CN111057639B - 一种基于微流控芯片的循环肿瘤细胞分离富集系统和方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于微流控芯片的循环肿瘤细胞分离富集系统和方法属于微流控技术领域，尤其涉及一种基于微流控芯片的循环肿瘤细胞分离富集系统和方法。本发明提供一种基于微流控芯片的循环肿瘤细胞分离富集系统和方法。本发明一种基于微流控芯片的循环肿瘤细胞分离富集系统包括微流控芯片，其特征在于微流控芯片包括细胞/液体注入口1、细胞捕获区域2、细胞迁移/排出通道4、基质胶通道5、开放收集区域6、细胞/液体排出口7、基质胶注入口8和基质胶排出口9，细胞捕获区域2位于所述微流控芯片中央；所述细胞迁移/排出通道4围绕于所述细胞捕获区域2外，所述基质胶通道5围绕于所述细胞迁移/排出通道4外。

Description

一种基于微流控芯片的循环肿瘤细胞分离富集系统和方法
技术领域
本发明属于微流控技术领域，尤其涉及一种基于微流控芯片的循环肿瘤细胞分离富集系统和方法。
背景技术
转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因，在肿瘤转移过程中，循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)发挥着非常重要的作用，它是来源于肿瘤的、存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。由于CTCs具有与其来源癌灶肿瘤细胞相似的基因遗传学特征，也可反映肿瘤演进、转移、耐药等特征，并具有取材方便、创伤性小等优势，因此对CTCs的分析在肿瘤早期诊断、预后评估等方面都有着重要的指导作用。
但是CTCs在血液中的含量非常少，因此对其进行分析前首先需要进行有效富集。目前CTCs的富集方法主要分为两大类：一种是基于其物理特性，利用CTCs与其它细胞在大小、密度、形变能力和电荷等方面的差异对其进行富集，这类方法具有简单易行、回收率高、速度较快等优势，但纯度相对较低；另一种是基于其生物化学特性，根据CTCs可表达来源组织的特征性标志物，如上皮标志物EpCAM等对其进行捕获富集。然而CTCs具有异质性，部分CTCs不表达EpCAM，特别是具有高转移能力的细胞常常由于发生EMT而失去其上皮特性，低表达甚至不表达上皮标志分子。虽然有研究尝试发现新标志物或组合多种标志物以提高捕获效率，但有限的标志物种类很难富集异质性的各类CTCs，CTCs富集的特异性成为限制其广泛应用的主要瓶颈。
研究表明，并非所有CTCs均能形成转移灶，仅仅那些具有强侵袭能力的细胞才真正具有形成转移灶的能力，我们将其命名为功能性循环肿瘤细胞。对这类具有形成转移灶能力的功能性循环肿瘤细胞的富集分析才更具有临床意义，但目前尚无依据其侵袭能力进行富集的方法。因此我们基于这类细胞的强转移潜能，发明一种结构简单、成本低廉的新型CTCs富集芯片，根据细胞的侵袭能力对功能性CTCs进行有效分离富集。
发明内容
本发明就是针对上述问题，提供一种基于微流控芯片的循环肿瘤细胞分离富集系统和方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案，本发明一种基于微流控芯片的循环肿瘤细胞分离富集系统包括微流控芯片，其特征在于微流控芯片包括细胞/液体注入口1、细胞捕获区域2、细胞迁移/排出通道4、基质胶通道5、开放收集区域6、细胞/液体排出口7、基质胶注入口8和基质胶排出口9，细胞捕获区域2位于所述微流控芯片中央；
所述细胞迁移/排出通道4围绕于所述细胞捕获区域2外，所述基质胶通道5围绕于所述细胞迁移/排出通道4外；
所述开放收集区域6围绕于所述基质胶通道5外；
所述细胞捕获区域2与所述细胞迁移/排出通道4之间、所述细胞迁移/排出通道4与所述基质胶通道5之间、基质胶通道5与所述开放收集区域6之间通过微缝连通；
所述细胞/液体注入口1位于所述细胞捕获区域，所述细胞/液体排出口7与所述细胞迁移/排出通道4相连通，所述基质胶注入口8和所述基质胶排出口9与所述基质胶通道5连通。
作为一种优选方案，本发明所述微流控芯片上下端具有覆盖细胞捕获区域2、细胞迁移/排出通道4、基质胶通道5的上下横板。即细胞捕获区域2、细胞迁移/排出通道4、基质胶通道5为各分立的腔体，只通过微缝连通。
作为一种优选方案，本发明所述微流控芯片为圆盘状。
作为一种优选方案，本发明所述细胞捕获区域2呈圆形。
作为另一种优选方案，本发明所述基质胶注入口8为四个，沿周向均布。
作为另一种优选方案，本发明所述基质胶排出口9为八个，沿周向均布。
作为另一种优选方案，本发明所述细胞/液体排出口7为四个，沿周向均布。
作为另一种优选方案，本发明还包括区域间隔3；区域间隔3位于细胞捕获区域2内，将所述细胞捕获区域2均等分隔为多个单元；各单元的内侧和外侧连通。
作为另一种优选方案，本发明将所述细胞捕获区域2均等分隔为四个单元。
作为另一种优选方案，本发明所述细胞迁移/排出通道4和所述基质胶通道5均呈环状，按同心圆依次排列。
作为另一种优选方案，本发明所述细胞/液体注入口1位于所述细胞捕获区域2正中央。
作为另一种优选方案，本发明所述微缝为多个，沿周向均布。
作为另一种优选方案，本发明所述微缝宽度为7-10μm。
作为另一种优选方案，本发明所述微缝宽度为8μm。
作为另一种优选方案，本发明所述细胞捕获区域2的半径为1cm。
作为另一种优选方案，本发明所述细胞迁移/排出通道4的宽度为300μm。
作为另一种优选方案，本发明所述基质胶通道5的宽度为200μm。
其次，本发明所述细胞/液体注入口1的直径为0.75mm。
另外，本发明所述微流控芯片由玻璃基底层和聚二甲基硅氧烷芯片层键合封接而成。
本发明一种基于微流控芯片的循环肿瘤细胞分离富集方法，包括以下步骤：
(1)从细胞/液体注入口1向细胞捕获区域2中泵入全血样品，直径大于微缝的循环肿瘤细胞被截留于细胞捕获区域2；红细胞及白细胞通过微缝并经细胞迁移/排出通道4排出芯片；待样品全部泵入芯片后，以一定的速度持续灌注PBS将红细胞及白细胞排出芯片；
(2)从细胞/液体注入口1向芯片中注入含血清的DMEM培养基，于培养箱中培养，使细胞贴壁；
(3)从基质胶注入口8向基质胶通道5中注入基质胶，置于培养箱中，使基质胶凝固；
(4)从细胞/液体注入口1向芯片中注入含有低浓度胎牛血清的培养基，将芯片置于含有高浓度胎牛血清培养基的细胞培养皿中，使芯片内部形成驱动循环肿瘤细胞迁移、侵袭的血清浓度梯度，细胞培养箱中培养；具有迁移、侵袭能力的循环肿瘤细胞将迁移通过细胞迁移/排出通道4，侵袭通过基质胶通道5，进入开放收集区域6。
作为一种优选方案，本发明所述(1)采用微量注射泵从细胞/液体注入口1向细胞捕获区域2中以0.6mL/h的速度泵入全血样品，直径大于8μm的循环肿瘤细胞被截留于细胞捕获区域2；红细胞及白细胞通过8μm微缝并经细胞迁移/排出通道4排出芯片；待样品全部泵入芯片后，以2mL/h的速度持续灌注PBS将红细胞及白细胞排出芯片。
作为另一种优选方案，本发明所述(2)采用微量注射泵从细胞/液体注入口1向芯片中注入含10％血清的DMEM培养基，于37℃、5％CO2培养箱中培养，使细胞贴壁。
其次，本发明所述(3)从基质胶注入口8向基质胶通道5中注入基质胶Matrigel，置于37℃培养箱中，使基质胶凝固。
另外，本发明所述(4)采用微量注射泵从细胞/液体注入口1向芯片中注入含有低浓度胎牛血清(2％)的培养基，将芯片置于含有高浓度胎牛血清(20％)培养基的细胞培养皿中，使芯片内部形成驱动循环肿瘤细胞迁移、侵袭的血清浓度梯度，细胞于37℃、5％CO2培养箱中培养；具有迁移、侵袭能力的循环肿瘤细胞将迁移通过细胞迁移/排出通道4，侵袭通过基质胶通道5，进入开放收集区域6；相差显微镜下拍照，测量芯片内前导细胞的迁移、侵袭距离，定量评价循环肿瘤细胞的转移活性。
本发明有益效果。
本发明提供一种基于微流控芯片的循环肿瘤细胞分离富集系统和方法，结合细胞大小分离技术和细胞侵袭力分析技术，通过大小分离原理去除血细胞；通过细胞穿过基质胶的能力分辨细胞侵袭力差异，直接从全血中分离富集具有高转移活性的功能性循环肿瘤细胞，提高循环肿瘤细胞分离富集的特异性。
1.本发明基于细胞的转移潜能进行循环肿瘤细胞的分离富集，相对于单纯依据细胞的物理特性或依据肿瘤标志物的富集方法，提高了循环肿瘤细胞富集的特异性，以此判断的肿瘤转移倾向会具有更强的临床相关性。
2.本发明利用微流控技术可将多个分析单元集成在一块芯片上的优势，将基于细胞大小分离和侵袭能力分离两个分离步骤连续进行，无需样品的转移，使芯片的制作及循环肿瘤细胞的富集操作更为简便有效。
3.本发明无需对血液样品进行预处理，直接取全血进样，减少了操作步骤，避免了对循环肿瘤细胞活性的影响，进而提高了检测的准确性。
4.本发明具有广泛的应用性，富集的循环肿瘤细胞可用于评价肿瘤进展及进行治疗的监控，同时，通过芯片的开放收集区域6可有效收集具有转移活性的循环肿瘤细胞，进行扩大培养建立细胞系或进行下游基于循环肿瘤细胞的单细胞基因组、转录组等分子特性的检测和功能的分析。
本发明实现了基于细胞大小特性和侵袭力特性相结合的循环肿瘤细胞的分离富集，提高了循环肿瘤细胞分离富集的特异性，提供了一种操作简便、成本低廉、直接从全血中捕获具有转移活性循环肿瘤细胞的系统和方法。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。本发明保护范围不仅局限于以下内容的表述。
图1、2实施例1基于微流控芯片的循环肿瘤细胞分离富集系统的构成。
图3、4实施例1微流控芯片系统进行循环肿瘤细胞分离富集的流程图。
图5、6实施例2微流控芯片细胞捕获区域2对全血样品中循环肿瘤细胞富集效率的分析。
图7、8实施例3微流控芯片系统对全血样品中肿瘤细胞的连续分离富集结果图。
图9、10实施例4微流控芯片系统对肿瘤患者外周血中循环肿瘤细胞的连续分离富集结果图。
图11、12、13实施例5微流控芯片系统分析通量的检测。
具体实施方式
实施例1基于微流控芯片的循环肿瘤细胞分离富集系统的构成及分离富集方法。
本系统的微流控芯片由玻璃基底层和聚二甲基硅氧烷芯片层键合封接而成。微流控芯片为圆盘状，内部结构见图1，包括细胞/液体注入口1、区域间隔3、细胞捕获区域2、细胞迁移/排出通道4、基质胶通道5、开放收集区域6、细胞/液体排出口7、基质胶注入口8和基质胶排出口9。细胞捕获区域2呈圆形，位于芯片中央，兼有向芯片内输送样品、PBS和培养基的功能；区域间隔3位于细胞捕获区域2内，将细胞捕获区域2均等分隔为四个单元，以提高系统的分析通量；细胞迁移/排出通道4围绕于细胞捕获区域2外，兼有血细胞排除和循环肿瘤细胞迁移的功能；基质胶通道5围绕于细胞迁移/排出通道4外，细胞迁移/排出通道4和基质胶通道5均呈环状，按同心圆依次排列；开放收集区域6为与芯片外环境直接连通、且无微缝间隔的开放式微通道，围绕于所述基质胶通道5外；细胞捕获区域2、细胞迁移/排出通道4、基质胶通道5和开放收集区域6之间通过一系列8μm的微缝相间隔。细胞/液体注入口1位于细胞捕获区域2正中央，液体排出口7与细胞迁移/排出通道4相连通，基质胶入口8和基质胶出口9分别位于基质胶通道5两侧。芯片置于含有培养基的培养皿中，提供细胞迁移侵袭所需的驱动力(图2)。
如图2所示，聚二甲基硅氧烷初始可为一整方块，聚二甲基硅氧烷切割后形成图示形状，聚二甲基硅氧烷先切割(切割的作用为使开放收集区域6与芯片外环境直接连通)、打孔(包括细胞/液体注入口1、基质胶注入口8等出入口，基质胶注入口8与基质胶通道5之间的通道是事先做好的，再将聚二甲基硅氧烷下端与玻璃基底层键合封接，最后放到器皿中。聚二甲基硅氧烷中部具有空腔(即本发明的细胞捕获区域2、细胞迁移/排出通道4、基质胶通道5的设置区域，各部分通过环形隔板隔开，环形隔板上设置微缝)。
如图2所示，进行循环肿瘤细胞分离富集时，采用微量注射泵从细胞/液体注入口1以0.6mL/h的速度向细胞捕获区域2中泵入全血样品，直径大于8μm的循环肿瘤细胞被截留于细胞捕获区域2；红细胞及白细胞通过8μm微缝并经细胞迁移/排出通道4排出芯片(图3)。待样品全部泵入芯片后，以2mL/h的速度持续灌注PBS将红细胞及白细胞排出芯片。采用微量注射泵从细胞/液体注入口1向芯片中注入含10％血清的培养基，于37℃、5％CO2培养箱中培养，使细胞贴壁。从基质胶注入口8向基质胶通道5中注入基质胶Matrigel，置于37℃培养箱中，使基质胶凝固。采用微量注射泵从细胞/液体注入口1向芯片中注入含有低浓度胎牛血清(2％)的培养基，将芯片置于含有高浓度胎牛血清(20％)培养基的细胞培养皿中，芯片内部形成驱动循环肿瘤细胞迁移、侵袭的血清浓度梯度，细胞于37℃、5％CO2培养箱中培养。循环肿瘤细胞将依据其迁移侵袭能力的不同迁移通过细胞迁移/排出通道4，侵袭通过基质胶通道5，进入开放收集区域6(图4)。相差显微镜下拍照，测量芯片内前导细胞的迁移、侵袭距离，定量评价循环肿瘤细胞的转移活性。侵袭进入开放区域的循环肿瘤细胞可经胰酶消化后被收集，可供进行下游的分子及功能分析。
实施例2微流控芯片系统中细胞捕获区域2对全血样品中循环肿瘤细胞富集效率的评价。
本发明的微流控芯片中的细胞捕获区域2主要用于对全血中的细胞进行基于细胞大小的分离，以去除血细胞。利用细胞捕获区域2与细胞迁移/排出通道4间的8μm微缝将血中大于8μm的循环肿瘤细胞截留于细胞捕获区域2，而小于8μm的红细胞、白细胞由微缝排入迁移通道，并经细胞排出口排出芯片，进而实现循环肿瘤细胞与血细胞的分离。本实施例即将肿瘤细胞掺入全血，评价系统基于细胞大小进行循环肿瘤细胞分离富集的效率。
取Green CMFDA活细胞示踪染料加入细胞培养基中，与培养的人胃癌细胞SGC-7901孵育45min后，胰酶消化制备细胞悬液。用细胞计数器取25～200个上述细胞，分别加入到1ml健康人外周血中，模拟临床患者外周血样品。使用微量注射泵以0.6mL/h的速度将样品泵入芯片，随后以2mL/h的速度向芯片中持续泵入PBS，将血细胞冲出。于荧光显微镜下对截留于捕获区域中的肿瘤细胞进行计数，按照捕获区域中的肿瘤细胞数/注入肿瘤细胞总数×100％计算富集效率。结果显示，被标记的肿瘤细胞可被有效截留于细胞捕获区域2(图5)，并具有满意的捕获效率(图6)。
实施例3微流控芯片系统对全血样品中肿瘤细胞的连续分离富集。
本发明的微流控系统将细胞大小分离与侵袭力分析两个分离富集过程连续进行，最终通过循环肿瘤细胞侵袭能力的分析，判断细胞的转移活性。本实施例将肿瘤细胞掺入全血，模拟临床患者外周血样品，评价系统的有效性。取对数生长期的人大肠癌细胞LoVo，胰酶消化制备细胞悬液，取200个细胞，加入到1ml健康人外周血中，制备血液样品。依据实施例1操作，将1ml血液样品泵入芯片，持续泵入PBS，将血细胞冲出。然后向芯片中通入含10％血清的培养基，使细胞贴壁。将1:9稀释的Matrigel注入基质胶通道5，胶凝固后将含有低浓度胎牛血清(2％)培养基注入芯片的细胞捕获区域2，将芯片置于含有高浓度胎牛血清(20％)培养基的培养皿中，不同时间点相差显微镜下拍照，选取5个视野测量前导细胞的细胞迁移或侵袭距离。结果显示，系统可将肿瘤细胞有效截留于细胞捕获通道，血细胞被有效排除(图7)；在不同时间点，被截留的肿瘤细胞依次迁移经过迁移通道，侵袭穿过基质胶通道5，并进入开放收集区域6(图8)，即通过本系统可以有效分离富集转移活性的细胞。
实施例4微流控芯片系统对肿瘤患者外周血中循环肿瘤细胞的连续分离富集。
本实施例采用微流控系统分离富集临床肿瘤患者外周血中的循环肿瘤细胞。取1ml肿瘤患者的外周血，依据实施例3操作，将外周血注入芯片，循环肿瘤细胞被富集于细胞捕获通道，有转移活性的细胞会进入迁移或基质胶通道5。图9所示为4个肿瘤患者外周血中循环肿瘤细胞捕获情况。将FITC-CD45荧光标记抗体泵入芯片，4℃孵育1h后用PBS冲洗。泵入4％多聚甲醛固定细胞15min，泵入PBS冲洗。注入DAPI染液，孵育8min，PBS冲洗。荧光显微镜下观察染色结果，DAPI+/CD45-判断为循环肿瘤细胞；DAPI+/CD45+判断为白细胞。结果显示，被截留于细胞捕获通道的细胞中存在DAPI+/CD45-细胞，且可被持续培养，提示该系统可捕获到患者全血中的循环肿瘤细胞(见图10)。
实施例5微流控芯片系统分析通量的评价。
本发明的微流控芯片含有四个相同的分析单元，一定程度上提高了分析通量。本实施例将肿瘤细胞注入芯片中，观察四个单元的平行分析能力。采用微量注射泵将红色染料从细胞/液体注入口1注入芯片，显微镜下观察液体扩散情况。取对数生长期的肿瘤细胞，依据实施例3操作，截留肿瘤细胞；在血清浓度梯度存在下，观察计数前导细胞的迁移侵袭距离。结果显示，注入的液体在四个单元中可均匀扩散(图11)，四个单元的细胞捕获区域2截留的肿瘤细胞数量具有良好一致性(图12)，四个单元的侵袭通道中前导细胞的侵袭距离具有良好一致性(图13)，即该微流控系统具有对多单元中样品进行平行分析的能力。
可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于微流控芯片的循环肿瘤细胞分离富集系统，包括微流控芯片，其特征在于微流控芯片包括细胞/液体注入口（1）、细胞捕获区域（2）、细胞迁移/排出通道（4）、基质胶通道（5）、开放收集区域（6）、细胞/液体排出口（7）、基质胶注入口（8）和基质胶排出口（9），细胞捕获区域（2）位于所述微流控芯片中央；
所述细胞迁移/排出通道（4）围绕于所述细胞捕获区域（2）外，所述基质胶通道（5）围绕于所述细胞迁移/排出通道（4）外；
所述开放收集区域（6）围绕于所述基质胶通道（5）外；
所述细胞捕获区域（2）与所述细胞迁移/排出通道（4）之间、所述细胞迁移/排出通道（4）与所述基质胶通道（5）之间、基质胶通道（5）与所述开放收集区域（6）之间通过微缝连通；
所述细胞/液体注入口（1）位于所述细胞捕获区域，所述细胞/液体排出口（7）与所述细胞迁移/排出通道（4）相连通，所述基质胶注入口（8）和所述基质胶排出口（9）与所述基质胶通道（5）连通。
2.根据权利要求1所述一种基于微流控芯片的循环肿瘤细胞分离富集系统，其特征在于所述微流控芯片上下端具有覆盖细胞捕获区域（2）、细胞迁移/排出通道（4）、基质胶通道（5）的上下横板。
3.根据权利要求1所述一种基于微流控芯片的循环肿瘤细胞分离富集系统，其特征在于所述微流控芯片为圆盘状。
4.根据权利要求1所述一种基于微流控芯片的循环肿瘤细胞分离富集系统，其特征在于所述细胞捕获区域（2）呈圆形。
5.根据权利要求1所述一种基于微流控芯片的循环肿瘤细胞分离富集系统，其特征在于还包括区域间隔（3）；区域间隔（3）位于细胞捕获区域（2）内，将所述细胞捕获区域（2）均等分隔为多个单元；各单元的内侧和外侧连通。
6.根据权利要求1所述一种基于微流控芯片的循环肿瘤细胞分离富集系统，其特征在于所述细胞迁移/排出通道（4）和所述基质胶通道（5）均呈环状，按同心圆依次排列。
7.根据权利要求1所述一种基于微流控芯片的循环肿瘤细胞分离富集系统，其特征在于所述细胞/液体注入口（1）位于所述细胞捕获区域（2）正中央。
8.根据权利要求1所述一种基于微流控芯片的循环肿瘤细胞分离富集系统，其特征在于所述微缝为多个，沿周向均布。
9.根据权利要求1所述一种基于微流控芯片的循环肿瘤细胞分离富集系统，其特征在于所述微流控芯片由玻璃基底层和聚二甲基硅氧烷芯片层键合封接而成。
10.一种基于微流控芯片的循环肿瘤细胞分离富集方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）从细胞/液体注入口（1）向细胞捕获区域（2）中泵入全血样品，直径大于微缝的循环肿瘤细胞被截留于细胞捕获区域（2）；红细胞及白细胞通过微缝并经细胞迁移/排出通道（4）排出芯片；待样品全部泵入芯片后，以一定的速度持续灌注PBS将红细胞及白细胞排出芯片；
（2）从细胞/液体注入口（1）向芯片中注入含血清的DMEM培养基，于培养箱中培养，使细胞贴壁；
（3）从基质胶注入口（8）向基质胶通道（5）中注入基质胶，置于培养箱中，使基质胶凝固；
（4）从细胞/液体注入口（1）向芯片中注入含有低浓度胎牛血清的培养基，将芯片置于含有高浓度胎牛血清培养基的细胞培养皿中，使芯片内部形成驱动循环肿瘤细胞迁移、侵袭的血清浓度梯度，细胞培养箱中培养；具有迁移、侵袭能力的循环肿瘤细胞将迁移通过细胞迁移/排出通道（4），侵袭通过基质胶通道（5），进入开放收集区域（6）。
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