TWI743024B - 灌注培養方法及其用途 - Google Patents

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揚 楊
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Abstract

本發明提供哺乳動物細胞的方法和利用這些培養方法的多種方法。還提供多孔細胞培養板用於例如灌注培養方法中。

Description

灌注培養方法及其用途
本發明涉及分子生物學方法、細胞培養方法開發方法和重組蛋白的製造方法。
含有編碼重組蛋白的核酸的哺乳動物細胞經常用於生產治療上或商業上重要的蛋白質。雖然有幾種高通量(HT)的細胞培養系統已在生物技術工業中用於補料分批方法數年，但是沒有已知存在的使用多孔板用於基於灌注的細胞培養的HT模型。
本發明(至少部分上)基於如下發現，即在多孔板中以本文描述的具體方式培養哺乳動物細胞導致實質性改進的活細胞密度和重組蛋白產生，並提供了大規模灌注、生產生物反應器中培養性能的精確模型。鑒於這一發現，本發明提供培養哺乳動物細胞的方法、產生重組蛋白的方法和用於測試製備重組蛋白的製造方法的方法。還提供多孔細胞培養板系統，其能夠用於例如實施任何本文所述的方法。
本發明提供培養哺乳動物細胞的方法，其包括：提供一多孔板，其包含至少一個包含置於第一液體培養基中的一哺乳動物細胞的孔，其中所述第一液體培養基佔據約5%至約70%的孔體積；在約31℃至 約40℃並伴隨約320轉每分鐘(RPM)至約500RPM旋轉攪拌將所述多孔板培養一段時間；和在該段時間內，連續地或週期性地去除第一體積的第一液體培養基並向所述第一液體培養基添加第二體積的第二液體培養基，其中所述第一和第二體積大致相等。在這些方法的一些實施方案中，所述哺乳動物細胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在這些方法的一些實施方案中，所述CHO細胞含有編碼重組蛋白(例如，免疫球蛋白、酶、生長因子、蛋白片段或工程化蛋白)的核酸。
還提供用於產生重組蛋白的方法，其包括：提供一多孔板，其包含至少一個包含置於第一液體培養基中的一哺乳動物細胞的孔，其中所述第一液體培養基佔據約5%至約70%的孔體積，並且所述哺乳動物細胞含有編碼重組蛋白的核酸；在約31℃至約40℃並伴隨約320轉每分鐘(RPM)至約500RPM旋轉攪拌將所述多孔板培養一段時間；在該段時間內，連續地或週期性地去除第一體積的第一液體培養基並向所述第一液體培養基添加第二體積的第二液體培養基，其中所述第一和第二體積大致相等；和從所述哺乳動物細胞或從所述第一或第二培養基回收所述重組蛋白。在這些方法的一些實施方案中，所述重組蛋白(例如，免疫球蛋白、酶、生長因子、蛋白片段或工程化蛋白)回收自所述哺乳動物細胞。在這些方法的一些實施方案中，所述重組蛋白(例如，分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生長因子、分泌的蛋白片段或分泌的工程化蛋白)回收自所述第一或第二液體培養基。
還提供用於測試用於製備重組蛋白的製造方法的方法，其包括：提供一多孔板，其包含至少一個包含置於第一液體培養基中的一哺乳動物細胞的孔，其中所述第一液體培養基佔據約5%至約70%的孔體積，並且所述哺乳動物細胞含有編碼重組蛋白的核酸；在約31℃至約40℃並伴隨約320轉每分鐘(RPM)至約500RPM旋轉攪拌將所述多孔 板培養一段時間；在該段時間內，連續地或週期性地去除第一體積的第一液體培養基並向所述第一液體培養基添加第二體積的第二液體培養基，其中所述第一和第二體積大致相等；檢測所述哺乳動物細胞中或所述第一或第二液體培養基中的所述重組蛋白；和將所述哺乳動物細胞中或所述第一或第二液體培養基中存在的重組蛋白的量與重組蛋白的參考水平進行比較。在這些方法的一些實施方案中，所述重組蛋白的參考水平是使用不同的培養方法產生的重組蛋白的水準。在這些方法的一些實施方案中，所述不同培養的方法利用不同的第一或第二液體培養基、不同的哺乳動物細胞、不同的溫度、不同的攪拌水準或不同的多孔板。在這些方法的一些實施方案中，所述不同的培養方法利用不同的原材料、抗結塊劑或化學成分確定的液體培養基。在一些實施方案中，這些方法用於進行高通量細胞培養實驗來執行實驗設計(design-of-experiment；DOE)或質量源於設計(quality-by-design；QDB)研究。在這些方法的一些實施方案中，在所述第一或第二液體培養基中檢測所述重組蛋白(例如，分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生長因子、分泌的蛋白片段或分泌的工程化蛋白)。在這些方法的一些實施方案中，在所述細胞中檢測所述重組蛋白(例如，免疫球蛋白、酶、生長因子、蛋白片段或工程化蛋白)。
在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述第一體積的第一液體培養基基本上不含哺乳動物細胞。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述第一液體培養基佔據約10%至約60%的孔體積。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述哺乳動物細胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述旋轉攪拌為約320RPM至約400RPM。在本文描述的任何方法中，去除第一體積的第一液體培養基和添加第二體積的第二液體培養基 同時進行。在本文描述的任何方法中，去除第一體積的第一液體培養基和添加第二體積的第二液體培養基連續或週期性進行。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，去除的第一液體培養基的第一體積和添加的第二培養基的第二體積隨時間增加。
在本文描述的任何方法的一些實施方案中，將所述多孔板培養超過7天的一段時間，並且在培養的第1至3天中的每24小時的時間段內，去除的第一液體培養基的第一體積和添加的第二培養基的第二體積是第一液體培養基的體積的約30%至約50%；在培養的第4至6天中的每24小時的時間段內，去除的第一液體培養基的第一體積和添加的第二培養基的第二體積是第一液體培養基的體積的約40%至約70%；並且從培養的第7天起的每24小時的時間段內，去除的第一液體培養基的第一體積和添加的第二培養基的第二體積是第一液體培養基的體積的約90%至約150%。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述孔具有約1mL至約18mL的體積(例如，約1mL至約7mL或約1mL至約3.5mL)。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述多孔板是6孔板、12孔板、24孔板、48孔板或96孔板。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述多孔板是深孔板(deep-well plate)。在本文描述的任何方法的一些實施方案中所述孔的底部直徑為約6.0mm至約35mm(例如，約12mm至約50mm)。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述孔的高度為約12mm至約50mm。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述哺乳動物細胞懸浮在約150μL至約15mL(例如，約150μL至約10mL，約150μL至約5mL或約150μL至約150μL)的第一培養基中。
在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述第一液體培養基和/或第二液體培養基選自下組：化學成分確定的液體培養基、無血清 液體培養基、含血清液體培養基、無動物來源組分的液體培養基和無蛋白質培養基。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，在約最初的24至48小時的時間段之後，在每24小時的時間段內，去除的第一液體培養基的第一體積和添加的第二培養基的第二體積是第一液體培養基的體積的約30%至約150%。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，在去除所述第一體積的第一液體培養基之前，使攪拌中止至少30秒的一段時間。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述多孔板用透氣性拋棄式膜或透氣性矽層(gas-permeable silicone layer)密封。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述孔具有平底或圓底。
本文描述的任何方法的一些實施方案包括週期性地添加額外體積的第二液體培養基至多個孔中的每一個，從而抵消因蒸發造成的第一液體培養基體積的任何減少。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，去除第一體積的第一液體培養基和向第一液體培養基添加第二體積的第二液體培養基使用自動化設備進行。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述多孔板是本文描述的任何多孔細胞培養板系統。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述方法在孔中產生15 x 106細胞/mL至60 x 106細胞/mL的活細胞密度。
還提供培養哺乳動物細胞的方法，其包括：在如下條件下在梯度灌注方法中培養懸浮在置於多孔板的孔中的液體培養基中的哺乳動物細胞，所述條件在所述培養基中產生的流體剪切力(fluid sheer force)和溶解氧(O2)濃度與在佔據具有約6.0mm至約35mm的直徑和約40mm至約50mm的高度的方底孔約15%至約25%體積的培養基中當所述方底孔在約31℃至約40℃的溫度下培養並且以約320轉每分鐘(RPM)至約360RPM的頻率旋轉攪拌時所實現的基本上相同。在這些 方法的一些實施方案中，所述哺乳動物細胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(例如，含有編碼重組蛋白(例如，免疫球蛋白、酶、生長因子、蛋白片段或工程化蛋白)的核酸的CHO細胞)。
還提供產生重組蛋白的方法，其包括：在如下條件下在梯度灌注方法方法中培養懸浮在置於多孔板的孔中的液體培養基中的哺乳動物細胞，所述條件在所述培養基中產生的流體剪切力和溶解氧(O2)濃度與在佔據具有約6.0mm至約35mm的直徑和約40mm至約50mm的高度的方底孔約15%至約25%體積的培養基中當所述方底孔在約31℃至約40℃的溫度下培養並且以約320轉每分鐘(RPM)至約360RPM的頻率旋轉攪拌時所實現的基本上相同；和從所述哺乳動物細胞或所述液體培養基回收所述重組蛋白。在任何這些方法的一些實施方案中，所述重組蛋白(例如，免疫球蛋白、酶、生長因子、蛋白片段或工程化蛋白)回收自所述哺乳動物細胞。在任何這些方法的一些實施方案中，所述重組蛋白(例如，分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生長因子、分泌的蛋白片段或分泌的工程化蛋白)回收自所述液體培養基。在這些方法的一些實施方案中，所述哺乳動物細胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述多孔板選自6孔板、12孔板、24孔板、48孔板或96孔板。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述多孔板是深孔板。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述液體培養基選自下組：化學成分確定的液體培養基、無血清液體培養基、含血清液體培養基、無動物來源組分的液體培養基和無蛋白質培養基。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述多孔板用透氣性拋棄式膜或透氣性矽層密封。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述多孔板包含具有平底或圓底的孔。在本 文描述的任何方法的一些實施方案中，所述多孔板是本文描述的多孔細胞培養板系統之一。在本文描述的任何方法的一些實施方案中，所述培養在孔中產生15 x 106細胞/mL至60 x 106細胞/mL的活細胞密度。
還提供多孔細胞培養板系統，其包括：統一支撐板(unitary support plate)，其包含含有多個孔隙(aperture)的第一平面；置於所述支撐板內並配置用於放置在體積方面具有約200μL至約18mL體積的細胞培養物的多個培養容器，其中每一孔隙與每一培養容器配對並且限定進入每一培養容器中的開口，並且其中每個培養容器進一步包含至少一個配置用於容納流入和/或流出所述培養容器的流體流的埠。在本文描述的任何系統的一些實施方案中，配置所述統一支撐板以包含用於放置液體和向所述埠供應液體的貯存器。在本文描述的任何系統的一些實施方案中，所述培養容器包含至少第一和第二埠，其中配置所述第一埠以容納流體的單向流流入所述培養容器，並且配置所述第二埠以容納流體的單向流流出所述培養容器。在本文描述的任何系統的一些實施方案中，所述埠包含配置用於選擇性防止細胞流入和流出所述培養容器的過濾器。在本文描述的任何系統的一些實施方案中，所述第一和第二埠各自包含配置用於選擇性防止細胞流入和流出所述培養容器的過濾器。本文描述的任何系統的一些實施方案進一步包含至少一個置於所述統一支撐板內並且與所述埠流體連接的導管，其中配置所述導管以使流體流至和/或流自所述培養容器。本文描述的任何系統的一些實施方案進一步包含至少一個與至少一個埠可操作地連接的流體流調節器。本文描述的任何系統的一些實施方案進一步包含至少一個與至少一個導管可操作地連接的流體流量計。
如用於本文，名詞前的詞語「一」代表一個或多個該特定名詞。 例如，短語「一哺乳動物細胞」代表「一個或多個哺乳動物細胞」。
術語「哺乳動物細胞」意指任何來自或源自任何哺乳動物(例如，人、倉鼠、小鼠、綠猴、大鼠、豬、牛或兔)的細胞。在一些實施方案中，哺乳動物細胞可以是永生化細胞。在一些實施方案中，所述哺乳動物細胞是分化細胞。在一些實施方案中，所述哺乳動物細胞是未分化細胞。
術語「第0天」意指將哺乳動物細胞接種到第一液體培養基中的時間點。
術語「第1天」意指在將哺乳動物細胞接種到第一液體培養基中後在第0天與約24個小時之間的時間段。
術語「第2天」意指在將哺乳動物細胞接種到第一液體培養基中後在約24小時至約48個小時之間的時間段。
術語「第3天」意指在將哺乳動物細胞接種到第一液體培養基中後在約48小時至約72個小時之間的時間段。
術語「第4天」意指在將哺乳動物細胞接種到第一液體培養基中後在約72小時至約96個小時之間的時間段。對於每多一天的術語(「第5天」、「第6天」、「第7天」，等等)意指從緊鄰的前一天結束起範圍在額外約24小時期間的時間段。
術語「基本上不含」意指至少或約90%不含(例如，至少或約95%、96%、97%、98%，或至少或約99%不含或約100%不含)特定物質(例如，哺乳動物細胞)的組合物。
術語「0.5x體積」意指體積的約50%。術語「0.6x體積」意指體積的約60%。類似地，0.7x、0.8x、0.9x和1.0x分別意指體積的約70%、80%、90%，或100%。
術語「培養」或「細胞培養」意指在一組受控的物理條件下維持 哺乳動物細胞或哺乳動物細胞的生長。
術語「液體培養基」意指含有允許哺乳動物細胞在體外生長的充足營養物的流體。例如，液體培養基可以含有下列一種或多種：胺基酸(例如，20種胺基酸)、嘌呤(例如，次黃嘌呤)，嘧啶(例如，胸苷)、膽鹼、肌醇、硫胺素、葉酸、生物素、鈣、煙醯胺、吡哆醇、核黃素、胸苷、氰鈷胺素、丙酮酸(鹽)、硫辛酸、鎂、葡萄糖、鈉、鉀、硫酸鐵、硫酸銅、硫酸鋅和碳酸氫鈉。在一些實施方案中，液體培養基可以含有來自哺乳動物的血清。在一些實施方案中，液體培養基不含血清或另一種來自哺乳動物的提取物(確定的液體培養基)。在一些實施方案中，液體培養基可含有痕量金屬、哺乳動物生長激素和/或哺乳動物生長因子。液體培養基的非限制性實例在本文中描述。液體培養基的另外的實例是本領域已知的，並且是市售的。液體培養基可含有任何密度的哺乳動物細胞。例如，如本文所使用的，從孔中去除的第一體積的第一培養基可以基本上不含哺乳動物細胞。
術語「第一液體培養基」意指適合用於哺乳動物細胞培養的一定體積的液體培養基。
術語「第二液體培養基」意指在第一和第二液體培養基進行任何混合之前適合用於與所述體積的第一液體培養基分開的哺乳動物細胞培養的一定體積的液體培養基。
術語「無動物來源組分的液體培養基」意指不含任何源自哺乳動物的組分(例如，蛋白質或血清)的液體培養基。
術語「無血清液體培養基」意指不含哺乳動物血清的液體培養基。
術語「含血清液體培養基」意指含有哺乳動物血清的液體培養基。
術語「化學成分確定的液體培養基」意指其中全部化學成分均已知的液體培養基。例如，化學成分確定的液體培養基不含胎牛血清、牛血清白蛋白、或人血清白蛋白，因為這些製備物通常含有白蛋白和脂質的複雜混合物。
術語「無蛋白質液體培養基」意指不含任何蛋白質(例如，任何可檢測蛋白)的液體培養基。
術語「攪拌」意指為了增加液體培養基中的溶解O2濃度而使含有至少一個包含所述液體培養基的孔的多孔板進行的運動。攪拌，如旋轉攪拌，可以使用任何本領域已知方法進行，例如，以圓形或橢圓形移動多孔板的設備，如旋轉振盪器(rotary shaker)。能夠用於攪拌多孔板的示例性裝置在本文描述。這些裝置的其他實例是本領域已知的，並且是市售的。
術語「免疫球蛋白」意指含有免疫球蛋白的至少15個胺基酸(例如，至少20、30、40、50、60、70、80、90或100個胺基酸)的胺基酸序列的多肽(例如，可變結構域序列、框架序列或恒定結構域序列)。例如，免疫球蛋白可包括輕鏈免疫球蛋白的至少15個胺基酸，例如重鏈免疫球蛋白的至少15個胺基酸。免疫球蛋白可以是分離的抗體(例如，IgG、IgE、IgD、IgA或IgM)。免疫球蛋白可以是IgG的亞類(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。免疫球蛋白可以是抗體片段，例如，Fab片段、F(ab')2片段或scFv片段。免疫球蛋白也可以是雙特異性抗體或三特異性抗體，或二聚體、三聚體或多聚體抗體，或雙抗體、Affibody®或Nanobody®。免疫球蛋白還可以是含有至少一個免疫球蛋白結構域的工程化蛋白(例如，融合蛋白)。免疫球蛋白的非限制性實例在本文描述，並且免疫球蛋白的其他實例是本領域已知的。
術語「蛋白片段」或「多肽片段」意指多肽序列的一部分，其長 度為至少或約4個胺基酸、至少或約5個胺基酸、至少或約6個胺基酸、至少或約7個胺基酸、至少或約8個胺基酸、至少或約9個胺基酸、至少或約10個胺基酸、至少或約11個胺基酸、至少或約12個胺基酸、至少或約13個胺基酸、至少或約14個胺基酸、至少或約15個胺基酸、至少或約16個胺基酸、至少或約17個胺基酸、至少或約18個胺基酸、至少或約19個胺基酸或至少或約20個胺基酸，或長度超過20個胺基酸。重組蛋白片段可以使用任何本文描述的方法產生。
術語「工程化蛋白」意指不是由生物體(例如，哺乳動物)內存在的內源核酸天然編碼的多肽。工程化蛋白的實例包括酶(例如，具有導致工程化的酶的穩定性和/或催化活性增加的一個或多個胺基酸取代、缺失、插入或添加)、融合蛋白、抗體(例如，二價抗體、三價抗體或雙抗體)和包含至少一種重組支架序列的抗原結合蛋白。
術語「流體剪切力」意指由與表面(例如，細胞的表面或孔的表面)大致上平行流動的液體引起的應力。流體剪切力通常被定義為所施加的力除以材料的截面積和與施加的力向量平行的面積。計算流體剪切力的示例性方法在本文中描述並且是本領域已知的。
術語「溶解O2濃度」或「溶解氧濃度」意指氧氣溶解在液體培養基中的量(例如，任何本文描述的或本領域已知的液體培養基)。非限制性的用於測量液體培養基中溶解O2濃度的方法在本文中描述，並且其它的方法是本領域已知的。
術語「回收」意指從細胞培養基中存在的一種或多種其他組分(例如，哺乳動物細胞或培養基蛋白質)或哺乳動物細胞裂解物中存在的一種或多種其他組分(例如，DNA，RNA或其他蛋白質)部分地純化或分離(例如，按重量計至少或約5%，例如，至少或約10%、15%、20%、 25%、30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或至少或約95%純的)重組蛋白。用於從液體培養基或從哺乳動物細胞裂解物回收蛋白質的非限制性方法在本文中描述，並且其它的方法是本領域已知的。
術語「分泌的蛋白」或「分泌的重組蛋白」意指這樣的蛋白質或重組蛋白，當其在哺乳動物細胞內被翻譯時原始含有至少一個分泌信號序列，並且在哺乳動物細胞中(至少部分)通過酶促切割分泌信號序列釋放到胞外空間(例如，液體培養基)中。
短語「梯度灌注」指在培養期間的時間段內(例如，約24小時的時間段、約1分鐘至約24小時的時間段或超過24小時的時間段)去除和添加的培養基體積的增量變化(例如，增加或減少)(例如，每日的培養基再補料速率)。例如，梯度灌注方法的一個實施方案可能需要如下的再補料方案：第1-3天約0.5x反應器體積的培養基(RV)/天的再補料，第4-6天約0.7x RV/天的再補料，並且第7天起約1.0x RV/天的再補料。這個特定實例可以在具有某些再補料速率的天數方面和/或在任何特定的24小時時間段內的再補料速率方面有所變化。每天去除和替換的培養基所占分數可以根據培養的特定細胞、初始接種密度和特定時間的細胞密度而改變。「RV」或「反應器體積」意指在培養過程開始時存在的培養基體積(例如，接種之後的培養基總體積)。
術語「補料分批培養」意指向初始細胞培養物遞增或連續添加第二液體培養基，而不實質或顯著地從細胞培養物去除第一液體培養基。在補料分批培養的一些實施方案中，所述第二液體培養基與所述第一液體培養基相同。在補料分批培養的一些實施方案中，所述第二液體培養基濃縮自所述第一液體培養基。在補料分批培養的一些實施方案 中，所述第二液體培養基作為乾粉添加。
「比生產率(specific productivity rate)」或「SPR」如用於本文指每天每個哺乳動物細胞產生的重組蛋白的質量或酶活性。重組抗體的SPR通常作為質量/細胞/天測量。重組酶的SPR通常作為單位/細胞/天或(單位/質量)/細胞/天測量。
「體積生產率」或「VPR」如用於本文指每天每體積的培養物(例如，每L的生物反應器、容器或管體積)產生的重組蛋白的質量或酶活性。重組抗體的VPR通常作為質量/L/天測量。重組酶的VPR通常作為單位/L/天或質量/L/天測量。
術語「微載劑」意指具有20μm至約1000μm的尺寸的顆粒(例如，有基聚合物)，其含有容許性(permissive)的表面或促進哺乳動物細胞的附著(例如，本文描述的或本領域已知的任何哺乳動物細胞)。微載劑可含有一個或多個孔(例如，具有約10μm至約100μm平均直徑的孔)。微載劑的分限定性實例在本文描述。微載劑的其他實例是本領域已知的。例如，微載劑可以含有聚合物(例如，纖維素、聚乙二醇或聚乳酸-羥基乙酸共聚物)。
除非另行限定，本文使用的科技術語具有與本發明所屬技術領域的普通技術人員通常理解的相同的含義。在本文描述了用於本發明中的用途的方法和材料；也可以使用其他本領域已知的合適的方法和材料。所述材料、方法和實例僅為說明性的而不意圖進行限制。將本文提及的全部出版物、專利申請、專利、序列、數據庫條目和其他參考文獻通過提述以其整體併入。如有衝突，以包括定義在內的本發明說明書為准。
本發明的其他特徵和優勢從如下詳述和附圖以及從請求範圍中將是顯而易見的。
圖1是一示例性多孔板系統的頂視圖的示意圖。
圖2是一示例性多孔板系統的側視圖的示意圖。
圖3是另一多孔板系統的側視圖的示意圖。
圖4是另一多孔板系統的側視圖的示意圖。
圖5是在歷時兩天的細胞灌注中的活細胞密度圖，所述細胞灌注培養在含有10-mL培養基並以160RPM攪拌的50-mL搖管中或含有200μL或300μL培養基並以330RPM攪拌的圓底96深孔板中，並且以不同分批再補料速率培養。誤差棒表示n=2的標准偏差。
圖6是細胞灌注的兩天培養物的終點活細胞密度圖，所述培養物培養在含有200μL或300μL培養基並以330RPM攪拌的圓底96深孔板中，並且以不同分批再補料速率培養(2 x 0.5反應器體積/天或1反應器體積/天)。誤差棒表示n=2的標准偏差。
圖7是細胞灌注的11天培養物的百分比細胞活力圖，所述培養物培養在含有300μL培養基並以360RPM攪拌的圓底96深孔板中，或在含有10mL培養基並以160RPM攪拌的搖管中。誤差棒表示n=2的標准偏差(對於震盪燒瓶培養物)和n=8的標准偏差(對於圓底96深孔板培養物)。
圖8是細胞灌注的11天培養物的活細胞密度，所述培養物培養在含有300μL培養基並以360RPM攪拌的圓底96深孔板中，或在含有10mL培養基並以160RPM攪拌的搖管中。誤差棒表示n=2的標准偏差(對於震盪燒瓶培養物)和n=8的標准偏差(對於圓底96深孔板培養物)。
圖9是在修改的再補料速率方案中和對照再補料速率方案中15 天培養的每一天所用的再補料速率(以反應器體積表示)圖。
圖10是在含有200μL、300μL或500μL培養基、以330RPM或360RPM攪拌並使用Applikon系統或拋棄式膜密封的方底或圓底96深孔板中培養的；或在對照搖管中培養的細胞隨時間的活細胞密度圖。誤差棒表示n=3的標准偏差。
圖11是在含有200μL、300μL或500μL培養基、以330RPM或360RPM攪拌並使用Applikon系統或拋棄式膜密封的方底或圓底96深孔板中培養的；或在對照搖管中培養的細胞隨時間的活細胞百分比圖。誤差棒表示n=3的標准偏差。
圖12是在含有200μL、300μL或500μL培養基、以330RPM或360RPM攪拌並使用Applikon系統或拋棄式膜密封的方底或圓底96深孔板中培養的；或在對照搖管中培養的細胞隨時間的活細胞密度圖。誤差棒表示n=3的標准偏差。
圖13是在含有200μL、300μL或500μL培養基、以330RPM或360RPM攪拌並使用Applikon系統或拋棄式膜密封的方底或圓底96深孔板中培養的；或在對照搖管中培養的細胞隨時間的活細胞百分比圖。誤差棒表示n=3的標准偏差。
圖14是在含有300μL或500μL培養基並以320RPM、330RPM或340RPM攪拌的方底96深孔板中培養的；或在對照搖管中培養的細胞隨時間的活細胞密度圖。誤差棒表示n=3的標准偏差。
圖15是在含有100μL、200μL或300μL CD CHO培養基並以320RPM、340RPM或360RPM攪拌的圓底96深孔板中培養的；或在對照搖管(帶有使用對照再補料速率或修改的再補料速率進行的培養基灌注)中培養的細胞隨時間的活細胞密度圖。誤差棒表示n=2的標准偏差。
圖16是在含有200μL、400μL或600μL CD CHO培養基並以320RPM、340RPM或360RPM攪拌的方底96深孔板中培養的；或在對照搖管(帶有使用對照再補料速率或修改的再補料速率進行的培養基灌注)中培養的細胞隨時間的活細胞密度圖。誤差棒表示n=2的標准偏差。
圖17是在含有100μL、200μL或300μL CD CHO培養基並以320RPM、340RPM或360RPM攪拌的圓底96深孔板中培養的細胞；或在搖管(帶有使用對照再補料速率或修改的再補料速率進行的培養基灌注)中培養的細胞的整體/積分的活細胞密度圖。誤差棒表示n=2的標准偏差。
圖18是在含有200μL、400μL或600μL CD CHO培養基並以320RPM、340RPM或360RPM攪拌的方底96深孔板中培養的細胞；或在搖管中培養的細胞(帶有使用對照再補料速率或修改的再補料速率進行的培養基灌注)的整體活細胞密度圖。誤差棒表示n=2的標准偏差。
圖19是在含有100μL、200μL或300μL CD CHO培養基並以320RPM、340RPM或360RPM攪拌的圓底96深孔板中培養的細胞；或在搖管中培養的細胞(帶有使用對照再補料速率或修改的再補料速率進行的培養基灌注)的體積生產率圖。誤差棒表示n=2的標准偏差。
圖20是在含有200μL、400μL或600μL CD CHO培養基並以320RPM、340RPM或360RPM攪拌的方底96深孔板中培養的細胞；或在搖管中培養的細胞(帶有使用對照再補料速率或修改的再補料速率進行的培養基灌注)的體積生產率圖。誤差棒表示n=2的標准偏差。
圖21是在含有100μL、200μL或300μL CD CHO培養基並以320RPM、340RPM或360RPM攪拌的圓底96深孔板中培養的細胞；或在搖管(帶有使用對照再補料速率或修改的再補料速率進行的培養基灌注)中培養的細胞的比生產率圖。誤差棒表示n=2的標准偏差。
圖22是在含有200μL、400μL或600μL CD CHO培養基並以320RPM、340RPM或360RPM攪拌的方底96深孔板中培養的細胞；或在搖管(帶有使用對照再補料速率或修改的再補料速率進行的培養基灌注)中培養的細胞的比生產率圖。誤差棒表示n=2的標准偏差。
圖23是實時數據擬合至活細胞密度的模型預測結果的圖。
圖24是實時數據擬合至體積生產率的模型預測結果的圖。
圖25是一組12幅圖，顯示了基於輸入考慮了標准偏差的統計學模型的經驗數據的最佳操作條件。
圖26是產生重組單株抗體的哺乳動物細胞系在置於方底96深孔板中並以330RPM的頻率攪拌的500μL多種不同培養基之一中的活細胞密度概貌圖。對照數據代表CD CHO培養基。
圖27是產生重組酶的哺乳動物細胞系在置於方底96深孔板中並以330RPM的頻率攪拌的活細胞密度概貌圖。對照數據代表CD CHO培養基。
圖28是產生重組單株抗體的哺乳動物細胞系在置於方底96深孔板中並以330RPM的頻率攪拌的500μL多種不同培養基之一中的培養物的滴度(mg/mL)圖。對照數據代表CD CHO培養基。
圖29是產生重組酶的哺乳動物細胞系在置於方底96深孔板中並以330RPM的頻率攪拌的500μL多種不同培養基之一中的培養物的滴度(mg/mL)圖。對照數據代表CD CHO培養基。
本文提供改進的在多孔板中培養哺乳動物細胞的方法。所述培養方法可以實現與較大規模生產灌注生物反應器所實現的類似的活哺乳動物細胞濃度(例如，在液體培養基，例如第一液體培養基，或第一和第二液體培養基的組合中)，例如，大於10 x 106細胞/mL、大於15 x 106細胞/mL、大於20 x 106細胞/mL、大於25 x 106細胞/mL、大於30 x 106細胞/mL、大於35 x 106細胞/mL、大於40 x 106細胞/mL、大於45 x 106細胞/mL、大於50 x 106細胞/mL、大於55 x 106細胞/mL或大於60 x 106細胞/mL的哺乳動物細胞密度。例如，所述培養方法能夠產生10 x 106細胞/mL至70 x 106細胞/mL、10 x 106細胞/mL至65 x 106細胞/mL、10 x 106細胞/mL至60 x 106細胞/mL、10 x 106細胞/mL至50 x 106細胞/mL、10 x 106細胞/mL至40 x 106細胞/mL、10 x 106細胞/mL至30 x 106細胞/mL、15 x 106細胞/mL至70 x 106細胞/mL、15 x 106細胞/mL至65 x 106細胞/mL、15 x 106細胞/mL至60 x 106細胞/mL、15 x 106細胞/mL至55 x 106細胞/mL、15 x 106細胞/mL至50 x 106細胞/mL、15 x 106細胞/mL至45 x 106細胞/mL、15 x 106細胞/mL至40 x 106細胞/mL、15 x 106細胞/mL至35 x 106細胞/mL、20 x 106細胞/mL至70 x 106細胞/mL、20 x 106細胞/mL至65 x 106細胞/mL、20 x 106細胞/mL至60 x 106細胞/mL、20 x 106細胞/mL至55 x 106細胞/mL、20 x 106細胞/mL至50 x 106細胞/mL、20 x 106細胞/mL至45 x 106細胞/mL、20 x 106細胞/mL至40 x 106細胞/mL、25 x 106細胞/mL至70 x 106細胞/mL、25 x 106細胞/mL至65 x 106細胞/mL、25 x 106細胞/mL至60 x 106細胞/mL、25 x 106細胞/mL至55 x 106細胞/mL、25 x 106細胞/mL至50 x 106細胞/mL、25 x 106細胞/mL至45 x 106細胞/mL、30 x 106細胞/mL至70 x 106細胞/mL、30 x 106細胞/mL 至65 x 106細胞/mL、30 x 106細胞/mL至60 x 106細胞/mL、30 x 106細胞/mL至55 x 106細胞/mL、30 x 106細胞/mL至50 x 106細胞/mL、35 x 106細胞/mL至70 x 106細胞/mL、35 x 106細胞/mL至65 x 106細胞/mL、35 x 106細胞/mL至60 x 106細胞/mL、35 x 106細胞/mL至55 x 106細胞/mL、40 x 106細胞/mL至70 x 106細胞/mL、40 x 106細胞/mL至65 x 106細胞/mL、40 x 106細胞/mL至60 x 106細胞/mL、40 x 106細胞/mL至55 x 106細胞/mL、45 x 106細胞/mL至70 x 106細胞/mL或45 x 106細胞/mL至65 x 106細胞/mL的活哺乳動物細胞濃度。多種不同的方法可以用於測定細胞密度或活細胞密度。例如，可以將細胞培養物的樣品在生理緩衝液中稀釋，將稀釋的細胞懸浮液置於血細胞計數器中，並使用光學顯微術計數細胞。在另一方法中，活細胞密度可以使用類似的方法確定，但在生理緩衝液中包括染料，所述染料被非存活細胞選擇性地攝取(例如，錐蟲藍(trypan blue)，如來自Beckman Coulter的Vi-CELL方法(見Beckman Coulter網站))。在又另一實例中，細胞密度或活細胞密度可以使用熒光輔助流式細胞術(例如，來自Merck Millipore的GUAVA(參見Millipore網站))和其他細胞計數方法確定。
在一些實施方案中，所述培養方法產生顯著改進的比生產率。例如，本文提供的方法實現的比生產率與在基本上相同的培養條件下、但不去除某個體積的第一培養基並添加第二體積的第二培養基所實現的比生產率相比是至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍大。本發明的方法實現的生產力可以是至少10,000單位/L、至少15,000單位/L、至少約20,000單位/L、至少約25,000單位/L、至少約30,000單位/L、至少約35,000單位/L或至少約40,000 單位/L(在所述第一和/或第二液體培養基中)。在一些實施方案中，本發明的方法實現的生產力可以是至少1g/L、至少1.5g/L、至少2.0g/L、至少2.5g/L、至少3.0g/L、至少4.0g/L、至少4.5g/L或至少5.0g/L。
重組蛋白的生物活性可以使用本領域已知的多種方法評估，並且會依賴於特定重組蛋白的活性。例如，作為免疫球蛋白(例如，抗體或抗體片段)的重組蛋白的生物活性可以通過測量所述抗體與其特異性表位的親和力來測定(例如，使用Biocore或競爭性酶聯吸附測定法)。所述重組蛋白可以是酶(例如，重組半乳糖苷酶，例如，重組α-半乳糖苷酶)，而生物活性可以通過測量酶的活性測定(例如，通過測量可檢測底物的濃度的減少或可檢測產物的濃度的增加(例如，使用分光光度法或光發射)來測定酶的催化速率常數)。例如，重組半乳糖苷酶的生物活性可以通過測量神經醯胺三己糖苷(GL-3)或半乳糖二糖基神經醯胺(galabiosylceramide)水準的減少，或神經醯胺二己糖苷或半乳糖水準的增加來檢測。
還提供能夠用於進行例如本文描述的任何方法的多孔細胞培養板系統。
用於測試製造方法方法的方法
本文還提供用於測試製備重組蛋白(例如，本文所述的或本領域已知的任何重組蛋白)的製造方法方法的方法。這些方法包括進行本文所述的產生重組蛋白的方法，在所述方法的過程中和/或在那之後，檢測或測量至少一種(例如，兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種、十一種、十二種、十三種或十四種)培養讀數(例如，細胞中或第一和/或第二培養基中的重組蛋白量、葡萄糖消耗、活細胞濃度、乳酸產生、體積生產率、比生產率、從葡萄糖產生乳酸的 產率、穀胺醯胺濃度、谷胺酸濃度、培養基的pH、溶解CO2的分壓或濃度、溶解O2的分壓或濃度、代謝物質量轉移和代謝物質量平衡)；並將所述至少一種培養讀數與所述至少一種(例如，兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種、十一種、十二種或十三種)培養讀數的參照水準(例如，細胞中或第一和/或第二培養基中存在的(例如，檢測的)重組蛋白量、葡萄糖消耗、活細胞濃度、乳酸產生、體積生產率、比生產率、從葡萄糖產生乳酸的產率、穀胺醯胺濃度、谷胺酸濃度、培養基的pH、溶解CO2的分壓或濃度、溶解O2的分壓或濃度、代謝物質量轉移和代謝物質量平衡的參照水準)進行比較。
熟練的操作者會理解本文描述的多種培養參數中的任何參數(例如，多孔板、體積、替代培養液體積的速率或頻率、攪拌頻率、溫度、培養基、CO2濃度和反應器角度)能夠以任何組合使用以進行這些方法。另外，本文描述的或本領域已知的任何哺乳動物細胞可以用於所述方法中。
至少一種培養讀數(例如，細胞中或第一和/或第二培養基中存在的(例如，細胞中或第一和/或第二培養基中的重組蛋白量、葡萄糖消耗、活細胞濃度、乳酸產生、體積生產率、比生產率、從葡萄糖產生乳酸的產率、穀胺醯胺濃度、谷胺酸濃度、培養基的pH、溶解CO2的分壓或濃度、溶解O2的分壓或濃度、代謝物質量轉移和代謝物質量平衡)的參照水準可以是使用不同培養方法產生的水準，所述培養方法例如利用至少一種不同的培養參數(例如，不同的第一和/或第二液體培養基、不同的哺乳動物細胞、不同的頻率和/或攪拌類型、不同的多孔板、不同的分批再補料或灌注速率(例如，在24小時時間段或其他遞增的時間段內10%至200%的孔體積或第一液體培養基體積)和任何其他本文描述的培養參數)的培養方法。例如，重組蛋白的參 照量可以是使用一組產生不同水準的溶解O2和/或不同水準的液體剪切應力的培養參數產生的重組蛋白水準。
本文描述的方法可以用於測試製造方法的任何組分或特徵的效果。例如，本文描述的方法可以用於測試不同的原料、攪拌水準、多孔板、抗結塊劑、培養基(例如，化學成分確定的培養基)或營養元素或化合物對至少一種培養讀數的效果(例如，本文描述的任何培養讀數，例如，對重組蛋白產生和/或哺乳動物細胞生長的效果)。例如，本文提供測試第一或第二液體培養基、第一或第二液體培養基中存在的原始成分或補充劑或哺乳動物細胞的來源用於在產生重組蛋白的方法中的用途的效力的方法，所述方法包括提供包含至少一個包含置於第一液體培養基中的一哺乳動物細胞的孔，所述第一液體培養基佔據約5%至約70%的孔體積；在約31℃至約40℃並伴隨約320RPM至約500RPM旋轉攪拌將所述多孔板培養一段時間；在該段時間內，連續地或週期性地去除第一體積的第一液體培養基並向所述第一液體培養基添加第二體積的第二液體培養基，其中所述第一和第二體積大致相等；檢測或測定至少一種培養讀數(例如，本文描述的任何培養讀數，例如，細胞中或第一和/或第二培養基中的重組蛋白的量)；將所述至少一種培養讀數與通過不同培養方法產生的該至少一種培養讀數(例如，本文描述的任何培養讀數，例如，細胞中或第一和/或第二培養基中的重組蛋白的量)的參照水準比較，所述不同培養方法使用不同的第一或第二液體培養基或不同的哺乳動物細胞來源中的一種或多種；並將與所述至少一種培養讀數相較于參照水準的有利變化(例如，增加或減少)(例如，增加的重組蛋白量)相關的第一或第二液體培養基、第一或第二液體培養基中存在的原始成分或補充劑或哺乳動物細胞來源鑒定為對於在產生重組蛋白的方法中的使用而言是 有效的。例如，相較于參照水準的重組蛋白水準的增加、活細胞濃度的增加、體積生產率的增加、比生產率的增加和葡萄糖消耗的增加表明該第一或第二液體培養基、第一或第二液體培養基中存在的該原始成分或補充劑或該哺乳動物細胞來源對於在產生重組蛋白的方法中的使用而言是有效的。
本文描述的方法還可用於測試改變本文描述的或本領域已知的多種細胞培養參數(例如，孔的體積、高度、直徑或底部形狀、攪拌的頻率或類型、剪切力、培養接種密度、第一或第二液體培養基的pH、溶解O2濃度或分壓、孔的內表面塗層、液體培養基(例如，第一和/或第二液體培養基)內的多種內容物、哺乳動物細胞類型或細胞系、CO2暴露或溶解CO2濃度或分壓、溫度、液體培養基的體積(例如，第一和/或第二液體培養基的體積)和/或去除第一體積的第一培養基和添加第二體積的第二培養基至第一培養基的速率或頻率)中的任何參數的效果。所述方法還可用於測試用於製備液體培養基(例如，第一和/或第二液體培養基)的水質和/或液體培養基中的不同痕量金屬對至少一種培養讀數的效果(例如，本文描述的任何培養讀數，例如，對重組蛋白產生和/或哺乳動物細胞生長的效果)。所述方法還可用於測試生長因子或生長激素對至少一種培養讀數的效果(例如，本文描述的任何培養讀數，例如，對重組蛋白產生和/或哺乳動物細胞生長的效果)。所述方法還可用於測試用於製備第一和/或第二液體培養基的過濾方法和過濾器。所述方法還可用於測試液體培養基穩定性和液體培養基對生物學功能的效果(例如，本文描述的任何培養讀數中的至少一種，例如，對重組蛋白產生和/或哺乳動物細胞生長的效果)。所述方法還可用於篩選多種重組細胞系和細胞庫產生期望的重組蛋白(例如，期望的分泌性治療蛋白)的能力。如本文所注意到的，所述 方法還可用於篩選任何細胞培養方法參數，包括但不限於，攪拌的類型和頻率、剪切力、灌注速率和體積、培養物接種密度等等。
本文描述的方法還可用於測試第一或第二液體培養基中污染物的存在、用於生成第一或第二液體培養基的原材料或哺乳動物細胞的來源。例如，本文提供測試第一或第二液體培養基中污染物的存在、用於生成第一或第二液體培養基的原材料或哺乳動物細胞的來源的方法，所述方法包括提供包含至少一個包含懸浮於第一液體培養基中的一哺乳動物細胞的孔，所述第一液體培養基佔據約5%至約70%的孔體積；在約31℃至約40℃並伴隨約320轉每分鐘(RPM)至約500RPM攪拌將所述多孔板培養一段時間；在該段時間內，連續地或週期性地去除第一體積的第一液體培養基並向所述第一液體培養基添加第二體積的第二液體培養基，其中所述第一和第二體積大致相等；檢測或測定至少一種培養讀數(例如，本文描述的任何培養讀數，例如，細胞中或第一和/或第二培養基中的重組蛋白的量)；將所述至少一種培養讀數與通過不同培養方法產生的至少一種培養讀數(例如，本文描述的任何培養讀數，例如，細胞中或第一和/或第二培養基中的重組蛋白的量)的參照水準比較，所述不同培養方法使用不同的第一或第二液體培養基、生成所述第一或第二液體培養基的不同原材料或不同的哺乳動物細胞來源中的一種或多種；並且當所述至少一種培養參數的水準相較于參照水準不利變化(例如，增加或減少)時，將該第一或第二液體培養基、生成該第一或第二液體培養基的原材料或該哺乳動物細胞來源鑒定為含有污染物。例如，與參照水準比較重組蛋白產生的減少(例如，細胞中或第一和/或第二培養基中的重組蛋白的減少)、體積生產率的減少或活細胞濃度的減少是不利的變化，其表明在該第一或第二液體培養基、用於生成該第一或第二液體培養基的原 材料或該哺乳動物細胞來源中污染物的存在。一些方法進一步包括一種或多種測定該第一或第二液體培養基、用於生成該第一或第二液體培養基的原材料或該哺乳動物細胞來源中存在的污染物的身份的測定法。污染物可能是生物污染物(例如，分枝桿菌、真菌、細菌、病毒或不希望有的哺乳動物細胞)。污染物也可能是物理上未表徵的物質。
所述方法可用于進行高通量細胞培養實驗來執行對細胞培養方法的實驗設計(design-of-experiment；DOE)或質量源於設計(quality-by-design；QBD)優化。例如，本文提供優化產生重組蛋白的製造方法的方法，所述方法包括提供包含至少一個包含懸浮於第一液體培養基中的一哺乳動物細胞的孔，所述第一液體培養基佔據約5%至約70%的孔體積；在約31℃至約40℃並伴隨約320轉每分鐘(RPM)至約500RPM旋轉攪拌將所述多孔板培養一段時間；在該段時間內，連續地或週期性地去除第一體積的第一液體培養基並向所述第一液體培養基添加第二體積的第二液體培養基，其中所述第一和第二體積大致相等；檢測至少一種培養讀數(例如，本文描述的任何培養讀數，例如，細胞中或第一和/或第二液體培養基中的重組蛋白的量)；將所述至少一種培養讀數與通過不同培養方法產生的至少一種培養讀數(例如，本文描述的任何培養讀數，例如，細胞中或第一和/或第二培養基中存在的重組蛋白的量)的參照水準比較；並且鑒定和去除或改變製造方法中與相較於至少一種培養讀數(例如，本文描述的任何培養讀數，例如，產生的重組蛋白量)的參照水準的至少一種培養讀數的不利變化(例如，增加或減少)相關的任何培養組分或參數，或鑒定並向製造方法添加與相較於至少一種培養讀數(例如，本文描述的任何培養讀數，例如，產生的重組蛋白量)的參照水準的至少一種培養 讀數的有利變化(例如，增加或減少)相關的任何培養組分或參數。例如，產生的重組蛋白量、體積生產率、比生產率或活細胞濃度的增加是培養讀數中的有利變化，而產生的重組蛋白量、體積生產率、比生產率或活細胞濃度的減少是培養讀數中的不利變化。在一些情況中，所述方法用於以高通量方式鑒定能夠用於重組蛋白的規模放大(例如，生物反應器)生產的優化的細胞培養條件。
在本節描述的任何方法中，至少一種培養讀數的參照水準可以來自較大規模培養(例如，灌注生物反應器，例如，2000-L灌注生物反應器、40-L灌注生物反應器或12-L灌注生物反應器)。在本節描述的任何方法的一些實施方案中，將哺乳動物細胞使用本文描述的任何方法培養在多孔板中，經歷與實施較大規模培養相同的時間段(平行培養)。例如，在本文描述的任何方法中用於接種多孔板的接種物也用於在大致相同的時間接種較大規模灌注生物反應器。
在一個實施方案中，用於接種孔的接種物獲得自較大規模培養(例如，較大規模灌注生物反應器)。例如，將來自任意時間點的較大規模培養的等分試樣(例如，在生長階段、過渡階段(例如，當培養物正在過渡至一組不同的生長條件例如不同的液體培養基和/或溫度的任選時期)或收穫階段期間取出)用於接種孔(例如，用於起始衛星多孔板培養)。等分試樣可以在生長階段期間自較大規模培養取出並用於接種(inoculate)或接種(seed)含有至少一個含有液體培養基的孔的多孔板，隨後將所述孔在複製了或類似於較大規模培養中採用的生長階段條件的條件下培養。作為另一種選擇或者此外，等分試樣可以取自過渡階段期間的較大規模培養並用於接種(inoculate)或接種(seed)含有至少一個含有液體培養基的孔的多孔板，隨後將所述孔在複製了或類似於較大規模培養中採用的過渡階段條件的條件下培養。作為另一種選 擇或者此外，等分試樣可以取自收穫階段期間的較大規模培養並用於接種(inoculate)或接種(seed)含有至少一個含有液體培養基的孔的多孔板，隨後將所述孔在複製了或類似於較大規模培養中採用的收穫階段條件的條件下培養。在任何這些方法中，可以改變在用於在多孔板中培養哺乳動物細胞的方法中的一種或多種培養參數(相較於在較大規模培養中用於培養所述哺乳動物細胞的培養參數或組分)，測量至少一種培養讀數，並將所述至少一種培養讀數與針對所述較大規模培養所測定的至少一種培養讀數進行比較。正如本領域技術人員能夠理解的，這些方法能夠用於測試特定培養參數或組分對培養方法中一個或多個具體階段過程中的至少一種培養讀數的效果(例如，一種或多種培養參數和/或培養組分對生長階段、任選的過渡階段和/或收穫階段期間至少一種培養讀數的效果)。
在某些實施方案中，可以執行這些方法以測定污染物是否存在於較大規模生物反應器中，其通過測定或檢測多孔板(例如，用較大規模生物反應器培養的等分試樣或用於接種較大規模生物反應器的同一冷凍細胞庫接種)中的至少一種培養讀數，將所述至少一種培養讀數與至少一種培養讀數的參照水準(例如，來自基本上不含污染的培養物的至少一種培養讀數的水準)相比，並且當與所述至少一種培養讀數的參照水準相比孔中的至少一種培養讀數指示孔中存在污染物時，將較大規模生物反應器鑒定為含有污染物。例如，所述污染物可以是生物污染物，如病毒、真菌、不希望有的哺乳動物細胞或細菌，如分枝桿菌。例如，所述污染物可以是水皰疹病毒(vesivirus)。
多孔細胞培養板系統
本說明書提供用於培養哺乳動物細胞(例如，使用任何本文所述 的方法)的示例性多孔細胞培養板系統。這些系統經設計而允許通過至少一個埠連續或週期去除培養容器中存在的流體(例如，第一液體培養基)和向培養容器添加流體(例如，第二液體培養基)，所述埠經配置以容納流入和/或流出所述培養容器的流體流。
示例性多孔細胞培養板系統
多孔細胞培養板系統1的非限定性實例的頂視圖在圖1中提供。多孔細胞培養板系統1包括統一支撐板2，統一支撐板2包含具有多個孔隙4的表面3。孔隙可以以任何形式排列，並且儘管圖1顯示孔隙呈線和行的形式，熟練的操作人員會理解可以採用孔隙的任何構型。
示例性多孔培養板系統11的非限定性實例的側視圖在圖2中提供。多孔培養板系統11包括統一支撐板2，所述統一支撐板2具有包括多個孔隙4的表面3。所述統一支撐板2可以由任何生物相容性材料(例如，聚苯乙烯或任何其他本領域已知的生物相容性材料)製成。所述統一支撐板2可以具有至少2個孔隙4(例如，4、6、9、10、12、15、18、20、24、36、48、60、72或96個孔隙4)或者可以具有至少3、4、5、6、12、18、24、36、48或96個孔隙4。圖2中所示的多孔培養板系統11具有多個在支撐板2之內形成的或設置的並配置用於容納細胞培養物(例如，本文描述的任何示例性哺乳動物細胞和/或組織培養基)的培養容器5。容器5可以經配置以容納任意體積的細胞培養物，例如，那些具有約0.3mL至約25mL(例如，約0.3mL至約24mL、約0.3mL至約22mL、約0.3mL至約20mL、約0.3mL至約18mL、約0.3mL至約16mL、約0.3mL至約14mL、約0.3mL至約12mL、約0.3mL至約10mL、約0.3mL至約8mL、約0.3mL 至約6mL、約0.3mL至約5mL、約0.3mL至約4mL、約0.3mL至約3mL、約0.3mL至約2mL、約0.3mL至約1mL、約0.5mL至約25mL、約0.5mL至約24mL、約0.5mL至約22mL、約0.5mL至約0.5mL至約20mL、約0.5mL至約18mL、約0.5mL至約16mL、約0.5mL至約14mL、約0.5mL至約12mL、約0.5mL至約10mL、約0.5mL至約8mL、約0.5mL至約6mL、約0.5mL至約5mL、約0.5mL至約4mL、約0.5mL至約3mL、約0.5mL至約2mL、約0.5mL至約1mL、約1mL至約25mL、約1mL至約24mL、約1mL至約22mL、約1mL至約20mL、約1mL至約18mL、約1mL至約16mL、約1mL至約14mL、約1mL至約12mL、約1mL至約10mL、約1mL至約8mL、約1mL至約7mL、約1mL至約6mL、約1mL至約5mL、約1mL至約4mL、約1mL至約3.5mL、約1mL至約3mL、約1mL至約2.5mL、約1mL至約2mL、約1mL至約1.5mL、約1.5mL至約25mL、約1.5mL至約24mL、約1.5mL至約22mL、約1.5mL至約20mL、約1.5mL至約18mL、約1.5mL至約16mL、約1.5mL至約14mL、約1.5mL至約12mL、約1.5mL至約10mL、約1.5mL至約8mL、約1.5mL至約6mL、約1.5mL至約5mL、約1.5mL至約4mL、約1.5mL至約3.5mL、約1.5mL至約3mL、約1.5mL至約2.5mL、約1.5mL至約2.0mL、約2mL至約25mL、約2mL至約24mL、約2mL至約22mL、約2mL至約20mL、約2mL至約18mL、約2mL至約16mL、約2mL至約14mL、約2mL至約12mL、約2mL至約10mL、約2mL至約8mL、約2mL至約6mL或約2mL至約5mL)的體積的細胞培養物，其中每一孔隙3與每一培養容器4配對並限定進入每一培養容器中的開口。
所述培養容器5可以具有不同的形狀。所述培養容器的形狀的非限定性實例可以是大致圓柱或圓柱形，其具有與孔隙4的末端相對的末端，所述末端是例如平的、半球形的、金字塔形的或圓錐形的。孔隙4的直徑可以是，例如，約4.0mm至約50mm(例如，約4.0mm至約45mm、約4.0mm至約40mm、約4.0mm至約35mm、約4.0mm至約30mm、約4.0mm至約25mm、約4.0mm至約20mm、約4.0mm至約15mm、約4.0mm至約10mm、約6.0mm至約50mm、約6.0mm至約45mm、約6.0mm至約40mm、約6.0mm至約35mm、約6.0mm至約30mm、約6.0mm至約25mm、約6.0mm至約25mm、約6.0mm至約20mm、約6.0mm至約15mm、約6.0mm至約10mm、約8mm至約50mm、約8mm至約45mm、約8mm至約40mm、約8mm至約35mm、約8mm至約30mm、約8mm至約25mm、約8mm至約20mm、約8mm至約15mm、約10mm至約50mm、約10mm至約45mm、約10mm至約40mm、約10mm至約35mm、約10mm至約30mm、約10mm至約25mm、約10mm至約20mm、約15mm至約50mm、約15mm至約45mm、約15mm至約40mm、約15mm至約35mm、約15mm至約30mm、約15mm至約25mm或約15mm至約20mm)。培養容器5可以具有約1cm至約12cm(例如，約1cm至約11cm、約1cm至約10cm、約1cm至約9cm、約1cm至約8cm、約1cm至約7cm、約1cm至約6cm、約1cm至約5cm、約1cm至約4cm、約1cm至約3cm、約1.2cm至約12cm、約1.2cm至約11cm、約1.2cm至約10cm、約1.2cm至約9cm、約1.2cm至約8cm、約1.2cm至約7cm、約1.2cm至約6cm、約1.2cm至約5cm、約1.2cm至約4cm、約1.2cm至約3cm、約1.5cm至約11cm、約1.5cm至約10cm、約1.5cm至約9cm、約1.5cm至約8cm、約 1.5cm至約7cm、約1.5cm至約6cm、約1.5cm至約5cm、約1.5cm至約4cm、約1.5cm至約3cm、約2cm至約12cm、約2cm至約11cm、約2cm至約10cm、約2cm至約9cm、約2cm至約8cm、約2cm至約7cm、約2cm至約6cm、約2cm至約5cm、約2cm至約4cm、約2cm至約3cm、約2.5cm至約12cm、約2.5cm至約11cm、約2.5cm至約10cm、約2.5cm至約9cm、約2.5cm至約8cm、約2.5cm至約7cm、約2.5cm至約6cm、約2.5cm至約5cm、約2.5cm至約4cm、約3cm至約12cm、約3cm至約11cm、約3cm至約10cm、約3cm至約9cm、約3cm至約8cm、約3cm至約7cm、約3cm至約6cm、約3cm至約5cm、約4cm至約12cm、約4cm至約11cm、約4cm至約10cm、約4cm至約9cm、約4cm至約8cm、約4cm至約7cm、約4cm至約6cm、約5cm至約12cm、約5cm至約11cm、約5cm至約10cm、約5cm至約9cm、約5cm至約8cm或約5cm至約7cm)的高度。
圖2中所示的多孔細胞培養板系統11還包括埠6，例如，一單向或多向閥，其經配置以容納流入和流出培養容器5的流體流。所述埠6可以流體連接至培養容器5的任意位置。本文描述的多孔細胞培養板系統可以具有至少一個，例如，兩個、三個或至少四個埠6流體連接至每一培養容器5。埠6與培養容器5的連接的示例性位置示於圖2和圖3中。可配置埠6以使流體以單向(例如，進或出培養容器5)或雙向流動(進和出培養容器5)。在一些實施方案中，第一埠6可經配置以容納單向流入培養容器5的單向流，而第二埠6可經配置以容納單向流出培養容器5的單向流。
圖3顯示多孔細胞培養板系統12，其包括配置用於選擇性阻止細胞流入和流出培養容器5的過濾器8。過濾器8可以是任何本領域已 知的用於過濾哺乳動物細胞的微或納米過濾器。具有兩個或多個埠6的多孔細胞培養板系統可以具有配置在每個埠6之上或之內的過濾器8，以選擇性地阻止細胞流入或流出所述培養容器5。
分別顯示於圖2和圖3中的多孔細胞培養板系統12和13還包括至少一個置於統一支撐板2之內並與埠6流體聯通的導管7，其中所述導管7經配置以使流體流至或流自培養容器5。在一些實例中，多孔細胞培養板系統可以具有與每一埠6流體聯通的導管7(例如，經配置以使流體流至和/或流自每一培養容器5)。
本文提供的多孔細胞培養板系統可進一步包括與埠6可操作連接的至少一個流體流調節器。本文提供的多孔細胞培養板系統可進一步包括與導管7可操作連接的至少一個流體流調節器。流體流調節器的非限定性實例可以通過檢測培養容器5內流體體積和/或流體壓力的變化來控制流體流動速率和/或流動方向。在一些實例中，可以對流體流調節器進行編程以使流體以特定速率以特定的了流動方向(例如，流入和/或流出培養容器5)流動一段特定的時間。
在一些實施方案中，統一支撐板2經配置以包括用於容納液體並向埠6或導管7供應液體的貯存器。在一些實例中，多孔細胞培養板系統包括用於容納液體並向埠6或導管7供應液體的貯存器，其經配置使得其在統一支撐板2的外部並且與埠6或導管7分別流體連接(其中所述埠6或導管7執行使流體流入培養容器5的功能)。在一些實施方案中，配置統一支撐板2以包括用於容納和儲存從培養容器5去除的液體的貯存器，其中所述用於容納和儲存去除的液體的貯存器在統一支撐板2的外部並且與埠6或導管7流體連接(其中所述埠6或導管7執行使流體流出培養容器5的功能)。
經配置以包括用於容納液體並將液體供應至埠6的內部貯存器9 的示例性統一支撐板2示於圖4。圖4中的統一支撐板2進一步包括交換埠10用於去除或向內部貯存器9添加液體。包括內部貯存器9的統一支撐板可以包括單向和/或雙向交換埠10(例如，單向或雙向閥)。例如，包括內部貯存器9的統一支撐板2可以具有第一交換埠10，其允許液體流入內部貯存器，以及第二交換埠，其允許液體流出內部貯存器。在另一實例中，包括內部貯存器9的統一支撐板2可以具有單一雙向交換埠10，其允許液體流入和流出內部貯存器10。內部貯存器10中存在的流體可以通過一個或多個埠6和/或導管7的使用流入和/或流出容器5。
在一些實例中，多孔細胞培養板進一步包含蓋板，其經配置以覆蓋統一支撐板2和孔隙4(例如，統一支撐板2中的全部孔隙4)，防止培養容器5的污染(例如，細菌(例如，分枝桿菌)、病毒或真菌污染)並允許培養容器5和外部環境之間的氣體交換。在一些實施方案中，多孔培養板還包括置於蓋板和統一支撐板2之間的透氣性拋棄式膜或透氣性矽層以防止培養容器5的污染，同時允許培養容器5和外部環境之間的氣體交換。
可以使用本領域已知的流體壓力、氣壓、重力和機械壓力的多種方法中的一種或多種使流體流動通過本文描述的任何系統(例如，流入和/或流出系統，例如，流入和/或流出埠6，流入和/或流出導管7，或流入和/或流出交換埠10)。例如，可以使用泵、重力、離心力或機械壓力使流體移動通過本文描述的任何系統。用於使流體流過本文描述的任何系統的其他方法是本領域已知的。
培養哺乳動物細胞的方法
在說明本文描述內容的方法中，首先提供多孔板。將第一液體培 養基添加至孔使得培養基佔據約5%至約80%(例如，約5%至約75%、約5%至約70%、約5%至約65%、約5%至約60%、約5%至約55%、約5%至約50%、約5%至約45%、約5%至約40%、約5%至約35%、約5%至約30%、約10%至約80%、約10%至約75%，約10%至約70%、約10%至約65%、約10%至約60%、約10%至約55%、約10%至約50%、約10%至約45%、約10%至約40%、約10%至約35%、約15%至約80%、約15%至約75%、約15%至約70%、約15%至約65%、約15%至約60%、約15%至約55%、約15%至約50%、約15%至約45%、約15%至約40%、約20%至約80%、約20%至約75%、約20%至約70%、約20%至約65%、約20%至約60%、約20%至約55%、約20%至約50%、約20%至約45%、約25%至約80%、約25%至約75%、約25%至約70%、約25%至約65%、約25%至約60%、約25%至約55%或約25%至約50%)的孔體積。將至少一個哺乳動物細胞添加至第一液體培養基，即，在將培養基添加至孔之前或在此之後。將多孔板在約31℃至約40℃並且以約300RPM至約600RPM(例如，本文描述的任何示例性攪拌範圍)攪拌(例如，在旋轉振盪器設備上)培養一段時間。例如，細胞可以在培養箱中培養，如拋擲(軌道)直徑約3mm至約50mm的搖動培養箱。在培養過程中，在所述時間段內連續地或週期性地去除第一體積的第一液體培養基(例如，含有任何哺乳動物細胞濃度的，例如，基本上不含哺乳動物細胞或被製成基本上不含哺乳動物細胞的第一體積的第一液體培養基)，並向所述第一液體培養基添加第二體積的第二液體培養基。通常，所述第一和第二體積大致相等，但是可以有小量的不同，例如當比較第一和第二體積時相差約1%至約10%(例如，約1%至約8%、約1%至約5%或約1%至約3%)。在一些實施方案中，添加的第二體積的第二液體培 養基少於(例如，至多少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%)去除的第一體積的第一液體培養基。如本領域已知的，術語培養可包括在其間將含有哺乳動物細胞和液體培養基的多孔板從培養箱移出從而去除第一體積的第一液體培養基並添加第二體積的第二液體培養基的短時間段(例如，至多1分鐘、至多2分鐘、至多3分鐘、至多4分鐘、至多5分鐘、至多10分鐘、至多20分鐘、至多30分鐘、至多40分鐘、至多50分鐘或至多1小時)。在一些實例中，術語培養不包括在其間將含有哺乳動物細胞和液體培養基的多孔板從培養箱移出從而去除第一體積的第一液體培養基並添加第二體積的第二液體培養基的短時間段(例如，通過使用本文描述的多孔培養板系統)。
這些培養方法的各個方面的多種非限定性實例在下文描述。本文提供的方法的示例性方面可不受限地以任意組合使用。
哺乳動物細胞
本文提供的方法可以用於培養多種不同的哺乳動物細胞。例如，所述哺乳動物細胞可以是生長在懸浮液中的細胞或者可以是貼壁細胞。能夠使用本文描述的任何方法培養的哺乳動物細胞的非限定性實例包括：中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、Sp2.0、黑素瘤細胞(例如，NS/0)、B細胞、雜交瘤細胞、T細胞、人胚胎腎(HEK)細胞(例如，HEK 293E和HEK 293F)，非洲綠猴腎上皮細胞(Vero)細胞和Madin-Darby犬(可卡犬(Cocker Spaniel))腎上皮細胞(MDCK)細胞。能夠使用本文描述的方法培養的其他哺乳動物細胞是本領域已知的。
哺乳動物細胞可以含有編碼重組蛋白的重組核酸(例如，穩定整合到所述哺乳動物細胞的基因組的核酸)。編碼示例性重組蛋白的重 組核酸的非限定性實例在下文描述，因為重組蛋白可以使用本文描述的方法產生。在一些情況中，置於用於培養的多孔板中的哺乳動物細胞源自較大培養。例如，多孔板中的哺乳動物細胞可以源自大規模生物反應器培養，即，可以使用所述方法製備衛星培養物。
培養基
液體培養基是本領域已知的。所述第一和/或第二組織培養基可以補充有哺乳動物血清(例如，胎牛血清和牛血清)和/或生長激素或生長因子(例如，胰島素、轉鐵蛋白和表皮生長因子)。作為另一種選擇或另外地，第一和/或第二液體培養基可以是化學成分確定的液體培養基、無動物來源組分的液體培養基、無血清液體培養基、含血清液體培養基或無蛋白質液體培養基。化學成分確定的液體培養基、無動物來源組分的幼體培養基、無血清液體培養基和含血清液體培養基的非限定性實例是市售的。
液體培養基通常含有能量源(例如，碳水化合物，如葡萄糖)、必需胺基酸(例如，基本組的二十種胺基酸加上半胱胺酸)、維生素和/或其他以低濃度需要的有機化合物、遊離脂肪酸和/或痕量元素。如有需要，第一和/或第二液體培養基可以補充有例如哺乳動物激素或生長因子(例如，胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽和緩衝液(例如鈣、鎂和磷酸鹽)、核苷和鹼基(例如，腺苷、胸苷和次黃嘌呤)、蛋白質和組織水解物和/或這些添加劑的任意組合。
在本文描述的方法中特別有用的液體培養基的非限定性實例包括，例如，CD CHO、Opti CHO和Forti CHO(全部可從Life Technologies；Grand Island,NY獲得)、Hycell CHO培養基(Thermo Fisher Scientific,Inc.；Waltham,MA)、Ex-cell CD CHO融合培養基 (Sigma-Aldrich Co.；St.Louis,MO)和PowerCHO培養基(Lonza Group,Ltd.；Basel,Switzerland)。在本方法中也可能有用的培養基組分包括但不限於化學成分確定(CD)的水解物，例如，CD蛋白腖、CD多肽(兩個或多個胺基酸)和CD生長因子。液體組織培養基和培養基組分的其他實例是本領域已知的。
在本文描述的任何方法的一些實施例中，將哺乳動物細胞懸浮在約100μL至約25mL(例如，約100μL至約20mL、約100μL至約15mL、約100μL至約10mL、約100μL至約8mL、約100μL至約6mL、約100μL至約4mL、約100μL至約3mL、約100μL至約2.5mL、約100μL至約2.0mL、約100μL至約1.5mL、約100μL至約1.0mL、約100μL至約800μL、約100μL至約600μL、約100μL至約500μL、約100μL至約400μL、約100μL至約300μL、約100μL至約250μL、約100μL至約200μL、約150μL至約25mL、約150μL至約20mL、約150μL至約15mL、約150μL至約10mL、約150μL至約8mL、約150μL至約6mL、約150μL至約4mL、約150μL至約3mL、約150μL至約2.5mL、約150μL至約2.0mL、約150μL至約1.5mL、約150μL至約1.0mL、約150μL至約800μL、約150μL至約600μL、約150μL至約500μL、約150μL and約400μL、約150μL至約300μL、約150μL至約200μL、約250μL至約25mL、約250μL至約20mL、約250μL至約15mL、約250μL至約10mL、約250μL至約8mL、約250μL至約6mL、約250μL至約5mL、約250μL至約4mL、約250μL至約3mL、約250μL至約2.5mL、約250μL至約2mL、約250μL至約1mL、約500μL至約25mL、約500μL至約20mL、約500μL至約15mL、約500μL至約10mL、約500μL至約8mL、約500μL至約6mL、約500μL 至約5mL、約500μL至約4mL、約500μL至約3mL、約500μL至約2.5mL、約500μL至約2mL、約500μL至約1mL、約1mL至約25mL、約1mL至約20mL、約1mL至約15mL、約1mL至約10mL、約1mL至約8mL、約1mL至約6mL、約1mL至約5mL、約1mL至約4mL、約1mL至約3mL、約1mL至約2.5mL或約1mL至約2mL)的第一培養基中。
熟練的操作者會理解本文描述的第一液體培養基和第二液體培養基可以是相同類型的培養基或是不同培養基。
微載劑
在哺乳動物細胞是貼壁細胞的一些實例中，第一和/或第二液體培養基包括多個微載劑。例如，孔可以含有例如，約1.0g/L至約15.0g/L的終濃度(例如，震盪燒瓶中約1.0g/L至約2.5g/L、約1.0g/L至約2.0g/L、約1.0g/L至約1.75g/L、約1.0g/L至約1.5g/L、約1.0g/L至約1.25g/L、約2.5g/L至5.0g/L、約5.0g/L至約7.5g/L、約7.5g/L至約10.0g/L、約10.0g/L至約12.5g/L、約12.5g/L至約15.0g/L、約1.0g/L至約5.0g/L、約5.0g/L至約10.0g/L、約10.0g/L至約15.0g/L、約2.5g/L至約3.5g/L、約3.0g/L至約4.0g/L、約4.0g/L至約5.0g/L、約5.0g/L至約6.0g/L、約6.0g/L至約7.0g/L、約7.0g/L至約8.0g/L、約8.0g/L至約9.0g/L、約9.0g/L至約10.0g/L、約10.0g/L至約11.0g/L、約11.0g/L至約12.0g/L、約12.0g/L至約13.0g/L、約13.0g/L至約14.0g/L或約14.0g/L至約15.0g/L的終濃度)的微載劑。
在一些實施方案中，多個微載劑可以具有約20μm至約1mm(例如，約20μm至約250μm、約100μm至約250μm、約150μm至約 250μm、約250μm至500μm、約200μm至約300μm、約750μm至1mm、約200μm至約800μm、約200μm至約500μm或約500μm至約800μm)的平均直徑，其中所述微載劑具有容許性的表面或促進哺乳動物細胞的附著(例如，本文描述的或本領域已知的任何哺乳動物細胞)。在一些實例中，微載劑可以含有一個或多個孔(例如，具有約10μm至約100μm(例如，約10μm至20μm、約20μm至約30μm、約30μm至約40μm、約50μm至約60μm、約60μm至約70μm、約70μm至約80μm、約80μm至約90μm、約90μm至約100μm、約10μm至約45μm、約45μm至約80μm、約25μM至約35μm或約30μm)的平均直徑的一個或多個孔)。在一些實施方案中，將多個微載劑的表面和/或多個微載劑中一個或多個孔的表面用促進哺乳動物細胞附著至微載劑(例如，附著至微載劑的外表面和/或微載劑中的孔的表面)的試劑塗覆。能夠用於促進哺乳動物細胞的附著的這些試劑的實例包括但不限於明膠、膠原蛋白、聚-L-鳥胺酸、聚苯乙烯和層粘連蛋白。
在一些實例中，微載劑具有約0.5m2/g乾重至2.0m2/g乾重(例如，約0.75m2/g乾重至1.25m2/乾重、約1.0m2/g乾重至約1.5m2/乾重、約1.25m2/乾重至約1.5m2/乾重、約1.5m2/乾重至約2.0m2/乾重，或約1.1m2/乾重)的平均有效細胞結合表面積。在一些實例中，微載劑具有約10mL/g乾重至約70mL/g乾重(例如，約10mL/g乾重至約20mL/g乾重、約20mL/g乾重至約30mL/g乾重、約30mL/g乾重至約40mL/g乾重、約40mL/g乾重至約50mL/g乾重、約50mL/g乾重至約60mL/g乾重、約60mL/g乾重至約70mL/g乾重、約10mL/g乾重至約40mL/g乾重、約30mL/g乾重至約40mL/g乾重、約40mL/g乾重至約70mL/g乾重，或約40mL/g乾重)的平均體積。在一些實施 方案中，微載劑的平均相對密度為0.8g/mL至約1.2g/mL(例如，約0.8g/mL至約0.9g/mL、約0.9g/mL至約1.0g/mL、約1.0g/mL至約1.1g/mL、約1.0g/mL、約1.1g/mL至約1.2g/mL、約0.95g/mL至約1.05g/mL，或約1.03g/mL)。
在一些實施方案中，微載劑大致為球形或橢球形的形狀。在其他實例中，微載劑具有經刮擦的或粗糙的表面，其帶有增加微載劑的外表面總面積的小突起。在一些實施方案中，微載劑具有網絡狀結構。在一些實施方案中，微載劑是吸濕性的。在一些實例中，微載劑含有纖維素。在一些實施方案中，微載劑具有的外表面和/或微載劑孔具有的表面是荷正電的(例如，由於N,N-二乙基胺基乙基基團的存在而荷正電)。在一些實例中，微載劑具有網絡或網狀或網樣結構。微載劑可具有約0.5me/g至約2.5me/g(例如，約0.5me/g至約1.5meq/g、約0.75meq/g至約1.25meq/g、約1.1meq/g、約1.5meq/g至約2.5meq/g、約1.5meq/g至約2.0meq/g、約1.8meq/g、約0.5meq/g至約1.0meq/g或約1.0meq/g至約1.5meq/g)的平均電荷密度。
在一些情況中，微載劑可以含有天然聚合物和/或合成聚合物。合成聚合物的非限定性實例包括聚乙二醇(PEG)、聚環氧乙烷、聚乙烯亞胺、二甘醇、三甘醇、聚亞烷基二醇、聚氧化烯、聚乙烯醇、多聚磷酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚甲基□唑啉、聚乙基□唑啉、聚羥丙基□唑啉、聚羥基丙基甲基丙烯醯胺、聚甲基丙烯醯胺，聚二甲基丙烯醯胺、聚甲基丙烯酸羥丙基酯、聚丙烯酸羥乙酯、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚甘油、聚天冬醯胺、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆(poloxamer))、羧酸(例如，丙烯酸、甲基丙烯酸、衣康酸和馬來酸)、聚氧乙烯類、聚環氧乙烷、不飽和烯屬單二羧酸、聚乳酸(PLA)、聚環氧丙烷、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、 聚(ε-己內酯)、聚(乙基乙烯)、聚丁二烯、聚乙醇酸、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯基丁基醚、聚苯乙烯、聚環戊二烯基甲基降冰片烯、聚乙烯丙烯、聚乙基乙烯、聚異丁烯、聚矽氧烷、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸異丁酯、丙烯酸2-乙酯、丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸酯類(例如，甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸正丁酯和甲基丙烯酸異丁酯)、丙烯腈類、甲基丙烯腈、乙烯基類(例如，乙酸乙烯酯、叔碳酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、乙烯基甲醯胺、乙烯基乙醯胺、乙烯基吡啶和乙烯基咪唑)、胺基烷類(例如，胺基烷基丙烯酸酯、胺基烷基甲基丙烯酸酯和胺基烷基(甲基)丙烯醯胺)、苯乙烯、聚亞烷基二醇、多堿氧化物和乳酸。天然聚合物的非限定性實例包括纖維素、卵磷脂和玻尿酸。微載劑可以含有不同聚合物以相同或不同比例混合的混合物(例如，本文描述的或本領域已知的一種或多種聚合物的任意組合)。本文描述的任何微載劑可以含有核心和外層，所述核心含有一種或多種聚合物(例如，本文描述的或本領域已知的任何聚合物)，所述外層含有一種或多種不同的聚合物(例如，本文描述的或本領域已知的任何聚合物)。
能夠在本文描述的任何方法中使用的非限定性示例性微載劑包括CytoPoreTM 1和CytoPoreTM 2(可從GE Healthcare,Life Sciences,Piscataway,New Jersey獲得)。能夠在本文描述的任何方法中使用的微載劑的其他實例是公眾可以獲得的和本領域已知的。
多孔板
多種多孔板是本領域已知的並且可以用於本文描述的任何方法。例如，多孔板可以是2孔板、4孔板、6孔板、8孔板、9孔板、10孔板、12孔板、15孔板、18孔板、20孔板、24孔板、36孔板、48 孔板、60孔板、72孔板，或96孔板。在一些實例中，孔具有約0.3mL至約25mL(例如，約0.3mL至約24mL、約0.3mL至約22mL、約0.3mL至約20mL、約0.3mL至約18mL、約0.3mL至約16mL、約0.3mL至約14mL、約0.3mL至約12mL、約0.3mL至約10mL、約0.3mL至約8mL、約0.3mL至約6mL、約0.3mL至約5mL、約0.3mL至約4mL、約0.3mL至約3mL、約0.3mL至約2mL、約0.3mL至約1mL、約0.5mL至約25mL、約0.5mL至約24mL、約0.5mL至約22mL、約0.5mL至約0.5mL至約20mL、約0.5mL至約18mL、約0.5mL至約16mL、約0.5mL至約14mL、約0.5mL至約12mL、約0.5mL至約10mL、約0.5mL至約8mL、約0.5mL至約6mL、約0.5mL至約5mL、約0.5mL至約4mL、約0.5mL至約3mL、約0.5mL至約2mL、約0.5mL至約1mL、約1mL至約25mL、約1mL至約24mL、約1mL至約22mL、約1mL至約20mL、約1mL至約18mL、約1mL至約16mL、約1mL至約14mL、約1mL至約12mL、約1mL至約10mL、約1mL至約8mL、約1mL至約7mL、約1mL至約6mL、約1mL至約5mL、約1mL至約4mL、約1mL至約3.5mL、約1mL至約3mL、約1mL至約2.5mL、約1mL至約2mL、約1mL至約1.5mL、約1.5mL至約25mL、約1.5mL至約24mL、約1.5mL至約22mL、約1.5mL至約20mL、約1.5mL至約18mL、約1.5mL至約16mL、約1.5mL至約14mL、約1.5mL至約12mL、約1.5mL至約10mL、約1.5mL至約8mL、約1.5mL至約6mL、約1.5mL至約5mL、約1.5mL至約4mL、約1.5mL至約3.5mL、約1.5mL至約3mL、約1.5mL至約2.5mL、約1.5mL至約2.0mL、約2mL至約25mL、約2mL至約24mL、約2mL至約22mL、約2mL至約20mL、約2mL至約18mL、約 2mL至約16mL、約2mL至約14mL、約2mL至約12mL、約2mL至約10mL、約2mL至約8mL、約2mL至約6mL或約2mL至約5mL)的體積(內部體積)。
在一些實例中，多孔板是深孔板。例如，深孔板中的孔的內部高度可以為1cm至約12cm(例如，約1cm至約11cm、約1cm至約10cm、約1cm至約9cm、約1cm至約8cm、約1cm至約7cm、約1cm至約6cm、約1cm至約5cm、約1cm至約4cm、約1cm至約3cm、約1.2cm至約12cm、約1.2cm至約11cm、約1.2cm至約10cm、約1.2cm至約9cm、約1.2cm至約8cm、約1.2cm至約7cm、約1.2cm至約6cm、約1.2cm至約5cm、約1.2cm至約4cm、約1.2cm至約3cm、約1.5cm至約11cm、約1.5cm至約10cm、約1.5cm至約9cm、約1.5cm至約8cm、約1.5cm至約7cm、約1.5cm至約6cm、約1.5cm至約5cm、約1.5cm至約4cm、約1.5cm至約3cm、約2cm至約12cm、約2cm至約11cm、約2cm至約10cm、約2cm至約9cm、約2cm至約8cm、約2cm至約7cm、約2cm至約6cm、約2cm至約5cm、約2cm至約4cm、約2cm至約3cm、約2.5cm至約12cm、約2.5cm至約11cm、約2.5cm至約10cm、約2.5cm至約9cm、約2.5cm至約8cm、約2.5cm至約7cm、約2.5cm至約6cm、約2.5cm至約5cm、約2.5cm至約4cm、約3cm至約12cm、約3cm至約11cm、約3cm至約10cm、約3cm至約9cm、約3cm至約8cm、約3cm至約7cm、約3cm至約6cm、約3cm至約5cm、約4cm至約12cm、約4cm至約11cm、約4cm至約10cm、約4cm至約9cm、約4cm至約8cm、約4cm至約7cm、約4cm至約6cm、約5cm至約12cm、約5cm至約11cm、約5cm至約10cm、約5cm至約9cm、約5cm至約8cm或約5cm至約7 cm)。
在一些實例中，孔(例如，深孔多孔板中的孔)可以具有平底(也稱為方底)、圓底(也稱為半球底)、錐形底或金字塔形底。在一些實施方案中，本文描述的任何孔的直徑可以為約4.0mm至約50mm(例如，約4.0mm至約45mm、約4.0mm至約40mm、約4.0mm至約35mm、約4.0mm至約30mm、約4.0mm至約25mm、約4.0mm至約20mm、約4.0mm至約15mm、約4.0mm至約10mm、約6.0mm至約50mm、約6.0mm至約45mm、約6.0mm至約40mm、約6.0mm至約35mm、約6.0mm至約30mm、約6.0mm至約25mm、約6.0mm至約25mm、約6.0mm至約20mm、約6.0mm至約15mm、約6.0mm至約10mm、約8mm至約50mm、約8mm至約45mm、約8mm至約40mm、約8mm至約35mm、約8mm至約30mm、約8mm至約25mm、約8mm至約20mm、約8mm至約15mm、約10mm至約50mm、約10mm至約45mm、約10mm至約40mm、約10mm至約35mm、約10mm至約30mm、約10mm至約25mm、約10mm至約20mm、約15mm至約50mm、約15mm至約45mm、約15mm至約40mm、約15mm至約35mm、約15mm至約30mm、約15mm至約25mm或約15mm至約20mm)。
在一些實例中，將多孔板密封(例如，用透氣性拋棄式膜或透氣性矽層密封)。用於密封多孔板的材料的非限制性實例在實施例中描述。用於密封多孔板的其他材料是本領域已知的。
孔的內表面可以具有至少一種塗層(例如，至少一種明膠、膠原蛋白、聚-L-鳥胺酸、聚苯乙烯和層粘連蛋白塗層)。多孔板的其他實例(例如，不同形狀和尺寸的孔)和孔的內表面塗層的其他實例是本領域已知的並且可以用在本發明中。
攪拌
本發明描述的方法需要旋轉攪拌含有哺乳動物細胞和第一和/或第二液體培養基的培養物。旋轉攪拌可以以約300RPM至約600RPM(例如，約300RPM至約580RPM、約300RPM至約560RPM、約300RPM至約540RPM、約300RPM至約520RPM、約300RPM至約500RPM、約300RPM至約480RPM、約300RPM至約460RPM、約300RPM至約440RPM、約300RPM至約420RPM、約300RPM至約400RPM、約300RPM至約380RPM、約300RPM至約360RPM、約320RPM至約600RPM、約320RPM至約580RPM、約320RPM至約560RPM、約320RPM至約540RPM、約320RPM至約520RPM、約320RPM至約500RPM、約320RPM至約480RPM、約320RPM至約460RPM、約320RPM至約440RPM、約320RPM至約420RPM、約320RPM至約400RPM、約320RPM至約380RPM、約330RPM至約600RPM、約330RPM至約580RPM、約330RPM至約560RPM、約330RPM至約540RPM、約330RPM至約520RPM、約330RPM至約500RPM、約330RPM至約480RPM、約330RPM至約460RPM、約330RPM至約440RPM、約330RPM至約420RPM、約330RPM至約400RPM、約330RPM至約380RPM、約340RPM至約600RPM、約340RPM至約580RPM、約340RPM至約560RPM、約340RPM至約540RPM、約340RPM至約520RPM、約340RPM至約500RPM、約340RPM至約480RPM、約340RPM至約460RPM、約340RPM至約440RPM、約340RPM至約420RPM、約340RPM至約400RPM、約360RPM至約600RPM、約360RPM至約580RPM、約360RPM至約560RPM、約360RPM至約540RPM、約360RPM至約520RPM、 約360RPM至約500RPM、約360RPM至約480RPM、約360RPM至約460RPM、約360RPM至約440RPM、約360RPM至約420RPM、約380RPM至約600RPM、約380RPM至約580RPM、約380RPM至約560RPM、約380RPM至約540RPM、約380RPM至約520RPM、約380RPM至約500RPM、約380RPM至約480RPM、約380RPM至約460RPM、約380RPM至約440RPM、約400RPM至約600RPM、約400RPM至約580RPM、約400RPM至約560RPM、約400RPM至約540RPM、約400RPM至約520RPM、約400RPM至約500RPM、約400RPM至約480RPM或約400RPM至約460RPM)的頻率發生(例如，在培養箱中，如具有約3mm至約50mm的拋擲(軌道)直徑的搖動培養箱)。
如本領域所能夠理解的，攪拌的水準(例如，RPM速度)可依賴于孔的大小和形狀(例如，孔的直徑、形狀和高度中的一項或多項)以及用於進行培養的培養箱的拋擲(軌道)的直徑而變化。例如，較小的拋擲(軌道)直徑可能需要更高水準的攪拌(例如，較高的RPM速度)，而較大的拋擲(軌道)直徑可能需要較低水準的攪拌(例如，較低的RPM速度)來達到類似水準的流體剪切力和溶解O2濃度。在另一實例中，具有較大直徑的孔可能需要較低的RPM速度，而具有較小直徑的孔可能需要較高的RPM速度來達到類似水準的流體剪切力和溶解O2濃度。
在一些實施方案中，使用具有約3mm至約50mm(例如，約3mm至約25mm或約25mm至約50mm)的拋擲(軌道)直徑的搖動管型培養箱並以約320RPM至約500RPM(例如，約320RPM至約480RPM、約320RPM至約460RPM、約320RPM至約400RPM、約320RPM至約380RPM、約320RPM至約360RPM、約320RPM至約350RPM、 約320RPM至約340RPM、約330RPM至約500RPM、約330RPM至約480RPM、約330RPM至約460RPM、約330RPM至約440RPM、約330RPM至約420RPM、約330RPM至約400RPM、約330RPM至約380RPM、約330RPM至約370RPM、約330RPM至約360RPM、約330RPM至約350RPM、約340RPM至約500RPM、約340RPM至約480RPM,340RPM至約460RPM、約340RPM至約440RPM、約340RPM至約420RPM、約340RPM至約400RPM、約340RPM至約380RPM、約340RPM至約370RPM、約340RPM至約360RPM、約350RPM至約500RPM、約350RPM至約480RPM、約350RPM至約460RPM、約350RPM至約440RPM、約350RPM至約420RPM、約350RPM至約400RPM、約350RPM至約390RPM、約350RPM至約380RPM、約350RPM至約370RPM、約360RPM至約500RPM、約360RPM至約480RPM、約360RPM至約460RPM、約360RPM至約440RPM、約360RPM至約420RPM、約360RPM至約400RPM、約360RPM至約380RPM或約400RPM至約500RPM)的攪拌進行培養。例如，可以使用旋轉圓形搖動或旋轉橢圓形搖動進行旋轉攪拌。可以連續地或週期性地進行攪拌。
多孔板的旋轉攪拌能夠產生與含有佔據約10%至約40%(例如，約10%至約35%、約10%至約30%、約10%至約25%、約10%至約20%、約10%至約15%，約15%至約40%、約15%至約35%、約15%至約30%、約15%至約25%、約15%至約20%、約20%至約40%、約20%至約35%、約20%至約30%、約20%至約25%、約25%至約40%、約25%至約35%、約25%至約30%、約30%至約40%、約30%至約35%或約35%至約40%)孔體積的液體培養基的、具有約6.0mm至約35mm(例如，約6.0mm至約30mm、約6.0mm至約25mm、 約6.0mm至約20mm、約6.0mm至約15mm、約10mm至約35mm、約10mm至約30mm、約10mm至約25mm、約10mm至約20mm、約15mm至約35mm、約15mm至約30mm、約15mm至約25mm、約20mm至約35mm、約20mm至約30mm或約25mm至約35mm)的直徑和約40mm至約50mm(例如，約40mm至約45mm或約45mm至約50mm)的高度的方底孔中在約31℃至約40℃的溫度下並以約320RPM至約450RPM(例如，約320RPM至約440RPM、約320RPM至約430RPM、約320RPM至約420RPM、約320RPM至約410RPM、約320RPM至約400RPM、約320RPM至約390RPM、約320RPM至約380RPM、約320RPM至約370RPM、約320RPM至約360RPM、約320RPM至約350RPM、約320RPM至約340RPM、約320RPM至約330RPM、約330RPM至約450RPM、約330RPM至約440RPM、約330RPM至約430RPM、約330RPM至約420RPM、約330RPM至約410RPM、約330RPM至約400RPM、約330RPM至約390RPM、約330RPM至約380RPM、約330RPM至約370RPM、約330RPM至約360RPM、約330RPM至約350RPM、約330RPM至約340RPM、約340RPM至約450RPM、約340RPM至約440RPM、約340RPM至約430RPM、約340RPM至約420RPM、約340RPM至約410RPM、約340RPM至約400RPM、約340RPM至約390RPM、約340RPM至約380RPM、約340RPM至約370RPM、約340RPM至約360RPM、約340RPM至約350RPM、約350RPM至約450RPM、約350RPM至約440RPM、約350RPM至約430RPM、約350RPM至約420RPM、約350RPM至約410RPM、約350RPM至約400RPM、約350RPM至約390RPM、約350RPM至約380RPM、約350RPM至約370RPM、約350RPM至約360RPM、約360RPM至約450RPM、 約360RPM至約440RPM、約360RPM至約430RPM、約360RPM至約420RPM、約360RPM至約410RPM、約360RPM至約400RPM、約360RPM至約390RPM、約360RPM至約380RPM、約360RPM至約370RPM、約370RPM至約450RPM、約370RPM至約430RPM、約370RPM至約410RPM、約370RPM至約390RPM、約390RPM至約450RPM、約390RPM至約430RPM、約390RPM至約410RPM、約410RPM至約450RPM、約410RPM至約430RPM或約430RPM至約450RPM)的頻率攪拌進行培養所實現的基本上相同的流體剪切力和溶解氧(O2)濃度。
旋轉攪拌可以使用加濕氣氛的受控培養箱(例如，大於20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的濕度，或100%的濕度)進行，所述培養箱帶有提供對含有哺乳動物細胞和液體培養基(例如，第一和/或第二液體培養基)的一個或多個多孔板的攪拌的機械裝置。
溫度
本文描述的培養方法可以在約31℃至約40℃的溫度下進行。熟練的操作人員會理解可以在培養方法中的特定時間點改變溫度，例如，每小時或每天。例如，可以在用哺乳動物細胞對孔進行初始接種之後約一天、兩天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、十一天、十二天、十四天、十五天、十六天、是七天、十八天、十九天或二十天或更久時改變或變換(例如，提高或降低)溫度。例如，可以向上變換溫度(例如，高至或大約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19，或高至或大約20℃的變化)。例如，可以向下變換溫度(例如，高至或大約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19，或高至或大約20℃的變化)。
培養基去除和替換
本文描述的方法包括從孔去除第一體積的第一液體培養基(例如，含有任何濃度的哺乳動物細胞，例如，基本上不含細胞的第一體積的第一液體培養基)，向第一液體培養基添加第二體積的第二液體培養基。去除和添加可以同時或順序或以二者的組合進行。另外，去除和添加可以連續進行(例如，以在任意給定的時間段內(例如，在24小時期間，在約1小時至約24小時的漸增時間段內，或在大於24小時的漸增時間段內)或週期性地(例如，每三天一次、每隔一天、每天一次、每天兩次、每天三次、每天四次或每天五次)或其任意組合去除和替換孔體積或第一液體培養基體積的0.1%至700%(例如，1%至600%、1%至500%、1%至400%、1%至350%、1%至300%、1%至250%、1%至100%、100%至200%、5%至150%、10%至50%、15%至40%、8%至80%或4%至30%)的體積的速率)。在週期性進行的情況下，去除或替換的體積(例如，在約24小時期間，在約1小時至約24小時的漸增時間段內，或在大於24小時的漸增時間段內)可以是例如孔體積或第一液體培養基體積的0.1%至700%(例如，1%至700%、1%至600%、1%至500%、1%至400%、1%至300%、1%至200%、1%至100%、100%至200%、5%至150%、10%至50%、15%至40%、8%至80%或4%至30%)的體積。在一些情況下，可以在整個或部分 培養時期內在每24小時的時期內(或，作為另一種選擇，在約1小時至約24小時的漸增時間段內，或在大於24小時的漸增時間段內)使去除的第一體積的第一液體培養基和添加的第二體積的第二液體培養基保持大致相同。如本領域已知的，去除第一體積的第一液體培養基的速率(體積/單位時間)和添加第二體積的第二液體培養基的速率(體積/單位時間)可以有所變化。去除第一體積的第一液體培養基的速率(體積/單位時間)和添加第二體積的第二液體培養基的速率(體積/單位時間)可以大致相同或可以不同。
或者，在培養期間在每24小時的時期內(或，作為另一種選擇，在約1小時至約24小時的漸增時間段內，或在大於24小時的漸增時間段內)可以改變(例如，逐漸增加)去除和添加的體積。包括逐漸增加體積的方法的非限定性實例在本文描述。例如，在培養期間在每24小時的時期內(或，作為另一種選擇，在約1小時至24小時以上的漸增時間段內，或在大於24小時的漸增時間段內)去除的第一液體培養基的體積和添加的第二液體培養基的體積可以從孔體積或第一液體培養基體積的0.5%至約30%的體積增加(例如，逐漸地或通過交錯增量)至孔體積或第一液體培養基體積的約30%至約200%的體積。
在本文描述的任何方法的一些實施方案中，將多孔板培養超過7天的一段時間，並且在培養的第1至3天中的每24小時的時間段內，去除的第一液體培養基的第一體積和添加的第二培養基的第二體積是第一液體培養基的體積的約30%至約50%；在培養的第4至6天中，去除的第一液體培養基的第一體積和添加的第二培養基的第二體積是第一液體培養基的體積的約30%至約50%或約40%至約70%；並且從培養的第7天起的每24小時的時間段內，去除的第一液體培養基的第一體積和添加的第二培養基的第二體積是第一液體培養基的 體積的約90%至約150%。
在其他實例中，在大約最初的24-48小時的時間段之後，在每24小時的時間段內，去除的第一液體培養基的第一體積和添加的第二培養基的第二體積是第一液體培養基的體積的約30%至約300%(例如，約30%至約280%、約30%至約260%、約30%至約240%、約30%至約220%、約30%至約200%、約30%至約180%、約30%至約160%、約30%至約150%、約30%至約140%、約30%至約120%、約30%至約100%、約30%至約80%、約30%至約60%、約30%至約50%、約40%至約300%、約40%至約280%、約40%至約260%、約40%至約240%、約40%至約220%、約40%至約200%、約40%至約180%、約40%至約160%、約40%至約140%、約40%至約120%、約40%至約100%、約40%至約80%、約40%至約60%、約50%至約300%、約50%至約280%、約50%至約260%、約50%至約240%、約50%至約220%、約50%至約200%、約50%至約180%、約50%至約160%、約50%至約140%、約50%至約120%、約50%至約100%或50%至約80%)。
熟練的操作人員會理解第一液體培養基和第二液體培養基可以使相同類型的培養基。在其他情況中，第一液體培養基和第二液體培養基可以是不同的。
例如，可以通過離心(例如，旋翼式離心(swinging bucket centrifugation))多孔板，並將第一體積的基本上不含細胞的第一液體培養基從上清液去除來去除第一體積的第一液體培養基。作為另一種選擇或者此外，可以通過使第一體積的第一液體培養基滲透或重力流過無菌膜來去除第一體積的第一液體培養基，所述無菌膜具有排除哺乳動物細胞的分子量截留值。作為另一種選擇或者此外，第一液體培養 基可以通過在去除第一體積的第一液體培養基之前停止攪拌至少30秒的時間段(例如，至少一分鐘、至少兩分鐘、至少三分鐘、至少四分鐘或至少五分鐘)來去除。可以手動地(例如，通過從孔中抽吸或移液掉第一體積的第一液體培養基)或以自動化的方式(例如，使用自動化設備或使用任何本文描述的多孔細胞培養板系統)去除第一體積的第一液體培養基。
例如，可以通過灌注泵向第一液體培養基添加第二體積的第二液體培養基。可以手動地(例如，通過將第二體積的第二液體培養基直接移液到第一液體培養基上)或以自動化的方式(例如，使用自動化設備或使用任何本文描述的多孔細胞培養板系統)將第二液體培養基添加至第一液體培養基。
在一些實例中，使用本文描述的任何多孔細胞培養板系統可以去除第一體積的第一液體培養基並且可以向第一液體培養基添加第二體積的第二液體培養基。
在一些情況中，去除第一體積的第一液體培養基(例如，基本上不含哺乳動物細胞的第一體積的第一液體培養基)和向第一液體培養基添加第二體積的第二液體培養基不會發生在用哺乳動物小接種孔的至少1小時之內(例如，2小時之內、3小時之內、4小時之內、5小時之內、6小時之內、7小時之內、8小時之內、9小時之內、10小時之內、12小時之內、14小時之內、16小時之內、18小時之內、24小時之內、36小時之內、48小時之內、72小時之內、96小時之內或96小時之後)。
一些實施方案進一步包括向多個孔中的每一個週期性地添加額外體積的第二液體培養基，從而抵銷因為蒸發而造成的第一液體培養基在體積上的任何減少。例如，可以向孔添加這樣的額外體積的第二 液體培養基，例如，至少每24小時一次，至少每48小時一次、至少每72小時一次或至少每96小時一次。可以手動地或以自動化的方式(例如，使用自動化設備或使用任何本文描述的多孔細胞培養板系統)添加這種額外體積的第二液體培養基。
CO 2
本文描述的方法可以進一步包括在含有至多或大約15% CO2(例如，至多或大約14% CO2、12% CO2、10% CO2、8% CO2、6% CO2、5% CO2、4% CO2、3% CO2、2% CO2或至多或大約1% CO2)的氣氛中培養多孔板。另外，本文描述的任何方法可包括在加濕氣氛(例如，至少或大約20%、30%、40%、50%、60%、70%、85%、80%、85%、90%或至少或大約95%濕度，或大約100%濕度)中培養多孔板。
示例性設備
能夠用於進行本文描述的培養方法的設備的非限制性實例包括：Appropriate Technical Resources(Maryland,USA)分銷的INFORS Multiron搖動培養箱(INFORS；Basel,Switzerland)，和Kuhner搖動培養箱(Kuhner AG；Basel,Switzerland)。能夠用於進行培養方法的設備的非限制性實例包括具有約3mm至約50mm(例如，約1mm至約25mm或約25mm至約50mm)的拋擲(軌道)直徑的旋轉培養箱。搖動培養箱和滾動培養箱的其他實例是本領域已知的。
溶解O 2 和液體剪切力
還提供包括在梯度灌注方法中在如下條件下培養懸浮在置於多孔板孔內的液體培養基中的哺乳動物細胞的培養方法，所述條件在所 述培養基中生成與含有佔據具有約6.0mm至約35mm(例如，約6.0mm至約30mm、約6.0mm至約25mm、約6.0mm至約20mm、約6.0mm至約15mm、約10mm至約35mm、約10mm至約30mm、約10mm至約25mm、約10mm至約20mm、約15mm至約35mm、約15mm至約30mm、約15mm至約25mm、約20mm至約35mm、約20mm至約30mm或約25mm至約35mm)的直徑和約40mm至約50mm(例如，約40mm至約45mm或約45mm至約50mm)的高度的方底孔體積約10%至約40%(例如，約10%至約35%、約10%至約30%、約10%至約25%、約10%至約20%、約10%至約15%、約15%至約40%、約15%至約35%、約15%至約30%、約15%至約25%、約15%至約20%、約20%至約40%、約20%至約35%、約20%至約30%、約20%至約25%、約25%至約40%、約25%至約35%、約25%至約30%、約30%至約40%、約30%至約35%或約35%至約40%)的液體培養基中在約31℃至約40℃的溫度下並以約320RPM至約450RPM(例如，約320RPM至約440RPM、約320RPM至約430RPM、約320RPM至約420RPM、約320RPM至約410RPM、約320RPM至約400RPM、約320RPM至約390RPM、約320RPM至約380RPM、約320RPM至約370RPM、約320RPM至約360RPM、約320RPM至約350RPM、約320RPM至約340RPM、約320RPM至約330RPM、約330RPM至約450RPM、約330RPM至約440RPM、約330RPM至約430RPM、約330RPM至約420RPM、約330RPM至約410RPM、約330RPM至約400RPM、約330RPM至約390RPM、約330RPM至約380RPM、約330RPM至約370RPM、約330RPM至約360RPM、約330RPM至約350RPM、約330RPM至約340RPM、約340RPM至約450RPM、約340RPM至約440RPM、約340RPM至約430RPM、 約340RPM至約420RPM、約340RPM至約410RPM、約340RPM至約400RPM、約340RPM至約390RPM、約340RPM至約380RPM、約340RPM至約370RPM、約340RPM至約360RPM、約340RPM至約350RPM、約350RPM至約450RPM、約350RPM至約440RPM、約350RPM至約430RPM、約350RPM至約420RPM、約350RPM至約410RPM、約350RPM至約400RPM、約350RPM至約390RPM、約350RPM至約380RPM、約350RPM至約370RPM、約350RPM至約360RPM、約360RPM至約450RPM、約360RPM至約440RPM、約360RPM至約430RPM、約360RPM至約420RPM、約360RPM至約410RPM、約360RPM至約400RPM、約360RPM至約390RPM、約360RPM至約380RPM、約360RPM至約370RPM、約370RPM至約450RPM、約370RPM至約430RPM、約370RPM至約410RPM、約370RPM至約390RPM、約390RPM至約450RPM、約390RPM至約430RPM、約390RPM至約410RPM、約410RPM至約450RPM、約410RPM至約430RPM或約430RPM至約450RPM)的頻率攪拌進行培養所實現的流體剪切力和溶解氧(O2)濃度相同(或基本上相同)的流體剪切力和溶解氧(O2)濃度。
如本領域已知的，可以調節多種細胞培養參數以實現特定溶解O2濃度和特定流體剪切力。能夠被調節的這些參數的非限定性實例包括：孔體積、液體培養基的體積、孔的形狀(例如，直徑、高度和孔底部形狀中的一項或多項)、攪拌類型(例如，旋轉圓形攪拌和/或旋轉橢圓形攪拌)、攪拌的頻率、培養基類型、孔的內部塗層和液體培養基的溫度。這些培養參數的其他實例是本領域已知的。本文描述的或本領域已知的培養參數的任何組合可以以任何方式組合以在培養基中實現與佔據具有約6.0mm至約35mm的半徑和約40mm和約50 mm的高度的平底孔體積的約10%至約40%(例如，約15%至約25%)的培養基中在約31℃至約40℃的溫度下並以約320RPM至約450RPM(例如，約320RPM至約360RPM)的頻率攪拌進行培養所實現的流體剪切力和溶解氧(O2)濃度相同(或基本上相同)的流體剪切力和溶解氧(O2)濃度。
液體培養基中的溶解O2水準可以使用多種不同的方法檢測。例如，溶解O2可以使用溶解O2電極或探測器(例如，可從Eutech Instruments WD-35201-80 Dissolved Oxygen Probe、Rosemount Analytical 499 Series Dissolved Oxygen/Ozone Sensor、Extech DO705 Dissolved Oxygen Electrode獲得的O2探測器和電極)測量。校準和使用O2探測器和電極的方法可以使用製造商的說明書進行。
液體培養基中的流體剪切力可以使用本領域已知的方法計算。描述液體培養基中液體剪切力計算的合適教科書的非限定性實例描述在Fluid Mechanics,Robert A.Granger,1995,Dover Publications,Inc.,Mineola,NY，和Fundamentals of Fluid Mechanics,Bruce R.Munson等，John Wiley & Sons,Inc.,2009中。
產生重組蛋白的方法
本文還提供產生重組蛋白的方法，其包括培養使用本文描述的方法能夠產生重組蛋白的細胞。在執行所述方法之後，可以從哺乳動物細胞和/或從第一或第二培養基回收所述重組蛋白。在一些實施方案中，在培養方法過程中任何給定的時間點從所述第一和/或第二液體培養基回收所述重組蛋白(例如，在培養的第0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100天或在超過100天的一天或數天中從第一和/或第二液體培養基回收)。這些方法的一些實施方案進一步包括添加某個體積的第三培養基或某個體積的第四液體培養基，但是在每種情況中，孔中的液體培養基的總體積應該大致等於或小於第一液體培養基體積。
熟練的操作人員會理解可以以任何組合使用多種培養參數(例如，本文描述的多孔板、孔、體積、替換培養物體積的速率或頻率、攪拌頻率、溫度、培養基和CO2濃度)中的任何參數來進行這些方法。另外，本文描述的或本領域已知的任何哺乳動物細胞可以用於產生重組蛋白。
可以使用分子生物學和分子遺傳學中已知的多種多樣的方法將編碼重組蛋白的核酸引入哺乳動物細胞。非限定性實例包括轉染(例如，脂質轉染)、轉導(例如，慢病毒、腺病毒或逆轉錄病毒感染)和電穿孔。在一些情況中，編碼重組蛋白的核酸不是穩定地整合在哺乳動物細胞的染色體中的(瞬時轉染)；而在其他方法中核酸是整合的。作為另一種選擇或者此外，編碼重組蛋白的核酸可以存在於質粒和/或哺乳動物人工染色體(例如，人的人工染色體)中。作為另一種選擇或者此外，可以使用病毒載體(例如，慢病毒、逆轉錄病毒或腺病毒載體)將核酸引入細胞中。可以將核酸與啟動子序列(例如，強啟動子，如β-肌動蛋白啟動子和CMV啟動子或誘導型啟動子)可操作地連接。如有需要，含有核酸的載體可以還含有選擇標記(例如，為哺乳動物細胞賦予潮黴素、嘌呤黴素或新黴素抗性的基因)。
在一些情況中，重組蛋白是分泌蛋白並且由哺乳動物細胞釋放至胞外培養基(例如，第一和/或第二液體培養基)中。例如，編碼可溶性重組蛋白的核酸序列可以含有編碼在重組蛋白的N或C末端的分泌信號肽的序列，其通過哺乳動物細胞中存在的酶被切割，並且隨後釋放至胞外培養基(例如，第一和/或第二液體培養基)中。例如，這樣的分泌的重組蛋白可以是分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生長因子、分泌的蛋白片段或分泌的工程化蛋白。在其他情況中，所述重組蛋白是不被分泌的可溶性蛋白，並且所述重組蛋白從哺乳動物細胞內回收。例如，不被分泌的重組蛋白可以是免疫球蛋白、酶、生長因子、蛋白片段或工程化蛋白。
能夠通過本文提供的方法產生的重組蛋白的非限定性實例包括免疫球蛋白(包括輕鏈和重鏈免疫球蛋白、抗體或抗體片段(例如，本文描述的任何抗體片段)、酶(例如，半乳糖苷酶(α-半乳糖苷酶)、Myozyme或Cerezyme)、蛋白質(例如，生長因子，人促紅細胞生成素、腫瘤壞死因子(TNF)或幹擾素α或β)、工程化蛋白或免疫原性或抗原性蛋白或蛋白片段(例如用於在疫苗中使用的蛋白質))。在一些實施方案中，重組蛋白是工程化抗原結合多肽，其含有至少一個多功能重組蛋白支架(參見，例如，在Gebauer等，Current Opin.Chem.Biol.13：245-255,2009；和美國專利申請公開號2012/0164066(通過提述以其整體併入本文)中描述的重組抗原結合蛋白)。作為抗體的重組蛋白的非限定性實例包括：帕尼單抗(panitumumab)、奧馬珠單抗(omalizumab)、阿巴伏單抗(abagovomab)、阿昔單抗(abciximab)、阿托續單抗(actoxumab)、阿達木單抗(adalimumab)、阿德木單抗(adecatumumab)、阿非莫單抗(afelimomab)、阿托珠单抗(afutuzumab)、阿珠單抗(alacizumab)、阿侖單抗(alemtuzumab)、alirocumab、阿妥莫 單抗(altumomab)、阿麥妥昔單抗(amatuximab)、马安莫单抗(anatumomab)、阿泊珠单抗(apolizumab)、阿替奴单抗(atinumab)、托珠單抗(tocilizumab)、巴利昔單抗(basilizimab)、贝妥莫单抗(bectumomab)、貝利單抗(belimumab)、貝伐單抗(bevacizumab)、比西單抗(biciromab)、卡那单抗(canakinumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、達珠單抗(daclizumab)、迪諾賽单抗(densumab)、艾庫組單抗(eculizumab)、依決洛單抗(edrecolomab)、依法利珠單抗(efalizumab)、依芬古单抗(efungumab)、厄妥索单抗(ertumaxomab)、达珠单抗(etaracizumab)、戈利木單抗(golimumab)、英夫利昔單抗(infliximab)、他珠單抗(natalizumab)、帕利珠單抗(palivizumab)、帕尼單抗(panitumumab)、培妥珠單抗(pertuzumab)、蘭尼單抗(ranibizumab)、利妥昔單抗(rituximab)、托珠單抗(tocilizumab)和曲妥單抗(trastuzumab)。能夠通過本領域描述的方法產生的治療性抗體的其他實例是本領域已知的。能夠通過本發明的方法產生的重組蛋白的其他非限定性實例包括：阿葡糖苷酶阿爾法(alglucosidase alfa)、laronidase、abatacept(阿貝西普)、galsulfase、促黃體素α(lutropin alfa)、抗血友病因子(antihemophilic factor)、阿加糖酶-β(agalsidase beta)、幹擾素β-1a(interferon beta-1a)、阿法達貝泊汀(darbepoetin alfa)、替奈普酶(tenecteplase)、伊納西普(etanercept)、凝血因子IX(coagulation factor IX)、卵泡雌激素(follicle stimulating hormone)、幹擾素β-1a(interferon beta-1a)、伊米苷酶(imiglucerase)、dornase alfa、epoetin alfa和阿替普酶(alteplase)。
分泌的可溶性重組蛋白可以通過將液體培養基從哺乳動物細胞去除或以其他方式在物理上分開而從液體培養基(例如，第一和/或第二液體培養基)回收。用於從哺乳動物細胞去除液體培養基的多種不 同的方法是本領域已知的，包括，例如，離心、過濾、移液和/或抽吸。然後可以使用多種生物化學技術從液體培養基回收並進一步純化分泌的重組蛋白，所述技術包括多種類型的層析(例如，親和層析、分子篩層析、陽離子交換層析或陰離子交換層析)和/或過濾(例如，分子量截留過濾)。
為了回收胞內重組蛋白，可以裂解哺乳動物細胞。用於裂解哺乳動物細胞的多種多樣的方法是本領域已知的，包括，例如，超聲處理和/或洗滌劑、酶和/或化學裂解。可以使用多種本領域已知的生物化學方法從哺乳動物細胞裂解液純化重組蛋白，所述方法通常以離心去除細胞碎片的步驟開始，然後是一個或多個額外步驟(例如，一種或多種類型的層析(例如，親和層析、分子篩層析、陽離子交換層析或陰離子交換層析)和/或過濾(例如，分子量截留過濾))。
在一些實施方案中，回收的重組蛋白是按重量計至少或約50%純的，例如，按重量計至少或約55%純的，按重量計至少60%純的，按重量計至少65%純的，按重量計至少70%純的，按重量計至少75%純的，按重量計至少80%純的，按重量計至少85%純的，按重量計至少90%純的，按重量計至少95%純的，按重量計至少96%純的，按重量計至少97%純的，按重量計至少98%純的，或按重量計至少或大約99%純的或按重量計大於99%純的。
實施例
在下列實施例中進一步沒描述本發明，所述實施例不對請求範圍中記載的本發明的範圍進行限制。
實施例1. 示例性培養方法的有益特性
進行實驗以生成灌注培養的小規模高通量模型並測定這些培養 是否能夠實現與生產灌注培養類似的細胞密度。
材料和方法 重組半乳糖苷酶懸浮細胞培養
在每個細胞培養方法運行中使用了產生重組半乳糖苷酶的同一選殖細胞系，並且將用於每個細胞培養方法運行的培養基列於表1中。
Figure 104118071-A0202-12-0062-1
儀器和試劑
在本實施例描述的細胞培養方法運行中使用了以下儀器和試劑：Multitron搖動培養箱(Appropriate Technical Resources,Inc.)(型號AJ125)、Cellometer® Auto1000(Nexcelom Bioscience LLC)、Beckman Coulter Allegra離心機(型號Allegra X-14 R)、TubeSpin® Bioreactors 50(Techno Plastic Products AG,Trasadingen,Switzerland)、96-孔MASTERBLOCK®微板2-mL(Griener Bio One,Frickenhausen,Germany)、96-孔MASTERBLOCK®微板1-mL(Griener Bio One,Frickenhausen,Germany)、Olympus白光桌面型顯微鏡(型號BH-s)、Olympus白光桌面型顯微鏡(型號BX40)、Olympus白光桌面型顯微鏡 (型號BX41)、0.4%錐蟲藍溶液(Sigma)、0.2%錐蟲藍溶液(Sigma)、Reichert Bright-Line®血細胞計數儀腔室、Thermo Scientific顯微鏡蓋玻片、Fisher Scientific Laboratory Counter、SAS® JMP Software(版本X)、Applikon MicroFlask微量滴定板夾持裝置(Applikon Biotechnology Inc.)、AeraSeal、微孔拋棄式膜密封(Phenix Research Products)、Beckman Coulter Biomek® 3000 Laboratory Automation Workstation、RAININ Pipetting 360° Pipet-LiteTM XLSTM Pipettor(Mettler Toledo)、Ergenomic High-Performance Pipettor(VWR®)和試劑貯存器(VistaLab Technologies)。
方法
進行研究以測試攪拌(RPM)、孔形狀和工作體積的一系列變化條件。設計研究以覆蓋320RPM至360RPM的攪拌範圍、圓底(1-mL標稱容積)或方底(2-mL標稱容積)孔和100μL至600μL工作體積。進行細胞培養方法運行I以測定用於圓底深孔板(1-mL標稱容積)的操作條件的基礎。進行細胞培養方法運行II以測定圓底深孔板支援高密度細胞培養的能力。進行細胞培養方法運行III以建立用於設計優化的參數範圍，以及比較Applikon MicroFlask微量滴定板夾持裝置(Applikon Biotechnology,Inc.,Foster City,CA)與無菌的、微孔膜密封(AeraSeal,Phenix Research Products,Candler NC)。設計進行細胞培養方法運行IV和V用於模型優化目的。
使用JMP軟件的定制設計工具設計細胞培養方法運行V。考慮到三階相互作用(third-order interaction)，將模型設計為對於兩個連續的變量(搖動速度和工作體積)和一個分類響應(孔形狀)的I最佳。根據表2(其中工作體積作為總容器體積的分數列出)設定下限和上限。定制設計以具有2次冪來考慮變量之間的任何非線性關係。最後，設計研 究以使一式兩份重複運行的每個實驗具有總共15個條件(圓底孔6個和方底孔9個)。
Figure 104118071-A0202-12-0064-2
將全部容器使用來自種子培養物的細胞以5 x 106活細胞/mL接種，所述種子培養物在細胞庫的小瓶解凍後對於細胞培養方法運行1-5分別在震盪燒瓶中擴張9、10、7、0和7次傳代。將細胞培養物保持在搖動培養箱中5% CO2、37℃和80%相對濕度的受控環境中。對照搖管條件與每個實驗一起運行，其具有10mL每管的恒定工作體積、45°的搖動角度和160RPM的攪拌。對於全部實驗(除非另行注明)，根據表3考慮了蒸發。
Figure 104118071-A0202-12-0064-3
對於細胞培養方法運行I，將圓底深孔板以5 x 105活細胞/mL和1 x 106活細胞/mL接種。在接種後的第一天開始，每天採樣(10μL)培養物以通過手動計數(排除錐蟲藍)測定活細胞密度(VCD)，進行兩日。
對於細胞培養方法運行II，在接種後的第一天開始，每日採樣(10μL)培養物以通過手動計數測定VCD，進行11日。在細胞計數之後，將板以~233 x g離心5分鐘，並去除用過的培養基。以表4中描述的 比例交換培養基。
使用圓底(1-mL)深孔板和方底(2-mL)深孔板用於細胞培養方法運行III和IV。在接種後的第一天開始，在每個週一、週三和週五採樣培養物(2-2-3時間表)(10μL)以通過Cellometer® Auto 1000測定VCD。在細胞計數之後，將板以~233 x g離心5分鐘，並去除用過的培養基。以表4中描述的比例交換培養基。
對於細胞培養方法運行V，使用了Biomek 3000液體處理器。在接種後的第一天開始，在每個週一、週三和週五採樣培養物(0.10 x工作體積)以通過Cellometer® Auto 1000確定VCD。在細胞計數之後，將板以~233 x g離心5分鐘，並立即使用去除的用過的培養基或將其儲存在-80℃直到進行重組人α-半乳糖苷酶(rhα-Gal)活性測定以測定產物滴度。以表5中描述的比例交換培養基，並使用下文的等式1和2計算rhα-Gal體積生產率和比生產率。此外，使用下文的等式3計算整體/積分的(integrated)活細胞密度(IVCD)。
Figure 104118071-A0202-12-0065-4
 1接種時的接種密度為5 x 105細胞/mL。
Figure 104118071-A0202-12-0065-5
 1接種時的接種密度為5 x 105細胞/mL。
VPR=滴度* PR 等式1
Figure 104118071-A0202-12-0066-6
Figure 104118071-A0202-12-0066-7
PR：灌注速率
VPR：體積生產率(U/L/d)
Titer：rhα-Gal活性(U/L)
SPR：比生產率(U/E9細胞/d)
Xv：活細胞計數(E6細胞/mL)
IVCD：整體/積分的活細胞密度(細胞-d/mL)
t：時間(d)
手動細胞計數
用異丙醇(IPA)清潔血細胞計數器腔室和蓋片。將蓋片的角落用IPA沾濕，並固定至血細胞計數器。將細胞樣品均勻地按照1：1與0.4%錐蟲藍混合。將10μL等分試樣轉移至血細胞計數器腔室。在四個較大的外正方形中計數細胞：每個大的外正方形含有16個較小的正方形網格。將位於較大正方形的邊界上的細胞僅對四邊中的兩邊進行計數。將未染色的細胞計算為活細胞，同時將那些染為藍色的細胞認為是死細胞。百分比活力和活細胞密度使用下文的等式4和5計算。
Figure 104118071-A0202-12-0066-8
Figure 104118071-A0202-12-0066-9
總細胞：活細胞和死細胞之和
Nexcelom細胞計數器細胞計數
將細胞樣品均勻地按照1：1與0.2%錐蟲藍混合。將混合物的20μL等分試樣轉移至儀器專用載片。在通過儀器中整合的數碼相機取得的四幅圖像中計數細胞。將未染色的細胞計算為活細胞，同時將那些染為藍色的細胞認為是死細胞。
統計學分析
使用JMP軟件進行統計學分析。使用的應答為使用最大化期望值(maximized desirability)的峰值活細胞密度(VCD或XV)和體積生產率(VPR)。通過帶有效果篩選報告的「擬合模型」功能評價統計學模型。‘分選參數估計’報告了顯著影響應答變量的因素，其是通過t檢驗在統計學上確定的。最後，‘預測分析器(Prediction Profiler)’繪製了參數對應答變量的效果的獨立趨勢，並使用模型通過最大化期望值功能來預測最佳條件。
結果 細胞培養方法運行I
在本實驗中，在小瓶解凍之後第27天，將rhα-Gal CHO細胞系(於CD CHO培養基中)用於在三種不同條件(表6)下接種容器。追蹤細胞培養增殖概貌11天。
Figure 104118071-A0202-12-0067-10
保持在CD CHO培養基中的培養物十一天的活細胞密度概貌示 於圖5。觀察了全部實驗培養物中的生長。對於以5 x 105細胞/mL接種的細胞，在兩種工作體積下(200μL和300μL)存在達到1 x 106細胞/mL的VCD的最小生長。這提示細胞能夠以低接種密度在圓底深孔板中生長。以1 x 106細胞/mL接種的培養物也在第2天展現出生長，其中以0.5RV每天再補料兩次的培養物具有更好的生長(圖6)。再補料兩次的培養物在第2天達到了2 x 106細胞/mL以上的VCD：以200μL為2.7 x 106細胞/mL，而以300μL為2.3 x 106細胞/mL。以大約1.0RV/天再補料的培養物在第2天具有低得多的VCD，這可能也是因為在去除用過的培養物的過程中無意的細胞損失。這些數據表明2 x 0.5RV/天的灌注速率允許比1.0RV/天的灌注速率更好的細胞生長。這些數據提示圓底1-mL 96深孔板能夠支持細胞生長。在整個實驗過程中，當從搖動培養箱中立即取出時，觀察到了培養物具有小細胞團塊，可能是因為不充分的攪拌。這一觀察結果提示對於圓底1-mL深孔板應該使用更高的攪拌速度。
細胞培養方法運行II
進行了一組實驗來優化用於在圓底(1-mL)96深孔板中培養細胞的灌注速率。在這些實驗中，使用CD CHO培養基中的rhα-Gal細胞(小瓶解凍之後的第30天)來接種圓底96深孔板中的孔和搖管(如表7中所述)。在一11天的分批再補料過程中評估了細胞培養表現。
Figure 104118071-A0202-12-0068-11
全部培養物保持了85%以上的百分比細胞活力(圖7)。保持在CD CHO培養基中的細胞的11天培養的活細胞密度概貌示於圖8。對於 全部培養觀察到了生長直到第9天，此時實驗對照(搖管培養)細胞生長達到了25 x 106細胞/mL的峰值密度的平臺期。圓底96深孔板中的培養物展現了比實驗對照慢的生長速率，達到8 x 106細胞/mL的峰值VCD。在第8天，考慮到蒸發損失，向圓底96深孔板培養物添加了培養基的推注(50μL)。
圓底96深孔板的這些數據提示應該調整再補料時間表。修改的再補料時間表示於圖9和表3。
細胞培養方法運行III
進行了一組實驗來優化用於在圓底(1-mL)96深孔板中培養細胞的再補料速率。這些實驗使用1-mL圓底和2-mL圓底兩種96深孔板和圖9中所示的修改的再補料速率方案進行。在小瓶解凍之後的第8天，將CD CHO培養基中的rhα-Gal細胞用於接種兩種類型的深孔板和搖管(參見，表8)。方底96深孔培養含有300μL或500μL的培養體積，而圓底96深孔培養含有200μL或300μL的培養體積(1mL標稱容積)。這些孔使用Applikon系統或使用AeraSeal膜之一來密封。將全部96深孔板培養以330RPM或360RPM攪拌。在9天期間測量了細胞培養物生長。對96深孔板培養的全部活細胞計數均在一式三份重複的孔中進行計數並進行平均。
15天細胞培養的活細胞密度概貌示於圖10。使用Applikon系統覆蓋的或使用拋棄式膜密封覆蓋的方底96深孔板培養展現了相似的生長曲線(彼此處在一個標准偏差(1SD)之內)。96孔板形式中最高的活細胞密度是35 x 106細胞/mL的活細胞密度，其是在方底96深孔板中在第15天時實現的。在對照搖管培養中實現的最高活細胞密度是第10天時的21 x 106細胞/mL。直到第13天，方底96深孔板培養還 非常接近地模仿了對照搖管培養的生長曲線。然而，方底96深孔板培養在整個15天的過程中模仿了歷史搖管對照(n=11)。最接近地模仿了歷史搖管對照培養的兩種方底96深孔板培養使用了拋棄式膜覆蓋並且以330RPM攪拌並且具有300μL或500μL的培養體積。
在本實驗中的圓底96深孔板培養沒有展現出與對照搖管培養相當的生長。在圓底96深孔板培養中觀察到的最高活細胞密度是第15天時的14 x 106細胞/mL。全部培養保持了85%以上的百分比細胞活力(圖11)，直到進入下降期。與搖管對照不同，兩種孔形狀中的培養持續地增殖超過第14天，到第20天達到了50 x 106細胞/mL(方底)和17 x 106細胞/mL(圓底)的活細胞密度(圖12和13)。這些數據表明圓底96深孔板能夠支援高細胞密度。
Figure 104118071-A0202-12-0070-12
細胞培養方法運行IV
進行了另外一組實驗來優化方底96深孔板(2-mL標稱容積)中的細胞生長。在這些實驗中，在小瓶解凍之後的第1天，使用CD CHO 培養基中的細胞來接種方底96深孔板和搖管(n=3)(參見，表9)。在這些實驗中使用的培養體積是300μL或500μL，並且以320RPM、330RPM或340RPM攪拌培養物。在14天期間評估了培養物中的細胞生長。對於培養物的全部活細胞計數均從一式三份重複的孔中計數並進行平均。
Figure 104118071-A0202-12-0071-13
在14天期間的方底96深孔板培養的活細胞密度概貌示於圖14中。直到第7天，所有測試的條件展現出了相似的生長概貌。在第7天之後，具有500μL的培養體積並以320RPM或330RPM攪拌的方底96深孔板展現了更好的細胞生長。儘管全部測試的培養條件均持續增殖到過了第13天之後，達到30 x 106細胞/mL至35 x 106細胞/mL的活細胞密度，具有更好的生長表現的兩種培養條件達到了40 x 106細胞/mL以上的活細胞密度。在第12天之後，在具有500μL的培養體積和320RPM或330RPM的攪拌速率的方底96深孔板培養中實現的活細胞密度超過了搖管中相同細胞系的培養物在歷史上觀察到的活細胞密度(落入1標准偏差之內)。直到培養的第12天，在具有500μL的培養體積和320RPM或330RPM的攪拌速率的方底96深孔板培養中和搖管培養中觀察到了相似的生長模式。
細胞培養方法運行V
進行了另外一組實驗來優化細胞培養操作條件(參見，上文對實驗方法設計的描述)。在這些實驗中，在小瓶解凍之後第21天，使用CD CHO中的細胞來接種方底或圓底96深孔板或搖管。每種測試的培養的操作條件示於圖10。將測試的每種96深孔板用AeraSeal拋棄式膜覆蓋。搖管培養充當對照(n=4)：一組兩個搖管培養按照對照再補料時間表，而另一組兩個搖管培養按照用於96深孔板中的修改的再補料速率(圖9中所示)。全部條件以一式兩份重複測試。在9天的分批再補料方法中評估了細胞生長。
Figure 104118071-A0202-12-0072-14
列於表10中維持在CD CHO培養基中的細胞的15天培養的活細胞密度概貌示於圖15和16。在當前測試的條件下，圓底96深孔板培養不像方底培養一樣表現良好(分別為圖15和圖16)。對於在360RPM 攪拌的100μL培養，圓底96深孔板中達到的最高活細胞密度是20 x 106細胞/mL。與具有接近40 x 106細胞/mL的峰值活細胞密度的對照搖管培養相比，方底96深孔板培養具有相當的活細胞密度(在1標准偏差之內)(當使用上文所述的修改的再補料速率時)。使用400μL的培養體積和320RPM或340RPM的攪拌實現了最好的方底96深孔細胞培養，在第15天達到了大約50 x 106細胞/mL的峰值活細胞密度。另外，具有600μL培養體積和340RPM的攪拌的方底96深孔在第13天產生了高達27 x 106細胞/mL的細胞生長，並且產生了與達到31 x 106細胞/mL的峰值活細胞密度的搖管對照培養(對照再補料速率)相當的結果。全部測試的培養保持了大於85%的活細胞百分比。在搖管對照培養和96深孔培養的整體/積分的活細胞密度之間進行的比較示於圖17和18。
在CD CHO中培養的細胞的15天培養的體積生產率概貌示於圖19和20。正如基於活細胞生長所預測的，在圓底96深孔板中生長的培養物具有較低的生產力(圖19)。22,000單位/L/天的最佳體積生產率是在第15天在圓底96深孔板內100μL培養基中並以320RPM的攪拌生長的培養物中觀察到的(圖19)。然而，具有相同培養體積和攪拌的圓底96深孔板培養在之前數天具有低的體積生產率(<5000單位/L/天)。在方底96深孔培養中觀察到了改進的體積生產率(圖20)，其緊密地遵循了生長概貌。對於生長模式緊密地模仿了搖管培養的培養(具有600μL體積並以340RPM攪拌的方底培養)觀察到了相當的活性(到第15天為40000單位/L/天)。具有初始生長延遲但最終與對照搖管培養具有類似的峰值活細胞密度的數種培養(方底96深孔培養，其具有400μL的體積和340RPM的攪拌，或400μL或600μL的體積或360RPM的攪拌)直到第13天展現了類似的體積生產率(達到約 40,000單位/L/天的體積生產率)。在第13天之後，體積生產率減少，除了以400μL的體積和360RPM的攪拌生長的培養，其在第15天達到了60,000單位/L/天的體積生產率。在具有400μL的體積並以320RPM攪拌的方底96深孔培養中觀察到了最佳生產力，其在第15天達到了67,000單位/L/天的體積生產率。
用於圓底96深孔板培養的大多數條件展現了與對照搖管培養相比相當的或更低的比生產率(SPR)，除了在100μL的體積中生長並以320RPM攪拌的培養，或在300μL的體積中生長並以360RPM攪拌的培養(圖21)。這些培養在第15天具有增加的比生產率。具有相當的或更大的體積生產率的五種方底96深孔板培養也展現了與對照搖管培養(1600單位/1 x 109細胞/天)相當的或更大的比生產率(圖22)。
將收集的數據傳入JMP實驗設計，以基於統計學分析預測最佳操作條件。使用三種響應預測最佳操作條件：峰值活細胞密度、峰值體積生產率和峰值比生產率。設定全部響應限以最大化輸出。首先，將數據擬合至模型，如圖23和24所示。對於活細胞密度(圖23)和體積生產率(圖24)收集的數據與模型匹配良好。統計學分析(t檢驗)揭示了孔形狀和工作體積顯著影響活細胞密度和生產力二者，而搖動速度僅顯著影響生產力。
使用JMP分析儀預測了最佳操作條件(圖25)。基於該分析，最佳細胞表現應該在使用具有440μL工作體積並以360RPM攪拌的方底96深孔板時獲得。將標准偏差考慮在內並維持相同的合意性，對於方底96深孔板的最佳操作範圍是工作體積為約350μL至約550μL，而搖動速度為約320RPM至約360RPM。
綜上，數據顯示本文提供的方法能夠用作較大規模灌注生物反應器細胞培養的模型(例如，通過在相似的時間框架內實現相似的細胞 密度)。本文提供的方法能夠用於高通量篩選組織培養基(和組織培養基內的組分)。
實施例2. 96深孔培養方法用於篩選培養基的用途
進一步進行了一組實驗以使用本文描述的96深孔培養方法測試多種不同的組織培養基。在這些實驗中，將產生單株株抗體的重組哺乳動物細胞系(產mAb細胞)或產生酶的重組哺乳動物細胞系(產酶細胞)用於接種方底96深孔板，並將細胞在500μL的至少102種不同的組織培養基之一中伴隨330RPM的攪拌培養一周。這些實驗中的對照是使用相同的96深孔板、相同的培養基、樣品細胞系和CD CHO培養基實現的活細胞密度。在歷時七天中測量了培養物的活細胞密度和滴度二者。
圖26-29中的數據顯示本文描述的96深孔培養方法能夠篩選不同組織培養基對培養的細胞的生產力和活細胞密度的效果。
其他具體實施例
應理解的是，儘管已經結合本發明的詳述對本發明進行了描述，但是前文的描述旨在闡釋而不在限制本發明的範圍，本發明的範圍由所附請求項的範圍來限定。其他方面、優勢和修改在隨後請求項的範圍內。

Claims (31)

  1. 一種灌注培養哺乳動物細胞的方法，該方法包括：提供一包含至少一個孔之多孔板，該孔包含置於第一液體培養基中的哺乳動物細胞，其中該第一液體培養基佔5%至70%的孔體積且該孔具有平底或圓底；在31℃至40℃並以320轉每分鐘(RPM)至380RPM旋轉攪拌，將該多孔板培養一段時間；和在該段時間內，連續地或週期性地去除第一體積的第一液體培養基，並向該第一液體培養基添加第二體積的第二液體培養基，其中：經移除的該第一液體培養基的第一體積和所添加之第二液體培養基的第二體積大約相等，該第一體積的第一液體培養基實質上不含哺乳動物細胞，且該方法在該孔中產生15 x 106細胞/mL至60 x 106細胞/mL間的活細胞密度。
  2. 一種產生重組蛋白的方法，該方法包括：提供一包含至少一個孔之多孔板，該孔包含置於第一液體培養基中的哺乳動物細胞，其中該第一液體培養基佔據5%至70%的孔體積，該孔具有平底或圓底，並且該哺乳動物細胞含有編碼重組蛋白的核酸；在31℃至40℃並以320轉每分鐘(RPM)至380RPM旋轉攪拌，將該多孔板培養一段時間；在該段時間內，連續地或週期性地去除第一體積的第一液體培養基並向該第一液體培養基添加第二體積的第二液體培養基，其中該第一和第二體積大約相等，該第一體積的第一液體培養基實質上不含哺乳動物細胞，和 該方法在該孔中產生15 x 106細胞/mL至60 x 106細胞/mL間的活細胞密度；且從該哺乳動物細胞或從該第一或第二培養基回收該重組蛋白。
  3. 如請求項2的方法，其中該重組蛋白回收自該哺乳動物細胞。
  4. 如請求項3的方法，其中該重組蛋白是免疫球蛋白、酶、生長因子、蛋白片段或工程化蛋白。
  5. 如請求項2的方法，其中該重組蛋白回收自該第一或第二液體培養基。
  6. 如請求項5的方法，其中該重組蛋白是分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生長因子、分泌的蛋白片段或分泌的工程化蛋白。
  7. 如請求項6的方法，其中該重組蛋白是分泌的免疫球蛋白。
  8. 如請求項6的方法，其中該重組蛋白是分泌的酶。
  9. 如請求項8的方法，其中該分泌的酶是半乳糖苷酶。
  10. 如請求項9的方法，其中該半乳糖苷酶是α-半乳糖苷酶。
  11. 如請求項1或2的方法，其中該第一液體培養基佔據10%至60%的孔體積。
  12. 如請求項1或2的方法，其中該哺乳動物細胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
  13. 如請求項1或2的方法，其中去除第一體積的第一液體培養基和添加第二體積的第二液體培養基同時進行。
  14. 如請求項1或2的方法，其中去除第一體積的第一液體培養基和添加第二體積的第二液體培養基連續進行。
  15. 如請求項1或2的方法，其中去除第一體積的第一液體培養基和添加第二體積的第二液體培養基週期性進行。
  16. 如請求項1或2的方法，其中去除的第一液體培養基的第一體積和添加的第二培養基的第二體積隨時間增加。
  17. 如請求項1或2的方法，其中：將該多孔板培養超過7天的一段時間，並且在培養的第1至3天中的每24小時時段內，去除的第一液體培養基的第一體積和添加的第二培養基的第二體積是第一液體培養基的體積的30%至50%；在培養的第4至6天中的每24小時的時間段內，去除的第一液體培養基的第一體積和添加的第二培養基的第二體積是第一液體培養基的體積的40%至70%；並且從培養的第7天起的每24小時的時間段內，去除的第一液體培養基的第一體積和添加的第二培養基的第二體積是第一液體培養基的體積的90%至150%。
  18. 如請求項1或2的方法，其中該多孔板是6孔板、12孔板、24孔板、48孔板或96孔板。
  19. 如請求項1或2的方法，其中該多孔板是深孔板。
  20. 如請求項1或2的方法，其中該孔之底部直徑為6.0mm至35mm之間。
  21. 如請求項1或2的方法，其中該孔之高度為12mm至50mm之間。
  22. 如請求項1或2的方法，其中該哺乳動物細胞懸浮在150μL至1mL的第一培養基中。
  23. 如請求項1或2的方法，其中該第一液體培養基和/或第二液體培養基選自下列所組成之群組：化學成分確定的液體培養基、無血清液體培養基、含血清液體培養基、無動物來源組分的液體培養基和無蛋白質培養基。
  24. 如請求項1或2的方法，其中在最初的24至48小時時段之後，在每24小時時段內，去除的第一液體培養基的第一體積和添加的第二培養基的第二體積是第一液體培養基的體積的30%至150%。
  25. 如請求項1或2的方法，其中該多孔板用透氣性拋棄式膜密封。
  26. 如請求項1或2的方法，其中該多孔板用透氣性矽層(gas-permeable silicone layer)密封。
  27. 如請求項1或2的方法，其中該孔具有平底。
  28. 如請求項1或2的方法，其中該孔具有圓底。
  29. 如請求項1或2的方法，進一步包括週期性地添加額外體積的第二液體培養基至多個孔中的每一孔，從而抵消因蒸發之該第一液體培養基體積的任何減少。
  30. 如請求項1或2的方法，其中去除第一體積的第一液體培養基和向第一液體培養基添加第二體積的第二液體培養基係使用自動化設備進行。
  31. 如請求項1或2的方法，其中該旋轉攪拌為320RPM至360RPM。
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