CN113198551A - 利用兰姆波谐振器检测生物分子的方法和微流控装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用兰姆波谐振器产生体声波的微流控系统对生物小物质进行富集和检测的方法。本发明还提供了基于所述方法用于对生物小物质进行富集和检测的设备或装置。本发明提供的方法和设备具有灵敏度高、检测时间短和操作简便的优点，适合用于小型化的即时检测。

Description

利用兰姆波谐振器检测生物分子的方法和微流控装置
本申请要求以下中国专利申请的优先权：2020年2月3日提交的、申 请号为202010078266.3、发明名称为“利用兰姆波谐振器检测生物分子的 方法和微流控装置”，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及细胞研究方法学与医疗器械领域。具体的，本发明涉及利 用兰姆波谐振器对生物分子进行检测的微流控设备和使用所述设备来检 测生物学物质的方法。
背景技术
在现代生物医学工程中，对微米尺度的细胞甚至更小的亚微米尺度的 生化大分子的操作和控制，是实现各类生物医学工程，如细胞成像、生物 分子富集、人工组织生成等的重要手段。近年来“芯片实验室(Lab on a Chip)”概念指出，未来微纳器件的发展趋势是多功能元器件在单一芯片 系统中的集成。基于微机电系统技术的兰姆波谐振器是进入21世纪后兴 起的一类新型压电声波器件。它继承了MEMS器件小型化、高制造效率等 优点，能够在同一硅片上同时制造出大量不同频率的器件。新型的MEMS压 电兰姆波谐振器作为滤波器、执行器、传感器等多种功能器件中的关键换 能元器件，在现代科技诸多领域，如通信工程、生物医学工程、微流控等 领域中发挥作用。
纳米材料，例如纳米粒子、纳米多孔膜等在分子提纯、药物分子的运 载与传输等面已经被广泛研究。纳米材料与蛋白质等生物分子的相互作用 机理研究相对清楚。现有技术中利用各种物理场直接地将目标生物分子聚 集在一个特定局部区域。使用纳米尺寸的颗粒材料作为载体，对复杂生物 样品中的生物目标分子(血液、唾液、尿液等)进行特异性的提纯，然后 对纳米尺寸的颗粒载体进行操作，从而实现了对目标生物分子的操作。例如，捕捉和限制纳米粒子以及分子，进而实现局部区域内的聚集，是超高 灵敏度生物传感器、新型药物传输方法等领域长期追求的目标。高速离心 被用来分离不同尺度的纳米粒子；介电泳技术也被也用来捕捉积累和组装 纳米粒子；磁镊和光镊技术都被用来操纵纳米粒子和生物分子。目前已有 的分子富集技术包括施加高电压的电泳技术、纳米流道辅助的分子富集和 纳米过滤膜实现分子筛选等。
然而这些技术受限于高电压(几百至几千伏特)、低通量和易阻塞等 缺点，需要在局部产生非常大的场强分布，对分子操作存在较大的局限性。 与此同时，直接使用物理场操作分子的特异性较差。
检测设备的便携化是现代科学仪器发展的一大趋势。便携式的生物传 感装置具有更为广泛的应用，例如家庭健康检测、人体健康指标实时检测、 以及医疗资源匮乏的偏远地区的诊断等。一般而言，便携式传感器具有体 积小、操作简单、快捷可靠、价格相对较低等特点。相应地，只有符合上 述特点的生物传感技术或者方式才有望率先被研发成为便携式生物传感 器。
因此，目前亟需一种更有效、更方便的对生物分子的富集和检测的方 法和系统。
发明内容
本发明提供了新的利用兰姆波谐振器产生体声波的微流控系统和纳 米尺寸的载体对生物物质进行富集和检测的方法。本发明还提供了通过所 述方法用于对生物物质进行富集和检测的基于微流控的检测设备。
具体的，本发明提供了检测样品中的靶物质的方法，所述方法包括：
(1)提供含有靶物质的样品；
(2)提供颗粒，优选为聚合物颗粒；
(3)在溶液中，将所述样品和颗粒在适于将所述靶物质结合到所述 颗粒上的条件下接触；
(4)通过以下步骤从所述样品聚集所述颗粒：
在微流控设备中处理含有所述颗粒的溶液，所述微流控设备包括；流 体通道，其具有入口和出口；一个或多个兰姆波谐振器，其设置于所述流 体通道的壁上，所述兰姆波谐振器的频率为约50-1000mHz，优选为约 200-500mHz，更优选为约300-400mHz；
所述兰姆波谐振器发射体声波，在溶液中产生旋流，颗粒在所述旋流 中聚集；当样品中存在靶物质时，聚集的颗粒结合了靶物质，即形成颗粒 -靶物质复合物；
(5)检测聚集的颗粒。
样品中存在靶物质时，聚集的颗粒结合了靶物质。可通过检测聚集的 颗粒或颗粒上的靶物质携带的可检测的标记。这些标记包括而不限于荧光 或其它形式的(例如化学发光，生物发光，辐射发光，电发光，电化学发 光，机械发光，结晶发光，热致发光，声致发光，磷光和光致发光等)发 光，酶促反应，放射性等。
本发明的方法中，在微流控设备中处理含有所述颗粒的溶液。所述微 流控设备包括；流体通道，其具有入口和出口；一个或多个兰姆波谐振器， 其设置于所述流体容器的壁上。
本发明的方法利用设置在流体通道底部上的兰姆波谐振器在溶液中发 射体声波。所述兰姆波谐振器设置为使得其振动方向与流道方向相同。对 具有叉指结构的底电极和顶电极的兰姆波谐振器而言，其底电极/顶电极 的平面位于流体通道底部，其指状电极平行排列方向与流道方向水平垂 直。所述兰姆波谐振器发射的体声波在所述兰姆波谐振器器件区域的溶液 中产生旋流。本发明的方法在溶液中产生的旋流中存在各种液流和其中的 粒子的相互作用。在合适的条件下(溶液和颗粒的性质、体声波的强度、 沟道的结构，溶液的流速等)，当流体中的颗粒受到的力达到一定的平衡 时，颗粒“停止”在旋流，由此达到富集颗粒的目的。
在本发明的方法中，所述兰姆波谐振器产生频率为约50-1000mHz的 振动，在溶液中引发相应频率的体声波。在本发明的其中一个方面，所述 兰姆波体声波谐振器为S0模式的兰姆波谐振器。S0模式在长波极限附近 几乎不存在色散，即相速度与厚度波长比几乎无关。这种模式的谐振器通 过设计横向的波长即可基本确定谐振频率。根据兰姆波S0的振动特性， 在谐振器的上表面，几乎是在水平面内的垂直于电极条方向上的振动，即 振动方向位于器件表面固液界面所在平面内，因此在器件表面的液体中产 生旋流。本发明采用的兰姆波谐振器可以在装置和液体的界面产生局部化 的声流，不需要耦合介质或结构的帮助。
在本发明的其中一个方面，所述兰姆波谐振器的电极排布方式可为： 仅有叉指顶电极、叉指顶电极加大片悬浮底电极、叉指顶电极加大片接地 等。在本发明的其中又一个方面，所述兰姆波谐振器的电极排布方式的顶 电极(top electrode，TE)和底电极(bottomelectrode，BE)都是叉指电 极，这种结构能够最大限度地利用e33从而引发振动模式最大的机电耦 合。在本发明的其中又一个方面，所述兰姆波谐振器的叉指电极交替地连 接信号(signal)与接地(ground)，而且每一对上下相对的电极条的连接 不同。
在本发明的其中一个方面，所述兰姆波谐振器的压电材料层为AlN。 对于表面平行于xy平面的AlN薄膜，只能激发各类兰姆波，而不能激发 出水平剪切波。
本发明的方法可用于检测样品中的生物物质。所述样品可以是含有靶 物质的培养液或其悬浮液或其上清、缓冲液，例如为各种病毒、细菌 或细胞的培养液或其悬浮液或其上清。有例如为各种动物如人的各种 体液，包括血液、组织液、细胞外液、淋巴液、脑脊液、房水、尿液、 汗液等。
本发明涉及的颗粒是通常用在生物技术中用于固定的任何固体载体颗 粒。其材料包括硅石、玻璃、无机载体例如金属纳米颗粒或氧化铝、有机 载体例如聚合物载体(例如聚苯乙烯)等。优选地，固体载体是聚合物颗 粒，特别是聚合物微粒。
微粒指直径基本在微米范围内(即10-6m)的颗粒。因此，根据本发明 的聚合物微粒通常具有大体在微米范围内的尺寸(即直径)，例如，约 0.01μm到约100μm，优选是约0.05μm到约20μm，更优选是约0.1μm到 约10μm。在本发明中，所述颗粒，特别是所述聚合物颗粒，基本上是球 形的。
本发明的颗粒优选是聚合物颗粒，即通过单体聚合而形成的颗粒。例 如，聚合物颗粒由乙烯聚合物(例如苯乙烯)、丙烯酸酯和/或甲基丙烯 酸酯的组合制备。该聚合材料可任选地进行交联，需要的交联剂(如共聚 单体)的适当量对技术人员来说是熟知的。优选地，所述聚合物是交联的 苯乙烯类聚合物或交联的(甲基)丙烯酸酯聚合物。所述聚合物还可以进 行胺化(例如，通过与乙二胺反应)等进行表面官能化。本发明的聚合物 颗粒可以是多孔的，具有更高的与生物物质结合的能力。
在本发明的其中一个方面，本发明的颗粒是非磁性的，即所述聚合物 颗粒不能够被磁场吸引。在现有技术中，通常采用磁性颗粒与目标分子结 合，然后通过磁场来吸引磁性颗粒，达到分离和富集的目的。但磁性颗粒 通常加工难度较大，成本较高，而且需要更复杂的系统进行操作。本发明 提供的方法和系统的其中一个特点即在于不需要通过具有磁性的颗粒，也 可以达到分离和富集靶分子的目的。磁性颗粒也可用于本发明。
本发明的颗粒，特别是聚合物颗粒可进行涂覆，由此达到具有可以用 于结合感兴趣的分子的官能团的聚合物颗粒表面。例如带有任何已知的表 面结构，例如羧基、甲苯磺酰基、氨基、环氧基团、马来酰胺基团、硫醇 基团等。其实现方法在本领域中是熟知的。
在本发明中，所述颗粒，特别是所述聚合物颗粒，基本上是非形变的。 非形变是指在，例如在溶液或流体中，微粒的表面不因相互接触和碰撞， 或是与容器等接触和碰撞时发生改变或明显改变。相对的，如细胞、脂 囊泡，脂质体等，则为形变物质。
在本发明的其中一个方面，通过所述颗粒作为固体载体，其上具有靶 生物物质的对应的结合配体(binding ligand)，然后，通过所述结合配偶 体与靶生物物质的特异性结合，可以选择性地将靶生物物质结合到颗粒 上。
“结合配体”是指能够与另一生物分子进行结合或相互作用(特别是特 异性结合或相互作用)的任何生物分子或其它有机分子。这种结合或相互 作用可称为“配体”结合或相互作用。例如，但不限于，抗体/抗原、抗体/ 半抗原、酶/底物、酶/抑制剂、酶/辅因子、结合蛋白/底物、载体蛋白/底 物、凝集素/碳水化合物、受体/激素、受体/效应物、或阻抑物/诱导物结合 或相互作用。
因此，本发明的颗粒上具有与靶物质(特异性)结合的配体，所述靶 物质和所述配体互为抗体/抗原、抗体/半抗原、酶/底物、酶/抑制剂、 酶/辅因子、结合蛋白/底物、载体蛋白/底物、凝集素/碳水化合物、受 体/激素、受体/效应物、或阻抑物/诱导物。可根据本发明的载体的所需 用途选择适合的配体。
可通过本领域已知的方法将所述配体结合到颗粒上。例如，通过还原 性胺化或通过使结合配体上的亲核基团与颗粒的聚合物上的活化酯侧链 例如N-羟基琥珀酰亚胺活化酯反应，可以实现直接结合。又例如，配体 和聚合物上的胺基团和羧酸基团可以通过常规的肽形成化学方法，例如使 用碳二亚胺连接。
本发明提供的方法的靶物质为生物物质，一般为具有特定结构的分子， 例如为肽、多肽、蛋白质、脂蛋白、糖蛋白、核酸(DNA、RNA、PNA、 适体(aptomer))以及核酸前体(核苷和核苷酸)、多糖、脂质例如脂 囊泡等。其中，蛋白质可包括细胞因子、激素、维生素、表面受体、半抗 原、抗原、抗体、酶、生长因子、重组蛋白质、毒素、以及其片段和组合。 所述生物物质通常具有纳米数量级或更小的尺寸。本发明的方法和系统的 其中一个优点是适合用于富集和检测大小为微米数量级，例如约0.05μm 到约5μm的颗粒。通过具有适当体积的颗粒作为载体与尺寸远小于所述 颗粒的生物小物质结合，能够有效地和方便的区分和检测各种纳米级或更 小的生物小物质。
本发明的方法还包括检测靶物质，例如通过检测富集结合了靶物质的 颗粒。可以通过各种已知的方法对生物物质进行检测，特别是可视性检测。 可以采用具有荧光或其它形式的(例如化学发光，生物发光，辐射发光， 电发光，电化学发光，机械发光，结晶发光，热致发光，声致发光，磷光 和光致发光等)发光，酶促反应，放射性等标记的特异配体(通常与颗 粒上具有的配体不同)去识别靶物质。例如，当靶物质是蛋白或酶时， 可以采用具有荧光或放射性同位素标记的抗体特异性识别所述蛋白或 酶，通过检测所述荧光或放射性同位素来检测靶物质。优选的，本发明 的颗粒通过荧光性进行检测。所述颗粒，特别是聚合物颗粒上具有可检测 的荧光基团，通过光学检测部件对富集的颗粒发出的荧光信号进行检测。 常见的用于标记的荧光基团包括荧光素染料(例如FAM、JOE和HEX)， 罗丹明染料(例如R6G、TAMRA、ROX)，和花青染料(例如Cy3、 Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7)等。
在本发明的其中一个方面，本发明的方法还可通过对颗粒的特征或标 记信号进行检测来检测富集结合了靶物质的颗粒，包括而不限于根据颗粒 的尺寸、分子重量、分子磁矩、折射率、电导率、电荷、吸光率、荧光性、 极性等物理性质。例如，可通过在颗粒，特别是聚合物颗粒上加入荧光或 放射性同位素标记。
本发明的方法可通过微流控设备实现。其中所述微流控设备包括流体 通道，其具有入口和出口，所述一个或多个兰姆波谐振器设置于所述流体 通道的壁(例如底部)上，将含有所述颗粒的溶液通入所述流体通道，所 述颗粒在体声波引起的旋流中聚集，由此达到将颗粒富集的目的。
在本发明的其中一个方面，步骤(4)中包括使含有颗粒和/或样品的 溶液进入流体通道，流经体声波引起的旋流，溶液中的颗粒停留在旋流中；
或者，(4)中包括将含有靶物质和/或颗粒的溶液通入微流道后，停 止溶液的输入，然后开启兰姆波谐振器产生体声波，使得溶液中的颗粒汇 集到体声波引起的旋流中。
本发明的方法可以通过不断通入溶液，使其流经体声波引起的旋流区 域，溶液中的颗粒停留在旋流，溶液和其中不需要的粒子则流出通道。本 发明的方法也可以将溶液通入微流道后，停止溶液的输入，经过一段时间， 使得进入微流道的溶液中的颗粒都被汇集到旋流中。由于分散在溶液中的 颗粒汇集到旋流中，达到了富集颗粒的作用。在颗粒携带可检测的信号 时，达到了富集信号，增强检测的灵敏度的目的。本发明的方法可以将溶 液中的颗粒/信号富集约102-104倍或更高。
在本发明的其中一个方面，所述微流控设备的流体通道的宽度为约50-1000μm，优选为约150-300μm，例如为约240μm。
在本发明的其中一个方面，所述微流控设备的流体通道的高度为约 50-300μm，优选为约70-150μm，例如为约90μm。
在本发明的方法中，可通过调节所述微流控设备的不同的参数(例如 体声波功率、溶液流速)来微调产生的旋流以聚集所述颗粒。
在本发明的其中一个方面，通过调节体声波的功率来进行所述微调。 所述微流控设备通过功率调节装置调节所述兰姆波谐振器产生的体声波 的功率。所述功率调节装置的输出功率为约50-1000μm，优选为约 150-300μm，例如为约240μm。在一定的参数范围内，功率越高，越适合 在旋流中快速聚集颗粒。
所述兰姆波谐振器产生的体声波由高频信号发生器的信号驱动。驱动 谐振器的脉冲电压信号可以用脉冲宽度调制驱动，脉冲宽度调制可以产生 任何期望的波形，例如正弦波、方波、锯齿波或三角波。脉冲电压信号也 可以具有调幅或调频开始/停止能力，以开始或消除体声波。
在本发明的其中一个方面，通过调节所述溶液流经流体通道的流速来 进行所述微调。所述微流控设备通过流速调节装置调节所述溶液的流速。 在本发明的其中又一个方面，所述流速为约0.1-10mm/s，优选为约 0.3-5mm/s，更优选为约0.5-2mm/s。在本发明的其中又一个方面，所述流 速为约0.1-20μL/min，优选为约0.1-10μL/min，更优选为约0.5-5μL/min。 一般情况下，更快的流速在一定时间内向旋流输送更多的目标颗粒。与此 同时，更高速度的流场，可能降低旋流对粒子的混合效率和减少被捕捉颗 粒的数目。
在本发明的其中一个方面，本发明的方法用于区分和检测样品中的多 种靶物质。在所述方法中，提供多种不同的颗粒，特别是聚合物颗粒，其 分别特异性结合所述多种不同的靶物质。
本发明的方法和系统是通过体声波在溶液中引起的旋流捕获和聚集颗 粒-靶物质复合物，在不同的参数下可以聚集不同性质的颗粒-靶物质复合 物，特别是不同尺寸的颗粒-靶物质复合物。通过在本发明的方法中采用 不同的颗粒来捕获不同的靶物质，然后通过微调影响捕获颗粒的各种参 数，达到分别区分或富集不同的靶物质。在本发明的其中一个方面，所 述多种不同的颗粒和/或多个靶细胞具有不同的可检测的特征或信号。所 述不同的颗粒-靶物质复合物可通过不同的方式或不同的信号进行检测。 例如通过标记不同的荧光信号。例如通过检测不同大小的颗粒。由此，本 发明的方法可以对同一个样品同时进行几种靶物质的检测，由此大大增加 检测的方便性，并且由于可以显著减少样品的需求量，解决了临床上，特 别是在使用小型化检测仪器、即时检测仪器时遇到的样品量不足的问题。
本发明还提供了用于从样品纯化靶物质的方法的微流控设备。在本发 明的其中一个方面，所述微流控设备用于实现前述本发明的用于从样品纯 化靶物质的方法。
在本发明的其中一个方面，所述微流控设备包括：
流体通道，其具有入口和出口；
一个或多个兰姆波谐振器，其设置于所述流体通道的壁上，所述兰姆 波谐振器的频率为约50-1000mHz，优选为约200-500mHz，更优选为约 300-400mHz；
功率调节装置，其调节所述兰姆波谐振器产生的体声波的功率；
流速调节装置，其调节所述溶液的流速，
所述兰姆波谐振器发射体声波，在溶液中产生旋流，颗粒在所述旋流 中聚集。
在本发明的其中一个方面，所述微流控设备的所述流体通道具有输入 样品的入口。在本发明的其中又一个方面，所述微流控设备的所述流体通 道具有输入颗粒的入口。所述输入样品的入口和所述输入颗粒的入口可以 相同或不同。所述颗粒，优选为聚合物颗粒，用于结合样品中的靶物质。
在本发明的其中一个方面，所述微流控设备的功率调节装置的输出功 率为约0.1-500mW，优选为约0.5-100mW，更优选为约5-60mW。
在本发明的其中一个方面，所述微流控设备的流速调节装置可调节所 述溶液的流速为约0.1-10mm/s，优选为约0.3-5mm/s，更优选为约 0.5-2mm/s。
在本发明的其中一个方面，所述微流控设备的流体通道的宽度为约50-1000μm，优选为约150-300μm，例如为约240μm。
在本发明的其中一个方面，所述微流控设备的流体通道的高度为约 50-300μm，优选为约70-150μm，例如为约90μm。
在本发明的其中一个方面，所述微流控设备的流速调节装置可调节所 述溶液的流速为约0.1-20μL/min，优选为约0.1-10μL/min，更优选为约 0.5-5μL/min。
在本发明的其中一个方面，所述兰姆波体声波谐振器为S0模式的兰 姆波谐振器。
在本发明的其中一个方面，所述兰姆波谐振器的电极排布方式可为： 仅有叉指顶电极、叉指顶电极加大片悬浮底电极、叉指顶电极加大片接地 等。在本发明的其中又一个方面，所述兰姆波谐振器的电极排布方式的顶 电极(top electrode，TE)和底电极(bottomelectrode，BE)都是叉指电 极。
在本发明的其中一个方面，所述兰姆波谐振器的压电材料层为AlN。
本发明还提供了用于检测样品中的靶物质的方法的试剂盒。在本发明 的其中一个方面，所述试剂盒可用于实现前述本发明的检测样品中的靶物 质的方法。在本发明的其中一个方面，所述试剂盒可用于前述本发明的微 流控设备。在本发明的其中一个方面，所述试剂盒可用于前述本发明的微 流控装置。
在本发明的其中一个方面，所述试剂盒包含多种不同的颗粒，优选为 聚合物颗粒，所述颗粒可结合样品中的多个靶物质。
在本发明的其中一个方面，所述试剂盒还包含一个或多个兰姆波谐振 器。所述兰姆波谐振器可设置在微流道装置的流体通道上，通过发射体声 波在溶液中产生旋流，颗粒在所述旋流中聚集。
在本发明的其中一个方面，所述试剂盒中的所述颗粒的尺寸为约 0.01μm到约100μm，优选是约0.05μm到约10μm，更优选是约0.1μm到 约5μm。
在本发明的其中一个方面，所述试剂盒中的所述多种不同的颗粒的尺 寸不同，例如所述多种不同的颗粒相互有约1-200％的区别，优选有约5-100％的区别，更优选有约10-50％的区别。
在本发明的其中一个方面，所述试剂盒中的所述颗粒为非磁性的。
在本发明的其中一个方面，所述试剂盒中的所述颗粒为非形变的。
在本发明的其中一个方面，所述试剂盒中的兰姆波体声波谐振器为 S0模式的兰姆波谐振器。
在本发明的其中一个方面，所述试剂盒中的兰姆波谐振器的电极排布 方式可为：仅有叉指顶电极、叉指顶电极加大片悬浮底电极、叉指顶电极 加大片接地等。在本发明的其中又一个方面，所述兰姆波谐振器的电极排 布方式的顶电极(top electrode，TE)和底电极(bottom electrode，BE) 都是叉指电极。
在本发明的其中一个方面，所述试剂盒中的兰姆波谐振器的压电材料 层为AlN。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对 实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见 地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员 来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的 附图。
图1示出本发明的方法和微流控设备中采用的示例性兰姆波体声波谐 振器的制备工艺和实物。图1(a-h)是示例性的兰姆波体声波谐振器的制 备工艺示意图：(a)形成空腔；(b)沉积磷硅酸盐玻璃(PSG)作为牺牲层； (c)硅片的表面平坦化；(d)沉积底电极；(e)沉积压电层；(f)沉积顶 电极；(g)刻蚀氮化铝层；(h)沉积金层和去除掉牺牲层。图1i是由扫描 电子显微镜拍摄的兰姆波器件俯视图和比例尺。
图2为本发明的方法和微流控设备的示例性应用的示意图：在微流 道底部设置兰姆波体声波谐振器；从微流道的入口通入功能化修饰的PS 微球、PSA(靶物质)，二抗(HRP标记的抗PSA抗体)；形成的微球-PSA 复合物被兰姆波体声波谐振器发生的体声波在溶液中产生的旋流“捕获” 和富集；以智能手机检测富集的PSA样品携带的信号。
图3显示示例性的本发明的方法和微流控设备的三维有限元法模拟结 果。图3(a)为俯视图，显示在压电纳米板器件上方产生四个尺寸相似的 方向相反的旋流(在流体通道方向上前后各两个对称的旋流)。图3(b) 为侧视立体图，显示进入流体通道的微粒被捕获并集中在流体通道方向上 游的两个旋流中。
图4显示本发明的方法和微流控设备对FITC标记的聚苯乙烯(PS) 微球的富集和检测。图4(a)显示谐振器未开时在流道内均匀分布的荧光 微球；图4(b)显示谐振器作用10分钟之后在流道内聚集的荧光微球； 图4(c)为对应的荧光强度随时间变化的曲线。
图5显示本发明的方法和微流控设备可以通过聚苯乙烯微粒作为载体 结合前列腺特异抗原(PSA)，然后通过体声波引起的涡旋富集和检测。 图5中左上角图显示当流速固定为1μL/min时，不同功率对应的化学发 光强度；图5中右上角图显示当功率固定为10mW时，不同流速对应的 化学发光强度；图5中左下角图显示在缓冲液中的前列腺特意抗原(PSA) 的检测响应曲线(c)，图5中右下角图对应的标准曲线(d)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本 发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描 述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。 基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提 下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的区间。
实施例1
微流体通道和兰姆波谐振器(Lamb Wave Resonator，LWR)制备：
基于CMOS兼容工艺的兰姆波谐振器的制造工艺
图1为该制造工艺的流程示意图。首先，通过反应性离子蚀刻来蚀 刻硅基板，并形成气腔(图1a)。之后，使用化学气相沉积(CVD)将 用作牺牲层的磷硅酸盐玻璃(PSG)沉积在基板上(图1b)。在通过化学 机械抛光(CMP)进行平坦化之后(图1c)，随后分步在基板上沉积底 部电极(200nm Mo膜)(图1d)，压电层(450nm AlN膜)(图1e)和 顶部电极(200nm Mo膜)(图1f)。然后，通过基于Cl2的等离子体蚀 刻和氢氧化钾湿蚀刻来蚀刻AlN膜(图1g)。之后，通过蒸发沉积Au， 并通过剥离部分去除Au，最终形成叉指结构的电极；通过将已加工的硅 片浸入稀释的氢氟酸溶液中来释放PSG(图1h)。由此制备得到谐振频 率为390MHz的兰姆波谐振器。谐振频率采用网络分析仪(Agilent， E5061B)测量。图1i展示了用扫描电子显微镜(SEM)拍摄的制备得到 的兰姆波谐振器的俯视图。
微流体通道制备
构建长度为60mm，高度为90μm，宽度为240μm的PDMS微流体 通道，其放置在CMR芯片上。PDMS微流体通道通过标准的软光刻技术 制造得到：将PDMS的预聚物和固化剂以10：1的比例混合；均匀混合并 在真空中脱气后，将混合物倒在模具晶片上，在85℃下固化1h。
底部设置兰姆波谐振器的微流体系统
将兰姆波谐振器用夹具固定在PDMS微通道芯片的底部中央位置，设 置为振动方向(即叉指电极的横向方向)和液流方向一致。
实施例2
在本实施例的具体实施过程中，提供了一种微流控设备，其可用于检 测样品中的颗粒-靶生物物质复合体。
本发明的方法涉及采用具有兰姆波体声波谐振器的微流控设备，将结 合了靶生物物质的颗粒汇聚到兰姆波谐振器发射的体声波在流体中产生 的旋流，实现对把生物物质和其上的可探测标记的富集和检测。图2为 本发明的方法和微流控设备的示例性应用的示意图。左侧图显示：在微流 控设备(未显示顶部)的微流道底部设置兰姆波体声波谐振器；从微流道 的入口通入用捕获抗体进行功能化修饰的PS微球、PSA(靶物质)，二 抗(HRP标记的抗PSA抗体)；形成的微球-PSA复合物被兰姆波体声波 谐振器发生的体声波在溶液中产生的旋流“捕获”和富集；右侧图显示： 以智能手机通过微流道上方的检测孔(对着微流道底部的设置兰姆波体声 波谐振器的位置)检测富集的PSA样品携带的信号。
在本发明的方法中，通过颗粒-靶物质的特异结合来区别和捕获靶物 质，同时利用与颗粒或靶物质携带的发光信号来进行检测。例如，可在在 颗粒表面形成特异性结合和标记靶物质的三明治结构：在三明治结构中， 捕捉配体可特异性识别和结合靶生物物质；捕捉配体事先被结合在颗粒表 面，当捕捉配体和颗粒在溶液中接触到靶物质，则可形成颗粒-靶物质复 合物，然后通过标记有荧光发光分子的检测配体与目标靶生物物质结合， 通过检测荧光发光分子释放的荧光信号，可检测和定量生物蛋白分子。在 某些情况下，荧光发光分子也可直接与目标靶生物物质结合。
在本发明的方法中，所述配体和靶物质可以是特异性结合的抗体/抗 原、抗体/半抗原、酶/底物、酶/抑制剂、酶/辅因子、结合蛋白/底物、载 体蛋白/底物、凝集素/碳水化合物、受体/激素、受体/效应物、或阻抑物/ 诱导物。在本发明的其中一个方面，所述靶物质是生物蛋白分子，配体 是识别和结合该生物蛋白分子的特异性抗体。所述抗体可采用荧光发光分 子标记。
本发明提供的微流控设备可以单独存在，也可以是一个微流控系统的 一部分，例如以可装卸的芯片形式存在。微流控系统或装置可用于容纳和 运输液体等流体材料，其流道尺寸在微米甚至纳米级别。典型的微流控系 统和设备通常包括毫米级或更小尺寸的结构和功能单位。
所述微流控设备的流体通道，或称为微流道，除了供流体进入和流出 的开口以外，一般是封闭的。流体通道的截面可以为各种形状，包括椭圆、 矩形、方形、三角形、圆形等。可以用各种已知的微制备技术来制备流体 通道，其材料包括但不限于硅石、硅、石英、玻璃或聚合材料(例如PDMS、 塑料等)。可以用涂层涂覆所述通道。涂层可改变通道的特性，并且可以 图案化。例如，涂层可以是亲水的，疏水的，磁性的，传导的，或生物性 功能化的。
本发明的方法利用设置在微流道底部的兰姆波体声波谐振器在谐振 器的上表面的溶液中产生旋流。溶液样品中的颗粒/颗粒-靶物质复合物进 入旋流后，在适当的条件(流速、谐振器输出电压等)下在旋流中“停留” 和富集，由此可被检测。
本实施例的微流控设备可在流体通道底部设置一个或多个所述兰姆 波体声波谐振器。在本发明的方法中，所述兰姆波体声波谐振器可产生频 率为约50-1000mHz的振动，在溶液中引发相应频率的体声波。在液体中， 在最边缘的电极条外侧，即AlN被刻蚀形成谐振腔的侧向边界处，谐振 器中激发的兰姆波部分地通过固液界面传入液体中，而并非完全被限制在 固体当中。这种侧向泄漏的声波引发液体声流体效应。这种声波传播形式 与SAW的声流体效应显著不同。谐振腔的边界振动作为液体中声波的声 源，可以被视为“线声源”，液体在谐振腔侧向边界附近的声波可被视作柱 面波。在本实施例中，所述兰姆波体声波谐振器为S0模式的兰姆波谐振 器。S0模式在长波极限附近几乎不存在色散，即相速度与厚度波长比几乎 无关。这种模式的谐振器通过设计横向的波长即可基本确定谐振频率。根据兰姆波S0的振动特性，在谐振器的上表面，几乎是在水平面内的垂直 于电极条方向上的振动，即振动方向位于器件表面固液界面所在平面内， 因此在器件表面的液体中产生旋流。本发明采用的兰姆波谐振器可以在装 置和液体的界面产生局部化的声流，不需要耦合介质或结构的帮助。
在本发明的其中一个方面，所述兰姆波谐振器的电极排布方式可为： 仅有叉指顶电极、叉指顶电极加大片悬浮底电极、叉指顶电极加大片接地 等。在本发明的其中又一个方面，所述兰姆波谐振器的电极排布方式的顶 电极(top electrode，TE)和底电极(bottomelectrode，BE)都是叉指电 极，这种结构能够最大限度地利用e33从而引发振动模式最大的机电耦 合。在本发明的其中又一个方面，所述兰姆波谐振器的叉指电极交替地连 接信号(signal)与接地(ground)，而且每一对上下相对的电极条的连接 不同。
本实施例的微流控设备包括液体注入和流速调节装置，用于控制液体 注入和/或控制液体的流速。在本发明的其中又一个方面，微流道中液体 的流速为约0.1-10mm/s，优选为约0.3-5mm/s，更优选为约0.5-2mm/s。在 本发明的其中又一个方面，微流道中液体的流速为约0.1-20μL/min，优选 为约0.1-10μL/min，更优选为约0.5-5μL/min。
所述微流控设备包括输入样品或含有样品的液体的入口。所述微流控 设备还包括输入含有颗粒的液体的入口。所述输入样品或含有样品的液体 的入口和所述输入含有颗粒的液体的入口可以为同一个入口。可以通过外 部压力源、内部压力源、电子动力学或磁场动力学方式来控制注入液体的 流速。外部压力源和内部压力源可以是泵，例如蠕动泵、注射泵或气动泵 等。在本发明的其中一个方面，可以通过用人工手动的方法方便地将样品 或含有样品的液体滴入微流道入口，例如通过滴管或移液器。
本发明的微流控设备还包括功率调节装置，其调节所述兰姆波谐振器 产生的体声波的功率。在本实施例中，所述功率调节装置为具有功率调节 功能的功率放大器。在本发明的其中一个方面，所述功率调节装置的输出 功率为0.1-100mW，优选为0.5-50mW，更优选为5-20mW。
本发明的微流控设备还可以包括检测设备，用于检测靶物质和/或颗 粒的特征的信号。这些特征可包括分子尺寸、分子重量、分子磁矩、折射 率、电导率、电荷、吸光率、荧光性、极性等物理性质。例如，检测设备 是光电检测器，其包括照明源和光学检测部件，用于检测电荷、吸光率、 荧光性等物理参数。在本发明的其中一个方面，所述靶物质的特征信号可 用人眼直接观察；所述微流控设备具有供人眼直接观察的观测窗或观测 孔。在本发明的其中一个方面，所述靶物质的特征信号可用相机(例如手 提电话的相机)记录；所述微流控设备具有供相机取像的观测窗或观测孔。
实施例3
材料和实验
本发明的方法涉及的颗粒-配体-靶物质的特异性结合。在本申请示例 性实施方式中，其中一种靶物质是前列腺特异性抗原(PSA)，其配体为 抗PSA抗体。分别用不同的荧光信号标记PSA或其抗体。
在本申请的实施例中，颗粒采用可商购的聚苯乙烯(PS)微球。对 PS微球用荧光基团或蛋白基团进行标记。
相关材料包括：
FITC标记的聚苯乙烯颗粒购自上海阿拉丁Aladdin Industrial Corporation(Shanghai,China)；
前列腺特异抗原(PSA)，捕获抗体(小鼠抗PSA抗体，一抗，Ab1) 和检测抗体(辣根过氧化物酶修饰的抗PSA抗体，二抗，Ab2)购自Linc-bio (上海)，其中捕获抗体和检测抗体均为单克隆抗体。
功能化的聚苯乙烯微球(PS-Ab1)的制备：将羧基官能化的PS微球 (25mg/mL)在装有PBS缓冲液(pH 7.4)的离心管中进行均匀混合后， 将试剂离心5分钟以除去上清液。然后，将微球用PBS缓冲液重悬，并 再次离心以除去上清液，重复两次。之后，将微球重悬于MES缓冲液， EDC(10mg/mL)和NHS(2.5mg/mL)中。将上述混合物在室温下轻 轻搅拌10分钟。羧基活化后，将混合物再次离心。用PBS缓冲液重新悬 浮PS微球，离心去除两次。再用PBS缓冲液溶解微球。将一抗(10μg/mL) 加入混合物中，反应10分钟。修饰一抗后，按照前述步骤重悬。牛血清 白蛋白(BSA)被用于使非特异性结合最小化。最后，将修饰的微粒 (PS-Ab1)悬浮在PBS缓冲液中，并保存在4℃下以备将来使用。。
通过射频(RF)信号发生器(MXG模拟信号发生器，Agilent，N5181A 100kHz-3GHz)RF源仪器激发谐振器；注射泵为购自New Era Pump Systems，Inc.的NE-1000，通过Teflon管(内径0.75mm)与微流道入口 连接。
所有实验均在室温下进行。
实施例4
采用COMSOL软件进行三维有限元法(3D finite element method，FEM) 对本发明的微流控设备和方法进行了模拟计算和分析。模拟参数：微流道 宽240微米，高90微米，颗粒尺寸2微米，流速1uL/min，功率10mW。
结果如图3所示。设置在微流道底部的兰姆波谐振器发射的体声波在 微流道底部表面产生，沿横向传播。在压电纳米板器件上方产生四个尺寸 相似的方向相反的旋流(在流体通道方向上前后各两个对称的旋流)(图3a)。兰姆波谐振器放置在微流体系统中，声波和其引起的旋流受到流道 的限制，进入的微粒被捕获并集中在流体通道方向上游的两个旋流中(图 3b)。模拟结果显示，被捕集的微粒数量随对兰姆波谐振器施加的功率和 流速的变化而变化。功率越高意味着捕获的微粒越多，流速越高，捕获的 微粒越少。
实施例5
利用FITC标记的聚苯乙烯(PS)微球(2μm)验证本发明的方法和 设备富集流体样品中的颗粒的效果。
通过与CCD相机(DP73)集成的显微镜(Olympus，BX53)记录实 验，并以每秒25帧的速度捕获。
将稀释的FITC标记的PS微球以1μL/min的流速导入微流体通道， 在未对兰姆波谐振器施加功率的时候，没有观察到荧光，如图4a所示。 当对兰姆波谐振器施加50mW的功率时，微粒立即被捕获在在流体通道 方向上上游的两个旋流中，与实施例4的理论分析和FEM模拟结果吻合。 另外，观察到在涡旋周围出现耗尽层(即颗粒减少的区域)，并且随着越 来越多的颗粒被“捕获”到旋流中，耗尽层变得更大。同时，旋流中的荧 光强度逐渐增加并最终达到饱和，如图4b所示。图4c给出了实时荧光 强度图，以直观地表征“捕获”到旋流中的颗粒的变化。
实施例6
将实施例3中记载或制备的PS-Ab1微球以及PSA样品，二抗 (Ab2-HRP)同时通过微流道的入口通入。注入混合物5分钟后，使用 PBS缓冲液清洁微流体。随后，将HRP反应底物添加到微流道，与被捕 获的微粒携带的HRP反应发出蓝光，通过Android智能手机的相机录像或 拍照，获得了与样品浓度相对应的光强变化。通过调整流速和对兰姆波谐 振器施加的功率来优化实验条件以获得最大微粒捕获量和最大生物分子 结合的增强。
通过智能手机对荧光信号进行拍照检测。采用PRO模式，曝光时间5s。采用软件Image J处理图片和计算光强。
实验结果如图5所示。当流速设为1μL/min时，尝试了四个不同的 施加功率值(5、10、20、50mW)，选取的最佳施加功率为10mW(图 5左上角图)。然后，尝试将施加功率设置为10mW，选择最佳流量(图 5右上角图)。实验结果显示，当施加的功率为10mW，流速为1μL/min时，获得了发光强度的最大值。
当检测系统采用施加的功率为10mW，流速为1μL/min的最佳条件 时，观察蓝光信号的梯度变化。对蓝光信号强度进行检测，发现其与样品 PSA浓度(从0.5ng/mL到10ng/mL)具有良好的线性关系(图5左下 角图)。同时，还发现蓝光信号强度与较低检出阈值(lowerdetection limit， 0.1ng/mL，S/N＝3)也具有良好的线性关系(图5右下角图)。
实验结果有力地证明了本发明的检测方法和微流控装置在高灵敏度 检测中的实用性。
虽然关于本发明的示例实施例及其优点已经详细说明，应当理解在不 脱离本发明的精神和所附权利要求限定的保护范围的情况下，可以对这些 实施例进行各种变化、替换和修改。对于其他例子，本领域的普通技术人 员应当容易理解在保持本发明保护范围内的同时，工艺步骤的次序可以变 化。
此外，本发明的应用范围不局限于说明书中描述的特定实施例的工 艺、机构、制造、物质组成、手段、方法及步骤。从本发明的公开内容， 作为本领域的普通技术人员将容易地理解，对于目前已存在或者以后即将 开发出的工艺、机构、制造、物质组成、手段、方法或步骤，其中它们执 行与本发明描述的对应实施例大体相同的功能或者获得大体相同的结果， 依照本发明可以对它们进行应用。因此，本发明所附权利要求旨在将这些 工艺、机构、制造、物质组成、手段、方法或步骤包含在其保护范围内。

Claims (10)

1.检测样品中的靶物质(优选的，所述靶物质是蛋白质、脂质、碳水化合物、核酸、适体、核苷、脂囊泡、病毒，更优选的，所述靶物质是肽、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、PNA、核苷酸或多糖)的方法，所述方法包括：
(1)提供含有靶物质的样品；
(2)提供颗粒，优选为聚合物颗粒；更优选的，所述颗粒上具有与靶物质结合的配体，例如所述靶物质和所述配体互为抗体/抗原、抗体/半抗原、酶/底物、酶/抑制剂、酶/辅因子、结合蛋白/底物、载体蛋白/底物、凝集素/碳水化合物、受体/激素、受体/效应物、或阻抑物/诱导物；
(3)在溶液中，将所述样品和颗粒在适于将所述靶物质结合到所述颗粒上的条件下接触；
(4)通过以下步骤从所述样品聚集所述颗粒：
在微流控设备中处理含有所述颗粒的溶液，所述微流控设备包括；流体通道，其具有入口和出口；一个或多个兰姆波谐振器(例如为S0模式的兰姆波谐振器)，其设置于所述流体通道的壁上，所述兰姆波谐振器的频率为约50-1000mHz，优选为约200-500mHz，更优选为约300-400mHz；
所述兰姆波谐振器发射体声波，在溶液中产生旋流，颗粒在所述旋流中聚集；
(5)检测聚集的颗粒，
优选的，其中步骤(5)为检测聚集的颗粒上可识别的标记，例如荧光或其它形式的(例如化学发光，生物发光，辐射发光，电发光，电化学发光，机械发光，结晶发光，热致发光，声致发光，磷光和光致发光等)发光，酶促反应，放射性等。
2.如权利要求1所述的方法，其中(4)中包括使含有所述颗粒和/或样品的溶液进入流体通道，流经兰姆波谐振器发射的体声波引起的旋流，溶液中的颗粒或颗粒-靶物质复合物停留在旋流中；
或者，(4)中包括将含有靶物质和/或颗粒的溶液通入微流道后，停止溶液的输入，然后开启兰姆波谐振器发射体声波并产生旋流，使得溶液中的颗粒或颗粒-靶物质复合物汇集到所述旋流中。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述颗粒的尺寸为约0.01μm到约100μm，优选是约0.05μm到约20μm，更优选是约0.1μm到约10μm。
4.权利要求1的方法，其中所述微流控设备通过功率调节装置调节所述兰姆波谐振器发射的体声波的功率，优选的，所述功率调节装置的输出功率为约0.1-500mW，优选为约0.5-100mW，更优选为约5-60mW。
5.权利要求1的方法，其中所述微流控设备通过流速调节装置调节所述溶液的流速，例如为约0.1-10mm/s，优选为约0.3-5mm/s，更优选为约0.5-2mm/s；
或者，其中所述微流控设备通过流速调节装置调节所述溶液的流速，例如为约0.1-20μL/min，优选为约0.1-10μL/min，更优选为约0.5-5μL/min。
6.权利要求1的方法，其中所述微流控设备的流体通道的高度为约50-300μm，优选为约70-150μm，例如为约90μm。
7.权利要求1的方法，其中所述兰姆波谐振器具有叉指结构的底电极/顶电极。
8.权利要求1的方法，其中所述兰姆波谐振器的压电材料层为AlN。
9.用于权利要求1-8中任一项的检测样品中的靶物质的方法的试剂盒，包括：
聚合物颗粒，所述颗粒可结合样品中的多个靶物质；
一个或多个兰姆波谐振器，其用于设置于微流控的流体通道的壁上，所述兰姆波谐振器的频率为约50-1000mHz，优选为约200-500mHz，更优选为约300-400mHz；
所述兰姆波谐振器发射体声波，可在溶液中产生旋流，所述颗粒在所述旋流中聚集。
10.用于权利要求1-8中任一项的检测样品中的靶物质的微流控设备，包括：
流体通道，其具有入口和出口；
一个或多个兰姆波谐振器，其设置于所述流体通道的壁上，所述兰姆波谐振器的频率为约50-1000mHz，优选为约200-500mHz，更优选为约300-400mHz；
功率调节装置，其调节所述兰姆波谐振器产生的体声波的功率；
流速调节装置，其调节所述溶液的流速，
所述兰姆波谐振器发射体声波，在溶液中产生旋流，颗粒在所述旋流中聚集。
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