CN108588018A - 一种靶向循环肿瘤细胞CTCs的功能红细胞 - Google Patents

一种靶向循环肿瘤细胞CTCs的功能红细胞 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种靶向循环肿瘤细胞CTCs的功能红细胞，属于红细胞修饰与循环肿瘤细胞捕获技术领域。本发明的功能红细胞的细胞膜上嵌入功能分子，所述功能分子一端为嵌入端，用于嵌入到红细胞膜里面；功能分子另一端为靶向端，靶向端为CTCs靶向抗体或叶酸，能特异性识别和结合CTCs表面生物标记物，功能分子的嵌入端和靶向端通过聚乙二醇(PEG)连接，形成“嵌入端‑PEG‑靶向端”结构的功能分子。本发明的功能红细胞能识别、捕获或抑制循环肿瘤细胞，可用于体外对临床病人血液样本微量CTCs的特异性识别和捕获研究，且可用于对所捕获的CTCs活性进行调控，从而在肿瘤转移的预警和预防方面开拓应用前景。

Description

一种靶向循环肿瘤细胞CTCs的功能红细胞
技术领域
本发明涉及一种能够识别、捕获、富集或抑制循环肿瘤细胞CTCs的功能性红细胞。
背景技术
循环肿瘤细胞是恶性肿瘤转移的关键因素，高纯度样本具有重大研究价值。在我国，恶性肿瘤(癌症)的发病率不断提高，死亡率常年高居全部死亡疾病之首，严重威胁国人的生命健康。癌症的转移是导致患者死亡的主要原因，占癌症致死病例的比例高达90％。癌症转移的关键承载体是称为循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)的病变细胞，它从原发肿瘤病灶脱落，经过侵染等过程进入外周血中，然后在合适部位侵出血管并附着于组织上，最终形成新的恶性肿瘤。因此外周血CTCs分离与分析技术有望成为具有高度可行性的非侵入式癌症诊断手段，并且能够帮助我们进一步理解癌症的转移机制，在监测癌症复发与转移、快速药效评估、癌症个性化治疗乃至完全战胜癌症等方面都将发挥重要作用。
当前各类循环肿瘤细胞分离技术获得的样品中白细胞干扰严重，样品纯度低下，是制约深入研究与应用的最大瓶颈。虽然1mL病人外周血中CTCs的数量仅有几个到几百个，将它们从其他的约十亿个正常血细胞背景中分离出来是一个巨大的技术难题，但自从以基于免疫磁珠技术的美国强生公司CellSearchTM系统获批用于临床CTCs检测以来，CTCs分离技术得到了长足的发展。代表性的方法有利用特异性抗体和三维纳米结构的协同作用分离CTCs、借助声表面波直接操控CTCs实现分选、基于介电泳力对CTCs的作用进行分离、根据CTCs形态特征(如大小、密度等)利用特殊微结构来进行分离的方法等，均获得了不错的CTCs分离效率。
在这些方法中，利用声场、电场、流体动力等物理手段分离CTCs的技术具有较高的样品处理通量，然而由于外周血中白细胞的物理性质变化幅度较大，有相当一部分与CTCs差别并不不显著，导致获得的CTCs样品纯度十分有限。这一点是所有基于物理性质分离的方法的先天性缺陷，很难加以改进。利用特异性抗体与三维纳米结构协同作用的CTCs分离手段作为当前广泛采用的分离方案，器件制备与操作都更加简便，并且由于抗原抗体之间的特异性作用使得器件对于CTCs的识别更加精确，相比基于物理手段的分离器件能够得到更高的纯度。然而该类器件与CTCs接触作用的界面是三维纳米结构，对于白细胞存在非特异性的物理吸附作用，造成CTCs样品纯度仍然难以大幅度的提高。
综上所述，当前的CTCs分离技术都面临着样品中混入为数众多的白细胞所导致的分离纯度低下的技术瓶颈，无法满足后续细胞/分子生物学分析对于CTCs的纯度要求，严重制约了对于CTCs在癌症早期检测以及癌症转移机制中所起关键作用的深入研究，导致现阶段CTCs在临床上还局限于计数等简单应用上，难以深入到研究调控CTCs代谢活动的生物大分子(如蛋白质、DNA等)分析层面。因此发展一种新的高纯度CTCs分离手段是推进当前CTCs生物学/医学研究的迫切需求。
红细胞可以逃避白细胞的吸附，极大提高CTCs分离纯度，虽然1mL血液中存在海量的红细胞，但是这些红细胞却不会吸附白细胞，这是生物进化的结果。红细胞膜的这种特性给予了申请者非常大的启示，通过将红细胞修饰上CTCs靶向分子，我们就能够利用红细胞膜排斥白细胞而又能靶向CTCs的特性来实现CTCs的超高纯度分离。一方面利用细胞膜的磷脂双分子层对于其他细胞膜的排斥作用来消除CTCs分离材料的界面对于白细胞的吸附作用，另一方面又能通过细胞膜编辑技术在细胞膜表面锚定针对CTCs的特异性生物大分子(如抗体、FA等)来实现对于CTCs的捕获分离。通过这种手段，就完全有可能消除传统CTCs分离方法中白细胞的非特异性吸附的问题，实现CTCs的超高纯度的分离富集，为后续的CTCs细胞/分子生物学分析提供纯粹的样品。
发明内容
本发明的目的在于避免了传统纳米技术检测和捕获CTCs的非特异性问题，进而提供了一种特异性识别、捕获和抑制循环肿瘤细胞的功能化红细胞，该功能化红细胞因可特异性地捕获并抑制所捕获的循环肿瘤细胞，有望应用于癌症转移的预警和预防。
本发明通过一种靶向循环肿瘤细胞CTCs的功能红细胞，其为在红细胞的细胞膜上嵌入功能分子，所述功能分子一端为磷脂，用于嵌入到红细胞膜里面；功能分子另一端为靶向端，靶向端为CTCs靶向抗体或叶酸，能特异性识别和结合CTCs表面生物标记物，功能分子的嵌入端和靶向端通过中间体连接，形成“磷脂-中间体-靶向端”结构的功能分子。
所述CTCs表面生物标记物为上皮标记物细胞角蛋白(CKs)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、肿瘤胚胎抗原(CEA)、人类表皮生长因子受体2(HER2)、静脉内皮细胞分子(EphB4)、附膜蛋白(MUC-1)、唾液酸化的路易斯寡糖-X(Sialyl Lewis X)、乙醛脱氢酶1(ALDH1)、波形蛋白(Vimentin)、尿激酶受体(uPAR)、乙酰肝素酶(HPSE)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD44、CK18、CD133、CD90、CD45、CD146。
进一步地，CTCs靶向抗体上皮标记物为细胞角蛋白抗体(anti-CKs)、上皮细胞粘附分子抗体(anti-EpCAM)、肿瘤胚胎抗体(anti-CEA)、人类表皮生长因子受体2抗体(anti-HER2)、静脉内皮细胞分子抗体(anti-EphB4)、附膜蛋白抗体(anti-MUC-1)、唾液酸化的路易斯寡糖-X抗体(anti-Sialyl Lewis X)、乙醛脱氢酶1抗体(anti-ALDH1)、波形蛋白抗体(anti-Vimentin)、尿激酶受体抗体(anti-uPAR)、乙酰肝素酶抗体(anti-HPSE)、前列腺特异性膜抗体(anti-PSMA)、anti-CD44、anti-CK18、anti-CD133、anti-CD90、anti-CD45、anti-CD146。
优选地，本发明的靶向抗体为针对上皮循环肿瘤细胞高表达的EpCAM和SialylLewis X的抗体。
本发明的红细胞与表面靶向抗体，为了实现最大多价络合效应，靶向抗体的用量要远比红细胞本身多，具体多少要依据红细胞表面积而定。
所述磷脂包括但不限于二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二月桂酰磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酸磷脂酰胆碱(DPPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)。
所述中间体包括聚乙二醇、羧基化的聚乙二醇、巯基化的聚乙二醇、酰肼-聚乙二醇-二硫醇、邻二硫吡啶基-聚乙二醇、生物素-聚乙二醇或N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇。
本发明还提供了制备上述功能红细胞的方法，是在普通红细胞的细胞膜上嵌入功能分子，所述功能分子的结构为“嵌入端-中间体-靶向端”；
所述嵌入端用于嵌入到红细胞膜里面；嵌入端包括但不限于二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二月桂酰磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酸磷脂酰胆碱(DPPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)；所述靶向端为CTCs靶向抗体或叶酸，能特异性识别和结合CTCs表面生物标记物。所述中间体包括聚乙二醇、羧基化的聚乙二醇、巯基化的聚乙二醇、酰肼-聚乙二醇-二硫醇、邻二硫吡啶基-聚乙二醇、生物素-聚乙二醇或N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇。
本发明提供了所述功能红细胞在制备识别、捕获、富集或抑制循环肿瘤细胞试剂盒中的应用。
本发明提供了所述功能红细胞在识别、捕获、富集或抑制循环肿瘤细胞中的应用。
本发明的功能红细胞用于富集CTCs的方法，主要包括以下步骤：1)对生物体液样本进行红细胞裂解处理以去除红细胞；2)在去除红细胞的生物体液样本中加入本发明的功能红细胞进行孵育；3)将功能红细胞孵育后的生物体液样本在滤膜上进行过滤，在滤膜上得到富集后的循环肿瘤细胞。
本发明的体外循环肿瘤细胞模型应选取那些研究集中、术后转移和复发程度中高的癌细胞株，可采用但不局限于下列癌细胞株：乳腺癌细胞株、前列腺癌细胞株、结肠癌细胞株、肝癌细胞株、宫颈癌细胞株、胃癌细胞株、肺癌细胞株。优先推荐选用乳腺癌细胞系(即MCF-7)作为体外循环肿瘤细胞模型。因乳腺癌细胞系(即MCF-7)的转移和复发程度适中，风险性较小；且生物标记物EpCAM和Slex在该细胞表面稳定性高度表达，故选取乳腺癌细胞系(即MCF-7)为体外CTCs模型，将会有助于本研究的顺利开展。
本发明的含有循环肿瘤细胞的血液样本取自术后转移和复发程度高的晚期癌症病人，可选取并不局限于下列癌症病人：结肠癌病人、乳腺癌病人、肝癌病人、前列腺癌病人、宫颈癌病人、胃癌病人、肺癌病人。
本发明的功能纳米材料载药系统体外CTCs捕获研究的手段，可采取但不局限于下列方法：按照病人血液中CTCs含量，首先向大量的干扰细胞(诸如白细胞、红细胞、生物标记物不表达的正常细胞或其它肿瘤细胞)中添加一定量的目标肿瘤细胞或向全血中添加一定量的目标肿瘤细胞，后加入定量的功能红细胞开展捕获研究。优先推荐使用本发明中通过单独考察RBC-FA对悬浮和贴壁乳腺癌细胞系(即MCF-7)的识别和捕获作用，或考察在大量干扰细胞(白血病细胞HL-60或红细胞RBCs)存在下，对少量乳腺癌细胞系(即MCF-7)的捕获情况，采用荧光拍照和流式细胞仪分析法评估双抗络合物体外在模拟血液样本中对CTCs模型的特异性捕获效果。
本发明的功能纳米材料载药系统对临床病人血液样本中CTCs的捕获研究手段，可采用但不局限于本方法：获取术后或化疗后肿瘤病人的血液样本，经处理获取淋巴细胞层后，加入功能红细胞共孵育或直接全血中加入功能红细胞开展捕获研究。优先推荐使用本发明中通过获取肿瘤医院的术后结肠癌血液样本，添加定量的功能红细胞进行捕获实验，血液后期处理后，流式定量分析其捕获CTCs数目，激光共聚焦分析其捕获情况。
本发明的有益效果在于：(1)本发明提供了一种特异性识别、捕获和抑制循环肿瘤细胞的功能红细胞，该功能红细胞可特异性地识别、捕获血中的循环肿瘤细胞，并且结构稳定，可用于体外对模拟和临床病人血液样本中微量CTCs的特异性识别和捕获，从而有望在癌症转移的预警和预防领域发挥重要作用；(2)本发明提供了一种特异性识别、捕获和抑制循环肿瘤细胞的功能红细胞，所述功能红细胞能避免白细胞的非特异吸附，避免的白细胞对诊断结果的干扰，能实现90％以上的CTCs俘获纯度。
附图说明
图1为修饰了DSPE-PEG-Cy5的红细胞，在荧光显微镜下观察到发出荧光。
图2为利用功能红细胞俘获的CTCs免疫荧光显微照片。CD45-表示排除白细胞干扰，CK+表示为肿瘤细胞。
图3为修饰了DSPE-PEG-Cy5的红细胞俘获到的细胞中，CTCs的纯度统计
图4为修饰了RBC-Biotin-Avidin-antiEpCAM的红细胞，修饰上标记了CY5的二抗，在荧光显微镜下观察到发出荧光的红细胞。
图5为利用功能红细胞俘获的CTCs免疫荧光显微照片。CD45-表示排除白细胞干扰，CK+表示为肿瘤细胞。
图6为修饰了RBC-Biotin-Avidin-antiEpCAM的红细胞俘获到的细胞中，CTCs的纯度统计。
图7为修饰了anti-Sialyl Lewis X的红细胞，在荧光显微镜下观察到发出荧光。
图8为利用功能红细胞俘获的CTCs免疫荧光显微照片。CD45-表示排除白细胞干扰，CK+表示为肿瘤细胞。
图9为修饰了anti-Sialyl Lewis X的红细胞俘获到的细胞中，
CTCs的纯度统计
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1红细胞修饰叶酸(FA)，用于体外对CTCs的特异性识别、捕获和活性调控
(1)红细胞修饰叶酸(FA)：首先从1mL正常人血中提取100μL红细胞，然后与50μL(1mg/mL)DSPE-PEG-FA(购自美国nanocs公司)(孵育30分钟，所有样品在1000g离心10分钟后，用PBS洗涤三次再使用，形成修饰了FA的功能红细胞。
(2)为证实DSPE有效的嵌入了红细胞膜，用DSPE-PEG-Cy5代替DSPE-PEG-FA。首先从1mL正常人血中提取100μL红细胞，然后与50μL(1mg/mL)DSPE-PEG-Cy5孵育30分钟，所有样品在1000g离心10分钟后，用PBS洗涤三次再使用，形成修饰了Cy5的红细胞。用荧光显微镜(IX 81，奥林巴斯，日本)观察DSPE-PEG-Cy5修饰的红细胞。如图1所示。
(3)仿真CTCs血样：仿真CTCs血样是通过在健康人全血中加入不同数量的MCF-7癌细胞(每毫升血液5000细胞)来制备的。
(4)CTCs俘获实验：先取出20微升步骤(3)的仿真CTCs血样，提取红细胞并修饰FA成为功能红细胞。然后将步骤(1)制得的修饰了FA的功能红细胞加入(每毫升血液加入1000个功能红细胞)仿真CTCs血样混合，在一个恒温器中孵育1小时(37℃，5％CO2)。然后将样品经过直径为8微米的滤膜进行过滤。
(5)功能红细胞俘获CTCs效率统计：将过滤后的样品在红细胞裂解缓冲液中处理三次，同时去掉功能红细胞和非功能红细胞。然后，用Hoechst标记CTCs。用PE标记的抗人CK18单克隆抗体孵育(4℃，1小时)。用PBS洗涤后，用Cy3标记的抗人CD 45抗体对CTCs染色(4℃，1小时)。洗涤后，用荧光显微镜(日本奥林巴斯IX81)鉴定细胞。MCF-7细胞鉴定为CK 18+/CD 45-。白细胞鉴定为CK18-/CD 45+。由于MCF-7癌细胞膜表面富含细胞角蛋白18(CK18)，而没有CD45蛋白(CD45)；白细胞膜表面富含CD45蛋白(CD45)，而没有细胞角蛋白18(CK18)。当用荧光标记的CK 18抗体和两种细胞进行孵育反应的时候，CK18抗体只会和MCF-7癌细胞膜表面的CK 18发生反应，发出荧光，所以MCF-7鉴定为CK 18阳性(CK 18+)。而白细胞不和CK 18抗体反应，不发出荧光，所以鉴定为CK 18阴性(CK 18-)。同样的道理，当用荧光标记的CD45抗体和两种细胞进行孵育反应的时候，CD45抗体只会和富含CD45蛋白的白细胞发生反应，发出荧光，所以白细胞鉴定为CD45阳性(CD45+)。而MCF-7癌细胞不与CD45抗体发生反应，没有荧光，鉴定为CD45阴性(CD45-)。如图2所示。CTCs的俘获纯度定义为俘获到的癌细胞和俘获到的总细胞之比。结果说明鉴定所俘获细胞为MCF-7肿瘤细胞，并统计俘获效率，俘获效率为92％(图3)。
(6)普通MACS免疫磁珠法俘获CTCs效率统计：将5000颗的MCF-7细胞悬浮在900μL裂解了红细胞的血液中，用100μL(EpCAM)MACS免疫磁珠进行俘获，磁珠(约107)。反应2小时后，样品在微型MACS柱上通过高梯度磁场分离。将捕获的细胞分别用1ml缓冲液洗脱，用150μL PE标记的抗人CK 18单克隆抗体(4℃，1小时)孵育。用PBS洗涤后，用Cy3标记的抗人CD45抗体(4℃，1小时)染色。洗涤后，用荧光显微镜(日本奥林巴斯IX 81)统计俘获的细胞。MCF-7细胞鉴定为CK 18+/CD 45-。普通MACS法俘获效率为51％(图3)。
(7)俘获纯度对比：将功能红细胞俘获CTCs的纯度和普通MACS免疫磁珠法做对比。如图3所示，可以看到功能红细胞俘获CTCs的纯度超过92％，远远高于普通MACS免疫磁珠方法51％的效率。
实施例2红细胞修饰上皮细胞粘附分子抗体(RBC-antiEpCAM)
(1)在红细胞(RBC)表面修饰生物素(Biotin)：500μL红细胞悬浮于4ml PBS(pH7.4)，再加入0.5毫克DSPE-PEG-Biotin(购自美国nanocs公司)(3700D，100μg/mL)，37℃孵育30分钟，连续搅拌，DSPE嵌入RBC的磷脂双分子层，获得RBC-Biotin。所获得的RBC-Biotin洗涤两次(PBS，pH 7.4，400g，5min)，
(2)在RBC-Biotin上修饰抗生物素蛋白(Avidin)：在不断搅拌下，在RBC-Biotin溶液中加入1毫克的Avidin溶液(6.30×104分子/红细胞)，并在4℃反应60分钟。形成红细RBC-Biotin-Avidin。所获得的RBC-Biotin-Avidin溶液洗涤两次(PBS，pH值7.4，400克，5分钟)除去未结合的抗生物素蛋白。
(3)在RBC-Biotin-Avidin上修饰上皮细胞粘附分子抗体(antiEpCAM)：在不断搅拌下，将RBC-Biotin-Avidin与生物素化的antiEpCAM混合，并在4℃反应60分钟，形成红细RBC-Biotin-Avidin-anti EpCAM。所获得的RBC溶液洗涤两次(PBS，pH值7.4，400克，5分钟)除去未结合的antiEpCAM。制备了修饰有Biotin-Avidin-antiEpCAM的功能红细胞。
(4)为了测试antiEpCAM是否有效偶联到了RBC上，使用标记了CY5的二抗和RBC-Biotin-Avidin-antiEpCAM偶联，如图4所示，可以看到红细胞发出红色荧光。表示antiEpCAM被高效的偶联到了RBC上了。
(5)肿瘤病人CTCs俘获实验：先从病人血样中取出20微升血，提取红细胞并修饰antiEpCAM成为功能红细胞。然后将功能红细胞加入病人血样混合(每毫升病人血液加入工程红细胞1000个)，在一个恒温器中孵育1小时(37℃，5％CO2)。然后将样品经过滤膜(滤孔直径为8微米)进行过滤。
(6)功能红细胞俘获CTCs效率统计：将过滤后的样品在红细胞裂解缓冲液中处理三次，去除普通红细胞和功能红细胞。然后，用Hoechst标记CTCs细胞。用PE-CK 18单克隆抗体孵育(4℃，1小时)。用PBS洗涤后，用Cy3标记的抗人CD 45抗体染色(4℃，1小时)。洗涤后，用荧光显微镜(日本奥林巴斯IX 81)鉴定细胞。CTCs鉴定为CK 18+/CD 45-。白细胞鉴定为CK 18-/CD 45+，如图5所示。CTCs的俘获纯度定义为俘获到的癌细胞和俘获到的总细胞之比，结果说明所俘获细胞为MCF-7肿瘤细胞，并统计俘获效率为89％(图6)。
(7)普通MACS免疫磁珠法俘获CTCs效率统计：将5000颗的MCF-7细胞悬浮在900μL裂解了红细胞的血液中，用100μL(EpCAM)MACS免疫磁珠进行俘获，磁珠(约107)。反应2小时后，样品在微型MACS柱上通过高梯度磁场分离。将捕获的细胞分别用1ml缓冲液洗脱，用150μL PE标记的抗人CK 18单克隆抗体(4℃，1小时)孵育。用PBS洗涤后，用Cy3标记的抗人CD45抗体(4℃，1小时)染色。洗涤后，用荧光显微镜(日本奥林巴斯IX 81)统计俘获的细胞。MCF-7细胞鉴定为CK 18+/CD 45-。统计得到普通MACS法俘获效率为50％(图6).
(8)俘获纯度对比：将功能红细胞俘获CTCs的纯度和普通MACS免疫磁珠法做对比，如图6所示。可以看到功能红细胞俘获CTCs的纯度远远高于普通MACS免疫磁珠方法。
实施例3红细胞修饰唾液酸化的路易斯寡糖-X抗体(RBC-anti-Sialyl Lewis X)
(1)在红细胞(RBC)表面修饰生物素(Biotin)：500μL红细胞悬浮于4ml PBS(pH7.4)，再加入0.5毫克DSPE-PEG-Biotin(购自美国nanocs公司)(3700D，100μg/mL)，37℃孵育30分钟，连续搅拌，DSPE嵌入RBC的磷脂双分子层，获得RBC-Biotin。所获得的RBC-Biotin洗涤两次(PBS，pH 7.4，400g，5min)，
(2)在RBC-Biotin上修饰抗生物素蛋白(Avidin)：在不断搅拌下，在RBC-Biotin溶液中加入1毫克的Avidin溶液(6.30×104分子/红细胞)，并在4℃反应60分钟。形成红细RBC-Biotin-Avidin。所获得的RBC-Biotin-Avidin溶液洗涤两次(PBS，pH值7.4，400克，5分钟)除去未结合的抗生物素蛋白。
(3)在RBC-Biotin-Avidin上修饰上皮细胞粘附分子抗体(anti-Sialyl LewisX)：在不断搅拌下，将RBC-Biotin-Avidin与生物素化的antiSialyl Lewis X混合，并在4℃反应60分钟，形成红细RBC-Biotin-Avidin-anti Sialyl Lewis X。所获得的RBC溶液洗涤两次(PBS，pH值7.4，400克，5分钟)除去未结合的anti Sialyl Lewis X。
(4)为了测试anti-Sialyl Lewis X是否有效偶联到了RBC上，使用标记了CY5的二抗和RBC-Biotin-Avidin-anti Sialyl Lewis X偶联，如图7所示，可以看到红细胞发出红色荧光。表示anti Sialyl Lewis X被高效的偶联到了RBC上了。
(5)肿瘤病人CTCs俘获实验：先从病人血样中取出20微升血，提取红细胞并修饰anti Sialyl Lewis X成为功能红细胞。然后将功能红细胞加入病人血样混合(每毫升病人血液加入工程红细胞1000个)，在一个恒温器中孵育1小时(37℃，5％CO2)。然后将样品经过滤膜(滤孔直径为8微米)进行过滤。
(6)功能红细胞俘获CTCs效率统计：将过滤后的样品在红细胞裂解缓冲液中处理三次，去除普通红细胞和功能红细胞。然后，用Hoechst标记CTCs细胞。用PE-CK 18单克隆抗体孵育(4℃，1小时)。用PBS洗涤后，用Cy3标记的抗人CD 45抗体染色(4℃，1小时)。洗涤后，用荧光显微镜(日本奥林巴斯IX 81)鉴定细胞。CTCs鉴定为CK 18+/CD 45-。白细胞鉴定为CK 18-/CD 45+，如图8所示。CTCs的俘获纯度定义为俘获到的癌细胞和俘获到的总细胞之比，结果说明所俘获细胞为MCF-7肿瘤细胞，并统计俘获效率为92％(图9)。
(7)普通MACS免疫磁珠法俘获CTCs效率统计：将5000颗的MCF-7细胞悬浮在900μL裂解了红细胞的血液中，用100μL(EpCAM)MACS免疫磁珠进行俘获，磁珠(约107)。反应2小时后，样品在微型MACS柱上通过高梯度磁场分离。将捕获的细胞分别用1ml缓冲液洗脱，用150μL PE标记的抗人CK 18单克隆抗体(4℃，1小时)孵育。用PBS洗涤后，用Cy3标记的抗人CD45抗体(4℃，1小时)染色。洗涤后，用荧光显微镜(日本奥林巴斯IX 81)统计俘获的细胞。MCF-7细胞鉴定为CK 18+/CD 45-。统计得到普通MACS法俘获效率为52％(图9).
(8)俘获纯度对比：将功能红细胞俘获CTCs的纯度和普通MACS免疫磁珠法做对比，如图9所示。可以看到功能红细胞俘获CTCs的纯度远远高于普通MACS免疫磁珠方法。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (8)

1.一种靶向循环肿瘤细胞CTCs的功能红细胞，其特征在于，其为在红细胞的细胞膜上嵌入功能分子，所述功能分子一端为磷脂，用于嵌入到红细胞膜里面；功能分子另一端为靶向端，靶向端为CTCs靶向抗体或叶酸，能特异性识别和结合CTCs的表面生物标记物，功能分子的磷脂和靶向端通过中间体连接，形成“磷脂-中间体-靶向端”结构的功能分子。
2.如权利要求1所述的功能红细胞，其特征在于，所述CTCs的表面生物标记物为上皮标记物细胞角蛋白、上皮细胞粘附分子、肿瘤胚胎抗原、人类表皮生长因子受体2、静脉内皮细胞分子、附膜蛋白、唾液酸化的路易斯寡糖-X、乙醛脱氢酶1、波形蛋白、尿激酶受体、乙酰肝素酶、前列腺特异性膜抗原、CD44、CK18、CD133、CD90、CD45或CD146。
3.如权利要求2所述的功能红细胞，其特征在于，所述CTCs靶向抗体为上皮标记物细胞角蛋白抗体、上皮细胞粘附分子抗体、肿瘤胚胎抗体、人类表皮生长因子受体2抗体、静脉内皮细胞分子抗体、附膜蛋白抗体、唾液酸化的路易斯寡糖-X抗体、乙醛脱氢酶1抗体、波形蛋白抗体、尿激酶受体抗体、乙酰肝素酶抗体、前列腺特异性膜抗体、anti-CD44、anti-CK18、anti-CD133、anti-CD90、anti-CD45或anti-CD146。
4.如权利要求2所述的功能红细胞，其特征在于，所述中间体包括聚乙二醇、羧基化的聚乙二醇、巯基化的聚乙二醇、酰肼-聚乙二醇-二硫醇、邻二硫吡啶基-聚乙二醇、生物素-聚乙二醇或N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇。
5.权利要求1-4任一所述功能红细胞用于富集CTCs的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：1)每毫升血液样本加入10～100000个功能红细胞进行孵育；3)将功能红细胞孵育后的生物体液样本在直径6～10微米的滤膜上进行过滤，在滤膜上得到富集后的循环肿瘤细胞。
6.权利要求1-4任一所述功能红细胞的制备方法，其特征在于，普通红细胞的细胞膜上嵌入功能分子，所述功能分子的结构为“磷脂-中间体-靶向端”；
所述靶向端为CTCs靶向抗体或叶酸，能特异性识别和结合CTCs表面生物标记物。
7.权利要求1-4任一所述功能红细胞在制备识别、捕获、富集或抑制循环肿瘤细胞试剂盒中的应用。
8.权利要求1-4任一所述功能红细胞在识别、捕获、富集或抑制循环肿瘤细胞中的应用。
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