JP2008292270A - 物質検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】第一流路および第一流路から分岐する少なくとも2つの分岐流路を有するマイクロチップにおいて物質を検出する方法。被検出物質と結合可能な部位を有する捕捉物質が内壁に固定化された第一流路内へ検体溶液を送液すること、ならびに、上記送液後の第一流路内へ、被検出物質と直接または間接に結合可能な第一物質を含む第一溶液、および第一物質と直接結合可能な第二物質を含む第二溶液を、異なる分岐流路から略同時に送液することを含み、第一物質および第二物質は、それぞれ他方の物質と結合可能な部位を2つ以上有し、上記第一溶液および第二溶液の送液中および/または送液後の第一流路において、被検出物質の検出を行う。
【選択図】なし
Description
R. Bakalova et al. J. Am. Chem. Soc. 2005年, 127巻, 9328-9329ページ. C. X. Luo et al. Lab Chip 2005年, 5巻, 726-729ページ.
非特許文献1に記載の技術等の従来の樹状増幅では、被検出物質を固定化した直線型流路に架橋剤と標識とを交互に送液していた。これに対し、本発明者らの検討の結果、Y字型マイクロ流路を用い、予めY字型マイクロ流路の主流路内に検出対象分子を固定化した上で、異なる分岐流路から二液を同時かつ連続的に送液することにより、検出対象物質上に樹状構造を形成できることが新たに見出された。この方法によれば二液を繰り返し送液する必要がなく簡便な操作により樹状構造を形成し信号を増幅することが可能となる。
本発明は、以上の知見に基づき完成された。
[1]第一流路および第一流路から分岐する少なくとも2つの分岐流路を有するマイクロチップにおいて物質を検出する方法であって、
被検出物質と結合可能な部位を有する捕捉物質が内壁に固定化された第一流路内へ検体溶液を送液すること、ならびに、
上記送液後の第一流路内へ、被検出物質と直接または間接に結合可能な第一物質を含む第一溶液、および第一物質と直接結合可能な第二物質を含む第二溶液を、異なる分岐流路から略同時に送液することを含み、
第一物質および第二物質は、それぞれ他方の物質と結合可能な部位を2つ以上有し、
上記第一溶液および第二溶液の送液中および/または送液後の第一流路において、被検出物質の検出を行う物質検出方法。
[2]検体溶液の送液中ならびに/または送液後かつ第一溶液および第二溶液の送液前に、被検出物質と結合可能な部位および第一物質と結合可能な部位を有する連結物質を含む溶液を第一流路内へ送液することを含む[1]に記載の物質検出方法。
[3]上記検体溶液の送液および連結物質含有溶液の送液は、検体溶液および連結物質含有溶液を、異なる分岐流路から第一流路内へ略同時に送液することによって行われる[2]に記載の物質検出方法。
[4]第一物質および第二物質の少なくとも一方は、他方の物質と結合可能な部位を3つ以上有する[1]〜[3]のいずれかに記載の物質検出方法。
[5]上記送液中、第一溶液および第二溶液はそれぞれ層流を形成する[1]〜[4]のいずれかに記載の物質検出方法。
[6]第一物質および/または第二物質は標識を含む[1]〜[5]のいずれかに記載の物質検出方法。
[7]上記被検出物質の検出は、第一溶液および第二溶液の送液中および/もしくは送液後の第一流路における標識の有無を観察することにより、ならびに/または、該流路において標識から得られるシグナルを測定することにより行われる[6]に記載の物質検出方法。
[8]被検出物質は生体分子である[1]〜[7]のいずれかに記載の物質検出方法。
[9]生体分子は蛋白質または核酸である[8]に記載の物質検出方法。
[10]捕捉物質は被検出物質に対する抗体である[9]に記載の物質検出方法。
[11]検体溶液の送液前に、第一流路へブロッキング溶液を送液することを更に含む[1]〜[10]のいずれかに記載の生体分子検出方法。
そこで、連続的に反応を行うために、被検出物質を固定化したマイクロ流路内に、二種の溶液を順次送液しマイクロ流路内で樹状構造を形成することが考えられる。しかし、本発明者らの検討の結果、一般的なマイクロ流路において架橋剤と標識を含む溶液を送液しても信号増幅効果を得ることができないことが判明した。本発明者らは、この理由について、架橋剤と標識を予め混合すると、ただちに巨大な複合体が形成され、被検出物質や後述する連結物質への結合が、立体障害により妨げられるからではないかと推定している。そのため一般的なマイクロ流路において被検出物質上に樹状構造を形成しようとすれば、二液の送液を順次繰り返す必要がある。しかし、この方法では、依然として作業効率の点で問題がある。
これに対し、本発明では、Y字型流路等の分岐流路と主流路を有するマイクロチップにおいて、被検出物質(検出対象物質)が固定化された主流路に、樹状構造を形成するための2種の物質を異なる分岐流路から略同時に送液する。これにより被検出物質上に樹状構造を形成できることが、本発明者らの検討の結果、新たに見出された。本発明の物質検出方法によれば、従来の樹状増幅のように二液と交互に接触させる必要がない。また、架橋剤と標識を連続的に反応させることができる。これにより、簡便かつ短時間での信号増幅が可能となる。
以下に、本発明の物質検出方法の詳細を説明する。
本発明の物質検出方法では、第一流路および第一流路から分岐する少なくとも2つの分岐流路を有するマイクロチップを使用する。2つの分岐流路を有するマイクロチップの概略図を図6に示す。なお、本発明の物質検出方法において使用可能なマイクロチップの詳細は後述する。
前記マイクロチップにおいて、第一流路内に検体溶液を送液する。あらかじめ目的物質(被検出物質)と結合可能な部位を有する捕捉物質を第一流路内壁に固定化しておくことにより、検体溶液に被検出物質が含まれる場合には、検体溶液中の被検出物質を捕捉物質を介して第一流路内壁に固定化することができる。
検出対象となる蛋白質としては、通常、酵素免疫法(ELISAまたはEIA)によって測定される抗原、抗体等の各種蛋白質を挙げることができる。一例としては、前立腺特異抗原(PSA)、breast cancer antigen 225 (BCA225)、HIV抗原・抗体、塩基性フェトプロテイン(BFP)、C-reactive protein(CRP)を挙げることができる。また、本発明の物質検出方法は、異常プリオン検出にも適用可能である。
脂質としては、例えば、脂肪酸、リン脂質、糖脂質、グリセリドなどを挙げることができる。
天然低分子としては、例えば、ホルモン分子や抗生物質、毒物、ビタミン類、生理活性物質、二次代謝産物などを挙げることができる。
合成低分子としては、例えば、天然低分子の合成物、およびそれら誘導体などを挙げることができる。
また、捕捉物質の固定化には、公知の固定化方法、例えば、エレクトロスプレーディポジション法、ピンタイプスポッター、インクジェット、マイクロコンタクトプリンティング(例えばQuist AP, Pavlovic E, Oscarsson S:Recent advances in microcontact printing. Anal Bioanal. Chem. 381:591-600,2005参照)、マイクロチャンネルを用いた固定法(例えばCesaro-Tadic S, Dernick G, Juncker D,Buurman G, Kropshofer H, Michel B, Fattinger C, Delamarche E:High-sensitivity miniaturized immunoassays for tumor necrosis factor alphausing microfluidic systems.. Lab Chip 4:563-569,2004参照)などの公知の固定化方法を用いることもできる。
方法Iでは、被検出物質と間接に結合可能な第一物質を使用する。方法Iでは、被検出物質と第一物質を結合するために、被検出物質と結合可能な部位および第一物質と結合可能な部位を有する連結物質を含む溶液を、検体溶液の送液中ならびに/または送液後かつ第一溶液および第二溶液の送液前に、第一流路内へ送液する。連結物質含有溶液の送液は、分岐流路の1つのみから行ってもよく、複数の分岐流路から行ってもよい。また、検体溶液と連結物質含有溶液を異なる分岐流路から第一流路内へ略同時に送液することもできる。
アビジンは、ビオチン化抗体およびビオチン化抗アビジン抗体と、アビジン−ビオチン反応により結合可能である。よって、ビオチン化抗体上にアビジンとビオチン化抗アビジン抗体が複数連結した複合体を形成することができる(図7(c)参照)。こうして被検出物質上に樹状構造を形成することができる。
方法IIでは、被検出物質と直接結合可能な第一物質を使用する。本発明において、「直接結合可能」とは、被結合物質と結合可能な部位を有することを意味する。これに対し、「間接に結合可能」とは、被結合物質と他の物質を介して結合可能であることを意味する。また、「結合可能な部位」とは、他の物質を介することなく被結合物質と結合し得る部位をいうものとする。方法IIでは、前述の連結物質を使用することなく被検出物質上に第一物質と第二物質が複数結合することにより形成される複合体(樹状構造)を形成することができる。
管内を流れる流体の流れは、乱流(非定常的な流れ)と層流(定常的な流れ)に大別される。層流では流れの方向は送液方向に限定されるため異なる分岐流路から導入された第一溶液と第二溶液は、両溶液の境界でのみ接することとなる。よって、少なくともこの境界部分に被検出物質を固定化すれば、両物質を被検出物質上に略同時に到達させることができる。また、第一流路内壁全面に被検出物質が固定化されている場合、2液が層流を形成して第一流路内に導入されれば、両溶液の界面でのみ第一物質と第二物質の連続的結合(樹状構造形成)が生じる。これにより、第一流路内において、2液の界面に沿った直線状に、被検出物質を介して樹状構造を固定化することができる。このように第一流路内に選択的に樹状構造を固定化できれば、被検出物質の有無を顕微鏡観察等により容易に判定することができる。更に樹状構造が選択的に固定化された部分においてシグナルの読み取りを行うことにより、高精度な定量を行うことが可能となる。よって、本発明の物質検出方法では、第一溶液と第二溶液の送液は、両溶液の流れが、少なくとも被検出物質上に到達するまでは層流となるように行うことが好ましい。また、検体溶液と連結物質含有溶液を異なる分岐流路から第一流路内へ略同時に送液する場合にも、両液体の流れが、少なくとも被検出物質上に到達するまでは層流となるように行うことが好ましい。
層流と乱流は、下記式によって定義されるレイノルズ数Re(Reynolds number)により規定されることが知られている。
本発明の物質検出方法では、第一流路および第一流路から分岐する少なくとも2つの分岐流路を有するマイクロチップを用いる。本発明において、「マイクロチップ」とは、平板状の基板上に、太さ数μm〜数百μm程度の微細なマイクロ流路を集積化したものを意味する。
(1)所定の形状に形成されたマイクロチャネルと、前記マイクロチャネル内に液体を導入するために外部に開口する複数のポートとを有し、前記マイクロチャネルの全体または一部を高分子材料により形成し、前記高分子材料を脱気したことを特徴とするマイクロ流体制御機構を有するマイクロチップ;
(2)所定の形状に形成されたマイクロチャネルと、前記マイクロチャネルの複数の端部のうちの所定の端部側に連接され、前記マイクロチャネルの内部とのみ連通し外部に対して遮蔽された内部空間を有する減圧室と、前記マイクロチャネルの複数の端部のうちの前記減圧室が連接された端部を除いた残余の端部それぞれに形成され、前記マイクロチャネル内に液体を導入するために外部に開口する複数のポートとを有し、前記マイクロチャネルまたは前記減圧室のそれぞれの全体または一部のうちの少なくともいずれかを高分子材料により形成し、前記高分子材料を脱気したことを特徴とするマイクロ流体制御機構を有するマイクロチップ;
(3)一方の端部に複数の導入用流路が連接され、他方の端部が減圧室に連接された混合用流路と、前記複数の導入用流路それぞれの前記混合用流路と連通する側の端部とは異なる端部側に形成され、前記導入用流路内に液体を導入するために外部に開口する複数のポートと、前記減圧室の内部空間を、前記混合用流路の内部とのみ連通させ外部に対して遮蔽する封止手段とを有し、前記封止手段、前記減圧室または前記混合用流路のそれぞれの全体または一部のうちの少なくともいずれかを高分子材料により形成し、前記高分子材料を脱気したことを特徴とするマイクロ流体制御機構を有するマイクロチップ。
まず、図2には、マイクロ流体制御機構を有するマイクロチップの概略構成上面説明図を示す。図3(a)には、図2に示すマイクロチップのA−A線による断面図(概略構成縦断面図)が示されており、図3(b)には、図2に示すマイクロチップのB−B線による断面図(概略構成縦断面図)が示されている。
ここで、マイクロチップ10は、第1の板状部材12と、第2の板状部材14と、第1の板状部材12に配置された封止手段としての被覆部材16とを有して構成されている。
そして、第1の板状部材12には、マイクロチャネルとして、上面から見てY字型状の一連の流路を構成するマイクロチャネル20が形成されている。このマイクロチャネル20は、上面から見て直線状に延長するマイクロ流路たる混合用流路22と、混合用流路22の一方の端部22aが二股に分岐されて形成されたマイクロ流路たる第1導入用流路24ならびに第2導入用流路26とを有するものである。ここで、混合用流路22、第1導入用流路24ならびに第2導入用流路26は、第1の板状部材12の下面12b側が開口した溝状に形成されており、その下面12b側の開口面は、第2の板状部材14により遮蔽されている。
また、第1導入用流路24の一方の端部24a、即ち、混合用流路22の端部22a側とは異なる側の端部は、第1の板状部材12の上面12aに形成された試料や試薬などの液体を導入するために外部に開口している開口部たる第1サンプル用ポート30と連通している。一方、第2導入用流路26の一方の端部26a、即ち、混合用流路22の端部22a側とは異なる側の端部は、第1の板状部材12の上面12a側に形成された試料や試薬などの液体を導入するために外部に開口している開口部たる第2サンプル用ポート32と連通している。
従って、第1導入用流路24の端部24aならびに第2導入用流路26の端部26aは、大気に開放されていることになる。一方、第1導入用流路24の他方の端部24bと第2導入用流路26の端部26bとは、混合用流路22の一方の端部22aと連通している。
そして、混合用流路22の他方の端部22b、即ち、第1導入用流路24ならびに第2導入用流路26と連通する側とは異なる側の端部は、減圧室40の側方開口部40aと連通している、即ち、混合用流路22の一方の端部22aには、第1導入用流路24ならびに第2導入用流路26の複数の導入用流路が連接されており、他方の端部22bには、減圧室40が連接されている。この減圧室40は、第1の板状部材12の上面12aにおいて、略円形形状の上方開口部40bで開口するとともに、下面12b側において略円形形状の開口部で開口する円筒状に形成されており、その下面12b側の開口部は第2の板状部材14により遮蔽されている。
一方、減圧室40の上方開口部40bには、封止手段たる被覆部材16が配設されており、被覆部材16によって上方開口部40bは封止されている。これにより、減圧室40の内部空間40cは、混合用流路22の内部とのみ連通し、外部に対しては遮蔽されている。即ち、混合用流路22の他方の端部22bは、減圧室40の内部空間40cには開放されているが、大気には開放されていない。
例えば、高分子材料の1つであるゴムは、固体のミクロ構造がかなり疎であり、かつ固体分子の運動自由度が相当に大であるので、気体が固体中に入り込み易く、非常に多くの気体が溶解する固体材料である。このように非常に多くの気体が溶解可能な固体材料であるゴムなどの高分子材料によって、第1の板状部材12、第2の板状部材14、および被覆部材16を形成するとよい。
なお、この実施の形態において、マイクロチップ10を構成する第1の板状部材12、第2の板状部材14、および被覆材料16の材料として、ゴム、具体的にはポリジメチルシロキサン(以下、「PDMS」ともいう)などのシリコーンゴムを用いることができる。
C:固体中の気体濃度(cm3(STP)/cm3)
(1cm3の固体に溶けている気体の量を、標準状態での体積に換算したもの)
P:固体に接触する気体の圧力(atm)
S:溶解度係数(cm3(STP)/(cm3atm))
とするヘンリーの法則
C=SP
により、PDMSの空気に対する溶解度係数を算出することができる。温度35℃、空気を窒素80%、酸素20%とすると、PDMSの空気に対する溶解度は、S=0.11cm3(STP)/(cm3atm)となる。ただし、このPDMSの空気に対する溶解度係数Sは、PDMSの重合度などに依存するものである。
ただし、本発明の物質検出方法では、送液機構として、吸引ポンプまたは加圧ポンプを用いるマイクロチップを用いることもできる。そのようなマイクロチップの詳細については、例えば特開2002−243734号公報、特開2007−101221号公報等を参照できる。
本発明の物質検出方法では、第一溶液および第二物質の送液中および/または送液後の第一流路において、被検出物質の検出を行う。
検出方法としては、標識を利用する検出方法、例えば蛍光法、化学発光法、顕微鏡法等を挙げることができる。標識を利用する場合、第一物質および第二物質のいずれか一方に標識を導入すればよい。第一物質および第二物質のいずれか一方に標識が導入されていれば、樹状構造形成により被検出物質上に複数の標識を堆積させることができ、これにより信号増幅が可能となる。
Y字型流路を有するマイクロチップおよび比較用マイクロチップとして直線型(I字型)流路を有するマイクロチップを用意した。両マイクロチップの概略図を図9に示す。
比較用マイクロチップは、30×20×2mmのPDMS部品と76×26×1mmのガラス板からなり,4本のI字型流路(図9A参照)を備えていた。
Y字型流路を有するマイクロチップは、主流路と主流路から分岐する二本の流路を備えていた(図9B参照)。
両マイクロチップとも、Hosokawa, K.; Omata, M.; Sato, K.; Maeda, M. Lab Chip 2006, 6, 236-241.に記載の方法により作製した。まずPDMS成型に用いるための反転型を、シリコンウエハーの上に、超厚膜フォトレジスト(SU-8 25, MicroChem, Newton, MA)を用いて製作した。反転型の表面を不活性化するため,プラズマエッチング装置(RIE-10NR, Samco International, Kyoto, Japan).の中でCHF3プラズマ処理した.反転型の上に型枠を取り付け,PDMSプレポリマー溶液(Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI)を注ぎ込んだ。PDMSを硬化させた後、反転型から剥がし取り、金属製のパイプを使ってリザーバとなる穴を開けた。流路入り口を開口するため、PDMS部品をナイフで切った。PDMS部品を顕微鏡用スライドガラス(S1112, Matsunanmi Glass, Osaka, Japan)に可逆的に接合した。露出したガラス表面を疎水化するため,プラズマエッチング装置の中で10 秒間CHF3プラズマ処理した。
精製済みヒトCRP(CHEMICON International, Temecula, CA)を、CRP抜きヒト血清(HyTest, Turku, Finland)で順次希釈することにより、20 nM、0.20 nM、2.0 pMを含む検体溶液を調製した。ブランク試料溶液として、CRP抜きヒト血清を用いた。捕捉物質(1次抗体)として、0.50 mg/mLのウサギ抗ヒトCRP抗体(anti-CRP, Dako Cytomation, Glostrup, Denmark)溶液をリン酸バッファー(PBS, pH 7.5, Cambrex Bioscience, Walkersville, MD)で調製した。連結物質(2次抗体)として、100 または 75 μg/mLのビオチン化ヒツジ抗ヒトCRP抗体(B-anti-CRP, R&D Systems, Minneapolis, MN)溶液を、1%ウシ血清アルブミン(BSA, Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)を含むPBSで調製した。第一物質(第一の増幅用試薬)として、100 または 75 μg/mLのFITC標識ストレプトアビジン(F-SA, Sigma, St. Louis, MO)溶液を、1% BSAを含むPBSで調製した。第二物質(第二の増幅用試薬)として、100 または 75 μg/mLのビオチン化ウサギ抗ストレプトアビジン抗体(B-anti-SA, Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA)溶液を、1% BSAを含むPBSで調製した。ブロッキング剤として、0.1%の市販試薬(Blocking Reagent #1096176, Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)と1% BSA 混合溶液をPBSで調製した。
なお、上記ストレプトアビジンは、1分子あたり、ビオチンに対して4つの結合部位を有する。またビオチン化抗体には1分子あたり10個程度のビオチンが導入されている。
それぞれの溶液をマイクロ流路に注入する際には、Hosokawa, K.; Omata, M.; Sato, K.; Maeda, M. Lab Chip 2006, 6, 236-241.に記載の無動力逐次注入法を用いた。まずマイクロチップを真空デシケーターに入れ、10 kPaで1時間脱気した。真空デシケーターから取り出した後、すぐにPDMS上面に粘着テープを貼った。マイクロチップを倒立型蛍光顕微鏡(TE2000-U, Nikon, Tokyo, Japan)のステージにのせた。マイクロピペットを使って、注入すべき溶液0.5-3.0 μLを流路入り口に滴下した。実験は室温で行った。全ての実験は新しい流路を使って行った。
比較用マイクロチップを用いた検出では、以下の溶液を逐次注入した。(1) 0.50 mg/mLのanti-CRPを0.5 μL、(2) ブロッキング剤を0.5 μL、(3) 0-2.3 μg/mL (0-20 nM) のCRP 試料を1.0 μL、(4) 100 μg/mL のB-anti-CRP を0.5 μL、(5) 100 μg/mL のF-SA を0.5 μL、(6) 100 μg/mL のB-anti-SA を0.5 μL、(7) 100 μg/mL のF-SA を0.5 μL、(8) 100 μg/mL のB-anti-SA を0.5 μL、(9) 100 μg/mL のF-SA を0.5 μL、(10) 1% BSAを0.5 μL。
上記(6), (8), および(10)の溶液の送液中、蛍光画像を撮影し、蛍光強度を測定した。それぞれ図1に示す態様の1層目、2層目、3層目F-SAが発する信号に相当する。
Y字型流路を有するマイクロチップを用いた検出では、両分岐流路から0.50 mg/mLのanti-CRPを0.5 μL送液し、次いで両分岐流路からブロッキング剤を0.5 μL送液した。その後、左側の分岐流路から0-2.3 μg/mL (0-20 nM) のCRP 試料を0.5 μL、右側の分岐流路から75 μg/mL のB-anti-CRP を0.5 μL、主流路に向かって同時に送液した。次いで、左側の分岐流路から75 μg/mL のF-SA を3.0 μL、右側の分岐流路から75 μg/mLのB-anti-SA を3.0 μL、主流路に向かって同時に送液した。F-SAおよびB-anti-SAの溶液が流れている間、蛍光画像を撮影した。
上記1−3.に記載の通り、蛍光顕微鏡を用いて蛍光画像を撮影した。蛍光顕微鏡は、100 Wの高圧水銀ランプ、フィルタブロック(励起465-495 nm, 吸収515-555 nm)、10倍対物レンズ(開口数 0.3)、冷却CCDカメラ(C5958, Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan)を備えていた。CCDカメラの露光時間(Tで表す)は、予測される蛍光強度に合わせて最適な撮影条件となるように、0.1から3.0 秒の間で変化させた。得られた画像のマイクロ流路の中と外のグレイスケール値(それぞれGとG0で表す)を、画像解析ソフトウエア(ImageJ 1.28u, National Institutes of Health)で測定した。信号強度 I を、次式によって規格化した。
I = (G - G0) / T.
I = d + (a - d) / [1 + (x / c)b].
ここで x は分析種濃度であり,a, b, c, d は回帰パラメータである.これらのパラメータはグラフ作成ソフトウエア(KaleidaGraph ver. 3.51, Synergy Software, Reading, PA)を用いて最適化した。そのアルゴリズムは、各データの分散の逆数を重みとした、重み付き最小二乗非線形回帰である。得られた回帰関数から、検出限界を次の定義に従って計算した。すなわち、検出限界はある I を与える x であり、その I とは、ブランク試料に相当する値(つまり a)から、ブランク試料で得られた実測信号の標準偏差の3倍だけ離れた値である。
前述のY字型流路について、以下の方法によりレイノルズ数を試算した。
一方の分岐流路と主流路を合わせた流路の寸法(すなわち分岐流路から主流路へ送液される溶液の移動距離)lは10-3m、送液中の第一溶液および第二溶液の流速uは10-3m/sであった。ここで流体の密度および粘度として純水の密度および粘度(ρ=103kg/m3、μ=10-3Pa・sを)用いて前述の式からレイノルズ数を試算すると、Re=1となり、臨界レイノルズ数を3桁も下回る値であった。この試算から、前述のY字型流路を有するマイクロチップにおいて、第一溶液および第二溶液の流れが層流であったことが確認された。
第一物質(第一の増幅用試薬)として、200μg/mLのFITC標識ストレプトアビジン(F-SA, Sigma, St. Louis, MO)溶液を、1% BSAを含むPBSで調製した。第二物質(第二の増幅用試薬)として、200μg/mLのビオチン化ウサギ抗ストレプトアビジン抗体(B-anti-SA, Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA)溶液を、1% BSAを含むPBSで調製した。両溶液をそれぞれ1.5μl採取して混合し、第一物質および第二物質を含む混合溶液を調製した。
前述の比較用マイクロチップを用いて、第一溶液および第二溶液を順次送液する代わりに、調製した混合溶液1.5μlを送液した以外は上記1−3.と同様の操作を行った。
上記2−2.の操作を行ったマイクロチップについて、前述の1−4.と同様の方法で蛍光強度の測定を行った。前述の1−3.において(6), (8), および(10)の溶液の送液中の蛍光画像から測定した蛍光強度とともに結果を図14に示す。
図14に示すように、第一溶液と第二溶液を予め混合した後にマイクロ流路内に送液する方法では、ブランクと同程度の蛍光強度となり信号増幅を行うことはできなかった。これにより、予め第一物質と第二物質の複合体を形成し、この複合体を被検出物質と結合させることは困難であることが確認された。これに対し、先に示したように異なる分岐流路から2種の溶液を連続的に送液する方法によれば、信号を増幅し検出度を顕著に向上させることができる。
Claims (11)
- 第一流路および第一流路から分岐する少なくとも2つの分岐流路を有するマイクロチップにおいて物質を検出する方法であって、
被検出物質と結合可能な部位を有する捕捉物質が内壁に固定化された第一流路内へ検体溶液を送液すること、ならびに、
上記送液後の第一流路内へ、被検出物質と直接または間接に結合可能な第一物質を含む第一溶液、および第一物質と直接結合可能な第二物質を含む第二溶液を、異なる分岐流路から略同時に送液することを含み、
第一物質および第二物質は、それぞれ他方の物質と結合可能な部位を2つ以上有し、
上記第一溶液および第二溶液の送液中および/または送液後の第一流路において、被検出物質の検出を行う物質検出方法。 - 検体溶液の送液中ならびに/または送液後かつ第一溶液および第二溶液の送液前に、被検出物質と結合可能な部位および第一物質と結合可能な部位を有する連結物質を含む溶液を第一流路内へ送液することを含む請求項1に記載の物質検出方法。
- 上記検体溶液の送液および連結物質含有溶液の送液は、検体溶液および連結物質含有溶液を、異なる分岐流路から第一流路内へ略同時に送液することによって行われる請求項2に記載の物質検出方法。
- 第一物質および第二物質の少なくとも一方は、他方の物質と結合可能な部位を3つ以上有する請求項1〜3のいずれか1項に記載の物質検出方法。
- 上記送液中、第一溶液および第二溶液はそれぞれ層流を形成する請求項1〜4のいずれか1項に記載の物質検出方法。
- 第一物質および/または第二物質は標識を含む請求項1〜5のいずれか1項に記載の物質検出方法。
- 上記被検出物質の検出は、第一溶液および第二溶液の送液中および/もしくは送液後の第一流路における標識の有無を観察することにより、ならびに/または、該流路において標識から得られるシグナルを測定することにより行われる請求項6に記載の物質検出方法。
- 被検出物質は生体分子である請求項1〜7のいずれか1項に記載の物質検出方法。
- 生体分子は蛋白質または核酸である請求項8に記載の物質検出方法。
- 捕捉物質は被検出物質に対する抗体である請求項9に記載の物質検出方法。
- 検体溶液の送液前に、第一流路へブロッキング溶液を送液することを更に含む請求項1〜10のいずれか1項に記載の生体分子検出方法。
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