KR102029156B1 - 순환종양세포 검출용 미세유체칩 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 카르복실기를 말단기로 포함하는 알킬티올 화합물 및 N-히드록시숙신이미드(NHS) 에스테르기를 말단기로 포함하는 알킬티올 화합물이 결합된 금속나노구조체가 마이크로 채널에 고정된 순환종양세포 검출용 미세유체칩에 관한 것이다.

Description

순환종양세포 검출용 미세유체칩{MICROFLUIDIC CHIP FOR DETECTION OF CIRCULATING TUMOR CELLS OF CANCER CELLS}
본 발명은 순환종양세포 검출용 미세유체칩에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 카르복실기를 말단기로 포함하는 알킬티올 화합물 및 N-히드록시숙신이미드(NHS) 에스테르기를 말단기로 포함하는 알킬티올 화합물이 결합된 금속나노구조체가 마이크로 채널에 고정된, 순환종양세포 검출용 미세유체칩에 관한 것이다.
전이(Metastasis)는 암 관련 사망의 대부분을 담당하며, 원발 종양으로부터 순환종양세포(crculating tumor cells; CTC)의 방출에 의해 개시되는 것으로 알려져 있다. 전이성암 환자들의 말초 혈액에 존재하는 CTC의 열거(enumeration)는 전립선암, 유방암 및 대장암에서 진단 유용성이 있는 것으로 나타났다. CTC의 분자 특성화는 환자의 원발 종양으로부터 정보를 얻는 덜 침략적인 수단을 제공할 수 있고, 질병 경과의 치료 및 모니터링을 돕는다. 또한, CTC가 원발 종양 및 전이 종양으로부터의 유전자 물질 쉐드(shed)를 포함하는 것으로 나타나기 때문에, 전이를 바탕으로 하는 생물학적 메카니즘을 이해할 수 있는 독특한 기회를 제공하고 있다.
CTC의 존재가 100년 이상 전에 확인되었을지라도, CTC의 격리 및 후속 프로파일링은 혈액에 존재하는 CTC의 적은 수(1×109의 혈액 세포들 당 1CTC 보다 작음)와 동일한 환자 몸속에 그들의 물리적 및 생물학적 이종성 때문에 여전히 어려움이 있다.
현재 CTC 분리 기술의 단점들은 (i) CTC 분리 후, 높은 잔류 세포 백그라운드 수준으로 인해 제한된 분자 특성, (ii) 세포 스트레스를 일으키고, CTC 생존능력의 감소를 야기시킬 수 있는 감량(debuliking) 또는 전 표지(prelabeling) 단계, (iii) 종양 마커의 다른 표현 레벨[예를 들어, 상피세포 부착분자(예를 들어, EpCAM(epithelial cell adhesion molecule), 사이토케라틴]와 관련이 있는 상피간엽이행(epithelial-to-mesenchymal transitions; EMT)을 겪는 CTC 부분 모집단(subpopulations)의 잠재적 존재; 및 (iv) 침투 과정에 사용되는 기술 또는 고정액으로 인하여 분리되는 세포에 대한 액세스의 부족을 포함한다. 현재 CellSearch system®은 유방암, 전립선암 및 전이성 대장암의 CTC의 열거에 대하여 유일하게 FDA-승인된 CTC 진단 시스템이다. 상기 시스템을 사용하는 CTC 목록은 암 환자들에게 진단값을 제공하나, CTC는 생존이 불가능하여 다운스트림 분석 또는 생체 외 세포 배양을 위해 회수가 불가능하다. 따라서, 세포 농축 단계 후에 생존가능한 CTC 회수를 용이하게 하는 기술의 개발이 필요하다. 항체-코팅된 표면들을 갖는 기하학적 패턴을 갖는 미세유체 플랫폼들은 대안적인 CTC 분리방법으로 여겨져 왔으며, 상기 접근법을 사용하여 높은 정제 효율은 입증되고 있다.
상기 장치들은 저비용으로 용이하게 제작할 수 있으며, 낮은 CTC 농도 레벨에 대한 높은 감도로 살아있는 세포 분리를 가능하게 하며, 샘플 전처리 단계가 필요하지 않다. 본 발명자들은 이전에 이미 미세유체 헤링본칩(HBCTC-칩)이 전혈 내 마이크로볼티스(microvortices)를 생성함으로써 수동 혼합과 유동 세포와 항체-기능화된 표면 간의 접촉 시간을 증가시킴으로써 CTC 포획을 향상시킨다는 것을 증명했다.
혈액 샘플을 이용한 HBCTC-칩의 임상적 사용법은 RNA 시퀀싱, CTC 표현형에서 극적 변화의 증명, 전립선암 CTC를 위한 안드로겐 수용체(AR) 활성 분석, CTC 클러스터들의 전이성 역할 탐구, 및 더욱 최근에는 CTC 디옥시리보핵산(DNA) 내의 단일점 돌연 변이의 실현에 의해 CTC 신호 경로를 결정할 수 있게 한다. 최근, 나노구조 기판은 CTC 분리 감도를 향상시키기 위해 마이크로 기술에 통합되고 있다. 다른 면역친화성 접근법과 유사하게, 이러한 방식으로 포획된 CTC는 단일 세포 분자 분석 또는 희귀 세포 집단의 장기간 배양을 수행하는 능력을 크게 제한하는 나노 입자(NPs), 나노 튜브 및 나노 시트에 비가역적으로 고정화된다. 분리 후에 단일세포 분석을 위해, 폴리머 상전이(온도-구동) 및 효소 분해와 관련된 다양한 접근법들이 개발되고 있다. 이들 방법들 각각에는 장점과 한계가 있다. 나노구조 기판을 사용한 경우, 울퉁불퉁하게 거친 구조는 접착과 결합이 가능한 표면 영역을 더욱 증가시켜 암세포와 항체 사이의 특이적 상호작용에 영향을 미치며, 종양 포획을 향상시키나, 암세포와 정상 혈구 사이의 나노구조의 기판에 대한 차등적인 접착 프로파일로 인해 비특이성을 감소시키기도 한다. 온도 반응성 기질의 경우, 세포의 균일한 회수를 달성하기 위해 장치의 표면 온도를 주의깊게 제어해야 하므로, 온도를 제어하는 추가 장치가 필요하며, 이러한 장치를 상업적으로 확장할 수 있는 기능은 제한적이다. 반면에, 세포 재생 중 알지네이트 리아제, DN 분해효소, 또는 엔도뉴클레아제와 같은 효소 또는 킬레이트제의 사용은 분해된 필름 자체 및 효소 용액에 과도하게 노출되어 환자 CTC의 생존 가능성을 저해하는 등의 문제점이 있다.
[특허문헌 1] 한국공개특허 제10-2016-0093473호
[비특허문헌 1] Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature 2007 Dec 20;450:1235-9.
본 발명은 상술한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 암 환자의 말초 혈액으로부터 순환종양세포들을 효율적으로 분리할 수 있는 미세유체칩을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 본 발명에 따른 미세유체칩을 이용하여, 간엽 및 상피 암세포주로부터 분리된 암세포들뿐만 아니라 전이성 유방암 환자 샘플로부터 분리된 암세포들도 특별한 손상없이 간단한 티올 리간드 교환 반응을 통하여 회수할 수 있는 미세유체칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 미체유체칩으로 순환종양세포를 포획 후, 생체적합성 티올 분자를 첨가하여 리간드-교환 반응에 의해 순환종양세포를 방출시킴으로써 순환종양세포를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 순환종양세포(circulating tumor cell; CTC) 검출용 미세유체칩은 카르복실기를 말단기로 포함하는 알킬티올 화합물 및 N-히드록시숙신이미드(NHS) 에스테르기를 말단기로 포함하는 알킬티올 화합물이 결합된 금속나노구조체가 미세유체칩 내의 마이크로 채널에 고정된 것을 특징으로 한다.
상기 카르복시기를 말단기로 포함하는 알킬티올 화합물은, 분자내에 탄소수 3∼16개를 갖는 메르캅토알칸산일 수 있다.
상기 메르캅토알칸산은 11-메르캅토운데칸산일 수 있다.
상기 NHS 에스테르기를 말단기로 포함하는 알킬티올 화합물은 분자내에 탄소수 3∼16개를 갖는 메르캅토알칸산 N-히드록시숙신이미드 에스테르일 수 있다.
상기 메르캅토알칸산 N-히드록시숙신이미드 에스테르는 12-메르캅토도데칸 N-히드록시숙신이미드 에스테르일 수 있다.
상기 금속나노구조체에 결합된 상기 카르복시기를 말단기로 포함하는 알킬티올 화합물 및 상기 NHS 에스테르기를 말단기로 포함하는 알킬티올 화합물의 중량비는 5：95∼40：60일 수 있다.
상기 금속나노구조체는 티올기와 반응가능한 금, 은, 구리, 수은 및 카드뮴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 금속을 포함하는 나노구조체일 수 있다.
상기 금속나노구조체는 구형의 금속나노입자, 금속나노막대입자(nanoroad), 및 금속나노튜브로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 금속나노구조체의 입경은 1∼500nm일 수 있다.
상기 순환종양세포는 전립선암, 유방암, 직장암 및 세포암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 암세포일 수 있다.
상기 NHS 에스테르기를 말단기로 포함하는 알킬티올 화합물의 NHS기에 제1차 결합물질이 더 결합될 수 있다.
상기 제1차 결합 물질은 뉴트라비딘(neutravidin), 스트렙트아비딘(streptavidin), 아비딘 (avidin), 및 캡트아비딘(captavidin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 제1차 결합 물질에 제2차 결합물질이 더 결합될 수 있다.
상기 제2차 결합물질은 비오틴일 수 있다.
상기 제2차 결합물질에 순환종양세포 감지마커의 항체가 더 결합될 수 있다.
상기 항체는 항EpCAM(상피세포 부착분자; epithelial cell adhesion molecule), CD45, 항Her2(human epidermal growth factor receptor 2), 항EGFR 및 (Eepidermal growth factor receptor)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 항체일 수 있다.
상기 순환종양세포 감지마커의 항체에 순환종양세포 감지마커가 더 결합될 수 있다.
상기 순환종양세포 감지마커는 EpCAM(epithelial cell adhesion molecule), 사이토케라틴, 플라스틴 3, PSA(Prostate-specific antigen), 맘마글로빈, EGFR(Epidermal growth factor receptor), ER2(Estrogen receptor 2) 및 Her2(human epidermal growth factor receptor 2)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 마이크로 채널은 헤링본형 또는 벌집구조형의 마이크로 채널일 수 있다.
본 발명에 따른 순환종양세포를 검출하는 방법은 본 발명에 따른 미체유체칩으로 암 환자의 혈액으로부터 순환종양세포를 포획 후, 생체적합성 티올 분자를 첨가하여 리간드-교환 반응에 의해 순환종양세포를 방출시킴으로써 순환종양세포를 검출할 수 있다.
상기 생체적합성 티올 분자는 글루타티온일 수 있다.
본 발명에 따른 바이오센서는 본 발명에 따른 미세유체칩을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 순환종양세포 검출용 미세유체칩에 따르면, 제조의 용이, 다양한 리간드 교환 작용기와 함께 사용하기 위한 유연성 및 3차원 표면 구조에 대한 접근성이 포함됨으로써 순환종양세포의 결합 및 방출이 용이하다.
또한, 본 발명에 따른 미세유체칩을 이용한 순환종양세포의 포획 및 방출은 세포 생존능력에 대한 제한된 영향과 차세대 RNA 시퀀싱과 같은 민감한 다운스트림 분석을 이행할 수 있는 능력을 나타내며, 방출된 세포가 손상없이 회수 가능하다.
도 1은 본 발명에 따른 미세유체칩의 제조 및 상기 칩을 이용한 세포 포획 및 방출의 메카니즘을 나타낸 개략도이다.
도 2(A)∼(E)는 제조예 2의 헤링본형 마이크로 채널을 갖는 미세유체칩을 나타낸 것이다.
도 3(A) 및 도 3(B)는 AFM 분석을 통한 실시예 2 및 비교예 3의 미세유체칩의 두께 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 1(A), 실시예 2(B), 비교예 1(C) 및 비교예 2(D)의 미세유체칩의 표면의 토포그래피 이미지를 나타낸 것이다.
도 5는 비오틴 처리 후, 뉴트라비딘의 존재(도 5(A); 실시예 2) 및 부재하(도 5(B); 실시예 1)에서 준비된 미세유체칩의 표면에 대한 형광 이미지를 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 3의 미세유체칩의 항체 적용 범위와 농도 사이의 선형 관계(강도) 및 세포 포획 효율을 나타낸 그래프이다.
도 7(A)는 비교예 3 및 실시예 3의 미세유체칩의 세포 포획 효율 및 비특이적 세포 결합을 나타낸 그래프이고, 도 7(B)는 실시예 3의 미세유체칩에서의 항체에 따른 세포 포획 효율을 나타낸 그래프이며, 도 7(C)는 실시예 3의 미세유체칩의 형광 및 명시야 현미경의 이미지이고, 도 7(D)는 비교예 3의 미세유체칩의 형광 및 명시야 현미경의 이미지이다.
도 8(A)는 실시예 3의 미세유체칩으로부터 포획된 세포들과 추가된 세포들의 관계를 나타낸 그래프이고, 도 8(B)는 MB-MDA-231 및 PC3의 세포 포획 효율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 9는 글루타티온(1mg/mL)으로 인해 실시예 3의 미세유체칩으로부터 방출되는 세포들의 광학 현미경용 이미지로서, 도 9(A)는 PC3 세포이고, 도 9(B)는 MDA-MD-231 세포이며, 도 9(C)는 배양 1일 후의 세포들, 도 9(D)는 배양 5일 후의 세포들이다.
도 10은 실시예 3의 미세유체칩의 세포 방출 효율 및 방출된 세포의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 11은 개별의 CTC(A) 및 전이성 암 환자들의 말초 혈액 내에 존재하는 CTC 클러스터(B)의 면역형광 염색 이미지이며, 도 11(C)는 전이성 유방암 환자들(Br 1 내지 Br 4) 및 건강한 사람(C1 및 C2)의 CTC 수를 나타낸 그래프이다.
도 12(A) 및 도 12(B)는 각각 실시예 3의 미세유체칩을 사용하여 포획되고 방출되는 Brx 세포들(Brx from chip) 및 상기 칩으로부터 방출되지 않는 일반 Brx 세포들(Brx control; 대조구)의 Ct값 및 RFU를 나타낸 그래프이다.
도 13(A) 및 도 13(B)는 Brx 세포 및 실시예 3의 미세유체칩으로부터 얻어진 Brx 세포의 이미지이고, 도 13(C) 및 도 13(D)는 일반 Brx 세포들(대조구) 대 실시예 3의 미세유체칩으로부터 포획/방출된 Brx 세포들의 생존력 정량을 위해 사용된 게이트(gate)를 나타낸 것이고, 도 13(E) 및 도 13(F)는 EpCAM의 발현 수준을 나타낸 것이며, 도 13(G) 및 도 13(H)는 대조구 대 실시예 3의 미세유체칩으로부터 포획된 세포들의 분포도를 나타낸 것이고, 도 13(I)는 RT-qPCR를 사용하여 대조구(Brx 세포) 및 실시예 3의 미세유체칩으로부터 방출된 Brx 세포에 대한 동일한 임계 주기를 나타낸 것이다.
도 14는 실시예 3의 미세유체칩으로부터 방출되지 않는 일반 Brx 세포들(A) 및 실시예 3의 미세유체칩을 사용하여 포획/방출되는 Brx 세포들(B)의 유전자 발현을 나타낸 것이다.
도 15는 실시예 3의 미세유체칩으로부터 분리된 CTC 세포를 위한 유방암 특이전 유전자를 나타내기 위한 유전자 발현 프로파일이다.
도 16은 5가지 유전자의 Ct값을 비교한 표이다.
도 17은 실시예 3 및 비교예 3의 미세유체칩의 세포 포획 효율 및 비특이적 세포 결합을 나타낸 그래프이다.
도 18은 실시예 3(A) 및 비교예 3(B)의 미세유체칩의 세포 포획 효율을 나타낸 명시야 현미경의 이미지이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 구체예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 구체예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 발명의 구체예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않은 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.
이하, 본 발명에 따른 순환종양세포 검출용 미세유체칩에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 순환종양세포 검출용 미세유체칩은 카르복실기를 말단기로 포함하는 알킬티올 화합물 및 N-히드록시숙신이미드(NHS) 에스테르기를 말단기로 포함하는 알킬티올 화합물이 결합된 금속나노구조체가 미세유체칩 내의 마이크로 채널에 고정된 것을 특징으로 한다.
상기 순환종양세포는 전립선암, 유방암, 직장암 및 세포암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 암세포일 수 있다.
상기 금속나노구조체는 3차원의 입자형태를 갖는 것으로서, 플레이트(plate)형이 아니라면 특별히 제한이 없고, 예를 들어, 구형의 금속나노입자, 금속나노막대입자 및 금속나노튜브로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상이며, 바람직하게는 상기 금속나노구조체는 구형의 금속나노입자이다.
상기 금속나노구조체는 티올기와 반응가능한 금, 은, 구리, 수은 및 카드뮴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 금속을 포함하는 나노구조체일 수 있다.
상기 미세유체칩에서 나노구조화된 표면을 달성하기 위하여, 상기 금속나노구조체들은 종양-특이적 항체들을 모으기 위한 효과적인 플랫폼으로서 사용되어야 하며, 이를 위해 상기 금속나노구조체의 입경은 1∼500nm일 수 있으며, 바람직하게는 1∼200nm이고, 더욱 바람직하게는 2∼100nm인데, 1nm 미만이면 입자가 너무 작아 3차원의 나노구조를 형성하기가 어려워 바람직하지 않고, 500nm를 초과하면 높은 유속하에서 포획 효율 증가를 나타내지 못하므로 바람직하지 않다.
상기 카르복시기를 말단기로 포함하는 알킬티올 화합물은, 분자내에 탄소수 3∼16개를 갖는 메르캅토알칸산일 수 있으며, 바람직하게는 11-메르캅토운데칸산일 수 있다.
상기 NHS 에스테르기를 말단기로 포함하는 알킬티올 화합물은 분자내에 탄소수 3∼16개를 갖는 메르캅토알칸산 N-히드록시숙신이미드 에스테르일 수 있으며, 바람직하게는 12-메르캅토도데칸산 N-히드록시숙신이미드 에스테르일 수 있다.
상기 금속나노구조체에 결합된 상기 카르복시기를 말단기로 포함하는 알킬티올 화합물(COOH-알킬티올 화합물) 및 상기 NHS 에스테르기를 말단기로 포함하는 알킬티올 화합물(NHS-알킬티올 화합물)의 중량비는 5：95∼40：60인 것이 바람직하고, 5：95∼30：70인 것이 더욱 바람직하며, 가장 바람직하게는 25：75인데, 상기 COOH-알킬티올 화합물이 5중량부 미만이고, 상기 NHS-알킬티올 화합물이 95중량부를 초과하면 금속나노구조체의 수용성이 저하되어 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 이루어지는 미세유체칩에서의 사용이 곤란하여 바람직하지 않고, COOH-알킬티올 화합물이 40중량부를 초과하고, NHS-알킬티올 화합물이 60중량부 미만이면 순환종양세포와 결합가능한 영역이 축소되어 바람직하지 않다.
상기 알킬티올 화합물이 결합된 금속나노구조체는 다음과 같은 장점을 갖는다: (a) 편평한 플레이트형 구조가 아닌 나노구조체 집합체들에 의해 만들어진 울퉁불퉁하게 거친 3차원 구조는 접착과 결합이 가능한 표면 영역을 더욱 증가시키고, 이러한 상승작용으로 암세포와 항체 사이의 특이적 상호작용에 영향을 미치며, 궁극적으로 종양 세포 포획을 향상시킨다; (b) 알킬티올기를 갖는 금속나노구조체의 금속-티올 상호작용은 과량의 티올 분자(예를 들어, 글루타티온)들의 존재하에서 쉽게 파괴될 수 있어, 고정된 항체를 갖는 원래의 리간드가 생체 적합성 티올 분자(예를 들어 글루타티온)와 효율적으로 교환되어 표면들로부터 암세포를 방출시킬 수 있다; (c) 금속나노구조체들의 집합체들의 불규칙한 표면들은 방출 시약이 세포 아래의 표면 영역에 접근할 수 있도록 허용함으로써, 후속 분자 분석 및 탈체(ex vivo) 세포 배양을 위한 포획된 세포의 성공적인 방출을 가능하게 한다; 그리고 (d) 가역적 금속나노구조체 결합들로부터 유래된 화학적으로 자기조립된 단일층들은 별도의 추가 공정을 필요로 하지 않고, 복잡한 표면 토포그래피로 사용하기 위한 방법의 최적화를 가능하게 한다.
또한, 세포들과 미세유체칩들 사이의 상호작용은 세포 포획에 대하여 중요한 역할을 하는데, 본 발명에서의 금속나노구조체로 형성된 3차원의 나노구조는 미세유체칩의 마이크로 채널에서 달성되는 세포/기판 접촉의 빈도를 증가시키고, 지속 시간을 증가시킴으로써 향상된 세포-포획 효과를 나타낼 수 있고, 이렇게 증가된 감도는 순환종양세포와 같은 저농도의 세포를 확인할 수 있는 장점을 갖는다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에서, 상기 카르복실기를 말단기로 포함하는 알킬티올 화합물은 카르복실기를 말단기로 포함하는 복수의 알킬티올 화합물이 미세유체칩 내의 마이크로 채널에 고정되어 있고, 또한 상기 N-히드록시숙신이미드(NHS) 에스테르기를 말단기로 포함하는 복수의 알킬티올 화합물이 미세유체칩 내의 마이크로 채널에 고정되어 있다. 본 발명의 보다 바람직한 일 구체예에서, 미세유체칩의 마이크로 채널에 고정된 금속나노구조체에 복수의 11-메르캅토운데칸산 및 복수의 12-메르캅토도데칸산 N-히드록시숙신이미드 에스테르가 결합될 수 있고, 이를 도 1의 (a)에 나타내었다.
상기 NHS 에스테르기를 말단기로 포함하는 알킬티올 화합물에 제1차 결합물질이 더 결합될 수 있다.
상기 제1차 결합물질은 DNA, RNA, 단백질, 펩타이드, 지방 또는 탄수화물일 수 있고, 특별히 한정은 없고, 예를 들어 뉴트라비딘(neutravidin), 스트렙트아비딘(streptavidin), 아비딘(avidin), 및 캡트아비딘(captavidin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 상기 제1차 결합물질은 뉴트라비딘일 수 있고, 상기 제1차 결합물질의 아민기는 상기 NHS 에스테르기를 말단기로 포함하는 알킬티올 화합물의 NHS 에스테르기에 결합될 수 있다.
즉, 상기 복수의 NHS 에스테르기를 말단기로 포함하는 알킬티올 화합물이 결합된 금속나노구조체들은, 금속나노구조체와 결합된 복수의 알킬티올 화합물의 말단기인 NHS 에스테르기와 미세유체칩의 마이크로 채널에 형성된 아민기와의 반응을 통해 마이크로 채널 내에 고정될 수 있고, 반응에 참여하지 않은 금속나노구조체들에 결합된 나머지 알킬티올 화합물의 말단기인 NHS-에스테르기들은 제1차 결합물질의 아민기와 결합할 수 있다.
상기 제1차 결합물질-금속나노구조체로 결합된 미세유체칩은 특이적 종양 세포의 결합을 용이하게 하기 위해 상기 제1차 결합물질에 제2차 결합물질이 더 결합할 수 있다.
상기 제2차 결합물질은 DNA, RNA, 단백질, 펩타이드, 지방 또는 탄수화물일 수 있고, 특별히 한정은 없고, 예를 들어 비오틴일 수 있다.
상기 제2차 결합물질에 순환종양세포 감지마커의 항체가 더 결합될 수 있다.
상기 항체는 항EpCAM(epithelial cell adhesion molecule), CD45, 항Her2(human epidermal growth factor receptor 2) 및 항EGFR (Eepidermal growth factor receptor)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 항체일 수 있다.
상기 순환종양세포 감지마커의 항체에 순환종양세포 감지마커가 더 결합될 수 있다.
상기 순환종양세포 감지마커는 EpCAM(epithelial cell adhesion molecule), 사이토케라틴, 플라스틴 3, PSA(Prostate-specific antigen), 맘마글로빈, EGFR(Epidermal growth factor receptor), ER2(Estrogen receptor 2) 및 Her2(human epidermal growth factor receptor 2)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 마이크로 채널은 헤링본형 또는 벌집구조형의 마이크로 채널일 수 있다.
본 발명에 따른 순환종양세포를 검출하는 방법은 본 발명에 따른 미체유체칩으로 암 환자의 혈액으로부터 순환종양세포를 포획 후, 생체적합성 티올 분자를 첨가하여 리간드-교환 반응에 의해 순환종양세포를 방출시킴으로써 순환종양세포를 검출할 수 있다.
상기 생체적합성 티올 분자는 티올기를 갖는 생체분자이면 특별히 한정이 없고, 바람직하게는 글루타티온일 수 있다.
상기 글루타티온은 특성화된 트리펩티드이기 때문에 세포 방출 시약으로 바람직하고, 세포질에서 가장 풍부한 티올 종이다. 상기 글루타티온은 세포에서 산화환원 환경을 제어하는 것과 같은 많은 중요한 생리 기능을 수행할 수 있으며, 또한, 생리학적으로 세포 내에서 글루타티온의 높은 농도(간 세포에서 최대 10mM)는 글라타티온이 방출 과정에서 세포에 치명적인 손상없이 안전하게 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
상기 순환종양세포를 검출하는 방법은 알킬티올 화합물이 결합된 금속나노구조체가 미세유체칩 내의 마이크로 채널에 고정되어 있는 미세유체칩으로 암 환자의 혈액으로부터 순환종양세포를 포획 후, 과량의 티올 분자들의 존재하에서 쉽게 파괴될 수 있는 금속-티올 상호작용을 이용하여, 생체적합성 티올 분자인 글루타티온을 첨가하여 리간드 교환 반응에 의해 금속나노구조체에 결합된 알킬티올 화합물의 티올기가 파괴됨으로써 글루타티온은 금속나노구조체에 결합하고, 알킬티올 화합물을 갖는 금속나노구조체에 부착되어 있던 순환종양세포는 미세유체칩으로부터 용이하게 방출될 수 있는 것이다.
또한, 본 발명은 미세유체칩을 포함하는 바이오센서를 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 및 비교예
[재료]
1-펜탄티올, 11-메르캅토운데칸산(MUA), 12-메르캅토도데칸산 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르, 금-(III)클로라이드 하이드레이트, 소듐 아자이드, 트윈 20, 소혈청알부민(BSA), (3-메르캅토프로필)트리메톡시실란, N-(γ-말레이미도부틸옥시)숙신이미드에스테르(GMBS) N-[3-(트리메톡시실릴)프로필]에틸렌디아민(AEAPTMS), 에탄올, 에테르 및 디클로로메탄(DCM)은 시그마 알드리치사로부터 구입하였고, 정제없이 사용하였다.
[제조예 1: COOH-작용기 및 NHS-작용기를 말단기로 갖는 알킬티올 화합물을 작용기로 갖는 금나노입자의 제조]
구형의 금나노입자(AuNP)(입경: 2nm)들은 캡핑 리간드로서 1-펜탄티올을 사용하여 브러스트-쉬프린 2상 합성법에 의해 제조되었다.
금나노입자 표면에 작용기를 도입하기 위하여, 30mg의 1-펜탄티올기로 보호된 금나노입자들(Au-C5)을 20mL의 디클로로메탄(DCM) 내에서 COOH-작용기 및 NHS-작용기의 중량비가 25：75가 되도록 30mg의 11-메르캅토운데칸산(MUA)과 90mg의 12-메르캅토도데칸산 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르와 혼합하여 혼합용액을 제조하였다.
상기 금나노입자의 입경은 2nm였다. 그런 다음, 상기 혼합용액을 어두운 곳에서 24시간 동안 교반하였고, 교반하는 동안 합성된 금나노입자가 용액으로부터 침전되었다. 상기 반응 용액 내에 합성된 금나노입자를 원심분리하였고, 그런 다음 에테르 및 디클로로메탄으로 2회 세척한 후, 유리 티올(free thiol)을 제거하였다. 상기 결과의 침전물인 금나노입자(COOH-작용기 및 NHS-작용기를 말단기로 갖는 알킬티올 화합물이 결합된 금나노입자)는 진공하에서 건조하였고, 4℃에서 저장하였으며, 상기 반응 과정은 도 1의 (A)에 나타내었다.
[제조예 2: 헤링본형 마이크로 채널을 포함하는 미세유체칩의 제조]
최상단의 표면 상에 8개의 헤링본 패턴을 갖는 마이크로채널들을 포함하는 1인치±3인치의 유리 슬라이드 및 폴리(디메틸실록산)(PDMS, 상품명: 실가드 184, 제조사: 다우코닝사 제)층으로 구성되는 미세유체칩을 제조하였으며, 상기 미세유체칩은 하기와 같은 과정으로 제조하였다.
헤링본 패턴을 갖는 8개의 마이크로 채널을 포함하는 실리콘 웨이퍼 모형틀을 준비하고, 상기 모형틀에 폴리디메틸실록산 용액을 부어 마이크로 채널을 갖는 폴리디메틸실록산 모형을 제작하였다. 그런 다음, 상기 폴리디메틸실록산 모형의 양 말단에 펀치를 이용하여 유입부와 유출부를 형성하였다. 이어서, 상기 폴리디메틸실록산 모형을 산소 식각 후, 상기 폴리디메틸실록산 모형에서 기둥의 윗면이 유리 기판과 맞닿도록 슬라이드에 고정시켜 미세유체칩을 제조하였고, 도 2에 나타내었다.
[실시예 1: 헤링본형 마이크로 채널에 COOH-작용기 및 NHS-작용기를 갖는 금속나노입자가 결합된 헤링본형 마이크로 채널을 갖는 미세유체칩의 제조]
제조예 2에서 제조된 미세유체칩을 화학적으로 변형시키기 위하여, 우선 실온에서 1시간 동안 에탄올 내 1중량%의 N-[3-(트리메톡시실릴)프로필]에틸렌디아민 용액으로 처리하여 상기 마이크로 채널의 표면을 아민화시켰고, 이를 에탄올로 여러회 완전하게 세척하였다. 그런 다음, 상기 미세유체칩을 0.01중량%의 제조예 1에서 수득된 금나노입자(gold nanoparticles; GNP)를 포함하는 에탄올 용액에 넣고, 실온에서 30분 동안 배양하고, 에탄올로 세척한 후, 아민화된 미세유체칩의 마이크로 채널에 상기 금나노입자를 고정시켰다.
[실시예 2: 뉴트라비딘-NHS-금나노입자의 미세유체칩의 제조]
상기 실시예 1에서 얻어진 금나노입자가 고정된 마이크로 채널들을 1시간 동안 PBS 완충용액 내의 20㎍/mL의 뉴트라비딘(피어스 바이오테크놀로지사 제)과 반응시킴으로써 뉴트라비딘의 라이신의 아민기가 금나노입자의 남아있는 NHS기와 결합되도록 하여, 뉴트라비딘-NHS 작용기를 갖는 금속나노입자(미세유체칩의 마이크로 채널 내에 고정된 뉴트라비딘-NHS 작용기를 갖는 금속나노입자; 뉴트라비딘-NHS-GNP-칩)를 제조하였다.
[실시예 3: 항EpCAM-비오틴-뉴트라비딘-NHS-금나노입자의 미세유체칩의 제조]
상기 실시예 2에서 제조된 뉴트라비딘-NHS-GNP-칩을 사용하기 전까지 4℃에서 뉴트라비딘 내에 보관하였다. 실험 24시간 이내에, 1중량% 소혈청알부민 및 0.09중량%의 소듐 아자이드를 포함하는 20㎍/MmL의 비오틴화 항-EpCAM 항체(human biotinylated EpCAM antibody, 상품명: Anti-EpCAM antibody [VU-1D9] (Biotin) (ab79079), abcam사 제)의 PBS 용액 내에 1시간 동안 상기 뉴트라비딘-NHS-GNP-칩을 첨가하여 반응시켜, 항EpCAM-비오틴-뉴트라비딘-NHS-금나노입자의 미세유체칩을 수득하였고, 이어서 이 미세유체칩을 에탄올 및 PBS로 세척하여, 반응 후 결합되지 않은 분자들을 제거하였다. 상기 과정을 진행하기 1시간 전, 상기 뉴트라비딘-NHS-GNP-칩은 3중량%의 BSA 및 0.05중량%의 트윈 20으로 퍼지되었다.
[비교 제조예 1: N-말레이미도부틸옥시숙신이미드 에스테르기(GMBS)를 갖는 금나노입자의 제조]
2nm의 입경을 갖는 금나노입자를 에탄올 내의 4중량%의 (3-메르캅토프로필)트리메톡시실란(MPTMS)으로 1시간 동안 실온에서 처리한 후, 에탄올 내의 0.01μmol/mL의 N-y-말레이미도부틸옥시 숙신이미드 에스테르(GMBS)로 30분 동안 실온에서 배양하여 N-(γ-말레이미도부틸옥시)숙신이미드 에스테르(GMBS)기를 갖는 금나노입자를 제조하였다.
[비교예 1: GMBS기를 갖는 금나노입자가 고정된 헤링본형 마이크로 채널을 포함하는 미세유체칩의 제조]
비교 제조예 1에서 제조된 GMBS기를 갖는 금나노입자를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 미세유체칩을 제조하였다.
[비교예 2: 뉴트라비딘-GMBS-기를 갖는 금나노입자가 고정된 헤링본형 마이크로 채널을 포함하는 미세유체칩의 제조]
비교예 1에서 얻어진 GMBS기를 갖는 금나노입자가 고정된 헤링본형 마이크로 채널을 포함하는 미세유체칩을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 뉴트라비딘-GMBS기를 갖는 금나노입자가 고정된 헤링본형 마이크로 채널을 포함하는 미세유체칩(뉴트라비딘-GMBS-GNP-칩)을 제조하였다.
[비교예 3: 항EpCAM으로 코팅된 금속나노입자를 갖는 헤링본형 마이크로 채널을 포함하는 미세유체칩(항EpCAM-비오틴-뉴트라비딘-GMBS-GNP)의 제조]
실시예 2에서 제조된 뉴트라비딘-NHS-GNP-칩 대신에 비교예 2에서 얻어진 뉴트라비딘-GMBS-GNP-칩을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 공정으로 항EpCAM-비오틴-뉴트라비딘-GMBS-금나노입자의 미세유체칩(항EpCAM-비오틴-뉴트라비딘-GMBS-GNP칩)을 제조하였다.
[비교예 4: 헤링본형 금플레이트형 마이크로 채널에 COOH-작용기 및 NHS-작용기가 결합된 미세유체칩의 제조]
금-코팅된 헤링본형 마이크로 채널(금플레이트형 마이크로 채널)을 포함하는 미세유체칩을 제조하고, 이를 피란하(piranha) 용액(30% H2O2: 농축 H2SO4 = 1:3)으로 15∼30초 동안 주의깊게 세척하였고, d-H2O로 헹구고, 그런 다음 에탄올로 헹구었다. 상기 세척된 금표면(bare Au surface)을 10mM의 티옥산을 포함하는 에탄올 내에 하룻밤 동안 담그었고, 에탄올로 세척한 후 건조하였다. 금표면에 작용기를 도입하기 위하여, 에탄올에 COOH-작용기 및 NHS-작용기의 중량비가 25：75가 되도록 30mg의 11-메르캅토운데칸산(MUA)과 90mg의 12-메르캅토도데칸산 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르를 첨가하여 혼합하여 혼합용액을 제조하였다. 상기 금-코팅된 헤링본형 마이크로 채널(금플레이트)을 포함하는 미세유체칩을 실온에서 1시간 동안 상기 혼합용액에서 배양하였고, 그런 다음 에탄올로 헹구었다. 티올기가 금 표면에 화학적으로 흡착되어, 금코팅된 헤링본형 마이크로 채널 표면에 11-메르캅토운데칸산과 12-메르캅토도데칸산 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르가 고정된 미세유체칩을 제조하였다.
[비교예 5: 뉴트라비딘-NHS-금플레이트의 미세유체칩의 제조]
상기 비교예 4에서 얻어진 미세유체칩을 1시간 동안 PBS 완충용액 내의 20㎍/mL의 뉴트라비딘(피어스 바이오테크놀로지사 제)과 반응시킴으로써 뉴트라비딘의 라이신의 아민기가 금플레이트의 NHS기와 결합하도록 하여 뉴트라비딘-NHS 작용기를 갖는 금플레이트형 마이크로 채널의 미세유체칩(뉴트라비딘-NHS-금플레이트-칩)을 제조하였다.
[비교예 6: 항EpCAM-비오틴-뉴트라비딘-NHS-금플레이트형 마이크로 채널의 미세유체칩의 제조]
뉴트라비딘-NHS-GNP-칩 대신에 비교예 5에서 제조된 뉴트라비딘-NHS-금플레이트-칩을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 공정으로 항EpCAM-비오틴-뉴트라비딘-NHS-금플레이트형 마이크로 채널을 갖는 미세유체칩(항EpCAM-비오틴-뉴트라비딘-NHS-금플레이트칩)을 제조하였다.
[비교 제조예 2: NHS-작용기만을 말단기로 갖는 알킬티올 화합물을 작용기로 갖는 금나노입자의 제조]
금나노입자에 COOH-작용기가 존재하지 않는 것을 제외하고는 제조예 1과 동일하게 금나노입자를 제조하였다.
[비교예 7: 헤링본형 마이크로 채널에 NHS-작용기만을 갖는 금속나노입자가 결합된 헤링본형 마이크로 채널을 갖는 미세유체칩의 제조]
제조예 1에서 제조된 금나노입자 대신에 비교 제조예 2에서 제조된 금나노입자를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 미세유체칩을 제조하였다.
그러나, 금나노입자를 에탄올 용액에 넣어 배양시, 카르복실기가 존재하지 않아 알코올에 용해되지 않아 사용하지 못하였다.
[비교예 8]
COOH-작용기 및 NHS-작용기의 중량비가 50：50이 되는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 미세유체칩을 제조하였다. 그러나, COOH-작용기가 많아 금나노입자의 수용성이 좋아 미세유체칩에 고정은 잘 이루어졌으나, NHS-작용기가 부족하여 세포 포획 효율이 매우 떨어짐을 확인하였다.
[비교예 9: 입경이 100nm인 금나노입자를 이용한 항EpCAM-비오틴-뉴트라비딘-NHS-금나노입자의 미세유체칩의 제조]
입경이 2nm인 금나노입자 대신에 입경이 100nm인 금나노입자를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 3과 동일하게 미세유체칩을 제조하였다.
비교예 9의 미세유체칩의 경우, 금나노입자의 입경이 100nm로 입자 크기가 크기 때문에, 글루타티온을 첨가하였을 때, 금나노입자와 마이크로 채널 사이의 티올기가 파괴되어 금나노입자가 미세유체칩 내의 마이크로 채널과 단단하게 고정되지 못하는 결과를 나타내었다.
[실험방법 및 물성측정방법]
1) 표면 분석
금속나노입자의 표면 분석은 타원분광기(ellipsometer) 및 원자력 현미경(AFM)을 통하여 측정하였다.
2) 혈액 처리
건강한 기증자와 암 환자의 혈액 샘플을 임상연구심의위원회(institutional review board) 프로토콜에 따라 수집하였다. 총 4명의 전이성 유방암과 두명의 건강한 사람이 본 실험에 참여하였다. 혈액을 혈액응고 방지제인 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA)를 포함하는 배큐테이너 튜브(벡톤 디킨슨사 제) 내에 수집하였고, 전처리없이 샘플들을 채혈한 후, 4시간 이내에 처리하였다. 일반적으로, 3mL의 전혈을 위한 전체 처리 시간(방출 포함)은 4시간이었다.
3) 면역 형광 염색
순환종양세포는 Alexa Fluor 488 다이에 컨쥬게이트된 마우스 항-EPCAM(3:100, 셀 시그널링 테크놀로지사 제) 및 항-카데린 11(CDH 11)(1:10, R&D 시스템사 제)로 동정되었다. 백혈구는 PE-CF594 다이에 컨쥬게이트된 마우스 항-CD45(1:20 BD 바이오사이언스사 제)로 염색하였다. DAPI는 세포들을 위한 핵 염색제로서 사용되었다.
4) MTT 분석: 세포 생존율 분석
방출된 세포들을 96-웰 플레이트에 2000 cells/mL로 접종하였고, MTT 용액을 상이한 시점에서 추가하였고, 4시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그런 다음, 흡광도를 570nm에서 측정하되, 샘플을 3중으로 측정하였다.
5) 유세포(flow cytometry) 이미지화
유세포 이미지화는 40×objective, 6개의 이미지 채널들 및 405, 488, 및 642nm 레이저가 구비된 mageStreamX Mark II 이미지 유세포측정기를 사용하여 수행하였다. 세포 생존력과 EpCAM 유전자 분석을 위하여, 배양으로부터 수득된 또는 미세유체칩으로부터 포획/방출된 Brx 세포들을 (0.3% BSA와 HEPES가 보충된) RPMI 내에 재현탁시켰고, 다음의 적용가능한 항체 및 염색제에 염색시켰다. 칼세인 블루 AM (2.5μM, 써모 피셔 사이언티픽사 제), 셀이벤트 카스파제 3/7 그린 검출 시약(1.75μM, 라이프 테크놀로지사 제), PE-컨쥬게이트된 EpCAM 항체(1:260, 클론 VU1D9, 셀시그널링사 제), PE-cf594-컨쥬게이트된 CD45 항체(1:400, 클론 H130, BD 바이오사이언스), 및 DRAQ5 (1μM, 셀 시그널링 테크놀로지사 제). pCAM 양성 세포들은 생존 세포(칼세인 양성 및 카스파제 3/7 음성) 대 죽은 세포(카스파제 3/7 양성)로 연관지었다.
6) RT-qPCR
미세유체칩으로부터 포획/방출된 대조구 및 Brx 세포들로부터 RNA를 제조사의 설명서에 따라 RNeasy 플러스 마이크로 키트(Cat# 74034, 퀴아젠사 제)를 사용하여 추출하였다. RIN(RNA integrity number)를 2100 바이오어널라이저 인스트루먼트(애질런트 게노믹스사 제)를 사용하여 얻었으며, 8∼9의 값을 가졌다. 분광 광도계(암순응측정기, 에펜돌프사 제)를 순도 및 수득률을 확인하기 위하여 사용하였다. 고용량 cDNA 역전사 키트(Cat# 4368814, 어플라이드 바이오시스템즈사 제)를 1㎍의 전체 RNA를 사용하여 cDNA 합성을 위하여 사용하였다. cDNA 합성은 C1000 터치 써말 싸이클러(바이오-래드 레보라토리즈사 제)에서 수행하였다.
유전자 증폭 정량 측정 장치(Quantitative PCR; qPCR)는 적절한 대조구를 가지고 CFX96 실시간 시스템(qkdldhfoem 레보라토리즈사 제) 상에서 태크만 진 익스프레션 마스터 믹스((Cat# 4369016, 어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 수행하였다. 다음의 태크만 프로브는 써모피셔 사에서 구입하였다: EpCAM (Cat# 4331182), Cdh3 (Cat# 331182), HER2/ERBB2 (Cat# 4331182), Met (Cat# 4331182), and EGFR (Cat# 4331182). 모든 암-특이적 프로브는, 말초 혈액 세포 내에서 발현되는 것으로 확인되는 Her2를 제외하고는, 정제된 백혈구(WBCs)를 포함하는 샘플들 내에서 증폭시키지 않았다. 또한, PTPRC의 증폭은 배양물로부터 직접 수득된 Brx 세포가 오염된 백혈구를 함유하지 않음을 확인하였으며, 반면에 미세유체칩으로부터 분리된 세포들은 CD45의 높은 Ct값(낮은 유전자 발편)에 의해 나타낸 바와 같이, 낮은 레벨로 오염된 백혈구를 포함하였다. 또한, 상기 미세유체칩으로부터 분리된 Brx 세포의 오염된 백혈구는 액틴과 같은 하우스키핑 유전자의 유전자 발현에 기여하였다.
7) 라이브러리 프렙 및 RNA 시퀀싱
미세유체칩으로부터 포획 및 방출된 CTC는 700μL의 퀴아졸로 용해시키고, RNA는 퀴아젠사의 RNAeasy 미니 키트를 사용하여 추출하였다. RNA를 변형된 프로토콜 38을 사용하여 증폭하였고, 하버드 대학교와 MIT의 브로드 연구소에서 서열분석하였다.
8) 세포 포획 및 방출
유방암 세포주(MDA-MD-231) 및 전립선암 세포주(PC3)를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)에서 수득하였다. 암세포주들은 적절한 프로토콜을 사용하여 확장시켰고, 그들은 85%의 세포 밀집도(cell confluence)에서 사용하였다.
실험 전에, 상기 세포들을 CellTracker Green(CMFDA) 염색물질(써모 피셔 사이언티픽사 제)로 15분 동안 염색하였고, 그런 다음 트립신화(trypsinized)시켰다. 염색된 상기 세포들을 1000cells/mL의 농도에서 건강한 혈액에 넣었고, 미세유체칩을 통과시켰다. 암세포들을 포함하는 3mL의 혈액 샘플을 1mL/h의 유속으로 흘려보냈다. 그리고, 즉시 미세유체칩을 1시간 동안 PBS 완충용액으로 세척하였다. 상기 미세유체칩의 표면 상에 CTC 포획 효율은 자동화된 프로토콜로 평가되었다.
포획된 CTC의 방출을 위하여, 1% BSA를 포함하는 PBS 완충용액 내의 각각의 글루타티온(GSH) 용액을 30분 동안 미세유체칩을 통하여 1mL/h 유속으로 흘려보냈다. PBS로 세척한 후, 미세유체칩으로부터의 세포들을 세포 배지를 포함하는 바이알에 수집하였고, 미세유체칩의 출구에 연결하였다. 미세유체칩 및 수집 바이알에 남아있는 세포들은 모두 이미지화하였고, 형광 현미경을 이용하여 수동으로 수를 세었다. 손상된 세포의 막을 확인하기 위해, 상기 세포들의 생존 가능성을 PI(propidium iodide) 염색법을 사용하여 방출 과정 후에 평가하였다.
[실험결과]
도 3은 실시예 2에서 얻어진 뉴트라비딘-NHS-금나노입자가 고정된 헤링본형 마이크로 채널을 포함하는 미세유체칩과 비교예 2에서 얻어진 뉴트라비딘-GMBS-금나노입자가 고정된 헤링본형 마이크로 채널을 포함하는 미세유체칩에 대하여, AFM 분석을 통해 칩의 두께를 관찰한 그래프를 나타낸 것으로, 실시예 2 및 비교예 2의 두께가 약 1.7±0.3nm의 증가를 나타냄을 확인하였다. 그런 다음 생체적합성 티올 분자인 글루타티온을 첨가하여 두개의 칩의 두께 변화를 나타낸 그래프를 나타내었는데, 실시예 2의 경우, 뉴트라비딘으로 인하여 증가한 두께만큼 두께가 감소함을 확인하였으나, 비교예 2의 경우, 어떠한 두께의 변화가 나타나지 않았다.
이는 실시예 2의 경우, 티올 분자인 글루타티온으로 인하여 리간드 교환 반응이 일어나 금나노입자의 티올기가 파괴되었음을 알 수 있으나, 뉴트라비딘-GMBS-GNP칩의 경우, 리간드 교환 반응이 일어나지 않았음을 알 수 있다.
알킬티올 화합물이 결합된 금속나노입자 교환 반응을 통한 본 발명의 미세유체칩으로부터 암세포의 성공적인 방출을 증명하기 위해, 실시예 2의 미세유체칩을 다양한 농도의 GSH 용액에 30분 동안 침지하였고, 이의 결과를 도 3(B)에 나타내었으며, 0.5mg/mL 이상의 GSH 용액의 농도에서 1.9±0.4nm의 두께 감소가 관찰되었다. 이는 리간드 교환을 통하여 금나노입자의 표면으로부터 성공적인 뉴트라비딘의 분리를 나타냄을 알 수 있었다. GSH에 대한 노출 후에, 관찰된 1.9nm의 감소는 뉴트라비딘의 선택적인 제거를 나타낸 것으로서, 고정화된 작은 금나노입자(입경 2nm) 아래로 침범해야 하는 방출 시약(글루타티온)의 접근성에 어려움이 있어, 마이크로 채널의 표면에서의 금나노입자의 고정은 잘 유지됨을 알 수 있었다.
도 4는 실시예 1(도 4의 (A)), 실시예 2(도 4의 (B)), 비교예 1 및 비교예 2의 표면의 토포그래피 이미지를 나타낸 것으로서, 실시예 1(도 4의 (A)) 및 실시예 2(도 4의 (B))의 표면 거칠기(Rq)값은 각각 0.497nm 및 0.705nm이었다. 이는 GMBS기-금나노입자가 고정된 비교예 1(도 4의 (C)) 및 뉴트라비딘-GMBS기-금나노입자가 고정된 비교예 2(도 4의 (D))의 거칠기값이 각각 0.249nm 및 0.412nm인 것과 비교하여 거칠기 값이 보다 높은 것을 알 수 있다. 이는 실시예 1 및 2가 비교예 1 및 2보다 더욱 3차원 형상의 마이크로 채널을 갖는 것임을 의미한다.
실시예 2의 뉴트라비딘 결합의 적용범위와 균일성을 측정하기 위해, 형광표지된 비오틴(비오틴-R-피코에리트린)을 사용하였고, 상기 형광 트레이스들을 측정하고 분석하였다. 도 5는 비오틴 처리 후, 뉴트라비딘의 존재(실시예 2)(도 5(A) 및 (C)) 및 부재하(실시예 1)(도 5(B) 및 (D))에서 준비된 미세유체칩의 표면에 대한 형광 이미지를 나타낸 것이다. 뉴트라비딘에 결합가능한 비오틴의 강한 형광은 균일한 강도를 갖는 성공적인 아비딘 증착을 증명한다(도 5(C)).
항체 유효성 및 포획 효율에 대한 효과를 측정하기 위해, 항-EpCAM 결합 후 표면을 형광처리하였다. 도 6(A)는 실시예 3의 미세유체칩에 결합된 항체의 적용 범위의 적정 곡선으로서, 항체 적용 범위와 농도 사이의 선형 관계가 나타난다. 10㎍/mL의 농도까지 항체 적용 범위에서 PC3 세포의 포획 효율의 증가가 관찰되었으나, 항체 농도가 10㎍/mL 초과시에는 효율(98.15 ± 1.1%)은 포화되었다(도 6(B)). 이러한 결과들은 포획 항체의 최적 농도가 10㎍/mL임을 나타낸다. 또한, 실시예 3의 표면 형광 세기는 미세유체칩에 균일하게 분포된 항체를 나타낸다(도 6(C) 및 도 6(D)).
세포 포획 효과에 대하여 실시예 3 및 비교예 3을 비교하였다.
도 7(A)는 실시예 3 및 비교예 3의 미세유체칩에서의 암세포인 PC3 및 MDA-MB-231의 포획 효율 및 비특이적 결합[NSB(nonspecific binding); 미세유체칩을 통하여 각각의 혈액 샘플을 처리한 후, 미세유체칩의 표면에 존재하는 3ml 당 백혈구의 양]에 대하여 나타낸 그래프이다. PC3 세포들(전립선 암세포 및 상피세포형)은, 세포 당 약 52,000개의 상피세포 부착분자(EpCAM) 결합 부위를 가지고 있는 반면에, MB-MDA-231 세포들(유방암세포 및 중간엽형)은 오직 1,700개의 결합 부위(약 30배 적은)를 가지고 있다.
실시예 3 및 비교예 3의 포획 효율은 각각 99%, 82%로 실시예 3이 비교예 3 보다 높은 포획 효율을 나타내었고, 실시예 3의 NSB는 35% 감소한 것으로 나타났다. 또한, 실시예 3의 경우, MDA-MB-231 세포주를 사용할 때 비교예 3과 비교하여 포획 효율이 상당히 증가되고 NSB는 감소함을 알 수 있다(도 7(A)).
도 7(B)에는 다양한 EpCAM, Her2, EGFR 및 이들의 조합 항체를 실시예 3의 미세유체칩에 적용하였을 때, 그 결과를 나타낸 것으로서, 조합 항체인 경우 가장 우수한 세포 포획 효율을 나타냄을 알 수 있다.
또한, 도 7의 (C) 및 (D)에 실시예 3(도 7(C)) 및 비교예 3(도 7(D))의 형광 및 명시야 현미경 이미지(fluorescent and bright-field microscopic image)를 나타내었는데, 실시예 3의 미세유체칩의 PC3의 포획이 비교예 3 보다 우수함을 알 수 있다. 이러한 향상은 미세유체칩의 표면 나노구조체와 관련이 크다. 흥미롭게도, 비특이성의 감소는 암세포와 정상 혈액 세포 간의 나노구조화된 미세유체칩에 대한 차등 부착 프로파일을 갖는 본 발명의 나노구조화된 미세유체칩의 중요한 특성을 나타낸다.
인간 표피 성장 인자 수용체 2(Her2)와 비슷하게 EpCAM의 발현 수준이 낮으나, 표피 성장 인자 수용체(EGFR)의 발현 수준이 높은 MDA-MB-231 세포주의 포획 효율을 높이기 위해, 실시예 2의 미세유체칩을 각각 EpCAM, Her2, EGFR 또는 항체의 조합(EpCAM, Her2 및 EGFR)으로 추가 기능화하여 MDA-MB-231 세포로 시험하였고, 그 결과를 도 7(B)에 나타내었다. 도 7(B)에 나타낸 바와 같이, EpCAM, Her2 및 EGFR 항체의 조합의 경우, 95% 이상의 높은 포획율을 나타내었는데, 이는 다양항 항체들의 이종 발현을 갖는 CTC의 항체 선택이 매우 중요함을 명백하게 나타내고 있다. EpCAM, HER2, 및 EGFR의 3개의 항체들의 혼합 접근은 EMT 전이의 모든 단계들을 통해 유방암 세포가 포획될 수 있음을 증명하고 있다. 다만, 환자 혈액에 존재하는 CTC의 수는 크게 변할 수는 있으나, 흔히 있는 일은 아니다.
따라서, 암세포의 농도가 변화할 때의 본 발명의 미세유체칩(실시예 3)의 감도를 시험하기 위해, 5cells/mL 내지 1000cells/mL(10, 50, 100, 200, 500, 및 1000cells/ml)의 범위 내의 농도로 전체 혈액 내에 암세포를 추가하였다. 스파이크된(spiked) 세포(1000 내지 10 PC3cells/mL)와 포획된(captured) 세포의 수(R2 = 0.9947, n = 3) 사이의 선형 상관 관계가 관찰되었다(도 8(A)).
암세포의 초저(ultralow) 농도(전혈의 5cells/mL, n=10)를 테스트하기 위해, 두개의 다른 암세포주들(MDA-MB-231 및 PC3)을 조사하였다(도 8(B)). 1000, 500, 및 200cells/mL의 스파이킹 농도에 대하여, 초기 100,000cells/mL의 연속 희석을 사용하였다. 마이크로 니들이 구비된 현미 조작 장치(micromanipulator)는 전혈의 암세포의 100, 50, 10, 및 5cells/ml의 스파이킹 농도를 사용하였다. 이러한 낮은 암세포 농도에서 세포 포획 효능은 0 내지 100%의 범위에서 다양하였다. 각 세포주에 대하여, 총 5개의 세포들을 현미 조작 장치를 사용하여 한 번에 한 세포 씩 채취하여 실시예 3의 미세유체칩을 통과하기 전에 1mL의 전혈에 넣었다. 상기 접근법을 이용한 결과, MDA-MB-231 세포들에 대한 평균 포획 효율은 68±29.2%, n=10이고, PC3 세포들에 대한 평균 포획 효율은 72±26.4%, n=10이였다. 이들 결과들은 실시예 3의 미세유체칩이 표현형에 상관없이 CTC 항원과 항체 사이의 세포-표면 접촉 및 결합 친화성을 향상시킴으로써 적은 수의 암세포를 효율적으로 분리할 수 있음을 증명하고 있다. 도 1(b)에 나타낸 바와 같이, 생체적합성 티올 분자인 글루타티온을 첨가함으로써, 금나노입자의 표면에 결합된 가역적인 티올 결합은 과량의 GSH의 존재하에서 본 발명의 미세유체칩으로부터 분리되어 CTC의 격리를 용이하게 한다.
도 9는 광학 현미경용 이미지로서, 실시예 3의 미세유체칩에 GSH를 유동시킴으로써 달성된 방출 효율 및 회수된 암세포의 생존력의 결과를 나타낸 것이다. 도 9(A)는 PC3를 포획한 실시예 3의 미세유체칩에 GSH(1mg/mL)를 4.5시간 동안 유동시켜 방출된 PC3이며, 도 9(B)는 MDA-MD-231을 포획한 실시예 3의 미세유체칩에 GSH(1mg/mL)를 4.5시간 동안 유동시켜 방출된 MDA-MD-231이고, 상기 세포들의 1일 배양 결과는 도 9(C)에 나타내었고, 5일 후의 배양 결과는 도 9(D)에 나타내었다.
도 10에는 MTT 분석을 이용하여 측정한 PC3 및 MDA-MB-231의 방출 효율 및 세포 생존율의 그래프를 나타내었는데, PC3 및 MDA-MB-231는 각각 92% 및 91%의 방출 효율을 가짐으로써 우수한 세포 분리 성능을 나타내었고, 방출된 후 배지에서 5일 동안 배양된 세포들의 평균 세포 생존율은 PC의 경우 87%, MDA-MB-231의 경우 78%의 높은 생존율을 나타내었다. 이들 결과로서, 실시예 3의 미세유체칩으로 세포를 포획시 포획 효율이 우수하고, 포획 후 방출하여도 세포 생존능력이 매우 우수함을 알 수 있다.
실시예 3의 미세유체칩의 임상 적용을 시험하기 위하여 전이성 유방암 환자들의 혈액 샘플들을 사용하였다. 암환자로부터 얻어진 암세포들의 포획 효율을 극대화하기 위하여, 모든 환자들의 결과는 10㎍/mL에서 항체 조합(EpCAM, Her2 및 EGFR)의 사용으로 얻어졌다. 4명의 전이성 유방암 환자들 및 두명의 건강한 인간들로부터의 혈액 샘플을 본 발명의 미세유체칩을 통해 처리하였으며, 환자 당 평균 3.5mL의 혈액을 분석하였다. 모든 환자들에 있어서, 면역 형광 염색기술을 이용하여 CTC를 식별할 수 있었다. 세포들이 4',6-디아미노-2-페닐인돌(DAPI)로 DNA에 양성 반응을 보이고, 종양 감지 마커인 EpCAM 및 카데린 11(CDH11)을 발현하고, 백혈구 마커 CD45를 발현하지 않으면 세포는 CTC로 확인되었다. 적어도 2CTCs/mL가 검출되었을 때, 환자 혈액 샘플은 CTC에 대하여 양성으로 간주되었다. 상기 임계값은 2명의 건강한 대조구들(C1 및 C2) 내에서 검출된 양성 수준(중간값 = 0.9 CTCs/mL, 평균 = 0.7 ± 0.3 CTCs/mL)을 근거로 하여 확립되었다. 유방암 환자(Br 1 내지 Br 4)에서 CTC의 수는 6 내지 12CTCs/mL(중간값 = 7.4 CTCs/mL, 평균 = 8.2 ± 2.7 CTCs/mL)의 수치가 얻어졌다(도 11(C)). 전이성 암 환자들의 말초 혈액 내에 존재하는 CTC 클러스터(도 11(B))뿐만 아니라 개별의 CTC(도 11(A))도 포획되는 것이 본 발명의 미세유체칩의 특징이다. CTC 클러스터들은 면역 시스템 및 혈류 전단 응력으로부터 그들의 생물학적 및 물리학적 차폐(shielding)로 인해 단독 CTC보다 높은 전이성 잠재력을 가지고 있다.
따라서, 본 발명의 미세유체칩의 접근법은 CTC에 대한 다기능성과 민감성을 향상시킴을 증명하였다. 본 발명의 미세유체칩이 CTC 생물학을 이해하기 위한 강력하고 비침습적인(noninvasive) 방법이라는 것을 더욱 입증하기 위해, 생물학적 모델 시스템으로서 환자 유래 유방(Brx) CTD 세포주를 사용하여 분자 특성을 수행하였다. CTC 세포주는 매우 이질적이고, 불멸성 세포주보다 배양 및 조작 조건(예를 들어, 저산소증 상태, 비점착성 배양, 특정한 배지)에 더욱 민감한 환자의 CTC로부터 유래되었다. 이미징 유동 세포 측정법을 사용하기 위하여, 칼세인 AM을 사용하여 세포 생존력을 측정하고, 카파아제 3/7 형광 프로브를 사용하여 세포 사멸을 확인하였다.
본 발명의 미세유체칩(실시예 3)을 사용하여 포획되고 방출된 Brx 세포들(Brx from chip)을 일반 Brx 세포들(Brx control; 대조구)과 비교하였다. 그 결과 Ct값은 거의 유사함을 알 수 있었다(도 12의 (A) 및 (B)). 또한, 항-EpCAM 및 CD54 감지 마커들은 방출 후의 암세포들 및 백혈구들을 구별하기 위하여 사용하였다.
환자 유방 유방암 (Brx) CTC 라인의 특성을 확인하기 위하여, 이미징 유동 세포 계측법을 사용하였다. 데이터는 대조구(미세유체칩을 통과하지 않은 Br 세포) 대(vs) 실시예 3의 미세유체칩으로부터의 포획/방출된 세포의 생존능력, EpCAM 발현, 및 영역을 비교하였다. 도 13의 (A) 및 (B)는 대조구(A) 및 실시예 3의 미세유체칩으로부터의 포획/방출된 세포(B)로부터 수득된 살아있는 세포들 및 죽은 세포의 대표 이미지이다.
도 13의 (C) 및 (D)는 일반 Brx 세포들(대조구) 대 본 발명의 미세유체칩으로부터 포획/방출된 Brx 세포들의 생존력 정량을 위해 사용된 게이트(gate)를 나타낸 것이다. 대조구와 거의 동일한 산란도를 갖는 실시예 3의 미세유체칩으로부터 방출된 세포들의 생존력은 87% 내지 93%에서 유동적으로 나타났다.
또한, 대조구와 본 발명의 미세유체칩으로부터 방출된 세포들에 있어서 EpCAM의 발현 수준은 각각 평균 4.5×105±2.9×105 및 3.8×105±2.7×105의 EpCAM 강도를 갖는 거의 동일한 프로파일을 나타내고 있다(도 13의 (E) 및 (F)).
또한, 미세유체칩의 처리의 결과로서 임의의 잠재적 변화를 식별하기 위해 크기 분포도를 분석하였다. 도 13의 (G) 및 (H)는 대조구 대 실시예 3의 미세유체칩으로부터 포획된 세포들에 있어서, 크기 분포도에 현저한 변화는 나타나지 않았다.
RT-qPCR를 사용하여 대조구(Brx 세포) 및 실시예 3의 미세유체칩으로부터 방출된 Brx 세포는 동일한 임계 주기(Ct)값을 갖는 것을 확인하였고, 보다 낮은 Ct값들은 높은 유전자 발현을 나타내고 있다(도 13의 (I), 도 12 및 도 14).
도 12(A)에 나타낸 바와 같이, 대조구(Brx 세포) 대 실시예 3의 미세유체칩으로부터 방출된 세포들에 대한 Ct값들은 EpCAM에 대하여 22.38 (SD 0.23) 및 22.34 (SD 0.56), Cdh3에 대하여 31.86 (SD 0.08) 및 31.69 (SD 0.12), Her2에 대하여 26.05 (SD 0.05) 및 25.87 (SD 0.06), Met에 대하여 32.79 (SD 0.19) 및 32.86(0.13), 및 EGFR에 대하여 32.73 (SD 0.08) 및 32.93 (SD 0.16)이었다. 이들 결과로부터 티올에 대한 GSH의 사용으로 인한 화학적 방출은 생존능력 또는 Brx CTC 라인의 분자 지표에 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.
도 14는 상기 칩으로부터 방출되지 않는 일반 Brx 세포들(A) 및 실시예 3의 미세유체칩을 사용하여 포획되고 방출되는 Brx 세포들(B)의 유전자 발현을 나타낸 것이다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 이들 결과들은 티올 리간드 교환을 위한 GSH의 사용으로 화학적 방출은 Brx CTC 세포주의 생존력 또는 분자 지표(molecular signature)에 영향을 미치지 않는 것을 명백하게 입증하고 있다.
CTC의 유전자 발현 프로파일에 대한 방출 메카니즘의 영향력을 테스트하기 위해, 차세대의 RNA 시퀀싱 분석을 전이성 유방암 환자로부터 분리한 CTC에 대하여 수행하였다.
각 샘플에 대하여, 혈액 샘플은 "실시예 3의 미세유체칩으로부터 방출된 CTC" 및 "미세유체칩을 통과하지 않은 일반 CTC(대조구)"로 나누었다.
대조구 및 방출된 상태에서 RNA 온-칩으로 분리한 후에, CTC는 리간드-교환 접근법을 사용하여 방출하였다. 다른 처리 조건을 사용하여 분리된 RNA의 관리되지 않는 클러스터링은 대부분의 변종 유전자의 상위 1000개의 환자 샘플(예를 들어, 대조구 및 실시예 3의 미세유체칩으로부터 세포) 클러스터링을 함께 결합하는 결과를 가져왔다.
유방암 특이적 유전자에 대한 유전자 발현 프로파일을 살펴보면, 도 16에 나타낸 데이터는 대조구 및 실시예 3의 미세유체칩으로부터 방출된 CTC 사이의 발현 수준에서 현저하게 무시가능한 변화를 입증하고 있다.
또한, 본 발명에 따른 미세유체칩에 따르면, 질병의 진행되는 동안에 암세포의 질병 진행(예를 들어, KRT8, KRT18), 환자 생존 (예를 들어, TFF3), 전이 위험(예를 들어, CLCA2) 및 상피 간엽 이행(예를 들어 S100A14, S100A16)에 대한 고유한 유방암 유전자 표지를 일치시킬 수 있다(도 15 및 도 16).
세포 분리에 대하여 본 발명에 따른 미세유체칩에 고정된 3차원 형상의 콜게이트형(corrugated) 나노입자 필름의 효과를 증명하기 위하여, 실시예 3의 미세유체칩을 금플레이트형 마이크로 채널을 갖는 미세유체칩인 비교예 5와 비교하였다.
도 17은 실시예 3 및 비교예 6의 미세유체칩에서의 암세포인 PC3 및 MDA-MB-231의 포획 효율 및 비특이적 결합[NSB(nonspecific binding); 미세유체칩을 통하여 각각의 혈액 샘플을 처리한 후, 미세유체칩의 표면에 존재하는 3ml 당 백혈구의 양]에 대하여 나타낸 그래프이다. 실시예 3 및 비교예 6의 포획 효율은 각각 99%, 55%로 실시예 3이 비교예 6 보다 높은 포획 효율을 나타내었다. 또한, 도 18을 살펴보면, 실시예 3의 미세유체칩(A)이 비교예 6의 미세유체칩(B) 보다 더욱 뛰어난 세포 포획율(PC3)을 나타냄을 볼 수 있다.
이의 결과로서 금플레이트형의 마이크로 채널을 갖는 미세유체칩 보다 금속나노입자가 고정된 마이크로 채널을 갖는 미세유체칩의 경우, 금나노입자로 인한 3차원 입자를 가짐으로써 PC3의 포획이 보다 우수함을 알 수 있다.

Claims (22)

  1. 카르복실기를 말단기로 포함하는 알킬티올 화합물 및 N-히드록시숙신이미드에스테르기를 말단기로 포함하는 알킬티올 화합물이 표면에 결합된 금속나노구조체가 미세유체칩 내의 마이크로 채널에 고정되어 있고,
    상기 금속나노구조체의 표면에 결합된 상기 카르복실기를 말단기로 포함하는 알킬티올 화합물 및 상기 N-히드록시숙신이미드 에스테르기를 말단기로 포함하는 알킬티올 화합물의 중량비는 5：95∼40：60인 순환종양세포 검출용 미세유체칩.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 카르복실기를 말단기로 포함하는 알킬티올 화합물은, 분자내에 탄소수 3∼16개를 갖는 메르캅토알칸산인 미세유체칩.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 메르캅토알칸산은 11-메르캅토운데칸산인 미세유체칩.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 N-히드록시숙신이미드 에스테르기를 말단기로 포함하는 알킬티올 화합물은 분자내에 탄소수 3∼16개를 갖는 메르캅토알칸산 N-히드록시숙신이미드 에스테르인 미세유체칩.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 메르캅토알칸산 N-히드록시숙신이미드 에스테르는 12-메르캅토도데칸산 N-히드록시숙신이미드 에스테르인 미세유체칩.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 금속나노구조체는 티올기와 반응가능한 금, 은, 구리, 수은 및 카드뮴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 금속을 포함하는 나노구조체인 미세유체칩.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 금속나노구조체는 구형의 금속나노입자, 금속나노막대입자 및 금속나노튜브로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 미세유체칩.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 금속나노구조체의 입경은 1∼500nm인 미세유체칩.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 순환종양세포는 전립선암, 유방암, 직장암 및 세포암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 암세포인 순환종양세포 검출용 미세유체칩.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 N-히드록시숙신이미드 에스테르기를 말단기로 포함하는 알킬티올 화합물의 N-히드록시숙신이미드기에 제1차 결합물질이 더 결합되는 미세유체칩.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 제1차 결합 물질은 뉴트라비딘(neutravidin), 스트렙트아비딘(streptavidin), 아비딘 (avidin), 및 캡트아비딘(captavidin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 미세유체칩.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 제1차 결합 물질에 제2차 결합물질이 더 결합되는 미세유체칩.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 제2차 결합물질은 비오틴인 미세유체칩.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 제2차 결합물질에 순환종양세포 감지마커의 항체가 더 결합되는 미세유체칩.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 항체는 항EpCAM(epithelial cell adhesion molecule), CD45, 항Her2(human epidermal growth factor receptor 2) 및 항EGFR (Eepidermal growth factor receptor)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 항체인 미세유체칩.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 순환종양세포 감지마커의 항체에 순환종양세포 감지마커가 더 결합되는 미세유체칩.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 순환종양세포 감지마커는 EpCAM(epithelial cell adhesion molecule), 사이토케라틴, 플라스틴 3, PSA(Prostate-specific antigen), 맘마글로빈, EGFR(Epidermal growth factor receptor), ER2(Estrogen receptor 2), 및 Her2(human epidermal growth factor receptor 2)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질인 미세유체칩.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 마이크로 채널은 헤링본형 또는 벌집구조형의 마이크로 채널인 순환종양세포 검출용 미세유체칩.
  20. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항 또는 제7항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 미체유체칩으로 암 환자의 혈액으로부터 순환종양세포를 포획 후, 생체적합성 티올 분자를 첨가하여 리간드-교환 반응에 의해 순환종양세포를 방출시킴으로써 순환종양세포를 검출하는 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 생체적합성 티올 분자는 글루타티온인 티올 분자인 방법.
  22. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항 또는 제7항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 미세유체칩을 포함하는 바이오센서.
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