JP2017520242A - 灌流培養方法およびその使用 - Google Patents

Abstract

哺乳動物細胞を培養する方法、およびこれらの培養方法を利用する様々な方法が本明細書で提供される。例えば灌流培養方法で使用するための、マルチウェル細胞培養プレートも提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年６月６日に出願した米国特許仮出願第６２／００９，０５８号の優先権を主張するものであり、その全内容は参照によって本明細書に組み入れる。

本発明は、分子生物学、細胞培養プロセス開発および組換えタンパク質の製造の方法に関する。

組換えタンパク質をコードする核酸を含有する哺乳動物細胞は、治療的にまたは商業的に重要なタンパク質の生産に使用されることが多い。いくつかのハイスループット（ＨＴ）細胞培養システムが生物工学業界内で長年にわたってフェドバッチプロセスに使用されているが、マルチウェルプレートを使用する灌流ベースの細胞培養のＨＴモデルの存在は知られていない。

本発明は、本明細書に記載の特異的様式でマルチウェルプレートで哺乳動物細胞を培養することにより、生細胞密度および組換えタンパク質生産が実質的に向上される結果となり、大規模灌流、生産バイオリアクターでの培養実施の正確なモデルが得られるという発見に少なくとも一部は基づく。この発見を考慮して、哺乳動物細胞を培養する方法、組換えタンパク質を生産する方法、および組換えタンパク質を作製する製造プロセスを試験するための方法が本明細書で提供される。例えば本明細書に記載の方法のいずれかを行うために使用することができる、マルチウェル細胞培養プレートシステムも提供される。

哺乳動物細胞を培養する方法であって：第１の液体培養培地に配置された哺乳動物細胞を含有する少なくとも１つのウェルを含むマルチウェルプレートを用意する工程であって、第１の液体培養培地はウェルの体積の約５％〜約７０％を占める工程と；ある期間、約３１℃〜約４０℃で、約３２０回転毎分（ＲＰＭ）〜約５００ＲＰＭの回転撹拌をしながら、マルチウェルプレートをインキュベートする工程と；連続的にまたは定期的に、期間中に、第１の体積の第１の液体培養培地を除去し、第２の体積の第２の液体培養培地を第１の液体培養培地に添加する工程であって、第１および第２の体積はほぼ等しい工程とを含む方法が、本明細書で提供される。これらの方法の一部の実施形態では、哺乳動物細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。これらの方法の一部の実施形態では、ＣＨＯ細胞は、組換えタンパク質（例えば、免疫グロブリン、酵素、成長因子、タンパク質断片、または工学操作されたタンパク質）をコードする核酸を含有する。

組換えタンパク質を生産する方法であって：第１の液体培養培地に配置された哺乳動物細胞を含有する少なくとも１つのウェルを含むマルチウェルプレートを用意する工程であって、第１の液体培養培地はウェルの体積の約５％〜約７０％を占め、哺乳動物細胞は組換えタンパク質をコードする核酸を含有する工程と；ある期間、約３１℃〜約４０℃で、約３２０回転毎分（ＲＰＭ）〜約５００ＲＰＭの回転撹拌をしながら、マルチウェルプレートをインキュベートする工程と；連続的にまたは定期的に、期間中に、第１の体積の第１の液体培養培地を除去し、第２の体積の第２の液体培養培地を第１の液体培養培地に添加する工程であって、第１および第２の体積はほぼ等しい工程と；組換えタンパク質を哺乳動物細胞からまたは第１もしくは第２の培養培地から回収する工程とを含む方法も提供される。これらの方法の一部の実施形態では、組換えタンパク質（例えば、免疫グロブリン、酵素、成長因子、タンパク質断片、または工学操作されたタンパク質）は、哺乳動物細胞から回収される。これらの方法の一部の実施形態では、組換えタンパク質（例えば、分泌免疫グロブリン、分泌酵素、分泌成長因子、分泌タンパク質断片、または工学操作された分泌タンパク質）は、第１または第２の液体培養培地から回収される。

組換えタンパク質を作製する製造プロセスを試験するための方法であって：第１の液体培養培地に配置された哺乳動物細胞を含有する少なくとも１つのウェルを含むマルチウェルプレートを用意する工程であって、第１の液体培養培地はウェルの体積の約５％〜約７０％を占め、哺乳動物細胞は組換えタンパク質をコードする核酸を含有する工程と；ある期間、約３１℃〜約４０℃で、約３２０回転毎分（ＲＰＭ）〜約５００ＲＰＭの回転撹拌をしながら、マルチウェルプレートをインキュベートする工程と；連続的にまたは定期的に、期間中に、第１の体積の第１の液体培養培地を除去し、第２の体積の第２の液体培養培地を第１の液体培養培地に添加する工程であって、第１および第２の体積はほぼ等しい工程と；哺乳動物細胞または第１もしくは第２の液体培養培地中の組換えタンパク質を検出する工程と；哺乳動物細胞または第１もしくは第２の液体培養培地中に存在する組換えタンパク質の量を組換えタンパク質の基準レベルと比較する工程とを含む方法も提供される。これらの方法の一部の実施形態では、組換えタンパク質の基準レベルは、異なる培養方法を使用して生産される組換えタンパク質のレベルである。これらの方法の一部の実施形態では、異なる培養方法は、異なる第１もしくは第２の液体培養培地、異なる哺乳動物細胞、異なる温度、異なる撹拌レベルまたは異なるマルチウェルプレートを利用する。これらの方法の一部の実施形態では、異なる培養方法は、異なる原料、異なる凝集防止剤、または既知組成液体培養培地を利用する。一部の実施形態では、これらの方法は、例えば、実験計画（ＤＯＥ）またはクォリティー・バイ・デザイン（ＱＢＤ）研究を行うためのハイスループット細胞培養実験を行うために使用することができる。これらの方法の一部の実施形態では、組換えタンパク質（例えば、分泌免疫グロブリン、分泌酵素、分泌成長因子、分泌タンパク質断片、または工学操作された分泌タンパク質）は、第１または第２の液体培養培地で検出される。これらの方法の一部の実施形態では、組換えタンパク質（例えば、免疫グロブリン、酵素、成長因子、タンパク質断片、または工学操作されたタンパク質）は、細胞で検出される。

本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の体積の第１の液体培養培地は哺乳動物細胞を実質的に含まない。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の液体培養培地は、ウェルの体積の約１０％〜約６０％を占める。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、哺乳動物細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、回転撹拌は、約３２０ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭである。本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、第１の体積の第１の液体培養培地の除去と第２の体積の第２の液体培養培地の添加は同時に行われる。本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、第１の体積の第１の液体培養培地の除去と第２の体積の第２の液体培養培地の添加は連続的にまたは定期的に行われる。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、除去される第１の液体培養培地の第１の体積および添加される第２の液体培養培地の第２の体積は経時的に増加される。

本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、マルチウェルプレートは、７日より長い期間インキュベートされ、インキュベーション１〜３日目に、２４時間ごとに、除去される第１の液体培養培地の第１の体積および添加される第２の液体培養培地の第２の体積は、第１の液体培養培地の体積の約３０％〜約５０％の間であり；インキュベーション４〜６日目に、２４時間ごとに、除去される第１の液体培養培地の第１の体積および添加される第２の液体培養培地の第２の体積は、第１の液体培養培地の体積の約４０％〜約７０％の間であり；ならびにインキュベーション７日目以降に、２４時間ごとに、除去される第１の液体培養培地の第１の体積および添加される第２の液体培養培地の第２の体積は、第１の液体培養培地の体積の約９０％〜約１５０％である。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ウェルは約１ｍＬ〜約１８ｍＬの間（例えば、約１ｍＬ〜約７ｍＬの間、または約１ｍＬ〜約３．５ｍＬの間）の体積を有する。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、マルチウェルプレートは、６ウェルプレート、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、または９６ウェルプレートである。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、マルチウェルプレートは、深型ウェルプレートである。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ウェルの底の直径は、約６．０ｍｍ〜約３５ｍｍの間（例えば、約１２ｍｍ〜約５０ｍｍ）である。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ウェルの高さは、約１２ｍｍ〜約５０ｍｍである。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、第１の培養培地約１５０μＬ〜約１５ｍＬ（例えば、約１５０μＬ〜約１０ｍＬ、約１５０μＬ〜約５ｍＬ、または約１５０μＬ〜約１５０μＬ）に浮遊している。

本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の液体培養培地および／または第２の液体培養培地は：既知組成液体培養培地、無血清液体培養培地、血清含有液体培養培地、動物由来成分不含液体培養培地、およびタンパク質不含培地からなる群から選択される。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、期間の最初の約２４〜４８時間後、２４時間ごとに、除去される第１の液体培養培地の第１の体積および添加される第２の液体培養培地の第２の体積は、第１の液体培養培地の体積の約３０％〜約１５０％である。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、撹拌は、第１の体積の第１の液体培養培地を除去する前に少なくとも３０秒の期間、停止される。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、マルチウェルプレートは、ガス透過性ディスポーザブル膜またはガス透過性シリコーン層で密封される。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ウェルは、平底または丸底を有する。

本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態は、蒸発に起因する第１の液体培養培地の体積の減少を相殺するためにさらなる体積の第２の液体培養培地を複数のウェルの各々に定期的に添加する工程をさらに含む。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態において、第１の体積の第１の液体培養培地の除去と第２の体積の第２の液体培養培地の第１の液体培養培地への添加は、自動デバイスを使用して行われる。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、マルチウェルプレートは、本明細書に記載のマルチウェル細胞培養プレートシステムのいずれかである。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、方法は、ウェル中、細胞１５ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞６０ｘ１０^６個／ｍＬの間の生細胞密度をもたらす。

哺乳動物細胞を培養する方法であって：マルチウェルプレートのウェル内に配置された液体培養培地に浮遊している哺乳動物細胞を、培地において、約６．０ｍｍ〜約３５ｍｍの間の直径および約４０ｍｍ〜約５０ｍｍの間の高さを有する角底ウェルの体積の約１５％〜２５％を占める培地において、角底ウェルを約３１℃〜約４０℃の温度でインキュベートし、約３２０回転毎分（ＲＰＭ）〜約３６０ＲＰＭの回数で回転撹拌したときに達成されるものと本質的に同じである流体せん断力および溶存酸素（Ｏ_２）濃度を生じさせる条件下、勾配灌流プロセスで培養する工程を含む方法も提供される。これらの方法の一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、組換えタンパク質（例えば、免疫グロブリン、酵素、成長因子、タンパク質断片、または工学操作されたタンパク質）をコードする核酸を含有するＣＨＯ細胞）である。

組換えタンパク質を生産する方法であって：マルチウェルプレートのウェル内に配置された液体培養培地に浮遊している哺乳動物細胞を、培地において、約６．０ｍｍ〜約３５ｍｍの間の直径および約４０ｍｍ〜約５０ｍｍの間の高さを有する角底ウェルの体積の約１５％〜２５％を占める培地において角底ウェルを約３１℃〜約４０℃の温度でインキュベートし、約３２０回転毎分（ＲＰＭ）〜約３６０ＲＰＭの回数で回転撹拌したときに達成されるものと本質的に同じである流体せん断力および溶存酸素（Ｏ_２）濃度を生じさせる条件下、勾配灌流プロセスで培養する工程と；組換えタンパク質を哺乳動物細胞または液体培養培地から回収する工程とを含む方法も提供される。これらの方法のいずれかの一部の実施形態では、組換えタンパク質（例えば、免疫グロブリン、酵素、成長因子、タンパク質断片、または工学操作されたタンパク質）は、哺乳動物細胞から回収される。これらの方法のいずれかの一部の実施形態では、組換えタンパク質（例えば、分泌免疫グロブリン、分泌酵素、分泌成長因子、分泌タンパク質断片、または工学操作された分泌タンパク質）は、液体培養培地から回収される。これらの方法の一部の実施形態では、哺乳動物細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。

本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、マルチウェルプレートは、選択された６ウェルプレート、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、または９６ウェルプレートである。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、マルチウェルプレートは、深型ウェルプレートである。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、液体培養培地は：既知組成液体培養培地、無血清液体培養培地、血清含有液体培養培地、動物由来成分不含液体培養培地、およびタンパク質不含培地からなる群から選択される。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、マルチウェルプレートは、ガス透過性ディスポーザブル膜またはガス透過性シリコーン層で密封される。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、マルチウェルプレートは、平底または丸底を有するウェルを含む。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、マルチウェルプレートは、本明細書に記載のマルチウェル細胞培養プレートシステムの１つである。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、培養は、ウェル中、細胞１５ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞６０ｘ１０^６個／ｍＬの間の生細胞密度をもたらす。

マルチウェル細胞培養プレートシステムであって：複数の開口部を含む第１の表面を含む一体型支持プレートと；支持プレート内に配置されており、体積約２００μＬ〜約１８ｍＬの間の体積を有する細胞培養物を収容するように構成されている、複数の培養ベッセルとを含み、各開口部は、各培養ベッセルへの開放部と対になっており、開放部を画成しており、各培養ベッセルは、培養ベッセルの中へのおよび／または培養ベッセルから外への流体の流れに順応するように構成されている少なくとも１つのポートをさらに含む、マルチウェル細胞培養プレートシステムも提供される。本明細書に記載のシステムのいずれかの一部の実施形態では、一体型支持プレートは、液体の収容およびポートへの供給のためのリザーバーを含むように構成されている。本明細書に記載のシステムのいずれかの一部の実施形態では、培養ベッセルは、少なくとも第１および第２のポートを含み、第１のポートは、培養ベッセルの中への流体の一方向の流れに順応するように構成されており、第２のポートは、培養ベッセルから外への流体の一方向の流れに順応するように構成されている。本明細書に記載のシステムのいずれかの一部の実施形態では、ポートは、細胞の培養ベッセルへの流入および培養ベッセルからの流出を選択的に防止するように構成されているフィルターを含む。本明細書に記載のシステムのいずれかの一部の実施形態では、第１および第２のポート各々は、細胞の培養ベッセルへの流入および培養ベッセルからの流出を選択的に防止するように構成されているフィルターを含む。本明細書に記載のシステムのいずれかの一部の実施形態は、一体型支持プレート内に配置されており、ポートと流体連通している、少なくとも１つの導水路をさらに含み、導水路は、流体を培養ベッセルにおよび／または培養ベッセルから流すように構成されている。本明細書に記載のシステムのいずれかの一部の実施形態は、少なくとも１つのポートと作動可能に接続された少なくとも１つの流体流量調整器をさらに含む。本明細書に記載のシステムのいずれかの一部の実施形態は、少なくとも１つの導水路と作動可能に接続された少なくとも１つの流体流量計をさらに含む。

本明細書で使用する場合、名詞の前の語「ａ」は、その特定の名詞の１つまたはそれ以上を表す。例えば、句「哺乳動物細胞（ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ）」は、「１つまたはそれ以上の哺乳動物細胞」を表す。

用語「哺乳動物細胞」は、任意の哺乳動物（例えば、ヒト、ハムスター、マウス、ミドリサル、ラット、ブタ、ウシ、もしくはウサギ）からのまたは由来の任意の細胞を意味する。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は不死化細胞である。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は分化細胞である。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は未分化細胞である。

用語「０日目」は、哺乳動物細胞が第１の液体培養培地に播種される時点を意味する。

用語「１日目」は、第１の液体培養培地への哺乳動物細胞の播種後、第０日〜約２４時間の間の期間を意味する。

用語「２日目」は、第１の液体培養培地への哺乳動物細胞の播種後、約２４時間〜約４８時間の期間を意味する。

用語「３日目」は、第１の液体培養培地への哺乳動物細胞の播種後、約４８時間〜約７２時間の期間を意味する。

用語「４日目」は、第１の液体培養培地への哺乳動物細胞の播種後、約７２時間〜約９６時間の間の期間を意味する。各々のさらなる日についての用語（「５日目」、「６日目」、「７日目」など）は、直前の日の終わりからさらなる約２４時間にわたる期間を意図したものである。

用語「実質的に含まない」は、特定の物質（例えば哺乳動物細胞）が少なくともまたは約９０％ない（例えば、少なくとももしくは約９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとももしくは約９９％ない、または約１００％ない）組成物（例えば液体培養培地）を意味する。

用語「０．５ｘ体積」は、その体積の約５０％を意味する。用語「０．６ｘ体積」は、その体積の約６０％を意味する。同様に、０．７ｘ、０．８ｘ、０．９ｘおよび１．０ｘは、その体積の７０％、８０％、９０％または１００％をそれぞれ意味する。

用語「培養」または「細胞培養」は、一連の管理された物理的条件下での哺乳動物細胞の維持または増殖を意図したものである。

用語「液体培養培地」は、哺乳動物細胞をインビトロで増殖させるのに十分な栄養素を含有する流体を意味する。例えば、液体培養培地は、以下の１つまたはそれ以上を含有することができる：アミノ酸（例えば２０種のアミノ酸）、プリン（例えばヒポキサンチン）、ピリミジン（例えばチミジン）、コリン、イノシトール、チアミン、葉酸、ビオチン、カルシウム、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チミジン、シアノコバラミン、ピルベート、リポ酸、マグネシウム、グルコース、ナトリウム、カリウム、硫酸鉄、硫酸銅、硫酸亜鉛、および重炭酸ナトリウム。一部の実施形態では、液体培養培地は、哺乳動物からの血清を含有することができる。一部の実施形態では、液体培養培地は、哺乳動物からの血清も別の抽出物も含有しない（定義された液体培養培地）。一部の実施形態では、液体培養培地は、微量金属、哺乳動物成長ホルモン、および／または哺乳動物成長因子を含有することができる。液体培養培地の非限定的な例を本明細書に記載する。液体培養培地のさらなる例は当技術分野において公知であり、市販されている。液体培養培地は、任意の密度の哺乳動物細胞を含有することができる。例えば、本明細書で使用するような、ウェルから除去される第１の体積の第１の培養培地は、哺乳動物細胞を実質的に含まないこともある。

用語「第１の液体培養培地」は、哺乳動物細胞の培養に好適である液体培養培地の体積を意味する。

用語「第２の液体培養培地」は、第１および第２の液体培養培地のいずれの混合前にも第１の液体培養培地の体積から独立している、哺乳動物細胞の培養に好適である液体培養培地の体積を意味する。

用語「動物由来成分不含液体培養培地」は、哺乳動物に由来するいずれの成分も（例えば、タンパク質も血清も）含有しない液体培養培地を意味する。

用語「無血清液体培養培地」は、哺乳動物の血清を含有しない液体培養培地を意味する。

用語「血清含有液体培養培地」は、哺乳動物血清を含有する液体培養培地を意味する。

用語「既知組成液体培養培地」は、化学成分のすべてが既知である液体培養培地を意味する。例えば、既知組成液体培養培地は、ウシ胎仔血清も、ウシ血清アルブミンも、ヒト血清アルブミンも含有しない。これらの調製物は、アルブミンと脂質の複雑な混合物を通常は含有するからである。

用語「タンパク質不含液体培養培地」は、いずれのタンパク質も（例えば、いずれの検出可能なタンパク質も）含有しない液体培養培地を意味する。

用語「撹拌」は、液体培養培地中の溶存Ｏ_２濃度を増加させるために、液体培養培地を含有する少なくとも１つのウェルを含有するマルチウェルプレートを動かすことを意味する。回転撹拌などの撹拌は、当技術分野において公知の任意の方法、例えば、円または楕円運動でマルチウェルプレートを動かす機器、例えばロータリーシェーカーを使用して行うことができる。マルチウェルプレートを撹拌するために使用することができる例示的デバイスを本明細書に記載する。そのようなデバイスのさらなる例も当技術分野において公知であり、市販されている。

用語「免疫グロブリン」は、免疫グロブリンタンパク質のアミノ酸少なくとも１５個（例えば、アミノ酸少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００個）のアミノ酸配列（例えば、可変ドメイン配列、フレームワーク配列、または定常ドメイン配列）を含有するポリペプチドを意味する。免疫グロブリンは、例えば、軽鎖免疫グロブリンのアミノ酸少なくとも１５個、例えば、重鎖免疫グロブリンのアミノ酸少なくとも１５個を含むことがある。免疫グロブリンは、単離された抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＭ）であることがある。免疫グロブリンは、ＩｇＧのサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）であることもある。免疫グロブリンは、抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、またはｓｃＦｖ断片であることがある。免疫グロブリンは、二重特異性抗体もしくは三重特異性抗体、または二量体、三量体もしくは多量体抗体、またはダイアボディ、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）もしくはＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）であることもある。免疫グロブリは、少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含有する工学操作されたタンパク質（例えば融合タンパク質）であることもできる。免疫グロブリンの非限定的な例は本明細書に記載があり、免疫グロブリンのさらなる例は当技術分野において公知である。

用語「タンパク質断片」または「ポリペプチド断片」は、少なくとももしくは約４アミノ酸、少なくとももしくは約５アミノ酸、少なくとももしくは約６アミノ酸、少なくとももしくは約７アミノ酸、少なくとももしくは約８アミノ酸、少なくとももしくは約９アミノ酸、少なくとももしくは約１０アミノ酸、少なくとももしくは約１１アミノ酸、少なくとももしくは約１２アミノ酸、少なくとももしくは約１３アミノ酸、少なくとももしくは約１４アミノ酸、少なくとももしくは約１５アミノ酸、少なくとももしくは約１６アミノ酸、少なくとももしくは約１７アミノ酸、少なくとももしくは約１８アミノ酸、少なくとももしくは約１９アミノ酸または少なくとももしくは約２０アミノ酸長であるか２０アミノ酸長より長い、ポリペプチド配列の一部分を意味する。組換えタンパク質断片は、本明細書に記載の任意の方法を使用して生産することができる。

用語「工学操作されたタンパク質」は、生物（例えば哺乳動物）体内に存在する内因性核酸によって天然にコードされないポリペプチドを意味する。工学操作されたタンパク質の例は、酵素（例えば、工学操作された酵素の安定性および／または触媒活性を増大させる結果となる１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、欠失、挿入または付加を有するもの）、融合タンパク質、抗体（例えば、二価抗体、三価抗体またはダイアボディ）、および少なくとも１つの組換え足場配列を含有する抗原結合タンパク質を含む。

用語「流体せん断力」は、表面（例えば、細胞の表面またはウェルの表面）に対してほぼ平行に流れる液体によって生ずる応力を意味する。流体せん断力は、一般に、印加された力ベクトルに対して平行な面を有する材料の断面積で割った、印加された力と定義される。流体せん断力の例示的計算方法は、本明細書に記載があり、当技術分野において公知である。

用語「溶存Ｏ_２濃度」または「溶存酸素濃度」は、液体培養培地（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野において公知の液体培養培地のいずれか）に溶解している酸素ガスの量を意味する。液体培養培地中の溶存Ｏ_２濃度の非限定的な測定方法は本明細書に記載があり、他の方法は当技術分野において公知である。

用語「回収」は、細胞培養培地中に存在する１つもしくはそれ以上の他の成分（例えば、哺乳動物細胞もしくは培養培地タンパク質）または哺乳動物細胞溶解物中に存在する１つもしくはそれ以上の他の成分（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡもしくは他のタンパク質）からの組換えタンパク質の部分的精製または単離（例えば、少なくとももしくは約５重量％、例えば、少なくとももしくは約１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、または少なくとももしくは約９５重量％の純度）を意味する。液体培養培地からのまたは哺乳動物細胞溶解物からのタンパク質の非限定的な回収方法は本明細書に記載があり、その他は当技術分野において公知である。

用語「分泌タンパク質」または「分泌組換えタンパク質」は、哺乳動物細胞内で翻訳されるとき少なくとも１つの分泌シグナル配列を元々含有しており、少なくとも一つには、その哺乳動物細胞内の分泌シグナル配列の酵素的切断によって、細胞外空間（例えば液体培養培地）に放出される、タンパク質または組換えタンパク質を意味する。

句「勾配灌流」は、培養期間中の増分期間（例えば、約２４時間の期間、約１分〜約２４時間の間の期間、または２４時間より長い期間）につれての除去および添加される培養培地の体積（例えば、１日単位での培養培地再供給割合）の漸進的変化（例えば増加または減少）を指す。例えば、勾配灌流プロセスの一実施形態は、次のような再供給プロトコールを伴うことができる：１〜３日目 培養培地約０．５ｘ反応器体積（ＲＶ）／日の再供給、４〜６日目 約０．７ｘＲＶ／日の再供給、および７日目以降 約１．０ｘＲＶ／日の再供給。この特定の例は、ある特定の再供給割合を有する日数に関しておよび／または任意の特定の２４時間にわたっての再供給割合に関して変ることがある。それぞれの日に除去および補充される培地の分率は、培養される特定の細胞、初期播種密度、および特定の時点での細胞密度に依存して変わることがある。「ＲＶ」または「反応器体積」は、培養プロセスの開始時に存在する培養培地の体積（例えば、播種後に存在する培養培地の総体積）を意味する。

用語「フィードバッチ培養」は、初期細胞培養物への第２の液体培養培地の、その細胞培養物からの第１の液体培養培地の実質的なまたは有意な除去なしでの、増分または連続添加を意味する。フィードバッチ培養の一部の実施形態では、第２の液体培養培地は、第１の液体培養培地と同じである。フィードバッチ培養の一部の実施形態では、第２の液体培養培地は、第１の液体培養培地の濃縮形である。フィードバッチ培養の一部の実施形態では、第２の液体培養培地は、乾燥粉末として添加される。

本明細書で使用する場合の「比生産速度」または「ＳＰＲ」は、１日あたりの哺乳動物細胞１個あたりの生産される組換えタンパク質の質量または酵素活性を指す。組換え抗体のＳＰＲは、通常、質量／細胞／日として測定される。組換え酵素のＳＰＲは、通常、単位／細胞／日、または（単位／質量）／細胞／日として測定される。

本明細書で使用する場合の「体積生産速度」または「ＶＰＲ」は、１日あたりの培養物の体積あたりの（例えば、バイオリアクター、ベッセルまたはチューブ体積１Ｌあたりの）生産される組換えタンパク質の質量または酵素活性を指す。組換え抗体のＶＰＲは、通常、質量／Ｌ／日として測定される。組換え酵素のＶＰＲは、通常、単位／Ｌ／日、または質量／Ｌ／日として測定される。

用語「マイクロキャリア」は、哺乳動物細胞（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野において公知の哺乳動物細胞のいずれか）を許容するまたは哺乳動物細胞の接着を促進する表面を含有する、２０μｍ〜約１０００μｍの間のサイズを有する粒子（たとえば有機ポリマー）を意味する。マイクロキャリアは、１つまたはそれ以上の細孔（例えば、約１０μｍ〜約１００μｍの平均径を有する細孔）を含有することができる。マイクロキャリアの非限定的な例を本明細書に記載する。マイクロキャリアのさらなる例は当技術分野において公知である。マイクロキャリアは、例えばポリマー（例えば、セルロース、ポリエチレングリコール、またはポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸））を含有することができる。

別段の定義がない限り、本明細書で用いるすべての専門および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本発明において使用するための方法および材料を本明細書に記載する；当技術分野において公知の他の好適な方法および材料も使用することができる。材料、方法および例は、説明に役立つものに過ぎず、限定することを意図したものではない。本明細書において言及するすべての公報、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参考文献は、それら全体を参照によって本明細書に組み入れる。矛盾がある場合、定義を含めて本明細書が優先するものとする。

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかになる。

例示的なマルチウェルプレートシステムの上面から見た概略図である。 例示的なマルチウェルプレートシステムの側面から見た概略図である。 代替的なマルチウェルプレートシステムの側面から見た概略図である。 代替的なマルチウェルプレートシステムの側面から見た概略図である。 １０ｍＬの培養培地を含有する５０ｍＬ振盪チューブ中で灌流培養され、かつ１６０ＲＰＭで撹拌されたか、または２００μＬもしくは３００μＬの培養培地を含有する丸底９６ウェル深型プレート中で灌流培養され、かつ３３０ＲＰＭで撹拌されて、異なるバッチの再供給割合の間に培養された、細胞の２日間にわたる生細胞密度のグラフである。エラーバーは、ｎ＝２の標準偏差を表す。 ２００μＬまたは３００μＬの培養培地を含有する丸底９６ウェル深型プレート中で灌流培養され、かつ３３０ＲＰＭで撹拌され、異なるバッチ再供給割合で培養された（２×０．５リアクター体積／日または１リアクター体積／日）細胞の２日間培養の終点の生細胞密度のグラフである。エラーバーは、ｎ＝２の標準偏差を表す。 ３００μＬの培養培地を含有する丸底９６ウェル深型プレート中で灌流培養され、かつ３６０ＲＰＭで撹拌されるか、または１０ｍＬの培養培地を含有する振盪チューブ中で灌流培養され、かつ１６０ＲＰＭで撹拌された、細胞の１１日間培養の細胞生存率のグラフである。エラーバーは、振盪チューブ培養についてｎ＝２の、丸底９６ウェル深型プレート培養についてｎ＝８の標準偏差を表す。 ３００μＬの培養培地を含有する丸底９６ウェル深型プレート中で灌流培養され、かつ３６０ＲＰＭで撹拌されるか、または１０ｍＬの培養培地を含有する振盪チューブ中で灌流培養され、かつ１６０ＲＰＭで撹拌された、細胞の１１日間培養の生細胞密度の図である。エラーバーは、振盪チューブ培養についてｎ＝２の、丸底９６ウェル深型プレート培養についてｎ＝８の標準偏差を表す。 修正した再供給割合のプロトコールおよび対照の再供給割合のプロトコールにおいて、１５日間培養のそれぞれの日に使用した再供給割合（リアクター体積（複数可）中の）のグラフである。 ２００μＬ、３００μＬもしくは５００μＬのいずれかの培養培地を含有する角底もしくは丸底の９６ウェル深型プレート中で培養され、かつ３３０ＲＰＭもしくは３６０ＲＰＭで撹拌され、かつＡｐｐｌｉｋｏｎシステムもしくはディスポーザブル膜を使用して密封されたか、または対照の振盪チューブ中で培養された、細胞の経時的な生細胞密度のグラフである。エラーバーは、ｎ＝３の標準偏差を表す。 ２００μＬ、３００μＬもしくは５００μＬのいずれかの培養培地を含有する角底もしくは丸底の９６ウェル深型プレート中で培養され、かつ３３０ＲＰＭもしくは３６０ＲＰＭで撹拌され、かつＡｐｐｌｉｋｏｎシステムもしくはディスポーザブル膜を使用して密封されたか、または対照の振盪チューブ中で培養された、細胞の経時的な生細胞率のグラフである。エラーバーは、ｎ＝３の標準偏差を表す。 ２００μＬ、３００μＬもしくは５００μＬのいずれかの培養培地を含有する角底もしくは丸底の９６ウェル深型プレート中で培養され、かつ３３０ＲＰＭもしくは３６０ＲＰＭで撹拌され、かつＡｐｐｌｉｋｏｎシステムもしくはディスポーザブル膜を使用して密封されたか、または対照の振盪チューブ中で培養された、細胞の経時的な生細胞密度のグラフである。エラーバーは、ｎ＝３の標準偏差を表す。 ２００μＬ、３００μＬまたは５００μＬのいずれかの培養培地を含有する角底もしくは丸底の９６ウェル深型プレート中で培養され、かつ３３０ＲＰＭもしくは３６０ＲＰＭで撹拌され、かつＡｐｐｌｉｋｏｎシステムもしくはディスポーザブル膜を使用して密封されたか、または対照の振盪チューブ中で培養された、細胞の経時的な生細胞率のグラフである。エラーバーは、ｎ＝３の標準偏差を表す。 ３００μＬまたは５００μＬのいずれかの培養培地を含有する角底９６ウェル深型プレート中で培養され、かつ３２０ＲＰＭ、３３０ＲＰＭもしくは３４０ＲＰＭで撹拌されたか、または対照の振盪チューブ中で培養された、細胞の経時的な生細胞密度のグラフである。エラーバーは、ｎ＝３の標準偏差を表す。 １００μＬ、２００μＬもしくは３００μＬのいずれかのＣＤ ＣＨＯ培養培地を含有する丸底９６ウェル深型プレート中で培養され、かつ３２０ＲＰＭ、３４０ＲＰＭもしくは３６０ＲＰＭで撹拌された細胞か、または振盪チューブ中で培養された（対照の再供給割合または修正した再供給割合を使用して培地の灌流を実施した）細胞の、経時的な生細胞密度のグラフである。エラーバーは、ｎ＝２の標準偏差を表す。 ２００μＬ、４００μＬもしくは６００μＬのいずれかのＣＤ ＣＨＯ培養培地を含有する角底９６ウェル深型プレート中で培養され、かつ３２０ＲＰＭ、３４０ＲＰＭもしくは３６０ＲＰＭで撹拌された細胞か、または振盪チューブ中で培養された（対照の再供給割合または修正した再供給割合を使用して培地の灌流を実施した）細胞の、経時的な生細胞密度のグラフである。エラーバーは、ｎ＝２の標準偏差を表す。 １００μＬ、２００μＬもしくは３００μＬのいずれかのＣＤ ＣＨＯ培養培地を含有する丸底９６ウェル深型プレート中で培養され、かつ３２０ＲＰＭ、３４０ＲＰＭもしくは３６０ＲＰＭで撹拌された細胞か、または振盪チューブ中で培養された（対照の再供給割合または修正した再供給割合を使用して培地の灌流を実施した）細胞の、累積生細胞密度のグラフである。エラーバーは、ｎ＝２の標準偏差を表す。 ２００μＬ、４００μＬもしくは６００μＬのいずれかのＣＤ ＣＨＯ培養培地を含有する角底９６ウェル深型プレート中で培養され、かつ３２０ＲＰＭ、３４０ＲＰＭもしくは３６０ＲＰＭで撹拌された細胞か、または振盪チューブ中で培養された（対照の再供給割合または修正した再供給割合を使用して培地の灌流を実施した）細胞の、累積生細胞密度のグラフである。エラーバーは、ｎ＝２の標準偏差を表す。 １００μＬ、２００μＬもしくは３００μＬのいずれかのＣＤ ＣＨＯ培養培地を含有する丸底９６ウェル深型プレート中で培養され、かつ３２０ＲＰＭ、３４０ＲＰＭもしくは３６０ＲＰＭで撹拌された細胞か、または振盪チューブ中で培養された（対照の再供給割合または修正した再供給割合を使用して培地の灌流を実施した）細胞の、体積当たり生産速度のグラフである。エラーバーは、ｎ＝２の標準偏差を表す。 ２００μＬ、４００μＬもしくは６００μＬのいずれかのＣＤ ＣＨＯ培養培地を含有する角底９６ウェル深型プレート中で培養され、かつ３２０ＲＰＭ、３４０ＲＰＭもしくは３６０ＲＰＭで撹拌された細胞か、または振盪チューブ中で培養された（対照の再供給割合または修正した再供給割合を使用して培地の灌流を実施した）細胞の、体積当たり生産速度のグラフである。エラーバーは、ｎ＝２の標準偏差を表す。 １００μＬ、２００μＬもしくは３００μＬのいずれかのＣＤ ＣＨＯ培養培地を含有する丸底９６ウェル深型プレート中で培養され、かつ３２０ＲＰＭ、３４０ＲＰＭもしくは３６０ＲＰＭで撹拌された細胞か、または振盪チューブ中で培養された（対照の再供給割合または修正した再供給割合を使用して培地の灌流を実施した）、細胞の比生産速度のグラフである。エラーバーは、ｎ＝２の標準偏差を表す。 ２００μＬ、４００μＬもしくは６００μＬのいずれかのＣＤ ＣＨＯ培養培地を含有する角底９６ウェル深型プレート中で培養され、かつ３２０ＲＰＭ、３４０ＲＰＭもしくは３６０ＲＰＭで撹拌された細胞か、または振盪チューブ中で培養された（対照の再供給割合または修正した再供給割合を使用して培地の灌流を実施した）細胞の、比生産速度のグラフである。エラーバーは、ｎ＝２の標準偏差を表す。 生細胞密度のモデル予測へのリアルタイムデータのフィットを示すグラフである。 体積当たり生産速度のモデル予測へのリアルタイムデータのフィットを示すグラフである。 標準偏差を考慮に入れた統計モデルへ実験データを入力することに基づき、最も良い稼働条件を示す、１２本のグラフのセットである。 角底９６ウェル深型プレートに配された５００μＬの１つまたは様々に異なる培養培地中で組換えモノクローナル抗体を生産し、かつ３３０ＲＰＭの回数で撹拌される、哺乳動物細胞株の生細胞密度プロファイルを示すグラフである。対照データは、ＣＤ ＣＨＯ培地を表す。 角底９６ウェル深型プレート中で組換え酵素を生産し、かつ３３０ＲＰＭの回数で撹拌される、哺乳動物細胞株の生細胞密度プロファイルを示すグラフである。対照データは、ＣＤ ＣＨＯ培地を表す。 角底９６ウェル深型プレートに配された５００μＬの１つまたは様々に異なる培養培地中で組換えモノクローナル抗体を生産し、かつ３３０ＲＰＭの回数で撹拌される、哺乳動物細胞株の培養の力価（ｍｇ／ｍＬ）を示すグラフである。対照データは、ＣＤ ＣＨＯ培地を表す。 角底９６ウェル深型プレートに配された５００μＬの１つまたは様々に異なる培養培地中で組換え酵素を生産し、かつ３３０ＲＰＭの回数で撹拌される、哺乳動物細胞株の培養の力価（ｍｇ／ｍＬ）を示すグラフである。対照データは、ＣＤ ＣＨＯ培地を表す。

マルチウェルプレートでの哺乳動物細胞の改善された培養方法が本明細書で提供される。培養方法は、大規模生産灌流バイオリアクターによって達成される濃度、例えば、１ｍＬあたり細胞１０ｘ１０^６個より高い、細胞１５ｘ１０^６個／ｍＬより高い、細胞２０ｘ１０^６個／ｍＬより高い、細胞２５ｘ１０^６個／ｍＬより高い、細胞３０ｘ１０^６個／ｍＬより高い、細胞３５ｘ１０^６個／ｍＬより高い、細胞４０ｘ１０^６個／ｍＬより高い、細胞４５ｘ１０^６個／ｍＬより高い、細胞５０ｘ１０^６個／ｍＬより高い、細胞５５ｘ１０^６個／ｍＬより高い、または細胞６０ｘ１０^６個／ｍＬより高い哺乳動物生細胞密度と同様の、哺乳動物生細胞濃度（例えば、液体培養培地、例えば、第１の液体培養培地、または第１および第２の液体培養培地の組合せ中の濃度）を達成することができる。例えば、培養方法は、細胞１０ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞７０ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞１０ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞６５ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞１０ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞６０ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞１０ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞５０ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞１０ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞４０ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞１０ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞３０ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞１５ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞７０ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞１５ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞６５ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞１５ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞６０ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞１５ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞５５ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞１５ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞５０ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞１５ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞４５ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞１５ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞４０ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞１５ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞３５ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞２０ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞７０ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞２０ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞６５ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞２０ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞６０ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞２０ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞５５ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞２０ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞５０ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞２０ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞４５ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞２０ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞４０ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞２５ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞７０ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞２５ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞６５ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞２５ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞６０ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞２５ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞５５ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞２５ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞５０ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞２５ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞４５ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞３０ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞７０ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞３０ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞６５ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞３０ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞６０ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞３０ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞５５ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞３０ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞５０ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞３５ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞７０ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞３５ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞６５ｘ１０^６個／ｍＬの間、３細胞５ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞６０ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞３５ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞５５ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞４０ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞７０ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞４０ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞６５ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞４０ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞６０ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞４０ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞５５ｘ１０^６個／ｍＬの間、細胞４５ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞７０ｘ１０^６個／ｍＬの間、または細胞４５ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞６５ｘ１０^６個／ｍＬの間の哺乳動物生細胞濃度をもたらすことができる。様々な異なる方法を使用して、細胞密度または生細胞密度を判定することができる。例えば、細胞培養物の試料を生理学的緩衝液で希釈し、希釈された細胞浮遊液を血球計算盤に入れ、光学顕微鏡を使用して細胞を計数することができる。別の方法では、非生細胞によって選択的に取り込まれる色素を生理学的緩衝液中に含むこと以外同様の方法（例えば、トリパンブルー、例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｔｅｒからのＶｉ−ＣＥＬＬ法（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒウェブサイトを参照されたい））を使用して、生細胞密度を判定することができる。さらに別の例では、蛍光利用フローサイトメトリー（例えば、Ｍｅｒｃｋ ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＧＵＡＶＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅウェブサイトを参照されたい））、および他の細胞計数方法を使用して、細胞密度または生細胞密度を判定することができる。

一部の実施形態では、培養方法は、有意に向上した比生産速度をもたらす。例えば、本明細書で提供される方法によって達成される比生産速度は、ある体積の第１の培養培地の除去および第２の体積の第２の培養培地の添加がないが実質的に同じ培養条件下で達成される比生産速度より少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍または１００倍高い。本方法によって達成される生産性は、（第１および／または第２の液体培養培地中）少なくとも１０，０００単位／Ｌ、少なくとも１５，０００単位／Ｌ、少なくとも２０，０００単位／Ｌ、少なくとも２５，０００単位／Ｌ、少なくとも３０，０００単位／Ｌ、少なくとも３５，０００単位／Ｌ、または少なくとも４０，０００単位／Ｌである。一部の実施形態では、本方法によって達成される生産性は、少なくとも１ｇ／Ｌ、少なくとも１．５ｇ／Ｌ、少なくとも２．０ｇ／Ｌ、少なくとも２．５ｇ／Ｌ、少なくとも３．０ｇ／Ｌ、少なくとも４．０ｇ／Ｌ、少なくとも４．５ｇ／Ｌ、または少なくとも５．０ｇ／Ｌである。

組換えタンパク質の生物活性は、当技術分野において公知の様々な方法を使用して評価することができ、その特定の組換えタンパク質の活性に依存するであろう。例えば、免疫グロブリン（例えば、抗体または抗体断片）である組換えタンパク質の生物活性は、抗体がその特異的エピトープと結合する親和性を（例えば、Ｂｉｏｃｏｒｅまたは酵素結合免疫吸着測定法を使用して）測定することによって判定することができる。組換えタンパク質は、酵素（例えば、組換えガラクトシダーゼ、例えば組換えアルファ−ガラクトシダーゼ）であってもよく、その生物活性を、その酵素の活性を測定すること（例えば、検出可能な基質の濃度の減少または検出可能な生成物の濃度の増加を（例えば分光光度法または発光を使用して）測定することによってその酵素の触媒速度定数を決定すること）によって判定してもよい。例えば、組換えガラクトシダーゼの生物活性を、グロボトリアオシルセラミド（ＧＬ−３）もしくはガラビオシルセラミドレベルの減少またはセラミドジヘキソシドもしくはガラクトースレベルの増加を測定することによって検出することができる。

例えば本明細書に記載の方法のいずれかを行うために使用することができる、マルチウェル細胞培養プレートシステムも提供される。

製造プロセスを試験する方法
組換えタンパク質（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野において公知の組換えタンパク質のいずれか）を作製するための製造プロセスを試験する方法が本明細書で提供される。これらの方法は、本明細書に記載の組換えタンパク質を生産する方法を行う工程と、方法中および／またはその後に、少なくとも１つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４）の培養リードアウト（例えば、細胞中または第１および／もしくは第２の培養培地中の組換えタンパク質の量、グルコース消費量、生細胞濃度、ラクテート生産、容積生産速度、比生産速度、グルコースからのラクテート収量、グルタミン濃度、グルタメート濃度、培養培地のｐＨ、溶存ＣＯ_２の分圧または濃度、溶存Ｏ_２の濃度または分圧、代謝物物質移動、ならびに代謝物物質収支）を検出または測定する工程と；および少なくとも１つの培養リードアウトを、少なくとも１つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）の培養リードアウトの基準レベル（例えば、細胞中または第１および／もしくは第２の培養培地中に存在する（で検出される）組換えタンパク質の量、グルコース消費量、生細胞濃度、ラクテート生産、容積生産速度、比生産速度、グルコースからのラクテート収量、グルタミン濃度、グルタメート濃度、培養培地のｐＨ、溶存ＣＯ_２の濃度または分圧、溶存Ｏ_２の濃度または分圧、代謝物物質移動ならびに代謝物物質収支の基準レベル）と比較する工程とを含む。

本明細書に記載の様々な培養パラメータ（例えば、マルチウェルプレート、体積、培養物体積を交換する速度または回数、撹拌回数、温度、培地、ＣＯ_２濃度、および反応器角度）のいずれかを任意の組合せで使用してこれらの方法を行うことができることを、当業者は理解するであろう。さらに、本明細書に記載のまたは当技術分野において公知の任意の哺乳動物細胞をこれらの方法において使用することができる。

少なくとも１つの培養リードアウト（例えば、細胞中または第１および／もしくは第２の培養培地中の組換えタンパク質の量、グルコース消費量、生細胞濃度、ラクテート生産、容積生産速度、比生産速度、グルコースからのラクテート収量、グルタミン濃度、グルタメート濃度、培養培地のｐＨ、溶存ＣＯ_２の濃度または分圧、溶存Ｏ_２の濃度または分圧、代謝物物質移動、ならびに代謝物物質収支）の基準レベルは、異なる培養方法、例えば、少なくとも１つの異なる培養パラメータ（例えば、異なる第１および／または第２の液体培養培地、異なる哺乳動物細胞、異なる撹拌回数および／またはタイプ、異なるマルチウェルプレート、異なるバッチ再供給または灌流割合（例えば、２４時間の期間または他の増分期間にわたってのウェル体積または第１の液体培養培地体積の１０％〜２００％）、および本明細書に記載の他の培養パラメータのいずれか）を利用する培養方法を使用して生じるレベルである。組換えタンパク質の基準量は、例えば、異なる溶存Ｏ_２レベルおよび／または異なる液体せん断応力レベルをもたらす一連の培養パラメータを使用して生産される組換えタンパク質レベルである。

本明細書に記載の方法は、製造プロセスの任意の成分または特徴の効果を試験するために使用することができる。例えば、本明細書に記載の方法は、異なる原料、撹拌レベル、マルチウェルプレート、凝集防止剤、培養培地（例えば既知組成培養培地）または栄養元素もしくは化合物の、少なくとも１つの培養リードアウト（例えば、本明細書に記載の培養リードアウトのいずれか）に対する効果（例えば、組換えタンパク質生産および／または哺乳動物細胞増殖に対する効果）を試験するために使用することができる。例えば、組換えタンパク質の生産方法での使用に対する、第１もしくは第２の液体培養培地、第１もしくは第２の液体培養培地中に存在する原料成分もしくは栄養補助剤、または哺乳動物細胞源の有効性を試験する方法であって、ウェルの体積の約５％〜約７０％を占める第１の液体培養培地に配置された哺乳動物細胞を含有する少なくとも１つのウェルを含有するマルチウェルプレートを用意する工程と；ある期間、約３１℃〜約４０℃で、約３２０ＲＰＭ〜約５００ＲＰＭの回転撹拌をしながら、マルチウェルプレートをインキュベートする工程と；連続的にまたは定期的に、期間中に、第１の体積の第１の液体培養培地を除去し、第２の体積の第２の液体培養培地を第１の液体培養培地に添加する工程であって、第１および第２の体積はほぼ等しい工程と；少なくとも１つの培養リードアウト（例えば、本明細書に記載の培養リードアウトのいずれか、例えば、細胞中のまたは第１および／もしくは第２の培養培地中の組換えタンパク質の量）を検出または判定する工程と；少なくとも１つの培養リードアウトを、異なる第１もしくは第２の液体培養培地または異なる哺乳動物細胞源のうちの１つまたはそれ以上を使用する異なる培養方法によって生じる、少なくとも１つの培養リードアウト（例えば、本明細書に記載の培養リードアウトのいずれか、例えば、細胞中のまたは第１および／もしくは第２の液体培養培地中の組み替えタンパク質の量）の基準レベルと比較する工程と；基準レベルと比較して少なくとも１つの培養リードアウトの有益な変化（例えば増加または減少）（例えば、組換えタンパク質量増加）に関連付けられる、第１もしくは第２の液体培養培地、第１もしくは第２の液体培養培地中に存在する原料もしくは栄養補助剤、または哺乳動物細胞源を、組換えタンパク質の生産方法での使用に有効であると特定する工程とを含む方法が、本明細書で提供される。例えば、基準レベルと比較して組換えタンパク質レベルの増加、生細胞濃度の増加、容積生産速度の増加、比生産速度の増加、およびグルコース消費量の増加は、第１もしくは第２の液体培養培地、第１もしくは第２の液体培養培地中に存在する原料成分もしくは栄養補助剤、または哺乳動物細胞源が、組換えタンパク質の生産方法での使用に有効であることを示す。

本明細書に記載する方法は、本明細書に記載のまたは当技術分野において公知の様々な細胞培養パラメータ（例えば、ウェルの体積、高さ、直径もしくは底の形状、撹拌回数もしくはタイプ、せん断力、培養播種密度、第１もしくは第２の液体培養培地のｐＨ、溶存Ｏ_２濃度もしくは分圧、ウェルの内面コーティング、液体培養培地（例えば、第１および／もしくは第２の液体培養培地）中の様々な内容物、哺乳動物細胞タイプもしくは哺乳動物細胞株、ＣＯ_２曝露もしくは溶存ＣＯ_２濃度もしくは分圧、温度、液体培養培地の体積（例えば、第１および／もしくは第２の液体培養培地の体積）、ならびに／または第１の体積の第１の培養培地を除去する、および第１の培養培地に第２の体積の第２の培養培地を添加する速度または回数）のいずれかを変化させることの効果を試験するために使用することもできる。方法は、液体培養培地（例えば、第１および／または第２の液体培養培地）を調製するために使用される水の量、および／または少なくとも１つの培養リードアウト（例えば、本明細書に記載の培養リードアウトのいずれか）に対する液体培養培地中の異なる微量金属の効果（例えば、組換えタンパク質生産および／または哺乳動物細胞増殖に対する効果）を試験するために使用することもできる。方法は、少なくも１つの培養リードアウト（例えば、本明細書に記載の培養リードアウトのいずれか）に対する成長因子または成長ホルモンの効果（例えば、組換えタンパク質生産および／または哺乳動物細胞増殖に対する効果）を試験するために使用することもできる。方法は、第１および／または第２の液体培養培地を調製するために使用される濾過プロセスおよびフィルターを試験するために使用することもできる。方法は、液体培養培地安定性、および液体培養培地の生物学的機能（例えば、本明細書に記載の培養リードアウトのいずれかの少なくとも１つ）に対する効果（例えば、組換えタンパク質生産および／または哺乳動物細胞増殖に対する効果）を試験するために使用することもできる。方法は、様々な組換え細胞株および細胞バンクを、所望の組換えタンパク質（例えば、所望の、分泌の治療用タンパク質）を生産するそれらの能力についてスクリーングするために使用することもできる。本明細書において述べるように、方法は、撹拌のタイプおよび回数、せん断力、灌流率および体積、培養播種密度などを含むがこれらに限定されない、任意の細胞培養プロセスパラメータをスクリーニングするために使用することもできる。

本明細書に記載の方法は、第１もしくは第２の液体培養培地中の、第１もしくは第２の液体培養培地を生成するために使用された原料中の、または哺乳動物細胞源中の夾雑物の存在について試験するために使用することもできる。例えば、第１もしくは第２の液体培養培地中の、第１もしくは第２の液体培養培地を生成するために使用された原料中の、または哺乳動物細胞源中の夾雑物の存在について試験する方法であって、ウェルの体積の約５％〜約７０％を占める第１の液体培養培地に浮遊している哺乳動物細胞を含有する少なくとも１つのウェルを含有するマルチウェルプレートを用意する工程と；ある期間、約３１℃〜約４０℃で、約３２０回転毎分（ＲＰＭ）〜約５００ＲＰＭの撹拌をしながら、マルチウェルプレートをインキュベートする工程と；連続的にまたは定期的に、期間中に、第１の体積の第１の液体培養培地を除去し、第２の体積の第２の液体培養培地を第１の液体培養培地に添加する工程であって、第１および第２の体積はほぼ等しい工程と；少なくとも１つの培養リードアウト（例えば、本明細書に記載の培養リードアウトのいずれか、例えば、細胞中のまたは第１および／もしくは第２の液体培養培地中の組換えタンパク質の量）を検出または判定する工程と；少なくとも１つの培養リードアウトを、異なる第１もしくは第２の液体培養培地、第１もしくは第２の液体培養培地を生成するための異なる原料、または異なる哺乳動物細胞源のうちの１つまたはそれ以上を使用する異なる培養方法によって生じる、少なくとも１つの培養リードアウト（例えば、本明細書に記載の培養リードアウトのいずれか、例えば、細胞中のまたは第１および／もしくは第２の培養培地中の組み替えタンパク質の量）の基準レベルと比較する工程と；基準レベルと比較して少なくとも１つの培養パラメータが有害に変化された（例えば増加されたまたは減少された）場合、第１もしくは第２の液体培養培地、第１もしくは第２の液体培養培地を生成するために使用された原料、または哺乳動物細胞源を夾雑物を含有すると断定する工程とを含む方法が、本明細書で提供される。例えば、基準レベルと比較して組換えタンパク質生産の減少（例えば、細胞中のまたは第１および／もしくは第２の培養培地中の組換えタンパク質の減少）、容積生産速度の減少または生細胞濃度の減少は、第１もしくは第２の液体培養培地中の、第１もしくは第２の液体培養培地を生成するために使用された原料中の、または哺乳動物細胞源中の夾雑物の存在を示す有害な変化である。一部の方法は、第１もしくは第２の液体培養培地中、第１もしくは第２の液体培養培地を生成するために使用された原料中、または哺乳動物細胞源中に存在する夾雑物の正体を判定するための１つまたはそれ以上のアッセイをさらに含む。夾雑物は、生物学的夾雑物（例えば、マイコバクテリウム、真菌、細菌、ウイルスまたは望ましくない哺乳動物細胞）であることがある。夾雑物は、物理的性質不明の物質であることもある。

方法は、細胞培養方法の実験計画（ＤＯＥ）またはクォリティー・バイ・デザイン（ＱＢＤ）最適化を行うためのハイスループット細胞培養実験を実行するために使用することができる。例えば、組換えタンパク質を生産する製造プロセスを最適化する方法であって、ウェルの体積の約５％〜約７０％を占める第１の液体培養培地に浮遊している哺乳動物細胞を含有する少なくとも１つのウェルを含有するマルチウェルプレートを用意する工程と；ある期間、約３１℃〜約４０℃で、約３２０ＲＰＭ〜約５００ＲＰＭの回転撹拌をしながら、マルチウェルプレートをインキュベートする工程と；連続的にまたは定期的に、期間中に、第１の体積の第１の液体培養培地を除去し、第２の体積の第２の液体培養培地を第１の培養培地に添加する工程であって、第１および第２の体積はほぼ等しい工程と；少なくとも１つの培養リードアウト（例えば、本明細書に記載の培養リードアウトのいずれか、例えば、細胞中のまたは第１および／もしくは第２の液体培養培地中の組換えタンパク質の量）を検出する工程と；少なくとも１つの培養リードアウトを、異なる培養法によって生じた少なくとも１つの培養リードアウト（例えば、本明細書に記載の培養リードアウトのいずれか、例えば、細胞中または第１および／もしくは第２の液体培養培地中に存在する組換えタンパク質の量）の基準レベルと比較する工程と；少なくとも１つの培養リードアウト（例えば、本明細書に記載の培養リードアウトのいずれか、例えば、生産された組換えタンパク質）の基準レベルと比較して少なくとも１つの培養リードアウト（例えば、本明細書に記載の培養リードアウトのいずれか、例えば、生産された組換えタンパク質の量）の有害な変化（例えば、増加または減少）と関連付けられる任意の培養成分もしくはパラメータを特定し、製造プロセスにおいて除去もしくは変更する工程、または少なくとも１つの培養リードアウト（例えば、本明細書に記載の培養リードアウトのいずれか、例えば、生産された組換えタンパク質）の基準レベルと比較して少なくとも１つの培養リードアウト（例えば、本明細書に記載の培養リードアウトのいずれか、例えば、生産された組換えタンパク質の量）の有益な変化（例えば、増加または減少）と関連付けられる任意の培養生物もしくはパラメータを特定し、製造プロセスに加える工程とを含む方法が、本明細書で提供される。例えば、生産された組換えタンパク質の量、容積生産速度、比生産速度、または生細胞濃度の増加は、培養リードアウトの有益な変化であり、生産された組換えタンパク質の量、容積生産速度、比生産速度、または生細胞濃度の減少は、培養リードアウトの有害な変化である。場合によっては、方法は、組換えタンパク質の大規模化（例えばバイオリアクター）生産に使用することができる最適化細胞培養条件をハイスループット方式で同定するために使用される。

この節に記載の方法のいずれにおいても、少なくとも１つの培養リードアウトの基準レベルは、大規模培養（例えば、灌流バイオリアクター、例えば、２０００Ｌ灌流バイオリアクター、４０Ｌ灌流バイオリアクターまたは１２Ｌ灌流バイオリアクター）からのものである。この節に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、大規模培養が行われる（並行して培養される）同じ期間にわたって、本明細書に記載の方法のいずれかを使用してマルチウェルプレートで培養される。例えば、本明細書に記載の方法のいずれかにおいてマルチウェルプレートに接種するために使用される接種材料は、ほぼ同時に大規模灌流バイオリアクターに接種するためにも使用される。

一実施形態において、ウェルに播種するために使用される接種材料は、大規模培養（例えば、大規模灌流バイオリアクター）から得られる。例えば、大規模培養からの任意の時点（例えば、増殖期、移行期（例えば、培養が異なる一連の増殖条件、例えば、異なる液体培養培地および／もしくは温度に移行されている任意選択の期間）または回収期）での、およびウェルに接種するために使用される（例えば、サテライトマルチウェルプレート培養を開始させるために使用される）、アリコート。アリコートを大規模培養から増殖期中に除去し、使用して、液体培養培地を含有する少なくとも１つのウェルを含有するマルチウェルプレートに接種または播種することができ、その後、大規模培養で利用される増殖期条件を再現するまたは大規模培養で利用される増殖期条件と同様である条件下でウェルをインキュベートする。あるいは、または加えて、アリコートを大規模培養から移行期中に除去し、使用して、液体培養培地を含有する少なくとも１つのウェルを含有するマルチウェルプレートに接種または播種することができ、その後、大規模培養で利用される移行期条件を再現するまたは大規模培養で利用される移行期条件と同様である条件下でウェルをインキュベートする。あるいは、または加えて、アリコートを大規模培養から回収期中に除去し、使用して、液体培養培地を含有する少なくとも１つのウェルを含有するマルチウェルプレートに接種または播種することができ、その後、大規模培養で利用される回収期条件を再現するまたは大規模培養で利用される回収期条件と同様である条件下でウェルをインキュベートする。これらの方法のいずれにおいても、マルチウェルプレートで哺乳動物細胞を培養するために使用される方法における１つまたはそれ以上の培養パラメータを（大規模培養で哺乳動物細胞を培養するために使用される培養パラメータまたは成分と比較して）変更することができ、少なくとも１つの培養リードアウトを測定し、その少なくとも１つの培養リードアウトを、大規模培養について判定された少なくとも１つの培養リードアウトと比較する。当業者には理解できるように、これらの方法は、培養プロセスの１つまたはそれ以上の特定の期の間の少なくとも１つの培養リードアウトに対する特定の培養パラメータまたは成分の効果（例えば、増殖期、任意選択の移行期、および／または回収期中の少なくとも１つの培養リードアウトに対する１つまたはそれ以上の培養パラメータおよび／または培養成分の効果）を試験するために使用することができる。

ある特定の実施形態では、（例えば、大規模バイオリアクター培養のアリコートを接種した、または大規模バイオリアクターへの接種に使用した同じ凍結細胞バンクを接種した）マルチウェルプレートにおける少なくとも１つの培養リードアウトを判定または検出する工程、少なくとも１つの培養リードアウトを、少なくとも１つの培養リードアウトの基準レベル（例えば、夾雑が実質的にない培養物からの少なくとも１つの培養リードアウトのレベル）と比較する工程、およびウェルにおける少なくとも１つの培養リードアウトが、少なくとも１つの培養リードアウトの基準レベルと比較して、夾雑物がウェル内に存在することを示す場合、大規模バイオリアクターを、夾雑物を含有すると断定する工程によってこれらの方法を行って、夾雑物が大規模バイオリアクター内に存在するかどうかを判定することもできる。夾雑物は、例えば、生物学的夾雑物、例えばウイルス、真菌、望ましくない哺乳動物細胞、または細菌、例えばマイコバクテリウムであることがある。夾雑物は、例えば、ベシウイルスであることもある。

マルチウェル細胞培養プレートシステム
本明細書は、（例えば、本明細書に記載の方法のいずれかを使用する）哺乳動物細胞の培養に有用な、例示的マルチウェル細胞培養プレートシステムを提供する。これらのシステムは、培養ベッセルの中へのおよび／または培養ベッセルから外への流体の流れに順応するように構成されている少なくとも１つのポートによって培養ベッセル内に存在する流体（例えば、第１の液体培養培地）の連続的または定期的除去、および培養ベッセルへの流体（例えば、第２の液体培養培地）の添加を可能にするように設計されている。

例示的マルチウェル細胞培養プレートシステム
マルチウェル細胞培養プレートシステム１の非限定的な例の上面図を図１に提供する。マルチウェル細胞培養プレートシステム１は、複数の開口部４を有する表面３を含む一体型支持プレート２を含む。開口部を任意の形式で配列することができ、図１は縦列・横列の形式の開口部を示しているが、開口部の任意の構成を利用できることを当業者は理解するであろう。

例示的マルチウェル培養プレートシステム１１の側面図を図２に示す。マルチウェル培養プレートシステム１１は、複数の開口部４を含む表面３を有する一体型支持プレート２を含む。一体型支持プレート２は、いずれの生物学的適合性材料（例えば、ポリスチレン、または当技術分野において公知のいずれの他の生物学的適合性材料）製であってもよい。一体型支持プレート２は、少なくとも２個の開口部４（例えば４、６、９、１０、１２、１５、１８、２０、２４、３６、４８、６０、７２もしくは９６個の開口部４）を有することができ、または少なくとも３、４、５、６、１２、１８、２４、３６、４８もしくは９６個の開口部４を有することができる。図２に示すマルチウェル培養プレートシステム１１は、複数の培養ベッセル５も有し、培養ベッセル５は、支持プレート２内に形成または配置されており、細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的哺乳動物細胞および／または組織培養培地のいずれか）を収容するように構成されている。ベッセル５は、任意の体積の細胞培養物、例えば、約０．３ｍＬ〜約２５ｍＬの間（例えば、約０．３ｍＬ〜約２４ｍＬの間、約０．３ｍＬ〜約２２ｍＬの間、約０．３ｍＬ〜約２０ｍＬの間、約０．３ｍＬ〜約１８ｍＬの間、約０．３ｍＬ〜約１６ｍＬの間、約０．３ｍＬ〜約１４ｍＬの間、約０．３ｍＬ〜約１２ｍＬの間、約０．３ｍＬ〜約１０ｍＬの間、約０．３ｍＬ〜約８ｍＬの間、約０．３ｍＬ〜約６ｍＬの間、約０．３ｍＬ〜約５ｍＬの間、約０．３ｍＬ〜約４ｍＬの間、約０．３ｍＬ〜約３ｍＬの間、約０．３ｍＬ〜約２ｍＬの間、約０．３ｍＬ〜約約１ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約２５ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約２４ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約２２ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約２０ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約１８ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約１６ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約１４ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約１２ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約１０ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約８ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約６ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜５約ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約４ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約３ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約２ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約１ｍＬの間、約１ｍＬ〜約２５ｍＬの間、約１ｍＬ〜約２４ｍＬの間、約１ｍＬ〜約２２ｍＬの間、約１ｍＬ〜約２０ｍＬの間、約１ｍＬ〜約１８ｍＬの間、約１ｍＬ〜約１６ｍＬの間、約１ｍＬ〜約１４ｍＬの間、約１ｍＬ〜約１２ｍＬの間、約１ｍＬ〜約１０ｍＬの間、約１ｍＬ〜約８ｍＬの間、約１ｍＬ〜約７ｍＬの間、約１ｍＬ〜約６ｍＬの間、約１ｍＬ〜約５ｍＬの間、約１ｍＬ〜約４ｍＬの間、約１ｍＬ〜約３．５ｍＬの間、約１ｍＬ〜約３ｍＬの間、約１ｍＬ〜約２．５ｍＬの間、約１ｍＬ〜約２ｍＬの間、約１ｍＬ〜約１．５ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約２５ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約２４ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約２２ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約２０ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約１８ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約１６ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約１４ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約１２ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約１０ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約８ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約６ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約５ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約４ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約３．５ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約３ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約２．５ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約２．０ｍＬの間、約２ｍＬ〜約２５ｍＬの間、約２ｍＬ〜約２４ｍＬの間、約２ｍＬ〜約２２ｍＬの間、約２ｍＬ〜約２０ｍＬの間、約２ｍＬ〜約１８ｍＬの間、約２ｍＬ〜約１６ｍＬの間、約２ｍＬ〜約１４ｍＬの間、約２ｍＬ〜約１２ｍＬの間、約２ｍＬ〜約１０ｍＬの間、約２ｍＬ〜約８ｍＬの間、約２ｍＬ〜約６ｍＬの間、または約２ｍＬ〜約５ｍＬの間）の体積を有するものを収容するように構成することができ、ここで、各開口部３は、各培養ベッセル４と対になっており、各培養ベッセル４への開放部を画成している。

培養ベッセル５は、様々な形状を有することができる。培養ベッセルの形状の非限定的な例は、開口部４の端部に相対する端部が例えば、平面形、半球形、ピラミッド形または円錐形になっている、略円柱形または円柱形である。開口部４の直径は、例えば、約４．０ｍｍ〜約５０ｍｍの間（例えば、約４．０ｍｍ〜約４５ｍｍの間、約４．０ｍｍ〜約４０ｍｍの間、約４．０ｍｍ〜約３５ｍｍの間、約４．０ｍｍ〜約３０ｍｍの間、約４．０ｍｍ〜約２５ｍｍの間、約４．０ｍｍ〜約２０ｍｍの間、約４．０ｍｍ〜約１５ｍｍの間、約４．０ｍｍ〜約１０ｍｍの間、約６．０ｍｍ〜約５０ｍｍの間、約６．０ｍｍ〜約４５ｍｍの間、約６．０ｍｍ〜約４０ｍｍの間、約６．０ｍｍ〜約３５ｍｍの間、約６．０ｍｍ〜約３０ｍｍの間、約６．０ｍｍ〜約２５ｍｍの間、約６．０ｍｍ〜約２５ｍｍの間、約６．０ｍｍ〜約２０ｍｍの間、約６．０ｍｍ〜約１５ｍｍの間、約６．０ｍｍ〜約１０ｍｍの間、約８ｍｍ〜約５０ｍｍの間、約８ｍｍ〜約４５ｍｍの間、約８ｍｍ〜約４０ｍｍの間、約８ｍｍ〜約３５ｍｍの間、約８ｍｍ〜約３０ｍｍの間、約８ｍｍ〜約２５ｍｍの間、約８ｍｍ〜約２０ｍｍの間、約８ｍｍ〜約１５ｍｍの間、約１０ｍｍ〜約５０ｍｍの間、約１０ｍｍ〜約４５ｍｍの間、約１０ｍｍ〜約４０ｍｍの間、約１０ｍｍ〜約３５ｍｍの間、約１０ｍｍ〜約３０ｍｍの間、約１０ｍｍ〜約２５ｍｍの間、約１０ｍｍ〜約２０ｍｍの間、約１５ｍｍ〜約５０ｍｍの間、約１５ｍｍ〜約４５ｍｍの間、約１５ｍｍ〜約４０ｍｍの間、約１５ｍｍ〜約３５ｍｍの間、約１５ｍｍ〜約３０ｍｍの間、約１５ｍｍ〜約２５ｍｍの間、または約１５ｍｍ〜約２０ｍｍの間）である。培養ベッセル５は、１ｃｍ〜約１２ｃｍの間（例えば、約１ｃｍ〜約１１ｃｍの間、約１ｃｍ〜約１０ｃｍの間、約１ｃｍ〜約９ｃｍの間、約１ｃｍ〜約８ｃｍの間、約１ｃｍ〜約７ｃｍの間、約１ｃｍ〜約６ｃｍの間、約１ｃｍ〜約５ｃｍの間、約１ｃｍ〜約４ｃｍの間、約１ｃｍ〜約３ｃｍの間、約１．２ｃｍ〜約１２ｃｍの間、約１．２ｃｍ〜約１１ｃｍの間、約１．２ｃｍ〜約１０ｃｍの間、約１．２ｃｍ〜約９ｃｍの間、約１．２ｃｍ〜約８ｃｍの間、約１．２ｃｍ〜約７ｃｍの間、約１．２ｃｍ〜約６ｃｍの間、約１．２ｃｍ〜約５ｃｍの間、約１．２ｃｍ〜約４ｃｍの間、約１．２ｃｍ〜約３ｃｍの間、約１．５ｃｍ〜約１１ｃｍの間、約１．５ｃｍ〜約１０ｃｍの間、約１．５ｃｍ〜約９ｃｍの間、約１．５ｃｍ〜約８ｃｍの間、約１．５ｃｍ〜約７ｃｍの間、約１．５ｃｍ〜約６ｃｍの間、約１．５ｃｍ〜約５ｃｍの間、約１．５ｃｍ〜約４ｃｍの間、約１．５ｃｍ〜約３ｃｍの間、約２ｃｍ〜約１２ｃｍの間、約２ｃｍ〜約１１ｃｍの間、約２ｃｍ〜約１０ｃｍの間、約２ｃｍ〜約９ｃｍの間、約２ｃｍ〜約８ｃｍの間、約２ｃｍ〜約７ｃｍの間、約２ｃｍ〜約６ｃｍの間、約２ｃｍ〜約５ｃｍの間、約２ｃｍ〜約４ｃｍの間、約２ｃｍ〜約３ｃｍの間、約２．５ｃｍ〜約１２ｃｍの間、約２．５ｃｍ〜約１１ｃｍの間、約２．５ｃｍ〜約１０ｃｍの間、約２．５ｃｍ〜約９ｃｍの間、約２．５ｃｍ〜約８ｃｍの間、約２．５ｃｍ〜約７ｃｍの間、約２．５ｃｍ〜約６ｃｍの間、約２．５ｃｍ〜約５ｃｍの間、約２．５ｃｍ〜約４ｃｍの間、約３ｃｍ〜約１２ｃｍの間、約３ｃｍ〜約１１ｃｍの間、約３ｃｍ〜約１０ｃｍの間、約３ｃｍ〜約９ｃｍの間、約３ｃｍ〜約８ｃｍの間、約３ｃｍ〜約７ｃｍの間、約３ｃｍ〜約６ｃｍの間、約３ｃｍ〜約５ｃｍの間、約４ｃｍ〜約１２ｃｍの間、約４ｃｍ〜約１１ｃｍの間、約４ｃｍ〜約１０ｃｍの間、約４ｃｍ〜約９ｃｍの間、約４ｃｍ〜約８ｃｍの間、約４ｃｍ〜約７ｃｍの間、約４ｃｍ〜約６ｃｍの間、約５ｃｍ〜約１２ｃｍの間、約５ｃｍ〜約１１ｃｍの間、約５ｃｍ〜約１０ｃｍの間、約５ｃｍ〜約９ｃｍの間、約５ｃｍ〜約８ｃｍの間、または約５ｃｍ〜約７ｃｍの間）の高さを有することができる。

図２に示すマルチウェル細胞培養プレートシステム１１は、培養ベッセル５の中へのおよび培養ベッセル５から外への流体の流れに順応するように構成されているポート６、例えば、一または二方向弁も含む。ポート６を培養ベッセル５と任意の位置で流体連通させることができる。本明細書に記載のマルチウェル培養プレートシステムは、各培養ベッセル５と流体連通された少なくとも１つ、例えば、２つ、３つまたは少なくとも４つのポート６を有することができる。ポート６と培養ベッセル５の例示的連通位置を図２および３に示す。ポート６を、一方向に（例えば、培養ベッセル５の中へ、もしくは培養ベッセル５から外へ）または両方向に（培養ベッセル５の中へおよび培養ベッセル５から外へ）流体を流すように構成することができる。一部の実施形態では、第１のポート６を、培養ベッセル５の中への一方向の流れに順応するように構成することができ、第２のポート６を、培養ベッセル５から外への一方向の流れに順応するように構成する。

図３は、細胞の培養ベッセル５への流入および培養ベッセル５からの流出を選択的に防止するように構成されているフィルター８を含むマルチウェル細胞培養プレートシステム１２を示す。フィルター８は、哺乳動物細胞を濾過するために使用される当技術分野において公知の任意のマイクロまたはナノフィルターである。２つまたはそれ以上のポート６を有するマルチウェル細胞培養プレートシステムは、細胞の培養ベッセル５への流入および培養ベッセル５からの流出を選択的に防止するように構成されているフィルター８を各ポート６の上または中に有する。

図２および図３にそれぞれ示すマルチウェル細胞培養プレートシステム１２および１３は、少なくとも１つの導水路７も含み、導水路７は、一体型支持プレート２の中に配置されており、ポート６と流体連通しており、流体を培養ベッセル５におよび培養ベッセル５から流すように構成されている。一部の例では、マルチウェル細胞培養プレートシステムは、（例えば、流体を各培養ベッセル５におよび／または各培養ベッセル５から流すように構成されている）各ポート６と流体連通している導水路７を有することができる。

本明細書で提供されるマルチウェル細胞培養プレートシステムは、ポート６に作動可能に連結された少なくとも１つの流体流量調整器をさらに含むことができる。本明細書で提供されるマルチウェル細胞培養プレートシステムは、導水路７に作動可能に接続された少なくとも１つの流体流量調整器をさらに含むことができる。流体流量調整器の非限定的な例は、培養ベッセル５内の流体体積および／または流体圧力の変化を検出することによって流体の流量および／または流れ方向を制御することができる。一部の例では、特定の速度で、特定の期間にわたって、特定の流れ方向に（例えば、培養ベッセル５の中へおよび／または培養ベッセル５から外へ）流体を流すように、流体流量調整器をプログラムすることができる。

一部の実施形態では、一体型支持プレート２は、液体の収容およびポート６または導水路７への供給のためのリザーバーを含むように構成される。一部の例では、マルチウェル細胞培養プレートシステムは、液体の収容およびポート６または導水路７への供給のためのリザーバーであって、一体型支持プレート２の外部にあり、ポート６または導水路７とそれぞれ流体連通されるように構成されている（この場合、ポート６または導水路７は、培養ベッセル５の中へ流体を流す機能を果たす）リザーバーを含む。一部の実施形態では、一体型支持プレート２は、培養ベッセル５から除去された液体を収容および保管するためのリザーバーを含むように構成されており、除去された液体を収容および保管するためのリザーバーは、一体型支持プレート２の外部にあり、ポート６または導水路７と流体連通されている（この場合、ポート６または導水路７は、培養ベッセル５から外に流体を流す機能を果たす）。

液体の収容およびポート６への供給のための内部リザーバー９を含むように構成されている例示的一体型支持プレート２を図４に示す。図４の一体型支持プレート２は、液体の除去または内部リザーバー９への添加のための交換ポート１０をさらに含む。内部リザーバー９を含む一体型支持プレートは、一および／または二方向交換ポート１０（例えば、一または二方向弁）を含むことができる。例えば、内部リザーバー９を含む一体型支持プレート２は、内部リザーバーの中への液体の流れを可能にする第１の交換ポート１０と、内部リザーバーから外への液体の流れを可能にする第２の交換ポートを有することができる。別の例では、内部リザーバー９を含む一体型支持プレート２は、内部リザーバー１０の中へのおよび内部リザーバー１０から外への液体の流れを可能にする単一の二方向交換ポート１０を有することができる。内部リザーバー１０内に存在する流体を、１つまたはそれ以上のポート６および／または導水路７の使用によって、ベッセル５の中へおよび／またはベッセル５から外へ流すことができる。

一部の例では、マルチウェル細胞培養プレートは、カバープレートをさらに含み、カバープレートは、一体型支持プレート２および開口部４（例えば、一体型支持プレート２内のすべての開口部４）を覆うように、培養ベッセル５の夾雑（例えば、細菌（例えばマイコバクテリア）、ウイルスまたは真菌汚染）を防止するように、および培養ベッセル５と外部環境間のガス交換を可能にするように構成されている。一部の実施形態では、マルチウェル培養プレートは、培養ベッセル５と外部環境間のガス交換を可能にする上に培養ベッセル５の夾雑を防止するために、カバープレートと一体型支持プレート２の間に配置されたガス透過性ディスポーザブル膜またはガス透過性シリコーン層をさらに含む。

当技術分野において公知の様々な方法、例えば流体圧力、空気圧、重力および機械的圧力、の１つまたはそれ以上を使用して、本明細書に記載のシステムのいずれかを通して（例えば、システムの中へおよび／もしくはシステムから外へ、例えば、ポート６の中へおよび／もしくはポート６から外へ、導水路７の中へおよび／もしくは導水路７から外へ、または交換ポート１０の中へおよび／もしくは交換ポート１０から外へ）流体を流すことができる。例えば、ポンプ、重力、遠心力または機械的圧力を使用して、本明細書に記載のシステムのいずれかを通して流体を除去することができる。本明細書に記載のシステムのいずれかを通して流体を流すためのさらなる方法は、当技術分野において周知である。

哺乳動物細胞培養方法
本明細書で記載される例示的な方法において、まずマルチウェルプレートが提供される。第１の液体培養培地が、培地がウェル体積の約５％〜約８０％の間（例えば、約５％〜約７５％の間、約５％〜約７０％の間、約５％〜約６５％の間、約５％〜約６０％の間、約５％〜約５５％の間、約５％〜約５０％の間、約５％〜約４５％の間、約５％〜約４０％の間、約５％〜約３５％の間、約５％〜約３０％の間、約１０％〜約８０％の間、約１０％〜約７５％の間、約１０％〜約７０％の間、約１０％〜約６５％の間、約１０％〜約６０％の間、約１０％〜約５５％の間、約１０％〜約５０％の間、約１０％〜約４５％の間、約１０％〜約４０％の間、約１０％〜約３５％の間、約１５％〜約８０％の間、約１５％〜約７５％の間、約１５％〜約７０％の間、約１５％〜約６５％の間、約１５％〜約６０％の間、約１５％〜約５５％の間、約１５％〜約５０％の間、約１５％〜約４５％の間、約１５％〜約４０％の間、約２０％〜約８０％の間、約２０％〜約７５％の間、約２０％〜約７０％の間、約２０％〜約６５％の間、約２０％〜約６０％の間、約２０％〜約５５％の間、約２０％〜約５０％の間、約２０％〜約４５％の間、約２５％〜約８０％の間、約２５％〜約７５％の間、約２５％〜約７０％の間、約２５％〜約６５％の間、約２５％〜約６０％の間、約２５％〜約５５％の間または約２５％〜約５０％の間）を占めるように、ウェルに添加される。少なくとも１つの哺乳動物細胞が第１の液体培養培地に、すなわち、培地がウェルに添加される前か後に添加される。マルチウェルプレートは約３１℃〜約４０℃で一定時間インキュベートされ、例えば、回転振盪デバイスにおいて約３００ＲＰＭ〜約６００ＲＰＭ（例えば、本明細書で記載される撹拌の例示的な範囲のいずれか）で撹拌される。例えば、投てき（軌道）（ｔｈｒｏｗ（ｏｒｂｉｔ））直径約３ｍｍ〜約５０ｍｍの振盪インキュベーターなどのインキュベーターで、細胞をインキュベートしてよい。インキュベーションの間、期間中連続的にまたは定期的に、第１の体積の第１の液体培養培地（例えば、任意の哺乳動物細胞濃度を含む、例えば、哺乳動物細胞を含まないか、実質的に含まなくした第１の体積の第１の液体培養培地）が除去され、第２の体積の第２の液体培養培地が第１の液体培養培地に添加される。典型的には、第１および第２の体積を比較すると、第１および第２の体積はほぼ等しいが、少量分、例えば、約１％〜約１０％（例えば、約１％〜約８％、約１％〜約５％または約１％〜約３％）変動してもよい。一部の実施形態において、添加される第２の体積の第２の液体培養培地は、除去される第１の体積の第１の液体培養培地よりも（例えば、最大で約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％未満）少ない。当技術分野で既知の通り、インキュベート期間は、哺乳動物細胞および液体培養培地を含むマルチウェルプレートが、第１の体積の第１の液体培養培地を除去し、第２の体積の第２の液体培養培地を添加するためにインキュベーターから取り出される短い時間（例えば、最大１分間、最大２分間、最大３分間、最大４分間、最大５分間、最大１０分間、最大２０分間、最大３０分間、最大４０分間、最大５０分間または最大１時間）を含んでいてよい。一部の例において、インキュベート期間は、（例えば、本明細書で記載されるマルチウェル培養プレートシステムの使用により）哺乳動物細胞および液体培養培地を含むマルチウェルプレートが、第１の体積の第１の液体培養培地を除去し、第２の体積の第２の液体培養培地を添加するためにインキュベーターから取り出される短い時間を含まない。

これらの培養方法の各態様についての様々な非限定的な例が下に記載される。本明細書で提供される方法の例示的な態様を、限定されることなく任意の組合せで使用することができる。

哺乳動物細胞
本明細書で提供される方法は、様々な異なる哺乳動物細胞を培養するために使用することができる。哺乳動物細胞は、例えば、浮遊液中で増殖する細胞であっても、接着細胞であってもよい。本明細書で記載される方法のうちいずれかを使用して培養可能な哺乳動物細胞の非限定的な例には：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｓｐ２．０、骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ／０）、Ｂ細胞、ハイブリドーマ細胞、Ｔ細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞（例えば、ＨＥＫ２９３ＥおよびＨＥＫ２９３Ｆ）、アフリカミドリザル腎臓上皮細胞（Ｖｅｒｏ）細胞、およびメイディンダービーイヌ（コッカスパニエル）腎臓上皮細胞（ＭＤＣＫ）細胞が含まれる。本明細書で記載される方法を使用して培養可能なさらなる哺乳動物細胞が、当技術分野で既知である。

哺乳動物細胞は、組換えタンパク質をコードする組換え核酸（例えば、哺乳動物細胞ゲノムに安定に組み込まれた核酸）を含んでいてよい。例示的な組換えタンパク質をコードする組換え核酸の非限定的な例が、本明細書で記載される方法を使用して生産可能な組換えタンパク質と同様に下に記載される。一部の例において、培養のためマルチウェルプレートに配置される哺乳動物細胞は、より大きな培養物由来である。例えば、マルチウェルプレートにおける哺乳動物細胞は、大規模バイオリアクター培養物由来であってよい、すなわち、これらの方法を使用してサテライト培養物を調製してよい。

培養培地
液体培養培地が当技術分野で既知である。第１および／または第２の組織培養培地には、哺乳動物血清（例えば、ウシ胎児血清およびウシ血清）、および／または成長ホルモンもしくは成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリンおよび上皮成長因子）を添加してよい。あるいはまたはさらに、第１および／または第２の液体培養培地は、既知組成液体培養培地、動物由来成分不含液体培養培地、無血清液体培養培地、血清含有液体培養培地またはタンパク質不含液体培養培地であってよい。既知組成液体培養培地、動物由来成分不含液体培養培地、無血清液体培養培地および血清含有液体培養培地の非限定的な例は、市販されている。

液体培養培地は、典型的にはエネルギー供給源（例えば、グルコースなどの糖質）、必須アミノ酸（例えば、アミノ酸２０個およびシステインの基本的なセット）、低濃度で必要であるビタミンおよび／またはその他の有機化合物、遊離脂肪酸、および／または微量元素を含む。第１および／または第２の液体培養培地には、必要に応じて、例えば、哺乳動物ホルモンまたは成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子）、塩および緩衝液（例えば、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩）、ヌクレオシドおよび塩基（例えば、アデノシン、チミジンおよびヒポキサンチン）、タンパク質および組織加水分解物、および／またはこれらの添加物の任意の組合せを添加してよい。

ここで記載される方法において特に有用な液体培養培地の非限定的な例には、例えば、ＣＤＣＨＯ、ＯｐｔｉＣＨＯ、およびＦｏｒｔｉＣＨＯ（全てＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹから入手可能）、ＨｙｃｅｌｌＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、Ｅｘ−ｃｅｌｌＣＤＣＨＯ融合培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）およびＰｏｗｅｒＣＨＯ培地（Ｌｏｎｚａ Ｇｒｏｕｐ、Ｌｔｄ．；Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）が含まれる。本方法において有用となりうる培地成分には、既知組成（ＣＤ）加水分解物、例えば、ＣＤペプトン、ＣＤポリペプチド（２つ以上のアミノ酸）およびＣＤ成長因子が含まれるが、これに限定されない。液体組織培養培地および培地成分のさらなる例が、当技術分野で既知である。

本明細書で記載される方法のうちいずれかについての一部の例においては、哺乳動物細胞が、第１の培養培地約１００μＬ〜約２５ｍＬ（例えば、約１００μＬ〜約２０ｍＬ、約１００μＬ〜約１５ｍＬ、約１００μＬ〜約１０ｍＬ、約１００μＬ〜約８ｍＬ、約１００μＬ〜約６ｍＬ、約１００μＬ〜約４ｍＬ、約１００μＬ〜約３ｍＬ、約１００μＬ〜約２．５ｍＬ、約１００μＬ〜約２．０ｍＬ、約１００μＬ〜約１．５ｍＬ、約１００μＬ〜約１．０ｍＬ、約１００μＬ〜約８００μＬ、約１００μＬ〜約６００μＬ、約１００μＬ〜約５００μＬ、約１００μＬ〜約４００μＬ、約１００μＬ〜約３００μＬ、約１００μＬ〜約２５０μＬ、約１００μＬ〜約２００μＬ、約１５０μＬ〜約２５ｍＬ、約１５０μＬ〜約２０ｍＬ、約１５０μＬ〜約１５ｍＬ、約１５０μＬ〜約１０ｍＬ、約１５０μＬ〜約８ｍＬ、約１５０μＬ〜約６ｍＬ、約１５０μＬ〜約４ｍＬ、約１５０μＬ〜約３ｍＬ、約１５０μＬ〜約２．５ｍＬ、約１５０μＬ〜約２．０ｍＬ、約１５０μＬ〜約１．５ｍＬ、約１５０μＬ〜約１．０ｍＬ、約１５０μＬ〜約８００μＬ、約１５０μＬ〜約６００μＬ、約１５０μＬ〜約５００μＬ、約１５０μＬ〜約４００μＬ、約１５０μＬ〜約３００μＬ、約１５０μＬ〜約２００μＬ、約２５０μＬ〜約２５ｍＬ、約２５０μＬ〜約２０ｍＬ、約２５０μＬ〜約１５ｍＬ、約２５０μＬ〜約１０ｍＬ、約２５０μＬ〜約８ｍＬ、約２５０μＬ〜約６ｍＬ、約２５０μＬ〜約５ｍＬ、約２５０μＬ〜約４ｍＬ、約２５０μＬ〜約３ｍＬ、約２５０μＬ〜約２．５ｍＬ、約２５０μＬ〜約２ｍＬ、約２５０μＬ〜約１ｍＬ、約５００μＬ〜約２５ｍＬ、約５００μＬ〜約２０ｍＬ、約５００μＬ〜約１５ｍＬ、約５００μＬ〜約１０ｍＬ、約５００μＬ〜約８ｍＬ、約５００μＬ〜約６ｍＬ、約５００μＬ〜約５ｍＬ、約５００μＬ〜約４ｍＬ、約５００μＬ〜約３ｍＬ、約５００μＬ〜約２．５ｍＬ、約５００μＬ〜約２ｍＬ、約５００μＬ〜約１ｍＬ、約１ｍＬ〜約２５ｍＬ、約１ｍＬ〜約２０ｍＬ、約１ｍＬ〜約１５ｍＬ、約１ｍＬ〜約１０ｍＬ、約１ｍＬ〜約８ｍＬ、約１ｍＬ〜約６ｍＬ、約１ｍＬ〜約５ｍＬ、約１ｍＬ〜約４ｍＬ、約１ｍＬ〜約３ｍＬ、約１ｍＬ〜約２．５ｍＬまたは約１ｍＬ〜約２ｍＬ）中に浮遊している。

本明細書で記載される第１の液体培養培地および第２の液体培養培地が、同じ種類の培地であっても異なる培地であってもよいことを、当業者は理解するであろう。

マイクロキャリア
哺乳動物細胞が接着細胞である一部の例において、第１および／または第２の液体培養培地は、複数のマイクロキャリアを含む。例えば、ウェルは、最終濃度が、例えば約１．０ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、（例えば、振盪フラスコ中の最終濃度が約１．０ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ〜約２．０ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ〜約１．７５ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ〜約１．５ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ〜約１．２５ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜５．０ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約７．５ｇ／Ｌ、約７．５ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約１０．０ｇ／Ｌ〜約１２．５ｇ／Ｌ、約１２．５ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約１０．０ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ〜約３．５ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約６．０ｇ／Ｌ〜約７．０ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約９．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約１０．０ｇ／Ｌ〜約１１．０ｇ／Ｌ、約１１．０ｇ／Ｌ〜約１２．０ｇ／Ｌ、約１２．０ｇ／Ｌ〜約１３．０ｇ／Ｌ、約１３．０ｇ／Ｌ〜約１４．０ｇ／Ｌまたは約１４．０ｇ／Ｌ〜約１５．０ｇ／Ｌ）のマイクロキャリアを含んでいてよい。

一部の実施形態において、複数のマイクロキャリアは平均直径約２０μｍ〜約１ｍｍの間（例えば、約２０μｍ〜約２５０μｍの間、約１００μｍ〜約２５０μｍの間、約１５０μｍ〜約２５０μｍの間、約２５０μｍ〜約５００μｍの間、約２００μｍ〜約３００μｍの間、約７５０μｍ〜１ｍｍの間、約２００μｍ〜約８００μｍの間、約２００μｍ〜約５００μｍの間または約５００μｍ〜約８００μｍの間）を有していてよく、マイクロキャリアは、許容状態であるか、哺乳動物細胞（例えば、本明細書で記載されるか当技術分野で既知の哺乳動物細胞のいずれか）の付着を促進する表面を有する。一部の例において、マイクロキャリアは、１つまたはそれ以上の孔（例えば、平均直径約１０μｍ〜約１００μｍ（例えば、約１０μｍ〜約２０μｍ、約２０μｍ〜約３０μｍ、約３０μｍ〜約４０μｍ、約５０μｍ〜約６０μｍ、約６０μｍ〜約７０μｍ、約７０μｍ〜約８０μｍ、約８０μｍ〜約９０μｍ、約９０μｍ〜約１００μｍ、約１０μｍ〜約４５μｍ、約４５μｍ〜約８０μｍ、約２５μｍ〜約３５μｍまたは約３０μｍ）の１つまたはそれ以上の孔）を含んでいてよい。一部の実施形態において、複数のマイクロキャリアにおける、複数のマイクロキャリア表面および／または１つもしくはそれ以上の孔表面は、哺乳動物細胞のマイクロキャリアへの付着（例えば、マイクロキャリア外表面および／またはマイクロキャリアの孔表面への付着）を促進する薬剤でコーティングされている。哺乳動物細胞の付着を促進するために使用可能なこのような薬剤の例には、ゼラチン、コラーゲン、ポリ−Ｌ−オルニチン、ポリスチレンおよびラミニンが含まれるが、これに限定されな
い。

一部の例において、マイクロキャリアは、平均有効細胞結合表面積約０．５ｍ^２／ｇ ｄｒｙ〜約２．０ｍ^２／ｇ ｄｒｙの間（例えば、約０．７５ｍ^２／ｇ ｄｒｙ〜１．２５ｍ^２／ｄｒｙの間、約１．０ｍ^２／ｇ ｄｒｙ〜約１．５ｍ^２／ｄｒｙの間、約１．２５ｍ^２／ｄｒｙ〜約１．５ｍ^２／ｄｒｙの間、約１．５ｍ^２／ｄｒｙ〜約２．０ｍ^２／ｄｒｙの間、または約１．１ｍ^２／ｄｒｙ）を有する。一部の例において、マイクロキャリアは、平均体積約１０ｍＬ／ｇ ｄｒｙ〜約７０ｍＬ／ｇ ｄｒｙ（例えば、約１０ｍＬ／ｇ ｄｒｙ〜約２０ｍＬ／ｇ ｄｒｙ、約２０ｍＬ／ｇ ｄｒｙ〜約３０ｍＬ／ｇ ｄｒｙ、約３０ｍＬ／ｇ ｄｒｙ〜約４０ｍＬ／ｇ ｄｒｙ、約４０ｍＬ／ｇ ｄｒｙ〜約５０ｍＬ／ｇ ｄｒｙ、約５０ｍＬ／ｇ ｄｒｙ〜約６０ｍＬ／ｇ ｄｒｙ、約６０ｍＬ／ｇ ｄｒｙ〜約７０ｍＬ／ｇ ｄｒｙ、約１０ｍＬ／ｇ ｄｒｙ〜約４０ｍＬ／ｇ ｄｒｙ、約３０ｍＬ／ｇ ｄｒｙ〜約４０ｍＬ／ｇ ｄｒｙ、約４０ｍＬ／ｇ ｄｒｙ〜約７０ｍＬ／ｇ ｄｒｙ、または約４０ｍＬ／ｇ ｄｒｙ）を有する。一部の実施形態において、マイクロキャリアの平均相対密度は０．８ｇ／ｍＬ〜約１．２ｇ／ｍＬの間（例えば、約０．８ｇ／ｍＬ〜約０．９ｇ／ｍＬ、約０．９ｇ／ｍＬ〜約１．０ｇ／ｍＬ、約１．０ｇ／ｍＬ〜約１．１ｇ／ｍＬ、約１．０ｇ／ｍＬ、約１．１ｇ／ｍＬ〜約１．２ｇ／ｍＬ、約０．９５ｇ／ｍＬ〜約１．０５ｇ／ｍＬ、または約１．０３ｇ／ｍＬ）である。

一部の実施形態において、マイクロキャリアは、ほぼ球状または楕円状である。その他の例においては、マイクロキャリアは、マイクロキャリアの総外表面積を増加させる小さな隆起を有する、擦過したまたは粗い表面を有する。一部の実施形態において、マイクロキャリアはネットワーク構造を有する。一部の例において、マイクロキャリアは吸湿性である。一部の例において、マイクロキャリアはセルロースを含む。

一部の実施形態において、マイクロキャリアは正に荷電した（例えば、Ｎ，Ｎ，−ジエチルアミノエチル基の存在により正に荷電した）外表面を有し、および／またはマイクロキャリア孔は正に荷電した（例えば、Ｎ，Ｎ，−ジエチルアミノエチル基の存在により正に荷電した）表面を有する。一部の例において、マイクロキャリアはネットワークまたは網状またはクモの巣状構造を有する。マイクロキャリアは、平均電荷密度約０．５ｍｅ／ｇ〜約２．５ｍｅ／ｇ（例えば、約０．５ｍｅ／ｇ〜約１．５ｍｅｑ／ｇ、約０．７５ｍｅｑ／ｇ〜約１．２５ｍｅｑ／ｇ、約１．１ｍｅｑ／ｇ、約１．５ｍｅｑ／ｇ〜約２．５ｍｅｑ／ｇ、約１．５ｍｅｑ／ｇ〜約２．０ｍｅｑ／ｇ、約１．８ｍｅｑ／ｇ、約０．５ｍｅｑ／ｇ〜約１．０ｍｅｑ／ｇ、または約１．０ｍｅｑ／ｇ〜約１．５ｍｅｑ／ｇ）を有していてよい。

一部の例において、マイクロキャリアは天然ポリマーおよび／または合成ポリマーを含んでいてよい。合成ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンイミン、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリリン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリグリセリン、ポリアスパルトアミド、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー（ポロクサマー）、カルボン酸（例えば、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸およびマレイン酸）、ポリオキシエチレン、ポリエチレンオキシド、不飽和エチレンモノジカルボン酸、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリプロピレンオキシド、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（イプシロン−カプロラクトン）、ポリ（エチルエチレン）、ポリブタジエン、ポリグリコリド、ポリメチルアクリレート、ポリビニルブチルエーテル、ポリスチレン、ポリシクロペンタジエニルメチルノルボルネン、ポリエチレンプロピレン、ポリエチルエチレン、ポリイソブチレン、ポリシロキサン、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸ｎ−ブチル、アクリル酸イソブチル、アクリル酸２−エチル（２−ｅｔｈｙｌ ａｃｒｙｌａｔｅ）、アクリル酸ｔ−ブチル、メタクリル酸エステル（例えば、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ｎ−ブチル、およびメタクリル酸イソブチル）、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ビニル（例えば、酢酸ビニル、ビニルバーサテート（ｖｉｎｙｌｖｅｒｓａｔａｔｅ）、プロピオン酸ビニル、ビニルホルムアミド、ビニルアセトアミド、ビニルピリジン、およびビニルイミダゾ−ル）、アミノアルキル（例えば、アミノアルキルアクリレート、アミノアルキルメタクリレート、およびアミノアルキル（メタ）アクリルアミド）、スチレン、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、および乳酸が含まれる。天然ポリマーの非限定的な例には、セルロース、レシチンおよびヒアルロン酸が含まれる。マイクロキャリアは、同じまたは異なる比で、異なるポリマーの混合物（例えば、本明細書で記載されるか当技術分野で既知の、１つまたはそれ以上のポリマーの任意の組合せ）を含んでいてよい。本明細書で記載されるマイクロキャリアのうちいずれも、１つまたはそれ以上のポリマー（例えば、本明細書で記載されるか当技術分野で既知のポリマーのうちいずれか）を含むコア、および１つまたはそれ以上の異なるポリマー（例えば、本明細書で記載されるか当技術分野で既知のポリマーのうちいずれか）を含む外層を含んでいてよい。

本明細書で記載される方法のうちいずれかにおいて使用可能な、非限定的で例示的なマイクロキャリアには、ＣｙｔｏＰｏｒｅ（商標）１およびＣｙｔｏＰｏｒｅ（商標）２（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙから入手可能）が含まれる。本明細書で記載される方法のうちいずれかにおいて使用可能なマイクロキャリアのさらなる例が、公的に入手可能であり当技術分野で既知である。

マルチウェルプレート
様々なマルチプレートが当技術分野で既知であり、本明細書で記載される方法のうちいずれかにおいて使用可能である。例えば、マルチウェルプレートは、２ウェルプレート、４ウェルプレート、６ウェルプレート、８ウェルプレート、９ウェルプレート、１０ウェルプレート、１２ウェルプレート、１５ウェルプレート、１８ウェルプレート、２０ウェルプレート、２４ウェルプレート、３６ウェルプレート、４８ウェルプレート、６０ウェルプレート、７２ウェルプレートまたは９６ウェルプレートであってよい。一部の例において、ウェルは、体積（内部体積）約０．３ｍＬ〜約２５ｍＬの間（例えば、約０．３ｍＬ〜約２４ｍＬの間、約０．３ｍＬ〜約２２ｍＬの間、約０．３ｍＬ〜約２０ｍＬの間、約０．３ｍＬ〜約１８ｍＬの間、約０．３ｍＬ〜約１６ｍＬの間、約０．３ｍＬ〜約１４ｍＬの間、約０．３ｍＬ〜約１２ｍＬの間、約０．３ｍＬ〜約１０ｍＬの間、約０．３ｍＬ〜約８ｍＬの間、約０．３ｍＬ〜約６ｍＬの間、約０．３ｍＬ〜約５ｍＬの間、約０．３ｍＬ〜約４ｍＬの間、約０．３ｍＬ〜約３ｍＬの間、約０．３ｍＬ〜約２ｍＬの間、約０．３ｍＬ〜約１ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約２５ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約２４ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約２２ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約２０ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約１８ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約１６ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約１４ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約１２ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約１０ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約８ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約６ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約５ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約４ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約３ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約２ｍＬの間、約０．５ｍＬ〜約１ｍＬの間、約１ｍＬ〜約２５ｍＬの間、約１ｍＬ〜約２４ｍＬの間、約１ｍＬ〜約２２ｍＬの間、約１ｍＬ〜約２０ｍＬの間、約１ｍＬ〜約１８ｍＬの間、約１ｍＬ〜約１６ｍＬの間、約１ｍＬ〜約１４ｍＬの間、約１ｍＬ〜約１２ｍＬの間、約１ｍＬ〜約１０ｍＬの間、約１ｍＬ〜約８ｍＬの間、約１ｍＬ〜約７ｍＬの間、約１ｍＬ〜約６ｍＬの間、約１ｍＬ〜約５ｍＬの間、約１ｍＬ〜約４ｍＬの間、約１ｍＬ〜約３．５ｍＬの間、約１ｍＬ〜約３ｍＬの間、約１ｍＬ〜約２．５ｍＬの間、約１ｍＬ〜約２ｍＬの間、約１ｍＬ〜約１．５ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約２５ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約２４ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約２２ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約２０ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約１８ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約１６ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約１４ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約１２ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約１０ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約８ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約６ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約５ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約４ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約３．５ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約３ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約２．５ｍＬの間、約１．５ｍＬ〜約２．０ｍＬの間、約２ｍＬ〜約２５ｍＬの間、約２ｍＬ〜約２４ｍＬの間、約２ｍＬ〜約２２ｍＬの間、約２ｍＬ〜約２０ｍＬの間、約２ｍＬ〜約１８ｍＬの間、約２ｍＬ〜約１６ｍＬの間、約２ｍＬ〜約１４ｍＬの間、約２ｍＬ〜約１２ｍＬの間、約２ｍＬ〜約１０ｍＬの間、約２ｍＬ〜約８ｍＬの間、約２ｍＬ〜約６ｍＬの間、または約２ｍＬ〜約５ｍＬの間）を有する。

一部の例において、マルチウェルプレートは深型ウェルプレートである。例えば、深型ウェルプレートのウェル内部の高さは、１ｃｍ〜約１２ｃｍの間（例えば、約１ｃｍ〜約１１ｃｍの間、約１ｃｍ〜約１０ｃｍの間、約１ｃｍ〜約９ｃｍの間、約１ｃｍ〜約８ｃｍの間、約１ｃｍ〜約７ｃｍの間、約１ｃｍ〜約６ｃｍの間、約１ｃｍ〜約５ｃｍの間、約１ｃｍ〜約４ｃｍの間、約１ｃｍ〜約３ｃｍの間、約１．２ｃｍ〜約１２ｃｍの間、約１．２ｃｍ〜約１１ｃｍの間、約１．２ｃｍ〜約１０ｃｍの間、約１．２ｃｍ〜約９ｃｍの間、約１．２ｃｍ〜約８ｃｍの間、約１．２ｃｍ〜約７ｃｍの間、約１．２ｃｍ〜約６ｃｍの間、約１．２ｃｍ〜約５ｃｍの間、約１．２ｃｍ〜約４ｃｍの間、約１．２ｃｍ〜約３ｃｍの間、約１．５ｃｍ〜約１１ｃｍの間、約１．５ｃｍ〜約１０ｃｍの間、約１．５ｃｍ〜約９ｃｍの間、約１．５ｃｍ〜約８ｃｍの間、約１．５ｃｍ〜約７ｃｍの間、約１．５ｃｍ〜約６ｃｍの間、約１．５ｃｍ〜約５ｃｍの間、約１．５ｃｍ〜約４ｃｍの間、約１．５ｃｍ〜約３ｃｍの間、約２ｃｍ〜約１２ｃｍの間、約２ｃｍ〜約１１ｃｍの間、約２ｃｍ〜約１０ｃｍの間、約２ｃｍ〜約９ｃｍの間、約２ｃｍ〜約８ｃｍの間、約２ｃｍ〜約７ｃｍの間、約２ｃｍ〜約６ｃｍの間、約２ｃｍ〜約５ｃｍの間、約２ｃｍ〜約４ｃｍの間、約２ｃｍ〜約３ｃｍの間、約２．５ｃｍ〜約１２ｃｍの間、約２．５ｃｍ〜約１１ｃｍの間、約２．５ｃｍ〜約１０ｃｍの間、約２．５ｃｍ〜約９ｃｍの間、約２．５ｃｍ〜約８ｃｍの間、約２．５ｃｍ〜約７ｃｍの間、約２．５ｃｍ〜約６ｃｍの間、約２．５ｃｍ〜約５ｃｍの間、約２．５ｃｍ〜約４ｃｍの間、約３ｃｍ〜約１２ｃｍの間、約３ｃｍ〜約１１ｃｍの間、約３ｃｍ〜約１０ｃｍの間、約３ｃｍ〜約９ｃｍの間、約３ｃｍ〜約８ｃｍの間、約３ｃｍ〜約７ｃｍの間、約３ｃｍ〜約６ｃｍの間、約３ｃｍ〜約５ｃｍの間、約４ｃｍ〜約１２ｃｍの間、約４ｃｍ〜約１１ｃｍの間、約４ｃｍ〜約１０ｃｍの間、約４ｃｍ〜約９ｃｍの間、約４ｃｍ〜約８ｃｍの間、約４ｃｍ〜約７ｃｍの間、約４ｃｍ〜約６ｃｍの間、約５ｃｍ〜約１２ｃｍの間、約５ｃｍ〜約１１ｃｍの間、約５ｃｍ〜約１０ｃｍの間、約５ｃｍ〜約９ｃｍの間、約５ｃｍ〜約８ｃｍの間、または約５ｃｍ〜約７ｃｍの間）であってよい。

一部の例において、（例えば、深型ウェルマルチウェルプレートの）ウェルは、平底（角底とも呼ばれる）、丸底（半球底とも呼ばれる）、円錐底またはピラミッド状底を有していてよい。一部の実施形態において、本明細書で記載されるウェルのうちいずれかの直径は、約４．０ｍｍ〜約５０ｍｍの間（例えば、約４．０ｍｍ〜約４５ｍｍの間、約４．０ｍｍ〜約４０ｍｍの間、約４．０ｍｍ〜約３５ｍｍの間、約４．０ｍｍ〜約３０ｍｍの間、約４．０ｍｍ〜約２５ｍｍの間、約４．０ｍｍ〜約２０ｍｍの間、約４．０ｍｍ〜約１５ｍｍの間、約４．０ｍｍ〜約１０ｍｍの間、約６．０ｍｍ〜約５０ｍｍの間、約６．０ｍｍ〜約４５ｍｍの間、約６．０ｍｍ〜約４０ｍｍの間、約６．０ｍｍ〜約３５ｍｍの間、約６．０ｍｍ〜約３０ｍｍの間、約６．０ｍｍ〜約２５ｍｍの間、約６．０ｍｍ〜約２５ｍｍの間、約６．０ｍｍ〜約２０ｍｍの間、約６．０ｍｍ〜約１５ｍｍの間、約６．０ｍｍ〜約１０ｍｍの間、約８ｍｍ〜約５０ｍｍの間、約８ｍｍ〜約４５ｍｍの間、約８ｍｍ〜約４０ｍｍの間、約８ｍｍ〜約３５ｍｍの間、約８ｍｍ〜約３０ｍｍの間、約８ｍｍ〜約２５ｍｍの間、約８ｍｍ〜約２０ｍｍの間、約８ｍｍ〜約１５ｍｍの間、約１０ｍｍ〜約５０ｍｍの間、約１０ｍｍ〜約４５ｍｍの間、約１０ｍｍ〜約４０ｍｍの間、約１０ｍｍ〜約３５ｍｍの間、約１０ｍｍ〜約３０ｍｍの間、約１０ｍｍ〜約２５ｍｍの間、約１０ｍｍ〜約２０ｍｍの間、約１５ｍｍ〜約５０ｍｍの間、約１５ｍｍ〜約４５ｍｍの間、約１５ｍｍ〜約４０ｍｍの間、約１５ｍｍ〜約３５ｍｍの間、約１５ｍｍ〜約３０ｍｍの間、約１５ｍｍ〜約２５ｍｍの間、または約１５ｍｍ〜約２０ｍｍの間）であってよい。

一部の例において、マルチウェルプレートは密封される（例えば、ガス透過性ディスポーザブル膜、またはガス透過性シリコーン層で密封される）。マルチウェルプレートを密封するために使用される材料の非限定的な例が、実施例に記載されている。マルチウェルプレートを密封するために使用されるさらなる材料が、当技術分野で周知である。

ウェルの内部表面は、少なくとも１つのコーティング（例えば、ゼラチン、コラーゲン、ポリ−Ｌ−オルニチン、ポリスチレンおよびラミニンのうち少なくとも１つのコーティング）を有していてよい。マルチウェルプレート（例えば、様々な形状および寸法のウェル）およびウェルの内部表面コーティングのさらなる例が、当技術分野で既知であり本方法において使用可能である。

撹拌
本明細書で記載される方法には、哺乳動物細胞ならびに第１および／または第２の液体培養培地を含む培養物の回転撹拌が必要である。回転撹拌は、（例えば、投てき（軌道）直径約３ｍｍ〜約５０ｍｍの振盪インキュベーターなどのインキュベーター内で）約３００ＲＰＭ〜約６００ＲＰＭ（例えば、約３００ＲＰＭ〜約５８０ＲＰＭ、約３００ＲＰＭ〜約５６０ＲＰＭ、約３００ＲＰＭ〜約５４０ＲＰＭ、約３００ＲＰＭ〜約５２０ＲＰＭ、約３００ＲＰＭ〜約５００ＲＰＭ、約３００ＲＰＭ〜約４８０ＲＰＭ、約３００ＲＰＭ〜約４６０ＲＰＭ、約３００ＲＰＭ〜約４４０ＲＰＭ、約３００ＲＰＭ〜約４２０ＲＰＭ、約３００ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭ、約３００ＲＰＭ〜約３８０ＲＰＭ、約３００ＲＰＭ〜約３６０ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約６００ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約５８０ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約５６０ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約５４０ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約５２０ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約５００ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約４８０ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約４６０ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約４４０ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約４２０ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約３８０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約６００ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約５８０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約５６０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約５４０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約５２０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約５００ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約４８０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約４６０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約４４０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約４２０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約３８０ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約６００ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約５８０ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約５６０ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約５４０ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約５２０ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約５００ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約４８０ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約４６０ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約４４０ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約４２０ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭ、約３６０ＲＰＭ〜約６００ＲＰＭ、約３６０ＲＰＭ〜約５８０ＲＰＭ、約３６０ＲＰＭ〜約５６０ＲＰＭ、約３６０ＲＰＭ〜約５４０ＲＰＭ、約３６０ＲＰＭ〜約５２０ＲＰＭ、約３６０ＲＰＭ〜約５００ＲＰＭ、約３６０ＲＰＭ〜約４８０ＲＰＭ、約３６０ＲＰＭ〜約４６０ＲＰＭ、約３６０ＲＰＭ〜約４４０ＲＰＭ、約３６０ＲＰＭ〜約４２０ＲＰＭ、約３８０ＲＰＭ〜約６００ＲＰＭ、約３８０ＲＰＭ〜約５８０ＲＰＭ、約３８０ＲＰＭ〜約５６０ＲＰＭ、約３８０ＲＰＭ〜約５４０ＲＰＭ、約３８０ＲＰＭ〜約５２０ＲＰＭ、約３８０ＲＰＭ〜約５００ＲＰＭ、約３８０ＲＰＭ〜約４８０ＲＰＭ、約３８０ＲＰＭ〜約４６０ＲＰＭ、約３８０ＲＰＭ〜約４４０ＲＰＭ、約４００ＲＰＭ〜約６００ＲＰＭ、約４００ＲＰＭ〜約５８０ＲＰＭ、約４００ＲＰＭ〜約５６０ＲＰＭ、約４００ＲＰＭ〜約５４０ＲＰＭ、約４００ＲＰＭ〜約５２０ＲＰＭ、約４００ＲＰＭ〜約５００ＲＰＭ、約４００ＲＰＭ〜約４８０ＲＰＭ、または約４００ＲＰＭ〜約４６０ＲＰＭ）の回数で行ってよい。

当技術分野において理解される通り、撹拌のレベル（例えば、ＲＰＭ速度）は、ウェルのサイズおよび形状（例えば、ウェルの直径、形状および高さのうち１つまたはそれ以上）、ならびにインキュベートを実施するために使用されるインキュベーターの投てき（軌道）直径次第で変動させてよい。例えば、同等のレベルの流体せん断力および溶存Ｏ_２濃度を達成するためには、より小さい投てき（軌道）直径にはより高レベルの撹拌（例えば、より大きいＲＰＭ速度）が必要となり、より大きい投てき（軌道）直径にはより低レベルの撹拌（例えば、より小さいＲＰＭ速度）が必要となりうる。別の例においては、同等のレベルの流体せん断力および溶存Ｏ_２濃度を達成するためには、より大きい直径を有するウェルにはより小さいＲＰＭ速度が必要となり、より小さい直径を有するウェルにはより大きいＲＰＭ速度が必要となりうる。

一部の実施形態において、投てき（軌道）直径が約３ｍｍ〜約５０ｍｍの間（例えば、約３ｍｍ〜約２５ｍｍの間または約２５ｍｍ〜約５０ｍｍの間）、および撹拌が約３２０ＲＰＭ〜約５００ＲＰＭの間（例えば、約３２０ＲＰＭ〜約４８０ＲＰＭの間、約３２０ＲＰＭ〜約４６０ＲＰＭの間、約３２０ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭの間、約３２０ＲＰＭ〜約３８０ＲＰＭの間、約３２０ＲＰＭ〜約３６０ＲＰＭの間、約３２０ＲＰＭ〜約３５０ＲＰＭの間、約３２０ＲＰＭ〜約３４０ＲＰＭの間、約３３０ＲＰＭ〜約５００ＲＰＭの間、約３３０ＲＰＭ〜約４８０ＲＰＭの間、約３３０ＲＰＭ〜約４６０ＲＰＭの間、約３３０ＲＰＭ〜約４４０ＲＰＭの間、約３３０ＲＰＭ〜約４２０ＲＰＭの間、約３３０ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭの間、約３３０ＲＰＭ〜約３８０ＲＰＭの間、約３３０ＲＰＭ〜約３７０ＲＰＭの間、約３３０ＲＰＭ〜約３６０ＲＰＭの間、約３３０ＲＰＭ〜約３５０ＲＰＭの間、約３４０ＲＰＭ〜約５００ＲＰＭの間、約３４０ＲＰＭ〜約４８０ＲＰＭの間、約３４０ＲＰＭ〜約４６０ＲＰＭの間、約３４０ＲＰＭ〜約４４０ＲＰＭの間、約３４０ＲＰＭ〜約４２０ＲＰＭの間、約３４０ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭの間、約３４０ＲＰＭ〜約３８０ＲＰＭの間、約３４０ＲＰＭ〜約３７０ＲＰＭの間、約３４０ＲＰＭ〜約３６０ＲＰＭの間、約３５０ＲＰＭ〜約５００ＲＰＭの間、約３５０ＲＰＭ〜約４８０ＲＰＭの間、約３５０ＲＰＭ〜約４６０ＲＰＭの間、約３５０ＲＰＭ〜約４４０ＲＰＭの間、約３５０ＲＰＭ〜約４２０ＲＰＭの間、約３５０ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭの間、約３５０ＲＰＭ〜約３９０ＲＰＭの間、約３５０ＲＰＭ〜約３８０ＲＰＭの間、約３５０ＲＰＭ〜約３７０ＲＰＭの間、約３６０ＲＰＭ〜約５００ＲＰＭの間、約３６０ＲＰＭ〜約４８０ＲＰＭの間、約３６０ＲＰＭ〜約４６０ＲＰＭの間、約３６０ＲＰＭ〜約４４０ＲＰＭの間、約３６０ＲＰＭ〜約４２０ＲＰＭの間、約３６０ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭの間、約３６０ＲＰＭ〜約３８０ＲＰＭの間、または約４００ＲＰＭ〜約５００ＲＰＭの間）の振盪チューブインキュベーターを使用して、インキュベートが実施される。回転撹拌は、例えば、回転円形振盪または回転楕円形振盪を使用して実施することができる。撹拌は連続的または定期的に実施することができる。

マルチウェルプレートの回転撹拌により、温度約３１℃〜約４０℃でインキュベートされ、約３２０ＲＰＭ〜約４５０ＲＰＭ（例えば、約３２０ＲＰＭ〜約４４０ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約４３０ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約４２０ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約４１０ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約３９０ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約３８０ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約３７０ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約３６０ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約３５０ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約３４０ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約３３０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約４５０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約４４０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約４３０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約４２０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約４１０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約３９０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約３８０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約３７０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約３６０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約３５０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約３４０ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約４５０ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約４４０ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約４３０ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約４２０ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約４１０ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約３９０ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約３８０ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約３７０ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約３６０ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約３５０ＲＰＭ、約３５０ＲＰＭ〜約４５０ＲＰＭ、約３５０ＲＰＭ〜約４４０ＲＰＭ、約３５０ＲＰＭ〜約４３０ＲＰＭ、約３５０ＲＰＭ〜約４２０ＲＰＭ、約３５０ＲＰＭ〜約４１０ＲＰＭ、約３５０ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭ、約３５０ＲＰＭ〜約３９０ＲＰＭ、約３５０ＲＰＭ〜約３８０ＲＰＭ、約３５０ＲＰＭ〜約３７０ＲＰＭ、約３５０ＲＰＭ〜約３６０ＲＰＭ、約３６０ＲＰＭ〜約４５０ＲＰＭ、約３６０ＲＰＭ〜約４４０ＲＰＭ、約３６０ＲＰＭ〜約４３０ＲＰＭ、約３６０ＲＰＭ〜約４２０ＲＰＭ、約３６０ＲＰＭ〜約４１０ＲＰＭ、約３６０ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭ、約３６０ＲＰＭ〜約３９０ＲＰＭ、約３６０ＲＰＭ〜約３８０ＲＰＭ、約３６０ＲＰＭ〜約３７０ＲＰＭ、約３７０ＲＰＭ〜約４５０ＲＰＭ、約３７０ＲＰＭ〜約４３０ＲＰＭ、約３７０ＲＰＭ〜約４１０ＲＰＭ、約３７０ＲＰＭ〜約３９０ＲＰＭ、約３９０ＲＰＭ〜約４５０ＲＰＭ、約３９０ＲＰＭ〜約４３０ＲＰＭ、約３９０ＲＰＭ〜約４１０ＲＰＭ、約４１０ＲＰＭ〜約４５０ＲＰＭ、約４１０ＲＰＭ〜約４３０ＲＰＭ、または約４３０ＲＰＭ〜約４５０ＲＰＭ）の回数で撹拌される、ウェル体積の約１０％〜約４０％（例えば、約１０％〜約３５％、約１０％〜約３０％、約１０％〜約２５％、約１０％〜約２０％、約１０％〜約１５％、約１５％〜約４０％の間、約１５％〜約３５％、約１５％〜約３０％、約１５％〜約２５％、約１５％〜約２０％、約２０％〜約４０％、約２０％〜約３５％、約２０％〜約３０％、約２０％〜約２５％、約２５％〜約４０％、約２５％〜約３５％、約２５％〜約３０％、約３０％〜約４０％、約３０％〜約３５％、または約３５％〜約４０％の間）を占める液体培養培地を含む、直径約６．０ｍｍ〜約３５ｍｍの間（例えば、約６．０ｍｍ〜約３０ｍｍの間、約６．０ｍｍ〜約２５ｍｍの間、約６．０ｍｍ〜約２０ｍｍの間、約６．０ｍｍ〜約１５ｍｍの間、約１０ｍｍ〜約３５ｍｍの間、約１０ｍｍ〜約３０ｍｍの間、約１０ｍｍ〜約２５ｍｍの間、約１０ｍｍ〜約２０ｍｍの間、約１５ｍｍ〜約３５ｍｍの間、約１５ｍｍ〜約３０ｍｍの間、約１５ｍｍ〜約２５ｍｍの間、約２０ｍｍ〜約３５ｍｍの間、約２０ｍｍ〜約３０ｍｍの間、または約２５ｍｍ〜約３５ｍｍの間）、および高さ約４０ｍｍ〜約５０ｍｍの間（例えば、約４０ｍｍ〜約４５ｍｍの間または約４５ｍｍ〜約５０ｍｍの間）を有する角底ウェルにおいて達成されるものと本質的に同じ流体せん断力および溶存酸素（Ｏ_２）濃度が生じうる。

哺乳動物細胞および液体培養培地（例えば、第１および／または第２の液体培養培地）を含む１つまたはそれ以上のマルチウェルプレートを撹拌する機械式デバイスを備えた、加湿雰囲気制御インキュベーターを使用して（例えば、湿度２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％超、または湿度１００％で）回転撹拌を実施することができる。

温度
本明細書で記載される培養方法は、温度約３１℃〜約４０℃で実施することができる。例えば、時間または日ベースで、培養方法における特定の時点で温度を変化させてよいことを、当業者は理解するであろう。例えば、哺乳動物細胞によるウェルへの最初の播種後約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日または約２０日以上で、温度を変化または移行（例えば、上昇または下降）させてよい。例えば、温度を上方へ（例えば、最大もしくは約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または最大もしくは約２０℃の変化）移行させてよい。例えば、温度を下方へ（例えば、最大もしくは約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または最大もしくは約２０℃の変化）移行させてよい。

培養培地除去および交換
本明細書で記載される方法は、第１の体積の第１の液体培養培地（例えば、任意の濃度の哺乳動物細胞を含む、例えば、細胞を実質的に含まない第１の体積の第１の液体培養培地）をウェルから除去すること、および第１の液体培養培地に第２の体積の第２の液体培養培地を添加することを含む。除去および添加は同時にまたは連続的に、または２つを組み合わせて実施してよい。さらに、除去および添加を連続的に（例えば、任意の所与の期間（例えば、２４時間期間、約１時間〜約２４時間の増分期間、または２４時間超の増分期間）、ウェル体積または第１の液体培養培地体積の０．１％〜７００％の間（例えば、１％〜６００％の間、１％〜５００％の間、１％〜４００％の間、１％〜３５０％の間、１％〜３００％の間、１％〜２５０％の間、１％〜１００％の間、１００％〜２００％の間、５％〜１５０％の間、１０％〜５０％の間、１５％〜４０％の間、８％〜８０％の間、または４％〜３０％の間）の体積を除去および交換する比率で）、または定期的に（例えば、３日に１度、１日おきに１度、１日に１度、１日に２度、１日に３度、１日に４度または１日に５度）、またはそれらを任意で組み合わせて実施してよい。定期的に実施される場合、（例えば、約２４時間期間内、約１時間〜約２４時間の増分期間内、または２４時間超の増分期間内で）除去または交換される体積は、例えば、ウェル体積または第１の液体培養培地体積の０．１％〜７００％の間（例えば、１％〜７００％の間、１％〜６００％の間、１％〜５００％の間、１％〜４００％の間、１％〜３００％の間、１％〜２００％の間、１％〜１００％の間、１００％〜２００％の間、５％〜１５０％の間、１０％〜５０％の間、１５％〜４０％の間、８％〜８０％の間、または４％〜３０％の間）であってよい。除去される第１の液体培養培地の第１の体積および添加される第２の液体培養培地の第２の体積は、一部の例において、培養期間の全体または一部の間、各２４時間期間（あるいは、約１時間〜約２４時間の増分期間、または２４時間超の増分期間）中ほぼ同じに維持してよい。当技術分野で既知である通り、第１の体積の第１の液体培養培地が除去される比率（体積／単位時間）、および第２の体積の第２の液体培養培地が添加される比率（体積／単位時間）は変動させてよい。第１の体積の第１の液体培養培地が除去される比率（体積／単位時間）、および第２の体積の第２の液体培養培地が添加される比率（体積／単位時間）は、ほぼ同じでもよく異なっていてもよい。

あるいは、除去および添加される体積を、培養期間の間、各２４時間期間（あるいは、１時間〜約２４時間の間の増分期間、または２４時間超の増分期間）中に変化（例えば、漸増）させてよい。体積の漸増を含む方法の非限定的な例が本明細書で記載される。例えば、培養期間の間、各２４時間期間（あるいは、約１時間〜２４時間超の間の増分期間、または２４時間超の増分期間）内で除去される第１の液体培養培地の体積および添加される第２の液体培養培地の体積は、培養期間の間、ウェル体積または第１の液体培養培地体積の０．５％〜約３０％の間の体積から、ウェル体積または第１の液体培養培地体積の約３０％〜約２００％へ（例えば徐々にまたは時差的増加により）増加させてよい。

本明細書で記載される方法のうちいずれかについての一部の実施形態において、マルチウェルプレートは７日超の期間インキュベートされ、各２４時間期間中のインキュベーション１〜３日目には、除去される第１の液体培養培地の第１の体積および添加される第２の液体培養培地の第２の体積は、第１の液体培養培地の体積の約３０％〜約５０％の間であり；インキュベーション４〜６日目には、除去される第１の液体培養培地の第１の体積および添加される第２の液体培養培地の第２の体積は、第１の液体培養培地の体積の約３０％〜約５０％の間であり；各２４時間期間中のインキュベーション７日目以降には、除去される第１の液体培養培地の第１の体積および添加される第２の液体培養培地の第２の体積は、第１の液体培養培地の体積の約９０％〜約１５０％である。

その他の例においては、各２４時間期間における、期間の最初の約２４〜４８時間後、除去される第１の液体培養培地の第１の体積および添加される第２の液体培養培地の第２の体積は、第１の液体培養培地の体積の約３０％〜約３００％（例えば、約３０％〜約２８０％、約３０％〜約２６０％、約３０％〜約２４０％、約３０％〜約２２０％、約３０％〜約２００％、約３０％〜約１８０％、約３０％〜約１６０％、約３０％〜約１５０％、約３０％〜約１４０％、約３０％〜約１２０％、約３０％〜約１００％、約３０％〜約８０％、約３０％〜約６０％、約３０％〜約５０％、約４０％〜約３００％、約４０％〜約２８０％、約４０％〜約２６０％、約４０％〜約２４０％、約４０％〜約２２０％、約４０％〜約２００％、約４０％〜約１８０％、約４０％〜約１６０％、約４０％〜約１４０％、約４０％〜約１２０％、約４０％〜約１００％、約４０％〜約８０％、約４０％〜約６０％、約５０％〜約３００％、約５０％〜約２８０％、約５０％〜約２６０％、約５０％〜約２４０％、約５０％〜約２２０％、約５０％〜約２００％、約５０％〜約１８０％、約５０％〜約１６０％、約５０％〜約１４０％、約５０％〜約１２０％、約５０％〜約１００％、または約５０％〜約８０％）である。

第１の液体培養培地および第２の液体培養培地が同じ種類の培地であってよいことを、当業者は理解するであろう。その他の例においては、第１の液体培養培地および第２の液体培養培地は異なっていてよい。

第１の体積の第１の液体培養培地を、例えば、マルチウェルプレートを遠心処理（例えば、低速スイングバケット遠心処理）し、細胞を実質的に含まない第１の体積の第１の液体培養培地を上清から除去することで除去してもよい。あるいはまたはさらに、第１の体積の第１の液体培養培地を、哺乳動物細胞を除外する分子量カットオフの滅菌膜を通して、第１の体積の第１の液体培養培地の浸出または重力流により除去してもよい。あるいはまたはさらに、第１の液体培養培地を、第１の体積の第１の液体培養培地を除去する前に、少なくとも３０秒（例えば、少なくとも１分、少なくとも２分、少なくとも３分、少なくとも４分または少なくとも５分）の期間、撹拌を停止して除去してもよい。第１の体積の第１の液体培養培地は、手作業で（例えば、ウェルから第１の体積の第１の液体培養培地を吸引またはピペットで）、または自動式に（例えば、自動デバイス、または本明細書で記載されるマルチウェル細胞培養プレートシステムのうちいずれかを使用して）除去することができる。

第２の体積の第２の液体培養培地は、例えば、灌流ポンプで第１の液体培養培地に添加することができる。第２の液体培養培地は、手作業で（例えば、第２の体積の第２の液体培養培地を直接第１の液体培養培地にピペッティングすることで）または自動式に（例えば、自動デバイス、または本明細書で記載されるマルチウェル細胞培養プレートシステムのうちいずれかを使用して）第１の液体培養培地に添加することができる。

一部の例において、本明細書で提供されるマルチウェル細胞培養プレートシステムのうちいずれかを使用して、第１の体積の第１の液体培養培地を除去し、第２の体積の第２の液体培養培地を第１の液体培養培地に添加することができる。

一部の例において、第１の体積の第１の液体培養培地（例えば、哺乳動物細胞を実質的に含まない第１の体積の第１の液体培養培地）を除去すること、および第１の液体培養培地に第２の体積の第２の液体培養培地を添加することは、哺乳動物細胞によるウェルへの播種から少なくとも１時間以内（例えば、２時間以内、３時間以内、４時間以内、５時間以内、６時間以内、７時間以内、８時間以内、９時間以内、１０時間以内、１２時間以内、１４時間以内、１６時間以内、１８時間以内、２４時間以内、３６時間以内、４８時間以内、７２時間以内、９６時間以内または９６時間後）には行われない。

一部の実施形態は、蒸発に起因する第１の液体培養培地の体積の減少を相殺するためにさらなる体積の第２の液体培養培地を複数のウェルの各々に定期的に添加することをさらに含む。例えば、このようなさらなる体積の第２の液体培養培地を、例えば、少なくとも２４時間に１回、少なくとも４８時間に１回、少なくとも７２時間に１回または少なくとも９６時間に１回、各ウェルに添加することができる。このさらなる体積の第２の液体培養培地は、手作業でまたは自動式に（例えば、自動デバイスを使用するか、または本明細書で記載されるマルチウェル細胞培養プレートシステムのうちいずれかを使用して）添加することができる。

ＣＯ_２
本明細書で記載される方法は、最大または約１５％ＣＯ_２（例えば、最大もしくは約１４％ＣＯ_２、１２％ＣＯ_２、１０％ＣＯ_２、８％ＣＯ_２、６％ＣＯ_２、５％ＣＯ_２、４％ＣＯ_２、３％ＣＯ_２、２％ＣＯ_２、または最大もしくは約１％ＣＯ_２）を含む雰囲気下でマルチウェルプレートをインキュベートすることをさらに含んでいてよい。さらに、本明細書で記載される方法のうちいずれかは、加湿雰囲気（例えば、湿度少なくとももしくは約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８５％、８０％、８５％、９０％、または湿度少なくとももしくは約９５％、または湿度約１００％）下でマルチウェルプレートをインキュベートすることを含んでいてよい。

例示的なデバイス
本明細書で記載される培養方法を実施するために使用可能なデバイスの非限定的な例には：Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ （Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ）が販売するＩＮＦＯＲＳ Ｍｕｌｔｉｒｏｎ振盪インキュベーター（ＩＮＦＯＲＳ；Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびＫｕｈｎｅｒ振盪インキュベーター（Ｋｕｈｎｅｒ ＡＧ；Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）が含まれる。培養方法を実施するために使用可能なデバイスの非限定的な例には、投てき（軌道）直径約３ｍｍ〜約５０ｍｍの間（例えば、約１ｍｍ〜約２５ｍｍの間または約２５ｍｍ〜約５０ｍｍの間）の回転式インキュベーターが含まれる。振盪インキュベーターおよび回転式培養インキュベーターのさらなる例が、当技術分野で既知である。

溶存Ｏ_２および流体せん断力
温度約３１℃〜約４０℃でインキュベートされ、約３２０ＲＰＭ〜約４５０ＲＰＭ（例えば、約３２０ＲＰＭ〜約４４０ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約４３０ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約４２０ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約４１０ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約３９０ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約３８０ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約３７０ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約３６０ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約３５０ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約３４０ＲＰＭ、約３２０ＲＰＭ〜約３３０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約４５０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約４４０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約４３０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約４２０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約４１０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約３９０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約３８０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約３７０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約３６０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約３５０ＲＰＭ、約３３０ＲＰＭ〜約３４０ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約４５０ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約４４０ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約４３０ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約４２０ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約４１０ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約３９０ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約３８０ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約３７０ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約３６０ＲＰＭ、約３４０ＲＰＭ〜約３５０ＲＰＭ、約３５０ＲＰＭ〜約４５０ＲＰＭ、約３５０ＲＰＭ〜約４４０ＲＰＭ、約３５０ＲＰＭ〜約４３０ＲＰＭ、約３５０ＲＰＭ〜約４２０ＲＰＭ、約３５０ＲＰＭ〜約４１０ＲＰＭ、約３５０ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭ、約３５０ＲＰＭ〜約３９０ＲＰＭ、約３５０ＲＰＭ〜約３８０ＲＰＭ、約３５０ＲＰＭ〜約３７０ＲＰＭ、約３５０ＲＰＭ〜約３６０ＲＰＭ、約３６０ＲＰＭ〜約４５０ＲＰＭ、約３６０ＲＰＭ〜約４４０ＲＰＭ、約３６０ＲＰＭ〜約４３０ＲＰＭ、約３６０ＲＰＭ〜約４２０ＲＰＭ、約３６０ＲＰＭ〜約４１０ＲＰＭ、約３６０ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭ、約３６０ＲＰＭ〜約３９０ＲＰＭ、約３６０ＲＰＭ〜約３８０ＲＰＭ、約３６０ＲＰＭ〜約３７０ＲＰＭ、約３７０ＲＰＭ〜約４５０ＲＰＭ、約３７０ＲＰＭ〜約４３０ＲＰＭ、約３７０ＲＰＭ〜約４１０ＲＰＭ、約３７０ＲＰＭ〜約３９０ＲＰＭ、約３９０ＲＰＭ〜約４５０ＲＰＭ、約３９０ＲＰＭ〜約４３０ＲＰＭ、約３９０ＲＰＭ〜約４１０ＲＰＭ、約４１０ＲＰＭ〜約４５０ＲＰＭ、約４１０ＲＰＭ〜約４３０ＲＰＭ、または約４３０ＲＰＭ〜約４５０ＲＰＭ）の回数で撹拌される、直径約６．０ｍｍ〜約３５ｍｍの間（例えば、約６．０ｍｍ〜約３０ｍｍの間、約６．０ｍｍ〜約２５ｍｍの間、約６．０ｍｍ〜約２０ｍｍの間、約６．０ｍｍ〜約１５ｍｍの間、約１０ｍｍ〜約３５ｍｍの間、約１０ｍｍ〜約３０ｍｍの間、約１０ｍｍ〜約２５ｍｍの間、約１０ｍｍ〜約２０ｍｍの間、約１５ｍｍ〜約３５ｍｍの間、約１５ｍｍ〜約３０ｍｍの間、約１５ｍｍ〜約２５ｍｍの間、約２０ｍｍ〜約３５ｍｍの間、約２０ｍｍ〜約３０ｍｍの間、または約２５ｍｍ〜約３５ｍｍの間）および高さ約４０ｍｍ〜約５０ｍｍの間（例えば、約４０ｍｍ〜約４５ｍｍの間または約４５ｍｍ〜約５０ｍｍの間）を有する角底ウェルの体積の約１０％〜約４０％（例えば、約１０％〜約３５％、約１０％〜約３０％、約１０％〜約２５％、約１０％〜約２０％、約１０％〜約１５％、約１５％〜約４０％の間、約１５％〜約３５％、約１５％〜約３０％、約１５％〜約２５％、約１５％〜約２０％、約２０％〜約４０％、約２０％〜約３５％、約２０％〜約３０％、約２０％〜約２５％、約２５％〜約４０％、約２５％〜約３５％、約２５％〜約３０％、約３０％〜約４０％、約３０％〜約３５％、または約３５％〜約４０％の間）を占める培地において達成されるものと同じ（または本質的に同じ）流体せん断力および溶存酸素（Ｏ_２）濃度を培地中に発生させる条件下で、マルチウェルプレートのウェル内に配置された液体培養培地中に浮遊している哺乳動物細胞を、勾配灌流プロセスで培養することを含む培養方法も提供される。

当技術分野で既知である通り、一定の溶存Ｏ_２濃度および一定の流体せん断力を達成するように、様々な細胞培養パラメータを調節することができる。調節可能なこのようなパラメータの非限定的な例には：ウェル体積、液体培養培地の体積、ウェルの形状（例えば、直径、高さ、およびウェル底部の形状のうち１つまたはそれ以上）、撹拌の種類（例えば、回転円形撹拌および／または回転楕円形撹拌）、撹拌の回数、液体培養培地の種類、ウェルの内部コーティングおよび液体培養培地の温度が含まれる。このような培養パラメータのさらなる例が、当技術分野で既知である。温度約３１℃〜約４０℃でインキュベートされ、約３２０ＲＰＭ〜約４５０ＲＰＭ（例えば、約３２０ＲＰＭ〜約３６０ＲＰＭ）の回数で撹拌される、直径約６．０ｍｍ〜約３５ｍｍの間、および高さ約４０ｍｍ〜約５０ｍｍの間を有する角底ウェルの体積の約１０％〜約４０％（例えば、約１５％〜約２５％）を占める培地において達成されるものと同じ（または本質的に同じ）流体せん断力および溶存酸素（Ｏ_２）濃度を培養培地中で達成するように、本明細書で記載されるか当技術分野で既知の培養パラメータの任意の組合せを、任意の様式で組み合わせることができる。

液体培養培地中の溶存Ｏ_２レベルを、様々な異なる方法を使用して検出することができる。例えば、溶存Ｏ_２電極またはプローブ（例えば、Ｅｕｔｅｃｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＷＤ−３５２０１−８０ Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ Ｏｘｙｇｅｎ Ｐｒｏｂｅ、Ｒｏｓｅｍｏｕｎｔ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ４９９ Ｓｅｒｉｅｓ Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ Ｏｘｙｇｅｎ／Ｏｚｏｎｅ Ｓｅｎｓｏｒ、およびＥｘｔｅｃｈ ＤＯ７０５ Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ Ｏｘｙｇｅｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅから入手可能なＯ_２プローブおよび電極）を使用して溶存Ｏ_２を測定することができる。Ｏ_２プローブおよび電極の較正および使用方法は、製造業者の説明書を使用して実施することができる。

液体培養培地の流体せん断力は、当技術分野で既知の方法を使用して算出することができる。液体培養培地の流体せん断力算出について記載している適切な教科書の非限定的な例が、Ｆｌｕｉｄ Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ、Ｒｏｂｅｒｔ Ａ．Ｇｒａｎｇｅｒ、１９９５、Ｄｏｖｅｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｅｏｌａ、ＮＹ、およびＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｆｌｕｉｄ Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ、Ｂｒｕｃｅ Ｒ．Ｍｕｎｓｏｎら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、２００９に記載されている。

組換えタンパク質を生産する方法
本明細書で記載される方法を使用して、組換えタンパク質を生産することができる細胞を培養することを含む、組換えタンパク質を生産する方法も本明細書で提供される。この方法の実施に従って、組換えタンパク質を哺乳動物細胞および／または第１もしくは第２の培養培地から回収することができる。一部の実施形態において、組換えタンパク質は、培養方法の間の任意の所与の時点で第１および／または第２の液体培養培地から回収される（例えば、培養０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００日目、または培養１００日超後のうち１日またはそれ以上に、第１および／または第２の液体培養培地から回収される）。これらの方法についての一部の実施形態は、第３の培養培地の体積または第４の液体培養培地の体積を添加することをさらに含むが、各例において、ウェル中の液体培養培地の総体積は、第１の液体培養培地体積とほぼ等しいかそれ未満となるべきである。

様々な培養パラメータ（例えば、本明細書で記載される、マルチウェルプレート、ウェル、体積、培養物体積を交換する速度または回数、撹拌回数、温度、培地およびＣＯ_２濃度）のいずれかを任意の組合せで使用してこれらの方法を行うことができることを、当業者は理解するであろう。さらに、組換えタンパク質を生産するために、本明細書で記載されるか当技術分野で既知の哺乳動物細胞のうちいずれかを使用することができる。

組換えタンパク質をコードする核酸を、分子生物学および分子遺伝学において既知の多様な方法を使用して、哺乳動物細胞に導入することができる。非限定的な例には、トランスフェクション（例えば、リポフェクション）、形質導入（例えば、レンチウイルス、アデノウイルスまたはレトロウイルス感染）、およびエレクトロポレーションが含まれる。ある例においては、組換えタンパク質をコードする核酸は、哺乳動物細胞の染色体に安定に組み込まれず（一過性トランスフェクション）；その他の例においては、核酸が組み込まれる。あるいはまたはさらに、組換えタンパク質をコードする核酸は、プラスミドおよび／または哺乳動物人工染色体（例えば、ヒト人工染色体）に存在していてよい。あるいはまたはさらに、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、レトロウイルスまたはアデノウイルスベクター）を使用して、核酸を細胞に導入することができる。核酸は、プロモーター配列（例えば、β−アクチンプロモーターおよびＣＭＶプロモーターなどの強力なプロモーター、または誘導性プロモーター）に作動可能に連結させることができる。核酸を含むベクターは、必要に応じて、選択可能なマーカー（例えば、哺乳動物細胞にハイグロマイシン、ピューロマイシンまたはネオマイシン抵抗性を付与する遺伝子）も含む。

ある例において、組換えタンパク質は分泌タンパク質であり、哺乳動物細胞により細胞外の培地（例えば、第１および／または第２の液体培養培地）へ放出される。例えば、可溶性の組換えタンパク質をコードする核酸配列は、組換えタンパク質のＮ−またはＣ−末端に分泌シグナルペプチドをコードする配列を含んでいてよく、このタンパク質が、哺乳動物細胞中に存在する酵素により切断され、次いで、細胞外の培地（例えば、第１および／または第２の液体培養培地）へ放出される。例えば、このような分泌組換えタンパク質は、分泌免疫グロブリン、分泌酵素、分泌成長因子、分泌タンパク質断片または工学操作された分泌タンパク質であってよい。その他の例においては、組換えタンパク質は、分泌されない可溶性タンパク質であり、組換えタンパク質は哺乳動物細胞内から回収される。例えば、分泌されない組換えタンパク質は、免疫グロブリン、酵素、成長因子、タンパク質断片または工学操作されたタンパク質であってよい。

本明細書で提供される方法により生産することができる組換えタンパク質の非限定的な例には、免疫グロブリン（軽鎖および重鎖免疫グロブリンを含む）、抗体または抗体断片（例えば、本明細書で記載される抗体断片のうちいずれか）、酵素（例えば、ガラクトシダーゼ（例えば、アルファ−ガラクトシダーゼ）、マイオザイムまたはセレザイム）、タンパク質（例えば、成長因子、ヒトエリスロポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）またはインターフェロンアルファまたはベータ）、工学操作されたタンパク質、または免疫原性もしくは抗原性タンパク質もしくはタンパク質断片（例えば、ワクチンに使用するタンパク質）が含まれる。一部の実施形態において、組換えタンパク質は、少なくとも１つの多機能組換えタンパク質スキャホールドを含む工学操作された抗原結合ポリペプチド（例えば、Ｇｅｂａｕｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３：２４５〜２５５頁、２００９；および米国特許出願公開第２０１２／０１６４０６６号（その全体を参照によって本明細書に組み入れる）に記載される抗原結合組換えタンパク質を参照のこと）である。抗体である組換えタンパク質の非限定的な例には：パニツムマブ、オマリズマブ、アバゴボマブ、アブシキシマブ、アクトクスマブ（ａｃｔｏｘｕｍａｂ）、アダリムマブ、アデカツムマブ（ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ（ａｌａｃｉｚｕｍａｂ）、アラシズマブ、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルツモマブ（ａｌｔｕｍｏｍａｂ）、アマツキシマブ、アナツモマブ（ａｎａｔｕｍｏｍａｂ）、アポリズマブ、アチヌマブ（ａｔｉｎｕｍａｂ）、トシリズマブ、バシリジマブ（ｂａｓｉｌｉｚｉｍａｂ）、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ビシロマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、デンスマブ（ｄｅｎｓｕｍａｂ）、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ（ｅｆｕｎｇｕｍａｂ）、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、ナタリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、およびトラスツズマブが含まれる。本明細書で記載される方法により生産することができる治療抗体のさらなる例が、当技術分野で既知である。本方法により生産することができる組換えタンパク質のさらなる非限定的な例には：アルグルコシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、アバタセプト、ガルスルファーゼ、ルトロピンアルファ、抗血友病因子、アガルシダーゼベータ、インターフェロンベータ−１ａ、ダルベポエチンアルファ、テネクテプラーゼ、エタネルセプト、凝固因子ＩＸ、卵胞刺激ホルモン、インターフェロンベータ−１ａ、イミグルセラーゼ、ドルナーゼアルファ、エポエチンアルファ、およびアルテプラーゼが含まれる。

分泌された可溶性組換えタンパク質は、哺乳動物細胞から液体培養培地を除去すること、またはそうでなければ物理的に分離することで、液体培養培地（例えば、第１および／または第２の液体培養培地）から回収することができる。例えば、遠心処理、濾過、ピペッティングおよび／または吸引を含む、哺乳動物細胞から液体培養培地を除去する様々な異なる方法が、当技術分野で既知である。次いで、分泌された組換えタンパク質を、各種クロマトグラフィー（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーまたは陰イオン交換クロマトグラフィー）および／または濾過（例えば、分子量カットオフ濾過）を含む様々な生化学技術を使用して、液体培養培地から回収し、さらに精製することができる。

細胞内組換えタンパク質を回収するために、哺乳動物細胞を溶解させることができる。例えば、ソニケーションならびに／または界面活性剤、酵素的および／もしくは化学的溶解を含む、哺乳動物細胞を溶解する多様な方法が当技術分野で既知である。典型的には細胞破片を除去するための遠心処理工程、次いで１つまたはそれ以上のさらなる工程（例えば、１つまたはそれ以上の種類のクロマトグラフィー（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーまたは陰イオン交換クロマトグラフィー）および／または濾過（例えば、分子量カットオフ濾過））で開始される、当技術分野で既知の様々な生化学方法を使用して、組換えタンパク質を哺乳動物細胞ライセートから精製することができる。

一部の実施形態において、回収される組換えタンパク質は、純度少なくとももしくは約５０重量％、例えば、純度少なくとももしくは約５５重量％、純度少なくとも６０重量％、純度少なくとも６５重量％、純度少なくとも７０重量％、純度少なくとも７５重量％、純度少なくとも８０重量％、純度少なくとも８５重量％、純度少なくとも９０重量％、純度少なくとも９５重量％、純度少なくとも９６重量％、純度少なくとも９７重量％、純度少なくとも９８重量％、または純度少なくとももしくは約９９重量％、または純度９９重量％超である。

本発明は、以下の実施例にさらに記載されるが、特許請求の範囲に記載した本発明の範囲を限定するものではない。

例示的な培養方法の有益な特性
小スケールかつハイスループットの灌流培養のモデルを生成し、そのような培養が生産用灌流培養のものと同様の細胞密度を達成することができるか否かを決定するための実験を実施した。

材料および方法
組換えガラクトシダーゼ浮遊細胞培養
組換えガラクトシダーゼを生産する同一のクローン細胞株を、各細胞培養プロセスランで使用した。各細胞培養プロセスランで使用した培養培地を表１に挙げる。

装置および試薬
以下の装置および試薬を、この実施例に記載の細胞培養プロセスランで使用した：Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎシェーカーインキュベーター（Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．）（型式番号ＡＪ１２５）、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（登録商標）Ａｕｔｏ１０００（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＬＬＣ）、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ遠心機（型式番号 Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ−１４Ｒ）、ＴｕｂｅＳｐｉｎ（登録商標）Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ５０（Ｔｅｃｈｎｏ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ＡＧ、トラザーディンゲン、スイス）、９６ウェルＭＡＳＴＥＲＢＬＯＣＫ（登録商標）マイクロプレート２ｍＬ（Ｇｒｉｅｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ、フリッケンハウゼン、ドイツ）、９６ウェルＭＡＳＴＥＲＢＬＯＣＫ（登録商標）マイクロプレート１ｍＬ（Ｇｒｉｅｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ、フリッケンハウゼン、ドイツ）、Ｏｌｙｍｐｕｓ白色光卓上顕微鏡（型式番号ＢＨ−ｓ）、Ｏｌｙｍｐｕｓ白色光卓上顕微鏡（型式番号ＢＸ４０）、Ｏｌｙｍｐｕｓ白色光卓上顕微鏡（型式番号ＢＸ４１）、０．４％トリパンブルー溶液（Ｓｉｇｍａ）、０．２％トリパンブルー溶液（Ｓｉｇｍａ）、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｂｒｉｇｈｔ−Ｌｉｎｅ（登録商標）血球計算盤、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ顕微鏡用カバーガラス、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｎｔｅｒ、ＳＡＳ（登録商標）ＪＭＰ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョンＸ）、Ａｐｐｌｉｋｏｎ ＭｉｃｒｏＦｌａｓｋ微量測定プレートクランピングデバイス（Ａｐｐｌｉｋｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）、ＡｅｒａＳｅａｌ、微穴性ディスポーザブル膜シール（Ｐｈｅｎｉｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｂｉｏｍｅｋ（登録商標）３０００ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ、ＲＡＩＮＩＮ Ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ ３６０° Ｐｉｐｅｔ−Ｌｉｔｅ（商標）ＸＬＳ（商標）Ｐｉｐｅｔｔｏｒ（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ）、Ｅｒｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｐｉｐｅｔｔｏｒ［ＶＷＲ（登録商標）］およびＲｅａｇｅｎｔ Ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ（ＶｉｓｔａＬａｂ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。

方法
撹拌（ＲＰＭ）、ウェル形状、および実施体積の条件を変化させる範囲を試験するために、研究を実施した。３２０ＲＰＭから３６０ＲＰＭの間の撹拌、丸底（１ｍＬの呼び体積）または角底（２ｍＬの呼び体積）のウェル、および１００μＬから６００μＬの間の実施体積の範囲を包含するよう、研究を設計した。細胞培養プロセスランＩを実施して、丸底深型ウェルプレート（１ｍＬの呼び体積）の稼働条件のベースを決定した。細胞培養プロセスランＩＩを実施して、丸底深型ウェルプレートの高密度細胞培養支持能を決定した。細胞培養プロセスランＩＩＩを実施して、設計の最適化に用いるパラメータ範囲を確定すると共に、Ａｐｐｌｉｋｏｎ ＭｉｃｒｏＦｌａｓｋ微量測定プレートクランピングデバイス（Ａｐｐｌｉｋｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、フォスターシティ、カリフォルニア州）を、滅菌済みの微孔性膜シール（ＡｅｒａＳｅａｌ、Ｐｈｅｎｉｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、キャンドラー、ノースカロライナ州）と比較した。モデルの最適化を目的として、細胞培養プロセスランＩＶおよびＶを設計した。

ＪＭＰソフトウェアのカスタム設計ツールを使用して、細胞培養プロセスランＶを設計した。３次の相互作用を考慮し、Ｉの最適形として、２つの連続的な変量（振盪スピードおよび実施体積）ならびに１つの絶対的な応答（ウェル形状）を伴うモデルを設計した。表２に従って（総ベッセル体積のうちの割合として挙げられた実施体積を用いて）、下限および上限を設定した。変量間の任意の非線形関係を説明するために２のべき乗となるよう、設計をカスタマイズした。最後に、実験当たり計１５通りの条件（丸形ウェルを６つおよび角底ウェルを９つ）のランで２連となるように、研究を設計した。

細胞バンクのバイアルを解凍した後、細胞培養プロセスラン１〜５に対し振盪フラスコ中でそれぞれ９、１０、７、０および７継代に拡大した種培養から得た細胞を使用して、全てのベッセルに生細胞５×１０^６個／ｍＬで接種した。５％ＣＯ_２、３７℃、および８０％相対湿度の制御された環境下、振盪インキュベーター中で細胞培養を維持した。対照の振盪チューブの条件を、各実験についてチューブ当たり１０ｍＬの一定の実施体積、４５°の振盪角、および１６０ＲＰＭの撹拌として、ランした。全ての実験について（特段に述べない限り）、蒸発は、表３の通りに相当するものとした。

細胞培養プロセスランＩに用いるために、丸底深型ウェルプレートに生細胞５×１０^５個／ｍＬおよび生細胞１×１０^６個／ｍＬで接種した。接種後１日目の開始で、培養を毎日サンプリングし（１０μＬ）、２日間、手作業の計数（トリパンブルー排除）によって生細胞密度（ＶＣＤ）を決定した。

細胞培養プロセスランＩＩに用いるために、播種後１日目の開始で、培養を毎日サンプリングし（１０μＬ）、１１日間、手作業の計数によってＶＣＤを決定した。細胞の計数後、プレートを〜２３３×ｇで５分間遠心分離し、使用済みの培地を除去した。表４に記載の比率で、培養培地を交換した。

丸底（１ｍＬ）深型ウェルプレートおよび角底（２ｍＬ）深型ウェルプレートを、細胞培養プロセスランＩＩＩおよびＩＶに使用した。接種後１日目に始めて、培養を毎週月曜日、水曜日および金曜日にサンプリングし（２−２−３スケジュール）（１０μＬ）、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（登録商標）Ａｕｔｏ１０００によってＶＣＤを決定した。細胞を計数した後、プレートを〜２３３×ｇで５分間遠心分離して、使用済みの培地を取り出した。表４に記載の比率で培養培地を交換した。

細胞培養プロセスランＶに用いるために、Ｂｉｏｍｅｋ３０００液体操作機を使用した。接種後１日目に始めて、培養を毎週月曜日、水曜日および金曜日にサンプリングし（０．１０×実施体積）、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（登録商標）Ａｕｔｏ１０００によってＶＣＤを決定した。細胞の計数後、プレートを〜２３３×ｇで５分間遠心分離して、取り出した使用済みの培地を直ちに使用するか、または、生産力価を決定するため組換えヒトα−ガラクトシダーゼ（ｒｈα−Ｇａｌ）活性のアッセイを実施するまで、−８０℃で保存した。表５に記載の比率で培養培地を交換し、下記の数式１および２を使用して、ｒｈα−Ｇａｌの体積当たりおよび比生産速度を算出した。さらに、下記の数式３を使用して、累積生細胞密度（ＩＶＣＤ）を算出した。

ＶＰＲ＝力価^＊ＰＲ 数式１

ＰＲ：灌流速度
ＶＰＲ：体積当たり生産速度（Ｕ／Ｌ／ｄ）
力価：ｒｈα−Ｇａｌ活性（Ｕ／Ｌ）
ＳＰＲ：比生産速度（Ｕ／Ｅ９細胞／ｄ）
Ｘｖ：生細胞計測数（Ｅ６細胞／ｍＬ）
ＩＶＣＤ：累積生細胞密度（細胞−ｄ／ｍＬ）
Ｔ：時間（日）

手作業の細胞計数
血球計算盤およびカバースリップを、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）で清掃した。カバースリップの隅をＩＰＡで湿らせ、血球計算器に貼り付けた。細胞試料を、０．４％トリパンブルーと１：１で均一に混合した。１０μＬのアリコートを血球計算盤に移した。大きい方の外側の４つの正方形で細胞を計数した：外側の大きな正方形のそれぞれは、１６個のさらに小さな正方形の格子を含んでいた。大きい方の正方形の境界上にある細胞を、４辺のうち２辺についてのみ計数した。着色していない細胞を生きたものとして計数すると共に、青で染色されたものを死んだものとみなした。下記の数式４および５を使用して、生存率および生細胞密度を算出した。

総細胞：生細胞と死細胞との和

Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒによる細胞の計数
細胞試料を０．２％トリパンブルーと１：１で均一に混合した。２０μＬの混合液のアリコートを、装置専用のスライドに移した。装置に組み入れられたデジタルカメラによって取り込まれた４つのイメージで、細胞を計数した。着色していない細胞を生きたものとして計数すると共に、青で染色されたものを死んだものとみなした。

統計解析
ＪＭＰソフトウェアを使用して、統計解析を実施した。使用した応答は、最大化された望ましさを伴うピーク生細胞密度（ＶＣＤまたはＸ_Ｖ）および体積当たり生産速度（ＶＰＲ）であった。効果スクリーニングレポートを用いて、「Ｆｉｔ Ｍｏｄｅｌ」機能によって統計モデルを評価した。「Ｓｏｒｔｅｄ Ｐａｒａｍｅｔｅｒ Ｅｓｔｉｍａｔｅｓ」によって、ｔ検定により統計的に決定された応答変量を有意にもたらす要素が報告された。最後に、「Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ」によって、応答変量に関するパラメータの効果の独立傾向がプロットされ、そのモデルを使用し、望ましさ関数を最大化することによって、最良の条件が予測された。

結果
細胞培養プロセスランＩ
この実験では、バイアルの解凍後２７日目に、ｒｈα−Ｇａｌ ＣＨＯ細胞株（ＣＤ ＣＨＯ培地中）を使用して、３つの異なる条件下で（表６）ベッセルに接種した。細胞培養増殖のプロファイルを１１日間にわたって追跡した。

ＣＤ ＣＨＯ培地で１１日間維持した培養の生細胞密度のプロファイルを図５に示す。全ての実験培養で成長が観察された。細胞５×１０^５個／ｍＬで播種した細胞について、両方の実施体積（２００μＬおよび３００μＬ）で最小限の成長があり、ＶＣＤは細胞１×１０^６個／ｍＬに達した。このことは、細胞が、丸底深型ウェルプレートにて、低い播種密度で成長することが可能であることを示唆する。細胞１×１０^６個／ｍＬで播種された培養はまた、２日目までに成長を示し、この培養には、成長がさらに良好な０．５ＲＶで、１日に２回再供給された（図６）。１日に２回再供給された培養は、２日目に細胞２×１０^６個／ｍＬ超のＶＣＤに達した：２００μＬで細胞２．７×１０^６個／ｍＬ、３００μＬで細胞２．３×１０^６個／ｍＬであった。およそ１．０ＲＶ／日で再供給された培養は、２日目にＶＣＤがさらに非常に低かったが、これは、使用済みの培地を取り出す間の意図しない細胞の損失に起因する可能性もあった。これらのデータは、２×０．５ＲＶ／日の灌流速度が、灌流速度１．０ＲＶ／日よりも良好な細胞成長を可能にするということを示す。これらのデータは、丸底１ｍＬ９６ウェル深型プレートが、細胞成長を支持することが可能であることを示唆する。実験を通じて、培養物を振盪インキュベーターから直ちに取り出す際に、小さな細胞ペレットを含むことが観察されたが、これは恐らくは不十分な撹拌のためである。この観察は、さらに高い撹拌スピードを丸底１ｍＬ深型ウェルプレートに使用するべきであるということを示唆する。

細胞培養プロセスランＩＩ
丸底（１ｍＬ）９６ウェル深型プレートで細胞を培養するのに使用する灌流速度を最適化するために、一連の実験を実施した。これらの実験では、ＣＤ ＣＨＯ培地中のｒｈα−Ｇａｌ細胞（バイアルの解凍後３０日目）を使用して、丸底９６ウェル深型プレートのウェルおよび振盪チューブに接種した（表７に記載の通り）。細胞培養の実績を、１１日間バッチ再供給プロセスにて評価した。

全ての培養は、８５％超の細胞の生存率を維持した（図７）。ＣＤ ＣＨＯ培地で維持された細胞の１１日間培養の生細胞密度のプロファイルを図８に示す。実験対照（振盪チューブ培養）の細胞の成長が、細胞２５×１０^６個／ｍＬのピーク密度でプラトーとなった９日目までに、全ての培養で成長が観察された。丸底９６ウェル深型プレートでの培養は、実験対照よりも遅い成長速度を示し、細胞８×１０^６個／ｍＬでピークＶＣＤに達した。８日目に、蒸発による損失を考慮して、培地のボーラス（５０μＬ）を丸底９６ウェル深型プレート培養に添加した。

丸底９６ウェル深型プレートについてのこれらのデータは、再供給スケジュールを調整するべきであることを示唆する。修正した再供給スケジュールを図９および表３に示す。

細胞培養プロセスランＩＩＩ
丸底９６ウェル深型プレートで細胞を培養するのに使用する再供給割合を最適化するために、一連の実験を実施した。これらの実験を、１ｍＬ丸底および２ｍＬ角底の両方の９６ウェル深型プレート、ならびに図９に示す修正した再供給割合プロトコールを使用して実施した。バイアルの解凍後８日目に、ＣＤ ＣＨＯ培養培地中のｒｈα−Ｇａｌ細胞を使用して、深型ウェルプレートと振盪チューブの両方のタイプに接種した（表８を参照されたい）。角底９６ウェル深型培養は、３００μＬまたは５００μＬの培養体積を含有し、一方、丸底９６ウェル深型培養は、２００μＬまたは３００μＬの培養体積を含有した（１ｍＬ呼び体積）。Ａｐｐｌｉｋｏｎシステムを使用するか、またはＡｅｒａＳｅａｌ膜を使用するかのどちらかで、ウェルを密封した。９６ウェル深型プレート培養の全てを、３３０ＲＰＭまたは３６０ＲＰのどちらかで撹拌した。細胞培養の成長を９日間にわたって測定した。９６ウェル深型プレート培養についての全ての生細胞の計数を、３連のウェルで計数し、平均した。

１５日間細胞培養の生細胞密度プロファイルを図１０に示す。Ａｐｐｌｉｋｏｎシステムを使用して覆うか、またはディスポーザブル膜シールを使用して覆った角底９６ウェル深型プレート培養では、同様の成長プロファイルが示された（互いの１標準偏差（１ＳＤ）以内に存在した）。９６ウェルプレート方式での最高生細胞密度は、細胞３５×１０^６個／ｍＬの生細胞密度であり、その密度は、角底９６ウェル深型プレートで１５日目に達成された。対照の振盪チューブ培養で達成された最高生細胞密度は、１０日目の細胞２１×１０^６個／ｍＬであった。角底９６ウェル深型プレート培養はまた、１３日目まで、対照の振盪チューブ培養の成長プロファイルによく似ていた。しかし、角底９６ウェル深型プレート培養は、１５日間プロセス全体の間、従来の振盪チューブ対照（ｎ＝１１）に類似した。従来の振盪チューブ対照の培養に最もよく似た２つの角底９６ウェル深型プレート培養では、ディスポーザブル膜カバーを使用し、３３０ＲＰＭで撹拌し、３００μＬまたは５００μＬの培養体積を有した。

この実験における丸底９６ウェル深型プレート培養は、対照振盪チューブ培養に匹敵する成長を示さなかった。丸底９６ウェル深型プレート培養で観察された最高生細胞密度は、１５日目の細胞１４×１０^６個／ｍＬであった。全ての培養が、減衰期に入るまで８５％超の細胞生存率を維持した（図１１）。振盪チューブ対照とは異なり、両方のウェル形状の培養が、１４日を超えて増殖を続け、２０日目に細胞５０×１０^６個／ｍＬ（角底）および細胞１７×１０^６個／ｍＬ（丸底）の生細胞密度に到達した（図１２および１３）。これらのデータは、丸底９６ウェル深型プレートが、高い細胞密度を支持することが可能であるということを示す。

細胞培養プロセスランＩＶ
角底９６ウェル深型プレート（２ｍＬ呼び体積）での細胞成長を最適化するために、追加の一連の実験を実施した。これらの実験では、バイアルの解凍後１日目に、ＣＤ ＣＨＯ培養培地中の細胞を使用して、角底９６ウェル深型プレートおよび振盪チューブに接種した（ｎ＝３）（表９を参照されたい）。これらの実験に使用した培養体積は、３００μＬまたは５００μＬであり、培養物を、３２０ＲＰＭ、３３０ＲＰＭ、または３４０ＲＰＭで撹拌した。培養における細胞成長を１４日間にわたって評価した。培養についての生細胞の計数の全ては、３連のウェルから計数し平均した。

１４日間にわたる角底９６ウェル深型プレート培養の生細胞密度のプロファイルを図１４に示す。全ての試験条件について、７日目まで同様の成長プロファイルが示された。５００μＬの培養体積を有し、かつ３２０ＲＰＭまたは３３０ＲＰＭで撹拌された角底９６ウェル深型プレート培養は、７日後に、さらに良好な細胞成長を示した。試験された全ての培養条件で、１３日目を過ぎても増殖が続き、細胞３０×１０^６個／ｍＬから細胞３５×１０^６個／ｍＬの生細胞密度に到達したが、さらに良好な成長の実績があった２つの培養条件では、細胞４０×１０^６個／ｍＬ超の生細胞密度に到達した。５００μＬの培養体積および３２０ＲＰＭまたは３３０ＲＰＭの撹拌速度を有する角底９６ウェル深型プレート培養で達成された生細胞密度は、１２日目後に、同じ細胞株の振盪チューブでの培養で従来観察された生細胞密度を凌いだ（１標準偏差以内にある）。培養１２日目まで、５００μＬの培養体積および３２０ＲＰＭまたは３３０ＲＰＭの撹拌速度を有する角底９６ウェル深型プレート培養と、振盪チューブ培養とに、同様の成長パターンが観察された。

細胞培養プロセスランＶ
細胞培養の稼働条件を最適化するために、さらに一連の実験を実施した（上記の実験方法の設計の記載を参照されたい）。これらの実験では、バイアルの解凍後２１日目に、ＣＤ ＣＨＯ中の細胞を使用して、角底もしくは丸底のどちらかの９６ウェル深型プレート、または振盪チューブに接種した。各試験培養の稼働条件を表１０に示す。試験した９６ウェル深型プレートのそれぞれを、ＡｅｒａＳｅａｌディスポーザブル膜で覆った。振盪チューブ培養を対照（ｎ＝４）として用立てた：２本の振盪チューブ培養のセットは、対照の再供給スケジュールに従い、別の２本の振盪チューブ培養のセットは、９６ウェル深型プレートで使用される修正した再供給割合に従った（図９に図示した）。全ての条件を２連で試験した。９日間バッチ再供給プロセスにて細胞成長を評価した。

表１０に挙げられたＣＤ ＣＨＯ培地中で維持された細胞の１５日間培養の生細胞密度のプロファイルを、図１５および１６に示す。丸底９６ウェル深型プレート培養は、本願の試験条件下の角底培養と同じような性能を示さなかった（それぞれ図１５および図１６）。丸底９６ウェル深型プレートで到達した最高生細胞密度は、３６０ＲＰＭで撹拌された１００μＬ培養では細胞２０×１０^６個／ｍＬであった。角底９６ウェル深型プレート培養は、細胞４０×１０^６個／ｍＬに近いピーク生細胞密度を有する対照の振盪チューブ培養と比べて、それに匹敵する生細胞密度を有した（１標準偏差以内）（上記に記載の修正した再供給割合を使用した場合）。最も良好な角底９６ウェル深型細胞培養の実績は、４００μＬの培養体積と３２０ＲＰＭまたは３４０ＲＰＭの撹拌を使用して達成され、１５日目におよそ細胞５０×１０^６個／ｍＬのピーク生細胞密度に達した。さらに、６００μＬの培養体積および３４０ＲＰＭの撹拌を有する角底９６ウェル深型によって、１３日目に細胞２７×１０^６個／ｍＬもの細胞成長がもたらされ、また、細胞３１×１０^６個／ｍＬのピーク生細胞密度に到達するという振盪チューブ対照培養（対照の再供給割合）に匹敵する結果が生じた。全ての試験培養で、８５％超の生細胞率が維持された。振盪チューブの対照培養と９６ウェル深型培養との累積生細胞密度の比較を図１７および１８に示す。

ＣＤ ＣＨＯ中で培養した細胞の１５日間培養の体積当たり生産速度のプロファイルを、図１９および２０に示す。生細胞の成長に基づき予想した通り、丸底９６ウェル深型プレートで成長させた培養は、生産性がより少なかった（図１９）。丸底９６ウェル深型プレートにて１００μＬ培養培地中で、かつ３２０ＲＰＭの撹拌で成長させた培養は、１５日目に、最高の体積当たり生産速度の２２，０００ユニット／Ｌ／日が観察された（図１９）。しかし、それ以前の日では、同じ培養体積および撹拌を伴う丸底９６ウェル深型プレート培養は、体積当たり生産速度（＜５０００ユニット／Ｌ／日）が低かった。近似の成長プロファイルを辿った角底９６ウェル深型培養では、体積当たり生産速度の向上が観察された（図２０）。匹敵する活性（１５日までに４００００ユニット／Ｌ／日）は、成長パターンが振盪チューブ培養によく似た培養（６００μＬ体積を有しかつ３４０ＲＰＭで撹拌された角底培養）について観察された。成長に初発の遅れがあったものの結局は対照の振盪チューブ培養と同様のピーク生細胞密度を有した複数の培養（４００μＬの体積および３４０ＲＰＭの撹拌、または４００μＬもしくは６００μＬの体積および３６０ＲＰＭの撹拌を有する角底９６ウェル深型培養）で、同様の体積当たり生産速度を１３日目まで示した（およそ４０，０００ユニット／Ｌ／日の体積当たり生産速度に達した）。１３日後、体積当たり生産速度は低下したが、４００μＬの体積で成長しかつ３６０ＲＰＭで撹拌された培養は例外であり、１５日目までに体積当たり生産速度が６０，０００ユニット／Ｌ／日に達した。最も高い生産性は、４００μＬの体積を有しかつ３２０ＲＰＭで撹拌された角底９６ウェル深型培養で観察され、１５日目で６７，０００ユニット／Ｌ／日の体積当たり生産速度に到達した。

１００μＬの体積で成長しかつ３２０ＲＰＭで撹拌されたか、または３００μＬの体積で成長しかつ３６０ＲＰＭの撹拌された培養を除いて、丸底９６ウェル深型プレート培養の多くの条件が、対照の振盪チューブ培養と比べて、それに匹敵またはそれよりも低い比生産速度（ＳＰＲ）を示した（図２１）。これらの培養によって、１５日目に、比生産速度が増加した。体積当たり生産速度が匹敵またはより高かった５通りの角底９６ウェル深型プレート培養もまた、対照の振盪チューブ培養（１６００ユニット／細胞１×１０^９個／日）と比べて、それに匹敵またはそれよりも高い比生産速度を示した（図２２）。

収集したデータをＪＭＰの実験設計に供して、統計解析に基づき、最も良い稼働条件を予測した。３つの応答：ピーク生細胞密度、ピーク体積当たり生産速度およびピーク比生産速度を使用して、最良の稼働条件を予測した。全ての応答制限を、結果を最大にするように設定した。まず、図２３および２４に示すように、データをモデルにフィットさせた。生細胞密度（図２３）および体積当たり生産速度（図２４）について収集したデータは、モデルによくフィットしている。統計解析（ｔ検定）では、ウェル形状および実施体積が、生細胞密度および生産性の両方に有意に影響を及ぼし、その一方で、振盪スピードが、生産性のみに有意に影響を及ぼすことが明らかになった。

ＪＭＰプロファイラーを使用して、最も良い稼働条件を予測した（図２５）。解析に基づき、４４０μＬの実施体積を用いかつ３６０ＲＰＭで撹拌された角底９６ウェル深型プレートを使用した際に、最も良い細胞の実績が得られるべきである。標準偏差を考慮し、かつ同じ望ましさを維持すると、角底９６ウェル深型プレートについての最良の稼働範囲は、約３５０μＬから約５５０μＬの間の実施体積であり、約３２０ＲＰＭから約３６０ＲＰＭの間の振盪スピードであった。

まとめると、本データは、本願で提供する方法を、より大スケールの灌流バイオリアクター細胞培養のモデルとして使用することができることを示す（例えば、同様の時間枠にわたって同様の細胞密度を達成したことによって）。本願で提供する方法は、組織培養培地（および組織培養培地内の構成成分）のハイスループットスクリーニングに使用することができる。

培養培地をスクリーニングするための深型９６ウェル培養方法の使用
本明細書に記載の深型９６ウェル培養方法を使用して、様々に異なる組織培養を試験するために、さらに別の一連の実験を実施した。これらの実験では、モノクローナル抗体を生産する組換え哺乳動物細胞株（ｍＡｂ生産細胞）または酵素を生産する組換え哺乳動物細胞株（酵素生産細胞）を使用して、角底９６ウェル深型プレートに接種し、５００μＬの１つまたは少なくとも１０２通りの異なる組織培養培地中で、３３０ＲＰＭで撹拌しながら、細胞を１週間培養した。これらの実験の対照は、同じ９６ウェル深型プレート、同じ培養培地、試料細胞株、およびＣＤ ＣＨＯ培地を使用して達成される生細胞密度であった。７日間にわたって、培養の生細胞密度と力価との両方を測定した。

図２６〜２９のデータは、本明細書に記載の深型９６ウェル培養方法によって、異なる組織培養培地が生細胞密度および培養細胞の生産性に及ぼす効果をスクリーニングすることが可能であることを示す。

他の実施形態
本発明が、その詳細な記載と併せて記載されている一方で、前述の記載は、説明を意図するものであって、添付の特許請求の範囲によって規定される、本発明の範囲を限定することを意図しないことが理解されよう。別の態様、利点および修正は、以下の特許請求の範囲内にある。

Claims (76)

1. 哺乳動物細胞を培養する方法であって：
   第１の液体培養培地に配置された哺乳動物細胞を含む少なくとも１つのウェルを含むマルチウェルプレートを用意する工程であって、該第１の液体培養培地は該ウェルの体積の約５％〜約７０％を占める工程と；
   ある期間、約３１℃〜約４０℃で、約３２０回転毎分（ＲＰＭ）〜約５００ＲＰＭの回転撹拌をしながら、該マルチウェルプレートをインキュベートする工程と；
   連続的にまたは定期的に、該期間中に、該第１の体積の第１の液体培養培地を除去し、第２の体積の第２の液体培養培地を該第１の液体培養培地に添加する工程であって、該第１および第２の体積はほぼ等しい工程と
   を含む前記方法。
2. 哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１に記載の方法。
3. ＣＨＯ細胞は、組換えタンパク質をコードする核酸を含有する、請求項２に記載の方法。
4. 組換えタンパク質は、免疫グロブリン、酵素、成長因子、タンパク質断片、または工学操作されたタンパク質である、請求項３に記載の方法。
5. 組換えタンパク質を生産する方法であって：
   第１の液体培養培地に配置された哺乳動物細胞を含む少なくとも１つのウェルを含むマルチウェルプレートを用意する工程であって、該第１の液体培養培地は該ウェルの体積の約５％〜約７０％を占め、該哺乳動物細胞は組換えタンパク質をコードする核酸を含有する工程と；
   ある期間、約３１℃〜約４０℃で、約３２０回転毎分（ＲＰＭ）〜約５００ＲＰＭの回転撹拌をしながら、該マルチウェルプレートをインキュベートする工程と；
   連続的にまたは定期的に、該期間中に、該第１の体積の第１の液体培養培地を除去し、第２の体積の第２の液体培養培地を該第１の液体培養培地に添加する工程であって、該第１および第２の体積はほぼ等しい工程と；
   該組換えタンパク質を該哺乳動物細胞からまたは該第１もしくは第２の培養培地から回収する工程と
   を含む前記方法。
6. 組換えタンパク質は、哺乳動物細胞から回収される、請求項５に記載の方法。
7. 組換えタンパク質は、免疫グロブリン、酵素、成長因子、タンパク質断片、または工学操作されたタンパク質である、請求項６に記載の方法。
8. 組換えタンパク質は、第１または第２の液体培養培地から回収される、請求項５に記載の方法。
9. 組換えタンパク質は、分泌免疫グロブリン、分泌酵素、分泌成長因子、分泌タンパク質断片、または工学操作された分泌タンパク質である、請求項８に記載の方法。
10. 組換えタンパク質を作製する製造プロセスを試験するための方法であって：
    第１の液体培養培地に配置された哺乳動物細胞を含む少なくとも１つのウェルを含むマルチウェルプレートを用意する工程であって、該第１の液体培養培地は該ウェルの体積の約５％〜約７０％を占め、該哺乳動物細胞は組換えタンパク質をコードする核酸を含有する工程と；
    ある期間、約３１℃〜約４０℃で、約３２０回転毎分（ＲＰＭ）〜約５００ＲＰＭの回転撹拌をしながら、該マルチウェルプレートをインキュベートする工程と；
    連続的にまたは定期的に、該期間中に、該第１の体積の第１の液体培養培地を除去し、第２の体積の第２の液体培養培地を該第１の液体培養培地に添加する工程であって、該第１および第２の体積はほぼ等しい工程と；
    該哺乳動物細胞または該第１もしくは第２の液体培養培地中の該組換えタンパク質を検出する工程と；
    該哺乳動物細胞または該第１もしくは第２の液体培養培地中に存在する組換えタンパク質の量を組換えタンパク質の基準レベルと比較する工程と
    を含む前記方法。
11. 組換えタンパク質の基準レベルは、異なる培養方法を使用して生産される組換えタンパク質のレベルである、請求項１０に記載の方法。
12. 異なる培養方法は、異なる第１もしくは第２の液体培養培地、異なる哺乳動物細胞、異なる温度、異なる撹拌レベルまたは異なるマルチウェルプレートを利用する、請求項１１に記載の方法。
13. 異なる培養方法は、異なる原料、異なる凝集防止剤、または既知組成液体培養培地を利用する、請求項１１に記載の方法。
14. 実験計画（ＤＯＥ）またはクォリティー・バイ・デザイン（ＱＢＤ）研究を行うためのハイスループット細胞培養実験を行うために使用される、請求項１０に記載の方法。
15. 組換えタンパク質は、第１または第２の液体培養培地で検出される、請求項１０に記載の方法。
16. 組換えタンパク質は、分泌免疫グロブリン、分泌酵素、分泌成長因子、分泌タンパク質断片、または工学操作された分泌タンパク質である、請求項１５に記載の方法。
17. 組換えタンパク質は、細胞で検出される、請求項１０に記載の方法。
18. 組換えタンパク質は、免疫グロブリン、酵素、成長因子、タンパク質断片、または工学操作されたタンパク質である、請求項１７に記載の方法。
19. 第１の体積の第１の液体培養培地は哺乳動物細胞を実質的に含まない、請求項１、５および１０のいずれか１項に記載の方法。
20. 第１の液体培養培地は、ウェルの体積の約１０％〜約６０％を占める、請求項１、５および１０のいずれか１項に記載の方法。
21. 哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項５または１０に記載の方法。
22. 回転撹拌は、約３２０ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭである、請求項１、５および１０のいずれか１項に記載の方法。
23. 第１の体積の第１の液体培養培地の除去と第２の体積の第２の液体培養培地の添加は同時に行われる、請求項１、５および１０のいずれか１項に記載の方法。
24. 第１の体積の第１の液体培養培地の除去と第２の体積の第２の液体培養培地の添加は連続的に行われる、請求項１、５および１０のいずれか１項に記載の方法。
25. 第１の体積の第１の液体培養培地の除去と第２の体積の第２の液体培養培地の添加は定期的に行われる、請求項１、５および１０のいずれか１項に記載の方法。
26. 除去される第１の液体培養培地の第１の体積および添加される第２の液体培養培地の第２の体積は経時的に増加される、請求項１、５および１０のいずれか１項に記載の方法。
27. マルチウェルプレートは、７日より長い期間インキュベートされ、インキュベーション１〜３日目に、２４時間ごとに、除去される第１の液体培養培地の第１の体積および添加される第２の液体培養培地の第２の体積は、該第１の液体培養培地の体積の約３０％〜約５０％の間であり；
    インキュベーション４〜６日目に、２４時間ごとに、除去される第１の液体培養培地の第１の体積および添加される第２の液体培養培地の第２の体積は、該第１の液体培養培地の体積の約４０％〜約７０％の間であり；
    インキュベーション７日目以降に、２４時間ごとに、除去される第１の液体培養培地の第１の体積および添加される第２の液体培養培地の第２の体積は、該第１の液体培養培地の体積の約９０％〜約１５０％である、
    請求項１、５および１０のいずれか１項に記載の方法。
28. ウェルは、約１ｍＬ〜約１８ｍＬの間の体積を有する、請求項１、５および１０のいずれか１項に記載の方法。
29. ウェルは、約１ｍＬ〜約７ｍＬの間の体積を有する、請求項１、５および１０のいずれか１項に記載の方法。
30. ウェルは、約１ｍＬ〜約３．５ｍＬの間の体積を有する、請求項１、５および１０のいずれか１項に記載の方法。
31. マルチウェルプレートは、６ウェルプレート、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、または９６ウェルプレートである、請求項１、５および１０のいずれか１項に記載の方法。
32. マルチウェルプレートは、深型ウェルプレートである、請求項１、５および１０のいずれか１項に記載の方法。
33. ウェルの底の直径は、約６．０ｍｍ〜約３５ｍｍの間である、請求項１、５および１０のいずれか１項に記載の方法。
34. ウェルの高さは、約１２ｍｍ〜約５０ｍｍである、請求項１、５および１０のいずれか１項に記載の方法。
35. 哺乳動物細胞は、第１の培養培地約１５０μＬ〜約１５ｍＬに浮遊している、請求項１、５および１０のいずれか１項に記載の方法。
36. 哺乳動物細胞は、第１の培養培地約１５０μＬ〜約１０ｍＬに浮遊している、請求項３５に記載の方法。
37. 哺乳動物細胞は、第１の培養培地約１５０μＬ〜約５ｍＬに浮遊している、請求項３６に記載の方法。
38. 哺乳動物細胞は、第１の培養培地約１５０μＬ〜約１ｍＬに浮遊している、請求項３７に記載の方法。
39. 第１の液体培養培地および／または第２の液体培養培地は：既知組成液体培養培地、無血清液体培養培地、血清含有液体培養培地、動物由来成分不含液体培養培地、およびタンパク質不含培地からなる群から選択される、請求項１、５および１０のいずれか１項に記載の方法。
40. 期間の最初の約２４〜４８時間後、２４時間ごとに、除去される第１の液体培養培地の第１の体積および添加される第２の液体培養培地の第２の体積は、該第１の液体培養培地の体積の約３０％〜約１５０％である、請求項１、５および１０のいずれか１項に記載の方法。
41. 撹拌は、第１の体積の第１の液体培養培地を除去する前に少なくとも３０秒の期間、停止される、請求項１、５および１０のいずれか１項に記載の方法。
42. マルチウェルプレートは、ガス透過性ディスポーザブル膜で密封される、請求項１、５および１０のいずれか１項に記載の方法。
43. マルチウェルプレートは、ガス透過性シリコーン層で密封される、請求項１、５および１０のいずれか１項に記載の方法。
44. ウェルは平底を有する、請求項１、５および１０のいずれか１項に記載の方法。
45. ウェルは丸底を有する、請求項１、５および１０のいずれか１項に記載の方法。
46. 蒸発に起因する第１の液体培養培地の体積の減少を相殺するためにさらなる体積の第２の液体培養培地を複数のウェルの各々に定期的に添加する工程をさらに含む、請求項１、５および１０のいずれか１項に記載の方法。
47. 第１の体積の第１の液体培養培地の除去と、第２の体積の第２の液体培養培地の該第１の液体培養培地への添加は、自動デバイスを使用して行われる、請求項１、５および１０のいずれか１項に記載の方法。
48. マルチウェルプレートは、請求項６９に記載のマルチウェル細胞培養プレートシステムである、請求項１、５および１０のいずれか１項に記載の方法。
49. ウェル中、細胞１５ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞６０ｘ１０^６個／ｍＬの間の生細胞密度をもたらす、請求項１、５および１０のいずれか１項に記載の方法。
50. 哺乳動物細胞を培養する方法であって：
    マルチウェルプレートのウェル内に配置された液体培養培地に浮遊している哺乳動物細胞を、該培地において、約６．０ｍｍ〜約３５ｍｍの間の直径および約４０ｍｍ〜約５０ｍｍの間の高さを有する角底ウェルの体積の約１５％〜２５％を占める培地中において、該角底ウェルを約３１℃〜約４０℃の温度でインキュベートし、約３２０回転毎分（ＲＰＭ）〜約３６０ＲＰＭの回数で回転撹拌したときに達成されるものと本質的に同じである流体せん断力および溶存酸素（Ｏ_２）濃度を生じさせる条件下、勾配灌流プロセスで培養する工程
    を含む前記方法。
51. 哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項５０に記載の方法。
52. ＣＨＯ細胞は、組換えタンパク質をコードする核酸を含有する、請求項５１に記載の方法。
53. 組換えタンパク質は、免疫グロブリン、酵素、成長因子、タンパク質断片、または工学操作されたタンパク質である、請求項５２に記載の方法。
54. 組換えタンパク質を生産する方法であって：
    マルチウェルプレートのウェル内に配置された液体培養培地に浮遊している哺乳動物細胞を、該培地において、約６．０ｍｍ〜約３５ｍｍの間の直径および約４０ｍｍ〜約５０ｍｍの間の高さを有する角底ウェルの体積の約１５％〜２５％を占める培地において該角底ウェルを約３１℃〜約４０℃の温度でインキュベートし、約３２０回転毎分（ＲＰＭ）〜約３６０ＲＰＭの回数で回転撹拌したときに達成されるものと本質的に同じである流体せん断力および溶存酸素（Ｏ_２）濃度を生じさせる条件下、勾配灌流プロセスで培養する工程と；
    該組換えタンパク質を該哺乳動物細胞または該液体培養培地から回収する工程と
    を含む前記方法。
55. 組換えタンパク質は、哺乳動物細胞から回収される、請求項５４に記載の方法。
56. 組換えタンパク質は、免疫グロブリン、酵素、成長因子、タンパク質断片、または工学操作されたタンパク質である、請求項５５に記載の方法。
57. 組換えタンパク質は、液体培養培地から回収される、請求項５４に記載の方法。
58. 組換えタンパク質は、分泌免疫グロブリン、分泌酵素、分泌成長因子、分泌タンパク質断片、または工学操作された分泌タンパク質である、請求項５７に記載の方法。
59. 哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項５４に記載の方法。
60. マルチウェルプレートは、選択された６ウェルプレート、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、または９６ウェルプレートである、請求項５０または５４に記載の方法。
61. マルチウェルプレートは、深型ウェルプレートである、請求項５０または５４に記載の方法。
62. 液体培養培地は：既知組成液体培養培地、無血清液体培養培地、血清含有液体培養培地、動物由来成分不含液体培養培地、およびタンパク質不含培地からなる群から選択される、請求項５０または５４に記載の方法。
63. マルチウェルプレートは、ガス透過性ディスポーザブル膜で密封される、請求項５０または５４に記載の方法。
64. マルチウェルプレートは、ガス透過性シリコーン層で密封される、請求項５０または５４に記載の方法。
65. マルチウェルプレートは、平底を有するウェルを含む、請求項５０または５４に記載の方法。
66. マルチウェルプレートは、丸底を有するウェルを含む、請求項５０または５４に記載の方法。
67. マルチウェルプレートは、請求項６９に記載のマルチウェル細胞培養プレートシステムである、請求項５０または５４に記載の方法。
68. 培養は、ウェル中、細胞１５ｘ１０^６個／ｍＬ〜細胞６０ｘ１０^６個／ｍＬの間の生細胞密度をもたらす、請求項５０または５４に記載の方法。
69. マルチウェル細胞培養プレートシステムであって：
    複数の開口部を含む第１の表面を含む一体型支持プレート；
    該支持プレート内に配置されており、体積約２００μＬ〜約１８ｍＬの間の体積を有する細胞培養物を収容するように構成されている、複数の培養ベッセル
    を含み、各開口部は、各培養ベッセルへの開放部と対になっており、該開放部を画成しており、
    各培養ベッセルは、該培養ベッセルの中へのおよび／または該培養ベッセルから外への流体の流れに順応するように構成されている少なくとも１つのポートをさらに含む、前記マルチウェル細胞培養プレートシステム。
70. 一体型支持プレートは、液体の収容およびポートへの供給のためのリザーバーを含むように構成されている、請求項６９に記載のマルチウェル細胞培養プレートシステム。
71. 培養ベッセルは、少なくとも第１および第２のポートを含み、該第１のポートは、該培養ベッセルの中への流体の一方向の流れに順応するように構成されており、該第２のポートは、該培養ベッセルから外への流体の一方向の流れに順応するように構成されている、請求項６９に記載のマルチウェル細胞培養プレートシステム。
72. ポートは、細胞の培養ベッセルへの流入および培養ベッセルからの流出を選択的に防止するように構成されているフィルターを含む、請求項６９に記載のマルチウェル細胞培養プレートシステム。
73. 第１および第２のポート各々は、細胞の培養ベッセルへの流入および培養ベッセルからの流出を選択的に防止するように構成されているフィルターを含む、請求項７１に記載のマルチウェル細胞培養プレートシステム。
74. 一体型支持プレート内に配置されており、ポートと流体連通している、少なくとも１つの導水路をさらに含み、該導水路は、流体を培養ベッセルにおよび／または培養ベッセルから流すように構成されている、請求項６９に記載のマルチウェル細胞培養プレートシステム。
75. 少なくとも１つのポートと作動可能に接続された少なくとも１つの流体流量調整器をさらに含む、請求項６９に記載のマルチウェル細胞培養プレートシステム。
76. 少なくとも１つの導水路と作動可能に接続された少なくとも１つの流体流量調整器をさらに含む、請求項７４に記載のマルチウェル細胞培養プレートシステム。

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