡带的指条斜率较大，插入损耗较大，在系统中不起到筛选的作用，只起到连接第一部分与第二部分指条的作用；第三部分的叉指电极对应的声表面波共振频率为例如30MHz，对应的指条宽度为32.5微米，在系统中主要起到分选CTCs的作用。声表面波微流控芯片的制备流程，主要包括涂胶、光刻、镀膜、剥离、等离子处理等工艺，可参考已有的相关技术实现。以下过程说明中以第一电极部分的声波共振频率为15MHz、第二电极部分的声波共振频率为30MHz为例进行说明，但应理解，这些数值仅仅是为了描述上方便而给出的距离，其它数值也是可以的，只要保证第二电极部分的声波共振频率为第一电极部分的整数倍即可。

芯片中的腔道为PDMS腔道，其包括两个入口，分别进入外周血液与靶向细胞，出口为三个，分别为CTCs、血细胞和CTCs，腔道的宽度为例如65微米，深度为例如50微米，一种具体实现中可利用软光刻的工艺制备PDMS腔道。

步骤S3为CTCs富集阶段(如图2示意性示出的纵向的两条虚线曲线截出的部分)，即将外周血液与靶向微泡分别通过两个入口注入芯片内，在对叉指换能器施加15MHz连续正弦信号，便可在PDMS腔道内形成一个驻波声场，靶向微泡，血液中CTCs、红细胞、白细胞、血小板将聚集在驻波节点的位置，提高CTCs的浓度。另外，使CTCs与靶向微泡能够得到充分的接触，靶向微泡能够牢固的粘附在细胞表面，增强CTCs的声学敏感性。

在CTCs富集阶段，当外周血液与靶向微泡通过注射泵注入到PDMS腔道内，微泡与血细胞，CTCs均匀的散落在PDMS腔道内。对一对叉指换能器同时施加15MHz的连续正弦信号，在PDMS腔道内构建以平面驻波声场，细胞与微泡在驻波声场内，受到的声辐射力可分别表达为：

$F_{\mathrm{rs}}^{\left(\mathrm{st}\right)}=\mathrm{\π}{\mathrm{\ρ}}_0{\left|A\right|}^2\sin \left(2\mathrm{kd}\right){\left(k{R}_r\right)}^3\frac{5-2{\mathrm{\λ}}_p}{3(2+{\mathrm{\λ}}_p)}---\left(1\right)$

$F_b^{\left(\mathrm{st}\right)}=\frac{\mathrm{\π}{\mathrm{\ρ}}_0{\left|A\right|}^{2}k{R}_b(-{\mathrm{\ω}}_0^2/{\mathrm{\ω}}^2)\sin \left(2\mathrm{kd}\right)}{{(1-{\mathrm{\ω}}_0^2/{\mathrm{\ω}}^2)}^2+{\mathrm{\δ}}_{\mathrm{rad}}^2}---\left(2\right)$

通过公式(1)与公式(2)可知：细胞受到的声辐射力方向与细胞的可压缩比与密度有关，而微泡受到的声辐射力方向与微泡的共振频率和声波的共振频率有关。本发明中，由于细胞的密度大于液体介质密度，在驻波声场中，细胞将向节点移动，并被捕获在驻波声场节点位置。另一方面，磷脂微泡的共振频率一般为2-8MHz，远小于声波频率(15MHz)，微泡最终也将被节点俘获。这表明在本发明中微泡与细胞所受到的声辐射力方向相同，并且微泡与细胞均将被捕获在驻波节点的位置，由于腔道内包含四分之一个波长，这样细胞将排列在驻波声场中节点的位置，即腔道中心的部位。在这一阶段，由于靶向微泡与CTCs均停留在声场节点的位置，靶向微泡与CTCs均具有较高的浓度，能够使得靶向微泡与CTCs细胞充分接触，使得CTCs与靶向微泡通过表面配体与抗体的结合，微泡牢固的粘附在CTCs表面，形成一个整体。

步骤S4为CTCs筛选步骤。通过富集阶段，CTCs、靶向微泡、红细胞、白细胞、血小板均将汇聚为一条直线，由于微流体的层流特性，富集的细胞在流过15MHz的驻波声场后，这些细胞仍然会在一条直线中移动。与此同时，对叉指换能器施加30MHz的连续正弦信号，通过调节施加信号的电压，使得粘附靶向微泡的CTCs发生偏移，CTCs细胞将移动到30MHz声场中的节点位置；而血液中的红细胞、白细胞、血小板仍然在层流拽力的作用下依旧在15MHz声场中的节点位置移动，从而实现在血液中筛选CTCs的目的。

在CTCs筛选阶段(如图2示意性示出的横向的两条虚线直线截出的部分)，由于微流体中流体的雷诺数很低，流体为层流，层流效应将使聚集的CTCs与血液细胞经过第一阶段与过度带后依旧沿着腔道的中心移动，这时通过对叉指换能器施加30MHz连续交流信号，在PDMS腔道内形成一个30MHz的驻波声场，这样腔道内将会形成两个驻波声场的节点，分别位于腔道的壁面位置，如图2所示。通过公式(1)与公式(2)可知，在相同的情况下，微泡的声阻抗差异较大，微泡受到的辐射力远大于细胞所受到的声辐射力，所以，微泡的移动速度远大于细胞的移动速度。由于CTCs表面粘附了大量的靶向微泡，使得CTCs的声阻抗产生了明显的差异，在相同的情况下，CTCs细胞比血液细胞受到的声辐射力更大，对声波更敏感，更加容易移动到30MHz声波的节点位置。这与免疫磁珠的方法有些类似，粘附磁珠的细胞对磁场敏感，可移动到磁极位置。通过调节施加在叉指换能器的电压，根据CTCs与血液细胞的声阻抗差异，可控制CTCs与血液细胞的移动，使得CTCs细胞移动到30MHz的节点位置，即腔道的两个壁面，而血液细胞受到的声辐射力不足以抵抗层流引起的拽力，而依旧沿着腔道的中心移动，从而实现筛选CTCs的目的。

一种示例中采用本实施例的细胞筛选方法进行实验，该示例的实验表明：

(1)靶向微泡制备与特异性肿瘤细胞的粘附。采用深圳先进技术研究院制备的Lyp-1靶向微泡可与MDA-MB-453特异性粘附，而是非靶向微泡则不能够与肿瘤细胞粘附，如图3和图4所示，其中图3表明靶向微泡可以与肿瘤细胞的粘附，而图4表明非靶向微泡不能与肿瘤细胞粘附。

(2)细胞的富集。为了研究声表面波微流控芯片操控大量微纳米颗粒的性能，将发出红色荧光的细胞以5μl/min的速度注入到PDMS腔道中。从实验可以看出，开始时注射泵压力驱动细胞悬浮液，细胞在腔道内快速移动，当对两个叉指换能器同时施加两个相同的射频信号，细胞开始快速聚集，经过约10s后，细胞被排列为一条直线，并且细胞荧光强度随着聚集细胞数量的增多而不断增强。

(3)声分选实验研究。基于微机电系统(MEMS)工艺，制备声表面波微流控芯片，利用非对称声场形成的声流效应聚集微泡。示例中，在一维驻波声场中，细胞被排列为一条直线，通过改变施加在叉指换能器的频率，改变驻波声场中节点位置，可实现细胞的横向移动，从而实现细胞的筛选。这种方法通过调节驻波场中行波的频率，改变驻波场中节点位置，从而引起微粒(细胞、微泡)任意定点移动，不仅能够连续、精确、可控的移动微粒；还可对微粒的运动轨迹进行编程和多维度的空间操控；更重要的是体外的细胞实验证实，该方法不会影响细胞的活性，可以实现筛选CTCs。利用频率调制方法，微泡的移动分辨率为2.2μm，微泡移动的最大速度可达465μm/s。

(4)微泡与细胞在驻波声场中受力。在15MHz驻波声场中，将微泡和细胞同时注入到微腔道内，施加驻波声场，实验发现微泡与细胞均朝向驻波声场的节点位置移动，即微泡与细胞所受到的声辐射力方向一致，并且微泡的移动速度远大于细胞，这表明微泡对声波更加敏感，更容易受到声波的作用，也就是说可通过在CTCs表面粘附微泡增强CTCs的声波敏感性。

(5)实验表明利用本实施例的细胞筛选方法进行筛选不会影响细胞的生物活性。具体地，实验通过实时量化观测细胞活性，可以采用钙黄绿素(Calcein-AM)和碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)溶液，其可分别对活细胞和死细胞染色。Calcein-AM的乙酸甲基酯亲脂性很高，可透过细胞膜，通过活细胞内的酯酶作用，脱去AM基，产生的Calcein(钙黄绿素)发出强绿色荧光，因此Calcein-AM仅对活细胞染色。另一方面，作为核染色染料的PI不能穿过活细胞的细胞膜。它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光，因此PI仅对死细胞染色。利用Calcein AM/PI荧光双染色的特点，活细胞包质内酯酶可将Calcein-AM转化为calcein，进而发出黄绿色荧光。然而，PI可以通过坏死细胞紊乱的细胞膜与DNA结合，产生红色的荧光。将细胞溶液分成三组：第一组的细胞为阳性对照组，将细胞继续放置在37℃的培养箱内培养；将第二组的细胞为声表面波筛选后的细胞；第三组的细胞为阴性对照组，将细胞放置在65℃的烘箱内烘烤1小时。示例实验结果显示，在第一组中，几乎所有的细胞都发出绿色的荧光，只有几个细胞发出红色荧光，在第二组的被声表面波筛选的细胞中，细胞发出绿色荧光的亮度与第一组的细胞没有明显的差别，大概有85％的细胞在声表面波的筛选后依旧保持其活性，这表明声表面波筛选不会明显的影响细胞活性，而在第三组中，98％的细胞已经凋亡，几乎所有的细胞都发出红色荧光。这些结果表明，声表面波筛选后的细胞活性与阳性对照组差别不大，表明这种筛选方法不会对细胞的生物活性产生影响。

综上，本实施例的关键点如下：

首先，是靶向微泡的引入。靶向微泡目前主要作为超声造影剂被适用于超声成像中，靶向微泡也可在表面嵌入药物实现超声给药的目的。然而，本实施例将靶向微泡作为一种载体，粘附在细胞表面，增强细胞的声阻抗差异，提高细胞受到的声辐射力，加快CTCs的横向移动速度，提高CTCs分选效率。

其次，本实施例提出利用声表面波芯片作为CTCs分选芯片，声表面波芯片通常作为谐振器、滤波器广泛的应用于电子产品中，主要利用声表面波的电学信号，然而本实施例主要利用声表面作为驱动源，更注重的是声表面波的驱动能力，是CTCs筛选的基础。

再次，是利用声波富集CTCs。目前传统的CTCs富集方法主要依靠流动聚焦原理，芯片中需要鞘流的注入，引入鞘流不仅会对外周血、CTCs细胞进行稀释，而且鞘流引起的剪切应力有可能损伤CTCs的生物活性。本实施例利用驻波效应，将血液中CTCs、血细胞均富集于驻波节点位置，不需要鞘流，更大程度上保护了细胞的生物效应。此外，本实施例不需要先将CTCs与微泡混合，而是利用驻波声场的势阱效应，将靶向微泡与CTCs同时俘获在驻波节点位置，通过充分接触，使CTCs表面充分、稳定的粘附靶向细胞，提高系统的稳定性和筛选的特异性。

最后，对于筛选CTCs，本实施例通过调控声波的频率、幅值来分选CTCs细胞。通过粘附靶向微泡，CTCs细胞对声波更加敏感，更容易受到声波的作用，CTCs更容易移动到驻波声场中节点位置(腔道两侧)，而其他血细胞在较小的声辐射力作用下不足以抵抗层流引起的拽力作用，依旧沿原先的路径移动(腔道中心)，从而实现了分选目的。本实施例不需要改变器件的结构、腔道的尺寸，只需要改变射频信号的输入便可实现细胞的分选。

可以理解，对于上述实施例的基于的筛选方法，除了可以改变声波的频率、幅度，还可以改变声波的相位、幅度。而且，声波分选芯片除了基于声表面波，还可基于体声波，即利用压电陶瓷为激励源实现细胞筛选。此外，利用靶向微泡筛选CTCs的方法不仅仅适用于CTCs，只要细胞之间的声阻抗有差异，也适用与分选血液细胞，例如将血小板在血细胞中分离。

综上各实施例可知，本发明通过构建声波微流控芯片，并制备靶向微泡，首先将血液中的CTCs富集，使CTCs与靶向微泡充分接触，使靶向微泡粘附在CTCs表面，其后，通过调控声波的幅值、相位，筛选出血液中CTCs。这种基于靶向微泡的CTCs声学筛选方法，可提高筛选效率，而不影响细胞的生物活性，为肿瘤转移早期提供新的诊断方法。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (10)

1.一种用于对特异性细胞进行筛选的微流控芯片，包括基底(21)和附着于所述基底上的腔道(23)，其特征在于，还包括声波激励源；所述腔道包括中间通道、位于所述中间通道一端的用于供靶向微泡和含有特异性细胞的血液注入的入口(231,232)和位于所述中间通道另一端的用于供分离出的特异性细胞和血细胞输出的出口(233,234,235)；所述声波激励源位于基底上且位于所述中间通道的两侧，所述声波激励源包括沿所述中心通道并向出口方向延伸的两部分，其中靠近出口的第二部分对应的声波共振频率是远离出口的第一部分对应的声波共振频率的整数倍。

2.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述声波激励源包括一对叉指换能器(22)，所述叉指换能器位于基底上且位于所述中间通道的两侧，所述叉指换能器包括第一电极部分(221)、第二电极部分(223)和用于连接所述第一电极部分和所述第二电极部分的过滤带(222)，所述第一电极部分对应所述远离出口的第一部分，所述第二电极部分对应所述靠近出口的第二部分。

3.如权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，所述第一电极部分的指条宽度为所述第二电极部分的指条宽度的整数倍。

4.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述基底为128度YX双面抛光的铌酸锂晶体；所述腔道由聚二甲基硅氧烷材质制作；所述入口包括用于供靶向微泡注入的第一入口(231)和用于供血液注入的第二入口(232)，所述出口包括用于供分离出的特异性细胞输出的第三出口(233)、第五出口(235)和用于供血细胞输出的第四出口(234)，且所述第四出口位于所述第三出口和所述第五出口之间。

5.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述声波激励源包括基于体声波的激励源。

6.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述特异性细胞包括循环肿瘤细胞；所述特异性细胞与所述靶向微泡的特异性不同，且所述靶向微泡在声波激励源的作用下粘附于所述特异性细胞。

7.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述腔道采用软光刻工艺制作。

8.一种用于对特异性细胞进行筛选的方法，其特征在于，包括：

细胞富集步骤：将含有特异性细胞的血液和已制备的靶向微泡注入如权利要求1所述的微流控芯片，当所述血液和所述靶向微泡移动到与所述第一部分相对应的位置时，对所述微流控芯片施加信号以在所述腔道内形成驻波声场，且使得血液中的血细胞以及与靶向微泡充分接触的特异性细胞沿所述中心通道并朝向出口方向移动；

细胞分选步骤：当所述血液和所述靶向微泡移动到与所述第二部分相对应的位置时，调整所述信号的频率或相位，从而使得靶向微泡及与其充分接触的特异性细胞的移动速度大于血细胞的移动速度。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述特异性细胞为循环肿瘤细胞；所述靶向微泡的制备包括：

步骤A：在容器中按一定比例将一定量的二硬脂酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇2000修饰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺溶解在三氯甲烷中且在涡旋混合器上混匀，通入氮气除去三氯甲烷并使磷脂在容器壁上形成一层均匀的薄膜，真空干燥若干小时；

步骤B：在含有干燥磷脂薄膜的容器中加入经脱气处理的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，所述缓冲溶液含有10％体积的甘油和10％体积的丙二醇，加热所述缓冲溶液到相转变温度以上，水浴超声震荡使磷脂溶液分散彻底直至透明；

步骤C：将透明的磷脂溶液分装置西林瓶中，并将西林瓶中的空气置换为生物惰性气体；

步骤D：震荡西林瓶从而制备出微泡。

10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述微流控芯片的声波激励源为位于基底上且位于所述中间通道的两侧的一对叉指换能器，所述叉指换能器包括第一电极部分、第二电极部分和用于连接所述第一电极部分和所述第二电极部分的过滤带，所述第一电极部分对应的声波共振频率为所述第二电极部分对应的声波共振频率的整数倍。