JP7350810B2 - 灌流培養方法およびその使用 - Google Patents
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Description
本出願は、2014年6月6日に出願した米国特許仮出願第62/009,058号の優先権を主張するものであり、その全内容は参照によって本明細書に組み入れる。
される。これらの方法の一部の実施形態では、組換えタンパク質(例えば、免疫グロブリン、酵素、成長因子、タンパク質断片、または工学操作されたタンパク質)は、哺乳動物細胞から回収される。これらの方法の一部の実施形態では、組換えタンパク質(例えば、分泌免疫グロブリン、分泌酵素、分泌成長因子、分泌タンパク質断片、または工学操作された分泌タンパク質)は、第1または第2の液体培養培地から回収される。
~約70%の間であり;ならびにインキュベーション7日目以降に、24時間ごとに、除去される第1の液体培養培地の第1の体積および添加される第2の液体培養培地の第2の体積は、第1の液体培養培地の体積の約90%~約150%である。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ウェルは約1mL~約18mLの間(例えば、約1mL~約7mLの間、または約1mL~約3.5mLの間)の体積を有する。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、マルチウェルプレートは、6ウェルプレート、12ウェルプレート、24ウェルプレート、48ウェルプレート、または96ウェルプレートである。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、マルチウェルプレートは、深型ウェルプレートである。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ウェルの底の直径は、約6.0mm~約35mmの間(例えば、約12mm~約50mm)である。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ウェルの高さは、約12mm~約50mmである。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、第1の培養培地約150μL~約15mL(例えば、約150μL~約10mL、約150μL~約5mL、または約150μL~約150μL)に浮遊している。
れた液体培養培地に浮遊している哺乳動物細胞を、培地において、約6.0mm~約35mmの間の直径および約40mm~約50mmの間の高さを有する角底ウェルの体積の約15%~25%を占める培地において角底ウェルを約31℃~約40℃の温度でインキュベートし、約320回転毎分(RPM)~約360RPMの回数で回転撹拌したときに達成されるものと本質的に同じである流体せん断力および溶存酸素(O2)濃度を生じさせる条件下、勾配灌流プロセスで培養する工程と;組換えタンパク質を哺乳動物細胞または液体培養培地から回収する工程とを含む方法も提供される。これらの方法のいずれかの一部の実施形態では、組換えタンパク質(例えば、免疫グロブリン、酵素、成長因子、タンパク質断片、または工学操作されたタンパク質)は、哺乳動物細胞から回収される。これらの方法のいずれかの一部の実施形態では、組換えタンパク質(例えば、分泌免疫グロブリン、分泌酵素、分泌成長因子、分泌タンパク質断片、または工学操作された分泌タンパク質)は、液体培養培地から回収される。これらの方法の一部の実施形態では、哺乳動物細胞はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である。
なくとも1つの流体流量調整器をさらに含む。本明細書に記載のシステムのいずれかの一部の実施形態は、少なくとも1つの導水路と作動可能に接続された少なくとも1つの流体流量計をさらに含む。
形態では、液体培養培地は、微量金属、哺乳動物成長ホルモン、および/または哺乳動物成長因子を含有することができる。液体培養培地の非限定的な例を本明細書に記載する。液体培養培地のさらなる例は当技術分野において公知であり、市販されている。液体培養培地は、任意の密度の哺乳動物細胞を含有することができる。例えば、本明細書で使用するような、ウェルから除去される第1の体積の第1の培養培地は、哺乳動物細胞を実質的に含まないこともある。
少なくとも1つの免疫グロブリンドメインを含有する工学操作されたタンパク質(例えば融合タンパク質)であることもできる。免疫グロブリンの非限定的な例は本明細書に記載があり、免疫グロブリンのさらなる例は当技術分野において公知である。
4時間の間の期間、または24時間より長い期間)につれての除去および添加される培養培地の体積(例えば、1日単位での培養培地再供給割合)の漸進的変化(例えば増加または減少)を指す。例えば、勾配灌流プロセスの一実施形態は、次のような再供給プロトコールを伴うことができる:1~3日目 培養培地約0.5x反応器体積(RV)/日の再供給、4~6日目 約0.7xRV/日の再供給、および7日目以降 約1.0xRV/日の再供給。この特定の例は、ある特定の再供給割合を有する日数に関しておよび/または任意の特定の24時間にわたっての再供給割合に関して変ることがある。それぞれの日に除去および補充される培地の分率は、培養される特定の細胞、初期播種密度、および特定の時点での細胞密度に依存して変わることがある。「RV」または「反応器体積」は、培養プロセスの開始時に存在する培養培地の体積(例えば、播種後に存在する培養培地の総体積)を意味する。
の範囲から明らかになる。
細胞55x106個/mLの間、細胞40x106個/mL~細胞70x106個/mLの間、細胞40x106個/mL~細胞65x106個/mLの間、細胞40x106個/mL~細胞60x106個/mLの間、細胞40x106個/mL~細胞55x106個/mLの間、細胞45x106個/mL~細胞70x106個/mLの間、または細胞45x106個/mL~細胞65x106個/mLの間の哺乳動物生細胞濃度をもたらすことができる。様々な異なる方法を使用して、細胞密度または生細胞密度を判定することができる。例えば、細胞培養物の試料を生理学的緩衝液で希釈し、希釈された細胞浮遊液を血球計算盤に入れ、光学顕微鏡を使用して細胞を計数することができる。別の方法では、非生細胞によって選択的に取り込まれる色素を生理学的緩衝液中に含むこと以外同様の方法(例えば、トリパンブルー、例えば、Beckman CoulterからのVi-CELL法(Beckman Coulterウェブサイトを参照されたい))を使用して、生細胞密度を判定することができる。さらに別の例では、蛍光利用フローサイトメトリー(例えば、Merck MilliporeからのGUAVA(Milliporeウェブサイトを参照されたい))、および他の細胞計数方法を使用して、細胞密度または生細胞密度を判定することができる。
組換えタンパク質(例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野において公知の組換えタンパク質のいずれか)を作製するための製造プロセスを試験する方法が本明細書で提供
される。これらの方法は、本明細書に記載の組換えタンパク質を生産する方法を行う工程と、方法中および/またはその後に、少なくとも1つ(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13または14)の培養リードアウト(例えば、細胞中または第1および/もしくは第2の培養培地中の組換えタンパク質の量、グルコース消費量、生細胞濃度、ラクテート生産、容積生産速度、比生産速度、グルコースからのラクテート収量、グルタミン濃度、グルタメート濃度、培養培地のpH、溶存CO2の分圧または濃度、溶存O2の濃度または分圧、代謝物物質移動、ならびに代謝物物質収支)を検出または測定する工程と;および少なくとも1つの培養リードアウトを、少なくとも1つ(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12または13)の培養リードアウトの基準レベル(例えば、細胞中または第1および/もしくは第2の培養培地中に存在する(で検出される)組換えタンパク質の量、グルコース消費量、生細胞濃度、ラクテート生産、容積生産速度、比生産速度、グルコースからのラクテート収量、グルタミン濃度、グルタメート濃度、培養培地のpH、溶存CO2の濃度または分圧、溶存O2の濃度または分圧、代謝物物質移動ならびに代謝物物質収支の基準レベル)と比較する工程とを含む。
および第2の体積はほぼ等しい工程と;少なくとも1つの培養リードアウト(例えば、本明細書に記載の培養リードアウトのいずれか、例えば、細胞中のまたは第1および/もしくは第2の培養培地中の組換えタンパク質の量)を検出または判定する工程と;少なくとも1つの培養リードアウトを、異なる第1もしくは第2の液体培養培地または異なる哺乳動物細胞源のうちの1つまたはそれ以上を使用する異なる培養方法によって生じる、少なくとも1つの培養リードアウト(例えば、本明細書に記載の培養リードアウトのいずれか、例えば、細胞中のまたは第1および/もしくは第2の液体培養培地中の組み替えタンパク質の量)の基準レベルと比較する工程と;基準レベルと比較して少なくとも1つの培養リードアウトの有益な変化(例えば増加または減少)(例えば、組換えタンパク質量増加)に関連付けられる、第1もしくは第2の液体培養培地、第1もしくは第2の液体培養培地中に存在する原料もしくは栄養補助剤、または哺乳動物細胞源を、組換えタンパク質の生産方法での使用に有効であると特定する工程とを含む方法が、本明細書で提供される。例えば、基準レベルと比較して組換えタンパク質レベルの増加、生細胞濃度の増加、容積生産速度の増加、比生産速度の増加、およびグルコース消費量の増加は、第1もしくは第2の液体培養培地、第1もしくは第2の液体培養培地中に存在する原料成分もしくは栄養補助剤、または哺乳動物細胞源が、組換えタンパク質の生産方法での使用に有効であることを示す。
たは哺乳動物細胞源中の夾雑物の存在について試験する方法であって、ウェルの体積の約5%~約70%を占める第1の液体培養培地に浮遊している哺乳動物細胞を含有する少なくとも1つのウェルを含有するマルチウェルプレートを用意する工程と;ある期間、約31℃~約40℃で、約320回転毎分(RPM)~約500RPMの撹拌をしながら、マルチウェルプレートをインキュベートする工程と;連続的にまたは定期的に、期間中に、第1の体積の第1の液体培養培地を除去し、第2の体積の第2の液体培養培地を第1の液体培養培地に添加する工程であって、第1および第2の体積はほぼ等しい工程と;少なくとも1つの培養リードアウト(例えば、本明細書に記載の培養リードアウトのいずれか、例えば、細胞中のまたは第1および/もしくは第2の液体培養培地中の組換えタンパク質の量)を検出または判定する工程と;少なくとも1つの培養リードアウトを、異なる第1もしくは第2の液体培養培地、第1もしくは第2の液体培養培地を生成するための異なる原料、または異なる哺乳動物細胞源のうちの1つまたはそれ以上を使用する異なる培養方法によって生じる、少なくとも1つの培養リードアウト(例えば、本明細書に記載の培養リードアウトのいずれか、例えば、細胞中のまたは第1および/もしくは第2の培養培地中の組み替えタンパク質の量)の基準レベルと比較する工程と;基準レベルと比較して少なくとも1つの培養パラメータが有害に変化された(例えば増加されたまたは減少された)場合、第1もしくは第2の液体培養培地、第1もしくは第2の液体培養培地を生成するために使用された原料、または哺乳動物細胞源を夾雑物を含有すると断定する工程とを含む方法が、本明細書で提供される。例えば、基準レベルと比較して組換えタンパク質生産の減少(例えば、細胞中のまたは第1および/もしくは第2の培養培地中の組換えタンパク質の減少)、容積生産速度の減少または生細胞濃度の減少は、第1もしくは第2の液体培養培地中の、第1もしくは第2の液体培養培地を生成するために使用された原料中の、または哺乳動物細胞源中の夾雑物の存在を示す有害な変化である。一部の方法は、第1もしくは第2の液体培養培地中、第1もしくは第2の液体培養培地を生成するために使用された原料中、または哺乳動物細胞源中に存在する夾雑物の正体を判定するための1つまたはそれ以上のアッセイをさらに含む。夾雑物は、生物学的夾雑物(例えば、マイコバクテリウム、真菌、細菌、ウイルスまたは望ましくない哺乳動物細胞)であることがある。夾雑物は、物理的性質不明の物質であることもある。
か、例えば、生産された組換えタンパク質)の基準レベルと比較して少なくとも1つの培養リードアウト(例えば、本明細書に記載の培養リードアウトのいずれか、例えば、生産された組換えタンパク質の量)の有益な変化(例えば、増加または減少)と関連付けられる任意の培養生物もしくはパラメータを特定し、製造プロセスに加える工程とを含む方法が、本明細書で提供される。例えば、生産された組換えタンパク質の量、容積生産速度、比生産速度、または生細胞濃度の増加は、培養リードアウトの有益な変化であり、生産された組換えタンパク質の量、容積生産速度、比生産速度、または生細胞濃度の減少は、培養リードアウトの有害な変化である。場合によっては、方法は、組換えタンパク質の大規模化(例えばバイオリアクター)生産に使用することができる最適化細胞培養条件をハイスループット方式で同定するために使用される。
)マルチウェルプレートにおける少なくとも1つの培養リードアウトを判定または検出する工程、少なくとも1つの培養リードアウトを、少なくとも1つの培養リードアウトの基準レベル(例えば、夾雑が実質的にない培養物からの少なくとも1つの培養リードアウトのレベル)と比較する工程、およびウェルにおける少なくとも1つの培養リードアウトが、少なくとも1つの培養リードアウトの基準レベルと比較して、夾雑物がウェル内に存在することを示す場合、大規模バイオリアクターを、夾雑物を含有すると断定する工程によってこれらの方法を行って、夾雑物が大規模バイオリアクター内に存在するかどうかを判定することもできる。夾雑物は、例えば、生物学的夾雑物、例えばウイルス、真菌、望ましくない哺乳動物細胞、または細菌、例えばマイコバクテリウムであることがある。夾雑物は、例えば、ベシウイルスであることもある。
本明細書は、(例えば、本明細書に記載の方法のいずれかを使用する)哺乳動物細胞の培養に有用な、例示的マルチウェル細胞培養プレートシステムを提供する。これらのシステムは、培養ベッセルの中へのおよび/または培養ベッセルから外への流体の流れに順応するように構成されている少なくとも1つのポートによって培養ベッセル内に存在する流体(例えば、第1の液体培養培地)の連続的または定期的除去、および培養ベッセルへの流体(例えば、第2の液体培養培地)の添加を可能にするように設計されている。
マルチウェル細胞培養プレートシステム1の非限定的な例の上面図を図1に提供する。マルチウェル細胞培養プレートシステム1は、複数の開口部4を有する表面3を含む一体型支持プレート2を含む。開口部を任意の形式で配列することができ、図1は縦列・横列の形式の開口部を示しているが、開口部の任意の構成を利用できることを当業者は理解するであろう。
mLの間、約1mL~約20mLの間、約1mL~約18mLの間、約1mL~約16mLの間、約1mL~約14mLの間、約1mL~約12mLの間、約1mL~約10mLの間、約1mL~約8mLの間、約1mL~約7mLの間、約1mL~約6mLの間、約1mL~約5mLの間、約1mL~約4mLの間、約1mL~約3.5mLの間、約1mL~約3mLの間、約1mL~約2.5mLの間、約1mL~約2mLの間、約1mL~約1.5mLの間、約1.5mL~約25mLの間、約1.5mL~約24mLの間、約1.5mL~約22mLの間、約1.5mL~約20mLの間、約1.5mL~約18mLの間、約1.5mL~約16mLの間、約1.5mL~約14mLの間、約1.5mL~約12mLの間、約1.5mL~約10mLの間、約1.5mL~約8mLの間、約1.5mL~約6mLの間、約1.5mL~約5mLの間、約1.5mL~約4mLの間、約1.5mL~約3.5mLの間、約1.5mL~約3mLの間、約1.5mL~約2.5mLの間、約1.5mL~約2.0mLの間、約2mL~約25mLの間、約2mL~約24mLの間、約2mL~約22mLの間、約2mL~約20mLの間、約2mL~約18mLの間、約2mL~約16mLの間、約2mL~約14mLの間、約2mL~約12mLの間、約2mL~約10mLの間、約2mL~約8mLの間、約2mL~約6mLの間、または約2mL~約5mLの間)の体積を有するものを収容するように構成することができ、ここで、各開口部3は、各培養ベッセル4と対になっており、各培養ベッセル4への開放部を画成している。
間、約2.5cm~約12cmの間、約2.5cm~約11cmの間、約2.5cm~約10cmの間、約2.5cm~約9cmの間、約2.5cm~約8cmの間、約2.5cm~約7cmの間、約2.5cm~約6cmの間、約2.5cm~約5cmの間、約2.5cm~約4cmの間、約3cm~約12cmの間、約3cm~約11cmの間、約3cm~約10cmの間、約3cm~約9cmの間、約3cm~約8cmの間、約3cm~約7cmの間、約3cm~約6cmの間、約3cm~約5cmの間、約4cm~約12cmの間、約4cm~約11cmの間、約4cm~約10cmの間、約4cm~約9cmの間、約4cm~約8cmの間、約4cm~約7cmの間、約4cm~約6cmの間、約5cm~約12cmの間、約5cm~約11cmの間、約5cm~約10cmの間、約5cm~約9cmの間、約5cm~約8cmの間、または約5cm~約7cmの間)の高さを有することができる。
路7への供給のためのリザーバーを含むように構成される。一部の例では、マルチウェル細胞培養プレートシステムは、液体の収容およびポート6または導水路7への供給のためのリザーバーであって、一体型支持プレート2の外部にあり、ポート6または導水路7とそれぞれ流体連通されるように構成されている(この場合、ポート6または導水路7は、培養ベッセル5の中へ流体を流す機能を果たす)リザーバーを含む。一部の実施形態では、一体型支持プレート2は、培養ベッセル5から除去された液体を収容および保管するためのリザーバーを含むように構成されており、除去された液体を収容および保管するためのリザーバーは、一体型支持プレート2の外部にあり、ポート6または導水路7と流体連通されている(この場合、ポート6または導水路7は、培養ベッセル5から外に流体を流す機能を果たす)。
本明細書で記載される例示的な方法において、まずマルチウェルプレートが提供される。第1の液体培養培地が、培地がウェル体積の約5%~約80%の間(例えば、約5%~約75%の間、約5%~約70%の間、約5%~約65%の間、約5%~約60%の間、約5%~約55%の間、約5%~約50%の間、約5%~約45%の間、約5%~約40%の間、約5%~約35%の間、約5%~約30%の間、約10%~約80%の間、約10%~約75%の間、約10%~約70%の間、約10%~約65%の間、約10%~約60%の間、約10%~約55%の間、約10%~約50%の間、約10%~約45%の
間、約10%~約40%の間、約10%~約35%の間、約15%~約80%の間、約15%~約75%の間、約15%~約70%の間、約15%~約65%の間、約15%~約60%の間、約15%~約55%の間、約15%~約50%の間、約15%~約45%の間、約15%~約40%の間、約20%~約80%の間、約20%~約75%の間、約20%~約70%の間、約20%~約65%の間、約20%~約60%の間、約20%~約55%の間、約20%~約50%の間、約20%~約45%の間、約25%~約80%の間、約25%~約75%の間、約25%~約70%の間、約25%~約65%の間、約25%~約60%の間、約25%~約55%の間または約25%~約50%の間)を占めるように、ウェルに添加される。少なくとも1つの哺乳動物細胞が第1の液体培養培地に、すなわち、培地がウェルに添加される前か後に添加される。マルチウェルプレートは約31℃~約40℃で一定時間インキュベートされ、例えば、回転振盪デバイスにおいて約300RPM~約600RPM(例えば、本明細書で記載される撹拌の例示的な範囲のいずれか)で撹拌される。例えば、投てき(軌道)(throw(orbit))直径約3mm~約50mmの振盪インキュベーターなどのインキュベーターで、細胞をインキュベートしてよい。インキュベーションの間、期間中連続的にまたは定期的に、第1の体積の第1の液体培養培地(例えば、任意の哺乳動物細胞濃度を含む、例えば、哺乳動物細胞を含まないか、実質的に含まなくした第1の体積の第1の液体培養培地)が除去され、第2の体積の第2の液体培養培地が第1の液体培養培地に添加される。典型的には、第1および第2の体積を比較すると、第1および第2の体積はほぼ等しいが、少量分、例えば、約1%~約10%(例えば、約1%~約8%、約1%~約5%または約1%~約3%)変動してもよい。一部の実施形態において、添加される第2の体積の第2の液体培養培地は、除去される第1の体積の第1の液体培養培地よりも(例えば、最大で約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%または10%未満)少ない。当技術分野で既知の通り、インキュベート期間は、哺乳動物細胞および液体培養培地を含むマルチウェルプレートが、第1の体積の第1の液体培養培地を除去し、第2の体積の第2の液体培養培地を添加するためにインキュベーターから取り出される短い時間(例えば、最大1分間、最大2分間、最大3分間、最大4分間、最大5分間、最大10分間、最大20分間、最大30分間、最大40分間、最大50分間または最大1時間)を含んでいてよい。一部の例において、インキュベート期間は、(例えば、本明細書で記載されるマルチウェル培養プレートシステムの使用により)哺乳動物細胞および液体培養培地を含むマルチウェルプレートが、第1の体積の第1の液体培養培地を除去し、第2の体積の第2の液体培養培地を添加するためにインキュベーターから取り出される短い時間を含まない。
本明細書で提供される方法は、様々な異なる哺乳動物細胞を培養するために使用することができる。哺乳動物細胞は、例えば、浮遊液中で増殖する細胞であっても、接着細胞であってもよい。本明細書で記載される方法のうちいずれかを使用して培養可能な哺乳動物細胞の非限定的な例には:チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、Sp2.0、骨髄腫細胞(例えば、NS/0)、B細胞、ハイブリドーマ細胞、T細胞、ヒト胎児腎臓(HEK)細胞(例えば、HEK293EおよびHEK293F)、アフリカミドリザル腎臓上皮細胞(Vero)細胞、およびメイディンダービーイヌ(コッカスパニエル)腎臓上皮細胞(MDCK)細胞が含まれる。本明細書で記載される方法を使用して培養可能なさらなる哺乳動物細胞が、当技術分野で既知である。
する組換え核酸の非限定的な例が、本明細書で記載される方法を使用して生産可能な組換えタンパク質と同様に下に記載される。一部の例において、培養のためマルチウェルプレートに配置される哺乳動物細胞は、より大きな培養物由来である。例えば、マルチウェルプレートにおける哺乳動物細胞は、大規模バイオリアクター培養物由来であってよい、すなわち、これらの方法を使用してサテライト培養物を調製してよい。
液体培養培地が当技術分野で既知である。第1および/または第2の組織培養培地には、哺乳動物血清(例えば、ウシ胎児血清およびウシ血清)、および/または成長ホルモンもしくは成長因子(例えば、インスリン、トランスフェリンおよび上皮成長因子)を添加してよい。あるいはまたはさらに、第1および/または第2の液体培養培地は、既知組成液体培養培地、動物由来成分不含液体培養培地、無血清液体培養培地、血清含有液体培養培地またはタンパク質不含液体培養培地であってよい。既知組成液体培養培地、動物由来成分不含液体培養培地、無血清液体培養培地および血清含有液体培養培地の非限定的な例は、市販されている。
、約250μL~約20mL、約250μL~約15mL、約250μL~約10mL、約250μL~約8mL、約250μL~約6mL、約250μL~約5mL、約250μL~約4mL、約250μL~約3mL、約250μL~約2.5mL、約250μL~約2mL、約250μL~約1mL、約500μL~約25mL、約500μL~約20mL、約500μL~約15mL、約500μL~約10mL、約500μL~約8mL、約500μL~約6mL、約500μL~約5mL、約500μL~約4mL、約500μL~約3mL、約500μL~約2.5mL、約500μL~約2mL、約500μL~約1mL、約1mL~約25mL、約1mL~約20mL、約1mL~約15mL、約1mL~約10mL、約1mL~約8mL、約1mL~約6mL、約1mL~約5mL、約1mL~約4mL、約1mL~約3mL、約1mL~約2.5mLまたは約1mL~約2mL)中に浮遊している。
哺乳動物細胞が接着細胞である一部の例において、第1および/または第2の液体培養培地は、複数のマイクロキャリアを含む。例えば、ウェルは、最終濃度が、例えば約1.0g/L~約15.0g/L、(例えば、振盪フラスコ中の最終濃度が約1.0g/L~約2.5g/L、約1.0g/L~約2.0g/L、約1.0g/L~約1.75g/L、約1.0g/L~約1.5g/L、約1.0g/L~約1.25g/L、約2.5g/L~5.0g/L、約5.0g/L~約7.5g/L、約7.5g/L~約10.0g/L、約10.0g/L~約12.5g/L、約12.5g/L~約15.0g/L、約1.0g/L~約5.0g/L、約5.0g/L~約10.0g/L、約10.0g/L~約15.0g/L、約2.5g/L~約3.5g/L、約3.0g/L~約4.0g/L、約4.0g/L~約5.0g/L、約5.0g/L~約6.0g/L、約6.0g/L~約7.0g/L、約7.0g/L~約8.0g/L、約8.0g/L~約9.0g/L、約9.0g/L~約10.0g/L、約10.0g/L~約11.0g/L、約11.0g/L~約12.0g/L、約12.0g/L~約13.0g/L、約13.0g/L~約14.0g/Lまたは約14.0g/L~約15.0g/L)のマイクロキャリアを含んでいてよい。
い。
グリコリド、ポリメチルアクリレート、ポリビニルブチルエーテル、ポリスチレン、ポリシクロペンタジエニルメチルノルボルネン、ポリエチレンプロピレン、ポリエチルエチレン、ポリイソブチレン、ポリシロキサン、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸n-ブチル、アクリル酸イソブチル、アクリル酸2-エチル(2-ethyl acrylate)、アクリル酸t-ブチル、メタクリル酸エステル(例えば、メタクリル酸エチル、メタクリル酸n-ブチル、およびメタクリル酸イソブチル)、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ビニル(例えば、酢酸ビニル、ビニルバーサテート(vinylversatate)、プロピオン酸ビニル、ビニルホルムアミド、ビニルアセトアミド、ビニルピリジン、およびビニルイミダゾ-ル)、アミノアルキル(例えば、アミノアルキルアクリレート、アミノアルキルメタクリレート、およびアミノアルキル(メタ)アクリルアミド)、スチレン、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、および乳酸が含まれる。天然ポリマーの非限定的な例には、セルロース、レシチンおよびヒアルロン酸が含まれる。マイクロキャリアは、同じまたは異なる比で、異なるポリマーの混合物(例えば、本明細書で記載されるか当技術分野で既知の、1つまたはそれ以上のポリマーの任意の組合せ)を含んでいてよい。本明細書で記載されるマイクロキャリアのうちいずれも、1つまたはそれ以上のポリマー(例えば、本明細書で記載されるか当技術分野で既知のポリマーのうちいずれか)を含むコア、および1つまたはそれ以上の異なるポリマー(例えば、本明細書で記載されるか当技術分野で既知のポリマーのうちいずれか)を含む外層を含んでいてよい。
かにおいて使用可能なマイクロキャリアのさらなる例が、公的に入手可能であり当技術分野で既知である。
様々なマルチプレートが当技術分野で既知であり、本明細書で記載される方法のうちいずれかにおいて使用可能である。例えば、マルチウェルプレートは、2ウェルプレート、4ウェルプレート、6ウェルプレート、8ウェルプレート、9ウェルプレート、10ウェルプレート、12ウェルプレート、15ウェルプレート、18ウェルプレート、20ウェルプレート、24ウェルプレート、36ウェルプレート、48ウェルプレート、60ウェルプレート、72ウェルプレートまたは96ウェルプレートであってよい。一部の例において、ウェルは、体積(内部体積)約0.3mL~約25mLの間(例えば、約0.3mL~約24mLの間、約0.3mL~約22mLの間、約0.3mL~約20mLの間、約0.3mL~約18mLの間、約0.3mL~約16mLの間、約0.3mL~約14mLの間、約0.3mL~約12mLの間、約0.3mL~約10mLの間、約0.3mL~約8mLの間、約0.3mL~約6mLの間、約0.3mL~約5mLの間、約0.3mL~約4mLの間、約0.3mL~約3mLの間、約0.3mL~約2mLの間、約0.3mL~約1mLの間、約0.5mL~約25mLの間、約0.5mL~約24mLの間、約0.5mL~約22mLの間、約0.5mL~約20mLの間、約0.5mL~約18mLの間、約0.5mL~約16mLの間、約0.5mL~約14mLの間、約0.5mL~約12mLの間、約0.5mL~約10mLの間、約0.5mL~約8mLの間、約0.5mL~約6mLの間、約0.5mL~約5mLの間、約0.5mL~約4mLの間、約0.5mL~約3mLの間、約0.5mL~約2mLの間、約0.5mL~約1mLの間、約1mL~約25mLの間、約1mL~約24mLの間、約1mL~約22mLの間、約1mL~約20mLの間、約1mL~約18mLの間、約1mL~約16mLの間、約1mL~約14mLの間、約1mL~約12mLの間、約1mL~約10mLの間、約1mL~約8mLの間、約1mL~約7mLの間、約1mL~約6mLの間、約
1mL~約5mLの間、約1mL~約4mLの間、約1mL~約3.5mLの間、約1mL~約3mLの間、約1mL~約2.5mLの間、約1mL~約2mLの間、約1mL~約1.5mLの間、約1.5mL~約25mLの間、約1.5mL~約24mLの間、約1.5mL~約22mLの間、約1.5mL~約20mLの間、約1.5mL~約18mLの間、約1.5mL~約16mLの間、約1.5mL~約14mLの間、約1.5mL~約12mLの間、約1.5mL~約10mLの間、約1.5mL~約8mLの間、約1.5mL~約6mLの間、約1.5mL~約5mLの間、約1.5mL~約4mLの間、約1.5mL~約3.5mLの間、約1.5mL~約3mLの間、約1.5mL~約2.5mLの間、約1.5mL~約2.0mLの間、約2mL~約25mLの間、約2mL~約24mLの間、約2mL~約22mLの間、約2mL~約20mLの間、約2mL~約18mLの間、約2mL~約16mLの間、約2mL~約14mLの間、約2mL~約12mLの間、約2mL~約10mLの間、約2mL~約8mLの間、約2mL~約6mLの間、または約2mL~約5mLの間)を有する。
0mm~約10mmの間、約8mm~約50mmの間、約8mm~約45mmの間、約8mm~約40mmの間、約8mm~約35mmの間、約8mm~約30mmの間、約8mm~約25mmの間、約8mm~約20mmの間、約8mm~約15mmの間、約10mm~約50mmの間、約10mm~約45mmの間、約10mm~約40mmの間、約10mm~約35mmの間、約10mm~約30mmの間、約10mm~約25mmの間、約10mm~約20mmの間、約15mm~約50mmの間、約15mm~約45mmの間、約15mm~約40mmの間、約15mm~約35mmの間、約15mm~約30mmの間、約15mm~約25mmの間、または約15mm~約20mmの間)であってよい。
本明細書で記載される方法には、哺乳動物細胞ならびに第1および/または第2の液体培養培地を含む培養物の回転撹拌が必要である。回転撹拌は、(例えば、投てき(軌道)直径約3mm~約50mmの振盪インキュベーターなどのインキュベーター内で)約300RPM~約600RPM(例えば、約300RPM~約580RPM、約300RPM~約560RPM、約300RPM~約540RPM、約300RPM~約520RPM、約300RPM~約500RPM、約300RPM~約480RPM、約300RPM~約460RPM、約300RPM~約440RPM、約300RPM~約420RPM、約300RPM~約400RPM、約300RPM~約380RPM、約300RPM~約360RPM、約320RPM~約600RPM、約320RPM~約580RPM、約320RPM~約560RPM、約320RPM~約540RPM、約320RPM~約520RPM、約320RPM~約500RPM、約320RPM~約480RPM、約320RPM~約460RPM、約320RPM~約440RPM、約320RPM~約420RPM、約320RPM~約400RPM、約320RPM~約380RPM、約330RPM~約600RPM、約330RPM~約580RPM、約330RPM~約560RPM、約330RPM~約540RPM、約330RPM~約520RPM、約330RPM~約500RPM、約330RPM~約480RPM、約330RPM~約460RPM、約330RPM~約440RPM、約330RPM~約420RPM、約330RPM~約400RPM、約330RPM~約380RPM、約340RPM~約600RPM、約340RPM~約580RPM、約340RPM~約560RPM、約340RPM~約540RPM、約340RPM~約520RPM、約340RPM~約500RPM、約340RPM~約480RPM、約340RPM~約460RPM、約340RPM~約440RPM、約340RPM~約420RPM、約340RPM~約400RPM、約360RPM~約600RPM、約360RPM~約580RPM、約360RPM~約560RPM、約360RPM~約540RPM、約360RPM~約520RPM、約360RPM~約500RPM、約360RPM~約480RPM、約360RPM~約460RPM、約360RPM~約440RPM、約360RPM~約420RPM、約380RPM~約600RPM、約380RPM~約580RPM、約380RPM~約560RPM、約380RPM~約540RPM、約380RPM
~約520RPM、約380RPM~約500RPM、約380RPM~約480RPM、約380RPM~約460RPM、約380RPM~約440RPM、約400RPM~約600RPM、約400RPM~約580RPM、約400RPM~約560RPM、約400RPM~約540RPM、約400RPM~約520RPM、約400RPM~約500RPM、約400RPM~約480RPM、または約400RPM~約460RPM)の回数で行ってよい。
20RPM~約330RPM、約330RPM~約450RPM、約330RPM~約440RPM、約330RPM~約430RPM、約330RPM~約420RPM、約330RPM~約410RPM、約330RPM~約400RPM、約330RPM~約390RPM、約330RPM~約380RPM、約330RPM~約370RPM、約330RPM~約360RPM、約330RPM~約350RPM、約330RPM~約340RPM、約340RPM~約450RPM、約340RPM~約440RPM、約340RPM~約430RPM、約340RPM~約420RPM、約340RPM~約410RPM、約340RPM~約400RPM、約340RPM~約390RPM、約340RPM~約380RPM、約340RPM~約370RPM、約340RPM~約360RPM、約340RPM~約350RPM、約350RPM~約450RPM、約350RPM~約440RPM、約350RPM~約430RPM、約350RPM~約420RPM、約350RPM~約410RPM、約350RPM~約400RPM、約350RPM~約390RPM、約350RPM~約380RPM、約350RPM~約370RPM、約350RPM~約360RPM、約360RPM~約450RPM、約360RPM~約440RPM、約360RPM~約430RPM、約360RPM~約420RPM、約360RPM~約410RPM、約360RPM~約400RPM、約360RPM~約390RPM、約360RPM~約380RPM、約360RPM~約370RPM、約370RPM~約450RPM、約370RPM~約430RPM、約370RPM~約410RPM、約370RPM~約390RPM、約390RPM~約450RPM、約390RPM~約430RPM、約390RPM~約410RPM、約410RPM~約450RPM、約410RPM~約430RPM、または約430RPM~約450RPM)の回数で撹拌される、ウェル体積の約10%~約40%(例えば、約10%~約35%、約10%~約30%、約10%~約25%、約10%~約20%、約10%~約15%、約15%~約40%の間、約15%~約35%、約15%~約30%、約15%~約25%、約15%~約20%、約20%~約40%、約20%~約35%、約20%~約30%、約20%~約25%、約25%~約40%、約25%~約35%、約25%~約30%、約30%~約40%、約30%~約35%、または約35%~約40%の間)を占める液体培養培地を含む、直径約6.0mm~約35mmの間(例えば、約6.0mm~約30mmの間、約6.0mm~約25mmの間、約6.0mm~約20mmの間、約6.0mm~約15mmの間、約10mm~約35mmの間、約10mm~約30mmの間、約10mm~約25mmの間、約10mm~約20mmの間、約15mm~約35mmの間、約15mm~約30mmの間、約15mm~約25mmの間、約20mm~約35mmの間、約20mm~約30mmの間、または約25mm~約35mmの間)、および高さ約40mm~約50mmの間(例えば、約40mm~約45mmの間または約45mm~約50mmの間)を有する角底ウェルにおいて達成されるものと本質的に同じ流体せん断力および溶存酸素(O2)濃度が生じうる。
本明細書で記載される培養方法は、温度約31℃~約40℃で実施することができる。例えば、時間または日ベースで、培養方法における特定の時点で温度を変化させてよいことを、当業者は理解するであろう。例えば、哺乳動物細胞によるウェルへの最初の播種後約1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、14日、15日、16日、17日、18日、19日または約20日以上で、温度を変化または移行(例えば、上昇または下降)させてよい。例えば、温度を上方へ(例えば、最大
もしくは約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または最大もしくは約20℃の変化)移行させてよい。例えば、温度を下方へ(例えば、最大もしくは約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または最大もしくは約20℃の変化)移行させてよい。
本明細書で記載される方法は、第1の体積の第1の液体培養培地(例えば、任意の濃度の哺乳動物細胞を含む、例えば、細胞を実質的に含まない第1の体積の第1の液体培養培地)をウェルから除去すること、および第1の液体培養培地に第2の体積の第2の液体培養培地を添加することを含む。除去および添加は同時にまたは連続的に、または2つを組み合わせて実施してよい。さらに、除去および添加を連続的に(例えば、任意の所与の期間(例えば、24時間期間、約1時間~約24時間の増分期間、または24時間超の増分期間)、ウェル体積または第1の液体培養培地体積の0.1%~700%の間(例えば、1%~600%の間、1%~500%の間、1%~400%の間、1%~350%の間、1%~300%の間、1%~250%の間、1%~100%の間、100%~200%の間、5%~150%の間、10%~50%の間、15%~40%の間、8%~80%の間、または4%~30%の間)の体積を除去および交換する比率で)、または定期的に(例えば、3日に1度、1日おきに1度、1日に1度、1日に2度、1日に3度、1日に4度または1日に5度)、またはそれらを任意で組み合わせて実施してよい。定期的に実施される場合、(例えば、約24時間期間内、約1時間~約24時間の増分期間内、または24時間超の増分期間内で)除去または交換される体積は、例えば、ウェル体積または第1の液体培養培地体積の0.1%~700%の間(例えば、1%~700%の間、1%~600%の間、1%~500%の間、1%~400%の間、1%~300%の間、1%~200%の間、1%~100%の間、100%~200%の間、5%~150%の間、10%~50%の間、15%~40%の間、8%~80%の間、または4%~30%の間)であってよい。除去される第1の液体培養培地の第1の体積および添加される第2の液体培養培地の第2の体積は、一部の例において、培養期間の全体または一部の間、各24時間期間(あるいは、約1時間~約24時間の増分期間、または24時間超の増分期間)中ほぼ同じに維持してよい。当技術分野で既知である通り、第1の体積の第1の液体培養培地が除去される比率(体積/単位時間)、および第2の体積の第2の液体培養培地が添加される比率(体積/単位時間)は変動させてよい。第1の体積の第1の液体培養培地が除去される比率(体積/単位時間)、および第2の体積の第2の液体培養培地が添加される比率(体積/単位時間)は、ほぼ同じでもよく異なっていてもよい。
ョン1~3日目には、除去される第1の液体培養培地の第1の体積および添加される第2の液体培養培地の第2の体積は、第1の液体培養培地の体積の約30%~約50%の間であり;インキュベーション4~6日目には、除去される第1の液体培養培地の第1の体積および添加される第2の液体培養培地の第2の体積は、第1の液体培養培地の体積の約30%~約50%の間であり;各24時間期間中のインキュベーション7日目以降には、除去される第1の液体培養培地の第1の体積および添加される第2の液体培養培地の第2の体積は、第1の液体培養培地の体積の約90%~約150%である。
本明細書で記載される方法は、最大または約15%CO2(例えば、最大もしくは約14%CO2、12%CO2、10%CO2、8%CO2、6%CO2、5%CO2、4%CO2、3%CO2、2%CO2、または最大もしくは約1%CO2)を含む雰囲気下でマルチウェルプレートをインキュベートすることをさらに含んでいてよい。さらに、本明細書で記載される方法のうちいずれかは、加湿雰囲気(例えば、湿度少なくとももしくは約20%、30%、40%、50%、60%、70%、85%、80%、85%、90%、または湿度少なくとももしくは約95%、または湿度約100%)下でマルチウェルプレートをインキュベートすることを含んでいてよい。
本明細書で記載される培養方法を実施するために使用可能なデバイスの非限定的な例には:Appropriate Technical Resources (Maryl
and、USA)が販売するINFORS Multiron振盪インキュベーター(INFORS;Basel、Switzerland)およびKuhner振盪インキュベーター(Kuhner AG;Basel、Switzerland)が含まれる。培養方法を実施するために使用可能なデバイスの非限定的な例には、投てき(軌道)直径約3mm~約50mmの間(例えば、約1mm~約25mmの間または約25mm~約50mmの間)の回転式インキュベーターが含まれる。振盪インキュベーターおよび回転式培養インキュベーターのさらなる例が、当技術分野で既知である。
温度約31℃~約40℃でインキュベートされ、約320RPM~約450RPM(例えば、約320RPM~約440RPM、約320RPM~約430RPM、約320RPM~約420RPM、約320RPM~約410RPM、約320RPM~約400RPM、約320RPM~約390RPM、約320RPM~約380RPM、約320RPM~約370RPM、約320RPM~約360RPM、約320RPM~約350RPM、約320RPM~約340RPM、約320RPM~約330RPM、約330RPM~約450RPM、約330RPM~約440RPM、約330RPM~約430RPM、約330RPM~約420RPM、約330RPM~約410RPM、約330RPM~約400RPM、約330RPM~約390RPM、約330RPM~約380RPM、約330RPM~約370RPM、約330RPM~約360RPM、約330RPM~約350RPM、約330RPM~約340RPM、約340RPM~約450R
PM、約340RPM~約440RPM、約340RPM~約430RPM、約340RPM~約420RPM、約340RPM~約410RPM、約340RPM~約400RPM、約340RPM~約390RPM、約340RPM~約380RPM、約340RPM~約370RPM、約340RPM~約360RPM、約340RPM~約350RPM、約350RPM~約450RPM、約350RPM~約440RPM、約350RPM~約430RPM、約350RPM~約420RPM、約350RPM~約410RPM、約350RPM~約400RPM、約350RPM~約390RPM、約350RPM~約380RPM、約350RPM~約370RPM、約350RPM~約360RPM、約360RPM~約450RPM、約360RPM~約440RPM、約360RPM~約430RPM、約360RPM~約420RPM、約360RPM~約410RPM、約360RPM~約400RPM、約360RPM~約390RPM、約360RPM~約380RPM、約360RPM~約370RPM、約370RPM~約450RPM、約370RPM~約430RPM、約370RPM~約410RPM、約370RPM~約390RPM、約390RPM~約450RPM、約390RPM~約430RPM、約390RPM~約410RPM、約410RPM~約450RPM、約410RPM~約430RPM、または約430RPM~約450RPM)の回数で撹拌される、直径約6.0mm~約35mmの間(例えば、約6.0mm~約30mmの間、約6.0mm~約25mmの間、約6.0mm~約20mmの間、約6.0mm~約15mmの間、約10mm~約35mmの間、約10mm~約30mmの間、約10mm~約25mmの間、約10mm~約20mmの間、約15mm~約35mmの間、約15mm~約30mmの間、約15mm~約25mmの間、約20mm~約35mmの間、約20mm~約30mmの間、または約25mm~約35mmの間)および高さ約40mm~約50mmの間(例えば、約40mm~約45mmの間または約45mm~約50mmの間)を有する角底ウェルの体積の約10%~約40%(例えば、約10%~約35%、約10%~約30%、約10%~約25%、約10%~約20%、約10%~約15%、約15%~約40%の間、約15%~約35%、約15%~約30%、約15%~約25%、約15%~約20%、約20%~約40%、約20%~約35%、約20%~約30%、約20%~約25%、約25%~約40%、約25%~約35%、約25%~約30%、約30%~約40%、約30%~約35%、または約35%~約40%の間)を占める培地において達成されるものと同じ(または本質的に同じ)流体せん断力および溶存酸素(O2)濃度を培地中に発生させる条件下で、マルチウェルプレートのウェル内に配置された液体培養培地中に浮遊している哺乳動物細胞を、勾配灌流プロセスで培養することを含む培養方法も提供される。
る。例えば、溶存O2電極またはプローブ(例えば、Eutech Instruments WD-35201-80 Dissolved Oxygen Probe、Rosemount Analytical 499 Series Dissolved Oxygen/Ozone Sensor、およびExtech DO705 Dissolved Oxygen Electrodeから入手可能なO2プローブおよび電極)を使用して溶存O2を測定することができる。O2プローブおよび電極の較正および使用方法は、製造業者の説明書を使用して実施することができる。
本明細書で記載される方法を使用して、組換えタンパク質を生産することができる細胞を培養することを含む、組換えタンパク質を生産する方法も本明細書で提供される。この方法の実施に従って、組換えタンパク質を哺乳動物細胞および/または第1もしくは第2の培養培地から回収することができる。一部の実施形態において、組換えタンパク質は、培養方法の間の任意の所与の時点で第1および/または第2の液体培養培地から回収される(例えば、培養0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100日目、または培養100日超後のうち1日またはそれ以上に、第1および/または第2の液体培養培地から回収される)。これらの方法についての一部の実施形態は、第3の培養培地の体積または第4の液体培養培地の体積を添加することをさらに含むが、各例において、ウェル中の液体培養培地の総体積は、第1の液体培養培地体積とほぼ等しいかそれ未満となるべきである。
デノウイルスベクター)を使用して、核酸を細胞に導入することができる。核酸は、プロモーター配列(例えば、β-アクチンプロモーターおよびCMVプロモーターなどの強力なプロモーター、または誘導性プロモーター)に作動可能に連結させることができる。核酸を含むベクターは、必要に応じて、選択可能なマーカー(例えば、哺乳動物細胞にハイグロマイシン、ピューロマイシンまたはネオマイシン抵抗性を付与する遺伝子)も含む。
小スケールかつハイスループットの灌流培養のモデルを生成し、そのような培養が生産用灌流培養のものと同様の細胞密度を達成することができるか否かを決定するための実験を実施した。
組換えガラクトシダーゼ浮遊細胞培養
組換えガラクトシダーゼを生産する同一のクローン細胞株を、各細胞培養プロセスランで使用した。各細胞培養プロセスランで使用した培養培地を表1に挙げる。
以下の装置および試薬を、この実施例に記載の細胞培養プロセスランで使用した:Multitronシェーカーインキュベーター(Appropriate Technical Resources,Inc.)(型式番号AJ125)、Cellometer(登録商標)Auto1000(Nexcelom Bioscience LLC)、Beckman Coulter Allegra遠心機(型式番号 Allegra X-14R)、TubeSpin(登録商標)Bioreactors 50(Techno Plastic Products AG、トラザーディンゲン、スイス)、96ウェルMASTERBLOCK(登録商標)マイクロプレート2mL(Griener Bio One、フリッケンハウゼン、ドイツ)、96ウェルMASTERBLOCK(登録商標)マイクロプレート1mL(Griener Bio One、フリッケンハウゼン、ドイツ)、Olympus白色光卓上顕微鏡(型式番号BH-s)、Olympus白色光卓上顕微鏡(型式番号BX40)、Olympus白色光卓上顕微鏡(型式番号BX41)、0.4%トリパンブルー溶液(Sigma)、0.2%トリパンブルー溶液(Sigma)、Reichert Bright-Line(登録商標)血球計算盤、Thermo Scientific顕微鏡用カバーガラス、Fisher Scientific Laboratory Counter、SAS(登録商標)JMP Software(バージョンX)、Applikon MicroFlask微量測定プレートクランピングデバイス(Applikon Biotechnology Inc.)、AeraSeal、微穴性ディスポーザブル膜シール(Phenix Research Products)、Beckman Coulter Biomek(登録商標)3000 Laboratory Automation Workstation、RAININ Pipetting 360° Pipet-Lite(商標)XLS(商標)Pipettor(Mettler Toledo)、Ergenomic High-Performance Pipettor[VWR(登録商標)]およびReagent Reservoir(VistaLab Technologies)。
撹拌(RPM)、ウェル形状、および実施体積の条件を変化させる範囲を試験するために、研究を実施した。320RPMから360RPMの間の撹拌、丸底(1mLの呼び体積)または角底(2mLの呼び体積)のウェル、および100μLから600μLの間の実施体積の範囲を包含するよう、研究を設計した。細胞培養プロセスランIを実施して、丸底深型ウェルプレート(1mLの呼び体積)の稼働条件のベースを決定した。細胞培養プロセスランIIを実施して、丸底深型ウェルプレートの高密度細胞培養支持能を決定し
た。細胞培養プロセスランIIIを実施して、設計の最適化に用いるパラメータ範囲を確定すると共に、Applikon MicroFlask微量測定プレートクランピングデバイス(Applikon Biotechnology,Inc.、フォスターシティ、カリフォルニア州)を、滅菌済みの微孔性膜シール(AeraSeal、Phenix Research Products、キャンドラー、ノースカロライナ州)と比較した。モデルの最適化を目的として、細胞培養プロセスランIVおよびVを設計した。
VPR:体積当たり生産速度(U/L/d)
力価:rhα-Gal活性(U/L)
SPR:比生産速度(U/E9細胞/d)
Xv:生細胞計測数(E6細胞/mL)
IVCD:累積生細胞密度(細胞-d/mL)
T:時間(日)
血球計算盤およびカバースリップを、イソプロピルアルコール(IPA)で清掃した。カバースリップの隅をIPAで湿らせ、血球計算器に貼り付けた。細胞試料を、0.4%トリパンブルーと1:1で均一に混合した。10μLのアリコートを血球計算盤に移した。大きい方の外側の4つの正方形で細胞を計数した:外側の大きな正方形のそれぞれは、16個のさらに小さな正方形の格子を含んでいた。大きい方の正方形の境界上にある細胞を、4辺のうち2辺についてのみ計数した。着色していない細胞を生きたものとして計数すると共に、青で染色されたものを死んだものとみなした。下記の数式4および5を使用して、生存率および生細胞密度を算出した。
細胞試料を0.2%トリパンブルーと1:1で均一に混合した。20μLの混合液のアリコートを、装置専用のスライドに移した。装置に組み入れられたデジタルカメラによって取り込まれた4つのイメージで、細胞を計数した。着色していない細胞を生きたものとして計数すると共に、青で染色されたものを死んだものとみなした。
JMPソフトウェアを使用して、統計解析を実施した。使用した応答は、最大化された望ましさを伴うピーク生細胞密度(VCDまたはXV)および体積当たり生産速度(VPR)であった。効果スクリーニングレポートを用いて、「Fit Model」機能によって統計モデルを評価した。「Sorted Parameter Estimates
」によって、t検定により統計的に決定された応答変量を有意にもたらす要素が報告された。最後に、「Prediction Profiler」によって、応答変量に関するパラメータの効果の独立傾向がプロットされ、そのモデルを使用し、望ましさ関数を最大化することによって、最良の条件が予測された。
細胞培養プロセスランI
この実験では、バイアルの解凍後27日目に、rhα-Gal CHO細胞株(CD CHO培地中)を使用して、3つの異なる条件下で(表6)ベッセルに接種した。細胞培養増殖のプロファイルを11日間にわたって追跡した。
丸底(1mL)96ウェル深型プレートで細胞を培養するのに使用する灌流速度を最適化するために、一連の実験を実施した。これらの実験では、CD CHO培地中のrhα-Gal細胞(バイアルの解凍後30日目)を使用して、丸底96ウェル深型プレートのウェルおよび振盪チューブに接種した(表7に記載の通り)。細胞培養の実績を、11日間バッチ再供給プロセスにて評価した。
丸底96ウェル深型プレートで細胞を培養するのに使用する再供給割合を最適化するために、一連の実験を実施した。これらの実験を、1mL丸底および2mL角底の両方の96ウェル深型プレート、ならびに図9に示す修正した再供給割合プロトコールを使用して実施した。バイアルの解凍後8日目に、CD CHO培養培地中のrhα-Gal細胞を使用して、深型ウェルプレートと振盪チューブの両方のタイプに接種した(表8を参照されたい)。角底96ウェル深型培養は、300μLまたは500μLの培養体積を含有し、一方、丸底96ウェル深型培養は、200μLまたは300μLの培養体積を含有した(1mL呼び体積)。Applikonシステムを使用するか、またはAeraSeal膜を使用するかのどちらかで、ウェルを密封した。96ウェル深型プレート培養の全てを、330RPMまたは360RPのどちらかで撹拌した。細胞培養の成長を9日間にわたって測定した。96ウェル深型プレート培養についての全ての生細胞の計数を、3連のウェルで計数し、平均した。
状の培養が、14日を超えて増殖を続け、20日目に細胞50×106個/mL(角底)および細胞17×106個/mL(丸底)の生細胞密度に到達した(図12および13)。これらのデータは、丸底96ウェル深型プレートが、高い細胞密度を支持することが可能であるということを示す。
角底96ウェル深型プレート(2mL呼び体積)での細胞成長を最適化するために、追加の一連の実験を実施した。これらの実験では、バイアルの解凍後1日目に、CD CHO培養培地中の細胞を使用して、角底96ウェル深型プレートおよび振盪チューブに接種した(n=3)(表9を参照されたい)。これらの実験に使用した培養体積は、300μLまたは500μLであり、培養物を、320RPM、330RPM、または340RPMで撹拌した。培養における細胞成長を14日間にわたって評価した。培養についての生細胞の計数の全ては、3連のウェルから計数し平均した。
4に示す。全ての試験条件について、7日目まで同様の成長プロファイルが示された。500μLの培養体積を有し、かつ320RPMまたは330RPMで撹拌された角底96ウェル深型プレート培養は、7日後に、さらに良好な細胞成長を示した。試験された全ての培養条件で、13日目を過ぎても増殖が続き、細胞30×106個/mLから細胞35×106個/mLの生細胞密度に到達したが、さらに良好な成長の実績があった2つの培養条件では、細胞40×106個/mL超の生細胞密度に到達した。500μLの培養体積および320RPMまたは330RPMの撹拌速度を有する角底96ウェル深型プレート培養で達成された生細胞密度は、12日目後に、同じ細胞株の振盪チューブでの培養で従来観察された生細胞密度を凌いだ(1標準偏差以内にある)。培養12日目まで、500μLの培養体積および320RPMまたは330RPMの撹拌速度を有する角底96ウェル深型プレート培養と、振盪チューブ培養とに、同様の成長パターンが観察された。
細胞培養の稼働条件を最適化するために、さらに一連の実験を実施した(上記の実験方法の設計の記載を参照されたい)。これらの実験では、バイアルの解凍後21日目に、CD CHO中の細胞を使用して、角底もしくは丸底のどちらかの96ウェル深型プレート、または振盪チューブに接種した。各試験培養の稼働条件を表10に示す。試験した96ウェル深型プレートのそれぞれを、AeraSealディスポーザブル膜で覆った。振盪チューブ培養を対照(n=4)として用立てた:2本の振盪チューブ培養のセットは、対照の再供給スケジュールに従い、別の2本の振盪チューブ培養のセットは、96ウェル深型プレートで使用される修正した再供給割合に従った(図9に図示した)。全ての条件を2連で試験した。9日間バッチ再供給プロセスにて細胞成長を評価した。
た100μL培養では細胞20×106個/mLであった。角底96ウェル深型プレート培養は、細胞40×106個/mLに近いピーク生細胞密度を有する対照の振盪チューブ培養と比べて、それに匹敵する生細胞密度を有した(1標準偏差以内)(上記に記載の修正した再供給割合を使用した場合)。最も良好な角底96ウェル深型細胞培養の実績は、400μLの培養体積と320RPMまたは340RPMの撹拌を使用して達成され、15日目におよそ細胞50×106個/mLのピーク生細胞密度に達した。さらに、600μLの培養体積および340RPMの撹拌を有する角底96ウェル深型によって、13日目に細胞27×106個/mLもの細胞成長がもたらされ、また、細胞31×106個/mLのピーク生細胞密度に到達するという振盪チューブ対照培養(対照の再供給割合)に匹敵する結果が生じた。全ての試験培養で、85%超の生細胞率が維持された。振盪チューブの対照培養と96ウェル深型培養との累積生細胞密度の比較を図17および18に示す。
本明細書に記載の深型96ウェル培養方法を使用して、様々に異なる組織培養を試験するために、さらに別の一連の実験を実施した。これらの実験では、モノクローナル抗体を生産する組換え哺乳動物細胞株(mAb生産細胞)または酵素を生産する組換え哺乳動物細胞株(酵素生産細胞)を使用して、角底96ウェル深型プレートに接種し、500μLの1つまたは少なくとも102通りの異なる組織培養培地中で、330RPMで撹拌しながら、細胞を1週間培養した。これらの実験の対照は、同じ96ウェル深型プレート、同じ培養培地、試料細胞株、およびCD CHO培地を使用して達成される生細胞密度であった。7日間にわたって、培養の生細胞密度と力価との両方を測定した。
本発明が、その詳細な記載と併せて記載されている一方で、前述の記載は、説明を意図するものであって、添付の特許請求の範囲によって規定される、本発明の範囲を限定することを意図しないことが理解されよう。別の態様、利点および修正は、以下の特許請求の範囲内にある。
Claims (33)
- 第1もしくは第2の液体培養培地中の、または組換えタンパク質をコードする核酸を含有するチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞源中の生物学的夾雑物の存在について試験するための方法であって、
(a)第1の液体培養培地に配置された、組換えタンパク質をコードする核酸を含有するCHO細胞を含む少なくとも1つのウェルを含むマルチウェルプレートを用意する工程であって、該第1の液体培養培地は該ウェルの体積の5%~70%を占める工程と;
(b)ある期間、31℃~40℃で、320回転毎分(RPM)~500RPMの回転撹拌をしながら、該マルチウェルプレートをインキュベートする工程と;
(c)連続的にまたは定期的に、該期間中に、該第1の体積の第1の液体培養培地を除去し、第2の体積の第2の液体培養培地を該第1の液体培養培地に添加する工程であって、該第1および第2の体積は等しく、第1の体積の第1の液体培養培地はCHO細胞を実質的に含まない工程と;
(d)該CHO細胞または該第1および/もしくは第2の液体培養培地中の該組換えタンパク質を検出する工程と;
(e)該CHO細胞または該第1および/もしくは第2の液体培養培地中に存在する組換えタンパク質の第1の量を、工程(a)~(d)で使用された第1もしくは第2の液体培養培地と異なる第1もしくは第2の液体培養培地、または工程(a)~(d)で使用されたCHO細胞源と異なるCHO細胞源のうちの1つまたはそれ以上を使用する異なる方法によって生成される組換えタンパク質の第2の量と比較する工程と;
(f)組換えタンパク質の第1の量が組換えタンパク質の第2の量未満の場合、工程(a)~(d)で使用された第1もしくは第2の液体培養培地、または工程(a)~(d)で使用されたCHO細胞源を生物学的夾雑物を含有すると断定する工程
を含み、
生物学的夾雑物は、マイコバクテリウム、真菌、ウイルスおよび望ましくない哺乳動物細胞からなる群より選択される、前記方法。 - マルチウェルプレートは、6ウェルプレート、12ウェルプレート、24ウェルプレート、48ウェルプレート、または96ウェルプレートである、請求項1に記載の方法。
- マルチウェルプレートは、深型ウェルプレートである、請求項1に記載の方法。
- ウェルの底の直径は、6.0mm~35mmの間である、請求項1に記載の方法。
- ウェルの高さは、12mm~50mmである、請求項1に記載の方法。
- ウェルは、第1の液体培養培地の1mL~18mLの体積を有する、請求項1に記載の方法。
- ウェルは、1mL~7mLの間の体積を有する、請求項6に記載の方法。
- ウェルは、1mL~3.5mLの間の体積を有する、請求項7に記載の方法。
- 工程(a)におけるCHO細胞は、第1の液体培養培地150μL~15mLに浮遊している、請求項1に記載の方法。
- 工程(a)におけるCHO細胞は、第1の液体培養培地150μL~10mLに浮遊している、請求項9に記載の方法。
- 工程(a)におけるCHO細胞は、第1の液体培養培地150μL~1mLに浮遊している、請求項10に記載の方法。
- 工程(a)における第1の液体培養培地は、ウェルの体積の10%~60%を占める、請求項1に記載の方法。
- 回転撹拌は、320RPM~400RPMである、請求項1に記載の方法。
- 工程(a)~(d)における第1の液体培養培地および/または第2の液体培養培地は:既知組成液体培養培地、無血清液体培養培地、血清含有液体培養培地、動物由来成分不含液体培養培地、およびタンパク質不含液体培養培地からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- マルチウェルプレートは、ガス透過性ディスポーザブル膜で密封される、請求項1に記載の方法。
- マルチウェルプレートは、ガス透過性シリコーン層で密封される、請求項1に記載の方法。
- ウェルは平底を有する、請求項1に記載の方法。
- ウェルは丸底を有する、請求項1に記載の方法。
- 工程(c)において、期間の最初の24~48時間後、24時間ごとに、除去される第1の液体培養培地の第1の体積および添加される第2の液体培養培地の第2の体積は、該第1の液体培養培地の体積の30%~150%である、請求項1に記載の方法。
- 工程(c)において、撹拌は、第1の体積の第1の液体培養培地を除去する前に少なくとも30秒の期間、停止される、請求項1に記載の方法。
- 蒸発に起因する第1の液体培養培地の体積の減少を相殺するために、工程(c)においてさらなる体積の第2の液体培養培地を複数のウェルの各々に定期的に添加する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(c)における、第1の体積の第1の液体培養培地の除去と、第2の体積の第2の液体培養培地の該第1の液体培養培地への添加は、自動デバイスを使用して行われる、請求項1に記載の方法。
- 工程(c)における第1の体積の第1の液体培養培地の除去と第2の体積の第2の液体培養培地の添加は同時に行われる、請求項1に記載の方法。
- 工程(c)における第1の体積の第1の液体培養培地の除去と第2の体積の第2の液体培養培地の添加は連続的に行われる、請求項1に記載の方法。
- 工程(c)における第1の体積の第1の液体培養培地の除去と第2の体積の第2の液体培養培地の添加は定期的に行われる、請求項1に記載の方法。
- 工程(c)における第1の液体培養培地の第1の体積および添加される第2の液体培養培地の第2の体積は経時的に増加される、請求項1に記載の方法。
- マルチウェルプレートは、7日より長い期間インキュベートされ、インキュベーション1~3日目に、24時間ごとに、工程(c)において除去される第1の液体培養培地の第1の体積および添加される第2の液体培養培地の第2の体積は、該第1の液体培養培地の体積の30%~50%の間であり;
インキュベーション4~6日目に、24時間ごとに、工程(c)において除去される第1の液体培養培地の第1の体積および添加される第2の液体培養培地の第2の体積は、該第1の液体培養培地の体積の40%~70%の間であり;
インキュベーション7日目以降に、24時間ごとに、工程(c)において除去される第1の液体培養培地の第1の体積および添加される第2の液体培養培地の第2の体積は、該第1の液体培養培地の体積の90%~150%である、
請求項1に記載の方法。 - 組換えタンパク質は、免疫グロブリンである、請求項1に記載の方法。
- 組換えタンパク質は、酵素である、請求項1に記載の方法。
- 酵素は、ガラクトシダーゼである、請求項29に記載の方法。
- ガラクトシダーゼは、アルファ-ガラクトシダーゼである、請求項30に記載の方法。
- 組換えタンパク質は、成長因子、タンパク質断片、または工学操作されたタンパク質である、請求項1に記載の方法。
- ウェル中、細胞15x106個/mL~細胞60x106個/mLの間の生細胞密度をもたらす、請求項1に記載の方法。
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