JP4309131B2 - 集束音響排出細胞分類システムおよび方法 - Google Patents
集束音響排出細胞分類システムおよび方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4309131B2 JP4309131B2 JP2002554696A JP2002554696A JP4309131B2 JP 4309131 B2 JP4309131 B2 JP 4309131B2 JP 2002554696 A JP2002554696 A JP 2002554696A JP 2002554696 A JP2002554696 A JP 2002554696A JP 4309131 B2 JP4309131 B2 JP 4309131B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fluid
- cells
- volume
- acoustic
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 128
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 615
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 370
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 167
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 56
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 52
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 28
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 claims description 20
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 19
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 17
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 17
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 claims description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 14
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims description 12
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 10
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 claims description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 8
- 238000003957 acoustic microscopy Methods 0.000 claims description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 5
- 230000008021 deposition Effects 0.000 claims description 5
- 238000007599 discharging Methods 0.000 claims description 5
- 230000010287 polarization Effects 0.000 claims description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000005389 magnetism Effects 0.000 claims description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 claims description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000001579 optical reflectometry Methods 0.000 claims 3
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000003990 capacitor Substances 0.000 claims 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 claims 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 53
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 47
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 30
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 26
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 26
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 26
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 25
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 25
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 24
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 19
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 17
- 238000003491 array Methods 0.000 description 16
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 15
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 14
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 description 13
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 11
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 11
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 10
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 10
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 8
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 description 7
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 7
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 6
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 6
- -1 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 5
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 5
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 5
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010045649 agarase Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 3
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 241000233872 Pneumocystis carinii Species 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 3
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000007863 gel particle Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 229910021421 monocrystalline silicon Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 3
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 3
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 3
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000059 patterning Methods 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004833 X-ray photoelectron spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000002327 eosinophilic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 2
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000003134 recirculating effect Effects 0.000 description 2
- 238000002310 reflectometry Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228197 Aspergillus flavus Species 0.000 description 1
- 201000001178 Bacterial Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 241000223205 Coccidioides immitis Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000011724 DNA Repair Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010076525 DNA Repair Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241001502974 Human gammaherpesvirus 8 Species 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 102100025323 Integrin alpha-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010041341 Integrin alpha1 Proteins 0.000 description 1
- 108010055795 Integrin alpha1beta1 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 208000029523 Interstitial Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 241001443590 Naganishia albida Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 229910008051 Si-OH Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910006358 Si—OH Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 210000002367 agranular leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001552 airway epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 229920000402 bisphenol A polycarbonate polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 230000005465 channeling Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000005482 chemotactic factor Substances 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 239000012611 container material Substances 0.000 description 1
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000003066 decision tree Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000005485 electric heating Methods 0.000 description 1
- 239000008151 electrolyte solution Substances 0.000 description 1
- 230000005670 electromagnetic radiation Effects 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000005530 etching Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005294 ferromagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 231100000722 genetic damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 238000009499 grossing Methods 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000007641 inkjet printing Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- 210000001739 intranuclear inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000000207 lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 150000002736 metal compounds Chemical class 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 238000005065 mining Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 1
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011824 nuclear material Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 244000039328 opportunistic pathogen Species 0.000 description 1
- 238000012576 optical tweezer Methods 0.000 description 1
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 238000002161 passivation Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 238000000206 photolithography Methods 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002239 polyacrylonitrile Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229910021420 polycrystalline silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 229920002689 polyvinyl acetate Polymers 0.000 description 1
- 239000011118 polyvinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000007788 roughening Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- FZHAPNGMFPVSLP-UHFFFAOYSA-N silanamine Chemical compound [SiH3]N FZHAPNGMFPVSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 229910052814 silicon oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002210 silicon-based material Substances 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012306 spectroscopic technique Methods 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003046 sporozoite Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000006557 surface reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000010408 sweeping Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000003812 trophozoite Anatomy 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B41—PRINTING; LINING MACHINES; TYPEWRITERS; STAMPS
- B41J—TYPEWRITERS; SELECTIVE PRINTING MECHANISMS, i.e. MECHANISMS PRINTING OTHERWISE THAN FROM A FORME; CORRECTION OF TYPOGRAPHICAL ERRORS
- B41J2/00—Typewriters or selective printing mechanisms characterised by the printing or marking process for which they are designed
- B41J2/005—Typewriters or selective printing mechanisms characterised by the printing or marking process for which they are designed characterised by bringing liquid or particles selectively into contact with a printing material
- B41J2/01—Ink jet
- B41J2/135—Nozzles
- B41J2/14—Structure thereof only for on-demand ink jet heads
- B41J2/14008—Structure of acoustic ink jet print heads
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/02—Burettes; Pipettes
- B01L3/0241—Drop counters; Drop formers
- B01L3/0268—Drop counters; Drop formers using pulse dispensing or spraying, eg. inkjet type, piezo actuated ejection of droplets from capillaries
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
- C12M47/04—Cell isolation or sorting
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/1023—Microstructural devices for non-optical measurement
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1456—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N29/00—Investigating or analysing materials by the use of ultrasonic, sonic or infrasonic waves; Visualisation of the interior of objects by transmitting ultrasonic or sonic waves through the object
- G01N29/02—Analysing fluids
- G01N29/028—Analysing fluids by measuring mechanical or acoustic impedance
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
- G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
- G01N35/1065—Multiple transfer devices
- G01N35/1074—Multiple transfer devices arranged in a two-dimensional array
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/149—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry specially adapted for sorting particles, e.g. by their size or optical properties
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N2015/1028—Sorting particles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1404—Handling flow, e.g. hydrodynamic focusing
- G01N2015/1415—Control of particle position
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1404—Handling flow, e.g. hydrodynamic focusing
- G01N2015/142—Acoustic or ultrasonic focussing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N2015/1486—Counting the particles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
- G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
- G01N2035/1027—General features of the devices
- G01N2035/1034—Transferring microquantities of liquid
- G01N2035/1039—Micropipettes, e.g. microcapillary tubes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
- G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
- G01N2035/1027—General features of the devices
- G01N2035/1048—General features of the devices using the transfer device for another function
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
- G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
- G01N2035/1027—General features of the devices
- G01N2035/1048—General features of the devices using the transfer device for another function
- G01N2035/1062—General features of the devices using the transfer device for another function for testing the liquid while it is in the transfer device
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Acoustics & Sound (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
(技術分野)
本発明は、一般的にキャリア流体中に懸濁された細胞の空間的に指向された排出における収束音響エネルギーの使用に関する。本発明の方法およびデバイスは、細胞の効率的で非破壊的、かつ完全な分類を提供する。
【0002】
(背景技術)
効率的で、非破壊的で、そして完全な細胞分類法は、基礎生物学的研究および基礎医学的研究における適用を広めた。例えば、細胞分類は、通常、免疫学で使用され、そこでは、特定のマーカーを提示する細胞は、蛍光のような光学的特性を介して、他の細胞から分離される。もう1つの適用は、新形成に対する治療のような、医学的治療においてであり、そこでは、特定の自己細胞型または異種細胞型が、通常、移植に対して望まれる。生体適合性材料および一般的に生体工学の微小製作における進歩は、より効果的な細胞分類方法が、組織工学適用における使用法もまた見出すことを示唆する。
【0003】
初期の細胞分類デバイスは、物理的パラメータに基いて、細胞を区別した。そのような細胞分類技術は、濾過(これは、細胞の大きさに基づいて選択する)および遠心分離(これは、細胞の密度に基づいて選択する)を含む。これらの方法は、目的の細胞集団が、細胞混合物中のほかの細胞と、大きさまたは密度が有意に異なる場合、効果的である。しかし、個々の細胞集団が、細胞混合物中で、互いに大きさおよび密度が類似する場合、濾過技術も遠心分離技術もどちらもそれらを効果的に分離できない。
【0004】
これらの欠点を克服するために、表面マーカーまたはエピトープの提示に基づいて細胞集団を区別および分類する技術を開発した。これらの技術は、細胞表面に付着するタグエレメントに基づいて細胞集団を区別し、主要な細胞分類ツールとなる。蛍光活性化細胞分類(FACS)は、特定の細胞表面マーカーに結合する蛍光抗体標識または蛍光抗体タグを使用する。ほとんどの、そのような分類器は、主として二元的な方法で操作する:選択は、細胞が前もって選ばれた蛍光閾値に基づいて分離をトリガーするのに十分な蛍光ラベルを有するかどうかにのみ基づく。FACS分類器は、一度に1つの細胞を検査するので、細胞分離の速度は、比較的遅い。一般的に、FACS分類器は、103細胞/秒の速度で、細胞分類を提供し得る。より速い細胞分類速度は可能であるが、いくつかの細胞を損傷し得る。有限数のFACS分類器は、これらが費用がかさみ、熟練された技術によって操作されなければならないので、実験室に存在する。
【0005】
細胞タグ化を使用するもう1つの分離方法は、高度勾配磁気分離(HGMS)として公知である。磁気ベース分類は、最初に鉱業において使用された。そして、この分類は、この操作に対する、分類された材料の固有の磁気特性における違いによる(Frantz、米国特許第2,056,426号を参照のこと)。HGMSにおいて、異種細胞集団または細胞混合物は、磁気的にタグ化された細胞部分集団を含み、印加された磁場を通りぬけ、磁気的タグで標識された部分集団の細胞は、磁気供給源に選択的に付着する。磁気的にタグ化された細胞部分集団は、磁気供給源への、または磁気供給源近辺の細胞コレクターへの吸着によって、収集される。HGMSの1つの欠点は、FACSより迅速であり得るが、目的の細胞部分集団が、コレクター中で細胞が塊になってしまうことによって、HGMS工程中に損傷し得ることである。分離は単に磁気的タグの存在または非存在に基づくので、HGMSは、また主として元来、二元的である。
【0006】
磁性または蛍光のようなパラメーターに基づく二元的分離技術は、細胞分類における重要な使用法が見出されてきた。しかし、検出された磁性シグナルまたは蛍光シグナルの強度のような、特定のパラメーターの強度に基づいた非二元的方式での細胞の分離に対する必要性が存在する。
【0007】
最近、細胞に結合した磁気的タグの量に基づいた細胞の分類に対するシステムおよび方法が記載され(Zborowskiら、米国特許第6,120,735号)、それは、タグ化細胞が磁場を通り抜けるチャネルを使用する。この方法は、従来のFACSまたはHGMSに比べて、より高い細胞生存率に匹敵する生存性を維持しつつ、より大きなハイスループットを可能にする。異なる磁気感受性を有する粒子の集団は、流れの中で磁場をかけられ、流れにおける勾配を形成する。チャネル内の分割された流れ区画は、分画された遠心性流れを生成するのに使用される。しかし、これらの分画された細胞の流れ中の粒子は、厳密には分類されず、むしろ特定の画分に濃縮される。従って、細胞の生存性を維持しつつ、よりハイスループットの分画された濃縮方法は、純度の犠牲によって得られる。従って、非二元的分離を実行するための順応性を有し、純度の犠牲を有さない、ハイスループットを可能にする細胞分類の方法に対する必要性が存在する。
【0008】
細胞分類について、もう1つの最近の記載された方法は、ハイスループットを提供し、単なる濃縮を避けるが、全ての検出された所望されていない細胞をレーザーで破壊することによって細胞を犠牲にする(Hirakoら、米国特許第5,158,889号、1992)。
【0009】
いくつかの細胞分類方法は、Fulwylerら、米国特許第3,710,933号、ならびにFulwyler、同第3,380,584号および同第4,148,718号に記載されるように、チャネル中の流体懸濁細胞の1列の連続的行列を単一の細胞を含む個々の液滴の行列へ分離する能力を含む。個々の液滴の行列は、流れが通過するフローチャンバーまたはオリフィスを、通常40,000Hz程度の頻度で、振動させることによって生成する。これらの液滴は、各々単一の細胞を含み、オリフィスから排出される。この方法において、1列の細胞は、有意な距離、互いから分離され、1列のほとんど近接する細胞の連続的行列を使用する方法における数に比べて、単位時間に検出点または排出点を通過する細胞の数がより少なくなる。従って、分類処理量または分類効率は、比較的低い。なぜなら、選択される細胞は、流体が連続である場合ほどには、迅速に行列から排出され得ないからである。また、多くの細胞を含むチャネルにおいて、個々の細胞の操作に関連して、かなりの非順応性および非効率性がある。例えば、チャネル中の個々の細胞の操作の速度は、本質的に限定される。なぜなら、流れは、チャネルまたは相互に連結したチャネルのシステムにおいて、細胞の衝突の阻害を防止するように遅くされるまたは停止される必要があり得るからである。
【0010】
そのような流体懸濁細胞分類器の例は、ジェットインエアーソーターであり、これは、通常、市販の哺乳動物細胞分類に対して最適化される。8μmから14μmまでの範囲の直径を有するリンパ球細胞および200μmまでの長さの寸法を有する精母細胞は、一般にそのようなデバイスによって分類される。ピエゾベースであるジェットインエアーシステムは、分類される細胞に特定の直径に合わせられ、実質的に異なる平均サイズを有する細胞の部分集団を分類することは困難である。そのようなシステムを異なる細胞サイズまたは流体粘度に適合するために合わせることは、フローチップ直径、シース圧、流速、液滴駆動頻度、駆動振幅、液滴スペーシング、液滴決裂点のようなパラメーターの調節を含む。
【0011】
ピエゾベースシステムはまた、他の理由について不十分である傾向があり、流れにおける細胞の間隔を空けて、細胞の集中を防止するこれらの必要性を含み、分類操作に対して細胞を迅速に配置する能力を減少する。例えば、細胞の集中を避けるために、10のうち1つの流体液滴が、1つの細胞を含み得る。従って、1秒当たり32000ドロップの流速に対して、1秒当たりほんの3200細胞がカウントされ、これは、各々の液滴が1つの細胞を含むシステムの使用に比べて、10倍低い効率である。
【0012】
従って、フローチップを交換する必要も他の流体パラメーターを調節する必要もない、大きな範囲の粒子サイズを分類できる方法およびシステムに対する必要性が存在する。実際に、目詰まりに対する可能性を排除するための、フローチップを使用しない細胞分類方法および細胞分類システムに対する必要性が存在する。目詰まりを有さずに、細胞の塊と、1つ1つの細胞との間を容易に区別し得、塊が別々に同定され、分類されることを可能にする分類システムおよび分類方法に対する必要性が存在する。エネルギー変換器での周波数および出力設定を単に変えることによって、溶液の変化する粘度に適応して調節され得る分類システムおよび分類方法に対する追加の必要性が存在する。例えば、かなりの平行で多重チャネル分類の使用によって、現在のシステムを越えるスループットレベルおよび効率レベルを経済的に達成し得る細胞分類システムに対する追加の必要性が存在する。分離純度または細胞生存力を犠牲にすることなく、多重パラメーターに従って細胞を区別し、そして単一のパラメーター(非二元的決定をなす)の程度に基づいて細胞を2つ以上の群に分類する改善された方法に対する基本的な必要性がなお存在する。
【0013】
研究の目的のために、多くの改善が、細胞分類システムに対して望まれる。全体的に見て、例えば、全時間が、細胞混合液(例えば、血液サンプル)を得ることと実験的に分離された細胞を使用することとの間で短くされるように、より効率的にする必要性がある。さらに、実験は、一般的に、少数の特定の細胞型を個々のプレート、皿、ウェル、またはこれらのアレイにプレートすることが必要である。全ての既知の細胞分類方法は、最初、個々に選択される細胞を直接ウェルプレートまたは他の容器に入れて除去することを可能にするよりむしろ、所定の部分集団の全ての細胞を1つの場所に収集するので、より多くの工程が、サンプル収集することと実験に対して準備の整った収集された細胞を有することとの間で必要とされる。かなりの実験室時間および労力が、分離された部分集団全体を単一の容器に入れて収集し、次いで細胞を実験容器中に再分割するよりむしろ、既知の少数の個々に選ばれた細胞を実験での使用のために容器に直接送達することによって節約される。従って、細胞混合物から生存細胞を非二元的に選択的に取り出し、直接実験容器に入れるための手段を使用するための必要性が存在する。この必要性は、音響排出の使用を通して満たされ得る。
【0014】
個々の生存細胞が流体から排出される、細胞の分類についての現在公知の方法またはシステムは存在しない。従って、流体から生存単一細胞を排出することによって、細胞を分類するための方法および対応するシステムに対する必要性が存在する。この方法および対応するシステムは、好ましくは、非二元的選択を使用し、流体から正確な数の細胞を実験容器に直接送達し得る。分類された細胞を直接実験容器に送達する能力および細胞を単一の本質的な特性またはタグ化された特性に基づいて(ちょうと2ではなく)いくつかの群に分類する能力によって既存の方法と比べた場合、液滴に含まれる個々の選択された細胞の音響排出を使用して細胞を分類するための方法および系は、生存力を減少せずに、増加した順応性および全体的効率を提供する。
【0015】
(発明の要旨)
従って、先行技術の上記の欠点を克服するシステムおよび方法を提供することが、本発明の目的である。
【0016】
1つの実施形態において、流体中の局在的な体積を分離する方法を提供し、ここで、各々の局在的な体積は、流体とは異なる音響インピーダンスを有する。検出器は、1つの局在的な体積の位置を同定し、その1つ以上の特性を決定するために使用される。従って、収束エネルギー、好ましくは、収束音響エネルギーは、局在的な体積を流体から液滴として排出するために効果的な方法で、流体に印加される。前述の方法を実行するために好ましいデバイスは、複数の流体液滴の音響排出を可能にするデバイスである。そのようなデバイスは、以下を備える:例えば、その中に懸濁された細胞または他の局在的な体積を運送可能な流体を含むように適合された複数の容器またはレザバ;音響放射を発生する音響排出器および各々のレザバ中の流体表面近くの焦点で収束させるための収束手段;ならびに各々の容器またはレザバと音響連結関係で排出器の位置づけをする手段。好ましくは、各々の容器は、取り外し可能であるか、またはウェルプレート中の個々のウェルからなるか、および/または一列に配列されている。さらに、好ましくは、容器またはレザバは、実質的に互いに音響的に区別できず、含んだ流体の表面近くで、音響エネルギーがエネルギー的に十分収束することを可能にする、適切な音響インピーダンスおよび音響減衰を有する。
【0017】
前記の方法のバリエーションにおいて、局在的な体積は、基板表面上の流体排出チャネル内での流れに存在するか、または培地(代表的には、寒天または類似する半固体もしくはゲル)上で増殖する細胞コロニー内で生育する細胞である。
【0018】
他の実施形態において、収束音響排出技術を細胞をまたは他の制限された体積を、流体の表面に平行な面によって実質的に横断されるチャネルまたは他の容器に選択的に分類するために使用するシステムを提供する。この面はまた、液滴が排出される容器を横断する。個々の細胞または他の制限された体積は選択され、次いで、調整可能な速度で、実質的に平面の基板に、この基板上にアレイを形成するように排出され得る。システムのこの操作は、第1のキャリア流体中の細胞または他の制限された体積を含む、第1のレザバと音響的に連結した関係であるように、音響排出器を位置づけすることによって実行される。流体表面の十分近くに、制限された体積が存在することが、音響的に検出された後、排出についての基準として使用される任意の性質は、音響的測定および/または電磁気学的測定によって検出され、この排出器は、キャリア流体内およびその表面近くに焦点を有する音響放射を発生し、指向するように起動される。適用される音響エネルギーは、キャリア流体の液滴の排出を生じる。システムが細胞放出に使用される場合、音響エネルギーは、ただ1つの細胞のみが中に含まれ得るように十分小さい液滴を排出するのに効果的な様式で適用される。好ましくは、液滴は、流体表面の面に平行な成分を有する速度ベクトルで排出される。望まれる場合、この排出器は、第2のレザバと音響的に連結した関係であるように位置づけられ得、このプロセスは、第2の流体の液滴を排出するために上記のように繰り返される。このシステムはまた、複数の流体容器を用いて繰り返し可能なように構成され得る。
【0019】
さらなる実施形態において、本発明は、他の細胞アレイ形成アプローチより効率的、迅速、順応的かつ経済的に単一の生存細胞のアレイを形成する方法を提供する。本方法は、効果的、連続的かつ同時の選択およびこれらの特性の定量的または半定量的測定に基づいた細胞の分類を可能にする。本方法はまた、多数排出標的、非二元的細胞選択、および複数の分枝決定の使用を可能にする。この配列された細胞は、1つ以上の特定の結合系によって、基板表面に結合され得る。各々の特定の結合系は、リガンドレセプター対のように、同種の部分を特異的に認識する外部マーカー部分を使用する。1つのそのような特異的な結合系は、同種の部分として使用されるビオチンと共に、外部マーカー部分として、形質転換によって産出されるストレプトアビジンを使用する。(細胞の形質転換に対する必要性なしに存在する)内因性外部マーカー部分を使用する結合系の例は、同種の部分として、外部に提示されたIgリンパ球クローンおよびエピトープを使用する。
(発明の詳細な説明)
本発明の詳細を記載する前に、本発明は、特定の流体、細胞、生体分子、またはデバイス構造に限定されず、それ自体変化し得ることが理解される。本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載する目的のためのものであり、限定されることを意図されないこともまた理解される。
【0020】
本明細書および添付された特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明確に他を規定しない限り、複数の対象を含むことに留意しなければならない。従って、例えば、「容器」または「レザバ」との言及は、単一の容器またはレザバおよび複数の容器またはレザバを含み、「流体」との言及は、単一流体または異なる流体の組合せおよび/もしくは混合物を含み、「生体分子」との言及は、単一分子ならびに生体分子の組合せおよび/または混合物を含む、など。
【0021】
本発明の記載および請求において、以下の用語は、以下に述べる定義に従って使用される。
【0022】
用語「局在的な流体の体積」とは、流体の空間的に局在化する体積をいう。代表的には、局在的な流体の体積は、周囲の流体とは異なる物理的特性を有するが、これは、必要とされない。実際には、局在的な流体体積は、この特性が周囲の流体の特性と異なる場合にのみ検出され得る。不飽和(糖によって)水溶液中に懸濁され、そして局部的な流体の糖濃度が大部分の流体の平均糖濃度より高い体積によって取り囲まれる糖の結晶は、詳細に描写するまたは範囲を定める構造を有さない、範囲を定めない局在的な流体の体積の一例である。他の、範囲を定めない局在的な流体の体積は、流体的組成物を含む。そこでは、局在化する脂質領域、もしくは疎水性領域が、親水性(例えば、水性)流体内に含まれるか、または、局在化する親水性(例えば、水性)領域が、脂質性流体、もしくは疎水性流体に含まれる。
【0023】
「制限された流体体積」は、通常は構造によって、しかしおそらくエネルギー場のポテンシャル井戸によって、線引きまたは制限された、局所的な流体体積である。生物学的細胞が、制限された流体体積の主な例である。なぜなら、これは、細胞膜によって制限されているからである。制限された流体体積の他の例としては、血小板、ミトコンドリア、および核(これらは、細胞小器官または包まれた細胞細区画である)が挙げられる。生きた生物に由来しない制限された体積の例は、流体を含有する微小カプセルであり、そこでは、そのカプセル壁は、そのカプセルの内側と外部流体との間のいくらかの物質交換を可能にしても可能にしなくてもよい。制限された流体体積中の流体は、懸濁された固体粒子およびゲル粒子を含み得る。しかし、制限されることによって、制限された体積全体は、その制限する構造または場が破れない限り、単一の粒子として挙動する。固体粒子またはゲル粒子(例えば、ガラスビーズまたはポリマービーズ)が、企図される意味の制限された体積内に含まれる;そのような粒子は、作製される材料によってキャリア流体から制限されている。他の型の制限された体積は、リポソーム、ミセル、および逆ミセルであり、そこでは、外層が、小胞カプセル化層として作用し、そして小胞の内側は、流体で満たされている。なお他の型の制限された体積は、含まれる流体と非混和性であっても非混和性でなくてもよい、第1流体から構成され、そこでは、非混和性材料の単層が、その流体性の内側とその流体性の外側との間に障壁を提供するように、第1流体を制限する。
【0024】
他のように示されない限り、用語「細胞」とは、本明細書中で使用される場合、非細胞性の局所的流体体積も指し得る。従って、細胞を含むように述べられた排出された流体液滴は、細胞を含んでも含まなくてもよい局所的な流体体積を含み得る流体液滴として、解釈されるべきである。より大きな体積の流体内に含まれる他の型の局所的流体体積の例は、上記に提供される。
【0025】
本明細書中で使用される場合、用語「流体」は、固体でないか、または少なくとも部分的に気体状および/もしくは液体である、物質をいう。流体は、最小限に、部分的に、または完全に、溶媒和、分散もしくは懸濁されている固体を含み得;ゲルまたは不連続流体から構成される粒子もまた、流体中に懸濁され得る。流体の例としては、水性液(水自体および塩類水を含む)ならびに非水性液(例えば、有機溶媒など)が挙げられるが、これらに限定されない。キャリア流体中に懸濁された生細胞は、流体中に懸濁されたゲルまたは不連続流体の例を表す。
【0026】
用語「近傍(near)」は、集束させた音響放射の焦点から、液滴が排出されるべき流体の表面までの距離をいうために、使用される。この距離は、流体に対して集束させた音響放射が、その流体表面からの液滴排出を生じるようになされるべきであり、そして当業者は、簡単かつ慣用的な実験を用いて任意の所定の流体に関して、適切な距離を選択し得る。しかし、一般的に、音響放射の焦点と流体表面との間の適切な距離は、その流体における音速の波長の約1倍〜約15倍の範囲であり、より代表的には、この波長の約1倍〜約10倍の範囲であり、好ましくは、この波長の約1倍〜約5倍の範囲である。
【0027】
用語「レザバ」とは、本明細書中において使用される場合、流体を保持または収容するための、レセプタクルまたはチャンバをいう。従って、レザバ内の流体は、必然的に自由表面(すなわち、液滴がそこから排出されることを可能にする表面)を有する。流体が排出され得る少なくとも1つの自由表面を流体容器が有する限り、この容器は、特定の幾何学的構造にかかわらず、レザバである。従って、「レザバ」としては、例えば、液滴が排出される流れる流体を含む、微小流体チャネルが挙げられる。「細胞容器」または「細胞レザバ」とは、キャリア流体に懸濁された生細胞の排出のために特殊化されたレザバであり、そして例えば、キャリア流体に懸濁された生細胞が流れる、微小流体チャネルまたは他のチャネルが挙げられる。
【0028】
用語「音響連結」および「音響連結された」とは、本明細書中で使用される場合、対象物が別の対象物と直接的または間接的に接触して配置されて、それらの対象物間で音響エネルギーを実質的には損失することなく音響放射が伝達されることが可能になるようにされている、状態を指す。2つの実体が間接的に音響連結されている場合、「音響連結媒体」が、音響放射が伝達され得る中間体を提供するために必要とされる。従って、排出器は、流体と音響連結され得、これは、例えば、その排出器をその流体中に浸漬することによるか、またはその排出器とその流体との間に音響連結媒体を挿入して、その排出器により生成される音響放射をその音響連結媒体を通してその流体中へと伝達することによる。
【0029】
用語「結合した(bound)」(例えば、「結合した」細胞を有する基板表面におけるような「結合した」)は、共有結合、吸着および物理的固定化を包含する。用語「付着した(attached)」は、本明細書中で使用される用語「結合した(bound)」と意味が同一である。
【0030】
本明細書中で使用される場合、用語「吸着する」は、基板表面による、分子、分子セグメントまたは細胞の非共有的保持をいう。すなわち、吸着は、基板表面と、吸着される実体上に存在する吸着部分との間の非共有的相互作用の結果として生じる。吸着は、水素結合、ファンデルワールス力、極性引力または静電力を介して(すなわち、イオン結合を介して)生じ得る。時折、この基板は、特定の様式で相互作用するための吸着部分で官能化され得る。
【0031】
本明細書中で使用される用語「アレイ」は、特徴物または材料(例えば、細胞)の二次元整列をいう。アレイは、一般的に、規則的な(regular)、順序付けられた(ordered)特徴物(例えば、直線の格子、平行な片、らせん状の状態にあるような特徴物)から構成されるが、順序付けられていないアレイもまた、同様に有利に使用され得る。
【0032】
用語「生体分子」および「生物学的分子」とは、全体的または部分的に、天然に存在しようが、組換え生成されようが、または化学合成されようが、すなわち、生きた生物の一部であったのであろうが、または生きた生物の一部であり得ようが、任意の有機分子を指すために本明細書中で互換可能に使用される。これらの用語は、例えば、ヌクレオチド、アミノ酸、および単糖、ならびにオリゴマー種およびポリマー種(例えば、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、ペプチド分子(例えば、オリゴペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質)、糖類(例えば、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、ムコ多糖類、またはペプチドグリカン(ペプチド−ポリ多糖))など)を包含する。この用語はまた、リボソーム、酵素補因子、薬理学的に活性な因子などもまた、包含する。
【0033】
用語「集束手段」および「音響集束手段」とは、光学レンズと同様に作用する音響エネルギー源とは別個のデバイスによってか、または音響エネルギー源の空間的配置によってかのいずれかによって、焦点において音波を集束させ、強め合う干渉および弱め合う干渉によって、焦点において音響エネルギーの集束をもたらすための手段をいう。集束手段は、湾曲した表面を有する固体部材程度に単純であり得るか、またはフレネルレンズ(これは、音響放射を指向するために、回折を使用する)において見出される構造のような複雑な構造を含み得る。適切な集束手段はまた、当該分野において公知であり、そして例えば、Nakayasuらに対する米国特許第5,798,779号、およびAmemiyaら(1997)Proceedings of the 1997 IS&T NIP 13 International Conference on Digital Printing Technologies Proceedings,698−702頁に記載されるような、フェーズドアレイ法を包含する。
【0034】
用語「基板」とは、本明細書中において使用される場合、1以上の流体が配置され得る表面を有する、任意の材料をいう。この基板は、例えば、ウェーハ、スライド、ウェルプレート、膜のような、多数の形態のいずれかで構築され得る。さらに、この基板は、特定の流体の配置のために必要とされ得るように、多孔性または非多孔性であり得る。適切な基板材料としては、固相化学合成のために代表的に使用される支持体、例えば、ポリマー材料(例えば、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリアクリロニトリル、ポリアクリルアミド、ポリメチルメタクリレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニリデンフルオリド、ポリカーボネート、ジビニルベンゼンスチレンベースポリマー)、アガロース(例えば、Sepharose(登録商標))、デキストラン(例えば、Sephadex(登録商標))、セルロースポリマーおよび他の多糖類、シリカおよびシリカベース材料、ガラス(特に、制御孔隙ガラス、すなわち「CPG」)および官能基化ガラス、セラミック、ならびに表面コーティング(例えば、細孔ポリマー(特に、ニトロセルロースのようなセルロースポリマー)、細孔金属化合物(特に、細孔アルミニウム)、抗体結合タンパク質(Pierce Chemical Co.,Rockford ILから入手可能)、ビスフェノールAポリカーボネートなど)で処理されたこのような基板が挙げられるが、これらに限定されない。特に興味深い多孔性基板としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:コーティングされていない多孔性スライドガラス(CPGスライドを含む)、ポリマーコーティング(例えば、アミノシランコーティングまたはポリ−L−リジンコーティング)でコーティングされており、従って多孔性ポリマー表面を有する、多孔性スライドガラス;および多孔性コーティングでコーティングされた非多孔性スライドガラス。多孔性コーティングは、多孔性ポリマーコーティング(例えば、セルロースポリマー(例えば、ニトロセルロース)またはポリアクリルアミドからなり得るようなコーティング)、あるいは多孔性金属コーティング(例えば、細孔アルミニウムからなる)であり得る。多孔性表面を有する市販の基板の例としては、Schleicher & Schuell,Inc.(Keene,NH)から入手可能な蛍光アレイ表面技術(FASTTM)スライド(これは、10〜30μmの厚みの、多孔性の流体透過性ニトロセルロース層でコーティングされており、この層は、表面の単位面積あたりの利用可能な結合面積を実質的に増加させる)が挙げられる。他の市販の多孔性基板としては、Eppendorf AG(Hamburg,Germany)から現在入手可能な、CREATIVECHIP(登録商標)透過性スライド、および整列された高度に多孔性の構造(これは、この構造全体の孔隙およびチャネルを通って試薬が流れ、そして浸透することを可能にする)によって「三次元」幾何学構造を有する基板が挙げられる。このような基板は、Gene Logic,Inc.から、「Flow−Thru Chip」の商品名で入手可能であり、そしてSteelら、Microarray Biochip Technologyの第5章(Bio Techniques Books,Natick,MA,2000)によって記載されている。
【0035】
「多孔性基板」または「多孔性表面を有する基板」におけるような用語「多孔性」とは、約1%〜約99%、好ましくは約5%〜約99%、より好ましくは約15%〜約95%の範囲の空隙率(空隙の百分率)、および約100Å〜約1mm、代表的には約500Å〜約0.5mmの平均孔隙サイズを有する、基板または表面をそれぞれいう。
【0036】
用語「不浸透性」とは、水または他の流体が通過することを可能にしないことを意味する、通常の意味で使用される。用語「浸透性」とは、本明細書中において使用される場合、「不浸透性」ではないことを意味する。従って、「浸透性基板」および「浸透性表面を有する基板」とは、水または他の流体が浸透し得る基板または表面をそれぞれいう。
【0037】
前述の支持体材料は、従来使用される基板の代表的なものであるが、基板は、事実上、任意の生物学的材料、非生物学的材料、有機材料および/または無機材料を含み得、そして種々の物理的形態(例えば、粒子、ひも、沈殿物、ゲル、シート、管、球、容器、毛細管、パッド、スライス、フィルム、プレートなど)のいずれかであり得、そしてさらに、任意の所望の形状(例えば、円盤、正方形、球、円など)を有し得ることが、理解されるべきである。この基板表面は、平坦であっても平坦でなくてもよく、例えば、この表面は、隆起領域または陥凹領域を含み得る。基板はさらに、反応性官能基を含み得るか、または反応性官能基を含むように誘導体化され得る。これらは広く公知であり、そしてこれらとしては例えば、反応性Si−OH基を含む二酸化ケイ素支持体、ポリアクリルアミド支持体、ポリスチレン支持体、ポリエチレングリコール支持体などが挙げられる。
【0038】
用語「表面修飾」とは、本明細書中において使用される場合、基板表面または基板表面の選択された部位もしくは領域の、1つ以上の化学的特性および/または物理的特性を変化させるための、加法プロセスまたは減法プロセスによる、表面の化学的変更および/または物理的変更をいう。例えば、表面修飾は、以下を包含し得る:(1)表面のぬれ特性を変化させること、(2)表面を官能基化すること(すなわち、表面の官能基を提供するか、修飾するか、または置換すること)、(3)表面を脱官能基化すること(すなわち、表面の官能基を除去すること)、(4)表面の化学的組成を他の様式で(例えば、エッチングによって)変更すること、(5)表面の粗さを増加または減少させること、(6)表面にコーティング(例えば、その表面のぬれ特性とは異なるぬれ特性を示すコーティング)を提供すること、および/あるいは(7)表面に微粒子を配置させること。本明細書中の基板表面のいずれもが、上述の様式のうちの1つ以上で修飾され得、そして用語「表面」は、上に記載されたような修飾された表面を含むことが意図される。
【0039】
用語「バイナリー」とは、2つの可能性を選択するスキーム(例えば、閾値レベルの蛍光の検出に基づく、排出または非排出)を指す。用語「非バイナリー」とは、2つより多くの可能な選択肢(例えば、高閾値より大きい蛍光発光の検出に基づく第1標的容器への排出、この検出閾値を超えるがこの高蛍光閾値より下で検出される蛍光に基づく第2標的容器への排出、および所定の振動数の蛍光が検出可能でない場合に排出しないこと)を有する選択スキームを指す。
【0040】
用語「細胞のコロニー」または「細胞コロニー」とは、本明細書中で使用される場合、1つ以上の細胞を指す。複数の細胞がそのコロニーに含まれる場合、それらの細胞は、所定の単一細胞の環境条件または外部条件が近隣の細胞により影響される程度に十分に近い。
【0041】
例えば語句「アレイの実質的に全ての細胞」におけるような、用語「実質的に」とは、アレイの細胞のうちの少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも99%、そして最も好ましくは少なくとも99.9%をいう。用語「実質的に」の他の使用は、類似の定義を包含する。
【0042】
「任意の」または「必要に応じて」とは、この後に記載される状況が起こっても起こらなくてもよいことを意味し、その結果、この表現は、その状況が起こる例およびその状況が起こらない例を包含する。
【0043】
次いで、1つの実施形態において、本発明は、流体内の局所的体積を分離するための方法に関し、ここで、各局所的体積は、その流体とは異なる音響インピーダンスを有する。1つの局所的体積の位置を同定し、その1つ以上の特性を決定するために、検出器が使用される。その後、その流体からその局所的体積を液滴として排出するのに有効な様式で、集束されたエネルギー(好ましくは、集束された音響エネルギー)がその流体に適用される。使用されるデバイスは、好ましくは、音響排出デバイスであり、このデバイスは、1つ以上の容器またはレザバ(各々が、生細胞が懸濁されているキャリア流体を含むように適合されている)と;音響放射を生成するための音響放射発生器を備える、排出器;そのレザバの各々におけるその流体表面内またはその流体表面付近の焦点で音響放射を集束させるための、集束手段と;そのレザバの各々に対して音響連結関係にその排出器を位置付けるための、手段;とを備える。
【0044】
図1および図5は、使用されるデバイスの代替の実施形態を、単純化した断面図で示す。図1は、その容器またはレザバが、放射状に対称的な従来の容器(例えば、従来のペトリ皿)である、細胞排出システムを図示する。図5において、そのレザバは、流体チャネルであり、例えば、このチャネルを通って、生細胞がキャリア流体中を流れる。このデバイス11は、複数の細胞容器または細胞レザバ(すなわち、少なくとも2つの容器またはレザバ)を備え、第1の容器は、13で示されており、そして第2の容器は、15で示されており、これらは、各々、流体を含むよう適合されており、そして各流体は、流体表面を有する;例えば、第1の細胞容器は、流体14に懸濁された細胞を有し、そして第2の細胞容器は、流体16に懸濁された細胞を有し、流体表面はそれぞれ、17および19で表されている。14および16のキャリア流体およびその中に懸濁された任意の細胞は、同じであっても異なってもよい。図示されるように、その容器またはレザバは、実質的に音響的に区別不可能であるように実質的に同一の構成であるが、同一の構成は、必須要件ではない。この容器は、取り外し可能な別個の構成要素として示されるが、所望であれば、プレートまたは他の基板内に固定され得る。例えば、図1における複数の容器は、個々のウェルをウェルプレートに含み得るが、必要に応じて、必ずしもアレイに配置されなくてもよい。同様に、図5における複数の容器は、プレートにおける別個のチャネルまたは個々のチャネルを含み得、例えば、個々の微小流体チャネルのパターンが、フォトリソグラフィーによってなどで、プレートにエッチングされる。細胞容器またはレザバ13および15の各々は、好ましくは、左右対称(図5)または軸対称(図1)である。これらの容器の各々は、実質的に垂直な壁21および23を有し、これらの壁は、レザバの基部25および27から上方に延び、そしてそれぞれ、開口部29および31において終結するが、他のレザバ形状(特定の位置における排出のための開口部または開口を有する、流体チャネルを有する形状が挙げられる)が使用され得る。各容器基部またはレザバ基部の材料および厚みは、音響放射がこれらを通ってこのレザバ内に収容される流体内に伝達され得るようなものであるべきである。
【0045】
図1および図5に示されるデバイスはまた、音響放射を発生させるための音響放射発生器35と、流体内(ここから液滴が排出される)の焦点(流体表面近傍)にその音響放射を集束させるための集束手段37とを含む、音響排出器33を備える。図1および図5に示されるように、この集束手段37は、音響放射を集束するための凹型表面39を有する単一の中実部分を含み得るが、この集束手段は、以下に議論されるような他の方法で構成され得る。従って、この音響排出器33は、それぞれ、レザバ13および15に、従って流体14および16に音響連結された場合に、流体表面17および19の各々から流体の液滴を排出するように、音響放射を生成しそしてその音響放射を集束するように適合される。音響放射発生器35および集束手段37は、デバイスの所望の性能に依存して、単一のコントローラにより制御される単一のユニットとして機能し得るか、またはこれらは独立して制御され得る。代表的に、単一排出器設計が、複数排出器設計よりも好ましい。なぜなら、液滴の配置の精度、ならびに液滴のサイズおよび速度の一貫性は、単一の排出器を用いた場合に、より容易に達成されるからである。
【0046】
当業者に理解されるように、種々の集束手段のいずれかが、本発明と共に用いられ得る。例えば、1つ以上の湾曲表面を使用して、音響放射を流体表面付近の焦点に方向付けし得る。1つのこのような技術は、Loveladyらの米国特許第4,308,547号に記載される。湾曲表面を有する集束手段は、市販の音響変換器(例えば、Panametrics Inc.(Waltham,Massachusetts)により製造される音響変換器)に組み込まれている。さらに、対象面から所定の焦点距離に音響エネルギーを方向付けするためのフレネルレンズが、当該分野で公知である。例えば、Quateらの米国特許第5,041,849号を参照のこと。フレネルレンズは、音響エネルギーのかなりの部分を、そのレンズに対して半径方向に変化する回折角度で所定の回折次数に回折させる、半径方向の位相プロフィールを有し得る。この回折角は、所望の対象面上に、その回折次数内の音響エネルギーを集束させるように選択されるべきである。音響エネルギーエミッターのフェーズドアレイもまた、整列された供給源により放射される音波の間の強め合う干渉および弱め合う干渉の結果として、音響エネルギーを指定の点に集束させるために使用されている(Amemiyaら(1997)Proceedings of 1997 IS&T NIP13 International Conference on Digital Printing Technologies,pp.698−702)。
【0047】
排出器33を、個々のレザバの各々、従ってその中の流体に音響連結するための多数の方法もある。1つのこのようなアプローチは、例えば、Loveladyらの米国特許第4,308,547号に記載されるように、直接接触によるものであり、ここでは、セグメント電極を有する半球型クリスタルから構成された集束手段が、排出される液体中に沈められる。上記の特許は、この集束手段が、その液体の表面にかまたはこの表面の下に配置され得ることをさらに開示する。しかし、排出器が複数の容器またはレザバから異なる流体を排出するために使用される場合、相互汚染を回避するために集束手段の度重なる洗浄が必要であるため、集束手段を流体に音響連結するためのこのアプローチは、望ましくない。必然的に、この洗浄プロセスは、各液滴排出事象の間の移行時間を延長する。さらに、このような方法において、その流体中の細胞は、容器から取り出される場合に、排出器に付着して、稀少であるか代わりのない可能性のある細胞物質が無駄になる。最終的に、レザバが微細製造される場合(例えば、細胞容器が微小流体チャネルまたはマイクロウェルである場合)、流体中に沈めることは、その容器が小さすぎるために、従来の音響エネルギー集束手段を用いては可能ではない。
【0048】
微細製造の当業者は、微細製造した湾曲部材を含む集束手段を作製し得る。同様に、セグメント電極を有する半球型クリスタルから構築された、微細製造された集束手段(例えば、Loveladyらの米国特許第4,308,547号に記載されるようなミニチュア集束手段)は、慣用的な微細製造技術によって作製され得る。次いで、流体中に沈めることは、可能であるが、上記と同じ欠点を伴う。微量流体チャネルまたはウェルについて、次いで、集束手段および音響エネルギー源が、微細製造されたアセンブリに組み込まれ得る。
【0049】
どのレザバ寸法についても実行可能なアプローチは、従来の微細製造されていない排出器またはマクロスケールの排出器を、この排出器のいずれの部分(例えば、集束手段)も、排出される流体と少しも接触させることなく、レザバおよびレザバの流体に音響連結することである。このために、本発明は、排出器を、細胞容器または細胞レザバ中の流体の各々と制御された反復可能な様式で音響連結して位置付けして、その流体の中に排出器を沈めることなくこの流体から液滴を排出するための、排出器位置決め手段を提供する。この方法は、代表的に、排出器と各レザバの外面との間の直接的または間接的な接触を包含する。直接接触が、排出器を各レザバに音響連結するために使用される場合、この直接接触が、効率的な音響エネルギー伝達を保証するために完全に適合していることが好ましい。すなわち、この排出器およびレザバは、嵌合接触に適合した対応する表面を有するべきである。従って、音響連結が、集束手段によって排出器とレザバとの間で達成される場合、このレザバが、集束手段の表面プロフィールに対応する外側表面を有していることが、望ましい。適合した接触がない場合、音響エネルギー伝達の効率および精度が損なわれ得る。さらに、多くの集束手段は湾曲表面を有するので、直接接触アプローチは、特別に形成された逆向き面を有するレザバの使用を必要とし得る。
【0050】
必要に応じて、音響連結は、図1Aおよび図5Aに例示されるように、間接的接触によって、排出器とレザバ各々との間で達成される。これらの図において、音響連結媒体41が、排出器33とレザバ13の基部25との間に配置され、ここで排出器およびレザバは、互いから所定の距離に位置している。この音響連結媒体は、音響連結流体であり得、好ましくは、音響集束手段37および各レザバの両方と適合接触した、音響的に均質な材料であり得る。さらに、この流体媒体が、その流体媒体自体とは異なる音響特性を有する材料を実質的に含まないことを保証することが、重要である。示されるように、第1のレザバ13は、音響集束手段37に音響連結され、その結果、音波が、音響放射発生器によって生成され、そしてこの集束手段37によって、音響連結媒体41に向かって方向付けられ、これにより、次いで音響放射がレザバ13に伝達される。
【0051】
作動中、デバイスのレザバ13および15の各々は、図1および5に示されるように、それぞれ、第1のキャリア流体および第2のキャリア流体で満たされ、これらのキャリア流体は、それぞれ、その中に懸濁された細胞または細胞混合物14および16を有する。音響排出器33は、音響連結媒体41を介した排出器とレザバとの間の音響連結を達成するために、レザバ13の下に示す排出器位置決め手段43によって配置可能である。基板45は、第1のレザバ13の上かつ第1のレザバ13の近位に配置され、その結果、この基板の一方の表面(図1および5において下側面51として示される)は、レザバに面し、そしてこのレザバ内の流体14の表面17に対して実質的に平行である。一旦、排出器、レザバおよび基板が適切に整列すると、音響放射発生器35は、音響放射を生成するように作動され、この音響放射は、集束手段37によって、第1のレザバの流体表面17付近の焦点47に方向付けられる。結果として、液滴49は、この流体表面17から、基板の下側面51上の指定した部位に排出される。この排出された液滴は、接触後に基板表面を凝固することによって、この基板表面上で保持され得;このような実施形態において、基板を低温(すなわち、接触後に液滴の凝固が生じる温度)で維持することが必要である。あるいは、またはさらに、液滴に含まれる細胞の表面上に提示される分子部分またはマーカー部分は、接触後に、吸着、機械的固定化または共有結合によって、基板表面に付着する。
【0052】
次いで、図1Bおよび5Bに示されるように、基板位置決め手段50は、基板45をレザバ15の上に再配置して、このレザバからの液滴を第2の指定された部位で受け取る。図1Bおよび5Bはまた、排出器33が、排出器位置決め手段43によってレザバ15の下に、音響連結媒体41によってこのレザバ15と音響的に連結した関係で、再配置されていることを示す。一旦、図1Bおよび5Bに示されるように、適切に整列されると、排出器33の音響放射発生器35は、音響放射を生成するように作動され、この音響放射は次いで、集束手段37によって、流体表面19付近の流体16内の焦点に方向付けられ、それにより液滴53がこの基板に向かって排出される。このような操作は、用いられるデバイスをどのように使用して、流体液滴に含まれる複数の単一の細胞をレザバから排出し、細胞のパターン(例えば、アレイ)を基板表面51上に形成し得るかの例示であることが明白でなければならない。同様に、このデバイスが、1つ以上のレザバから排出される流体液滴に含まれる複数の個々の細胞を、基板表面の同じ部位に排出するように適合され得ることも明白でなければならない。
【0053】
別の実施形態では、デバイスがウェルプレート間の流体滴に含まれる細胞の移送を可能にするように構成され、この場合、基板は、基板ウェルプレートを含み、流体懸濁した細胞含有レザバは、レザバのウェルプレートにおける個々のウェルである。図2は、このようなデバイスを示し、レザバウェルプレート12における4つの個々のウェル13、15、73、および75は、単一の細胞を含有する小滴の排出のための流体中で懸濁される、複数の特定の型の細胞または異なる細胞型の混合物を含むための流体レザバとして役立ち、そしてこの基板は、55、56、57、および58で示された4つの個々のウェルのより小さなウェルプレート45を含む。図2Aは、細胞容器またはレザバウェルプレートおよび基板ウェルプレートを上面図で示す。示されるように、各ウェルプレートは、ツーバイツーアレイに配置された4つのウェルを含む。図2Bは、使用されるデバイスを示し、細胞容器またはレザバウェルプレートおよび基板ウェルプレートがウェル13、15および55、57それぞれに沿った断面図で示される。図1および5に示されるように、レザバウェル13および15のそれぞれは、17および19でそれぞれ示されたキャリア流体表面を有するキャリア流体14および16中で懸濁された細胞を含む。細胞容器またはレザバウェルプレートのウェルの材料および設計は、図1および5に示された容器のものと同様である。例えば、図2B(ウェル)および図5B(チャネル)に示された細胞容器またはレザバは、実質的に音響的に区別不可能であるように実質的に同一の構成である。これらの実施形態において、細胞レザバのベースは、このベースを通って、含まれるキャリア流体に音響放射を効率的に伝達し得るような物質(例えば、適切な音響インピーダンスを有する物質)および厚さである。
【0054】
図2および5のデバイスはまた、音響発生手段35および集束手段37を含む、図1に示された排出器と同様の構成を有する音響排出器33を含む。図2Bは、間接的な接触を介してレザバウェルに音響的に接続された排出器を示し;すなわち、音響連結媒体41は、排出器33とレザバウェルプレート12との間(すなわち、音響集束手段37の曲がった表面39と第1の細胞容器またはレザバ(ウェルまたはチャネル)13のベース25との間)に配置される。示されたように、第1の細胞容器またはレザバ(ウェルまたはチャネル)13は、音響集束手段37に音響的に連結され、その結果、ほぼ上方向に生成された音響放射は、集束手段37によって音響連結媒体41に向けられ、次いで、音響放射を細胞容器またはレザバ(ウェルまたはチャネル)13に伝達する。
【0055】
動作時では、細胞容器またはレザバ(ウェルまたはチャネル)の各々は、好ましくは、キャリア流体内で懸濁された異なる型の細胞または細胞の混合物を有するキャリア流体で充填される。示されるように、デバイスのレザバウェル13および15は、図1のように、第1の細胞混合物14を有するキャリア流体および第2の細胞混合物16を有するキャリア流体で各々充填されて、流体表面17および19をそれぞれ形成する。図1および5は、排出器33が、音響連結媒体41を介してレザバウェルとの音響連結を達成するために、排出器33が排出器位置決め手段43によってレザバウェル13の下に位置決めされることを示す。
【0056】
細胞容器から個々の細胞をウェルプレートに排出するために、図2Aは、基板ウェルプレート45の第1基板ウェル55を、第1の細胞容器またはレザバ(ウェルまたはチャネル)から排出された液滴を受容するために、第1レザバウェル13の上に位置決めされることを示す。
【0057】
一旦、排出器、細胞容器またはレザバ(ウェルまたはチャネル)、ならびに基板が適切に位置調整されると、音響放射発生器は、流体表面17近くの焦点47に音波を向けるための集束手段によって集束された音波(エネルギーの量は、流体を排出するには不十分である)を生成させるために起動する。集束された音響エネルギーの第1放出は、音響エネルギーの反射(細胞とキャリア流体との間の音響インピーダンスの違いに起因する反射)による排出のために、表面に十分近い細胞の存在の音響検出を可能にする。音響検出によって細胞の位置を決定するための手段は、超音波顕微鏡および関連分野の当業者によって容易に理解される。細胞を検出および局在的な後、他の特性が、排出するための決定がなされる前に測定され得る。また、どの細胞も排出するために表面の十分近くに存在しない場合、この音響エネルギーは、細胞が局在化され、そして集束された音響エネルギーまたは他の手段によって表面のより近くまで駆動されるまで、この流体表面から次第により離れた距離で集束され得る。例えば、均一な場(field)を使用して、この細胞を表面のより近くまで移動させ得る。このような1つの場は、フォトン場であり、この場は、キャリア媒体および細胞の屈折率の違いによって決定される、断面積およびフォトンモーメントの変化に基づく力を及ぼす。細胞を移動させるために使用され得る別のこのような場は、電場であり、これは、正味の表面電荷に基づく力を及ぼす。細胞または密度勾配を含む流体に対して低い密度を有するキャリア流体がまた、排出に関して細胞を配置するために使用され得る。流体表面から細胞の短い平均距離に影響を及ぼす種々の方法が存在することが理解される。チャネル(特に、微小構築されたチャネル)について、機械的な手段または流体手段を使用して、このチャネルを横切るランプ様構造を配置することにより、流体表面から十分に近い距離をもたらし得、ランプを横切るチャネルの深さを、細胞の直径のオーダーの深さまで減少させ、これにより、細胞が表面近くを流れることのみを可能にし;図5Dに示されるように、チャネルの深さが最も浅い場所で、流体速度は最も速いので、細胞は、このランプで詰め込まれないようである。図5Eは、細胞に作用する力によって、細胞を表面の方に移動させる、微小流体チャネルを示す。
【0058】
微小流体チャネルは、細胞が配置され得る体積を減少させる小さな寸法で構築され得るので、この微小流体チャネルは、排出に適切な細胞の配置が非常に単純化される場合、音響排出と共に使用するのに特に好ましい。例えば、比較的均一な寸法を有する細胞型または細胞型の混合物(例えば、平均直径10.0μm、SD.約0.5μm)に対して、チャネルが、約12.0μmの幅となるように操作され、流体表面(排出体積4/3πr3=0.52pL)から約1.0μmの平均距離で細胞の単一ファイルを作製し得る。このような場合、この流体表面と細胞の位置との間の距離を短くするために、ランプ(図5D)または任意の他の手段を提供することは、必ずしも必要ではない。チャネルの深さは、そのチャネル中の所望の流体流れについて適切であるような深さであるが、このチャネルは、好ましくは、排出のために表面に十分近い位置に細胞を指向するための手段を備えている(例えば、チャネルの深さは、細胞直径の10倍以下である)。特定の例では、40μmの深さのチャネル様構造(各々が、細胞を表面に指向するランプ(約25μmのランプの高さ)を有する)を使用する。細胞が、流体流れ軸に沿って、一定の制限された距離範囲でチャネルから排出され得、スキャンされる流体表面の領域を減少させる。例えば、細胞を排出するための50μmの開口が、閉口したキャピラリーに提供され得るか、または開口キャピラリーの流れ軸に沿った制限された距離が、排出のために使用され得、細胞が排出器を通過して移動し、細胞のためにスキャンされる領域を減少させることが有意な利点である。このような方法を、ペトリ皿のような微小スケールの容器内で細胞を浮遊させるために使用する場合でさえ、有意な時間量が、排出するために細胞を配置するための流体表面に対して平行なプレートをスキャンして浪費され得る。微小流体チャネルを使用する利点は、広範な範囲の細胞サイズ(例えば、前述の細胞型(平均直径10.0μm、SD.約0.5μm)と混合された赤血球(RBC、平均直径7μm、SD.約0.3μm、両凹面ディスク、高さ約0.3μm))をわずかに減少させる。RBCは、流体排出体積に対して表面から有意な深さであり得、これによって、有意なエネルギーがRBCを排出するために必要とされるが、この状態は、細胞を流体表面の方に集束する記載の方法によって克服され得る。ペトリ皿の数cmの幅と対照的に、側方サーチを約12μmの幅まで制限する利点は、即座に明確である。
【0059】
表面に有意に近接する細胞が配置され、そして排出のための任意の他の判断基準に合うように決定されると、この音響放射発生器が起動され、流体表面17の近くの集束点47の方に集束手段によって集束される音波を生成し、このエネルギー量は、排出される細胞の体積に実質的に対応する流体の体積を排出するのに十分であるので、その結果、任意の排出された体積は、1個より多くの細胞を含まない。必要とされる体積以下のみを排出するために必要とされる正確な量のエネルギーは、適用されるエネルギーを排出に所望される細胞を排出するには不十分な量から標的される基板の位置に対して所望される距離で細胞に排出するために適用されたまさに十分なエネルギーが存在するまで、次第に増加させることによって最初に較正し得る。この最初の較正後、流体レベルの任意の変化に対して調節したほぼ同じエネルギーが、最初の較正細胞と実質的に同じ体積の細胞を排出するために適用され得る。結果として、液滴49(単一の生存細胞を含む)は、流体表面17から、基板ウェルプレート45の第1の基板ウェル55に排出される。細胞含有小滴は、表面張力によって基板のウェルプレート上に保持される。
【0060】
次いで、図2Cに示されるように、基板ウェルプレート45を、基板位置決め手段50によって、基板ウェル57が、それから細胞含有液滴を受けるために、細胞容器またはレザバ(ウェルまたはチャネル)15上に直接位置決めされるように再配置する。図2Cはまた、排出器33が、音響連結媒体41により排出器および容器を音響的に連結するために、細胞容器ウェル15の下に排出器位置決め手段により再配置されることを示す。平面上基板上の基板ウェルプレートおよびレザバウェルプレートまたはチャンネルは異なるサイズであるので、排出器位置決め手段の動きと基板ウェルプレートの動きとの間には、同一でない対応のみが存在する。図2Cに示されように、一旦適正に整列されると、排出器33の音響照射発生器35は作動されて、次いで、集束手段37により、流体表面19近傍の焦点に向けられる音波を生成し;この波は、排出されるキャリア流体表面に十分近接している細胞の存在を検出するために用いられる。このような細胞が検出され、そして排出のための規準として用いられる任意の性質が測定された後、排出器33の音響照射発生器35は作動され、次いで集束手段37によって、流体表面19近傍の焦点に向けられる音波を生成し、そこから、細胞含有液滴53が基板ウェルプレートの第2のウェル上に排出される。このような操作は、1つのウェルプレートから異なるサイズの別のウェルプレートに、適切なサイズの液滴に含まれる複数の単一細胞を移入するために、採用されたデバイスが、どのように用いられ得るかの例示であることを明確にすべきである。当業者は、この型の移入が、細胞、キャリア流体、および排出器および基板の両方が連続運動するときでさえ実施され得ることを認識する。レザバ、ウェルプレート、および/または基板の種々の組合せが、単一細胞を含む液滴を移入するための採用されたデバイスで用いられ得ることをさらに明確にすべきである。細胞を含有する流体液滴のさらなる移入のため(例えば、細胞アレイ配置のため)にレザバの位置決めの前に、任意のレザバが、流体キャリアで、または懸濁された細胞を含む流体キャリアで、それぞれ、細胞不含流体液滴または細胞含有流体液滴の音響排出により充填され得ることもなおさらに明確にすべきである。
【0061】
上記のように、個々の(例えば移動可能な)レザバ(ウェルまたはチャンネル)またはプレート(ウェルまたはチャンネル)を用い、排出のためにキャリア流体中に細胞懸濁物を含み得;レザバまたはウェルプレートのウェルは、好ましくは、互いから、音響的には実質的に区別不能である。また、排出器が流体中に隠れることが意図されなければ、レザバまたはウェルプレートは、排出されるべき流体の表面に運搬される排出器からの音響照射を可能にするに十分な音響的伝達性質を有さなければならない。代表的には、これは、キャリア流体に対して適切な音響的インピーダンスを有するレザバまたはウェルベースを提供することを含み、そしてこれらは、作製される材料の音響的インピーダンスに対して十分に薄く、受容されない消散または反射をなくしてそれを通って伝わる音響照射を可能にする。さらに、レザバの構築に用いられる材料は、含まれるキャリア流体と適合しなければならず、そして懸濁された細胞に非毒性でなければならない。
【0062】
従って、レザバまたはウェルは、水性キャリア中に懸濁される生存細胞を含むことが意図されるので、水中に溶解もしくは膨潤する、または生存細胞に毒性の化合物を水性キャリア中に放出する材料から作製されるレザバは、本発明に使用されるレザバ、基板、またはウェルプレートの形成における使用に不適切である。水ベースの流体には、多くの材料がレザバの構築に適切であり;これらとしては、組織培養もしくは細胞培養のための材料、生体材料、モノ結晶性シリコンもしくはポリ結晶性シリコン、酸化ケイ素および酸化アルミニウムのようなセラミック、ステンレス鋼および白金のような金属、およびポリエステルおよびポリテトラフルオロエチレンのようなポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。これらの材料は、細胞に毒性の物質が細胞に対しキャリア流体毒性を与えるに十分な量でキャリア流体中の漏出しないように調製され得、その結果、これらの表面特性は、意図された使用に適切である。例えば、細胞が排出される容器またはレザバは、容器材料の固い壁または床に対する接着を回避するように、表面が官能化され得る。
【0063】
採用されるデバイスとの使用に適切な多くのウェルプレートが市販されており、そして、例えば、ウェルプレートあたり96,384または1536ウェルを含み得る。採用されたデバイスにおける使用のために適切なウェルプレートの製造は、Corning Inc.(Corning,New York)およびGreiner America,Inc.(Lake Mary,Florida)を含む。しかし、このような市販のウェルプレートの利用可能性は、少なくとも約10,000ウェル、または100,000ウェル程度またはそれ以上を含むカスタムメイドのウェルプレートの製造および使用を排除するものではない。アレイを形成する適用には、約100,000〜約4,000,000のレザバを採用し得ることが予期される。さらに、排出器を各レザバまたはレザバウェルと整列するために必要な動きの量を低減するために、各レザバの中心は、任意の他のレザバ中心から、約1cmより大きくなく、好ましくは約1mmより大きくなく、そして最適には、約0.5mmより大きくなく位置決めされることが好ましい。
【0064】
一般に、デバイスは、実質的に任意の型および所望される量の流体を排出するように適合され得る。排出された流体は水性および/または非水性であり得るが、水性流体のみが生細胞の移入に適合する。水性流体の例は、水それ自身、水溶媒和イオンおよび非イオン溶液、ゲル、固体の懸濁液またはスラリー、および分離した細胞を含む水液体を含む。本発明の技法を用いて可能である正確さに起因して、デバイスを用いて、約100ナノリットルより多くない流体、好ましくは約10ナノリットルより多くない流体を含むように適合されたレザバからの液滴を排出し得る。特定の場合には、排出器は、約1〜約100ナノリットルの流体を含むように適合されたレザバから液滴を排出するように適合され得る。これは、排出される流体が希少または高価な生体分子または細胞を含むとき特に有用であり、この場合、約1ピコリットルまでの容量を有する液滴を排出することが所望され得る。
【0065】
上記の記載から、デバイスの種々の部材が、基板上の細胞のアレイを形成するために個々の制御または同調化を必要とし得ることが明らかである。例えば、排出器位置決め手段は、基板表面上に調製されるアレイと関連した予め決定されたシークエンスで、各細胞容器またはレザバから液滴を排出するように適合されている。同様に、排出器に対して基板表面を位置決めする、基板位置決め決め手段は、液滴をその上のパターンまたはアレイ中に受けるために基板表面を配置するように適合され得る。両方または片方の位置決め手段、すなわち、排出器位置決め手段および基板位置決め手段は、例えば、レバー、プーリー、ギア、リニアモーター、それらの組合せ、またはその他の当業者に公知の機械的手段から構築され得る。基板の動きと、排出器の動きと、および適切なパターン形成を確実にする排出器の活性化との間の対応があることを確実にすることが好ましい。
【0066】
さらに、デバイスは、性能を向上するその他の部材を備え得る。例えば、上記で暗示するように、このデバイスはさらに、サンプルの安定性を確実にするために温度を調節する手段を備え得る。温度調節の1つの例は、例えば、基板表面の温度を低下させて、排出された液滴が基板に接着することおよび細胞の生存性を維持するために急速に冷凍することを、確実にすることである。冷却手段は、基板表面を、細胞含有流体液滴がそれと接触した後、流体が部分的、または好ましくは完全に、すぐに凍結することを可能にする温度に維持するよう適合され得る。細胞を含む水性流体液滴の場合には、この温度調節手段は、基板表面を、細胞の型および実行されるアッセイの目的に依存して、広い範囲内(例えば、−80℃と80との間)で維持する能力を有し得る。
【0067】
さらに、音響エネルギーの流体のレザバへの繰り返し付与は、流体の加熱を生じ得る。加熱は、勿論、生細胞に対し所望されない影響を生じる。従って、デバイスは、細胞容器またはレザバ内の流体を一定の温度に維持するための手段をさらに備え得る。このような温度維持手段の設計および構成は当業者に公知であり、そして、例えば、加熱エレメント、冷却エレメント、熱電対のような温度検出手段、またはそれらの組合せのような部材を備え得る。生体分子および生細胞配置適用には、一般に、生体分子または細胞を含む流体を、約1℃または2℃より大きくない偏差で一定温度に保つことが所望される。さらに、流体は、生細胞には、冷却されなけば生存率が低いことが知られる特別の細胞型を除き、原核生物または真核生物であるか否かにかかわらず、温血生物の場合、細胞が由来する通常温度を約1℃を超えず、そしてその他すべての生物について16℃と37℃との間の温度に維持されることが好ましい。生存に冷却を必要とする細胞は、約1℃±約1℃で適切な浸透圧(わずかに高浸透圧)の生理食塩水キャリア流体を必要とすることが、細胞を培養および維持する当業者によって認識される。従って、例えば、生体分子含有流体が水性であるとき、排出の間に流体を約−1℃±約0.5℃に保つことが最適であり得る。
【0068】
本発明は、音響排出細胞含有液滴を受ける前の、基板表面の修飾を含み得る。表面修飾は、官能化または脱官能化、平滑化または粗面化、コーティング、分解、不動態化、または表面の化学的組成または物理的性質のその他の改変を含み得る。1つの実施形態では、本発明は、外部に表示されるマーカー部分と同族である部分での官能化を必要とするが、記載のその他の表面修飾が、特定の状況における本発明の成功に影響し得る。
【0069】
1つのこのような表面修飾方法は、表面のぬれ特性を変更することを含む。このような方法は、例えば、指定領域内の表面上に排出された液滴中に含まれる細胞の閉じ込めを容易にするため、または基板もしくは特定の基板位置を官能化(例えば、ビオチン化溶液の音響排出により達成されるパターン化されたビオチン化)するために用いられる分子部分の表面結合を増強するために用いられ得る。基板表面のぬれ特性を変更するための好ましい方法は、流体の音響排出前に基板表面の各指定部位に、適切な表面修飾流体の液滴を堆積して、そこにアレイを形成することを含む。このようにして、音響的に排出された液滴および含まれる細胞の「広がり」は最適化され得、そしてスポットの大きさ(すなわち、直径、高さおよび全体的な形状)における一貫性が確実にされ得る。この方法を実施する1つの方法は、排出器を、表面修飾流体を含むモディファイアレザバに音響的に連結し、次いで上記に詳細に記載されるように、この排出器を作動させて、表面修飾流体の液滴を生成し、そしてこれを、基板表面の指定部位に向かって排出することを含む。この方法は、所望により、表面修飾流体をさらなる指定部位に堆積させるために繰返される。生体分子(特に、形質転換細胞または非形質転換細胞の表面に提示されたマーカー部分に特異的に結合する、同族部分)のアレイを生成する他の方法もまた使用され得る。例えば、単一の同族部分(例えば、ビオチン)は、均一に、またはあるパターン(例えば、非ビオチン化領域によって取り囲まれたビオチン化領域のパターン)で、基板表面に連結され得る。パターン化されるべき細胞を形質転換して、その表面にストレプトアビジンを提示し得る。
【0070】
図3は、単純化した断面図において、図1に図示したデバイスと類似であるが、異なる型の細胞を含み得るか、または流体表面61を有する表面修飾流体(流体60)を含み得る、さらなるレザバ59を備えるデバイスを用いて、2つの細胞が基板上の異なる部位に堆積される、上記の方法の特定の実施形態を模式的に図示す。図3Aは、表面修飾流体または細胞を含有するキャリア流体60の液滴63(ここでは、表面修飾流体よりむしろ細胞を含むことが示される)の排出を図示する。所望される場合、表面モディファイアは、種々の目的のために用いられ得る;例えば、表面モディファイアは、基板45(ここに細胞が堆積される)の表面51上の指定された部位のぬれ特性を変更するように選択され得る。排出器33は、音響連結媒体41を介してモディファイアレザバ59との音響連結を達成するために、排出器位置決め手段43によってモディファイアレザバ59の下に配置される。基板45は、指定部位での表面修飾流体60の液滴の音響堆積を可能にする位置で、モディファイアレザバ19の上に配置される。一旦、排出器33、モディファイアレザバ59および基板45が適切に整列されたら、音響放射発生器35を作動させて、流体表面61からの表面修飾流体60の液滴63の、基板の下側表面51の指定部位への排出を可能にする様式で集束手段37によって方向付けされる、音響放射を生じる。一旦、液滴63が基板表面51と接触したら、この液滴は、基板表面の領域を修飾して、堆積した流体に関するこの領域の表面エネルギーの増大または減少を生じる。
【0071】
次に、図3Bに示すように、基板45は、液滴63によって修飾された基板表面領域が、レザバ13上に直接的に位置するように、基板位置決め手段50によって再配置される。図3Bはまた、排出器33が、排出器位置決め手段によってレザバ13の下に、音響連結媒体41を介して排出器とレザバとが音響連結するように配置されることを示す。一旦、適切に整列されると、排出器33は、液滴49を基板上に排出するように再度作動される。液滴49は、単一の細胞65(好ましくは、その細胞外膜上に、この表面に連結した同族部分によって特異的に結合されるマーカー部分を提示して、この表面への特異的結合をもたらす)を含む。マーカー部分は、非形質転換細胞において生じ得るか、または形質転換もしくは遺伝子操作の結果であり得、そして必要に応じて形質転換を示し得、その結果、マーカー以外の遺伝子が発現される(例えば、このマーカーは、別の遺伝子による形質転換のレポーターである)。
【0072】
図3Cに示すように、基板45は、再度、第一の単一の細胞65が結合した部位とは異なる部位が、液滴に含まれる細胞を受けるためにレザバ15上に直接位置するように、基板位置決め手段50によって再配置される。図3Bはまた、排出器33が、排出器位置決め手段によって、レザバ15の下に、排出器とレザバとが音響連結媒体41を通して音響的に連結するように配置されることを示す。一旦、適切に整列されたら、排出器33は、液滴53が基板上に排出されるように再度作動される。液滴53は、第二の単一の細胞を含む。
【0073】
同族部分は通常、オリゴヌクレオチドおよびペプチドを含む、リガンドである。マーカー部分は、ペプチドまたはペプチドグリカンであるようである。基板に結合したオリゴヌクレオチドを合成する際に用いられる化学は、音響流体液滴排出に適応され得る。これらの方法は、本発明での使用のための基板表面上にオリゴヌクレオチドのアレイを作製するために用いられ得る。このような適応は一般的に、核酸化学の当業者に公知であり、そして/または適切な文献および教科書に記載される、現在の従来技術を含む。例えば、DNA Microarrays:A Practical Approach,M.Schena編(Oxford University Press,1999)を参照のこと。すなわち、個々の連結反応は、オリゴヌクレオチドの合成のために用いられ、そして自動化オリゴヌクレオチド合成機で従来用いられる、標準的な条件下で実施される。このような方法論は、例えば、D.M.Matteuciら(1980)Tet.Lett.521:719、Caruthersらに対する米国特許第4,500,707号、ならびにSouthernらに対する米国特許第5,436,327号および同第5,700,637号に記載される。集束させた音響エネルギーもまた、インサイチュでの、コンビナトリアルオリゴヌクレオチド合成、オリゴペプチド合成、およびオリゴ糖合成に適応され得る;これらの合成を用いて、本発明で使用するためのコンビナトリアルアレイを生成し得る。
【0074】
あるいは、オリゴマーは、基板表面への結合の前に合成され得、次いで、本発明の方法論を用いてこの表面の特定の位置に「スポッティング(spot)」され得る。さらに、このオリゴマーは、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、オリゴ糖、または任意の他の生体分子(もしくは非生体分子)オリゴマー部分であり得る。
【0075】
本発明での使用のためのこれらの音響排出方法は、現行のアレイ調製技術(例えば、写真平版プロセス、圧電技術(例えば、インクジェット印刷技術を用いる)およびマイクロスポッティング)を用いて可能であるよりも実質的により高い密度を有する、分子アレイ(特に、生体分子のアレイ)の調製を可能にする。本発明のデバイスおよび方法を用いて達成され得るアレイ密度は、基板表面1平方センチメートルあたり少なくとも約1,000,000生体分子であり、好ましくは基板表面1平方センチメートルあたり少なくとも約1,500,000である。生体分子部分は、例えば、ペプチド性分子および/またはオリゴヌクレオチドであり得る。このような密度は、一般に、他の細胞からある距離で隔てられている、個々の細胞を含む部位を作製するために必要ではない。しかし、例えば、マーカー部分に特異的に結合する同族部分を用いて、部位表面の別個の部分を官能化するためのこのような方法の適応は、細胞をその部位内に局在させるために、または細胞を互いに極めて近接するように故意に配置するために有用であり得る。例えば、リンパ球アレイ(小さな直径の細胞(8μm)、中程度の直径の細胞(12μm)、大きな直径の細胞(14μm)からなる)は、適切な同族部分を用いて、各100μm×100μm部位の中心において直径10μmのスポットを官能化して、スポッティングした細胞を特異的に結合させることによって作製され得る。この配置は、例えば、個々の細胞の試験またはスクリーニングを可能にするのに十分な細胞分離を確実にする。この試験は、例えば、隣接部位の細胞を流体に曝露することなく、細胞を曝露または処理するに充分な容量の音響的に堆積された試薬含有流体の液滴により行われ得る。このような方法は、例えば、細胞のコンビナトリアルスクリーニングを可能にする。
【0076】
次いで、本発明の多くの改変が可能であることが明確であるべきである。例えば、排出された液滴の各々は、単離された「最終的な」特徴として堆積され得る。あるいは、またはさらに、排出された複数の液滴(各々、1つまたは複数の細胞を含む)は、各部位が、確認し得る数の複数の細胞を含む細胞アレイを合成するために、基板表面の同じ位置に堆積され得る。この方法を用いて、細胞を、他の目的のため(例えば、特定の組織学的構造物の複製に基づいて組織を操作するため)にパターン化し得る。細胞アレイおよび基質表面への細胞の結合を含むパターン形成製造技術に関して、洗浄工程は、液滴排出工程の間で用いられ得ると考えられる。このような洗浄工程は、例えば、細胞が堆積された基板表面全体を、洗浄流体中に浸漬することを含み得る。
【0077】
本発明は、同じレザバから、少なくとも約1,000,000滴/分の速度で、および異なるレザバから、少なくとも約100,000滴/分の速度で、液滴の排出を可能にする。さらに、現在の位置決め技術は、1つの細胞容器またはレザバから別の容器またはレザバへ、迅速かつ制御された様式で移動させるための排出器位置決め手段を可能にし、それによって、異なる流体の迅速かつ制御された排出を可能にする。つまり、現在市販の技術は、各レザバでの繰り返し可能でかつ制御された音響連結を伴って、高性能位置決め手段について約0.1秒未満、そして通常の位置決め手段について約1秒未満で、1つのレザバから別のレザバへ、排出器を移動させることを可能にする。カスタム設計されたシステムは、繰り返し可能でかつ制御された音響連結を用いて、約0.001秒未満で、1つのレザバから別のレザバへと排出器を移動させることを可能にする。
【0078】
カスタム設計されたシステムを提供するために、以下の2種の基本運動が存在することを留意することが重要である:パルス(運動)および連続(運動)。パルス運動は、排出器をある位置に移動させ、音響エネルギーを放出し、そして排出器を次の位置に移動させる、別々の工程を含み;また、このような方法と共に高性能位置決め手段を使用することによって、0.1秒未満での、各レザバにおける繰り返し可能でかつ制御された音響連結を可能にする。これに対して、連続運動設計は、排出器およびレザバを連続的に移動させ(同じ速度ではないが)、そしてこれらの移動が生じている間に排出を提供する。パルス幅は非常に短いので、この型のプロセスは、レザバの移動が、10Hzよりも高い、そしてさらには1000Hzよりも高い速度で生じるのを可能にする。
【0079】
流体排出の正確性を保証するために、排出器に対する、液滴が排出される流体表面の位置および方向を決定することが重要である。さもなければ、排出される液滴は、不適当な大きさにされ得るか、または不適当な軌道で移動し得る。従って、本発明の別の実施形態は、排出事象間のレザバ中の流体表面の高さおよび細胞の近位性を決定するための方法に関する。この方法は、音響放射発生器へ流体含有レザバを音響的に連結する工程、および、次いで、その発生器を起動して、検出音波を生成する工程を包含し、この音波は、流体表面へ移動し、そして反射音波として流体表面から反射される。次いで、反射された音響放射のパラメーターを、音響放射発生器と流体表面との間の空間的関係を評価するために分析する。このような分析は、音響放射発生器と流体表面との間の距離および/または音響放射発生器と関連付けた流体表面の方向の決定を含む。
【0080】
より詳細には、音響放射発生器は、流体表面から液滴を排出するのに不十分なエネルギーである、低エネルギーの音響放射を発生するように、起動され得る。これは、代表的には、液滴排出に通常必要とされるパルス(マイクロ秒オーダーでの)と比較して、極めて短いパルス(数十ナノ秒のオーダーでの)を使用して行われる。音響放射が流体表面によって反射され、音響放射発生器に戻るのに要する時間を決定し、次いで、その時間を流体中の音の速度と相関させることによって、距離(および従って、流体の高さ)が計算され得る。表面下の細胞の存在および深さは、同じ様式で決定され得る。もちろん、レザバの基部と流体との間の界面によって反射される音響放射が考慮されることを保証するように注意を払わなければならない。当業者は、このような方法が、従来のソナー技術または改良されたソナー技術を使用することを認識する。
【0081】
一旦、分析が行われると、流体の少なくとも1個の液滴を排出するために、流体表面付近の細胞中心に近い焦点を有する排出音波が生成され、ここで、排出音波の最適な強度および方向が、前述の分析を使用して、必要に応じて、さらなるデータと組み合わせて、決定される。「最適」な強度および方向は、一般に、一貫したサイズおよび速度の液滴を生成するように選択される。例えば、排出音波の所望の強度および方向は、上記で評価した空間的関係のみならず、以下を使用して決定され得る:レザバに関連する幾何学的データ、排出される流体に関連する流体特性データ、細胞の寸法および結果として得られる細胞体積、および/または排出順序に関連する細胞含有液滴排出のヒストリカルデータ。さらに、これらのデータは、所望の場合、排出音波の焦点が流体表面付近にあることを保証するために、流体表面に対して音響放射発生器を再位置決めする必要性を示し得る。例えば、この排出音波が流体表面付近に焦点合わせされ得ないように、音響放射発生器が位置決めされていることを分析が示す場合、音響放射発生器は、垂直方向運動、水平方向運動および/または回転運動を使用して再位置決めされ、排出音波の適切な焦点合わせを可能にする。
【0082】
本発明の1つの局面は、単一の細胞の排出であるので、本発明の選択的特性は、即座に理解される。単純な排出を使用することによって、最も小さい細胞の排出で開始して、十分に異なるサイズの細胞が分離され得る。従って、デバイスは、アレイを作製するためのその使用に加えて、1つの型のセルソーターとして使用され得る。例えば、単球(直径20μm)は、小さいリンパ球(直径8μm)ならびに中程度および大きいリンパ球(直径12〜14μm)の両方よりもはるかに大きいので(単球の細胞体積は、大きいリンパ球よりも約3倍大きく、小さいリンパ球よりも約16倍大きいことに対応する)、これらの細胞の混合物は、アレイ化またはソーティングのために選択的に排出され得る。小さいリンパ球を排出するのに十分な最小の音響エネルギーレベルは、大きいリンパ球および単球を排出するのに不十分である。
【0083】
一旦、全ての小さいリンパ球が排出されると、大きいリンパ球は、より大きくかつ重い単球を排出する危険性をほとんど伴わずに、大きいリンパ球を排出するのに十分な最小の音響エネルギーレベル(中程度のリンパ球を排出するのに十分である)を使用して排出され得る。細胞の外側上で外部に提示されたマーカー部分に対する同族の部分での表面官能基化は、表面上への排出を必要とするが、別のレベルの選択性を提供する。最後に、本発明は、細胞の音響的な位置を提供し、細胞が、排出されるべき表面に十分に近いか否かを決定するので、種々の特性が、排出のさらなる基準として測定および使用され得る。細胞分類の当業者は、さらなる基準を用いるこのような排出が、排出された細胞を別の流体容器へ移すのに適切な軌道での排出によってか、または基板にスポットし、その後、容器内へ所望の細胞を洗い出すことによって、従来の細胞分類適用に適合され得ることを理解する。同様に、キャリア流体とは異なる音響インピーダンスを有する限局体積物(例えば、細胞)を分類するように適合された本発明は、粒子(例えば、ガラスまたはポリマービーズ)の分類に明らかに適合しており、これらの粒子としては、特定の部分を用いてタグ化された粒子、または、さもなければ、いくつかの特性の測定により評価され得る粒子が挙げられる。細胞、および音響インピーダンスの異なる他の限局体積物(例えば、固体またはゲル粒子)を分類する際に有用な特性としては、音響密度および音響サイズ(これらの両方は、公知の音響手段により測定され得る)が挙げられる。密度は、限局体積物とキャリア流体との間の界面により反射された音波を測定することにより得られる音響反射率から計算され得る。サイズおよび形状は、従来のソナー法により測定され得る。
【0084】
セルソーターとして具現化される本発明は、好ましくは、少なくとも1つのチャネル、好ましくは、1より多いチャネルを用いて構成され、このチャネルから、細胞が排出される。排出チャネルは、好ましくは、分類される細胞が単一のフィールドを通過することを可能にする。細胞は、他の型の容器(流体チャネルを含む)に、または仕切りを有さない基板(例えば、平面アレイ)上に排出され得る。この基板では、細胞が、互いについて十分な距離で付着して、各々の細胞について仮想の別々の容器を形成することにより、局在される;あるいは、この基板は、仮想の容器における細胞間の相互作用を可能にするために十分に接近して整列された、いくつかの細胞を有し得る。従来の容器(例えば、市販のウェルプレート上のウェルのアレイ)は、1つ以上の細胞の仮想の容器のアレイについての物理的容器としての役目を果たし得るか、または個別の細胞もしくは1つ以上の細胞型の複数の細胞についてのレセプタクルとしての役目を果たし得る。細胞の混合物(例えば、単球、Bリンパ球、およびTリンパ球)は、特定の実験について所望され得る。
【0085】
各排出チャネルについての複数の排出器は、特に、複数のチャネルの場合、スループットを増大させ得、そしてこの構成が好ましい。各排出器は、1つ以上の検出(sensing)手段または検出(detecting)手段と協調され得る。このような協調は、所定の排出チャネルと関連する1つまたは複数の排出器を個別に解放することによるように、手動で実施され得る。好ましくは、検出および排出の協調は、プロセッサを用いる集積システムにより達成される。このプロセッサは、検出された特性について予め選択されたパラメーターに基づく選択を行う。異なる排出チャネルは、異なるサイズの細胞集団について設計され得る。この細胞集団は、従来の手段(例えば、濃縮技術および限外濾過)を用いて、サイズにより分別され得る。各排出チャネルについての好ましい複数の排出器は、複数の標的(例えば、複数のウェルプレートもしくは同じプレート上の異なるウェル、または異なる容器(流体チャネルを含む))に対して細胞を排出し得る。
【0086】
選択的に排出された細胞を目的の場所に運ぶための標的チャネルが備えられる。少なくとも1つの領域の頂部で開口する排出チャネルから、同様に頂部で開口する、すぐ近くに位置する輸出管(efferent)または標的チャネル(または他の容器)への細胞の簡便な排出のために、音響排出手段または集束音響エネルギーの供給源は、排出された液滴に対して非垂直方向軌道(すなわち、流体表面に対して並行な速度成分を有する軌道)を与え得るべきである。このような非垂直排出速度は、排出チャネル中の流れに対して並行ではない場合、この排出チャネルから水平方向に間隔をあけられた容器(例えば、標的チャネル)へと、液滴を排出し得ることが容易に理解される。排出チャネルから細胞を受け取るためのこのような標的チャネルは、この排出チャネルと流体連絡していても、していなくてもよく;さらに、音響排出された細胞を受け取るための標的チャネルもまた、別の標的チャネルもしくは容器(細胞が本来排出されたチャネルを含む)に対する細胞の排出のための排出チャネルとしての役目を果たし得る。
【0087】
最大の分離効率および柔軟性のために、排出速度の水平方向の(または表面に平行な)成分は、(1)流体に対して垂直方向の細胞の排出、(2)この速度の唯一の非水平成分が排出チャネルの流れより与えられるような、この排出チャネルの流れに対して平行な細胞の排出、あるいは(3)このチャネル中の流体の流れの方向に並行ではない、種々の非垂直速度成分による細胞の排出、を可能にするように変更され得る。排出のこのような方向性(音響排出器自体の集束により制御可能である)は、例えば、単一の排出器による、中央の排出チャネルから、この排出チャネルのいずれかの側面に流れる2つの標的チャネルのいずれかへの排出を可能にする。各標的チャネルは、排出チャネルの流れに対して、実質的に並行または逆並行に流れる。最も好ましくは、このような調節可能な音響排出器は、細胞を排出するために、1つのチャネルから別のチャネルへ移動され得る。例えば、細胞が中央のチャネルからいずれか一方の側面のチャネルへ排出される、3つの平行なチャネル配置において、排出器は、好ましくは、いずれかの側方のチャネルに移動されて、細胞を、中央のチャネルに排出して戻し得るか、中央のチャネルから反対側の側方に間隔を空けたチャネルに排出し得るか、または側方のチャネルに十分に近い上記の3つのチャネル以外のチャネルに排出し得る。
【0088】
さらに、排出の間に、排出容器もしくは排出チャネルまたは標的容器もしくは標的チャネルの中の流体は、他の容器またはチャネル中の流体に対して絶対的または相対的のいずれかの、特定の方向の流れを必要としないか、または全く流れを必要としないことが容易に理解される。流体の流れの場合、標的チャネルは、排出器チャネルに対してループし得るか、排出器チャネルが標的チャネルに対してループし得る;あるいは、慣用的な微小組み立て方法(例えば、Chuらに対する米国特許第6,044,981号(これは、犠牲酸化物を用いて構築されたナノメータースケールの埋め込み型チャネルフィルターおよびシリコン材料の層化を用いる標準的な写真平版技術を教示する)を参照のこと)により簡便に組み立てられ得るように、標的チャネルまたは排出チャネルは互いに交差(cross over or under)し得る。
【0089】
臨床細胞分類適用のために、速度および高スループットが医学的な理由のために所望され得る場合、制限された分類が、頻繁に起こり得る。例えば、特定の特殊な細胞(例えば、未成熟な幹細胞)のみが、異質の同種異系移植片(または、恐らく異種移植片)の場合に、注入のために分離される必要がある。自己再注入のために、病的な細胞のみが取り出される必要がある。このような場合、複数の音響細胞排出手段「プレチャネル」を用いて、1チャネルあたりの細胞スループットを増加させる単一または複数の検出手段と協調するように、望ましくない細胞を所定のチャネルから連続して(sequentially or in series)排出し得る。この増加した1チャネルあたりのスループットは、さらに、同時排出のための複数のチャネルの組み合わせを用いることにより達成される。
【0090】
図7は、周辺チャネルの側方に、高速で、細胞を供給する中央流体チャネルを有するデバイスを示す。周辺チャネルから、好ましくは、複数の排出器の使用により、細胞が基板上に排出される。図7Aは、より大きな容器内の、細胞を含有する垂直チャネルの側面図を示す。垂直チャネルからの流体は、この垂直チャネルから側方に突き出た斜めのリップの下を通過することにより、より大きな容器の周辺部にのみ接近可能である。このリップとより大きな容器の底との間の距離は、放射状に外に向きに減少し、その結果、細胞は、中央チャネルから周辺部へと放射状に外に向きに通過し得る。周辺部で、垂直チャネル中での細胞の間隔に対して、細胞がさらに離れて間隔をあけ、そして細胞が水平面に移動する場所にチャネルが形成される。図7Aおよび図7Bは、容器の壁92のすぐ内側に位置する周辺チャネル89に達している、細胞を排出するための回転流体チャンバの外周に位置する、2つの排出器部位93および94の2つの集束音響要素を示す。収集デバイスまたは基板は示さない。複数の集束音響要素は、好ましくは、この外周に位置づけらる。この要素の各々は、好ましくは、少なくとも1つの細胞特性検出器(ここではD1およびD2)の前に置かれる。液体はまた、上記の斜めのリップ91から引き集められて、音響要素のフォーカルスポットの排出ゾーンへの粒子の流れをさらに誘導し、そして細胞が存在し得る水平方向の領域を減少させる。この構成は、大きな容量の流体を排出ゾーンへの掃引の利点、ならびに細胞分類のスループットおよび全体の効率の両方を増加する利点を有する。流体の全体の容量、および含まれる全ての細胞は、共通の中央チャネル90を通過した後、周辺チャネル89の途中の斜めのリップ91舌を通過する。周辺チャネル89に進入した過剰な流体は、音響排出(示さず)によってか、または分別される細胞に対して小さすぎて細胞が通過できない寸法を有する従来のミクロ流体チャネルによって取り除かれ得る;このようなチャネルは、慣用的な微小組み立て技術により容易に作製されることが理解される。
【0091】
1つのこのような分別ユニットにおける多重化検出器および多重化排出器に加えて、複数のこのようなユニットが、並行して同時に用いられて、スループットおよび効率を大幅に増大し得る。さらに、二者択一ではない排出判定器(non−binary ejection decision)が、このユニットの各排出器に作製され得、そしてさらなる柔軟性が、複雑な分離について連続でユニットを用いることにより得られ得る。連続で用いられるユニットは、複雑な分類手順に関する、逐次的に異なる平均細胞サイズまたは他の細胞パラメーターについて最適化され得る。
【0092】
好ましい方向付け可能な音響排出手段は、チャネルにおける流体の流れに全く同じ水平方向速度および反対の方向で液滴を排出することにより、流体運動にもかかわらず、液滴を垂直に排出するように調整され得る。この排出手段は、チャネルの流体の流れに並行な静止した基準系に対する任意の水平方向の速度があろうとなかろうと、このチャネル中の流体の流れに対して垂直の方向に、正味の水平方向の速度を有する液滴を排出するように容易に調整され得る。従って、例えば、細胞を含む液滴は、1つの方向付け可能な排出器から、排出チャネルの近くの2つのチャネルのうちの1つに排出され得るか、または排出器チャネル上に配置された基板表面上に排出され得る。この排出器は、二者択一ではない。なぜならば、4つの選択が存在するからである:排出しない、2つの可能なチャネルの各々に排出する、および基板表面に排出する。同様に、排出のための可能な標的としての固体基板がないとしても、排出しない、または2つの標的vチャネルの各々に排出するという選択は、単一の排出器での二者択一の選択スキームよりむしろ三者択一(ternary)選択スキームを提供する。
【0093】
種々の検出手段が、しばしば、いくつかの性質(例えば、強磁性または蛍光など)を付与される特異的抗体(Ab)のようなタグを使用して、慣用的に使用される。このようなタグ化された性質および内在性の性質(例えば、内在性の蛍光性質)は、細胞の特性(例えば、直径、細胞質の体積に対する核の体積の割合、そしていくつかの場合において、細胞質内および核内の状態)を決定するために使用され得る。例えば、アミノ酸トリプトファン(Trp)の内在性蛍光の測定は、特定のタンパク質からの、または、異なる条件下での同じタンパク質の、正味のスペクトルへの寄与を検出することによって、細胞の正体についての有用な情報を生じ得る。各トリプトファン分子は、分子の局所環境によって影響または移行される吸収スペクトルおよび発光スペクトルを有する。従って、あるプロテアーゼは、別のプロテアーゼと異なるスペクトルを有し、同一のプロテアーゼは、そのプロテアーゼ周辺の流体のpHが変化される場合、そのスペクトルにおける移行を受ける。従って、顆粒球の中でも、例えば、好中球または多形核細胞(PMN)(過剰の好中性の膜に囲まれた顆粒を伴う)は、それらの特性的に異なる顆粒を有する好酸球および好塩基球とは異なる正味の内在性Trp蛍光を提示する。同様に、クロマチンに高レベルの密度でパックされたヒストンを有する核は、内在性Trp蛍光によって細胞質とは識別可能である。細胞の外表面の蛍光タグ化は、細胞が検出器を通過するときの、その細胞の蛍光発光を測定することによって細胞のサイジングが可能であり、ここで、検出ウインドウを通る発光スペクトルの任意の成分の発光の持続時間は、流れに対して平行な断面の面積に比例する。このシグナルは、可能な限り最も長い持続時間のシグナルを得る場合(例えば、細胞中心を横断してかまたは最も長い横断距離に沿って得られる)、このシグナルは、細胞直径に比例する。この検出はまた、流れの方向と、検出器から細胞中心への軸の両方に対して直交する横断面における全ての位置からの発光の検出である場合、時間にわたって積算した蛍光の強度は、その提示された断面積に比例するシグナルを生じる。時間に対する時間の関数として測定される強度の微分(一定の速度の流れに対する距離に対応する)は、立方体の細胞よりも鋭くないシグナルを示すことが予測される球状細胞を用いて、いくつかの形状についての情報をもたらす。細胞成分の内在性の蛍光が測定される場合、発光持続時間は細胞直径に対して比例し、一方、時間にわたって積算した発光強度は、検出ウインドウを通過した全体積に対して比例し、時間に対して微分した強度は、形状についての情報をもたらす。
【0094】
多くの異なる性質またはパラメーターのうちの任意の1つが検出され得ることが容易に理解される。一般的に、検出される性質は、プロービングシグナルまたは励起シグナルを必要とする。例えば、最も分光的な方法(蛍光を含む)は、電磁波による励起から生じる、電磁的な発光または吸収の測定を使用する。音響または超音波型の検出は、界面(例えば、細胞表面とキャリア流体との間の界面、または核と細胞質との間の界面)での音響インピーダンスにおける差異の結果としてもたらされる、集束音響エネルギーのプロービングシグナルを必要とする。例えば、高密度でパックされ、そしてしっかりと保持される核の物質と、緩く、低い密度の細胞質との間の音響インピーダンスにおける差異は、核の音響検出ならびに核および細胞質の体積の決定を可能にすることが理解される。表面を蛍光でタグ化した細胞をサイジングする、現在の慣用的な方法の良い例は、Harrisらに対する米国特許第4,765,737号に記載され、これは、細胞の混合物において最も大きな細胞よりも大きな直径を有するレーザービームを使用し、光散乱および蛍光の両方が測定される。等価な情報が音響検出方法または超音波方法から誘導され得ることが容易に理解される。しかしながら、核および細胞質の体積を測定するための内在性の蛍光検出の適応性は、音響的な寸法測定から計算された値よりも、より信頼性の高い全細胞体積、細胞質体積および核体積の推定をもたらすことが理解される。さらに、先に考察したように、内在性蛍光は、例えば、形態学的に類似する顆粒球間を識別可能である。
【0095】
物理学的特性において検出される差異は、視覚的特性における差異として明示され得る。これらの視覚的特性は、肉眼、顕微鏡検査または 適切にプログラムされた画像処理装置を備えるビデオカメラによって検出可能であり得る。光学的特性における差異(例えば、伝達性、反射性、色、偏光など)は、測定され得る。
【0096】
検出される差異は、他の物理学的特性の差異(例えば、導電率、静電容量、インダクタンス、マイクロ波の透過性または磁気特性)であり得る。これらの差異は、細胞生存度に実質的に影響を与えない検出方法である限り、超音波または他の音響エネルギーの使用によって、あるいは分光的技術によって検出され得る。
【0097】
一旦、特定の性質によって分けられると、これらの細胞は、さらに分けられる。例えば、広範なサイズの分布を有する細胞の混合物は、3つのサイズのビンに分けられ得る:大、中および小。これらのサイズを揃えた集団(例えば、中程度のサイズに揃えた集団)は、さらに、3つのビンにサイズによって再び分けられ得る。一般的に、同一の性質における小さな差異の連続的な検出は、検出条件を変化させることによってもたらされ得る。例えば、迅速に移動する流体中で、超音波または音響画像を用いて、サイズにおける大きい差異により分けられた細胞の亜集団は、よりゆっくりと移動する流体において、さらにサイズによって分けられ得る。血球は、このように分類され得る細胞の1つの例示である。単球(直径約11〜20μmの球)、リンパ球(直径約8μm(小)、12μm(中)または14μm(大)の球)および赤血球(直径約7μm、高さ約3μmのドーナツ状円盤)の混合物は、約22μm幅の排出チャネルの使用を通して細胞型によって分類され得る。このチャネルは、全ての細胞を確実に浮遊させるための手段(例えば、細胞生存度に影響しない、適切な密度のキャリア流体、または排出部位からすぐ上流の排出チャネルにおける物理的なランプ様構造)を使用する。リンパ球および単球は、約15μmの幅を有するリンパ球用の標的チャネルおよび約22μmの幅を有する単球用の標的チャネルを用いて、適切なサイズのチャネルに排出される。いくつかの赤血球は、排出チャネルにおける排出の間に排出される細胞と並んで配置されるそれらの能力に起因して、リンパ球と共に排出され得、単球と共に排出される可能性は少ない。一旦、15μm幅に流されたリンパ球は、全体にわたって高スループットを維持するために適度に迅速であるよりゆっくりとした流速を用いて、再び音響的にサイジングされ得る。なぜなら、このリンパ球の亜集団は、単に細胞総数の一割に過ぎないからである。
【0098】
あるいは、混合物における異なる細胞は、所定の波長での励起を用いて、内在性の蛍光によって分けられ得、そして測定された体積あたりの発光が測定され得;最初に分けられたグループは、細胞の異なる性質をプローブし得る、異なる波長での発光を測定することによってさらに分けられる。
【0099】
前述は、連続的な多重化の型であり、ここでは、異なる性質が、最初に分けられた亜集団の全てかまたはいくつかについて測定され、この亜集団をさらに分ける。この方法はまた、選択が連続的に変化する性質(例えば、サイズ)の値に基づいてなされ得るので、アナログ分離に類似する。この方法は、任意の形態の連続的処理のような方法は、処理能力を増加するために平行して実行され得る。
【0100】
細胞の複雑な混合物のために、連続的多重化および平行多重化の両方は、好ましくは、複数の検出器と異なる型の検出器とを組み合わされる。例えば、複数の検出部位での内在性蛍光と組み合わせた音響検出が使用され得る。多くのパラメーターが、経時的に、音響反射と蛍光の両方を測定することから決定され得る。例えば、細胞および核の直径は、核の存在および核/細胞質/全細胞の体積は、音響および内在性蛍光データを統合することによって決定され得る(本明細書中に記載される目的のために、細胞質体積は、オルガネラ(例えば、マクロファージ内のミトコンドリアおよび顆粒球の顆粒)を含む体積を含むものとして解釈されるが、これらの体積は、厳密には細胞質ではなく、そしてより正確な用語は、核外体積(すなわち、全細胞体積−核体積)である)。種々の周波数で内在性蛍光を測定すること(例えば、血液の細胞型にわたる平均に対するTrp発光周波数強度最大値;有核血液細胞の核の同様の平均に対するTrp発光周波数強度最大値;PMNの発光周波数強度最大値に対応する周波数偏移)は、細胞質体積に対する核体積の比率のような幾何学的パラメーターによって識別することはできない顆粒球のような細胞の選択を可能にする。導入されたタグを無効にすることが通常所望され得るが、意図的に標識された細胞に関する選択方法もまた、本発明と共に使用され得る。
【0101】
図6は、中央チャネル、排出チャネル、細胞が流れる2つの検出デバイスD1およびD2、および大きな楕円形によって示される2つの排出部位の上面図(各々は、細胞の描写を含む)である。この放出部位から、細胞は、基板表面に対して垂直に排出され得るか(示さず)、または隣接する標的チャネル中に排出され得る。細胞の流れは、排出部位に到達する前に検出器を通過する。細胞は、流体表面に実質的に平行な平面(ここでは、水平面(その面に対する直角方向が垂直方向である))に対して垂直である速度成分のみを伴って、排出部位から排出され得る。垂直な排出の速度成分が、0ではない速度の成分である場合、排出軌道が流体表面に対して垂直であり(ここで、垂直)、先の図面で示したように、アレイ形成のために基板表面(ここでは、示さず)上の排出を可能にする。細胞を含有する液滴はまた、非垂直な速度成分で排出され得、点線によって示される軌道のような軌道を可能にする。
【0102】
中央または排出チャネル付近に示されるチャネルは、排出された細胞を受け取るための標的チャネルである。排出チャネルにおける排出部位の各側部で、共通の流体チャネルは、排出チャネルに到達するすぐ前に2つのチャネルに分けられ、そして、2つのチャネルに向って輪になり、これらは、短距離にわたり、排出チャネルにおける流体の流れに対して平行および逆平行に流れる。標的チャネルは、中央のチャネルに十分近く、細胞が、排出チャネルから任意に選択された標的チャネル(排出部位近くで排出チャネルに隣接する)へ排出されることを可能にする。この描写において構成されるように、排出部位の1つで、細胞は、排出されないことが選択され得るか、基板表面(基板表面上のアレイ部位のような)に垂直に排出されることが選択され得るか、または4つの排出部位のいずれかに選択的に排出され得る。それゆえ、各部位からの6つの可能な排出先(排出しないことを含む)が存在し、11個(9つのチャネルおよび2つの基板表面)までの異なる細胞亜集団を分類することが可能である。あるいは、このチャネルは、細胞または細胞亜集団の9つの異なる型に分類するために使用され得、そして基板表面上のアレイ部位(ウェルプレートのウェルのような)での、これらの細胞の垂直な排出は、分類される細胞の特徴付けのために同時に実行され得る。
【0103】
細胞選択の1つの共通な仕事は、コロニー採集に関する。ここで、アガー表面は、細菌細胞または他の微生物由来の細胞で「穿刺」される。代表的に、コロニー採集デバイスは、接種ループまたは接種針を含むロボットアームを駆使する光学システムを備える。光学システムは、目的のコロニーを配置させ、針をアガーに刺し、そしてさらに増殖させるための容器にコロニーを移動させる。これらのシステムは、時々、目的のコロニーを見つける能力があてにならない。
【0104】
これらのデバイスの針は、接種の間にリンスされ、滅菌されなければならない。リンスおよび滅菌の処理は、炭素堆積物および化学的残渣の堆積を導き、これらは、目的の生物のさらなる増殖を妨げ得る。機械的ロボットアームはまた、失敗する傾向があり、そして密接な間隔のコロニーを採集するために、または高密度アレイ中に細胞を送達するために、比較的不正確に配置しかねない。
【0105】
コロニーからの直接的な細胞の音響排出は、アガーまたは他の半固体、ゲルなどの上で増殖する任意の数の細菌コロニーからの、特定数の細胞を排出する優れた方法を提供する。高密度にパックしたコロニーは、音響エネルギーを正確および厳密に集束することが可能なので、近くのコロニーからの細胞による採集されたコロニーの汚染を伴わずに別個に採集され得る。
【0106】
コロニーの存在は、音響顕微鏡手段によって、例えば、コロニーを有する領域とコロニーを有さない領域との比較において、アガー表面で異なる音響インピーダンスを検出することにより検出され得る。無数の他の検出手段(標準的な光学顕微鏡法および内在性トリプトファンの蛍光の検出を含む)と交換可能であるか、または付加する能力は、すぐに明らかである。
【0107】
細胞は、ウェルプレートのウェル中または他の物理学的容器に排出され得る。あるいは、平面の基板(基板に細胞を接着させるための特徴的な手段を有するか、または有さない)が、使用され得る。容器またはウェルは、そこへ細胞を排出する前に、栄養培地(例えば、栄養アガー)を含み得るか、または栄養物が排出後に添加され得る。単位時間当たりに送達される音響エネルギーの出力を調節すること(排出が起こる表面に十分近い焦点に対して、そしてこの距離を一定に保持すること)およびその結果としての液滴の体積は、再生可能な様式において、所望される細胞数(標的の容器またはレセプタクルあたりの)の堆積が可能である。複数の別個のコロニーが、1つ以上の培養容器で検出可能な場合、細胞サンプルは、ウェルプレートまたは他の基板表面上にコロニーによって整列され得る。
【0108】
コロニーの生物および形態に依存して、この細胞は、排出を容易にする特定の条件を生成する(例えば、コロニー中の流体の粘度、またはその基質もしくは培地を形成する下に存在するゲルもしくは半固体の粘度を減少させる)必要なく、寒天または他の栄養性表面から排出され得る。いくつかの状況は、排出を可能にする特定の条件を促進するための手段を必要とする。排出許容条件を生成するための種々の手段としては、細胞内接着および/または細胞体流体もしくは下に存在する寒天(もしくは他の寒天様培地)の粘度に影響を与える、コロニー部位における化学的または生化学的試薬の堆積が挙げられる。例えば、アガロースを含有する流体(または別の寒天分解酵素)は、コロニーの下にある寒天を液化してか、または液体培地の粘度を減少させて、コロニーからの細胞の排出を容易にするために、堆積され得る。例えば、細胞が増殖される培地のタイプに依存して、他の酵素が用いられ得る。
【0109】
真核生物細胞は、代表的に、ゲル様培地上では増殖させないが、これらは、しばしば、細胞内接着を減少するためにある処理を必要とし、この処理はまた、いくつかの原核生物細胞にも必要であり得る。真核生物が、ゲルまたは別の半固体培地上で増殖される場合、音響エネルギーまたは他のエネルギーの送達によって、細胞の下にある基質における相または粘度の変化に影響を与えることは、細胞間の接着を減少させるために必要な任意の処理と共に使用され得る。
【0110】
好ましくは、コロニーの下に存在する領域は、その上に存在するコロニー中の細胞の生存度に影響を与えることなく、寒天(または他のゲルもしくは半固体培地)を融解する温度(Tm)まで加熱される。このために、低Tm寒天またはゲル様培地が使用され得る。また、相変化は、細胞が排出されるコロニーの下にある領域に局在するべきであり、その結果、隣接するコロニーは破壊されない。多数のコロニーを含有する寒天プレート中の培地の大規模な融解は所望されない。なぜなら、全ての別個のコロニーは、いくつかの細胞が各コロニーから排出され得る前に、合体するからである。細胞が、各コロニーから絶え間なく排出され得るために、細胞が連続的に排出されるコロニーの下に存在する培地の局所的な相変化または融解が、迅速に達成されなければならない。局所的に迅速に加熱するための種々の手段が用いられ得る。例えば、薄い部材またはピンを備える電気加熱要素が、コロニーの下に挿入され得、そしてその下に存在する培地は、電気パルスにより融解され得る。
【0111】
加熱デバイスと培地との間の物理的接触を必要としない加熱手段が、好ましい。例えば、適切な断面および周波数を有する方向付けされた電磁エネルギー(例えば、方向付けされたマイクロ波もしくは赤外線、またはレーザービーム)が、用いられ得る。好ましくは、電磁放射線源は、電磁波が、細胞が排出されるコロニーの下に存在する培地を通過するように位置し(例えば、この供給源は、培地の下に位置する)、その結果、この下に存在する培地は、上に存在するコロニー中の細胞よりも早くかつより大きな程度まで加熱されて、この細胞を所望しない加熱からシールドする。
【0112】
集中した音響エネルギーによるコロニーの下の培地の液化は、局所的な融解を実施する最も好ましい手段である。なぜなら、熱エネルギーが伝達される深さおよび容量の大きさが、制御され得るからである。集中した音響エネルギーは、中程度の熱伝導率を有する物質の円柱形領域の外側を有意に加熱することなく、約20μm程度の小さな直径および約200μm程度の低い高さを有する円柱形領域を加熱するために、使用され得る。従って、一旦、例えば、音響的手段によってコロニーが位置決めされると、音響エネルギーの焦点は、その動力が表面から液滴を排出する閾エネルギーを送達するには不十分であるように調節され得る。加熱の領域は、目的のコロニーの境界の下に全体的に存在するように培地表面(範囲)に対して平行な面において、空間的に制御される。音響焦点の深さおよび加熱の深さは、培地とその上に存在するコロニーとの間の表面または界面より下にあるように調節され、このことにより排出がさらに防止される。排出することなく、所望の焦点においてより均一な加熱を達成するために、音波の周波数は、排出のために使用される周波数に対して減少され得る。音波の振幅は、加熱速度を調節するように、調節され得る。
【0113】
いくつかの場合において、コロニーを形成する、排出される細胞は、下に存在する培地を液化するように形質転換され得る。例えば、寒天ベースのゲル培地が使用される場合、細胞は、アガラーゼ(下に存在する寒天を加水分解的に液化する酵素)を放出するように、形質転換され得る。類似の酵素が、異なる培地について使用され得、例えば、セルラーゼは、種々のポリサッカリド部分を加水分解するために使用され得る。アガラーゼを放出するための形質転換は、アガロースゲル材料からの排出を促進するためのみに行われ得るか、またはこの形質転換は、形質転換されたコロニーからのみの排出を選択的に促進する別の形質転換と共に行われ得る。例えば、細菌は、細胞質におけるパンサイトケラチン(pancytokeratin)(哺乳動物タンパク質)の発現のため、および周辺細胞へのアガラーゼの放出のための構築物で形質転換され得、その結果、排出性は、形質転換された細胞のマーカーとなる。
【0114】
本発明の細胞を分類または整列するための方法およびシステムに必要ではないが、検出および排出の好ましい連続的な並行多重化は、プロセッサに適し、そして好ましくは、このプロセッサと一体化される。このプロセッサは、種々の検出データをまとめて、検出および測定された細胞が排出部位に到達する時間を計算し、そして適切な排出を実施するように機能し、標的容器、チャネルまたはアレイ部位を正確に標的化するのに適切な速度ベクトルおよび軌道を有する、細胞を含む排出液滴を与える。従って、最大の効率およびスループットは、各部位に多数の選択可能な排出標的を有する検出部位および排出部位の連続的かつ並行な高レベルの多重化を伴って、達成される。
【0115】
本発明が細胞分類に使用され得ることに加えて、排出基準としての性質を測定する能力は、キャリア流体とは異なる非生存固体、ゲルおよび流体領域の分類を可能にする。例えば、固相コンビナトリアル合成に使用され、このコンビナトリアル配列を同定するあるマーカーまたは特性を有するビーズの排出は、本発明の方法によって分離され得ることが、容易に理解される。
【0116】
(実施例1)
(赤血球細胞、顆粒球およびリンパ球のチャネルへの同時分離を伴う、末梢血由来の細胞の混合物からのアレイとしての基板への単球の音響排出)
ヒトMHC(全ての細胞上に提示される)に対するウサギポリクローナルAbを作製し、個体に対して特異的なエピトープではなく、全てのヒトに共通のMHCエピトープに結合する、単一のクローンを選択する。基板を、慣用的方法によってモノクローナル抗体(mAb)で官能基化する。単結晶Siを官能基化するための公知の方法の多さに起因して、単結晶Siを、基板として選択する。
【0117】
図6に例示されるように、25μmの幅を有するチャネルを使用して、細胞を探して排出するのにかかる時間を減少する。分類装置のこの中心排出チャネル要素は、約6cm長であり、約2.75cmと3.25cmとの間で上側が開いており、一端の約0.5cmが開いている。血液細胞は、流体連絡されたチャネル(示されず)から供給される。2つのディテクターD1およびD2は、この示されるチャネルの最初の約0.5cmに配置される。集中音響エネルギー変換器は、上部で開いた排出チャネルの領域中の排出部位の下に直接位置する。各排出部位の各側面に向かって、共通流体チャネルは2つのチャネルに分岐し、この2つのチャネルは、排出チャネルに向かって輪になり、その結果、短距離の間、排出チャネル内の流体の流れに対して、一方のチャネル中の流体は平行に流れ、そして他方のチャネル中の流体は、逆平行に流れる;これらの2つのチャネルは、排出チャネルに十分に接近しており、これにより、細胞は、排出チャネルから選択された標的チャネルに排出され得る。排出部位1つあたり、4個のチャネルがあり、合計で8個のチャネルがある。音響排出は、ゼロの大きさの速度成分、または流体表面に対して平行な(例えば、任意の水平方向)ゼロではない方向速度成分を与え得る。これにより、細胞含有液滴は、検出される特性に基づいて、4つの標的チャネルのいずれかにか、または排出部位の上の流体表面に対して実質的に平行に方向付けられた基板表面上に、音響的に排出されるか、あるいは全て排出されないのを可能にする。これらのチャネルは、慣用的な微小製造技術によりカバーガラスプレートに熱融着された(上部の開口部以外)HFエッチングガラスプレートから製造される。
【0118】
用いられるディテクターは、レーザー/固有蛍光ディテクター(D1)および音響画像化ディテクタ(D2)である。音響排出変換器はまた、排出部位においていくつかの検出機能を実行して、最低限、細胞が排出のための流体表面に十分に接近しているか否かを検出する。細胞は、図5Dに示されるように、ランプ様構造により表面に押しつけられる。加えられるストリンジェンシーは、排出される細胞の容量に基づいて送達される音響エネルギーを調節することにより、達成され、従って、細胞サイズを実質的に過小評価するサイズ決めにおける誤りが存在する場合、実質的により大きな細胞の排出を防止する。
【0119】
蛍光データ、光散乱データおよび音響データを、このプロセスを制御するプロセッサに入力する。サイズ化データ(寸法を含む)、細胞および検出された核の体積、および適切な細胞質/総/核のサイズ比または体積比を、組み込んだ音響データ、蛍光データおよび/または散乱データから得る。固有のTrp蛍光放出スペクトルもまた、各細胞について測定する。細胞の大半は、形態学的特徴によって区別可能であるので、決定樹は、第1に、サイズ比および体積比、ならびに第2に、固有の蛍光データに基づく。赤血球(RBC)は、それらの大きい寸法において、小さいリンパ球と幾分重複を有するが、半径が同一である場合でさえ、はるかに小さい総体積を有する。なぜなら、リンパ球は、球形であるが、RBCは、ドーナツ状であるからである。RBCはまた、核を持たない。小さいリンパ球は、中程度のリンパ球および大きいリンパ球と同様に、大きい核対細胞質(および核対全細胞)体積比を有する。中程度のリンパ球および大きいリンパ球は、顆粒球および小さい単球とサイズが重複するが、いずれよりも、実質的に大きい核対細胞質体積比を有し、ほとんどの場合、厳密性を加える場合を除いて、蛍光スペクトルデータの使用を必要としない。顆粒球とサイズが重複する単球は、ほぼ球形の2つの葉型の核を有して、より大きい核対細胞質体積比および連続的な核シグナルを含む、異なる形態学的特徴を有する傾向があり;顆粒球は、非連続的な核シグナルを有し、そして従って、それらの多葉型核形態に起因して、多核性であるようである。蛍光スペクトルは、それらが顆粒球または大きいリンパ球ではないことを確認するために、いくつかの小さい単球について、結論的なデータを提供する。顆粒球(PMN、好酸球および好塩基球を含む)は、形態学的に類似し、従って、それらの固有のTrp蛍光放出スペクトルの差異に基づいて区別され、これらのスペクトルは、それらの異なる特徴的な顆粒の結果として、特徴的にシフトされる。血小板もまた、末梢血中に存在し、そして、技術上、細部のフラグメントであり、核を持たず、そしてRBCより小さい。これらは、外科的手順において使用されるので、これらは、中心チャネルからも排出チャネルからも排出されず、さらなる精製のために血漿と共に収集される。
【0120】
分離される末梢血は、1個体由来であっても、多数の個体由来であってもよいが、容易に理解されるように、Igは、異なる抗原性の血液型と混合する前に、血液から除去されなければならない。2つの排出部位で8つの標的チャネルを、排出される異なる細胞(小さいリンパ球、中程度のリンパ球および大きいリンパ球を含む)に対して使用し、そして過剰の単球は、最も遠位側の排出部位から排出され、別々の排出チャネルに排出される。D1およびD2に近位の排出部位で、PMN、好酸球、好塩基球、およびRBCが、別々の標的チャネルに排出される。近位部位はまた、提供される基板を使用して、実験用の単球のアレイを作製するために使用される。1以上の細胞型のさらなるアレイが、遠位側の排出部位に同時に作製され得ることが、容易に理解され;例えば、アレイは、全ての有核細胞型(最も近く隣接する種は、同じ細胞型でない)から作製され得るか、またはアレイは、大きいリンパ球(ほぼおそらく、記憶リンパ球である)から作製され得る。排出チャネルは、慣用的な方法によって流体カラムに流体連結され、この流体カラムに細胞懸濁液が添加される。カラムの大きさは、5mLの流体キャリアおよび細胞が添加されるのを可能にし、その結果、十分なカラム圧が存在し、チャネルを通る流体の流れを開始して、流体が、十分に短時間で開口した上部領域に到達するのを可能にする。次いで、カラムの上部を圧力調節器に連結し、この調節器は、カラム中のキャリア流体の上にある気体の圧力を調節し、チャネルを通るキャリア流体の流れの精密な調整、終結および再開を可能にする。
【0121】
キャリア流体は、生理学的食塩水、または血液の血清の浸透圧重量モル濃度とほぼ等しい浸透圧重量モル濃度を有する他の電解質溶液であり得る。単球を、約38℃で維持された基板上にスポットする。使用される基板は、平面であり、そして10,000部位/cm2の密度が選択され、各部位は単一の細胞によって占有される。10人の異なる個体由来の循環単球を、慣用的な方法によって獲得および精製する。
【0122】
各個体の単球は、約4.2pLの容量を有する液滴の音響排出によって、アレイに付着される。詳細には、各列の10番目の部位ごとに、1人の個体由来の単球をアレイにスポットし、そして個体の細胞の分配を、その次の列へとずらし、個体由来の細胞間で分離を増加する。個体の細胞の分離は、それが、異なる基板領域間の条件における変動に対して内部コントロールを提供するので、好ましい。残りの個体由来の単球を、音響排出された液滴で、アレイ部位上に同様にスポットする。10個の2連のアレイが作製される。
【0123】
単球は、走化性により炎症した組織へと誘引されるので(単球が、免疫メディエイターの影響下でマクロファージへとトランスフォーメーションされる場合)、アレイを、ヒスタミン、インターロイキン(IL)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、ロイコトリエン、および当該分野で公知の他の炎症性メディエイターのような、1つ以上の炎症メディエイターを含む、種々の生理学的溶液中に浸漬することにより研究する。これらの細胞はまた、熱および公知の抗炎症剤(ステロイドを含む)、非ステロイド抗炎症薬物、ならびにマクロファージの活性に影響すると思われる物質のような、炎症に影響し得る他の条件に曝され得る。特定のメディエイターおよびこれらの組み合わせが、炎症誘発効果または抗炎症効果を有すること、ならびに個体の間で、および、より少ない程度で、個々の細胞の間で、差異が存在することが、容易に理解される。単球はmAb/MHC特異的結合により結合されるので、このアレイは、浸漬により破壊されない。
【0124】
単球のマクロファージへのトランスフォーメーション、および単球へのマクロファージの逆のトランスフォーメーションは、細胞の生存能力に影響することなく光学顕微鏡により観察され得る。個々の細胞を測定する他の公知の方法としては、個々の細胞のXPS(X線光電子分光法)が挙げられる。免疫細胞(特に、活性化されたマクロファージ)は、免疫メディエイターおよび走化性因子の放出により他の免疫細胞を活性化し得るので、ある個体の単球が、免疫メディエイターまたは免疫状態に対して非応答性であり得るが、この実験条件に対して応答性であった別の個体のマクロファージにより放出される免疫メディエイターに対して応答性であるという、可能性が存在する。上記のコントロールとして、標準のウェルプレートを、同一の方法を使用するコントロールとして用いる。このウェルプレートは、各ウェルに同じ個体由来の複数の単球を有する(96ウェルプレートについて、9ウェル/個体、各110個の細胞)。mAb/MHC結合系を含まないウェルプレートを用いる最終コントロールをまた、記載した方法により作製する。このウェルプレートは、排出された細胞含有液滴を定所に保持するのに十分な表面張力を有する。各ウェルプレートに配置される110個の液滴は、好ましくは、複数の配置によって、形成される液滴が大きくなり過ぎて、表面張力により定所に液滴を保持されなくなるのを防止するために、ウェル内の異なる場所に配置されることが容易に理解される。
【0125】
図7Aおよび7Bに示され、そして先に記載された、高スループット設計もまた、図6に示される構成と共に、本実施例において使用されるのと実質的に同じ様式で使用され得る。この設計の1つの利点は、細胞が、固有に再循環されるということである。いくつかの例において、排出部位は、操作されるべき細胞の数によって過負荷になり得る。血液の場合、この状況は、特に、RBC(これは、最も多い細胞である)に当てはまる。RBCの排出のために1より多い排出器を使用することによってか、またはRBC専用の第3の排出器をこのシステムに加えることによって(図6および7に例示されるシステムにおいて具体化されるような)、この問題を克服する能力が、容易に理解される。最初の通過中に排出されない再循環しているRBC(流れの破壊を伴わずに、細胞の整然とした処理を可能にするために)は、全てのより少ない数の多くの細胞型を分類した後に、キャリア流体を再循環することによって後に排出され得る。
【0126】
(実施例2)
(刺激細胞計数を用いて炎症応答を研究するための気管支肺胞洗浄液ヒト気道上皮(HAE)細胞アレイ)
前述の実施例の方法を、同時分類および差示的細胞計数を用いて気管支肺胞洗浄液から得たHAE細胞をアレイ化するように適合させる。上皮細胞に加えて、気管支肺胞洗浄液は、慣用的には、他の細胞を含む。洗浄液中に見出される細胞としては、無顆粒白血球、リンパ球、および単球(これは、代表的に、マクロファージとして活性化される)、および顆粒球白血球、好中球(PMN)、好酸球および好塩基球が挙げられる。しばしば、以下のような病原体が存在する:ウイルス(インフルエンザウイルスおよびDNAウイルス(ヘルペスウイルスファミリーメンバー、最も顕著には、CMV(サイトメガロウイルス)KSV(カポージ肉腫関連ヘルペスウイルスを含む)を含む);真菌種(Cryptococcus albidus、Coccidioides immitis、およびAspergillus flavusを含む);真核生物日和見病原体(例えば、Pneumocystis carinii(これは、健常な患者に見出され、そして重篤な免疫無防備状態で肺炎を引き起こす);グラム陽性細菌群およびグラム陰性細菌群のメンバー;ミコバクテリア種;および偏性細胞内原核生物(例えば、chlamydia、mycoplasmaおよびrickettsia)。偏性細胞内原核生物の可能性のある例外を除き、全ての病原体は、全ての哺乳動物細胞を排出した後に残存する流体から、慣用的な微生物学的方法およびウイルス学的方法によって培養され得る。Pneumocystis carinii嚢胞(直径5〜7μm)、栄養型、およびスポロゾイトは、細胞外細菌(代表的には、直径1μm)が排出され得るように、染色のために排出され得る。染色および試験は、培養の代わりに、または培養に加えて、同定に必要とされる場合に行われ得る。例えば、Pneumocystis carinii嚢胞は、染色された標本の顕微鏡試験によって、培養を行うことなく同定され得る。
【0127】
分類、計数、およびアレイ化は、実質的に実施例1に記載されるように進行し、計数目的のために、排出された各細胞の正体をさらに記録する。通常、差示的計数は、単独で有用な診断的および病態生理学的情報を提供する。例えば、好酸球およびリンパ球の上昇は、ぜん息または関連する好酸球性肺炎症プロセスを示す。分離されたリンパ球は、細胞表面活性化マーカーHLA−DR、IL−2R(インターロイキン2レセプター)およびVLA−1を発現する活性化されたTリンパ球が上昇されたことをさらに確認され得る。あるいは、これらのリンパ球を、その上記マーカーを認識する抗体で異なる部位において官能基化した基板上にアレイ化する。下気道の線維症炎症疾患(一般に、間質性肺疾患と呼ばれる)は、優勢なPMNおよび肺胞マクロファージを産生する。マクロファージ、ならびにより少ない程度のPMNおよび気道上皮細胞の免疫細胞化学は、これらの細胞が、早期の慢性肺疾患において特徴的なサイトカイン(例えば、IL−1β、IL−6、およびIL−8)を含むことを示す(Kotechaら(1996)Pediatric Res.40:250−56)。細菌性肺炎は、それらが、類似の差示的な細胞数を生じるので区別可能であるが、洗浄液中および時にはマクロファージ内に、より多くの免疫細胞および細菌粒子が存在する。
【0128】
差示的な細胞計数および微生物学的/ウイルス学的病原体培養物および同定方法を使用して、好酸球性および好中球性の初期炎症プロセスは、互いに区別され、そして肺洗浄液サンプルを採取した患者における、感染プロセスに対して二次的な炎症と区別される。患者由来のHAE細胞もまた、このアレイにおいて研究される。
【0129】
容易に理解されるように、適切な大きさを有するチャネルが、提供されなければならない(HAE細胞よりも、そしておそらく、大きい単球よりも、わずかに大きく、従って、約25〜30μm)。あるいは、このチャネルの幅は、細胞よりもわずかにより広く;より速い充填のために、深さは、細胞の直径の約3倍であり、そしてランプ(ramp)(図5Dに示されるような)を、開口するチャネル領域の直前のチャネル流路において使用する。さらなる選択肢として、光子場(光ピンセットにおいて通常使用されるように、レーザーによって提供され得る)を、細胞を表面に近づけるために用い得る。アレイ化されるHAE細胞を、気管支肺胞洗浄液によって得、そして本明細書中および前述の実施例において記載されるように、分類および計数の間に基板表面上に排出する。排出のためにロードされる前に、この洗浄液を、従来の組織培養方法を使用して脱凝集することによって、接着している細胞を個々の細胞として懸濁するように処理される。
【0130】
HAE細胞に対する実験は、細胞分裂を可能にする条件下で行われ得る。前述のための要件およびこれに必要とされる条件は、当業者によって理解される。ウェルプレートを用いるコントロールは、有用であるが、単球を有するプレートほど重要ではない。
【0131】
(実施例3)
(発癌の代わりとして変異誘発に対する個体の感受性を研究するためのHAE細胞アレイ)
上記実施例の方法を、化学突然変異誘発原および他の突然変異誘発原(例えば、熱および放射線)に、アレイ化したHAE細胞を曝露するように適合する。遺伝子の損傷は、慣用的な方法(例えば、破壊された架橋およびDNAに対する他の損傷の生化学的アッセイ)によって、曝露が停止された後の種々の時点で測定される。DNA修復酵素の遺伝学における差異は、曝露後の種々の時点での回復(損傷の減少の程度)を比較することによって研究され得る。ウェルプレートアレイは、コントロールとして依然有用であり、そして細胞をこのウェルプレート中で培養し得るか、またはアレイ細胞を取り出しそして培養して、曝露後のその後の細胞世代における形成異常細胞または新生物細胞の実際の出現、および検出された任意の形成異常細胞または新生物細胞における任意の脱分化の程度を決定し得る。
【0132】
(実施例4)
(細胞パターン化(patterning))
実施例1および2の方法を、基底扁平上皮細胞をパターン化するように適合する。基底扁平角質化上皮細胞および扁平非角質化上皮細胞を、実施例1のように、官能化したニトロセルロース基板上にパターン化する。生成したパターンは、唇の朱色輪郭を模倣する。次いで、基板上のパターン化した細胞を、適切な培養培地中に浸漬し、そして研究を、皮膚/非角質化接合部の形成に関して行う。
【0133】
(実施例5)
(血液からのリンパ球のエピトープアレイ上への音響排出)
小さいリンパ球、中程度のリンパ球、および大きなリンパ球を、クローンエピトープアレイを形成するために、上記実施例の方法により排出する。2つの平行に隣接するチャネルを異なる幅で構築し、そして細胞を表面に近づけるように適切に設計する。より幅広いチャネルは、培地および大きなリンパ球を収容するために約15μmの幅であり;より狭いチャネルは、小さなリンパ球を収容するために10μmの幅である。小さなリンパ球を、慣用的な方法または音響排出により、大きなリンパ球および中程度のリンパ球から分離し得る。小さなリンパ球を排出するのにかろうじて十分なエネルギーの量を、混合物中の全てのリンパ球が1つの共通チャネル(15μmの幅)を通過するように加える。このエネルギーを、各リンパ球に加えて、各リンパ球を、排出領域を形成するチャネル開口部またはアパーチャで検出する。排出されたリンパ球を、基板上に排出し、そしてペトリ皿または他の容器中に洗い流し得る。あるいは、音響エネルギーを、非垂直軌道で液滴を排出するように送達し得、その結果、この液滴は、容器(例えば、上部が開口しており、そして排出チャネルに十分に近いチャネル)のすぐ近くに着地する。
【0134】
エピトープアレイは、天然に存在するアミノ酸から形成したコンビナトリアルテトラペプチドアレイである。他のエピトープは、タンパク質において(非一次構造の結果として)、ハプテンを有するペプチド分子において、ならびにペプチドグリカンおよび多糖類のような他の生体分子の両方において存在することが容易に理解される。約1012個のエピトープの小さな画分のみをアレイ化する。T細胞およびB細胞の両方は、容易に理解されるように、わずかに異なる機構によって、これらのエピトープに結合する。テトラペプチドアレイは、種々の方法によって(例えば、上記のコンビナトリアル化学についての同時係属出願に記載されるような、試薬の集束させた音響排出を用いるデバイスに対して、固相ペプチド合成技術を適用することよって)作製され得る。1.6×104個の異なる天然のテトラペプチドが存在する場合、16個のアレイ合成領域(各々、1cm2であり、そして各々、1000個のアレイ部位を含む)が、全てのテトラペプチドの合成に、そして個々の細胞の分離を可能にするのに適切な密度を維持するために、利用可能であるはずである。
【0135】
細胞を、可能な限り迅速にアレイ部位上にスポットする(従って、異なるサイズであるにも拘わらず、2つのチャネルは、それらのチャネル中で細胞の一列の線を維持する必要がある)。これらの16,000個のアレイ部位の各々が、これらの部位上に排出された液滴を有するときに、このアレイを洗浄して、配置部位でエピトープに結合しない細胞を取り除く。これらのアレイを画像化して、どの部位が細胞を結合しているのかを決定し、そして細胞を結合していない部位に対して、このサイクルを繰り返し、これらの部位が、再スポットされる。このプロセスは、洗浄後のアレイの画像化を必要とし、そして自動化されなければならないことが直ぐに理解される。このようなシステムの自動化は、容易に達成でき、そしてクローン分離に対する価値ある情報が、この計画の完了の前に導き出される。異なる型のエピトープの使用はさらに、分類分けされる。
【0136】
(実施例6)
(形質転換された細菌を選択するための細菌の排出)
E.coliを、細胞表面上のストレプトアビジンの発現および提示もまた引き起こす構築物によって、パンサイトケラチン(pancytokeratin)(真核生物タンパク質)を発現するように、慣用的な方法により形質転換する。この細胞を、上記実施例1〜5に記載されるように、慣用的な方法によりビオチン化された基板上に音響排出する。この排出チャネルサイズは、細菌の寸法(1μm)に適合され得るが、これは、公知の微小製造方法により達成され得る。形質転換された細胞を、マーカー部分(ストレプトアビジン)によってビオチン同族部分に特異的に結合させる。基板を洗浄して、形質転換していない細胞を取り除き、基板に付着した形質転換された細胞のみを残す。
【0137】
形質転換された細胞を形質転換されていない細胞から分離する能力を、末梢血から全血液細胞を取り出す能力(実施例1)と組み合わせて、形質転換されたE.coliおよび形質転換されていないE.coliがマウスにおいて菌血症を引き起こす能力を評価し、そしてそれらの形質転換された細菌および形質転換されていない細菌に対してマウントされた免疫応答を比較する。接種されたマウスの血液を採取し、実施例1のように分類する。ただし、全ての異なる血液細胞を分類することに加えて、各型の細胞の数を計数して、免疫応答に関する情報を提供する。ベースライン計数を、接種前に慣用的な方法によって行う。実施例1に従う血液細胞の分類および計数後、細菌、血小板および血漿のみが、中央の排出チャネルに残る。血小板とほぼ同じサイズおよび形状であるが、細菌は、核封入体(ここに、細菌の染色体が局在している(これは、光散乱または他の手順によって検出され得る)の存在によって血小板と区別され得るか、または固有のTrp蛍光(これは、血小板と細菌との間で異なる)によって区別され得る。全ての細菌を計数および排出し、そして形質転換されている排出された細菌の数および割合を、洗浄後にビオチン化基板表面に付着されたままの細菌を計数することによって決定する。
【0138】
4つのマウスのグループを評価する。第1のグループには、適切なキャリア(例えば、緩衝化生理食塩水)のプラシーボを静脈内接種し、このプラシーボは、細菌を有さず、そして他のグループについての接種量と等量である。第2のグループには、既知の数の、形質転換された、生きたE.coliを含むキャリアを接種する。第3のグループには、既知の数の、形質転換されていない、生きたE.coli(上記の形質転換された細菌と同じ株)を含むキャリアを接種する。第4のグループには、既知の数の生きたE.coliの同じ株を含むキャリアを接種し、その集団は、形質転換された細菌と形質転換されていない細菌との等量混合物である。血液を、接種後1週間の間、または菌血症でマウスが死亡するまで、規則的な間隔でマウスから採取する。全てのグループからの細胞型および差示的計数についての統計的データは、グループ内の免疫応答の個々の変動についてのデータを提供する。
【0139】
第1のグループからのデータは、主に、非接種マウスの血液への細菌(ストレプトアビジンを提示するか否かにかかわらず)の自然発生的進入を決定するためのコントロールとして使用し;このグループ由来のマウスの血液中に検出された全ての細菌を、コントロールの目的で、培養しそして特徴付ける。第2のグループからのデータは、第4のグループについてのコントロールであることに加え、第3のグループからのデータと比較して、形質転換されていない細菌からの競合を伴わない相対的な病原性を研究し得る。さらに、第2のグループからのデータを使用して、この構築物の全てまたは一部の損失を研究し得る。例えば、ストレプトアビジンを提示せず、そしてビオチン化表面を結合しない、接種後の第2グループのマウスから得た細菌を培養し、そして免疫染色し、これらが、パンサイトケラチンを発現するか否かを決定し、コントロールの目的で復帰変異を定量する。第3のグループからのデータもまた、自然発生的な形質転換が生じたか否かを決定するため、およびストレプトアビジン/パンサイトケラチン構築物がその集団に(幾分)侵入するという遠い可能性を調査するために、得られ得る。第4のグループは、形質転換された株および形質転換されていない株が、競合条件下で菌血症を引き起こす能力についてのデータを提供する。1容量あたりの総細菌についての第4のグループからのデータを、他のグループと比較する。また、形質転換された細菌および形質転換されていない細菌の相対的割合が、自然感染の適切な考慮後に、形質転換の損失または獲得について分析され得る。これらの目的のために、接合体による形質転換構築物の移入は、自然発生的とはみなさない。異なる接種比率の形質転換された細菌と形質転換されていない細菌とを用いる他のグループの追加もまた、望ましくあり得る。
【0140】
(実施例7)
(寒天培地上で増殖したコロニーからの直接的な細胞の排出)
寒天上で増殖したコロニーからの、正確で非接触的な細胞選択の1つの様式は、液滴の排出をもたらす集束された音響エネルギーにより提供される。排出された液滴は、1つ以上の細胞を含み得、そして排出毎により多くの細胞またはより少ない細胞を堆積させるよう、体積が調節され得る。細胞のコロニーは、隣接するコロニーからの生物によるサンプルの汚染を回避するために、培地または基板の表面に対して平行な平面において、中心からサンプリングされる。個々のコロニーからの別個のサンプルの数(従って、堆積され得るサンプルの数)は、コロニーの大きさおよびサンプルの大きさに依存し;最小で、最も小さいコロニーのいくつかのサンプルが排出され得る。
【0141】
慣用的なスロートスメア(throat smear)は、従来のプラスチックペトリ皿中の標準的な血液寒天培地上で培養され、そして培養物は、約38℃で72時間インキュベートされる。インキュベーション後、音響変換器は、寒天および細菌コロニーを含むプラスチックペトリ皿の下に配置され、そしてコロニーの存在または非存在が、音響顕微鏡を通じて検出される。
【0142】
細胞の位置決めをするのに使用される同一の音響変換器は、寒天の表面から細胞を進めるのに使用される(ただし、表面は、適当な粘度を有する)。集束された音響エネルギーは、寒天培地の表面の約75μm下の集束点におけるコロニー中心の直下に送達される(「熱送達音響パルス」)。この音響エネルギーのパルスは、培地表面に対して平行な平面において寸法を有する寒天の円柱を液化するのに十分な動力および十分な持続時間を有し、この円柱は、このプレートにおけるコロニーの寸法内であり、表面に対して垂直な基板表面方向に延び、45℃付近の温度で液化する(Gibco,Inc.(現在は、Life Technologies)、Rockville Md.、a division of Invitrogen)。種々の直径の円柱状体積を溶解するために、特定の寒天の組成および深度ならびにペトリ皿に対して熱送達音響パルスを較正する必要性は、直ちに理解される。あるいは、スキャンレーザーは、低融点寒天を加熱するために使用され得る。低融寒天を用いることで、寒天表面上の選択された微生物の生存率を有意に減少させることなく、表面の液化が可能となる。レーザーが用いられる場合、レーザーの配置は、音響顕微鏡により決定されるコロニー位置に結び付けられ得る。排出のための音響エネルギーの焦点は、培地の表面である。局所的に寒天を加熱することによって、培地の表面の粘度は減少し、ウェルプレートまたは他の容器への目的の細胞の直接的な排出を可能にする。
【0143】
熱エネルギーの音響送達は、音響排出前にコロニー下での局所的な溶解をもたらすために使用される。この様式において、各々のコロニーは、4回サンプリングされる。細菌コロニーから排出される細胞の2つの二連アレイは、栄養寒天培地を含む標準的なウェルプレートを用いて作製され、各々の液滴は、約0.1〜1.0pLの量を有する。異なるウェルが異なる培地および栄養素を含み得ることは、すぐに理解される。各々のコロニーからの2つのさらなるサンプル(各々、約1.0〜100pLの量を有する(必要とされる場合、複数の滴中に))は、清潔な表面上に堆積され、そして生理食塩水を用いて栄養流体を含むフラスコ中へと(あるいは、栄養流体の容器へと注がれる流れる流体を含むチャネルへと)洗い流される。
【0144】
サンプリングされた細胞は、細胞培養の従来法により、フラスコからペトリ皿上で直ちに培養される。アレイプレートおよびフラスコは、細菌の繁殖を遅らせるために冷凍保存され、さらなる培養および試験を可能にする。元々の培養ペトリ皿もまた、培養結果を未決定のまま維持するよう冷凍保存される。スロート培養物からの培養結果は、従来の顕微鏡および他の手段により試験される。多数のグラム陰性細菌種およびグラム陽性細菌種は、いくつかの酵母種と共に、免疫適格性成人に対して全て非病原性であることが最初に同定されている。抗生物質耐性を決定するための慣用的な方法を用いる、抗生物質を含む栄養寒天培地を用いたフラスコからのさらなる培養は、同一種の細菌の異なるコロニーが、異なるレベルの抗生物質耐性を有することを明らかにし、これによって、異なるコロニーが異なる株および亜株であることが実証される。
【0145】
寒天培地上で増殖したコロニーからの細胞の排出方法は、形質転換された細胞を選択的に排出するために使用され得る。指標は、所望の遺伝的形質転換(本明細書中では、パンサイトケラチンの発現)と共に形質転換構築物において使用される。例えば、この構築物は、アガラーゼを分泌するよう細胞をさらに形質転換し得、そして形質転換コロニーは、変化した音響インピーダンスを検出することにより選択され得る。あるいは、形質転換コロニーは、構築物が、形質転換細胞がマーカー(例えば、緑色蛍光タンパク質)を同時発現するよう設計される場合、最適に選択され得る。最適に検出された緑色蛍光コロニーのみが排出される。
【0146】
本発明は、本発明の好ましい実施形態と共に記載されているが、前述の記載は、説明であって、本発明の範囲を限定することを意図しないことが理解される。他の局面、利点、および修飾は、本発明の属する分野の当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、本発明に関連する有用なデバイス(第1および第2のセル容器またはレザバ、音響排出器、および排出器位置決め手段を備える)の実施形態を、簡易化された断面図で図解により示す。類似する部分は、類似する数字によって参照されている、本明細書中に参照される全ての図と同様、図1は釣り合いがとれていないので、特定の寸法が、表示の明瞭性のため誇張され得る。図1Aは、第1のセル容器またはレザバに音響的に連結され、第1のセル容器およびレザバ内から基板表面の示される部位へ向けて、単一の細胞を含む流体の液滴を排出するために活性化される音響排出器を示す。図1Bは、第2のセル容器またはレザバに音響的に連結される音響排出器を示す。
【図2】図2は、図1の発明の実施形態のバリエーションの概略図で図示する。ここで、セル容器またはレザバが、レザバウェルプレートに個々のウェルを含み、基板表面は、対応するウェルの番号を有するより小さなウェルプレートを含む。図2Aは、2つのウェルプレートの略図的な上面図であり、すなわち、セル容器またはレザバウェルプレートおよび流体液滴に含まれる、整列された細胞を有する基板表面である。図2Bは、音響排出器と音響的に連結する、図2Aのセル容器またはレザバウェルプレートを含むデバイスの断面図を示す。ここで、液滴に含まれる細胞は、セル容器またはレザバの第1のウェルから、基板ウェルプレートの第1のウェルに排出される。図2Cは、図2Bで図示されるデバイスの断面図を示す。ここで、音響排出器は、セル容器またはレザバウェルプレートの第2のウェルと音響的に連結され、さらにここで、デバイスは整列され、音響排出器が、セル容器またはレザバウェルプレートの第2のウェルから、基板ウェルプレートの第2のウェルに液滴を排出する。
【図3】図3Aは、発明の方法の実施形態の簡易化された断面図で概観的に示す。ここで、外部に提示されるマーカー部分を有する細胞は、図1のデバイスを使用して基板上に排出される。図3Aは、基板表面の指示される部位での、細胞を含む流体液滴の排出を図示する。図3Bは、第1の同族部分が付着された、改変された基板表面への付着に対して適合された第1のマーカー部分を提示する、第1の細胞を含む液滴の排出を図示する。図3Cは、この表面上の異なる部位への付着に対して適合された第2の分子部分を提示する第2の細胞を含む、第2の液滴の排出を図示する。図3Dは、基板ならびに図3A、図3B、および図3Cで図示される工程によって、この基板の上に整列された第1および第2の細胞を図示する。
【図4】図4は、図1のデバイスを使用して音響排出によって置かれた液滴中に含まれる、整列された細胞を示す。図4Aは、表面張力によって、基板表面の示される部位に付着する流体液滴に含まれる、近接する整列部位に存在する2つの異なる細胞を図示する。各々の細胞は、ストレプトアビジン(SA)のビオチン化された(ビオチン(B)結合)表面への結合によって、この部位にさらに付着される。ストレプトアビジンは、外部提示標的化ストレプトアビジンに対する遺伝的コード配列による形質転換の結果として細胞外部に提示される。図4Bは、表面張力によって基板表面の示される部位に付着する流体液滴に含まれる、近接する整列部位に存在する2つの異なる細胞を図示する。各々の細胞は、この細胞に特徴的な2つの外部に提示された抗原性エピトープ(ここでは、E1およびE2)の、それぞれ異なるエピトープに対して特異的な、2つの異なるモノクローナル抗体(mAb−E1、mAb−E2)への結合によって、この部位にさらに付着される。各々のmAbは、近接する整列部位のただ1箇所で表面に連結する。
【図5】図5は、容器として流体のチャネルを有するデバイスを示す。細胞は、その容器から基板に排出される。図5Aおよび図5Bは、このデバイスを概略的に図示する。図5Cは、生存細胞を含むチャネルの上方面視を図示する。基板表面は、流体液滴に含まれる整列された細胞を有する。図5Dは、細胞を排出のために十分に流体表面に近づけるための、チャネル床の上向きの突出物を示すチャネルの断面を図示する。図5Eは、細胞を、排出のために十分に流体表面に近づけるための、音響エネルギーのような、集束エネルギーの使用を示すチャネルの断面を図示する。
【図6】図6は、中心のチャネル、排出チャネル、ならびに細胞が流れて通過する2つの検出デバイスD1およびD2の上面図を示す。2つの大きな楕円によって表される2つの排出部位もまた示され、各々は、細胞の描画を含み、そこから、細胞は、基板(示さず)上にまたは近接した標的化チャネルに、表面に対して垂直に排出され得る。
【図7】図7は、中心流体チャネルを有するデバイスを図示する。このチャネルは、好ましくは複数の排出器の使用によって、細胞を、細胞が基板に放出される周辺のチャネルへ、側方に高速で送り込む。図7Aは、より大きな容器内の、細胞を含む垂直のチャネルの側面図を図示する。垂直のチャネルからの流体は、垂直のチャネルから側方に突出している、ある角度に折り曲げられたリップの下を通り抜けることによって、より大きな容器の周辺へのみ接近できる。細胞が、中心チャネルから周辺チャネルへ、放射状に外側へ移動し得るように、リップとより大きな容器の床との距離は、放射状に外側へ向かって減少する。周辺では、チャネルが形成され、そこでは細胞は、垂直のチャネルでの間隔に比べてより広い間隔をおかれている。図7Bは、より大きな容器の側壁に沿った細胞を示す上面図である。この配置によって、多数の細胞の同時排出が、複数の排出器の使用によって可能となり、ハイスループットおよび有効性をもたらす。
Claims (53)
- 分離方法であって、以下:
(a)レザバに含まれ自由表面を有する流体において、排出のために該流体の自由表面の十分近くに位置する単一の局在的な体積を検出する工程であって、該流体は、該流体と異なる音響インピーダンスを有する複数の局在的な体積を含む、工程;
(b)該単一の局在的な体積が1つ以上の測定可能な特性を有するか否かを決定する工程;
(c)工程(b)における1つ以上の測定可能な特性の決定に基づき、該流体からの排出のための該単一の局在的な体積を選択する工程;および
(d)集束されたエネルギーの使用により、該流体から該単一の局在的な体積を排出する工程;
を包含し、
該(c)の選択および該(d)の排出が、該(a)の検出および該(b)の決定からのデータを参照することにより行われ、そして
該単一の局在的な体積が、該流体から流体滴として排出され、該集束されたエネルギーが、集束された音響エネルギーであり、該局在的な体積は、ゼロではない速度成分で排出され、ここで、該ゼロでない速度成分は、該集束された音響エネルギーによって該局在的な体積に対して付与され、該単一の局在的の検出が、イオン検出、レーザー検出、内因性蛍光物質検出、光散乱検出および音響顕微鏡からなる群より選択される検出技術によるものであり、ここで、該1つ以上の測定可能な特性は、体積サイズ、音響密度、体積形状、内因性蛍光物質、細胞質の体積に対する核の体積の比率、細胞直径、時間にわたって積算した蛍光の強度、蛍光の閾値レベル、電磁波発光、電磁波吸収、核体積、細胞質体積、光学透過性、光学反射性、色、偏光、電気伝導性、キャパシタンス、インダクタンス、マイクロ波透過性、磁性、コロニーの存在および音響インピーダンスからなる群より選択される、方法。 - 前記局在的な体積が、固形粒子またはゲル状粒子を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記局在的な体積が、細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記局在的な体積が、生存細胞を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記局在的な体積が、前記流体の自由表面に対して実質的に垂直な軌道で排出される、請求項1に記載の方法。
- 前記局在的な体積が、前記流体の自由表面に対して垂直な非ゼロ速度成分および該流体の自由表面に対して平行な非ゼロ速度成分を有して排出されて軌道を生じ、これによって、該局在的な体積が該流体の自由表面に対して平行な方向への正味の移動を生じる、請求項1に記載の方法。
- 前記軌道が、方向制御可能であり、その結果、前記流体の自由表面に対して平行な正味の移動の方向もまた、方向制御可能である、請求項6に記載の方法。
- 前記流体の自由表面に対して平行な移動の非垂直距離が、前記集束されたエネルギーを変化させることによって制御可能である、請求項6に記載の方法。
- 前記流体の自由表面に対して平行な移動の垂直距離が、前記集束されたエネルギーを変化させることにより制御可能である、請求項6に記載の方法。
- 前記工程(b)における前記1つ以上の測定可能な特性の決定が、定量的決定または半定量的決定であり、そして工程(c)における選択が、非排出軌道と複数排出軌道との間の選択であり、かつ該定量的決定または半定量的決定に依存する、請求項9に記載の方法。
- 前記レザバが、流体チャネルである、請求項10に記載の方法。
- 前記(a)の検出および前記(b)の決定からのデータが、プロセッサに入力され、それによって、該プロセッサは、該測定データ、プログラムされた選択基準、およびシステムパラメータを参照して、前記(c)の選択および前記(d)の排出を指示する、請求項11に記載の方法。
- 前記局在的な体積が、生存細胞を含む制限された体積である、請求項1に記載の方法。
- レザバに含まれ自由表面を有するキャリア流体からの1つ以上の制限された体積の分離システムであって、該キャリア流体は、該キャリア流体と異なる音響インピーダンスを有する複数の制限された体積を含み、該システムは、以下:
流体容器;
その局在的な体積を検出し、そして該局在的な体積の測定可能な特性を決定するための検出器;および
該キャリア流体からの流体滴の音響排出器であって、音響エネルギーを生じるための音響エネルギー生成器、および該流体の自由表面付近の集束点に該音響放射を集束させるための集束手段、を備える、音響排出器、
を備え、ここで、排出のために該流体の自由表面に十分近くで検出される、該キャリア流体に存在する該制限された体積は、該制限された体積が1つ以上の測定可能な特性を有するか否かに依存して、流体滴として該キャリア流体から標的に対して音響排出され得、
該局在的な体積は、ゼロではない速度成分で排出され、ここで、該ゼロでない速度成分は、該集束された音響エネルギーによって該局在的な体積に対して付与され、該検出器の検出が、イオン検出、レーザー検出、内因性蛍光物質検出、光散乱検出および音響顕微鏡からなる群より選択される検出技術によるものであり、ここで、該1つ以上の測定可能な特性は、体積サイズ、音響密度、体積形状、内因性蛍光物質、細胞質の体積に対する核の体積の比率、細胞直径、時間にわたって積算した蛍光の強度、蛍光の閾値レベル、電磁波発光、電磁波吸収、核体積、細胞質体積、光学透過性、光学反射性、色、偏光、電気伝導性、キャパシタンス、インダクタンス、マイクロ波透過性、磁性、コロニーの存在および音響インピーダンスからなる群より選択される、システム。 - 前記集束手段が、前記キャリア流体の所望の点における前記集束点に前記音響放射を集束させるのを可能にするような適切な位置に、前記容器と音響連結関係にある前記排出器を位置決めするための手段をさらに備える、請求項14に記載のシステム。
- 前記検出器、前記音響排出器、および前記容器に対して該音響排出器を位置決めするための前記手段を統合し、前記検出された測定可能な特性に基づいて選択された標的に対して前記制限された体積を排出するためのプロセッサをさらに備える、請求項15に記載のシステム。
- 前記流体容器が、表面を有する流体チャネルを備え、該流体チャネルは、前記複数の制限された体積を含む前記キャリア流体が、該チャネルを通って自由に流動することを可能にする寸法を有する、請求項16に記載のシステム。
- 前記流体チャネルは、前記複数の制限された体積または該複数の制限された体積のサブセットが、実質的に一列でのみ、該チャネルを通って自由に流動することを可能にする寸法を有する、請求項17に記載のシステム。
- 前記標的が、アレイ部位または標的流体チャネルである、請求項17に記載のシステム。
- 前記検出器による前記測定可能な特性の定量的測定または半定量的測定に基づき、前記制限された体積が、排出されないか、標的チャネルへと排出されるか、またはアレイ部位上に排出されるように選択される、請求項19に記載のシステム。
- 前記アレイ部位が、ウェルプレートウェルである、請求項20に記載のシステム。
- 前記標的チャネルへと排出される前記制限された体積が、該標的チャネルから引き続く標的チャネルまたは引き続くアレイ部位に排出され得る、請求項20に記載のシステム。
- 前記制限された体積が細胞である、請求項14または20に記載のシステム。
- 前記細胞が生存細胞である、請求項23に記載のシステム。
- レザバに含まれ自由表面を有するキャリア流体からの1つ以上の制限された体積の分離システムであって、該キャリア流体は、該キャリア流体と異なる音響インピーダンスを有する複数の制限された体積を含み、該システムは、以下:
容器;
該自由表面に対して実質的に平行に方向付けられた基板表面を有する基板;
該キャリア流体から、開口部を通って該基板表面上の位置へと、該キャリア流体と異なる音響インピーダンスを有する制限された体積を音響排出するために集積された音響エネルギーを用いるための手段であって、該局在的な体積は、ゼロではない速度成分で排出され、ここで、該ゼロでない速度成分は、該集束された音響エネルギーによって該局在的な体積に対して付与され、手段、
を備え、ここで、該開口部の下の流体の自由表面付近で検出される、該キャリア流体に存在する該制限された体積は、その制限された体積が1つ以上の測定可能な特性を有するか否かに基づき、流体滴として該キャリア流体から基板位置へと音響排出され得、該制限された体積の検出は、イオン検出、レーザー検出、内因性蛍光物質検出、光散乱検出および音響顕微鏡からなる群より選択される検出技術によるものであり、ここで、該1つ以上の測定可能な特性は、体積サイズ、音響密度、体積形状、内因性蛍光物質、細胞質の体積に対する核の体積の比率、細胞直径、時間にわたって積算した蛍光の強度、蛍光の閾値レベル、電磁波発光、電磁波吸収、核体積、細胞質体積、光学透過性、光学反射性、色、偏光、電気伝導性、キャパシタンス、インダクタンス、マイクロ波透過性、磁性、コロニーの存在および音響インピーダンスからなる群より選択される、システム。 - 前記検出器、前記音響排出手段、および前記容器に対して該音響排出器を位置決めするための前記手段を統合し、前記検出された1つ以上の測定可能な特性に基づいて選択された標的に対して前記制限された体積を排出するためのプロセッサをさらに備える、請求項25に記載のシステム。
- 前記流体容器が、表面を有する流体チャネルを有し、該流体チャネルは、前記複数の制限された体積を含む前記キャリア流体が、該チャネルを通って自由に流動することを可能にする寸法を有する、請求項26に記載のシステム。
- 前記流体チャネルは、前記複数の制限された体積または該複数の制限された体積のサブセットが、実質的に一列でのみ、該チャネルを通って自由に流動することを可能にする寸法を有する、請求項27に記載のシステム。
- 前記標的が、前記基板表面上のアレイ部位または標的流体チャネルである、請求項27に記載のシステム。
- 前記検出器による前記測定可能な特性の定量的測定または半定量的測定に基づき、前記制限された体積が、排出されないか、標的チャネルへと排出されるか、またはアレイ部位上に排出されるように選択される、請求項29に記載のシステム。
- 前記アレイ部位が、ウェルプレートウェルである、請求項30に記載のシステム。
- 前記標的チャネルへと排出される前記制限された体積が、該標的チャネルから引き続く標的チャネルまたは引き続くアレイ部位に排出され得る、請求項30に記載のシステム。
- 前記制限された体積が細胞である、請求項25または30に記載のシステム。
- 前記細胞が生存細胞である、請求項33に記載のシステム。
- 培地表面上に配置された細胞のコロニーから1つ以上の細胞を、基板表面または容器を含む標的に対して排出するための方法であって
該方法は、コロニーを位置決めする工程および集束されたエネルギーにより該細胞を排出する工程を包含し、該排出が、集束された音響エネルギーによるものであり、該1つ以上の細胞は、ゼロではない速度成分で排出され、ここで、該ゼロでない速度成分は、該集束された音響エネルギーによって該1つ以上の細胞に対して付与され、位置決めの実施はイオン検出、レーザー検出、内因性蛍光物質検出、光散乱検出および音響顕微鏡からなる群より選択される検出技術によるものである、方法。 - 前記位置決め工程が、前記培地表面の音響インピーダンスを測定することによりもたらされる、請求項35に記載の方法。
- 前記培地がゲルまたは半固体であり、該方法は、該培地表面に対して平行であり、かつ完全に前記細胞のコロニーの境界の下にある平面により横断される体積において、該培地を液化する工程をさらに包含する、請求項35または36に記載の方法。
- 培地の表面に位置する細胞のコロニーから細胞を排出するためのシステムであって、以下:
音響エネルギー源;
該音響エネルギー源からの音響エネルギーを集束点に集束するための手段;
該培地または該細胞のコロニーにおける任意の点に該集束点を位置決めするための手段、
を備え、ここで、該細胞は、該細胞を排出する一定量の音響エネルギーを送達するのに十分な動力によって、および該送達に十分な時間、該集束点に音響エネルギーを送達することにより排出され、該細胞は、ゼロではない速度成分で排出され、ここで、該ゼロでない速度成分は、該集束された音響エネルギーによって該細胞に対して付与される、システム。 - 前記音響エネルギー源、音響エネルギーを集束するための前記手段、および前記培地における任意の点に前記集束点を位置決めするための手段を統合し、前記細胞コロニーから選択された標的に該細胞を排出するためのプロセッサをさらに備える、請求項38に記載のシステム。
- 前記細胞のコロニーが、前記表面を横切る集束点をスキャンし、細胞のコロニーを有さない該表面の領域と異なる音響インピーダンスを有する表面の領域を検出することにより位置決めされる、請求項38に記載のシステム。
- 前記培地がゲルを含み、音響エネルギーが、該培地表面に対して平行であり、かつ完全に該細胞のコロニーの境界の下にある平面により横断される体積への該細胞の排出の前に、該培地のバルクにさらに送達される、請求項38または39に記載のシステム。
- 前記音響エネルギーが、前記体積の幾何学的中心で該体積に送達され、該幾何学的中心は、前記バルクにおける前記培地の表面の一定距離下に位置する、請求項41に記載のシステム。
- 前記体積の幾何学的中心は、前記バルクにおける前記培地の表面の約50〜約150μm下に位置する、請求項41に記載のシステム。
- 前記体積中の前記培地が、該体積の幾何学的中心から該培地の表面への排出の前に変化し、それによって、該変化が、前記細胞を排出する一定量の音響エネルギーを減少させる、請求項38に記載のシステム。
- 前記変化が液化であり、該液化は、前記体積の音響インピーダンスまたは音響減衰における変化を測定することにより検出される、請求項44に記載のシステム。
- 前記標的が、アレイ部位または流体チャネルである、請求項39に記載のシステム。
- 前記液化が、試薬の堆積、前記コロニーにおける前記細胞の特徴、または前記培地へのエネルギーの送達によって引き起こされる、請求項45に記載のシステム。
- 前記細胞のコロニーの測定可能な特性を測定する検出器をさらに備え、該検出器は、イオン検出、レーザー検出、内因性蛍光物質検出、光散乱検出および音響顕微鏡からなる群より選択される検出技術によるものであり、ここで、該1つ以上の測定可能な特性は、体積サイズ、音響密度、体積形状、内因性蛍光物質、細胞質の体積に対する核の体積の比率、細胞直径、時間にわたって積算した蛍光の強度、蛍光の閾値レベル、電磁波発光、電磁波吸収、核体積、細胞質体積、光学透過性、光学反射性、色、偏光、電気伝導性、キャパシタンス、インダクタンス、マイクロ波透過性、磁性、コロニーの存在および音響インピーダンスからなる群より選択される、請求項39に記載のシステム。
- 前記検出器による前記測定可能な特性の定量的測定または半定量的測定に基づき、前記コロニーからの前記細胞が、排出されないか、標的容器へと排出されるか、またはアレイ部位上に排出されるように選択される、請求項48に記載のシステム。
- 前記アレイ部位が、ウェルプレートウェルである、請求項49に記載のシステム。
- 前記標的容器が流体チャネルである、請求項49に記載のシステム。
- 前記標的容器へと排出される細胞が、該標的容器から引き続く標的容器または引き続くアレイ部位に排出され得る、請求項49または51に記載のシステム。
- 前記細胞が生存細胞である、請求項38、39、または49に記載のシステム。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US09/751,666 US20020064809A1 (en) | 2000-11-29 | 2000-12-28 | Focused acoustic ejection cell sorting system and method |
PCT/US2001/050753 WO2002054044A2 (en) | 2000-12-28 | 2001-12-28 | Focused acoustic ejection cell sorting system and method |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004530863A JP2004530863A (ja) | 2004-10-07 |
JP4309131B2 true JP4309131B2 (ja) | 2009-08-05 |
Family
ID=25022973
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002554696A Expired - Lifetime JP4309131B2 (ja) | 2000-12-28 | 2001-12-28 | 集束音響排出細胞分類システムおよび方法 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20020064809A1 (ja) |
EP (2) | EP1348116B1 (ja) |
JP (1) | JP4309131B2 (ja) |
AU (1) | AU2002231324A1 (ja) |
CA (1) | CA2433296C (ja) |
DK (1) | DK1348116T3 (ja) |
ES (1) | ES2551890T3 (ja) |
WO (1) | WO2002054044A2 (ja) |
Families Citing this family (53)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998034094A1 (en) | 1997-01-31 | 1998-08-06 | The Horticulture & Food Research Institute Of New Zealand Ltd. | Optical apparatus |
US6149867A (en) | 1997-12-31 | 2000-11-21 | Xy, Inc. | Sheath fluids and collection systems for sex-specific cytometer sorting of sperm |
US7208265B1 (en) | 1999-11-24 | 2007-04-24 | Xy, Inc. | Method of cryopreserving selected sperm cells |
AU2002237689B2 (en) | 2000-11-29 | 2008-01-10 | Xy, Llc. | System to separate frozen-thawed spermatozoa into X-chromosome bearing and Y-chromosome bearing populations |
US7713687B2 (en) | 2000-11-29 | 2010-05-11 | Xy, Inc. | System to separate frozen-thawed spermatozoa into x-chromosome bearing and y-chromosome bearing populations |
US6596239B2 (en) * | 2000-12-12 | 2003-07-22 | Edc Biosystems, Inc. | Acoustically mediated fluid transfer methods and uses thereof |
US6707038B2 (en) | 2001-02-14 | 2004-03-16 | Picoliter Inc. | Method and system using acoustic ejection for selective fluid deposition on a nonuniform sample surface |
US6855925B2 (en) | 2001-02-14 | 2005-02-15 | Picoliter Inc. | Methods, devices, and systems using acoustic ejection for depositing fluid droplets on a sample surface for analysis |
EP1366356B1 (en) | 2001-02-14 | 2010-07-21 | Picoliter, Inc. | Acoustic sample introduction for analysis and/or processing |
US6869551B2 (en) * | 2001-03-30 | 2005-03-22 | Picoliter Inc. | Precipitation of solid particles from droplets formed using focused acoustic energy |
DE10138072A1 (de) * | 2001-08-03 | 2003-02-27 | Fraunhofer Ges Forschung | Verfahren und Vorrichtung zum Bestimmen von Proteinen auf einem Reaktionsträger |
US6925856B1 (en) | 2001-11-07 | 2005-08-09 | Edc Biosystems, Inc. | Non-contact techniques for measuring viscosity and surface tension information of a liquid |
US7717544B2 (en) * | 2004-10-01 | 2010-05-18 | Labcyte Inc. | Method for acoustically ejecting a droplet of fluid from a reservoir by an acoustic fluid ejection apparatus |
US7354141B2 (en) * | 2001-12-04 | 2008-04-08 | Labcyte Inc. | Acoustic assessment of characteristics of a fluid relevant to acoustic ejection |
US6932097B2 (en) * | 2002-06-18 | 2005-08-23 | Picoliter Inc. | Acoustic control of the composition and/or volume of fluid in a reservoir |
US7405072B2 (en) * | 2002-07-18 | 2008-07-29 | Picoliter Inc. | Acoustic radiation for ejecting and monitoring pathogenic fluids |
EP2275533B9 (en) | 2002-08-01 | 2016-10-19 | Xy, Llc | Method of assessing sperm cells |
US8486618B2 (en) | 2002-08-01 | 2013-07-16 | Xy, Llc | Heterogeneous inseminate system |
WO2004017041A2 (en) | 2002-08-15 | 2004-02-26 | Xy, Inc. | High resolution flow cytometer |
US7169548B2 (en) | 2002-09-13 | 2007-01-30 | Xy, Inc. | Sperm cell processing and preservation systems |
US7190449B2 (en) * | 2002-10-28 | 2007-03-13 | Nanopoint, Inc. | Cell tray |
US7275807B2 (en) * | 2002-11-27 | 2007-10-02 | Edc Biosystems, Inc. | Wave guide with isolated coupling interface |
US7429359B2 (en) * | 2002-12-19 | 2008-09-30 | Edc Biosystems, Inc. | Source and target management system for high throughput transfer of liquids |
ES2561816T3 (es) | 2003-03-28 | 2016-03-01 | Inguran, Llc | Aparatos, métodos y procesos para clasificar partículas y para proporcionar esperma animal clasificado por sexo |
CA2566749C (en) | 2003-05-15 | 2017-02-21 | Xy, Inc. | Efficient haploid cell sorting for flow cytometer systems |
US7051654B2 (en) | 2003-05-30 | 2006-05-30 | Clemson University | Ink-jet printing of viable cells |
DE10358565B4 (de) * | 2003-12-15 | 2007-06-28 | P.A.L.M. Microlaser Technologies Ag | Aufnahmeelement zum Aufnehmen eines aus einer biologischen Masse mittels Laserstrahlung herausgelösten Objekts und Verfahren zur Gewinnung und Verarbeitung eines biologischen Objekts |
MXPA06011344A (es) | 2004-03-29 | 2006-12-15 | Monsanto Technology Llc | Suspensiones de espermatozoides para separar en poblaciones enriquecidas con cromosomas x o y. |
BRPI0513685A (pt) | 2004-07-22 | 2008-05-13 | Monsanto Technology Llc | processo para enriquecimento de uma população de células de esperma |
DE102006056694B4 (de) * | 2006-11-30 | 2010-08-05 | Advalytix Ag | Verfahren zum Durchführen einer enzymatischen Reaktion |
US20090061513A1 (en) * | 2007-05-15 | 2009-03-05 | Picovitro Ab | Cell sorting and cell cultivation methods |
US8165663B2 (en) * | 2007-10-03 | 2012-04-24 | The Invention Science Fund I, Llc | Vasculature and lymphatic system imaging and ablation |
US8285367B2 (en) | 2007-10-05 | 2012-10-09 | The Invention Science Fund I, Llc | Vasculature and lymphatic system imaging and ablation associated with a reservoir |
EP2197381B1 (en) * | 2007-10-03 | 2013-01-02 | The Invention Science Fund I, LLC | Vasculature and lymphatic system imaging and ablation |
US8285366B2 (en) | 2007-10-04 | 2012-10-09 | The Invention Science Fund I, Llc | Vasculature and lymphatic system imaging and ablation associated with a local bypass |
US9664619B2 (en) | 2008-04-28 | 2017-05-30 | President And Fellows Of Harvard College | Microfluidic device for storage and well-defined arrangement of droplets |
GB0820300D0 (en) * | 2008-11-06 | 2008-12-17 | Univ Dundee | Apparatus and method for the detection of cells |
EP2529213B1 (en) | 2010-01-26 | 2019-10-30 | Labcyte Inc. | Focus-activated acoustic ejection |
US10016757B2 (en) | 2011-04-28 | 2018-07-10 | Labcyte Inc. | Sample containers adapted for acoustic ejections and sample preservation and methods thereof |
ES2685638T3 (es) | 2011-07-26 | 2018-10-10 | The Curators Of The University Of Missouri | Carne comestible producida artificialmente |
WO2015038988A1 (en) | 2013-09-13 | 2015-03-19 | Modern Meadow, Inc. | Edible and animal-product-free microcarriers for engineered meat |
WO2015120174A1 (en) | 2014-02-05 | 2015-08-13 | Modern Meadow, Inc. | Dried food products formed from cultured muscle cells |
FR3031683B1 (fr) * | 2015-01-16 | 2017-02-17 | Commissariat Energie Atomique | Procede de formation d'un film compact de particules a la surface d'un liquide porteur |
ES2842501T5 (es) | 2015-09-21 | 2023-04-13 | Modern Meadow Inc | Materiales compuestos de tejido reforzados con fibras |
WO2017142896A1 (en) | 2016-02-15 | 2017-08-24 | Modern Meadow, Inc. | Method for making a biofabricated material containing collagen fibrils |
AU2018253595A1 (en) | 2017-11-13 | 2019-05-30 | Modern Meadow, Inc. | Biofabricated leather articles having zonal properties |
DE102017220792A1 (de) * | 2017-11-21 | 2019-05-23 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Verfahren und Vorrichtung zum Sortieren von Teilchen eines Materialstroms |
WO2020092407A1 (en) | 2018-10-29 | 2020-05-07 | Labcyte Inc. | Acoustic droplet ejection of non-newtonian fluids |
CA3121853A1 (en) | 2019-01-17 | 2020-07-23 | Modern Meadow, Inc. | Layered collagen materials and methods of making the same |
CA3127492C (en) * | 2019-02-01 | 2023-10-03 | Labcyte Inc. | Acoustic concentration, transfer and analysis of samples containing particles |
CN110765686B (zh) * | 2019-10-22 | 2020-09-11 | 中国人民解放军战略支援部队信息工程大学 | 利用有限波段海底地形进行船载声呐测深测线设计的方法 |
US20230256440A1 (en) | 2020-06-26 | 2023-08-17 | Hewlett-Packard Development Company, L.P. | Target particle ejection from recirculating fluid ejection channels |
CN117607006B (zh) * | 2024-01-23 | 2024-03-29 | 招金矿业股份有限公司 | 一种采矿迹地的土壤水力侵蚀检测容器 |
Family Cites Families (28)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2056426A (en) | 1932-05-31 | 1936-10-06 | Frantz Samuel Gibson | Magnetic separation method and means |
US3380584A (en) | 1965-06-04 | 1968-04-30 | Atomic Energy Commission Usa | Particle separator |
BE793185A (fr) | 1971-12-23 | 1973-04-16 | Atomic Energy Commission | Appareil pour analyser et trier rapidement des particules telles que des cellules biologiques |
JPS5319891A (en) | 1976-06-10 | 1978-02-23 | Coulter Electronics | Method and apparatus for folling drop formation and separation |
US4308547A (en) | 1978-04-13 | 1981-12-29 | Recognition Equipment Incorporated | Liquid drop emitter |
US4500707A (en) | 1980-02-29 | 1985-02-19 | University Patents, Inc. | Nucleosides useful in the preparation of polynucleotides |
JPH0535331Y2 (ja) * | 1985-04-11 | 1993-09-08 | ||
US4765737A (en) | 1987-03-30 | 1988-08-23 | Cornell Research Foundation | Cell size measurements using light in flow cytometry and cell sorting |
US5700637A (en) | 1988-05-03 | 1997-12-23 | Isis Innovation Limited | Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays |
GB8822228D0 (en) | 1988-09-21 | 1988-10-26 | Southern E M | Support-bound oligonucleotides |
JPH02168160A (ja) | 1988-12-22 | 1990-06-28 | Omron Tateisi Electron Co | 細胞選別装置 |
US5041849A (en) | 1989-12-26 | 1991-08-20 | Xerox Corporation | Multi-discrete-phase Fresnel acoustic lenses and their application to acoustic ink printing |
US6120735A (en) | 1992-02-26 | 2000-09-19 | The Ohio States University | Fractional cell sorter |
JP3488732B2 (ja) * | 1992-12-02 | 2004-01-19 | 株式会社日立製作所 | 超音波処理装置 |
WO1994027142A1 (de) * | 1993-05-19 | 1994-11-24 | Flueh Gerd | Verfahren und vorrichtung zum erkennen von fremdkörpern in viskosen oder flüssigen lebensmitteln mit stückigen inhaltsstoffen |
JPH07227394A (ja) * | 1994-02-21 | 1995-08-29 | Olympus Optical Co Ltd | 超音波診断治療システム |
US5798042A (en) | 1994-03-07 | 1998-08-25 | Regents Of The University Of California | Microfabricated filter with specially constructed channel walls, and containment well and capsule constructed with such filters |
JPH08254446A (ja) | 1995-03-16 | 1996-10-01 | Fujitsu Ltd | 超音波印字方法,超音波印字装置及び音響レンズの成形方法 |
GB9514335D0 (en) * | 1995-07-13 | 1995-09-13 | The Technology Partnership Plc | Solids and liquids supply |
NL1003595C2 (nl) * | 1996-04-10 | 1997-10-14 | Tno | Werkwijze en inrichting voor het karakteriseren van suspensies. |
US5932630A (en) * | 1996-05-02 | 1999-08-03 | Xerox Corporation | Ink compositions |
JP3296213B2 (ja) * | 1996-10-30 | 2002-06-24 | 三菱電機株式会社 | 液体エジェクタおよび液体エジェクタを用いる印刷装置 |
US6664044B1 (en) * | 1997-06-19 | 2003-12-16 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Method for conducting PCR protected from evaporation |
JP2000033712A (ja) * | 1997-09-30 | 2000-02-02 | Seiko Epson Corp | マイクロセンサーデバイス作成方法及びそれを用いた液体機能評価方法 |
JPH11201976A (ja) * | 1998-01-19 | 1999-07-30 | Toyota Motor Corp | 微量液体分注用液滴噴射装置 |
US6048699A (en) * | 1998-10-19 | 2000-04-11 | Motorola, Inc. | Method of fabricating bio-chip arrays |
JP2000229245A (ja) * | 1999-02-09 | 2000-08-22 | Seiko Epson Corp | マイクロ化学反応デバイス |
JP2000232873A (ja) * | 1999-02-17 | 2000-08-29 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 培養器に付着する細胞の分離装置および分離方法 |
-
2000
- 2000-12-28 US US09/751,666 patent/US20020064809A1/en not_active Abandoned
-
2001
- 2001-12-28 CA CA2433296A patent/CA2433296C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-12-28 AU AU2002231324A patent/AU2002231324A1/en not_active Abandoned
- 2001-12-28 ES ES01991599.0T patent/ES2551890T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-12-28 EP EP01991599.0A patent/EP1348116B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-12-28 WO PCT/US2001/050753 patent/WO2002054044A2/en active Application Filing
- 2001-12-28 DK DK01991599.0T patent/DK1348116T3/en active
- 2001-12-28 EP EP10180763.4A patent/EP2267429B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-12-28 JP JP2002554696A patent/JP4309131B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20020064809A1 (en) | 2002-05-30 |
EP1348116A2 (en) | 2003-10-01 |
CA2433296A1 (en) | 2002-07-11 |
AU2002231324A1 (en) | 2002-07-16 |
WO2002054044A2 (en) | 2002-07-11 |
EP2267429A1 (en) | 2010-12-29 |
WO2002054044A3 (en) | 2003-06-12 |
EP2267429B1 (en) | 2019-07-17 |
JP2004530863A (ja) | 2004-10-07 |
DK1348116T3 (en) | 2015-12-07 |
ES2551890T3 (es) | 2015-11-24 |
CA2433296C (en) | 2013-10-01 |
EP1348116B1 (en) | 2015-09-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4309131B2 (ja) | 集束音響排出細胞分類システムおよび方法 | |
US6849423B2 (en) | Focused acoustics for detection and sorting of fluid volumes | |
JP4434581B2 (ja) | キャリア流体からの空間的に指向された細胞の射出 | |
US6991917B2 (en) | Spatially directed ejection of cells from a carrier fluid | |
AU2002219959A1 (en) | Spatially directed ejection of cells from a carrier fluid | |
US8986944B2 (en) | Methods and compositions for separating rare cells from fluid samples | |
US9556485B2 (en) | Methods and compositions for detecting non-hematopoietic cells from a blood sample | |
EP2646830B1 (en) | Rapid screening of monoclonal antibodies | |
CN108432132A (zh) | 微流体颗粒操纵 | |
CN108823065B (zh) | 基于间歇式倾斜声表面波的微颗粒分选装置 | |
CA2462914A1 (en) | Methods, compositions, and automated systems for separating rare cells from fluid samples | |
US20220136949A1 (en) | Systems, articles, and methods for flowing particles | |
CN104830664A (zh) | 一种基于外置压电陶瓷驱动的微流体细胞分选系统 | |
Riba et al. | Technologies for Automated Single Cell Isolation | |
Mukherjee et al. | Isolation and Purification of Various Mammalian Cells: Single Cell Isolation |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040930 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070827 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20071114 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20071121 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080227 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20080227 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080530 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080825 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080901 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081128 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20081226 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090326 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090402 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090402 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090424 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090507 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4309131 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120515 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130515 Year of fee payment: 4 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130515 Year of fee payment: 4 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |