JP2022536104A - 光学的排除および音響浮揚によって細胞凝集体を構造化するためのマイクロ流体チップ - Google Patents

Abstract

本発明は、特に細胞培養のための、マイクロ流体チップに関する。このチップは、－生体適合性材料から作られたブロック（５）と、－液体、特に栄養液に浸された細胞の通過のために当該ブロック内に作られた通過チャネル（７、８）と、－当該通過チャネルに接続されておりかつ当該通過チャネルを源とする当該細胞を収容するための壁を含む、当該ブロック内に作られた共鳴空洞（６）と、－当該共鳴空洞内で音響浮揚中で少なくとも１つの細胞凝集体を形成することができる、音波を生成する発生器（１２）と、－当該共鳴空洞の少なくとも１つの壁を通して、かつ、当該少なくとも１つの凝集体を構造化するような方法での音波の当該生成と同時に、当該共鳴空洞内の細胞を照射することであって、光学的排除技術による、照射すること、ができる少なくとも１つの光エミッタ（１３、１３’）と、を備える。

Description

本発明は、０．１μｍ～３００μｍで構成されるサイズを有するマイクロ粒子またはナノ粒子などの物体を操作するためのマイクロ流体チップに関する。より具体的には、本発明は、音波を当てることによる細胞の浮揚に関する。以下では主に細胞に言及するが、しかし本発明は、少なくとも音波に敏感な、任意の粒子に適用される。

一般的に、音響浮揚の原理、および音響浮揚中での粒子（または細胞）凝集体の形成は、図１に要約されている。周波数に応じて、チャネル３の２つの対向する壁１と２の間に１～Ｎ個の圧力ノードを生成することが可能である。満たすべき条件は、ｈ＝Ｎ．λ_ａｃ／２であり、式中、ｈは空洞の高さ、λ_ａｃは超音波波長（音波）である。トランスデューサ４は、壁２と接触して、この壁２を通して音波を生成するようにチャネルの外側に配置されている。壁１は、反射器であり、当該反射器は、定常波、および空洞の高さにわたって分布するＮ個の圧力ノードを生成するように、チャネル３内の音波を反射する。圧力のこれら変化により、結果として音響放射力の場が作り出される。そうすると、このようにして作り出された音響放射力の軸方向成分は、音響浮揚平面を定める圧力ノードの各々における凝集体の形成を促進する。細胞は、複数の凝集体にわたって分布し、各凝集体は、平面を定める圧力ノードに配置される。図１において作成されている線は、圧力ノードを結果としてもたらす、音響放射力を示しているにすぎない。

より正確には、音響放射力の効果の下で、浮遊中の粒子（または細胞）は、音圧ノードに向かって移動するように強いられる。それぞれ異なる音響浮揚平面内になると、音響放射力の半径方向成分が、粒子を、一緒に集まって各レベルで凝集体を形成するように、強いる。超音波の周波数は、チャネルの高さｈにわたって分布するいくつかの圧力ノードを得るように、定められる。

現在の音響流体用途では、音響放射力は、種を、それらの物理的および機械的特性、すなわちそれらの密度およびそれらの圧縮率さらにはそれらのサイズの関数として分離するために使用される。音響力は、次の等式で定義されるようにこれらのパラメータに直接依存するためである。
Ｆ_ａｃ＝４π．ｒ^３．ｋ_ａｃ．Ｅ_０．Φ．ｓｉｎ（２ｋ_ａｃ．ｚ）

式中、ｒは粒子の半径、Φは音響コントラスト係数、ｋ_ａｃは音響波数、Ｅ_０は音響エネルギーである。これは、音響放射力に対する粒子（または細胞）の感度を定義する。粒子の密度が高くかつ粒子が大きいほど、その粒子が受ける音響力が大きくかつ粒子が圧力ノードに向かって移動するのが速くなる。この力は、通常、流れている粒子または細胞をこれらの特徴の関数として分離するために使用される。

流れている粒子を、それらを浮揚するために音波をあてることによって分離する方法を記載している文献、国際出願第２０１９／００２５５１号パンフレットが知られている。この文献は、光学的排除の原理も記載している。本発明は、粒子を浮揚する方法、および光学的排除の原理の用途について、この文献、国際出願第２０１９／００２５５１号パンフレットを参照する。

本発明の目的は、光学的操作を伴う音響浮揚の原理の新規な使用である。
本発明の別の目的は、音響浮揚によって作り出された凝集体の最適化された操作を可能にする、デバイスである。
本発明のさらに別の目的は、凝集体を作り出すための新規な方法である。

上記の目的のうちの少なくとも１つは、マイクロ流体チップであって、
－生体適合性材料から作られたブロックと、
－液体、特に栄養液（培地）に浸された細胞の通過のために当該ブロック内に作られた通過チャネルと、
－当該通過チャネルに接続されておりかつ当該通過チャネルを源とする当該細胞を収容するための壁を含む、当該ブロック内に作られた、例えば細胞培養を目的とした、共鳴空洞と、
－当該共鳴空洞内で音響浮揚中で少なくとも１つの細胞凝集体を形成することができる、音波発生器と、
－当該共鳴空洞の少なくとも１つの壁を通して、かつ、当該少なくとも１つの凝集体を構造化するような方法での音波の生成と同時に、当該共鳴空洞内の細胞を照射することであって、光学的排除の技術による、照射すること、ができる少なくとも１つの光エミッタと、を備える、マイクロ流体チップで達成される。

共鳴空洞は、細胞を収容するための壁を含む。言い換えれば、細胞は、それら細胞がもはや通過チャネル内の流れに影響されない、共鳴空洞内の領域に侵入することができる。
その結果、それら細胞は、音波および光波の作用を受けることができる。
それら細胞はまた、通過チャネル内の流れの動きに対して、不動のままであることができる。不動とは、それら細胞が培地の小さな動きにはさらされるけれども流れの直線変位の動きにはさらされないことを意味する。

流れの速度は、その速度が、細胞が特に１つ以上の凝集体を形成することを伴わないように、調整することができる。その場合には、音響力は、流れに対抗するのに十分な大きさとする。

本発明によるマイクロ流体チップでは、音波と光学ビームを、光学的排除の技術に従って光学ビームによって細胞を操作しながら、音波によってそれら細胞を１つ以上の層にわたって浮揚で保持するように、同時に使用することが可能である。

本発明によるマイクロ流体チップは、光音響バイオリアクタを構成する。当該光音響バイオリアクタにおいて、細胞を音響浮揚中で培養し、特定の照射によって操作して、細胞の連続する層に凝集体を構造化するようにすることができる。構造化とは、互いに異なる細胞の層の空間分布を意味する。
共鳴空洞内で、細胞は、使用される音波または光学ビームを乱さずかつ細胞培養に適した、液体に浸される。

共鳴空洞は、有利には、音響浮揚中での細胞の培養を意図している。音波およびおそらく特定の光学ビームに対して内因的または外因的に敏感な任意のマイクロ粒子またはナノ粒子を本発明で使用できることは、当業者に明らかである。

したがって、光学的特性と音響的特性の両方を使用して、音響浮揚中で細胞凝集体を空間的に構造化することが可能である。この操作は、マークされている（蛍光生物学的マーカ）かまたはされていない、異なる光波長に反応する異なるタイプの細胞を連続して注入することにより、数回繰り返すことができる。

必要な限り音響浮揚中で保持することができる、粒子凝集体を作り出すことが、音波による音響放射力によって可能になる。この力は、音響トラップを構成する共鳴空洞内の音響浮揚中でこの凝集体を保持するために、寸法が定められている。

本発明の有利な特徴によれば、マイクロ流体チップは、少なくとも１つの第２の光エミッタをさらに備えることができ、２つのエミッタがそれぞれ共鳴空洞の２つの対向する壁を通してエミットするように配置されている。

好ましくは、２つの光エミッタは、異なる波長でエミットする。そのような配置は、光学的排除の技術によって異なるタイプの細胞に同時にまたは順次に作用することを、可能にする。これはまた、凝集体に対称的に作用することを、可能にする。流体の厚みを通過するビームの強度の減衰があり、かつそのビームの伝播の軸に沿って凝集体への遭遇があるからである。この構成のおかげで、下部の凝集体と同じように上部の凝集体に作用する。

本発明の実施形態によれば、音波発生器は、共鳴空洞の少なくとも一部を挟みこんでいる上部要素と下部要素を、２つの対向する壁上に含むことができ、上部要素は、固定されているかまたは取外し可能であり、上部トランスデューサまたは音波反射器であり、下部要素は、下部トランスデューサであり、上部および下部トランスデューサは、音波をエミットすることができる。さらに、上部要素および／または下部要素は、細胞を照射するために提供される光ビームに対して透明である。

換言すれば、発生器は、共鳴空洞内に音響放射力を作り出すように、下部トランスデューサからの音波を反射することができる反射器と組み合わされた、下部トランスデューサを含む。ただし、共鳴空洞内に音響放射力を生成することもするように、反射器を、下部トランスデューサと同じ音波を同期して生成する上部トランスデューサに置き換えることができる。

好ましくは、２つのトランスデューサのうちの少なくとも１つは、光波長に対して透明であるか、そうでなければ、光学的照射がその中心に通ることを可能にするために環状である。
上部要素の取外し可能な性質は、凝集体を形成する細胞を排出または回収することを、可能にしてもよい。

本発明の実施形態によれば、共鳴空洞は、その共鳴空洞の下端で下部トランスデューサによって閉じられている。したがって、下部トランスデューサは、共鳴空洞の下部壁を構成する。そのような実施形態では、下部トランスデューサは、培地と直接接触している。この構成は、共鳴空洞のエネルギー効率を改善することを可能にする。

本発明の有利な特徴によれば、下部トランスデューサは、共鳴空洞の内側に配置することができる。
したがって、共鳴空洞の内側でスライドすることができる取外し可能な下部トランスデューサが提供される。好ましくは、トランスデューサの寸法は、共鳴空洞がシールされることを確実にすることを、可能にする。この場合、培地を形成する使用可能なボリュームは、共鳴空洞の総ボリュームよりも小さい。したがって、共鳴空洞の、異なるボリュームを定めることが可能である。したがって、その共鳴空洞は、可変のボリューム、およびしたがって可変の数の浮揚平面を有する、空洞である。
有利なことに、共鳴空洞は、下部トランスデューサのヘッドをそのヘッドが共鳴空洞に挿入されたらブロックするための少なくとも１つのストップを有することができる。

本発明の実施形態によれば、共鳴空洞は、その共鳴空洞の下端で、共鳴空洞の外側に配置された下部トランスデューサを源とする音波に対して透明である、固定されているかまたは取外し可能なフィルムによって閉じられていることができる。
このフィルムは、ポリジメチルシロキサン（ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ：ＰＤＭＳ）材料からもしくは環状オレフィンコポリマー（ｃｙｃｌｉｃ ｏｌｅｆｉｎ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ：ＣＯＣ）で作ることができ、または、容易に取外し可能であり、かつ超音波の非常に良好な伝達を可能にする粘着性のポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）フィルムであることができる。
取外し可能なフィルムは、例えば、培養の終わりにおける細胞凝集体の通過または回収を可能にする。

好ましくは、共鳴空洞は、円柱であって、当該円柱の側壁がブロックによって構成される、円柱である。上部ベースは、反射器または上部トランスデューサによって形成することができる。下部ベースは、フィルムによって形成することができ、または下部トランスデューサによって直接形成することができる。
実施形態によれば、通過チャネルは、円柱の側壁の上端で共鳴空洞に通じていることができる。そのような配置は、円柱の側壁の上端を通して空洞に細胞を供給することを可能にする。

本発明によれば、下部トランスデューサのヘッドが、共鳴空洞内の使用可能なボリュームの高さを低減するために、当該高さが通過チャネルの高さと等しくなるまで挿入されることができるように、共鳴空洞は、配置されたストップを有することができる。
理想的には、使用可能なボリュームは、１つ以上の単層または多層の細胞凝集体を作り出すことを可能にする。

本発明の有利な実施形態によれば、通過チャネルは、ブロックの上面上に作られていることができ、結合されているかまたは取外し可能なストリップは、共鳴空洞の上端を含めてブロックの表面のすべてを覆っていることができ、このストリップは、外側から共鳴空洞の細胞を照射するために提供される光学ビームに対して透明である。さらに、トランスデューサがそのストリップの反対側に配置されている場合、このストリップは、共鳴空洞の内側にあるトランスデューサからの音波を反射する。

好ましくは、通過チャネルおよび円柱は、互いに垂直に配置されていることができる。そうすると、ブロックは、一方の側から他方へブロックを通過する２つのマイクロチャネルであって、円柱に平行で、かつ通過チャネルの２つの自由端にそれぞれ接続されている、マイクロチャネルをさらに含むことができ、第１のマイクロチャネルは、通過チャネル内への細胞の到達を目的としており、第２のマイクロチャネルは、通過チャネルから細胞を排出することを目的としている。

非限定的な例として、反射器は、ガラス、ポリメチルメタクリレート（ｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ：ＰＭＭＡ）、石英、シリコン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、または環状ポリオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）から作られたストリップである。このようなストリップは、一方では良好な透過、他方では良好な反射を確実にするために、設計されている。好ましくは、反射器は、ブロックの材料と同一の材料から出発し、かつ音波を反射するように処理された内面を有して、設計されていることができる。

本発明によるチップは、複数のマイクロチャネルであって、ブロックの厚み内に作られて、細胞が入りかつ／または出るように共鳴空洞に通じる、複数のマイクロチャネルを備えることができる。好ましくは、これらマイクロチャネルは、音響放射力のせいで共鳴空洞内に提供される圧力ノードと、それぞれ位置合わせされている。これらマイクロチャネルは、例えば、通過チャネルを介して注入されたものとは異なる性質の細胞を注入するため、栄養分を注入するため、およびまた細胞を排出するために使用することができる。

有利なことに、共鳴空洞の高さは、作り出される圧力ノードの数と、発生器によって生成される音波の波長と、の関数であることができる。共鳴空洞は、いくつかの細胞層の重合わせを収容するように設計されており、一方、通過チャネルの高さは、好ましくは細胞のサイズに適合されている。

共鳴空洞は、通過チャネルよりも高く、例えば細胞の直径の数倍、特に直径の少なくとも１０倍である。最初の圧力ノードを通過チャネルのレベルに、したがってλ／４のオーダーのチャネル高さに置くことを試みることが可能である。

好ましくは、通過チャネルは、入口端と共鳴空洞との間の通過チャネルの区間が、共鳴空洞と通過チャネルの他の端である出口端との間の通過チャネルの区間と、同一直線上にあるような、直線形状を有することができる。

本発明の実施形態によれば、ブロックは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）または環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）から作ることができる。
特に、ブロックは、培地と、共鳴空洞の内容物と、必要に応じて外側との間のガス交換を促進にするために、ガス透過性材料から出発して設計されている。チャネルは、ブロック内にエッチングまたは成型されており、ガスおよび温度の観点から最適な培養条件を保証するようにインキュベータ内に設置できる。

特に、共鳴空洞は、この共鳴空洞に通じる通過チャネルの直径よりも大きい高さで寸法が定められていることができる。したがって、通過チャネルは、共鳴空洞とは明確に区別される。ここで、通過チャネルは、典型的には細胞を一列のみで運ぶのに適した、小さな直径の導管であり、共鳴空洞は、細胞凝集体を１つの平面に、および１つのボリュームに収容することができる、より大きな寸法を有する。
非限定的な例として、共鳴空洞は、１～５０ｍｍの直径を有することができ、共鳴空洞の高さは、５～１５ｍｍで構成され、通過チャネルの高さは、４５０μｍに等しい。

本発明によるマイクロ流体チップは、通過チャネルと同じ平面内でブロック内に作られた、少なくとも１つの追加のマイクロチャネルをさらに備えることができる。これは、共鳴空洞に細胞を供給することと、共鳴空洞から細胞を排出することと、を可能にする簡素化された配置であり、当該共鳴空洞では、細胞は、通過チャネルを源とする細胞と同じ平面に凝集体を形成することができ、当該通過チャネルは、実際上、メインマイクロチャネルである。
この追加のマイクロチャネルはまた、他の細胞、バイオマーカを注入するため、またはそうではなく培地を洗浄するためもしくは生成物である細胞をそれらの培養中に回収するために使用できる。

本発明の別の態様によれば、上記で定義されたような、マイクロ流体チップ内の音響浮揚中の細胞を操作するための方法が提案される。この方法は、以下のステップを含む。
－通過チャネルの入口を介して共鳴空洞に細胞を注入するステップと、
－少なくとも１つの層内に細胞凝集体を形成するように、注入された細胞を音響的に浮揚するための音波を生成するステップと、
－光学的排除原理に従って細胞を操作するように、音波を同時に維持しながら、細胞を特定の光波長で照射する少なくとも１つのフェーズのステップ。

本発明によれば、選択的光音響流体排除原理が使用され、これは、１つの粒子または細胞は、特定の光波長に反応するが、他の粒子または細胞は、まったく反応しないという事実を説明する。

本発明の有利な実施形態によれば、注入された細胞は、それぞれ異なる性質を有し、音波を生成して照射するステップは、以下のように実行することができる。
－注入された細胞を音響的に浮揚するための音波を生成し、同時に、特定の波長で光ビームをあててこの波長に感受性の細胞の排除の原理を可能にして、この光波長に感受性のない細胞だけが１つの層内に凝集体を形成するようにし、
－音波を維持し、前記光ビームを停止して、前記光ビームの波長に感受性の細胞が、すでに形成された凝集体の周辺に今や凝集体を形成するようにすることによって、半径方向に構造化された凝集体を得る。

したがって、本発明は、半径方向に構造化された単層の細胞凝集体を作り出すことを可能にする。したがって、凝集体は、異なる細胞の連続するリングで構成され得、このようにして、細胞の共培養を可能にするのであり、オルガノイドの形成に不可欠なステップである。
細胞凝集体とは、次の特徴のすべてを満たす細胞の層を意味する。当該層に含まれる少なくとも２つの細胞、特に当該層に含まれる細胞の少なくとも１０％、より良好には２５％、好ましくは５０％が、接触しており、かつ、当該層は、その長さの少なくとも一部にわたって、その横方向の寸法のうちの少なくとも１つでの変位の間にひと続きの細胞を有する。

本発明の有利な実施形態によれば、凝集体の複数の層で形成された３次元構造は、以下のステップを実行することによって作り出される。
－注入するステップは、１つ以上の入口を介して共鳴空洞に細胞を注入することを含み、
－音波を生成するステップは、複数のレベルに注入された細胞の複数の凝集体を音響的に浮揚させるための音波の生成をさらに含み、レベルが、音圧ノードであり、音圧ノードの数が、音波の波長と、共鳴空洞の高さと、に依存する。
本発明は、いくつかの単層（細胞シート）を上下に作り出すことを可能にし、このことは、細胞培養についてのかなりの時間節約をもたらす。細胞のシートをトリプシン処理して、後に別のものにそれを堆積させる目的で可能性のある固体基材からそれを分離する必要がもはやないからである。このプロセスは、より具体的には間葉系間質細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）タイプの幹細胞培養に適しており、この場合、細胞を培養して細胞シートを製造し、次いでそれを重ね合わせるのであるが、しかしこれは、細胞シートを形成することを目的としたあらゆるタイプの細胞培養に関連する。
本発明で、音響浮揚中で保持および培養され得るスフェロイド、オルガノイド、またはチューモロイドの、音響浮揚中での製造を想定することが可能である。

本発明は、細胞培養を、培養の期間中、得られた凝集体を音響浮揚中で不動に保持しながら実行することを可能にする。

したがって、このようなシステムにより、ＭＳＣを音響浮揚中で１８日間培養することが可能になった。この培養の終わりに、細胞は、生きていたし、基材上に置かれると正常に増殖することができた。このように、システムは、短期間（数時間）および長期間（数週間）の培養について検証されている。これは、栄養分の流れと、インキュベータ内のガス交換を可能にする、使用される材料の多孔性と、のおかげで可能になる。細胞の培養を可能にするために、音響バイオリアクタをインキュベータ内に配置した。本システムのコンパクト性により、インキュベータ内に複数のチップを配置することが可能になる。したがって、音響浮揚中でいくつかのシートまたはスフェロイドの培養を並行して実行することが可能である（ウェルあたり数十個、かつインキュベータ内で数個のウェル）。

本発明の他の特徴および利点は、添付の図に照らして、決して限定的ではない実現および実施形態の詳細な説明を読むことで明らかになるであろう。
従来技術による音響浮揚によるチャネル内の圧力ノードの生成の概略図である。 本発明によるデバイスの例の概略分解図である。 本発明によるデバイスの例を下方から見た図である。 本発明による、光エミッタと、共鳴空洞の外側に配置された音波トランスデューサと、を伴う、通過チャネルの長手方向軸に沿った概略断面図である。 本発明による、光エミッタと、共鳴空洞をそのベースにおいて閉じている音波トランスデューサと、を伴う、通過チャネルの長手方向軸に沿った概略断面図である。 本発明による、光エミッタと、共鳴空洞の内側に配置された音波トランスデューサと、を伴う、通過チャネルの長手方向軸に沿った概略断面図である。 本発明による、光エミッタと、上部ストップにおいて共鳴空洞の内側に配置された音波トランスデューサと、を伴う、通過チャネルの長手方向軸に沿った概略断面図である。 本発明による、光エミッタと、共鳴空洞をそのベースにおいて閉じている音波トランスデューサと、を伴い、かつ通過チャネルがブロックの厚み内に配置されている、通過チャネルの長手方向軸に沿った概略断面図である。 本発明による、２つの光エミッタと、音波トランスデューサと、を伴う、図８からのデバイスの図である。 本発明による、排除原理を実現するために提供される光学ビームに対して透明である材料から出発して設計されるトランスデューサの概略図である。 本発明による、リングの形状を有するトランスデューサの概略図である。 本発明による、２つの光エミッタと、共鳴空洞の周りに配置された中空円柱の形状を有するトランスデューサと、を伴う、通過チャネルの長手方向軸に沿った概略断面図である。 本発明による、ブロック内にエッチングされ共鳴空洞に通じる複数のマイクロチャネルを伴う、図２～図１２のデバイスに適合したブロックの概略断面図である。 本発明による、半径方向に構造化された細胞凝集体の概略断面図である。 本発明による、半径方向および横方向に構造化されたいくつかの細胞凝集体の概略断面図である。 波長の関数として、２つのタイプの細胞の放出速度を示す曲線である。 波長の関数として、異なるサイズを有するいくつかの異なるタイプの細胞の放出速度を示す曲線である。 波長の関数として、赤血球の放出速度を示す曲線である。 波長の関数として、赤血球の放出速度を示す曲線である。 波長の関数として、白血球の放出速度を示す曲線である。 白いポリスチレンの１０μｍ粒子と３μｍの赤い粒子との混合物から出発する、白い粒子の凝集体の形成を示す２つの写真である。 赤血球の光学的排除による、音響浮揚中の「純化された」凝集体の形成中のそれぞれ異なる時に撮影された４つの写真である。 マルチノードの空洞に適用された、光学的排除効果を示す３つの写真である。 直径１５μｍの赤いポリスチレンの粒子と白いポリスチレンの４０μｍ粒子とを含む、層状の環状構造を示す。

以下に記載される実施形態は、決して限定的ではない。本発明の変形は特に、記載されている他の特徴から分離して以下に記載される、特徴の選択のみを含んで実現することができる（特徴のこの選択が、技術的利点を与えるのに十分であるか、または先行技術水準に対して本発明を差異化するのに十分である場合）。この選択は、構造的な詳細を伴わないか、または構造的な詳細の一部のみを伴う（この一部だけで、技術的利点を与えるのに十分であるか、もしくは先行技術水準に対して本発明を差異化するのに十分である場合）、少なくとも１つの好ましくは機能的な特徴を含む。
特に、記載されるすべての変形およびすべての実施形態は、技術的観点からこれに異議がないすべての組み合わせで、一緒に組み合わされるように提供される。
図において、いくつかの図に共通する要素は、同じ参照を保っている。

本発明はそれに限定されないが、音響浮揚中で細胞凝集体を培養するのに適したマイクロ流体チップがここで説明される。
本発明によるマイクロ流体チップの例の構成要素のセットが、図２に表されている。例えばＰＤＭＳ材料から作られ平行六面体の形状を有し上面および下面を有する、ブロック５を見ることができる。円柱形状の共鳴空洞６が、このブロックの中央に、２つの表面の間のブロック５の厚み全体にわたって作られている。この共鳴空洞６の目的は、音響力によって細胞をトラップすることである。

共鳴空洞６への供給のために、通過チャネル７、８は、この通過チャネルと空洞の内側とがアクセス可能になるように、ブロック５の上面にエッチングされる。通過チャネルは、入口マイクロチャネル９から共鳴空洞に向かって細胞が進入することを目的とした、第１の部分７を有する。その通過チャネルはまた、共鳴空洞６から出口マイクロチャネル１０に向かって細胞を排出することを目的とした、第２の部分８を有する。入口および出口の２つのマイクロチャネルは、共鳴空洞と同様にブロックの厚み内に作られ、ブロック６の下面に通じており、このブロックの裏は、本発明によるマイクロ流体チップへの供給および本発明によるマイクロ流体チップの管理のために、様々なデバイスに対して、よりアクセスしやすくなっている。

好ましくは、このブロックは、必要に応じて共鳴空洞と外側（インキュベータ）との間のガス交換を確実にすることができる生体適合性材料から出発して設計される。そのブロックは、本発明によるマイクロ流体チップが必要に応じて共鳴空洞内の栄養分の流れおよび培地の流れを確実にすることができるように、設計されている。もちろん、そのブロックは、細胞を注入してかつそれらを排出することを可能にし、かつ共鳴空洞内に大きな寸法の凝集体を作り出すことを可能にする。
マイクロ流体チップは、最適な培養条件（ガスと温度）を保証するように、インキュベータ内に取り付けられる。

特にプラズマ結合によって、ブロック５の上面を覆うことを意図したガラスストリップも見ることができる。そのガラスストリップは、ブロック５と一緒に製造されたストリップであり得る。このガラスストリップ１１は、少なくともその内壁であって、共鳴空洞に面している、内壁に、反対側に設けられたトランスデューサ１２であって、ブロック６の下面の側の、トランスデューサ１２からの音波を反射することができる内面を有する。有利には、ガラスストリップは、ストリップ１１よりも上方に配置された光エミッタ１３からの光学ビームに対して透明である。

ストリップ１１は、一方では良好な透過、他方では良好な反射を確実にするように、次の材料のうちの１つまたは組み合わせから出発して設計することができる。ガラス、ＰＭＭＡ、石英、シリコン、ＣＯＣ、ＰＤＭＳ。
トランスデューサ１２は、圧電素子を含むステンレス鋼の円柱で構成され、その動作周波数は、共鳴空洞の高さの関数として選択することができる。この周波数は、厚さ（高さ）が数ｍｍから数十μｍまで変化することができる共鳴空洞に対して、０．１ＭＨｚから１０ＭＨｚの間で選択できる。

図３は、ブロック５を上方から見た図である。マイクロチャネル９および１０の端部は、通過チャネル７、８の各終端で見ることができる。この通過チャネルは、進入するときおよび排出されるときに細胞の良好な進行を確実にするように、マイクロチャネルから共鳴空洞に向かって広がる形状を有する。通過チャネルは、例えば、１～３０ｍｍの高さの（円形、長方形、正方形または他の）横断面を有することができる。後で見られるように、ストップ１４および１５は、共鳴空洞の内壁に配置され、約５～３０ｍｍの、共鳴空洞の上部レベルでの直径を定めることを可能にする。
マイクロチャネルタイプ９、１０および通過チャネルタイプ７、８の、他の入口／出口（図示せず）は、共鳴空洞に同一のもしくは異なる細胞、バイオマーカを供給するため、またはそうではなく培地を洗浄するためもしくは生成物である細胞をそれらの培養中に回収するために、作ることができる。

共鳴空洞の下部ベースが不浸透性フィルム１６によって閉じられている実施形態が、図４に示されている。そのような構成は、空洞の外側に配置されたトランスデューサ１２による、培地のあらゆる汚染を防止することを可能にする。このフィルム１６は、共鳴空洞内に形成された凝集体を排出することを可能にするように、取外し可能であり得る。理想的には、このフィルムは、空洞内に音響放射力を生み出すために提供される音波に対して、透明である。そのフィルムは、ＰＤＭＳ、ＣＯＣまたは粘着性のＰＣＲフィルムから作ることができる。
細胞の流れ１７、およびトランスデューサ１２によってエミットされた音波の作用下で共鳴空洞６にトラップされた細胞からの凝集体１８の生成が、図４に示されている。

図５に見られるような実施形態では、例えば、パッケージ化されたトランスデューサ１２は、共鳴空洞内の培地と直接接触することができる。この場合、透過壁はなく、反射性であるガラスストリップ１１のみがトランスデューサ１２の反対側に配置される。この構成は、エネルギーが散逸し得る透過層、例えば図４のフィルム１６を省くことにより、共鳴空洞のエネルギー効率を改善することを可能にする。

図６は、トランスデューサ１２が共鳴空洞６に挿入される実施形態を示す。そのような実施形態は、目的とする用途の関数として様々なボリュームを定めることを可能にする。そうすると、共鳴空洞の有効なボリュームは、可変になる。ストップ１４および１５は、トランスデューサのヘッドを所定の位置に位置づけるように、共鳴空洞の内壁の異なる場所に配置することができる。図７では、これらのストップは、共鳴空洞の上部に配置されている。

実施形態が図８に示されており、そこでは、通過チャネル７、８は、完全にブロック５の厚みの中に作られて、共鳴空洞に、その上部ではなく中間レベルで通じている。もちろん、この実施形態は、上記で提示された様々な構成、すなわち、例えば、空洞の内側または外側のトランスデューサと適合する。しかしながら、トランスデューサが内側にある場合、そのトランスデューサは、共鳴空洞へのチャネル７の入口より下方に留まっていなければならない。
細胞培養に加えて、細胞のそれぞれ異なる層を有する、空間的に構造化されたオルガノイドまたはスフェロイドの製造が有利に提供される。
本発明によるマイクロ流体チップは、特に粒子または細胞を共鳴空洞に注入することを可能にし、したがって、空洞内に細胞凝集体を作り出すことを可能にする。このことは、音響浮揚中の凝集された細胞に必要な培地を提供することにより、長期間にわたって細胞培養を行うことを可能にする。
本発明はまた、細胞の複合的な構造化された層を作り出すことを可能にし、当該層は、組織工学の観点から有用であり得る。これを行うために、エミッタ１３を使用して、特定の波長で細胞を照射して光学的排除の技術を実行する。

２つのタイプの粒子または細胞の混合物が、注入され得る。これらは、音波の作用下で２つの種を混合する凝集体を形成する。
凝集体を空間的に組織化することが望まれる場合、特に環状かつ同心の連続する層に凝集体を構造化することが望まれる場合、光学的排除原理を使用することが可能である。

光学的排除原理は、排除することが望まれる細胞または粒子に適した所与の波長での光学的照射の効果の下で、音響浮揚中の粒子または細胞を放出することを可能にする。この効果は、粒子／細胞の光吸収特性に依存する。蛍光マーカでマークされた細胞はまた、蛍光マーカの吸収波長の照射に反応するのであり、特に図１６～２０を参照されたい。

本発明は、凝集体の周辺にある連続するバンドによって平面内に構造化された２次元の凝集体を形成することを可能にする。図１４に示されるような半径方向に構造化された凝集体２５が、このようにして得られる。これにより、様々な性質の細胞の円形バンドで構成されるシートを製造することが可能になり、このことは、複雑なオルガノイドの製造に有用であることが示され得る。
これを行うために、２つの細胞Ｃ１とＣ２の混合物が、注入され、それら２つの細胞のうちの一方は、所与の光波長λ_ｏｐｔ１を吸収し、他方は、吸収しない。この場合、凝集体は、容易に構造化される。実際、凝集領域が波長λ_ｏｐｔ１で照射されている場合、これにより、音響力の効果の下でＣ１が凝集することが阻止される。したがって、Ｃ２種は、第１の凝集体を形成する。それから、Ｃ１種が第１の凝集体の周りに凝集体を形成するように、波長λ_ｏｐｔ１での照射を停止すれば十分である。

したがって、光学的特性と音響的特性の両方を使用して、音響浮揚中で細胞凝集体を空間的に構造化することが可能である。この操作は、マークされているかまたはされていない、異なる光波長に反応する異なるタイプの細胞を連続して注入することにより、数回繰り返すことができる。

図９では、２つの光エミッタ１３および１３’が、共鳴空洞の両側から同時に細胞を照射および／または観察するために配置されている。したがって、これにより、音響凝集領域から２つの種を同時に排除することが可能になる。

これを行うために、図１０で見ることができるように、透明である圧電トランスデューサ（ｐｉｅｚｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ：ＰＺＴ）１９の使用が準備される。実際、提供された光波長を通過させる透明なＰＺＴを製造すること、および、したがって片側のみからの単一照射に制限されることがないことが、可能である。
（パッケージ化されていない）環状トランスデューサ（ＰＺＴ）もまた、使用できる。この場合、リングを通して照射すること、および、したがって２つの光源を同時に結合することが可能である。

二重照射はまた、中空円柱の形状を有するトランスデューサ２４が共鳴空洞の周りに配置されている、図１２からの実施形態で実行することができる。この場合、フィルム２１が設けられ、当該フィルム２１は、共鳴空洞のベースでシールを形成し、かつ提供される光学ビームに対して透明である。この場合、２つのエミッタは、共鳴空洞内の細胞を自由に照射することができる。

浮揚中で培養することの別の利点は、空洞内に複数の圧力ノードを作り出すことが可能であり、したがって、浮揚中の細胞凝集体を上下に形成することが可能であるということである。図１３に示すように、高さが数ｍｍ、例えば６ｍｍの空洞内に、いくつかのノードを作り出すことができ、例えば約１５個（または数十個）である。これを行うために、複数の出口マイクロチャネル２３の反対側の、複数の入口マイクロチャネル２２を作ることができる。入口／出口マイクロチャネルの各ペアは、圧力ノードの平面内に設けることができる。しかしながら、複数の圧力ノードにわたる浮揚中の細胞の配置は、通過チャネルのような単一の入口チャネルで実行することもできる。

音響浮揚中でいくつかの細胞凝集体に対する光学的排除効果を使用することが可能であり、したがって、共鳴空洞のボリューム内の物体を構造化することが可能である。
したがって、凝集領域は、トランスデューサの軸を中心とする。そうすると、図１５に示すように、ボリューム内にいくつかの重ね合わされた凝集体２６を構造化することが可能であり、各凝集体は、それ自体、異なる細胞のいくつかの円形バンド（環状構造化）で構成されることができる。これにより、音響浮揚中で保持および培養できるスフェロイド、オルガノイド、またはチューモロイドの、音響浮揚中での製造を想定することが可能になる。
いくつかの単層を上下に作り出すことは、細胞培養についてのかなりの時間節約に相当する。

したがって、本発明は、固体基材上での細胞培養の従来の技術を置き換えるのに適した、細胞培養のための新しい手段を提案する。実際、従来の細胞培養の場合、例えば幹細胞などの細胞は、固体基材上で増殖するけれども、戻ってきて他の細胞と接触するために、移動もする。培養は、細胞が「コンフルエンシーに」到達したとき、すなわち互いに接触し、したがって「単層」である細胞の層（細胞の単一の層）を形成したとき、終了したと見なされる。
本発明は、光音響バイオリアクタの設計に関する。当該光音響バイオリアクタにおいて、細胞は、音響浮揚中で培養され得、細胞凝集体は、構造化された凝集体を形成するように、特定の照射によって操作および構造化され得る。

本発明者らは、光音響流体効果が、照射される物体の放出速度Ｖ_ｅｊによって定量化できることを示した。これは、本発明による浮揚中の物体が、特に照射信号の波長の関数である速度で、照射される領域を離れること、を示すことを含む。これらの物体は、０．１μｍ～３００μｍで構成されるサイズを有する、使用される波長に敏感なマイクロ粒子またはナノ粒子である。
一般に、放出速度は、光波長、照射の強度、顕微鏡の対物レンズの倍率の関数として、様々な種の粒子について測定することができる。これらのパラメータにより、照射のパワーを制御することが可能になる。例えば図１８では、粒子のサイズも重要な役割を果たしていることが特に理解され、粒子が小さいほど、放出速度が速くなる。

図１６は、サンプルまたは粒子の放出速度を波長の関数として示している。粒子の２つの群が、形成されており、直径１５μｍで、一方は赤い粒子、他方は青い粒子である。曲線は、放出速度が光波長に依存するけれども、粒子の色にも依存することを示している。赤い粒子は、３６５ｎｍ～７７０ｎｍのいくつかの光波長に関して照射される領域から放出されるが、青い粒子は、放出されない。この例では、音響周波数は、振幅Ａ＝１３Ｖｐｐに対してｆ_ａｃ＝０．６５０ＭＨｚである。

図１７では、以下のサンプルが、図１６と同じ条件下で分析された。
－３μｍの緑蛍光粒子、
－３μｍの赤蛍光粒子、
－１０μｍの緑蛍光粒子、
－１０μｍの赤蛍光粒子、
－１５μｍの赤色粒子。
サンプルのサイズが放出速度に影響を与えることが、観察される。赤色粒子は、蛍光粒子よりもはるかに大きな放出速度を有することも、観察される。

図１９の曲線は、波長の関数としての、（１：１０００の血液希釈での）赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ：ＲＢＣ）の放出速度の変化に関する。すべての実験は、７５１ｋＨｚの周波数と８Ｖの振幅で実行されたのであり、分析された血液凝集体は、空洞の中心に配置されていた。
ＲＢＣの放出速度は、３６５ｎｍ～約４９０ｎｍ、それから５１５ｎｍ～６００ｎｍで非常に大きく、それを超えると、赤血球は、凝集したままであることが、観察される。

図２０は、健康な患者に由来し、ＤＡＰＩおよびＣＤ４５（λｅｘｃ＝４１５ｎｍ、λｅｍｉｓｓｉｏｎ＝５００ｎｍ）でマークされ、音響パラメータが７５１ｋＨｚおよび８Ｖである全血サンプルから分離された、白血球の放出速度を示す曲線に関する。最大放出速度は、λ_ｏｐｔ＝３８５ｎｍの場合である。マークされたＧＢが反応する他の２つの波長は、λ_ｏｐｔ＝４０５および４６０ｎｍである。ＧＢは、他の波長には反応しない。

以下の表は、様々な細胞の光音響流体反応を示している。

図２１は、白いポリスチレンの１０μｍ粒子と３μｍの赤い粒子との混合物から出発する、白い粒子の凝集体の形成を示している。混合物は、音響力にかけられ、４６０ｎｍ（赤い粒子が反応する波長）で、最大パワーの６０％で、１０倍の倍率で照射される。音響周波数は、１．９１ＭＨｚで振幅が９Ｖである。流量は、０．１５ｍｌ／ｈである。
トラップされた赤い粒子をほとんど伴わない、白い粒子の凝集体の形成が観察される。左の図は、５分の時点に対応し、一方、右の図は、２０分後に形成された凝集体を示している。このようにして、白い粒子は、赤い粒子の光学的排除で、徐々に濃縮される。

図２２の写真は、流れを伴う細胞の混合物の光学的排除によって、音響浮揚中で「純化された」凝集体を形成する様々な段階に関する。実験は、赤血球の排出を示しており、当該排出は、この排出を可能にする波長で、信号を加えることによる。

細胞は、赤血球（／１００）およびＭＤＡがん細胞（／１００）を含む。照射は、１０倍の倍率で、最大パワーの８０％で、４６０ｎｍの信号によって得られる。音響周波数は、１．５９ＭＨｚで振幅が１０Ｖである。流量は、０．１５ｍｌ／ｈである。

図２３は、マルチノードの空洞に適用された、光学的排除効果を示している。左の写真では、マイクロ流体チップ内の音響浮揚中の赤い粒子の凝集体を見ることができる。凝集体は、塗りつぶされた円の形状の連続する層を形成する。
真ん中の写真では、最初に第１の層に到達する、ライティングがあてられている。これは、クラウンを構成するように中央の領域から粒子を排除することから始まる。（ライティングに近い）底部から始まって、層は、次々にクラウンに変わり、そのようにして、そのたびに上部層のために光の通路が解放される。
右の写真では、層は、ほとんどすべてクラウンに変わっている。
凝集体は、赤いポリスチレンの１５μｍ粒子で形成されている。照射は、１０倍の倍率で、最大パワーの６０％で、４６０ｎｍの信号によって得られる。音響周波数は、１．９１ＭＨｚで振幅が９Ｖである。照射シーケンス：４６０オフ－オン、すなわち、最初に凝集体が白い光（４６０オフ）の中で形成され、続いて４６０ｎｍ（オン）での照射で、音響浮揚中で粒子のクラウンを形成する。

図２４において、層状の環状構造を見ることができる。粒子の混合物は、直径１５μｍの赤いポリスチレンの粒子と白いポリスチレンの４０μｍ粒子とを含む。照射は、１０倍の倍率で、最大パワーの６０％で、４６０ｎｍの信号によって得られる。音響周波数は、１．９１ＭＨｚで振幅が９Ｖである。照射シーケンス：４６０オン－オフ、すなわち、音響と光学が同時にアクティブ化されるのであり、それによって、赤い粒子が中心から排除された。それから４６０ｎｍでの照射がオフにスイッチングされるのであり、それによって、それら赤い粒子が中央の凝集体上に凝集体を形成することが可能になった。

Claims (28)

1. 細胞の操作、および／もしくは前記細胞の構造化ならびに／または培養を実行することができるマイクロ流体チップであって、
   －生体適合性材料から作られたブロック（５）と、
   －液体に浸された細胞の通過のために前記ブロック内に作られた通過チャネル（７、８）と、
   －前記細胞がもはや前記通過チャネル内の流れの影響を受けないように、前記通過チャネルに接続されておりかつ前記通過チャネルに由来する前記細胞を収容するための壁を含む、前記ブロック（５）内に作られた共鳴空洞（６）と、
   －前記共鳴空洞内で音響浮揚中で少なくとも１つの細胞凝集体（１８、２５）を形成することができる音波発生器（１２）と、
   －前記共鳴空洞の少なくとも１つの壁を通して、かつ、前記少なくとも１つの凝集体を構造化するような方法での音波の生成と同時に、前記共鳴空洞内の細胞を照射することであって、前記照射に感受性のない前記細胞だけが１つの層に凝集体を形成するように、前記細胞の一部を光学的に排除する技術により、照射すること、ができる少なくとも１つの光エミッタ（１３）と、を備える、マイクロ流体チップ。
2. 少なくとも１つの第２の光エミッタ（１３’）を備え、２つの前記エミッタがそれぞれ前記共鳴空洞（６）の２つの対向する壁を通してエミットするように配置されていることを特徴とする、請求項１に記載のチップ。
3. ２つの前記光エミッタが、それぞれ異なる波長（λ_{ｏｐｔ １}、λ_{ｏｐｔ ２}）でエミットすることを特徴とする、請求項１または２に記載のチップ。
4. 前記音波発生器が、前記共鳴空洞の少なくとも一部を挟みこんでいる上部要素及び下部要素を、２つの対向する壁上に含んでおり、前記上部要素が、固定されているかまたは取外し可能であり、上部トランスデューサまたは音波反射器（１１）であり、前記下部要素が、下部トランスデューサ（１２）であり、前記トランスデューサが、前記音波をエミットすることができることと、前記上部要素および／または前記下部要素が、前記細胞を照射するために提供される前記光ビームに対して透明であることと、を特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載のチップ。
5. 前記共鳴空洞（６）が、前記共鳴空洞（６）の下端で前記下部トランスデューサ（１２）によって閉じられていることを特徴とする、請求項４に記載のチップ。
6. 前記下部トランスデューサ（１２）が、前記共鳴空洞（６）の内側に配置されていることを特徴とする、請求項４に記載のチップ。
7. 前記共鳴空洞（６）が、前記下部トランスデューサのヘッドを、前記ヘッドが前記共鳴空洞に挿入されると、ブロックするための少なくとも１つのストップ（１４、１５）を有することを特徴とする、請求項６に記載のチップ。
8. 前記下部トランスデューサおよび／または前記上部トランスデューサが、前記空洞の外側から前記細胞を照射するために提供される光学ビームが通過することを可能にする材料（１９）から出発して、設計されていることを特徴とする、請求項４から７のいずれか一項に記載のチップ。
9. 前記下部トランスデューサおよび／または前記上部トランスデューサが、リング（２０）の形状を有し、少なくとも前記空洞の外側から前記細胞を照射するために提供される光学ビームが前記リングの内側へ通ることを可能にすることを特徴とする、請求項４～８のいずれか一項に記載のチップ。
10. 前記共鳴空洞が、前記共鳴空洞の下端で、前記共鳴空洞の外側に配置された前記下部トランスデューサに由来する前記音波に対して透明である、固定されているかまたは取外し可能なフィルム（１６）によって閉じられていることを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載のチップ。
11. 前記音波発生器が、前記共鳴空洞の周りで外側に配置されているか、または前記共鳴空洞の側壁を形成している、中空円柱の形状のトランスデューサ（２４）であり、前記空洞の上部および／または下部壁が、前記空洞の外側から前記細胞を照射するために提供される光学ビームに対して透明である材料から作られている、ことを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載のチップ。
12. 前記共鳴空洞（６）が、円柱であり、前記円柱の前記側壁が、前記ブロックによって構成されることを特徴とする、請求項１～１１のいずれか一項に記載のチップ。
13. 前記通過チャネルが、前記円柱の側壁の上端で前記共鳴空洞に通じていることを特徴とする、請求項１２に記載のチップ。
14. 前記下部トランスデューサ（１２）のヘッドが、前記共鳴空洞内の使用可能なボリュームの高さを低減するために、前記高さが前記通過チャネルの高さと等しくなるまで挿入されることができるように、前記共鳴空洞が、配置されたストップを有することを特徴とする、請求項１３に記載のチップ。
15. 前記通過チャネル（７、８）が、前記ブロックの上面上に作られており、結合されているかまたは取外し可能なストリップ（１１）が、前記共鳴空洞の上端を含めて前記ブロックの表面のすべてを覆っており、前記ストリップが、外側から前記共鳴空洞の前記細胞を照射するために提供される光学ビームに対して透明であることと、トランスデューサが反対側に配置されている場合に、前記ストリップが、前記共鳴空洞の内側にある前記トランスデューサからの前記音波を反射する反射器として作用することと、を特徴とする、請求項１～１４のいずれか一項に記載のチップ。
16. 前記通過チャネル（７、８）および前記円柱が、互いに垂直に配置されていることと、前記ブロックが、一方の側から他方へ前記ブロックを通過する２つのマイクロチャネル（９、１０）であって、前記円柱（６）に平行で、かつ前記通過チャネル（７、８）の２つの自由端にそれぞれ接続されている、２つのマイクロチャネル（９、１０）をさらに含むことと、を特徴とし、第１の前記マイクロチャネル（９）が、前記通過チャネル内への細胞の到達を目的としており、第２の前記マイクロチャネル（１０）が、前記通過チャネルからの細胞の排出を目的としている、請求項１５に記載のチップ。
17. 前記反射器（１１）が、ガラス、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、石英、シリコン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、または環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）から作られたストリップであることを特徴とする、請求項４～１６のいずれか一項に記載のチップ。
18. 前記反射器（１１）が、前記ブロックの材料と同一の材料から出発して設計されており、かつ前記反射器（１１）が、音波を反射するように処理された内面を有することを特徴とする、請求項４～１７のいずれか一項に記載のチップ。
19. 複数のマイクロチャネル（２２、２３）であって、前記ブロックの厚さにおいて作られて、細胞が侵入する及び／または排出するように前記共鳴空洞に通じる、複数のマイクロチャネル（２２、２３）を備えることを特徴とする、請求項１～１８のいずれか一項に記載のチップ。
20. 前記共鳴空洞の高さが、作り出される圧力ノードの数と、前記発生器によって生成される前記音波の波長と、の関数であることを特徴とする、請求項１～１９のいずれか一項に記載のチップ。
21. 前記ブロック（５）が、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）または環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）から作られていることを特徴とする、請求項１～２０のいずれか一項に記載のチップ。
22. 前記共鳴空洞が、前記共鳴空洞に通じる前記通過チャネルの直径よりも大きい高さで寸法が定められていることを特徴とする、請求項１～２１のいずれか一項に記載のチップ。
23. 前記共鳴空洞（６）が、１～５０ｍｍの直径を有し、前記共鳴空洞の高さが、５～１５ｍｍで構成され、前記通過チャネルの高さが、４５０μｍに等しい、ことを特徴とする、請求項１～２２のいずれか一項に記載のチップ。
24. 前記通過チャネルと同じ平面内で前記ブロック内に作られた、少なくとも１つの追加のマイクロチャネルをさらに備えることを特徴とする、請求項１～２３のいずれか一項に記載のチップ。
25. 請求項１～２４のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ内の音響浮揚中の細胞を操作するための方法であって、前記方法が、
    －前記通過チャネル（７、８）の入口を介して前記共鳴空洞（６）に細胞を注入するステップと、
    －少なくとも１つの層内に細胞凝集体（１８）を形成するように、注入された前記細胞を音響的に浮揚するための音波を生成するステップと、
    －光学的排除原理に従って細胞を操作するように、前記音波を同時に維持しながら、前記細胞を照射する少なくとも１つのフェーズのステップと、を含む、方法。
26. 注入された前記細胞がそれぞれ異なる性質を有する請求項２５に記載の方法であって、音波を生成するステップおよび照射する前記ステップが、
    －注入された前記細胞を音響的に浮揚するための音波を生成し、同時に、前記細胞の一部の排除の前記原理を可能にする波長で光ビームをあてて、前記光波長に感受性のない前記細胞だけが１つの層内に凝集体を形成するようにし、
    －前記音波を維持し、前記光ビームを停止して、前記光ビームの前記波長に感受性のある前記細胞が、すでに形成された前記凝集体の周辺に次に凝集体を形成することによって、半径方向に構造化された凝集体を得る、ように実行される、方法。
27. 凝集体の複数の層で形成された３次元構造を作り出すための請求項２５または２６に記載の方法であって、
    －注入する前記ステップが、１つ以上の入口を介して前記共鳴空洞に細胞を注入することを含み、
    －音波を生成する前記ステップが、複数のレベルに注入された細胞の複数の凝集体を音響的に浮揚させるための音波の生成をさらに含み、前記レベルが、音圧ノードであり、前記音圧ノードの数が、前記音波の波長と、前記共鳴空洞の高さと、の関数である、方法。
28. 前記培養の期間中、得られた前記凝集体又は複数の凝集体を音響浮揚中で動かないように保持しながら細胞培養を実行するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
    

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