CN106399094A - 细胞培养和梯度迁移化验方法和装置 - Google Patents

细胞培养和梯度迁移化验方法和装置 Download PDF

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Abstract

一种细胞培养和梯度迁移化验方法和装置。公开了用于微流控侵袭化验系统的制造和操作的多个新颖的改进的微流控配置和系统和方法。

Description

细胞培养和梯度迁移化验方法和装置
本案是申请号：201380018324.1，发明名称为：细胞培养和梯度迁移化验方法和装置的分案申请。
版权通知
按照37 C.F.R. 1.71(e)，申请人注意到，本公开的一部分包含受到版权保护的材料（诸如但不限于图、装置照片或这个提案（其版权保护在任何管辖区中是或可能是可得到的）的任何其它方面。版权所有者不反对由专利文件或专利公开的任何人的传真复制，因为它在专利商标局专利文件或记录中出现，但在其它方面无论如何保留所有版权。
技术领域
本发明在各种实施例中涉及用于使用微流控系统来检测细胞的侵袭行为或其它微小物体的有关行为的化验、系统和装置。特别的实施例涉及可与各种标准自动处理系统、与培养基的主动或被动装载和灌注一起使用并提供用于分析细胞侵袭、移动、趋化性或其它性质的高吞吐量多化验自动系统的配置。
技术背景
在这个提案（包括与本申请一起提交的任何文档）中的任何地方对任何工作、公布物、销售或活动的讨论不应被理解为承认任何这样的工作构成现有技术。在本文中的任何活动、工作或公布物的讨论并不承认这样的活动、工作或公布物在任何特别的管辖区中存在或是已知的。
微流控细胞培养是用于在药物筛选、组织培养、毒性筛选和生物研究中的应用的重要技术，并可提供改进的生物功能、较高质量基于细胞的数据、减少的试剂消耗和较低成本。高质量分子和细胞样品制备对各种临床、研究和其它应用是重要的。体外样品（其接近地表示其体内特性）可潜在地有益于宽范围的分子和细胞应用。细胞或其它生物上或化学上活性的材料（诸如涂覆有各种生物分子的珠子）的处理、特性化、培养和可视化在药物发现、疾病诊断和分析以及多种其它治疗和实验工作方面变得日益受重视。
在上面引用的和有关的专利申请中讨论了涉及微流控系统、装置、方法和制造的很多方面。虽然从那些申请到本文中呈现的任何权利要求中不应读到特别的限制，但这些合并的文档提供关于特定实施例的有用背景材料。
在细胞化验系统中的所感兴趣的一个领域是能够确定细胞迁移的特性的化验。这样的化验在各种类型的恶性细胞的特性化中以及也在各种刺激下的其它细胞的特性化中是重要的。
已经提出了使用微室或微流控学的一些化验。其它系统使用具有各种障碍插入物的标准培养板来试图检测细胞侵袭。然而当前可用的系统关于对使用方便、高吞吐量或自动应用所必要的很多方面已经是失败的。
如上面引用的早些时候的工作和专利申请讨论了与微流控细胞培养有关的各种配置、方法和系统，且该工作和那些公布物通过引用被并入本文中。
发明内容
本发明涉及与改进的微流控细胞培养装置和系统——特别是用于侵袭性或以其它方式新陈代谢或能动细胞的培养和分析的系统——有关的各种部件、系统和方法。在一个方面中，本发明涉及具有优于使用多培养室板或微流控结构的前面提到的侵袭或迁移或移动化验的优点的新颖的微流控细胞培养装置、系统和方法。在另一方面中，本发明涉及用于将多个微流控细胞培养和/或细胞侵袭性化验单元集成到各种多细胞培养单元系统中，诸如到包括各种标准孔板格式（例如96孔SBS培养板或其它板格式，其包括具有6、12、24、96、384或1536样品孔以及开放底部标准孔板，从而允许附接到如在本文中所述的微流控结构）的微量滴定孔板结构中的新颖结构和方法。
在特别的实施例和示例中，设计特征包括以常规格式提供侵袭化验装置，其允许管道和到板本身的连接器的消除、使用被动重力驱动流来维持长期连续灌注细胞培养的能力、对微流控板的出口孔和/或细胞侵袭观察孔或培养孔执行直接分析的能力、有效地处理凝胶培养培养基的能力。
虽然在本文中详细讨论的很多示例被设计成结合标准或定制孔板来使用，但如本文中描述的各种配置的微流控结构和培养单元和系统和方法也可独立于任何孔板（诸如在各种集成芯片实验室系统中）被采用，实施集成芯片实验室系统并不被配置成结合孔板或各种其它微流控装置或系统来使用。
为了清楚的目的，这个讨论在特定示例方面提及装置、方法和概念。然而，本发明及其方面可应用于各种类型的装置和系统。因此意图是本发明并不被限制，除了如在所附权利要求和等效形式中提供的。
此外，在本领域中公知的，诸如在本文中描述的系统和实施例可以以模块化样式包括多种不同的部件和不同的功能。本发明的不同实施例可包括元件和功能的不同混合，并可将各种功能分组为各种元件的部分。为了清楚的目的，在包括很多不同的创新部件和创新部件及已知部件的创新组合的系统方面描述了本发明。不应推断的是，将本发明限制到包含在本说明书中的任何例证性实施例中列出的所有创新部件的组合。除非在本文中另有具体规定，本文中描述的元件的任何组合应被理解为包括那些元件的任何子集的每个子组合以及还包括与本文中描述的任何其它元件组合的那些元件的任何子集的任何子组合，如本领域中的技术从业人员将理解的。
在下面的附图和详细描述中的一些中，在多部件装置或系统的重要独立实施例方面描述了本发明。这不应被理解为限制本发明的各种新颖方面，其使用本文中提供的教导可应用于很多其它情况。在下面的附图和描述中的一些中，在包括与结构的尺寸、液体的压力或体积、温度、电气值、持续时间等有关的特定参数的很多特定的示例实施例方面描述了本发明。除了在所附权利要求中这样提供的场合以外，这些参数作为示例被提供且不限制本发明，其包括具有不同尺寸的其它装置或系统。为了提供更启发性的描述的目的，特定已知的制作步骤、细胞处理步骤、试剂、化学或机械工艺和可被包括来根据本发明的特定实施例制成系统或制造装置的其它已知部件作为示例被给出。本领域中的技术人员将理解，除了在本文中另有具体提到的以外，可在本文中描述的过程中做出各种已知的替代。
在这个提交中引用的所有参考、公布物、专利和专利申请由此为了所有目的通过引用被全部并入。
附图说明
本专利的文件包括以彩色执行的至少一个附图。具有彩色附图的本专利的副本将在请求和支付必要的费用时由美国专利和商标局提供。
图1（A）是根据特定实施例的示例微流控板设计的示意图，在该示例中具有在96孔板上的24个侵袭化验单元，每个单元在该示例中包含4个孔：流入口、细胞/凝胶入口、侵袭室和流出口。（B）是示出根据本发明的特定实施例的一个侵袭培养单元的细节的示意图。
图2是用从顶部（A）和底部（B）获取的图像图示填充有蓝色染料的示例单个流单元的照片，其中底部图片通过在自上而下的方向上翻过板而被获取，使得入口孔在两个图片中的左侧。
图3A-C是根据本发明的特定实施例的在装有凝胶以示出按梯度的侵袭化验操作和细胞迁移之后的侵袭室的区域的一系列显微照片。
图4A-B是示出根据本发明的特定实施例的在化验系统和装置中的按梯度的癌细胞侵袭和细胞迁移的显微照片。
图5A-B图示根据本发明的特定实施例的具有多个入口的示例细胞培养室设计的配置和操作。
图6A-C图示根据本发明的特定实施例的示例大致矩形的细胞培养室设计和梯度室设计的配置和操作。
图7图示用于微流控活细胞成像的示例定制板框架的机械附图，并且其图示了4个独立的单元（例如行）、用于改进的光学器件的大成像窗口、空气进入/出来口（例如相邻于成像窗口）和在该示例中用来改进歧管的真空密封的孔之间的扩展空间。在该示例中，在具有2个出口孔（在该示例中，一个出口孔放大以容纳更多的体积）的情况下存在每单元6个入口孔，。
图8图示根据特定实施例的针对每一个单元有三个流入口、成像窗口、细胞入口和流出口的2个培养单元板。
图9图示根据特定实施例的针对每一个单元有三个流入口、成像窗口、细胞入口和流出口的培养单元板的16单元版本。
图10图示根据本发明的特定实施例的具有气体灌注线的示例板歧管的附图。
图11A-B是图示根据特定实施例的具有四个独立培养单元的活性控制板的示例的示意图和照片，每一个培养单元具有6个流入口、培养室和两个流出口。
图12A-C是图示根据特定实施例的具有四个独立培养单元的进一步的示例培养板的图解，每一个培养单元具有可用于实践在本文中描述的一个或多个方法的6个流入口、培养室和两个流出口。
图13图示根据特定实施例的在暴露于稳定梯度之后的细胞迁移的一个示例。
图14作为示例图示根据特定实施例的用来更好地说明梯度对在微流控细胞培养装置中的细胞移动的影响的示例X/Y细胞迁移绘图。
图15作为示例图示根据特定实施例的作为在微流控细胞培养装置中行进的距离的函数的示例细胞迁移。
图16作为示例图示根据特定实施例示出在微流控细胞培养装置中暴露于稳定梯度的细胞比在稳定培养基环境中的细胞移动得更快的绘图。
图17图示示出根据特定实施例的对梯度的暴露刺激细胞朝着高浓度汇点的主动迁移的一个示例。
图18A-C示出根据本发明的特定实施例的示例歧管的示意图的顶视图、侧视图和平面视图。在该示例中，右边的八个管道线用于压缩的空气，且每一个管道线被配置成向微流控阵列中的一列细胞入口孔的提供压力。在图中最左边的线用于真空并连接到在歧管周围的外部真空环。孔的每一列一般连接到单个压力线，其中在成像区之上的孔被跳过。
图19图示根据本发明的特定实施例的用于操作微流控板的示例系统和歧管。
图20图示根据本发明的特定实施例的具有附加的气体线和物镜并示出在连接到培养装置的微流控板中的五个活性孔的歧管。
图21是示出代表性示例逻辑装置的方框图，其中本发明的各种方面可被体现。
图22（表1）图示根据本发明的特定实施例的可被评估或者药物或其它治疗可针对其被测试的疾病、状况或状态的示例。
具体实施方式
1．概述
定义
“颗粒”指生物细胞，状如哺乳动物或细菌细胞、病毒颗粒或脂质体或根据本发明可受到化验的其它颗粒。这样的颗粒具有在大约50-100 nm之间的最小尺寸，并可大至20微米或更大。当用于描述根据本发明的细胞化验时，术语“颗粒”和“细胞”可互换地使用。
“微通道”或“通道”或“流通道”通常指的是用于流体地连接根据本发明的特定实施例的系统和装置的各种部件的微米尺度通道。微通道通常具有矩形（例如正方形）或圆形横截面，其中在优选实施例中侧边和深度尺寸分别在10和500微米之间以及10和500微米之间。在微通道中流动的流体可展示微流控行为。当用于提及在本发明的微孔阵列装置内的微通道时，术语“微通道”和“通道”可互换地使用。“流通道”一般表示设计成使培养基、试剂或其它流体或凝胶和在一些实施例中细胞通过的通道。“培养通道”或“细胞培养通道”一般表示细胞被设计成流经的且也在细胞培养期间保留的细胞培养结构的一部分（虽然在一些实施例中细胞可位于培养通道的特别的培养区中）。“空气通道”一般表示用于允许气体（诸如空气、富含氧的混合物等）在流通道或培养区附近通过的大致微米尺度的通道。“灌注通道”有时用于指示允许培养基灌注到培养区的流通道和任何灌注通路或结构。
“障碍”或“扩散障碍”或“灌注障碍”或“质量转移障碍”指的是实心结构和比流通道小的通路的组合，其一般使流通道与细胞培养区或室分离。通路一般比微通道高度和/或宽度小（例如大约5-50%或大约10%），且在一些实施例中被设计成防止细胞、其它培养物品和在一些实施例中的凝胶迁移到流通道中，同时允许通过扩散、灌注或质量转移机制的任何组合的一些流体流动，其一般具有比在流通道中的流体流动高得多的流体阻力。在一个示例实施例中，障碍具有4微米高且以其它方式沿着微通道的大部分长度延伸的通路。在其它实施例中，障碍具有大约与微流控通道一样高但大约4微米宽的很多通路。障碍也可允许细胞或细胞成分穿过障碍或其它材料或小到足以穿过通路的颗粒的一些迁移。
“微流控装置”指的是具有由微米尺度微通道连接的各种台或孔的装置，其中流体将在其穿过通道的流动中展示微流控行为。
“微孔阵列”指在衬底上形成的两个或更多的微孔的阵列。
“装置”是广泛用在本领域中的并包括宽范围的意义的术语。例如在其最基本和最不复杂的水平处，“装置”可简单地表示具有诸如通道、室和口的特征的衬底。在增加的复杂水平处，“装置”还可包括围绕所述特征的衬底或具有一致地或独立地操作的微流控特征的其它层。在其最复杂的水平处，“装置”可包括与促进在外部世界和衬底的微流控特征之间的交互作用的对象配合的全功能衬底。这样的对象可以被不同地称为支持物、外壳、壳体或如下讨论的类似术语。如在本文中使用的，术语“装置”指的是上下文可指示的这些实施例或复杂水平中的任何一个。
如在本文中使用的元件或权利要求的“任何组合”指的是元件提及物或所提及的任何个别元件的组合。
微流控系统提供强大的工具来引导生物实验。最近，基于弹性体的微流控学由于其光学透明度、气体渗透性和简单的制作方法而尤其获得普及。然而，与最终用户的接口要求穿过弹性体穿出的劳动力密集的孔以及管道和注射器泵连接的附加步骤。
本发明涉及用于各种培养和化验应用的集成微流控。本发明还涉及用于使用这样的板使细胞培养自动化的微流控和部件和系统的制造方法。特定实施例的优点包括标准微量滴定板格式、无管道细胞培养和用于化验侵袭、迁移或趋化性细胞行为的仿生微环境的使用。
可使用用于处理标准微量滴定板的标准技术和装备来操作根据本发明的特定实施例的系统（例如使用96孔标准板），如在本领域中公知的。例如，用标准吸移管机构来实现液体和/或凝胶或细胞分配，且可进行与现有的培养箱和板阅读器兼容的细胞培养和分析。
根据本发明的另外的实施例，新颖的细胞装载系统使用气动歧管和气动压力来将细胞放置在微培养区中。在添加这个细胞装载系统的情况下，可使用存在来用于处理标准滴定板的其它自动设备来完全自动化微流控细胞培养和分析。
在另外的实施例中，重力驱动流培养配置利用在入口和出口孔之间的培养基水平差以及设计流体阻力来实现在nL/min状况中的期望流率。这提供能够使培养基“被动地”流动长时间段（例如多达4天）的显著优点，而不使用庞大的外部泵或管，其在侵袭化验的情况下允许在培养开始之后的一个或多个时间段的分析的容易建立和侵袭化验结构的容易读取。
在另外的实施例中，本发明涉及用来允许对粘附和/或侵袭或迁移细胞的长期时间推移显微镜检查的细胞培养环境的控制的微流控系统。根据本发明的特定实施例，本发明提供了允许时间推移显微镜检查实验和在其它化验当中的细胞侵袭的检查的多重微流控流体室。微流控室使用灌注障碍来分离细胞与流通道和侵袭障碍以研究在培养室和侵袭室之间的细胞的侵袭性质。示例实施例被格式化到标准孔板，其允许液体和细胞/凝胶样品使用标准装备直接被吸移到适当的入口储器中。
在一些实施例中，定制气动流控制器可用于将细胞装载到培养区中以及在不同的暴露溶液之间切换。数字软件接口可用于允许用户对特定的输入（脉冲、斜面等）随着时间的编程以使细胞在时间推移成像期间暴露于复杂功能。
在活细胞中的动态响应是用于现象（诸如生物信号处理、基因表达调节、区分和细胞分裂）的基础。在特定的实施例中，本发明涉及能够以与当前细胞培养方法兼容的多重格式控制细胞微环境的系统。可使用高放大率荧光显微镜来量化细胞响应以得到具有子细胞分辨率的动力学信息。这个能力在细胞系统生物学中具有广泛的应用，其中动态单细胞响应实验当前是不实际的。虽然根据特定实施例的一些侵袭化验实施例可使用在暴露于仅仅一个培养基/试剂混合物的情况下的大部分或完全被动系统，可使用复杂的试剂调度利用如本文中所述的歧管来执行根据特定实施例的其它侵袭化验。
2．微流控培养系统和阵列
上面提到的申请讨论了多种不同的细胞培养配置和制作技术。细胞培养区的操作的部分和材料作为本讨论的背景是有用的。在其中的一些示例中，一个或多个微培养区经由流体通路的栅格（或扩散入口或导管）连接到培养基或试剂通道，其中栅格包括多个交叉高流体阻力灌注通路。在一个所讨论的示例中，栅格中的通路在高度上是大约1到4 µm、在长度上是大约25到50 µm和在宽度上是大约5到10 µm，栅格允许在培养基或试剂通道和培养区之间的更均匀的扩散，并允许更容易的制造和更均匀的扩散。还讨论了在微室和灌注/扩散通路或栅格之间的高流体阻力比（例如在大约10:1、20:1到30:1的范围内的比）较早的申请提供细胞培养的很多优点，诸如：（1）细胞的大小排除；（2）在微室内部的细胞的定位；（3）促进用于细胞生长的统一流体环境；（4）配置微室或培养区的阵列的能力；（4）制作的容易，以及（5）没有大规模阀网络的试剂的操纵。图示了示例，其中根据本发明的特定实施例，栅格状灌注障碍可以比培养区短得多或可接近于相同的高度或在相同的高度处，且另外其中图示了培养装置的各种配置。
3．侵袭化验单元
在特定实施例中，本发明还包括用于3D癌细胞侵袭化验的微流控板。在特定的示例实现中，板使用具有由微流控通道连接的4个孔的标准96孔板格式来创建每一个个别的流动和侵袭化验单元（在特定实施例中每板具有例如24个单元）。在一些实施例中，流由如在本文中其它地方讨论的毛细管力和重力驱动，其在细胞和培养基的最初引入之后允许板在标准培养箱中操作而没有外部连接。在特定的实施例中，本发明的装置将在3D凝胶中的细胞接收到培养室内。培养室通过侵袭障碍与侵袭室分离，且这两者都通过一组例如8x8微米横截面微流控孔隙或通路（在本文中有时被称为侵袭障碍）与流通道分离，因而模仿肿瘤侵袭的体内环境。
图1（A）是根据特定实施例的示例微流控板设计的示意图，其在该示例中具有在96孔板上的24个侵袭化验单元的，每一个单元在该示例中包含4个孔：流入口、细胞/凝胶入口、侵袭室和流出口。在这个实施例中，在流入口、细胞/凝胶入口和流出口中的液体与微通道接触。在侵袭室之上的孔为了更好的成像质量而保持空。板的底表面是玻璃载玻片。每板有24个流单元（每一个单元是1孔乘4孔，在8x12孔板上形成8x3阵列）。
返回到图1A-B所示的示意图，该图提供三个放大水平。在图1A-B中被标记为F7以指示在示例96孔板中的特别孔位置的最放大的区示出根据特定实施例的一个侵袭室的细节。这个侵袭化验/培养区可被理解为包括5个主要区域。
细胞/凝胶装载通道被示出在图的底部处。根据特定的实施例，混合在凝胶（例如基质胶、胶原、纤维蛋白等）中的细胞通过毛细管流或使用如本文中所述的其它主动或被动装载装置被装载到底部通道中。在操作中，通道被设计成使得凝胶填充装载通道并且也填充侵袭障碍和侵袭室的部分或全部，但不通过灌注障碍。在一个示例实施例中，装载通道在宽度上是550 µm且在高度上是50 µm。
根据特定实施例，装载通道通过侵袭障碍与侵袭室分离。在特定的示例中，侵袭障碍由近似50x8x8µm（LxWxH）尺寸的通道的网络组成。这些在一些实施例中是或变得填充有凝胶或液体，并模仿在组织中的内皮障碍。侵袭癌细胞能够穿过侵袭障碍的窄通道移动到侵袭室内。在该示例中的侵袭室在尺寸（LxWxH）上大约是4.8 x 0.5 x .05 mm，且用于对侵袭或从装载通道迁移通过侵袭障碍的细胞的数量计数。在化验操作期间，在这个室中的细胞可通过手动或自动显微镜或其它装置被计数并被量化以确定孔的侵袭索引。
灌注障碍在特定的实施例中是100x4x2 µm（LxWxH）的尺寸的通道的网络，其分离侵袭室与流通道。窄横截面防止细胞和凝胶穿过灌输障碍。培养基（和在培养基中携带的药物，包括化学引诱剂、染料或在侵袭化验中或在细胞培养中使用的其它材料）跨越灌注障碍扩散并对侵袭细胞形成梯度，模仿在脉管系统中的肿瘤环境。
100x50 µm（WxH）流通道携带从流入口孔通过侵袭室的流体，并倒空到流出口孔。来自通过灌注障碍的流的营养物的扩散喂养细胞。这个通道刺激身体中的血流。在特定的示例实施例中，重力驱动流率被设置到~20 µl/天，其允许大于3天的连续流实验而不重新填充孔。
如上陈述的，本文中提供的尺寸用于示例培养单元。根据各种特定的实施例，适合于特别的培养基或培养物品的任何尺寸可根据本文中提供的其它教导来使用。
4．侵袭化验板
根据特定的实施例，如上所述的侵袭化验单元被配置到标准培养孔板中以允许多个侵袭化验实验的同时运行。这些实验可包括单个对象——相同或不同的组织样品——的多个化验、来自不同对象的多个化验，并可包括将细胞暴露于不同的培养基、激素或其它刺激物、药物、化学引诱剂等的化验。
虽然示出在96孔板上的4孔化验单元，但不同的单元大小和不同的培养板大小也可体现本发明，如从本文中提供的讨论和在有关的并入的申请中将是清楚的。
图2是用从顶部（A）和底部（B）获取的图像图示填充有蓝色染料的示例单流单元的照片，其中底部图片通过在自上而下的方向上翻过板而被获取，使得入口孔都在两个图片中的左侧。
5．示例操作
图3A-C是根据本发明的特定实施例的在装有凝胶以示出按梯度的侵袭化验操作和细胞迁移之后的侵袭室的区域的一系列显微照片。与荧光染料（红色）混合的基质胶通过毛细管流装载到装载通道中并在37C下聚合15分钟。图3A图示侵袭室的40倍放大，其示出凝胶填充装载通道、侵袭障碍和侵袭室的部分。图3B示出侵袭障碍的200倍放大。聚合凝胶可在侵袭障碍内部以及在侵袭室中被看到。图3C示出灌注障碍的200倍放大，其示出凝胶不能越过窄通道网络。如将从本文中的教导进一步理解的，“凝胶”可具有在特定的实施例和特定的测试中降至流体粘度的各种粘度。在特定的实施例中，灌注障碍允许根据本发明使用较宽范围的凝胶粘度。
图4A-B是示出根据本发明的特定实施例的在化验系统和装置中的按梯度的癌细胞侵袭和细胞迁移的显微照片。在该示例中，HT-1080侵袭性人类胸癌细胞被装载在3D基质胶中并灌注有包含10%血清的培养基。图4A示出紧接着在凝胶的装载和聚合之后的细胞位于侵袭障碍的底侧上。图4B示出在用包含培养基的血清（HT-1080侵袭的已知信号）的灌注培养的24小时之后的细胞，细胞中的一些细胞穿过基质胶和侵袭障碍迁移以占据侵袭室。在40倍放大下用相衬获取图像。
在另外的实施例中，各种策略可用于移除在侵袭室中的所有细胞中的一些细胞，以进行另外的分析。根据特定的实施例，本发明还通过在维持细胞的侵袭室中提供培养环境来促进此，直到它们被移除。
在另外的实施例中，可通过如在本文中其它地方描述的空气通路和气孔来促进穿过限定微流控通道（诸如硅酮弹性体聚二甲基硅氧烷（PDMS））结构的材料进入培养区中的空气扩散。
如在其它地方讨论的，可对如上所述的细胞培养区进行各种修改。各种配置对灌注障碍（诸如栅格状通路结构）是可能的。对于具有本文中提供的教导的本领域中的技术人员而言将暗示其它变化。
上面公开的结构也可适于使用在标准微量滴定孔板或完全定制或部分定制的板上的更多或更少的孔的系统，诸如在所引用的文档中和在本文中的其它示例中描述的系统。
如在本文中所述的板和系统可与如在上面引用的专利申请中描述的细胞培养区和侵袭室及微流控流结构的其它配置一起使用。在一个修改的设计中，所提供的细胞培养区是本质上矩形的细胞培养室。细胞培养室具有在右边的细胞入口和出口通路，以及在右边的流出口。在该示例中，细胞通路是成对的，其中中心对用于细胞流装载，而在任一侧上的对用作细胞流出口。
一旦细胞被装载，在任何侵袭性细胞有足够的时间来穿过侵袭障碍移动之后，侵袭化验就如上面概述的继续进行。
图5A-B图示根据本发明的特定实施例的具有多个入口的示例细胞培养室设计的配置和操作。该示例包括具有交叉舱口灌注通路设计的细胞/凝胶灌注障碍和如上面讨论的侵袭障碍。交叉舱口设计允许在凝胶基质中的细胞流到室中并允许培养基的灌注。虽然交叉舱口灌注障碍目前在一些设计中是优选的，但根据特定的实施例也实现具有不同的灌注障碍或没有灌注障碍的培养室。在培养基的通道周围的流包括在障碍的同一侧上的出口和入口。图5A图示一般实施例，其中出口和入口开口被示出在右边。图5B图示左边的入口通道和右边的出口通道，该配置在使用如本文中所述的孔板的一些示例系统中更适合。该图还提供根据本发明的特定实施例的样品设计的详细示例尺寸。因此在另外的实施例中，细胞培养室被修改以允许在3D凝胶基质中的细胞的更容易培养。在这个设计中，灌注障碍分离如所示的细胞培养区和流通道。障碍被设计成将3D凝胶保持在培养室中。使障碍与上面描述的3通道细胞/凝胶入口设计耦合是提供改进的性能的重要特征。通过在障碍的每一侧上具有分开的流入口/出口，可能将流体凝胶定位在培养室中，且不使它堵塞流通道。
如上所述的侵袭障碍被放置在由图中的虚线指示的区域中，并用于使细胞进入和培养室与侵袭室分离，如从本文中的教导中将理解的。在替换的实施例中，可提供灌注通道，使得它们只相邻于侵袭室。
如在其它地方讨论的，在特定的实施例中，本发明提供了例如使用温度敏感凝胶培养基质（诸如Matrigel™、Geltrex™、骨胶原等）的生物细胞培养和侵袭化验的3D凝胶环境。示例凝胶在4C下是液体，其例如在室温或37C下聚合。在一个示例方法中，细胞最初与在冰上的细胞悬浮液混合。溶液然后被吸移到细胞入口孔中，并经由毛细管流被运送到微流控室以及培养和侵袭室中。在特定的示例中，板被保持在室温下。流率允许足够的细胞/凝胶溶液在聚合之前完全填充培养室，同时细胞在流体流动期间由于侵袭通路的大小而不进入侵袭室中。灌注障碍防止任何凝胶溶液漏到流通道中。当凝胶变暖时，它聚合到半固体质量中，其中细胞被嵌入培养区中。在流通道中的培养基的流通过侵袭室并通过凝胶扩散到细胞培养室中，并滋养细胞以进行培养，同时为侵袭性细胞提供引诱剂以穿过侵袭障碍移动到侵袭室。这个新颖设计允许本发明提供在微流控装置中的3D凝胶培养系统，同时避免使凝胶堵塞流通道的问题。
在图5B所示的示例中，蓝色区指示空气流，并且是可选的且不存在于所有实施例中。灰色区指示具有大约40 µm的示例高度的流通道，红色区指示具有大约200 µm的示例高度的细胞培养和侵袭区，且绿色区指示具有大约2 µm的示例高度的灌注障碍。黄色侵袭障碍一般具有与培养区（例如200 µm）相同的高度或相似的高度，但将具有如上所述的侵袭障碍结构。
一旦细胞被装载，在任何侵袭性细胞有足够的时间穿过侵袭障碍移动之后，侵袭化验就如上概述的继续进行。
3D凝胶系统
在有时在本文中被称为3D:M的一个示例系统中，可在3D凝胶基质中执行细胞的多重灌注成像。示例板包含可装有如用户选择的细胞/凝胶的24个独立的培养单元。在示例系统中，板的每一行（A-H）包含3个完全独立的流单元（每一个流单元有4个孔），其由培养基入口（例如列1、5、9）、细胞培养/侵袭/成像孔（例如列2、6、10）、细胞/凝胶入口（列3、7、10）和出口（列4、8、12）组成。空气扩散通道（蓝色）向细胞提供气体转移。入口被设计成允许培养基经由重力驱动过程以40 μl/天连续流到细胞。在该示例中，每一个室在大小上是1.5 x 0.5 mm，具有200 μm的高度。灌注障碍确保通过凝胶基质的均匀营养物转移，且薄覆盖玻璃底部（170 μm）允许最佳成像质量。侵袭障碍提供在培养区域和侵袭区域之间的分离。可如在上面和在并入的参考中所述的执行在这样的系统中的3D凝胶装载。
如在本文中的其它地方讨论的，各种新颖微流控细胞培养室和相关联的微流控结构中的任何一个可根据本发明的特定实施例与孔滴定板装置集成，如通常在宏细胞培养化验中使用的。下面提供了很多特定的示例，虽然本发明包括用于与微流控装置集成的其它系统。
在这个设计中，每一个培养单元由4个孔位置组成。第一孔用于灌注培养基，第二孔用于细胞入口，第三孔用于使微流控室成像，且第四孔是出口。细胞障碍/灌注通道将细胞定位到细胞区，并在连续灌注培养期间改进营养物运输。细胞入口到出口路径的低流体阻力使细胞能够经由重力或表面张力方法被快速装载，而没有外部细胞装载机制。灌注入口流通道的高流体阻力允许经由重力流的培养基的长期连续灌注，而没有任何外部泵机制。侵袭障碍操作以使经培养的细胞与侵袭区域分离，以进行侵袭化验。
在示例特定系统中，细胞室被设计成模仿空隙组织环境，其中细胞被嵌入或覆盖在生理细胞外基质（ECM）中，并经由扩散从连续灌注的毛细管通道被馈送。细胞微环境使得能够进行在例如200微米厚凝胶层中的长期生长。氧合通道维持足够的气体运输，且玻璃盖玻片底部允许高质量细胞成像。标准布局允许高级微流控单元恰好像典型96孔板一样操作。重力驱动灌注设计消除了对泵或管道连接的需要，如上所述。
在示例系统中，每单元细胞的预期数量是大约500个细胞。示例灌注速率对于单个单元是40 ul/天。细胞室体积是150 nL，且室尺寸是1.5x0.5x0.2 mm。气体扩散膜是具有底表面#1.5厚度盖玻片的50 um硅酮。
用于连续灌注的开放顶部微流控细胞培养室也可使用使侵袭区与培养区分离的第二障碍被修改。
6．示例梯度培养室
图6A-C图示根据本发明的特定实施例的示例大致矩形的细胞培养室设计和梯度室设计的配置和操作。在示例设计中，所提供的细胞培养区是本质上矩形的细胞培养室。如在图6A和图6B中图示的细胞培养室具有在右边示出的细胞入口和出口通路E2以及也在右边示出的流出口E1。在该示例中，细胞通路是成对的，其中中心对用于细胞流装载，且在任一侧上的对用作细胞流出口。多个分离的流入口被示出在左边，被标记为A1、A2、B1、B2、C1、C2，且在这个示例设计中流入口具有栅格图案以防止被细胞堵塞。空气扩散通道被示为围绕室。出口E1提供部分地与培养室隔离的流体流的出口。
图6B图示如图6A所示的培养单元的细胞装载。细胞经由低阻力流体路径（具有流动路径中的较高阻力）被装载。细胞通过阻力比（细胞优先流到细胞出口而不是流通道）被防止堵塞流路径。在这个特别的实施例中的通道被布置成使得细胞进入和细胞出来通道在室的右侧上。这导致唯一的特征，其中细胞的流进入室内，进行180度转弯，并流出来，如由图6B所示的从细胞进入到细胞出来通路的急剧弯曲的流线图示的。因此，根据本发明的特定实施例，细胞从一个或多个中心右通道被装载（经由毛细管力）并从顶部和底部右通道出来。非常少量的流朝着侧出口通道被引导（图6B所示的较长的较不弯曲的流线在室的左边缘退出）。侧流对于细胞装载不是重要的，但用来帮助将细胞更均匀地分布在室中。由于流的低粘度，细胞自然停在室地面上，而不需要任何物理障碍。细胞出口路径帮助使装载变得对称，以及增加装载到室内的细胞的数量。这个装载机制可用于装载细胞、微粒、珠子、凝胶、具有细胞的凝胶等。
图6C示出诸如在图6A-B中的设计的使用以在根据本发明的特定实施例的细胞培养室设计中建立稳定的梯度。图6C中的示例设计只稍微不同于图6A-B的设计，且对本文中的这两种设计之一描述的操作模式应用于其它设计。在图6C的示例中，细胞通路是不成对的。三个不成对的流入口被示出在左边，且这些也具有栅格图案来防止被细胞堵塞。空气扩散通道一般被放置在室附近，虽然没有在这个图中示出。图6C还图示根据本发明的特定实施例在如上所述的微流控装置中通过使2（或更多）种溶液流动来在培养室中创建梯度。
7．活动控制灌注板
图7图示用于微流控活细胞成像的示例定制板框架的机械附图，并且其图示了4个独立的单元（例如行）、用于改进的光学器件的大成像窗口、空气进入/出来口（例如相邻于成像窗口）和在该示例中用来改进歧管的真空密封的孔之间的扩展空间。在该示例中，在具有2个出口孔（在该示例中，一个出口孔放大以容纳更多的体积）的情况下存在每单元6个入口孔，。
图8图示根据特定实施例的每单元有三个流入口、成像窗口、细胞入口和流出口的2个培养单元板。
图9图示根据特定实施例的每单元有三个流入口、成像窗口、细胞入口和流出口的培养单元板的16单元版本。
图10图示根据本发明的特定实施例的具有气体灌注线的示例板歧管的附图。
图11A-B是图示根据特定实施例的具有四个独立培养单元的活性控制板的示例的示意图和照片，每一个培养单元具有6个流入口、培养室和两个流出口。图11A示出具有4个独立流单元（板的行）的板设计，其具有6个入口溶液、开放室或其它培养室、出口和重力流通道。图11B示出四个开放室（绿色圆圈），其具有在开放室之上的入口流和之下的出口流。该设计允许流从入口通传递到出口通道，而没有溢出开放室。多个液体或试剂入口的可用性提供对活细胞成像和在细胞生物学中的其它实验和化验特别好的系统。在这样的系统中，研究可研究胰脏或其它器官细胞或癌细胞的培养，以确定它们如何对不同的药物或经由入口引入的其它刺激物做出响应。在这个设计的特定实施例中，重力孔也提供来在实验被执行之前促进维持（例如喂养）细胞。板可被密封到气动歧管，从而允许对6个入口溶液的压力驱动控制。这允许实验，其中溶液在细胞上快速改变。由于在入口和培养室之间的大阻力区域，高达10 PSI的压力驱动流是可能的，从而导致在室附近的小于输入压力的1/1000的压力。
图图示了具有4个独立单元（行）、6个上游入口（A1-A6、B1-B6、C1-C6、D1-D6）、带有四个培养室的中央成像窗口、大出口孔（椭圆形，A7、B7、C7、D7）和重力灌注孔（最后一列，A8、B8、C8、D8）的活性控制板的布局。
图12A-C是图示根据特定实施例的具有四个独立培养单元的另一示例培养板的图，每一个培养单元具有可用于实践在本文中描述的一个或多个方法的6个流入口、培养室和两个流出口。在2010年6月首次销售的这个板具有4个独立的培养室（例如A-D），每一个培养室具有重力流入口（1）、四个溶液入口（2-5）、细胞入口（6）和两个共享出口孔（7和8）。如在孔的每一行（A-D）中处理对应的培养室。（b）所有四个培养室位于单个成像窗之下以最小化高放大相物镜的行进距离。（c）室由在顶部和底部边缘上的灌注障碍约束以分离室与流通道。入口孔2和3使培养基流到上通道中，而4和5使培养基流经下通道。通过使不同成分的培养基同时流经上和下通道来建立梯度。由于连续灌注，稳定的梯度可被维持延长的时间段（> 2天）。
8．应用注解，在微流控培养装置中的稳定梯度中的细胞迁移
一般，细胞迁移通过细胞与细胞外基质（ECM）、相邻细胞或化学引诱剂的交互作用而被引导和刺激。在胚胎形成期间，细胞迁移参与范围从原肠形成到神经发育的几乎所有的形态成因过程。在成人有机体中，细胞迁移有助于生理和病理疾病，并且对影响伤口愈合和肿瘤转移的治疗学的发展是重要的。最终，可通过分析对迁移调节剂（抑制剂或活化剂）的细胞响应来理解迁移的机制。因此，用于迁移细胞的量化和可视化的技术对生命科学研究已经变得重要。
最广泛接受的细胞迁移化验是使用两室多孔板的博伊登（Boyden）室化验，其中在每一个孔中的膜提供在两个室之间的多孔界面。化学引诱剂被放置在下室中，且系统被允许平衡，其中期望的是，梯度将在上孔和下孔之间形成。然而实际上，非常陡的梯度可沿着垂直于膜的表面的单轴形成，导致在上孔和下孔之间的化学引诱剂浓度中的低于预期的差异。作为结果，该方法不适合于使特定的细胞响应与特别的梯度特性（即，斜率、浓度、时间发展等）相关且不适合于研究多梯度信号积分。此外，梯度在“静止”细胞培养状况下不是非常稳定的，从而阻止活细胞成像。
根据特定的实施例，诸如在上面的图中示出的细胞培养室或系统还可用于创建在数天的过程期间对长期活细胞成像足够稳定的在数量上限定的扩散梯度。根据本文中描述的特定实施例和方法的板的这样的微流控梯度培养室使得在整个灌注障碍上的精度控制的化学引诱剂扩散能够在培养区中创建空间梯度。
根据特定的实施例，培养室的流入口和出口形成维持稳定的浓度梯度分布几天的连续流“无限源/汇点”。在上面的示例系统中的一些示例系统中，在梯度方向性中的改变开启和关闭梯度并在梯度和单个溶液暴露之间切换是可能的。
根据另外的实施例，在稳定的化学引诱剂梯度上的长期活细胞成像可用于研究恶性细胞或能够移动或迁移的其它细胞。在下面讨论的很多示例中，根据特定实施例的血清梯度对转移性胸癌细胞迁移距离、速度和趋化性程度的影响被详细地表征。
血清梯度对转移性胸癌细胞迁移距离、速度和趋化性程度的影响
在一个示例实验中，MDA-MB-231 (HTB-26™, ATCC®)、从转移性胸膜溢出部位得到的人类胸癌系被维持在完全培养基（用1O°/ov/v胎牛血清（FBS）、1%非必需氨基酸、2 mM L-谷氨酰胺和抗生素（全EMD微孔）补充的杜氏改良培养基（DMEM））中，并通过胰蛋白酶消化（TrypLE™Select, GIBCO）常规地传代以确保对数期生长。
对于实验，细胞被胰蛋白酶化、通过离心法被收获并在完全培养基中重新悬浮。10 uL的每一个细胞样品与190 uL的guava ViaCount®试剂（EMD微孔）混合并在室温（RT）下培养5分钟。样品数据在guava easyCyte™ HT仪器上被获取并使用guava ViaCount®软件（EMD微孔）被分析。
图13图示根据特定实施例的在暴露于稳定梯度之后的细胞迁移的一个示例。在这个特定的示例中，示出在使用上面描述的多个梯度培养室之一暴露于稳定的FBS梯度之后的MDA-MB-231细胞迁移。这个示例示出来自细胞室的代表性图像（10倍放大率），其中细胞在完全培养基中被培养并暴露于沿着Y轴（垂直平面）建立的0-10% FBS梯度。顶面板包含在细胞装载之后24小时捕获的图像。中间面板示出装载后96小时的细胞；培养时间在完全培养基中分成三天，后面是24小时的血清饥饿（无FBS）。从图像中明显的是，细胞膨胀和移动都在三天间隔期间出现。在底面板中的图像在梯度引入之后12小时被获取。
图13示出在三天的过程中响应于FBS梯度的单MDA-MB-231细胞的迁移。细胞膨胀和移动都在顶部行和中间行之间在三天间隔期间出现。在底面板中的图像在梯度引入后12小时被获取。一般，对于暴露于FBS梯度的那些培养物，存在细胞沿着Y轴朝着细胞室的上部障碍的明显移动。相反，在没有空间血清梯度时培养的控制细胞以多得多的随机方向性质展示较少的移动。在中间和底面板中的框（编号为1-8）用于识别特定的细胞并展示它们在12小时时间帧内的总移动。总的来说，暴露于FBS梯度的细胞倾向于优先朝着较高的FBS浓度的源移动。
图14作为示例图示根据特定实施例的用来更好地说明梯度对在微流控细胞培养装置中的细胞移动的影响的示例X/Y细胞迁移绘图。在该示例中，该绘图是用来图示在微流控培养单元中的稳定梯度（例如在MDA-MB-231上的FBS梯度）对细胞移动的影响的X/Y迁移绘图。在这个特定示例中示出的是四个绘图：（a）0/0 FBS（无梯度），（b）10/10 FBS（无梯度），（c）10/0 FBS（底部到顶部梯度），以及（d）0/10 FBS（顶部到底部梯度）。对于这个特别的示例，每一个数据集合从来自单个细胞培养室的50个代表性细胞得到，对于时间推移视频（12小时）的最初36个图像帧，这50个代表性细胞被跟踪。在每一个绘图中，黑线和红线指定相对于Y轴分别拥有净“向上”或“向下”移动的细胞。
图像J软件用于跟踪在各种培养条件下个别细胞的迁移性质。在这些示例中的一些示例中，50个细胞被监控总共12个小时；将结果呈现在图14的X/Y绘图中。分析示出了：（1）细胞倾向于在稳定培养基中比在暴露于营养物梯度时移动少得多的程度，以及（2）当梯度在培养室内被建立时，细胞迁移明显更受引导。
为了区分朝着FBS的趋化性与无方向性迁移，我们与y轴（平行于梯度）移动分开地分析了在x方向（垂直于梯度）上的移动（图6）。显著的趋化性只由暴露于FBS梯度（10/0 FBS A-C和0/10 FBS）的细胞展示。在空间恒定的FBS中的细胞展示非常小的总移动。
图15作为示例图示根据特定实施例的作为在微流控细胞培养装置中行进的距离的函数的示例细胞迁移。在这个示例中，示出作为所行进的距离的函数的MDA-B-231细胞迁移。对于六个条件中的每一个条件（对于每一个条件，n = 50个代表性细胞），所迁移的平均距离（以μm为单位）被测量为总距离（a）和欧几里得距离（b）的函数，其中后者表示从开始到结束位置的直线。
使用从迁移绘图计算的迁移距离，在图15A中示出相对于梯度条件的总迁移距离和欧几里得距离。如所示，与在稳定环境中的细胞比较，针对梯度培养存在所行进的总距离的小的增加。有趣地，在0/0（血清饥饿）和10/10（完全培养基）条件之间几乎不存在差异。相反，当净（欧几里得）距离在图15B中被评估时，大差异在这两个条件（稳定相对于梯度）之间被找到。在这种情况下，暴露于FBS梯度的细胞比在恒定的培养基状态中的那些细胞迁移得离其起源部位3倍远。这样的发现暗示细胞在梯度的高FBS浓度端处主动寻求富含营养物的培养基，且因此展示更大程度的方向性迁移。
图16作为示例图示根据特定实施例示出在微流控细胞培养装置中暴露于稳定梯度的细胞比在稳定培养基环境中的细胞移动得更快的绘图。这个示例示出在一些情况下，暴露于梯度（例如FBS）的细胞比在稳定培养基环境中的那些细胞移动得更快。这个图表展示在该示例中在四个培养条件当中的迁移速度（μm/min）中的差异。基于所迁移的平均总距离来计算速度。
通常，细胞以稍微更高的速度在建立了FBS梯度的室中迁移，。有名地，在四个梯度培养物之一（10/0 FBS（Q））中的迁移细胞比其它示例展示大得多的迁移速度。从在这个实验期间进行的观察中，存在两个因素，其可潜在地有助于加速的细胞迁移：（1）细胞在较低细胞密度的培养物中倾向于迁移得更远，以及（2）细胞群的成员倾向于比隔离的配对物迁移得更快。这后一响应潜在地由在微环境内的局部化细胞间通信引起，如前面在分析细胞间交互作用和迁移速率之间的关系的研究中报告的。
图17图示示出根据特定实施例的对梯度的暴露刺激细胞朝着高浓度汇点的主动迁移的一个示例。在该示例中，对FBS梯度的暴露刺激MDAMB-231细胞朝着高浓度汇点的主动迁移。迁移索引提供在X（垂直于梯度）和Y（平行于梯度）方向上的细胞的移动（相对于它们的原点位置）的测量。对于六个化验中的每一个化验，两个平面移动的值都被显示（每一个条表示在单个细胞室内的50个个别跟踪的细胞的平均值）。
示例建立
在上面描述的特定实验之前，在细胞培养室内的环境温度使用CellASIC™ ONIX微培养箱控制器、温度校准板和DirecTemp™温度监控软件（EMD微孔）被校准到37 ℃。细胞室使用磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液来弄整齐，磷酸盐缓冲盐水溶液从CellASIC™板的孔1、6、7和8被吸出，且10 uL培养基被吸移到孔6中。该过程对微板上的全室单元重复。板被真空密封到F84歧管。通过使用CellASIC™ ONIX FG软件，培养基被设置成以0.25 psi从孔6灌注2分钟。
对于细胞装载，胰蛋白酶化的MDA-MB-231细胞以2 x 106/mL的速度重新悬浮在完全培养基中。培养基从孔1和6中的PTFE环吸出。孔1用10 uL培养基代替，且孔6用10 uL的细胞悬浮液代替。板被真空密封到F84歧管并被放置在EVOS™fl倒置显微镜（高级显微镜检查组）的台上以监控装载过程。使用CellASIC™ ONIX FG软件通过以0.4 psi同时从孔1和6流动0.3分钟（18秒）来装载细胞。板被放置在标准37 #C / 5% C02培养箱中一个小时以在自动培养基灌注之前允许细胞附着。
对于这些示例实验，每一个实验涉及三个不同的阶段——完全培养基馈送（从入口孔2和4，以1 psi流动48小时）、血清饥饿（从入口孔3和5，以1 psi流动24小时）和暴露于0-10% FBS梯度。为了建立在培养室内的梯度，300 uL完全培养基和完全培养基减FBS分别被装载到入口孔2和4内，并以1 psi同时流动。在特定实例中，在24小时之后，梯度的定向通过切换源孔而反转以进行灌注。在这种情况下，完全培养基减FBS和完全培养基分别被装载到孔3和5内，并以1 psi同时流动。使用CellASIC™ ONIX微流控系统来完成在这个系统中的培养基灌注。
在10倍放大率下使用EVOS™fl倒置显微镜来捕获图像。在每一个实验的FBS梯度部分期间执行时间推移成像；在梯度暴露时间的长度内以20分钟间隔捕获图像。结合手动跟踪（NIH）和趋化性工具（ibid.）插件使用图像J软件（NIH）来分析来自MDA-MV-231细胞迁移化验的图像。在每一种情况下，针对在整个连续的一系列36个图像（在培养中12个小时）上的迁移性质跟踪50个代表性细胞。
实验展示了在高度控制的细胞迁移研究期间的实时活细胞成像可用于观察并研究在成为病理现象（诸如伤口愈合和肿瘤转移）的基础的机制中涉及的细胞的迁移和侵袭过程。
9．气动歧管
虽然重力或被动装载对一些微流控细胞培养装置是有效的且在一些实施例中是期望的，如在本文中和在上面引用的申请中所述的专用气动歧管可与板匹配，且气动压力可施加到细胞入口区，以进行细胞装载并进行在侵袭化验期间的培养。
根据本发明的另外的实施例，新颖的细胞装载系统使用气动歧管和气动压力来将细胞放置在微培养区中。在添加这个细胞装载系统的情况下，可使用存在来处理标准滴定板的其它自动化装置来完全自动化微流控细胞培养和分析。
在另外的实施例中，本发明涉及允许控制用于附着细胞的长期时间推移显微镜检查的细胞培养环境的微流控系统。因为朝着“系统生物学”的趋势继续，研究在个别的活细胞中的动态行为以及改进高吞吐量活细胞筛选的功能和经济性将变得日益重要。根据本发明的特定实施例，本发明提供了允许在其它化验当中的时间推移显微镜检查实验的多重微流控流动室。微流控室使用人工内皮障碍来使细胞与流通道分离。装置被格式化到标准孔板，从而允许液体和细胞样品使用标准装置被直接吸移到适当的入口储器中。定制气动流控制器然后用于将细胞装载到培养区域内以及在不同的暴露溶液之间切换。数字软件接口可用于允许用户对特定的输入（脉冲、斜面等）随着时间的编程以在时间推移成像期间将细胞暴露于复杂功能。
在活细胞中的动态响应是用于现象（诸如生物信号处理、基因表达调节、区分和细胞分裂）的基础。在特定的实施例中，本发明涉及能够以与当前细胞培养方法兼容的多重格式控制细胞微环境的系统。细胞响应可使用高放大率荧光显微镜检查来量化以得到具有亚细胞分辨率的动力学信息。这个能力在细胞系统中有广泛的应用。
图18A-C示出根据本发明的特定实施例的示例歧管的示意图的顶视图、侧视图和平面视图。在该示例中，右边的八个管道线用于压缩的空气，且每一个管道线被配置成向微流控阵列中的细胞入口孔的列提供压力。在图中最左边的线用于真空并连接到在歧管周围的外部真空环。孔的每一列一般连接到单个压力线，其中在成像区域之上的孔被跳过。歧管被放置在标准孔板或板的其它配置的顶部上。橡胶垫圈位于板和歧管之间，其中孔与歧管（未示出）匹配。真空线在孔之间的腔中创建真空，从而将板和歧管保持在一起。压力被施加到孔以将液体驱动到微流控通道（未示出）中。使用1 psi的典型压力，因此真空强度足以维持气密密封。在一个示例中存在到压力控制器的9个管道线：8个线用于压缩空气，以及1个线用于真空（最左边）。在特定的示例实施例中，每一列连接到单个压力线。在细胞成像区之上的列被跳过。
在根据本发明的特定实施例的系统中的增压细胞装载被发现在制备聚集的细胞（例如实心肿瘤、肝、肌肉等）的培养物中特别有效。增压细胞装载也允许具有细长培养区的结构有效地被装载。用于细胞装载的增压歧管和用于灌注操作和侵袭化验的被动流的使用允许本发明利用相当简单的两入口设计，而不需要如在其它设计中使用的附加的入口孔和/或阀。
修改的歧管
在另外的实施例中，板歧管包括用于将细胞浸在具有特定的气体环境（例如5% CO2）的微流控装置中的附加“气体管线”。其它示例包括氧和氮控制，但任何气态混合物可被发送到细胞。气体通过歧管流到在细胞培养区之上的密封孔中，并且在微流控装置中的孔使气体能够流到指定的微流控空气通道中，如上所述。气体可透过装置层（PDMS）在暴露细胞之前允许气体扩散到培养基中。通过使气体连续流经微流控板，稳定的气体环境被维持。
这提供用于控制气体环境以将微流控板放置在培养箱中的可选装置。在这个修改的歧管中，歧管可用于独立于周围空气而创建“微培养箱”。
图19图示根据本发明的特定实施例的用于操作微流控板的示例系统和歧管。
10．自动化系统
因为板被设计成使用符合SBS的仪器来处理，各种“现成的”机器可用于创建自动化系统。这个示意图示出这如何被完成的示例。机器人臂（板处理器）将微流控板从一个台移动到另一台。自动化培养箱在适当的温度和气体环境下存储板，以进行经由重力流的长期灌注。吸移管管理器将液体（培养基、药物、化验试剂等）分配到入口孔，并从出口孔移除液体。板阅读器用于化验。细胞装载器可选地用于在实验开始时将细胞引入微流控化验中。特别是，细胞装载器一般不是“现成的”，并通过将气动压力施加到阵列板的指定孔以引起流来操作。标准或定制计算机软件可用来使操作完整。
基本过程包括：1）将板从培养箱移除，2）经由吸移管管理器将液体从出口孔移除，3）从“板叠层”移动培养基/药物存储板，4）经由吸移管管理器将液体从培养基/药物板转移到微流控板，5）将微流控板放置在培养箱中，6）对每一个板进行重复，7）在指定的时间间隔（例如24小时）之后重复。
96孔板标准允许微流控系统使用标准技术和装置来操作。例如，液体分配用标准吸移管机械来实现，且细胞培养和分析与现有的培养箱和板阅读器兼容。定制建立的细胞装载系统可用于使用如上所述的空气压力来装载细胞。重力驱动流培养配置利用在入口和出口孔之间的培养基水平差以及设计流体阻力来实现在nL/min状况的期望流率。这提供能够“被动地”使培养基流动长时间段（例如多达4天）的显著优点，而不使用庞大的外部泵。
集成系统
用于细胞和其它数据的收集和分析以及用于本发明的数据库的编译、存储和访问的集成系统一般包括数字计算机，其具有包括用于序列搜索和/或分析的指令集的软件，和可选地高吞吐量样品控制软件、图像分析软件、已收集数据解释软件、用于将溶液从源转移到目的地（诸如检测装置）的可操作地链接到数字计算机的机器人控制电枢、用于将主题数据输入到数字计算机或用来控制分析操作或由机器人控制电枢进行的高吞吐量样品转移的输入装置（例如计算机键盘）。可选地，集成系统还包括阀、浓度梯度、流体多重通道和/或用于与如所述的微室交互作用的其它微流控结构。
使用标准操作系统的容易可得的计算硬件资源可被采用并根据本文中提供的教导而被修改，例如在本发明的集成系统中使用的PC（英特尔x86或兼容奔腾芯片的DOS™、OS2™、WINDOWS™、WINDOWS NT™、WINDOWS95™、WINDOWS98™、LINUX或甚至Macintosh、Sun 或PCs将足够了）。在软件技术中的当前技术足以允许在计算机系统上实现本文中教导的方法。因此，在特定的实施例中，本发明可包括用于执行如在本文中教导的方法中的一种或多种方法的一组逻辑指令（软件或硬件编码的指令）。例如，用于提供数据和/或统计分析的软件可由技术人员使用标准编程语言（诸如Visual Basic、Fortran、Basic、Java等）来构造。这样的软件也可利用多种统计编程语言、工具箱或库来构造。
图21示出可被理解为可从介质717和/或网络端口719读取指令的逻辑设备的信息仪器（或数字装置）700，网络端口719可以可选地连接到具有固定介质722的服务器720。设备700可在下文中使用那些指令来指导服务器或客户端逻辑，如在本领域中理解的，以体现本发明的方面。可体现本发明的一种类型的逻辑设备是如在700中所示的计算机系统，其包含CPU 707、可选的输入装置709和711、磁盘驱动器715和可选的监视器705。固定介质717或在端口719之上的固定介质722可用于对这样的系统编程并可表示磁盘型光或磁介质、磁带、固态动态或静态存储器等。在特定的实施例中，本发明可全部或部分地体现为被记录在这个固定介质上的软件。通信端口719也可用于最初接收用来对这样的系统编程并可表示任何类型的通信连接的指令。
各种编程方法和算法——包括遗传算法和神经网络——可用于执行数据收集、关联和存储功能以及其它期望功能的方面，如在本文中所述的。此外，数字或模拟系统（诸如数字或模拟计算机系统）可控制多种其它功能，诸如输入和输出文件的显示和/或控制。用于执行本发明的电气分析方法的软件也包括在本发明的计算机系统中。
其它实施例
虽然已经在各种特定的实施例方面描述了本发明，但意图不是本发明被限制到这些实施例。在本发明的精神内的修改对本领域中的技术人员而言将是明显的。
理解的是，本文中描述的示例和实施例是为了例证性目的，以及根据其的各种修改或改变对本领域中的技术人员而言将通过本文中的教导来暗示，且将被包括在本申请的精神和范围以及权利要求的范围内。
在本文中引用的或与这个提案一起提交的所有公布物、专利和专利申请——包括作为信息公开陈述的部分被提交的任何参考资料——通过引用被全部并入。

Claims (22)

1.一种用于使用微流控细胞培养系统来培养和监控细胞的方法，包括：
监控细胞（例如转移性人类胸癌细胞线MDA-MB-231）以响应于在血清浓度中的空间变化来确定它们的移动；
针对暴露于梯度的细胞（例如FBS）检测在所述梯度的正方向上沿着Y轴朝着所述细胞室的上部障碍的细胞的移动；
监控在没有空间血清梯度的情况下培养的一个或多个控制细胞以检测具有多得多的随机方向性质的较少的移动；
其中暴露于梯度的细胞被确定为优先朝着较高梯度浓度的源移动；且其中细胞膨胀和移动两者都在4小时到6天间隔期间出现，图像在梯度引入之后的某个时间段被获取。
2.一种微流控装置，包括：
a. 第一通道：
b. 分离所述第一通道与细胞室的第一障碍；
c. 分离所述细胞室与第二通道的第二障碍；
d. 所述第一通道被配置成包含第一物质；
d. 所述第二通道被配置成包含第二物质；
e. 使得在细胞保持区域中的细胞暴露于将所述细胞吸引到所述第一障碍的在所述细胞室中的所述第一物质的梯度。
3.一种微流控装置，包括：
a. 细胞室；
b. 用于使第一物质流到所述细胞室内的第一流入口；
c. 用于使第二物质流到所述细胞室内的第二流入口；
d. 至少一个细胞入口；
e. 使得在所述细胞室中的细胞暴露于所述第一物质和所述第二物质的连续稳定梯度。
4.根据权利要求3所述的微流控装置，另外其中：
所述第一流入口或所述第二流入口或这两者包括允许物质流到所述细胞室内并禁止通过所述第一流入口或所述第二流入口到所述室外部的细胞通路的多个灌注通路。
5.根据权利要求3所述的微流控装置，还包括：
f. 用于使第三物质流到所述细胞室内的第三流入口。
6.根据权利要求2所述的微流控装置，另外其中：
所述装置被配置成使得在一个或多个流通道中的流由毛细管力或重力或活性气动歧管或其任何组合驱动。
7.根据权利要求2所述的微流控装置，另外所述第一流通道或第二流通道或这两者通过测量为大约8x8微米的一组横截面微流控孔隙或通路与所述细胞室分离。
8.根据权利要求2所述的微流控装置，另外其中在第一通道孔和第二通道孔中和在出口孔中的液体与流通道接触。
9.根据权利要求2所述的微流控装置，另外其中在培养室之上的孔为了更好的成像质量而保持空，且板的底表面是载玻片。
10.根据权利要求2所述的微流控装置，其中一个或多个流通道在宽度上是大约550 μm而在高度上是50 μm。
11.根据权利要求2所述的微流控装置，其中一个或多个障碍由大约50x8x8μm（LxWxH）的通路的网络组成。
12.根据权利要求2所述的微流控装置，其中一个或多个障碍由大约100x4x2μm（LxWxH）的通路的网络组成，且另外其中所述通路的窄横截面防止细胞穿过所述障碍，且另外其中培养基和/或诸如化学引诱剂、染料或其它材料的任何物质跨越所述障碍扩散并对所述细胞形成梯度。
13.根据权利要求2所述的微流控装置，其中所述室在尺寸（LxWxH）上大约是4.8x0.5x.05mm并用于对迁移的细胞的数量计数。
14.根据权利要求2所述的微流控装置，其中在所述室中的细胞通过手动或自动显微镜被计数并被量化。
15.根据权利要求2所述的微流控装置，其中一个或多个流通道是大约100x50μm（WxH），且至少一个流通道沿着障碍从流入口孔运送流体并将所述流体倒空到流出口孔，从而允许材料从所述流通道通过所述障碍扩散。
16.根据权利要求2所述的微流控装置，其中所述装置被配置到孔板中以允许一个或多个化验实验的同时运行，所述一个或多个化验实验包括使细胞暴露于不同物质、激素或其它刺激物、药物、化学引诱剂等的化验。
17.根据权利要求2所述的微流控装置，还包括提供在维持所述细胞的所述室中的培养环境和通过限定由空气通路和气孔促进的通道的材料的空气扩散的结构。
18.根据权利要求2所述的微流控装置，另外其中在一个或多个流通道中的物质或液体的流扩散到所述细胞培养室内并滋养所述细胞以进行培养，同时提供对细胞的引诱剂。
19.根据权利要求2所述的微流控装置，另外其中每一个室在大小上是大约1.5x0.5mm，具有大约200μm的高度。
20.根据权利要求2所述的微流控装置，其中每单元细胞的预期数量是大约500个细胞。
21.根据权利要求2所述的微流控装置，其中示例灌注速率是大约40 ul/天。
22.根据权利要求2所述的微流控装置，其中示例细胞室体积是大约150 nL，且室尺寸是大约1.5x0.5x0.2mm。
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