CN114096351A - 用于通过光学排斥和声悬浮构建细胞聚集体的微流控芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微流控芯片，其特别用于细胞培养，该芯片包含：‑块体(5)，其由可生物相容的材料制成，‑通道(7、8)，其在该块体中制成用于使浸泡在液体、特别是培养液中的细胞通过，‑谐振腔(6)，其在块体中制成，连接到通道并且包括用于容纳来自通道的细胞的壁，‑发生器(12)，其产生声波并且能够形成至少一个在谐振腔中声悬浮的细胞聚集体，‑至少一个光发射器(13、13')，其能够通过谐振腔的至少一个壁照射谐振腔中的细胞并且同时以通过光学排斥技术构造至少一个聚集体的方式产生声波。

Description

用于通过光学排斥和声悬浮构建细胞聚集体的微流控芯片
本发明涉及微流控芯片，其用于操纵例如尺寸为0.1μm至300μm的微米颗粒或纳米颗粒的物体。更具体地，本发明涉及通过应用声波使细胞悬浮。以下主要涉及细胞，但本发明也适用于至少对声波敏感的任何颗粒。
一般而言，声悬浮的原理和声悬浮中颗粒(或细胞)聚集体的形成在图1中被概述。根据频率，可以在通道3的两个相对的壁1和壁2之间产生1至N个压力节点。要满足的条件是h＝N.λac/2，其中h是腔体的高度，λac是超声波的波长(声波)。换能器4被布置在通道外侧与壁2接触从而产生声波通过该壁2。壁1是反射器，其反射通道3中的声波从而产生驻波和在腔体的整个高度上分布的N个压力节点。这些压力变化导致产生声辐射力场。以这种方式产生的声辐射力的轴向分量然后将促进在限定声悬浮平面的每个压力节点中形成聚集体。细胞分布在几个聚集体上，每个聚集体布置在限定平面的压力节点上。图1中制得的线条仅表示导致压力节点的声辐射力。
更准确地说，在声辐射力的作用下，悬浮的颗粒(或细胞)被迫向声压力节点迁移。一旦处于不同的声悬浮平面中，声辐射力的径向分量就迫使颗粒聚集在一起并且在每一层形成聚集体。定义超声波的频率从而获得分布在整个通道高度h上的多个压力节点。
在目前的声流控应用中，声辐射力被用于随着物质的物理和机械性能(即它们的密度和它们的可压缩性以及它们的大小)的变化来分离物质，因为声力直接取决于这些参数，如在以下等式中定义的：
Figure BDA0003395030080000011
其中r是颗粒的半径，
Figure BDA0003395030080000012
是声学对比因子，kac是声波数，E0是声能。这定义了颗粒(或细胞)对声辐射力的敏感性。颗粒越密集且越大，受到的声力越大，颗粒向压力节点迁移的速度就越快。该力通常被用于随着这些性能的变化来分离流动的颗粒或细胞。
文献WO 2019/002551 A1是已知的，其描述了通过施加声波以使它们悬浮来分离流动颗粒的方法。该文献还描述了光学排斥的原理。本发明关于悬浮颗粒的方法和光学排斥原理的应用方面参考该文献WO 2019/002551 A1。
本发明的目的是利用光学操纵的声悬浮原理的新用途。
本发明的另一个目的是能够使由声悬浮产生的聚集体操作优化的装置。
本发明的又一个目的是用于产生聚集体的新方法。
上述目标中的至少一个是通过微流控芯片实现的，所述微流控芯片包含：
-块体，其由可生物相容的材料制成，
-通道，其在块体中制成用于使浸泡在液体、特别是培养液(培养基)中的细胞通过，
-谐振腔，其例如旨在细胞培养，在块体中制成，与通道连接并且包含用于容纳来自通道的细胞的壁，
-声波发生器，其能够形成在谐振腔中声悬浮的至少一个细胞聚集体，
-至少一个光发射器，其能够通过谐振腔的至少一个壁照射谐振腔中的细胞并且同时产生声波，从而通过光学排斥技术来构建所述至少一个聚集体。
谐振腔包含用于容纳细胞的壁。换言之，细胞可穿透谐振腔中它们不再受到通道中的流动影响的区域。
因此，它们可受到声波和光波的作用。
它们还可相对于通道中的流动运动保持不动。不动是指它们受到介质的微小运动，但不受流动的线性位移运动的影响。
可调节流速以使其不涉及形成特别是一种或多于一种聚集体的细胞。然后声力足够大以抵抗流动。
利用根据本发明的微流控芯片，可以同时使用声波和光束，从而通过声波使细胞保持悬浮在一层或多于一层上，同时根据光学排斥技术通过光束来操纵它们。
根据本发明的微流控芯片构成光声生物反应器，其中细胞可以声悬浮方式培养并且通过特定照射进行操纵，从而在连续的细胞层中构建聚集体。构建是指彼此不同的细胞层的空间分布。
在谐振腔中，细胞浸泡在不会干扰所用声波或光束的液体中，并且适合细胞培养。
谐振腔有利地旨在培养声悬浮的细胞。本领域技术人员清楚对声波和可能对某些光束敏感的内源性或外源性的任何微米颗粒或纳米颗粒均可用于本发明。
因此，同时使用光学和声学性能，可在声悬浮中空间构建细胞聚集体。该操作可通过连续注射不同类型的细胞重复数次，这些细胞被标记(荧光生物标记)或未被标记，并且对不同的光波长起反应。
由于声波产生的声辐射力使其可以产生颗粒聚集体，因此只要需要，这些颗粒聚集体就可以保持声悬浮状态。该力的大小是为了将该聚集体以声悬浮方式保持在谐振腔中，这构成声阱。
根据本发明的有利特征，微流控芯片还可包括至少一个第二光发射器，这两个发射器布置成分别通过谐振腔的两个相对的壁发射。
优选地，两个光发射器以不同波长发射。这种布置使其可以通过光学排斥技术同时或依次作用于不同类型的细胞。这也使其可以对称作用于聚集体上，因为穿过流体厚度并且沿其传播轴遇到聚集体而导致光束的强度衰减。由于这种设置，顶部聚集体的作用方式与底部聚集体相同。
根据本发明的实施方案，声波发生器可包含上部元件和下部元件，其将至少一部分谐振腔夹持在两个相对的壁上；上部元件是固定的或可移除的，其是上部换能器或声波反射器；下部元件是下部换能器，上部换能器、下部换能器能够发射声波。此外，上部元件和/或下部元件对于提供用于照射细胞的光束是可穿透的。
换言之，发生器包含与反射器组合的下部换能器，该反射器能够反射来自下部换能器的声波从而在谐振腔中产生声辐射力。然而，反射器可以被替换为上部换能器以同步方式产生与下部换能器相同的声波，从而也在谐振腔中产生声辐射力。
优选地，两个换能器中的至少一个对于光波长是可穿透的或者是环形的，以便允许光照射进入其中心。
上部元件的可移除性质使其可以将形成聚集体的细胞排空或回收。
根据本发明的一个实施方案，谐振腔在其下端由下部换能器封闭。下部换能器因此构成谐振腔的下壁。在这样的实施方案中，下部换能器与培养基直接接触。这种配置使其可以提高谐振腔的能量效率。
根据本发明的有利特征，下部换能器可被布置在谐振腔内。
因此提供了能够在谐振腔内滑动的可移除的下部换能器。优选地，换能器的尺寸使其可以确保密封谐振腔。在这种情况下，形成培养基的可用体积小于谐振腔的总体积。因此可以限定不同体积的谐振腔。因此，它是具有可变体积并且因此具有可变数量的悬浮平面的腔体。
有利地，谐振腔可具有至少一个止挡件，其用于在下部换能器插入谐振腔后阻挡下部换能器的头部。
根据本发明的实施方案，谐振腔可以在其下端由固定的或可移除的膜封闭，该膜对于来自布置在谐振腔外侧的下部换能器的声波是可穿透的。
该膜可以由聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料或环烯烃共聚物(COC)制成，或者可以是黏性PCR(聚合酶链反应)膜，它很容易分离，并且能够很好地传输超声波。
例如，可移除的膜能够在培养结束时使细胞聚集体通过或回收细胞聚集体。
优选地，谐振腔是圆柱体，圆柱体的侧壁由块体构成。上基座可由反射器或上部换能器形成。下基座可由膜形成或直接由下部换能器形成。
根据实施方案，通道可以在圆柱体侧壁的上端通入谐振腔。这种布置使其可以通过圆柱体侧壁的上端向腔体提供细胞。
根据本发明，谐振腔可以具有止挡件，其布置成使得下部换能器的头部可以被插入以减小谐振腔中的可用体积的高度，直到它等于通道的高度。
理想地，可用体积使其可以制备一个或多于一个单层或多层细胞聚集体。
根据本发明的有利实施方案，通道可以制作在块体的上表面上，并且黏合的或可移除的条带可覆盖块体的所有表面，包括谐振腔的上端。该条带对于提供用于从外侧照射谐振腔的细胞的光束是可穿透的。此外，当换能器与其相对布置时，该条带反射来自谐振腔内侧上的换能器的声波。
优选地，通道和圆柱体可彼此垂直布置。块体然后还可包括两个微通道，其从一侧到另一侧穿过块体、平行于圆柱体并且分别连接至通道的两个自由端；第一微通道旨在使细胞到达通道中，第二微通道旨在使细胞从通道中排出。
作为非限制性实例，反射器是由如下物质制成的条带：玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、石英、硅、聚二甲基硅氧烷(PDMS)或环状聚烯烃共聚物(COC)。这种条带被设计成一方面确保良好传输，另一方面确保良好反射。优选地，反射器可从与块体的材料相同的材料开始设计并且具有处理为反射声波的内表面。
根据本发明的芯片可包含多个微通道，其在块体的厚度中制成并且通向谐振腔以供细胞进入和/或离开。优选地，由于声辐射力，这些微通道分别与设置在谐振腔中的压力节点对齐。例如，这些微通道可用于注入与通过通道注入的细胞不同性质的细胞以注入营养素以及排出细胞。
有利地，谐振腔的高度可以根据待产生的压力节点的数量和由发生器产生的声波的波长变化。谐振腔被设计成容纳多个细胞层的叠加体，同时通道的高度优选地适应于细胞的大小。
谐振腔比通道高，例如是细胞直径的数倍，特别是直径的至少10倍。可以尝试将第一压力节点置于通道的水平面上，因此通道高度为λ/4左右。
优选地，通道可以具有直线形状，使得入口端和谐振腔之间的通道截面与谐振腔和通道另一出口端之间的通道截面共线。
根据本发明的实施方案，块体可由聚二甲基硅氧烷(PDMS)或环状烯烃共聚物(COC)制成。
特别地，块体从透气材料开始设计以便促进介质、谐振腔的内容物和必要时的外侧之间的气体交换。通道被蚀刻或模制在块体中，并且可以安装在培养箱中从而确保在气体和温度方面的最佳培养条件。
特别地，谐振腔的高度可以设计成大于通向该谐振腔的通道的直径。因此，通道是直径较小的管道，其通常适用于仅在一条线上输送细胞，显然与谐振腔不同，谐振腔具有较大的尺寸，能够在一个平面内和在一个体积中容纳细胞聚集体。
作为非限制性实例，谐振腔的直径可以为1至50mm，谐振腔的高度为5至15mm，并且通道的高度等于450μm。
此外，根据本发明的微流控芯片可以包括至少一个额外的微通道，其在块体中在与通道相同的平面中制成。这是简化布置，其使得能够向谐振腔提供细胞并且从谐振腔排出细胞，该细胞可以在与来自通道(其实际上是主微通道)的细胞相同的平面中形成聚集体。
该额外的微通道还可用于注入其他细胞、生物标记，或者在细胞培养过程中清洗培养基或恢复细胞的制备。
根据本发明的另一方面，提出在如上定义的微流控芯片中以声悬浮方式操纵细胞的方法。该方法包括以下步骤：
-将细胞通过通道的入口注入谐振腔，
-产生声波以使注入的细胞声悬浮从而在至少一层中形成细胞聚集体，
-至少一个以特定光波长照射细胞同时保持声波的阶段，从而根据光学排斥原理操纵细胞。
根据本发明，使用选择性光声流体排斥原理，其描述了以下事实：一个颗粒或细胞对某些光波长起反应而其他颗粒或细胞根本不反应。
根据本发明的有利实施方案，注入的细胞具有不同性质，产生声波和照射的步骤可如下进行：
-产生声波使注入的细胞声悬浮，同时施加特定波长的光束，使得能够排除对该波长敏感的细胞，从而使仅有对这种光波长不敏感的细胞在一层中形成聚集体，
-保持声波并且停止光束，使得对光束波长敏感的细胞现在在已经形成的聚集体外围形成聚集体，从而获得放射状结构的聚集体。
因此，本发明使得能够制备放射状结构的单层细胞聚集体。因此，聚集体可以由不同细胞的连续环组成，从而使细胞的共培养成为可能，这些步骤对于类器官的形成是必不可少的。
细胞聚集体是指满足所有以下特征的细胞层：至少两个包括在所述层中的细胞，特别是包括在所述层中至少10％、更好25％、优选50％的细胞接触，并且所述层在其至少一部分长度上在其横向尺寸的至少之一上在位移期间具有一连串细胞。
根据本发明的有利实施方案，通过执行以下步骤来制备由几层聚集体形成的三维结构：
-注入步骤，其包括将细胞通过一个或多于一个入口注入谐振腔，和
-产生声波的步骤，其还包括产生声波，用于声悬浮在多个水平面上注入的多个细胞聚集体，所述水平面是声压力节点，声压力节点的数量取决于声波的波长和谐振腔的高度。
本发明使其可以一个个地产生多个单层(细胞片)，这为细胞培养节省大量时间，因为不再需要使细胞片胰蛋白酶化，将其与可能的固体基质上分离，以便然后将其储存在另一个上。该过程更特别适用于MSC类型(间充质基质细胞)干细胞培养，其中培养细胞以制造细胞片，然后叠加，但它与旨在形成细胞片的任何类型的细胞培养物相关。
利用本发明，可以预想在声悬浮中制造可以在声悬浮中保持和培养的球体、类器官或类肿瘤。
本发明使其可以进行细胞培养同时在培养期间保持聚集体或使所得聚集体在声悬浮中不动。
因此，这样的系统可在声悬浮中培养MSC持续18天。在该培养结束时，细胞是活的，一旦沉积在基质上就会正常增殖。因此，该系统已通过短期(几个小时)和长期(几周)的培养验证。由于营养素的流动和所用材料的孔隙率使得能够使培养箱中的气体交换。将声学生物反应器放置在培养箱中从而使细胞培养成为可能。本系统的紧凑性使其可以在培养箱中放置多个芯片。因此，可以在声悬浮中并行进行培养多个片或球体(每孔几十个，培养箱中的几个孔)。
本发明的其他特征和优点在阅读实施方式和实施方案的详细描述后将变得明显，这些实施方式和实施方案绝非限制性的，参照附图，其中：
[图1]图1是根据现有技术通过声悬浮在通道中产生压力节点的示意图；
[图2]图2是根据本发明的装置的实例的示意性分解图，
[图3]图3是根据本发明的装置的实例的仰视图，
[图4]图4是根据本发明的沿着通道纵轴的示意性截面图，其中光发射器和声波换能器布置在谐振腔外侧，
[图5]图5是根据本发明的沿着通道纵轴的示意性截面图，其中光发射器和声波换能器在其基部上封闭谐振腔，
[图6]图6是根据本发明的沿着通道纵轴的示意性截面图，其中光发射器和声波换能器布置在谐振腔内，
[图7]图7是根据本发明的沿着通道纵轴的示意性截面图，其中光发射器和声波换能器布置在谐振腔内的上止挡件处，
[图8]图8是根据本发明的沿着通道纵轴的示意性截面图，其中光发射器和声波换能器在其基部封闭谐振腔，通道布置在块体的厚度中，
[图9]图9是根据本发明的具有两个光发射器和一个声波换能器的图8中的装置的视图，
[图10]图10是根据本发明由材料开始设计的换能器的示意图，所述材料对于为实现排斥原理提供的光束是可穿透的，
[图11]图11是根据本发明的具有环形形状的换能器的示意图，
[图12]图12是根据本发明的沿着通道纵轴的示意性截面图，通道具有两个光发射器和具有围绕谐振腔布置的中空圆柱体形状的换能器，
[图13]图13是根据本发明的与图2至图12的装置相容的块体的示意性截面图，其中多个微通道蚀刻到块体中并且通向谐振腔，
[图14]图14是根据本发明的径向结构的细胞聚集体的示意性截面图，和
[图15]图15是根据本发明的几个径向和横向构建的细胞聚集体的示意性截面图。
[图16]图16是说明两种细胞的喷射速度随波长变化的曲线图；
[图17]图17是说明具有不同尺寸的几种不同类型细胞的喷射速度随波长变化的曲线图；
[图18]图18说明血红细胞的喷射速度随波长变化的曲线图；
[图19]图19说明血红细胞的喷射速度随波长变化的曲线图；
[图20]图20说明血白细胞的喷射速度随波长变化的曲线图；
[图21]图21包括两张照片，其说明从10-μm白色聚苯乙烯颗粒与3-μm红色颗粒的混合物开始形成白色颗粒的聚集体；
[图22]图22包括四张照片，其是在声悬浮中通过光学排斥血红细胞形成“纯化的”聚集体期间于不同时间拍摄的；
[图23]图23包括三张照片，其说明应用于多节点腔体的光学排斥效应；
[图24]图24说明分层的环形结构，其包括直径为15μm的红色聚苯乙烯颗粒和40-μm的白色聚苯乙烯颗粒。
下文将描述的实施方案绝不是限制性的；本发明的变体可以特别地实施，仅包括下文描述的与描述的其他特征分离的特征的选择，如果该特征的选择足以赋予技术优势或相对于现有技术的状态区分本发明即可。该选择包括至少一个、优选功能性特征而没有结构细节，或者仅包括部分结构细节，如果仅该部分足以赋予技术优势或相对于现有技术的状态区分本发明即可。
特别地，提供描述的所有变体和所有实施方案以与在从技术角度对此没有异议的所有组合组合在一起。
附图中，多个附图共有的元件保持相同附图标记。
尽管本发明不限于此，但现将描述适用于在声悬浮中培养细胞聚集体的微流控芯片。
图2中表示根据本发明的微流控芯片的一个实例的一组组件。可以看到块体5，其例如由PDMS材料制成并且具有平行六面体形状、具有上表面和下表面。具有圆柱形形状的谐振腔6在两个表面之间的块体5的整个厚度上形成在该块体的中心。该谐振腔6的目的是通过声力捕获细胞。
为了向谐振腔6供应，将通道7、8蚀刻在块体5的上表面上，使得该通道和腔体的内部是可进入的。通道具有第一部分7，其旨在使细胞从入口微通道9朝向谐振腔进入。它还具有第二部分8，其旨在将细胞从谐振腔6朝向出口微通道10排出。两个入口和出口微通道制造在块体的厚度中，如谐振腔，并且通向块体6的下表面，该块体的背面更容易进入不同装置用于提供和管理根据本发明的微流控芯片。
优选地，该块体从能够确保在必要时在谐振腔和外部(培养箱)之间进行气体交换的生物相容性材料开始设计。设计为使得根据本发明的微流控芯片能够确保营养素的流动和培养基的流动，必要时在谐振腔内。当然，这使其可以注入细胞和排出细胞，并且使其可以在谐振腔内产生具有大尺寸的聚集体。
微流控芯片安装在培养箱中，从而确保最佳的培养条件(气体和温度)。
还可看到旨在特别是通过等离子结合覆盖块体5的上表面的玻璃条带。它可以是与块体5一起制备的条带。该玻璃条带11至少在其面向谐振腔的内壁上具有能够反射来自在块体6的下表面侧上相对设置的换能器12的声波的内表面。有利地，玻璃条带对于来自布置在条带11上方的光发射器13的光束是可穿透的。
条带11可从以下材料中的一种或组合开始设计：玻璃、PMMA、石英、硅、COC、PDMS，从而一方面确保良好透射，另一方面确保良好反射。
换能器12由容纳压电元件的不锈钢圆柱体构成，其工作频率可根据谐振腔的高度变化来选择。对于厚度(高度)从几毫米到几十微米不等的谐振腔，该频率可在0.1MHz至10MHz之间选择。
图3是块体5的俯视图。在通道7、8的每个末端都可看到微通道9和10的端部。该通道具有从微通道向谐振腔加宽的形状，从而确保细胞在进入和排出时的良好进展。例如，通道可具有高度为1至30mm的横截面(圆形、矩形、正方形或其他)。如稍后将看到的，止挡件14和15布置在谐振腔的内壁上并且使其可以在谐振腔的上层处限定约5至30mm的直径。
可制备微通道类型9、10和通道类型7、8的其他入口/出口(未显示)，用于为谐振腔提供相同或不同的细胞、生物标记，或者用于在培养过程中洗涤培养基或恢复细胞的制备。
图4中示出一个实施方案，其中谐振腔的下底由不可渗透的膜16封闭。这种配置使其可以防止位于腔体外侧的换能器12对培养基的任何污染。该膜16可以是可移除的，从而使其可以排出形成在谐振腔中的聚集体。理想地，该薄膜对于用于在腔体中产生声辐射力的声波是可穿透的。它可由PDMS、COC或粘性PCR膜制成。
在换能器12发射的声波的作用下，细胞的流动17和由捕获在谐振腔6中的细胞产生的聚集体18示于图4。
在如可在图5中看到的一个实施方案中，例如，封装的换能器12可以与谐振腔中的培养基直接接触。在这种情况下，没有传输壁，仅有为反射性的玻璃条带11与换能器12相对放置。例如，这种配置使其可以通过取消传输层来提高谐振腔的能量效率，例如来自图4的膜16，其中能量可以消散。
图6示出一个实施方案，其中换能器12插入谐振腔6中。这样的实施方案使其可以根据所针对的应用变化来限定不同体积。谐振腔的有用体积则是变的。止挡件14和15可布置在谐振腔内壁上的不同位置，从而将换能器的头部定位在预定位置中。图7中，这些止挡件布置在谐振腔的顶部。
图8中示出一个实施方案，其中通道7、8完全在块体5的厚度内制成并且在中间层处而不是在其顶部通向谐振腔。当然，该实施方案与上述不同配置相容，即例如与腔体内侧或外侧的换能器相容。然而，如果换能器在内侧，则其必须保持在通道7进入谐振腔的入口下方。
除了细胞培养之外，有利地提供具有不同细胞层的空间结构化的类器官或球体的制造。
根据本发明的微流控芯片特别使其可以将颗粒或细胞注入谐振腔，并且因此在腔体中产生细胞聚集体。这使其可以通过为声悬浮的聚集细胞提供所需培养基来长时间制备细胞培养物。
本发明还使其可以产生复合和结构化细胞层，这从组织工程的角度可以是有用的。为了做到这一点，发射器13用于以特定波长照射细胞并且进行光学排斥技术。
可以注入两种类型的颗粒或细胞的混合物，这些将形成聚集体，其在声波的作用下将两种物质混合。
如果期望在空间上组织聚集体，特别是构造成为环形和同心的连续层的聚集体，则可以使用光学排斥原理。
光学排斥原理使其可以在适合于期望排除的细胞或颗粒的给定波长的光学照射作用下，喷射声悬浮的颗粒或细胞。这种效果取决于颗粒/细胞的光吸收性能。用荧光标记标记的细胞也对荧光标记在吸收波长的照射起反应，特别参见图16至20。
本发明使其可以通过在聚集体外围的连续带形成在平面中结构化的二维聚集体。由此获得如图14所示的径向结构化的聚集体25。这使其可以制造由具有不同性质的圆形细胞带组成的薄片，其可证明可用于制造复杂类器官。
为了做到这一点，注入两种细胞C1和C2的混合物，其中一个吸收给定的光波长λopt1，另一个不吸收。在这种情况下，可使聚集体容易地结构化。实际上，如果聚集区域以波长λopt1照射，则这将阻止C1在声力的作用下聚集。因此，C2物质将形成第一聚集体。然后足以停止波长λopt1的照射，以便C1物质在第一个聚集体周围形成聚集体。
因此，同时使用光学和声学性质，可以空间结构化声悬浮的细胞聚集体。该操作可通过如下重复多次：连续注入不同类型的细胞，这些细胞标记或未标记，并且对不同的光波长做出反应。
图9中，两个光发射器13和13'布置用于同时从谐振腔的两侧照射和/或观察细胞。因此，这使其可以同时从声学聚集区域中排除两种物质。
为了做到这一点，提供使用为可穿透的压电换能器(PZT)19，如图10可见。实际上，可以制造允许提供的光波长通过的可穿透的PZT，因此不受仅从一侧的单一照射的限制。
也可使用(非封装的)环形换能器(PZT)。在这种情况下，可以照射通过环，并且因此同时耦合两个光源。
也可利用来自图12的实施方案来进行双重照射，其中具有中空圆柱体形状的换能器24围绕谐振腔布置。在这种情况下，提供膜21，其在谐振腔的基底形成密封并且对于提供的光束是可穿透的。在这种情况下，两个发射器可以自由地照射谐振腔中的细胞。
悬浮培养的另一个优点是可以在一个腔体中产生几个压力节点，因而在悬浮中一个个地形成细胞聚集体。如图13所示，可以在高度为几毫米例如6毫米的腔体中产生多个节点，例如约十五个(或几十个)。为了做到这一点，可以产生与多个出口微通道23相对的多个入口微通道22。每对入口/出口微通道可设置在压力节点的平面中。然而，也可使用单个入口通道(如通道)在多个压力节点上悬浮布置细胞。
可以对声悬浮的几个细胞聚集体使用光学排斥效应，因此在谐振腔的体积中构造物体。
因此，聚集区域以换能器的轴为中心。然后可以在体积中构造多个叠加的聚集体26，如图15所示，每个聚集体本身能够由不同细胞的几个圆形带(环形结构化)组成。这使其可以预想制造声悬浮的球体、类器官或类肿瘤，其可在声悬浮中保持和培养。
一层层地产生多个单层代表为细胞培养节省相当多的时间。
因此，本发明提出适用于替代在固体基质上进行细胞培养的传统技术的细胞培养的新方法。实际上，在传统细胞培养的情况下，细胞(例如干细胞)将在固体基质上繁殖，但也会移动以重新与其他细胞接触。当细胞达到“汇合”时，即相互接触并因此形成“单层”细胞层(单层细胞)，认为培养终止。
本发明涉及光声生物反应器的设计，其中细胞可在声悬浮中培养，并且细胞聚集体可以通过特定照射进行操纵和结构化从而形成结构化聚集体。
发明人已经表明，光声流控效应可以通过被照射物体的喷射速度Vej来量化。这涉及显示根据本发明的悬浮物体以特别是照射信号波长的函数的速度离开照射区域。这些物体是微米颗粒或纳米颗粒，大小介于0.1μm至300μm之间，并且对使用的波长敏感。
通常，可以测量不同种类颗粒随光学波长、照射强度、显微镜物镜放大倍数变化的喷射速度。这些参数使其可以控制照射功率。图18中，例如，可以特别理解的是，颗粒大小也起着重要作用：颗粒越小，喷射速度就越高。
图16说明样品或颗粒随波长变化的喷射速度。已形成两组颗粒，一组为红色颗粒，另一组为直径为15μm的蓝色颗粒。曲线显示喷射速度取决于光波长，但也取决于颗粒的颜色。在365nm至770nm之间的几个光学波长范围内，红色颗粒从照射区域射出，然而蓝色颗粒从未射出。在该实例中，对于振幅A＝13Vpp，声频为fac＝0.650MHz。
图17中，以下样品在与图16相同的条件下分析：
-3-μm绿色荧光颗粒，
-3-μm红色荧光颗粒，
-10-μm绿色荧光颗粒，
-10-μm红色荧光颗粒，
-15-μm红色颗粒。
观察到样品的大小影响喷射速度。还观察到红色颗粒具有比荧光颗粒高得多的喷射速度。
来自图19的曲线涉及血红细胞(RBC)(血液稀释为1:1000)喷射血速度随着波长的变化。所有实验都是在751kHz的频率和8V的振幅下进行的，并且将分析的血液聚集体放置在腔体中心。
观察到RBC的喷射速度在365nm至约490nm之间、然后在515nm至600nm之间非常高，除此之外血红细胞保持聚集。
图20涉及如下曲线，其显示血白细胞的喷射速度，所述血白细胞从来自健康患者的全血样本中分离并且用DAPI和CD45标记(λexc＝415nm，λ发射＝500nm)，其中声学参数为751kHz和8V。λopt的最大喷射速度＝385nm。标记的GB反应的另外两个波长是λopt＝405nm和460nm。GB不对其他波长作出反应。
下表显示了各种细胞的光声流控响应。
Figure BDA0003395030080000141
Figure BDA0003395030080000151
图21显示了从10-μm白色聚苯乙烯颗粒与3-μm红色颗粒的混合物开始形成白色颗粒的聚集体。混合物受到声力作用，并且以460nm(红色颗粒反应时的波长)、最大功率的60％进行照射，放大倍数为10。声频为1.91MHz，振幅为9V。流速为0.15ml/h。
观察到白色颗粒聚集体的形成，其中捕获的红色颗粒非常少。左图对应于5分钟的时间，而右图显示20分钟后形成的聚集体。白色颗粒因此逐渐集中，其中光学排斥红色颗粒。
图22中的照片涉及通过光学排斥流动的细胞混合物形成声悬浮的“纯化的”聚集体的不同阶段。实验显示了通过在使该排出成为可能的波长处施加信号来排出红细胞。
细胞包括血红细胞(/100)和MDA癌细胞(/100)。照射通过460nm的信号以80％的最大功率获得，放大倍数为10。声频为1.59MHz，振幅为10V。流速为0.15ml/h。
图23显示了应用于多节点腔体的光学排斥效应。在左边的照片中，可以看到微流控芯片中声悬浮的红色颗粒聚集体。聚集体形成实心圆形状的连续层。
在中间的照片中，施加照明首先到达第一层，开始从中心区域排除颗粒从而构成冠部。从底部(靠近照明)开始，各层一层层地转变成一个皇冠，从而每次都为上层腾出光的通道。
在右边的照片中，各层几乎都转变成皇冠。
聚集体由15μm的红色聚苯乙烯颗粒形成。照明通过460nm的信号以60％的最大功率获得，放大倍数为10。声频为1.91MHz，振幅为9V。照明顺序：460关-开，即，首先在白光(460关闭)下形成聚集体，然后在460nm(开启)下照明，以形成声悬浮的颗粒冠。
图24中可看到分层的环形结构。颗粒混合物包含直径为15μm的红色聚苯乙烯颗粒和40-μm的白色聚苯乙烯颗粒。照明通过460nm的信号以60％的最大功率获得，放大倍数为10。声频为1.91MHz，振幅为9V。照明顺序：460开-关，即，声学和光学同时激活，其将红色颗粒从中心排除。然后关闭460nm的照明，这使得它们可以在中央聚集体上形成聚集体。

Claims (28)

1.一种微流控芯片，其能够进行操纵细胞和/或构建细胞和/或培养细胞，所述微流控芯片包含：
-块体(5)，其由可生物相容的材料制成，
-通道(7、8)，其在所述块体中制成用于使浸泡在液体中的细胞通过，
-谐振腔(6)，其在所述块体(5)中制成，与所述通道连接并且包含用于容纳来自所述通道的细胞的壁，使得所述细胞不再受到通道中流动的影响，
-声波发生器(12)，其能够在所述谐振腔中形成声悬浮的至少一个细胞聚集体(18、25)，
-至少一个光发射器(13)，其能够通过所述谐振腔的至少一个壁照射谐振腔中的细胞并且同时产生声波，从而通过光学排斥一部分细胞使得仅对照射不敏感的细胞在一层中形成聚集体的技术来构建所述至少一个聚集体。
2.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于所述芯片包含至少一个第二光发射器(13')，两个发射器被布置为分别通过所述谐振腔(6)的两个相对的壁发射。
3.根据权利要求1或2所述的芯片，其特征在于两个光发射器以不同波长(λopt1、λopt2)发射。
4.根据前述权利要求中任一项所述的芯片，其特征在于所述声波发生器包含上部元件和下部元件，所述上部元件和下部元件在两个相对的壁上夹持谐振腔的至少一部分；所述上部元件是固定的或可移除的，其为上部换能器或声波反射器(11)；所述下部元件是下部换能器(12)，所述换能器能够发射声波；并且所述上部元件和/或所述下部元件对于提供用于照射所述细胞的光束是可穿透的。
5.根据权利要求4所述的芯片，其特征在于所述谐振腔(6)在其下端由下部换能器(12)封闭。
6.根据权利要求4所述的芯片，其特征在于所述下部换能器(12)被布置在所述谐振腔(6)内部。
7.根据权利要求6所述的芯片，其特征在于所述谐振腔(6)具有至少一个止挡件(14、15)，一旦下部换能器被插入所述谐振腔中，所述止挡件用于阻挡所述下部换能器的头部。
8.根据权利要求4至7中任一项所述的芯片，其特征在于所述下部换能器和/或所述上部换能器从材料(19)开始设计，所述材料允许提供用于从腔体外侧照射所述细胞的光束通过。
9.根据权利要求4至8中任一项所述的芯片，其特征在于所述下部换能器和/或所述上部换能器具有环(20)的形状，使得其至少能够使提供用于从腔体外侧照射所述细胞的光束进入所述环的内部。
10.根据权利要求1至4中任一项所述的芯片，其特征在于所述谐振腔在其下端由固定的或可移除的膜(16)封闭，所述膜对于来自布置在谐振腔外侧的所述下部换能器的声波是可穿透的。
11.根据权利要求1至3中任一项所述的芯片，其特征在于所述声波发生器是中空圆柱体形状的换能器(24)，围绕谐振腔布置在谐振腔的外侧或形成谐振腔的侧壁，腔体的上壁和/或下壁由对光束可穿透的材料制成，提供所述光束用于从腔体外侧照射细胞。
12.根据前述权利要求中任一项所述的芯片，其特征在于所述谐振腔(6)是圆柱体，所述圆柱体的侧壁由所述块体构成。
13.根据权利要求12所述的芯片，其特征在于所述通道在圆柱体的侧壁的上端通向所述谐振腔。
14.根据权利要求13所述的芯片，其特征在于所述谐振腔具有止挡件，所述止挡件布置成使得下部换能器(12)的头部能够被插入以减小谐振腔中的可用体积的高度，直到其等于所述通道的高度。
15.根据前述权利要求中任一项所述的芯片，其特征在于所述通道(7、8)在块体的上表面上制成，黏合的或可移除的条带(11)覆盖块体的所有表面，包括谐振腔的上端；该条带对于提供用于从谐振腔外侧照射谐振腔的细胞的光束是可穿透的；并且当换能器被相对布置时，该条带充当反射器，在谐振腔的内侧上反射来自换能器的声波。
16.根据权利要求15所述的芯片，其特征在于所述通道(7、8)和圆柱体被彼此垂直布置，并且所述块体还包含两个微通道(9、10)，其从一侧通过块体至另一侧，与圆柱体(6)平行，并且分别与通道(7、8)的两个自由端连接；第一微通道(9)旨在使细胞到达通道中，第二微通道(10)旨在使细胞从通道中排出。
17.根据权利要求4至16中任一项所述的芯片，其特征在于所述反射器(11)是由如下物质制成的条带：玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、石英、硅、聚二甲基硅氧烷(PDMS)或环状烯烃共聚物(COC)。
18.根据权利要求4至17中任一项所述的芯片，其特征在于所述反射器(11)从与所述块体的材料相同的材料开始设计并且具有被处理为反射声波的内表面。
19.根据前述权利要求中任一项所述的芯片，其特征在于所述芯片包含几个微通道(22、23)，所述微通道以块体的厚度制成并且通向谐振腔以供细胞进入和/或离开。
20.根据前述权利要求中任一项所述的芯片，其特征在于所述谐振腔的高度随待产生的压力节点的数量和由发生器产生的声波的波长变化。
21.根据前述权利要求中任一项所述的芯片，其特征在于所述块体(5)由聚二甲基硅氧烷(PDMS)或环状烯烃共聚物(COC)制成。
22.根据前述权利要求中任一项所述的芯片，其特征在于使所述谐振腔的高度大于通向该谐振腔的通道的直径。
23.根据前述权利要求中任一项所述的芯片，其特征在于所述谐振腔(6)的直径为1至50mm，所述谐振腔的高度为5至15mm，并且所述通道的高度等于450μm。
24.根据前述权利要求中任一项所述的芯片，其特征在于所述芯片还包含至少一个额外的微通道，所述至少一个额外的微通道在块体中在与通道相同的平面中制成。
25.一种在根据前述权利要求中任一项所述的微流控芯片中以声悬浮方式操纵细胞的方法，该方法包括以下步骤：
-将细胞通过通道(7、8)的入口注入谐振腔(6)，
-产生声波以使注入的细胞声悬浮以在至少一层中形成细胞聚集体(18)，
-至少一个照射细胞同时保持声波的阶段，从而根据光学排斥原理操纵细胞。
26.根据权利要求25所述的方法，在所述方法中注入的细胞具有不同性质，产生声波和照射的步骤如下进行：
-产生声波使注入的细胞声悬浮，同时施加一定波长的光束，使得能够排除一部分细胞，从而使仅对这种光波长不敏感的细胞在一层中形成聚集体，
-保持声波并且停止光束，使得对光束的波长敏感的细胞现在在已经形成的聚集体的外围上形成聚集体，从而获得放射状结构的聚集体。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其用于制备由几层聚集体形成的三维结构：
-注入步骤，包括将细胞通过一个或多于一个入口注入谐振腔，和
-产生声波的步骤，其还包括产生声波，用于声悬浮在多个水平面上注射的多个细胞聚集体，所述水平面为声压力节点，所述声压力节点的数量随声波的波长和谐振腔的高度变化。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其特征在于所述方法还包括如下步骤：进行细胞培养，同时在培养期间使获得的聚集体在声悬浮中保持不动。
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