BR112012000242B1 - Métodos para cultivo em batelada de células eucariontes - Google Patents

Métodos para cultivo em batelada de células eucariontes Download PDF

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Abstract

métodos para cultivo em batelada de células eucariontes a presente invenção se refere a um aparelho e método para manter o ph dentro de uma faixa condutiva para crescimento celular em um sistema de cultura celular contendo bicarbonato sem a adição de base. o método é baseado nas características de transferência de gás do sistema biorreator para modular a transferência de co2 para e a partir da cultura celular, de modo que o ph da cultura celular possa ser mantido dentro de uma faixa desejada.

Description

“MÉTODOS PARA CULTIVO EM BATELADA DE CÉLULAS EUCARIONTES” [001] Este pedido reivindica benefício ao pedido provisório de patente US 61/223.313, depositado em 6 de julho de 2009, que é integralmente incorporado ao presente pedido como referência.
Campo da Invenção [002] A presente invenção refere-se a um aparelho e método para cultivar células eucariontes em um meio contendo bicarbonato que permite a manutenção do pH da cultura celular sem a adição de bases diretamente ao meio de cultura.
Antecedentes da Invenção [003] A cultura de células para bancos de células, para a produção de produtos celulares, como a produção de proteína recombinante é dificultada pela mudança das condições nas quais as células crescem. Embora biorreatores de aço inoxidável sejam muitas vezes utilizados para a produção de células, descartáveis são cada vez mais utilizados em todos os estágios na produção de produtos biológicos (Rao et al., 2009). No processamento a montante, biorreatores descartáveis oferecem muitas vantagens sobre os seus homólogos de aço inoxidável (que vão desde a redução dos riscos de contaminação cruzada até economia de custo e de tempo). O WAVE Bioreactor™ é um exemplo bem documentado de tecnologia a montante descartável utilizada para a produção de proteína recombinante na indústria biofarmacêutica (Cronin et al., 2007; Haldankar et al., 2006; Ling et al., 2003; Ye et al., 2009).
[004] O sistema WAVE Bioreactor™, desenvolvido por Singh (Singh, 1999), compreende uma câmara de cultura pré-esterilizada, flexível e descartável (Cellbag™), controladores de mistura de CO2 e/ou O2 no ar e uma plataforma com controle pneumático para balanço e aquecimento, Cellbag™. O
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2/45 movimento de balanço gerado por esta plataforma fornece mistura e transferência de gás na Cellbag™.
[005] O sistema WAVE Bioreactor™ pode ser ainda equipado para fornecer pH e monitoramento de oxigênio dissolvido (OD) on-line e controle de comando de retroalimentação em tempo real (Mikola et al., 2007; Tang et al., 2007). No entanto, os dispositivos adicionais necessários, bem como a necessidade de bolsas especialmente projetadas para acomodar as sondas de pH e OD, aumentam o custo e a complexidade operacional do sistema. Além disso, a adição de base necessária para elevar o pH da cultura até o ponto de ajuste definido no biorreator com pH controlado aumenta a osmolalidade da cultura. Dependendo da amplitude do aumento da pressão osmótica no biorreator, a diminuição associada no crescimento e viabilidade celular (deZengotita et al., 2002; Zhu et al., 2005) pode anular os benefícios de controle de pH. Além disso, se houver falha na sonda de pH, as perturbações resultantes no pH podem alterar o metabolismo celular e promover a morte celular (Miller et al., 1988; Osman et al., 2002).
[006] Controles justos de pH e OD podem não ser necessários para aplicações de certas culturas celulares como, por exemplo, a rotina de passagem de células em sistemas de cultura em pequena escala, como frascos agitados e agitadores, para manutenção e expansão celular. Entretanto, pH e OD extremos são prejudiciais para o crescimento e viabilidade celular (Lin etal., 1993; Link et al., 2004; Miller et al., 1988; Osman et al., 2001), e podem afetar a qualidade do produto (Restelli et al., 2006; Yoon et al., 2005). Portanto, é extremamente importante manter algum controle sobre essas condições de crescimento de células para todos os estágios de fabricação de produtos biológicos. Pesquisadores já demonstraram anteriormente o sucesso em cultura de
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3/45 células CHO em uma faixa de pH de 6,8 a 7,3 e na faixa de OD de 10 a 100% de saturação de ar (Link et al. 2004; Restelli et al. 2006; Trummer et al. 2006; Yoon et al. 2005).
[007] As características adicionais de biorreatores convencionais, como monitores de pH em tempo real e controle de monitoramento de OD aumentam significativamente o custo e a intensidade de trabalho de cultura celular na fabricação de produtos biológicos. Além disso, a falha ou funcionamento defeituoso desses recursos pode causar variações inaceitáveis e perda de potencial da cultura celular que tem alto custo de tempo e recursos.
[008] Assim, há uma necessidade de métodos aprimorados para cultura de células eucariontes, sem a necessidade de introdução de bases fortes, e sem monitoramento adicional e controle de pH e OD em tempo real.
Descrição Resumida da Invenção [009] A presente invenção fornece um aparelho e método para manter o pH em um sistema de cultura celular sem a adição de base. Em um meio de cultura celular contendo bicarbonato, a quantidade de CO2 no meio afeta 0 pH do meio, com base no equilíbrio do tampão ácido-bicarbonato (Equação 1):
CO2 + HOH <===> H2CO3 <===> H+ + HCOspH = pK - log([CO2]/[HCO3 ]) [010] Dessa forma, a presente invenção explora essa relação para ajustar 0 pH do meio de cultura celular sem a necessidade de adição de ácidos ou bases fortes, pelo aumento ou diminuição da concentração de CO2 dissolvido usando-se a interface dinâmica de uma fase líquida e fase gasosa de um sistema de cultura celular. A presente invenção fornece um método para alcançar essa modulação e um aparelho para a prática do método.
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4/45 [011] Em geral, o aparelho da presente invenção é fornecido com ar, oxigênio ou uma combinação desses gases para manter o oxigênio dissolvido da cultura celular. Ao fornecer uma mistura de gás (que pode ser manipulado em termos de sua composição e da taxa de introdução) para o espaço vazio do aparelho, o CO2 pode ser tanto adicionado como retirado do meio de cultura celular, dependendo da concentração diferencial de CO2 entre a fase líquida e a fase gasosa. A remoção de CO2 do espaço vazio aumenta 0 pH da cultura, conforme 0 CO2 dissolvido no meio se difunde para fora do espaço vazio. Por outro lado, quando 0 CO2 é adicionado ao aparelho em uma concentração que é maior do que a do meio, 0 CO2 se dissolve no meio e 0 pH da cultura diminui. Esta presente invenção fornece um método que permite a transferência de CO2 para dentro e para fora da cultura celular para manter 0 pH da cultura sem a adição de base.
[012] Dessa forma, a presente invenção fornece um método para cultivar células eucariontes que compreende células eucariontes em um líquido de cultura contendo bicarbonato em um recipiente, em que 0 recipiente possui paredes que encapsulam a cultura celular e um espaço vazio de fase gasosa (gas phase head space) acima da dita cultura celular. O recipiente também compreende pelo menos uma porta que fornece uma entrada e uma saída de gás a partir do dito espaço vazio. O recipiente é agitado para fornecer uma interface dinâmica entre a fase líquida e a fase gasosa. O pH da cultura pode ser monitorado e um gás é fornecido para 0 espaço vazio através da dita porta, em que 0 gás contém uma quantidade de CO2 para causar uma diminuição no pH quanto mais CO2 se dissolve na cultura celular, ou CO2 acumulado é removido do espaço vazio através da porta para causar um aumento no pH da cultura celular. O pH é, dessa forma, mantido em uma faixa pré-determinada.
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5/45 [013] Geralmente, a pressão parcial de CO2 dissolvido no meio de cultura celular é mantida em uma quantidade de 1 a 200 mmHg. Em algumas realizações, a pressão parcial de CO2 dissolvido é de 10 a 180 mmHg. Em algumas realizações, a pressão parcial de CO2 dissolvido é de 20 a 150 mmHg. Em algumas realizações, a pressão parcial de CO2 dissolvido é de 100 a 180 mmHg. Em algumas realizações, a pressão parcial de CO2 dissolvido é de 20 a 80 mmHg. Em algumas realizações, a pressão parcial de CO2 dissolvido é de 30 a 60 mmHg. Em algumas realizações, a pressão parcial de CO2 dissolvido é de 35 a 50 mmHg. Em algumas realizações, a pressão parcial de CO2 dissolvido é de 40 mmHg.
[014] A liberação do espaço vazio pode ser realizada continuamente ou intermitentemente.
[015] Em geral, OD é mantido acima de 10%. Em algumas realizações, OD é mantido acima de 20%. Em algumas realizações, OD é mantido acima de 30%. Em algumas realizações, OD é mantido acima de 40%. Em algumas realizações, OD é mantido acima de 50%. Em algumas realizações, OD é mantido acima de 60%.
[016] Em algumas realizações, a taxa de fluxo de gás dentro do recipiente é de 0,001 do volume do espaço vazio por minuto (hvm). Em algumas realizações, a taxa de fluxo de gás dentro do recipiente é de 0,005 hvm. Em algumas realizações, a taxa de fluxo de gás dentro do recipiente é de 0,01 hvm. Em algumas realizações, a taxa de fluxo de gás dentro do recipiente é de 0,02 hvm. Em algumas realizações, a taxa de fluxo de gás dentro do recipiente é de 0,05 hvm. Em algumas realizações, a taxa de fluxo de gás dentro do recipiente é de 0,1 hvm. Em algumas realizações, a taxa de fluxo de gás dentro do recipiente é de 0,2 hvm. Em algumas realizações, a taxa de fluxo de gás dentro do recipiente é de 0,5 hvm. Em algumas realizações, a taxa de
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6/45 fluxo de gás dentro do recipiente é de 0,9 hvm. Em algumas realizações, a taxa de fluxo de gás dentro do recipiente é de 1,0 hvm.
[017] As células eucariontes podem ser células de vertebrados como, mas não se limitam a células de rãs, coelhos, roedores, carneiros, cabras, cães, gatos, vacas, cavalos, porcos, primatas não humanos, ou seres humanos.
[018] O método pode ser realizado em um recipiente que possui paredes rígidas ou dobráveis, como um reservatório de plástico ou bolsa de cultura descartável.
[019] O recipiente pode ser agitado por qualquer meio que fornece uma interface dinâmica entre a fase líquida e a fase gasosa no recipiente. Essa agitação pode ser, por exemplo, por balanço, movimento orbital, uma figura oito em movimento, movimento de rotação, agitação e similares.
[020] Em algumas realizações, a agitação é realizada por balanço. A velocidade e ângulo de balanço podem ser ajustados para alcançar uma agitação desejada. Em algumas realizações o ângulo de balanço é de 20°, 19°, 18°, 17°, 16°, 15°, 14°, 13°, 12°, 11°, 10°, 9o, 8o, 7o, 6o, 5o, 4o, 3o, 2°ou 1o. Em certas realizações, o ângulo de balanço é entre 6 a 16°. Em outras realizações, o ângulo de balanço é entre 7 a 16°. Em outras realizações, o ângulo de balanço é entre 8 a 12°.
[021] Em algumas realizações, a taxa de balanço é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,1 12, 13, 14 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 rpm. Em outras realizações, a taxa de balanço é entre 19 a 25 rpm. Em algumas realizações, a taxa de balanço é entre 20 a 24 rpm. Em algumas realizações, a taxa de balanço é entre 21 a 23 rpm.
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7/45 [022] O método pode ser realizado no qual o recipiente contém uma única porta que permite a entrada e a saída de gás a partir do espaço vazio da cultura. Alternativamente, o recipiente pode conter uma pluralidade de portas.
[023] O pH da cultura é monitorado tanto continuamente como intermitentemente e o gás é introduzido no espaço vazio de modo que o nível de CO2 do gás no espaço vazio é fornecido tanto para aumentar como para diminuir a concentração de CO2 dissolvido na fase líquida da cultura, de modo que 0 pH da fase líquida é ajustado até um valor pré-determinado.
[024] Em uma realização alternativa, 0 método pode incluir uma etapa de perfusão de meio de cultura fresco dentro da cultura celular através de uma porta de meio. O meio fresco tem um pH que permite 0 ajuste do pH geral da cultura celular mediante adição, de modo que 0 pH do meio fresco é parcialmente mantido na cultura celular em uma faixa de pH pré-determinado. A modulação do pH utilizando meio fresco com um pH pré-determinado é útil no método de cultura, mas não é suficiente para controlar completamente 0 pH.
[025] O método é adaptável para qualquer tamanho de cultura. Em algumas realizações, 0 método é realizado em bolsas de biorreator descartáveis que estão disponíveis comercialmente. Essas bolsas de biorreator descartáveis estão disponíveis em 500 ml, 1 L, 2 L, 10 L, 20 L, 50 L, 100 L, 200 L, 500 Le 1000 L.
[026] Diversos parâmetros da cultura podem ser monitorados e controlados. Esses parâmetros podem ser controlados em um processo automatizado conforme os cálculos são realizados por um computador. Alguns parâmetros que podem ser controlados isoladamente ou em combinação incluem, mas não se limitam a, fluxo de gás, pH, concentração de CO2 dissolvido, temperatura e agitação.
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8/45 [027] A presente invenção também fornece um aparelho para realizar o método da presente invenção.
Breve Descrição das Figuras [028] A Figura 1 mostra um exemplo de um aparelho da invenção que inclui um filtro de perfusão. O aparelho inclui uma porta de entrada e uma porta de saída para gás, uma porta para fornecer meio fresco à cultura, um filtro de perfusão para remover meio usado, um deck de balanço e uma base. O movimento de balanço permite que a agitação forneça transferência suficiente de O2 e CO2 dentro e fora do meio de cultura celular.
[029] A Figura 2 mostra estudos livres de célula para medir transferência de oxigênio no WAVE Bioreactor™. (Painel A) Efeito da taxa de balanço e ângulo de balanço na ki_a na taxa de fluxo de ar de 0,2 l/min; (Painel B) Efeito da taxa de balanço, ângulo de balanço e taxa de fluxo de ar na ki_a; (Painel C) dados de OD bruto para ângulos de balanço diferentes, taxa de balanço e taxa de fluxo de gás constante de 0,2 l/min (também referido no presente pedido como LPM); (Painel D) dados de curso em relação ao tempo de OD bruto para dois pontos estabelecidos de balanço diferentes com diferentes taxas de fluxo de gás.
[030] A Figura 3 mostra estudos livres de célula para avaliar a taxa de transferência de esvaziamento de CO2 no WAVE Bioreactor™. (Painel A); dados de elevação de pH bruto para diferentes ângulos de balanço, taxa de balanço com uma taxa de fluxo de gás constante de 0,2 LPM; (Painel B) dados de curso em relação ao tempo da elevação de pH bruto para dois pontos estabelecidos de balanço diferentes com taxas de fluxo de gás diferentes. (Painel C) taxa calculada de alteração de pH para diferentes condições de balanço mostradas no Painel A; (Painel D) taxa calculada de alteração de pH para diferentes condições de balanço e taxas de fluxo de gás diferentes mostradas no Painel B. As barras cheias são a taxa de alteração no pH para os
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9/45 primeiros 5 minutos e as barras vazias são a taxa calculada de alteração no pH para os próximos 55 minutos.
[031] A Figura 4 mostra (Painel A) VCC, (Painel B) pH off-line, (Painel C) pCO2 off-line , e (Painel D) perfis de OD off-line para culturas em batelada no WAVE Bioreactor™. As condições do processo são mostradas na Tabela 2, abaixo. Apenas o estágio de inoculação foi avaliado para (i) linhagem celular que produz MAb B, apesar de que tanto os estágios de inoculação como aumento de escala (durante os quais o volume aumentou de 6 I até 20 I) terem sido avaliados para (ii) linhagem celular que produz MAb C. Durante cada estágio, o ar bombeado no espaço vazio foi suplementado com CO2 a 8% (v/v) durante 0 primeiro dia, a 5% (v/v) durante 0 segundo dia, e a 2% (v/v) subsequentemente.
[032] A Figura 5 mostra (Painel A) VCC, (Painel B) viabilidade de cultura (Painel C) pH off-line, e (Painel D) concentração de OD para duas culturas de perfusão no WAVE Bioreactor™ usando-se linhagem celular que produz MAb A executado mediante condições não otimizadas. As células foram cultivadas no modo batelada para os primeiros 6 dias e no modo perfusão subsequentemente. Durante 0 cultivo em batelada, 0 volume de trabalho no Cellbag™ foi primeiro inoculado com 6 I de cultura, e no dia 3, este volume de cultura foi aumentado para 25 I pela adição de meio fresco. Durante 0 cultivo de perfusão, 0 volume da cultura foi mantido a 25 I a uma taxa de perfusão de 1 volume por dia. Para este conjunto de experimentos, a taxa de balanço foi de 18 rpm e 0 ângulo de balanço foi de 8 graus, enquanto a taxa de fluxo de ar no espaço vazio foi de 0,2 l/min. Este ar foi suplementado com 5% de CO2 (v/v) para a duração completa da cultura.
[033] A Figura 6 mostra 0 perfil de crescimento da cultura celular e 0 perfil de pH para uma batelada (dias 0 a 6)/processo de perfusão (dias 6 a
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14). (Painel A) volume celular empacotado %PCV; (Painel B) viabilidade celular; (Painel C) perfil de pH; (Painel D) crescimento celular na contagem de célula viável (VCC) medido por ViCell™ AS.
[034] A Figura 7 mostra o desempenho da cultura a partir das variações das taxas de liberação do espaço vazio (hvm). (Painel A) mostra 2 experimentos com uma etapa de aumento no fluxo de ar que ocasiona um aumento na taxa de depuração do espaço vazio (0,1 hvm em (♦) e 0,02 hvm (-A-). A outra estratégia da taxa de depuração do espaço vazio é de muitas etapas de aumento (0,007 hvm até 0,013 hvm até 0,02 hvm) (--) nos dias 10 e
11. (Painel B) a pressão parcial de CO2 dissolvido medida por NOVA BioProfile® 400.
[035] A Figura 8 mostra (Painel A) VCC, (Painel B) viabilidade de cultura (Painel C) pH off-line, e (Painel D) concentração de OD para culturas no WAVE Bioreactor™ de seis linhagens celulares diferentes - cada uma produzindo um MAb diferente - usando-se 0 processo otimizado. Durante cada estágio de inoculação de 6 I, as culturas foram balançadas a 21 rpm, e a taxa de fluxo de ar no espaço vazio foi de 0,2 l/min. O ar foi suplementado com CO2 a 8% (v/v) para 0 primeiro dia, a 5% (v/v) para 0 segundo dia, e a 2% (v/v) subsequentemente. Esta estratégia de fluxo de ar foi repetida para um estágio de aumento de escala de 20 I (dias 3 a 6). Durante 0 cultivo no modo perfusão de 20 I (dia 6 em diante), a taxa de fluxo de ar no espaço vazio foi mantida a 0,6 l/min sem suplementação de CO2, embora a mistura de O2 no ar na entrada de ar tenha sido aumentada de 0% (v/v) até 30% (v/v) no dia 8, e mantida a 30% (v/v) para a duração restante da cultura. A batelada de 20 I e as culturas de perfusão foram balançadas a 23 rpm. O ângulo de balanço para todas as culturas foi constante a 10s.
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11/45 [036] A Figure 9 mostra (Painel A) VCC, (Painel B) viabilidade, (Painel C) pH off-line, e (Painel D) OD off-line para culturas paralelas de linhagem celular que produz MAb E no WAVE Bioreactor™ (·) e biorreator com tanque misturador (□).
Descrição Detalhada da Invenção [037] O técnico no assunto está bem familiarizado com muitos protocolos e métodos para cultivar células eucariontes e podem usar meios de cultura para o mesmo. Esses protocolos e meios de cultura são descritos na literatura e livros como em Animal Cell Culture, A Practical Approach 2- Ed., Rickwood, D. e Hames, B.D., eds., Oxford University Press, Nova York (1992). Métodos de uso geral também estão disponíveis na internet como em: protocolonline.org/prot/Cell_Biology/Cell_Culture. Meio de cultura celular também está disponível comercialmente a partir de uma variedade de fontes bem conhecidas. Toda literatura citada no presente pedido é incorporada como referência.
Definições [038] As técnicas e procedimentos de cultura celular em geral descritas ou mencionadas no presente pedido são bem compreendidas e comumente empregadas usando-se metodologia convencional por técnicos no assunto. Como apropriado, os procedimentos que envolvem o uso de kits e reagentes comercialmente disponíveis são geralmente realizados de acordo com os protocolos e/ou parâmetros definidos pelo fabricante a menos que apontado de outra forma.
[039] Antes dos métodos presentes serem descritos, deve ser entendido que esta invenção não está limitada à metodologia específica, protocolos, linhagens celulares, espécies ou gêneros animais, constructos e reagentes como descritos, podem, é claro, variar. Deve ser entendido que a terminologia usada no presente pedido é para os propósitos de descrever
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12/45 somente realizações específicas, e não tem a intenção de limitar o escopo da presente invenção que será limitada somente pelas reivindicações anexas.
[040] Deve ser apontado que como usado no presente pedido e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “e”, e “o/a” incluem os referentes plurais, a menos que o contexto dite claramente de outra forma. Todos os números recitados na especificação e reivindicações associadas (por exemplo, 1 a 200 mm de Hg, etc.) são entendidos serem modificados pelo termo “cerca de”.
[041] Todas as publicações mencionadas no presente pedido são incorporadas ao presente pedido como referência para divulgação e descrevem os métodos e/ou materiais em conexão com os quais as publicações são citadas. As publicações citadas no presente pedido são citadas para suas divulgações anteriores para a data do depósito do presente pedido. Nada aqui é para ser construído como uma admissão de que os inventores não são designados para preceder as publicações em virtude de uma data de prioridade anterior ou data anterior da invenção. Além disso, as datas de publicação atuais podem ser diferentes daquelas mostradas e requerem verificação independente.
[042] Como usado no presente pedido, “cerca de” refere-se a um valor que é mais ou menos 10% de um valor declarado.
[043] Como usado no presente pedido, “agitar” refere-se à perturbação de modo que a fase líquida da cultura seja uma interação dinâmica com a fase gasosa acima da cultura. Agitar pode se referir a um movimento, como agitação, movimentar, balançar, agitação orbital, rotação, agitação em forma de oito ou qualquer meio para fazer a fase líquida não estática e aumentar a difusão de gases dentro e fora da fase líquida.
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13/45 [044] Como usado no presente pedido, “gás” ou refere-se a um gás puro ou a uma mistura de gases que pode incluir nitrogênio, oxigênio e dióxido de carbono. Tipicamente, o nitrogênio está presente em uma quantidade de cerca de 60 a 90% da concentração total de gás, o oxigênio está presente em uma quantidade de cerca de 10 a 40% da concentração total de gás e o dióxido de carbono está presente em uma quantidade de cerca de 0 a 50% da concentração total de gás.
[045] Como usado no presente pedido, “líquido de cultura celular que contém bicarbonato” refere-se a um meio de cultura adequado para a cultura de células eucariontes que contém como parte de sua composição, um sistema tamponante de bicarbonato. O meio também pode conter agentes tamponantes adicionais, como HEPES ou MOPS ou semelhante, mas também deve conter um sistema baseado em bicarbonato.
[046] Como usado no presente pedido, “cultura celular” refere-se a uma preparação líquida que contém células eucariontes em um meio líquido contendo agentes tamponantes e nutrientes necessários para o crescimento e/ou manutenção de células viáveis.
[047] Como usado no presente pedido, “concentração de CO2 dissolvido” é expressa pela mediçáo relativa da pressáo parcial de CO2 em mm de Hg. Portanto, a pressáo parcial de CO2 dissolvido é utilizada como um reflexo da concentração de CO2 dissolvido.
[048] “DO” refere-se ao oxigênio dissolvido.
[049] Como usado no presente pedido, “interface dinâmica” refere-se a uma troca ativa aprimorada de gases entre a fase líquida e a fase gasosa fornecida pela agitação da cultura celular.
[050] Como usado no presente pedido, “células eucariontes” referem-se a células de animais que podem ser células de invertebrados ou vertebrados.
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14/45 [051] Como usado no presente pedido, “espaço vazio” (head space) refere-se a uma fase gasosa acima da fase líquida da cultura celular com o recipiente utilizado para cultura de células.
[052] Como usado no presente pedido, hvm refere-se ao volume do espaço vazio por minuto e indica a taxa na qual o gás no espaço vazio é liberado.
[053] ki_a refere-se ao coeficiente de transferência volumétrica de oxigênio.
[054] ki_aCO2 refere-se ao coeficiente de transferência volumétrica de dióxido de carbono.
[055] LPM refere-se aos litros por minuto de fluxo de gás.
[056] Como usado no presente pedido, “modular” refere-se à execução de um aumento ou diminuição em um valor.
[057] Como usado no presente pedido, “monitorar” refere-se ao acompanhamento de um valor específico por amostragem e análise para determinar esse valor tanto de forma intermitente como contínua.
[058] pCO2 refere-se a pressão parcial de concentração de CO2 dissolvida.
[059] Como usado no presente pedido, “porta” refere-se a um ponto de acesso a outra forma de sistema fechado.
[060] Como usado no presente pedido, “pré-determinado” referese a um valor previamente selecionado para um determinado parâmetro que é utilizado como um valor objetivo.
[061] Como usado no presente pedido, “rpm” refere-se a balanços por minuto.
[062] VCC refere-se a concentração de células viáveis.
[063] Como usado no presente pedido, “recipiente” refere-se a um reservatório. Como usado no presente pedido, tal recipiente pode ser, por
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15/45 exemplo, um frasco, biorreator, bolsa de biorreator descartável, câmara de cultura e similares.
[064] Como usado no presente pedido, “wm” refere-se ao volume do recipiente por minuto.
Aspectos Teóricos
Transferência de O2 em Cultura WAVE Bioreactor™ [065] Para determinar a taxa de transferência de O2 no WAVE Bioreactor™, assumimos um tempo de resposta suficientemente rápido para a sonda de OD on-line, mistura ideal na Cellbag™ e dominação de resistência de transferência de massa pela interface da fase líquida. Sob essas suposições, a seguinte equação de balanço de massa aproximaria a taxa de transferência de O2 da fase gasosa para a fase líquida:
^^ = kLa»(02 *-O2) dt (1) onde O2* é a concentração de OD saturado no meio e O2 é a concentração de
OD no meio. Pegando O2 para ser zero no tempo zero, a equação produziria:
= kLa · t (2) ln
O *-0
Plotando v 2 2' como uma função de tempo, a inclinação da linha de melhor ajuste forneceria 0 kLa para 0 sistema.
[066] Para aumentar a taxa de transferência de O2 no WAVE Bioreactor™ (equação 1), podemos tanto aumentar 0 kLa para 0 sistema como aumentar 0 gradiente de concentração (O2* - O2), como aumentar ambos. Para aumentar 0 kLa para 0 sistema WAVE Bioreactor™, poderiamos aumentar a taxa de balanço, 0 ângulo de balanço, ou a taxa de fluxo de ar (Mikola, 2007; Singh, 1999). Para aumentar 0 gradiente de concentração (O2* - O2) que fornece a força motriz para a transferência de O2 a partir do gás para a fase
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16/45 líquida, poderiamos aumentar a porcentagem de O2 na entrada de gás para aumentar O2*.
Transferência de CO2 em Cultivo no WAVE Bioreactor™ [067] Em um modelo simplificado, CO2 (CO2(g)) gasoso na
Cellbag™ existe em equilíbrio com 0 CO2 dissolvido (CO2(aq)) no meio de cultura:
CÜ2(g) <-> CO2(aq) (3) [068] O CO2(aq) um por um existe em equilíbrio com ácido carbônico (H2CO3), que pode se dissociar em bicabornato (HCO3 ):
H2O + CO2(aq) θ H2CO3 θ HCO3· + H+ (4) [069] Além disso, a dissociação do HCO3· em carbonato (CO32 ) deve ser insignificante na variação de pH 4 a 8 (Royce e Thornhill, 1991).
[070] A etapa de taxa limitante para a evolução de CO2 a partir do meio de cultura deve ser a transferência de massa gás líquida (equação 3). Assumindo que a concentração de CO2 no líquido na interface está em equilíbrio com 0 gás a granel, a equação de balanço de massa a seguir aproximaria a taxa de transferência de CO2 a partir da fase líquida para a fase gasosa:
r C<?2 onde 1 é 0 coeficiente de transferência volumétrica de dióxido de carbono dissolvido.
[071] Sem uma sonda de CO2 dissolvida no WAVE Bioreactor™, não poderiamos fazer medições de CO2 em tempo real para calcular diretamente a taxa de transferência de CO2(aq). No entanto, com base em nosso conhecimento do sistema tamponante de bicarbonato em nosso meio de cultura, esperamos retirada de CO2 para aumentar 0 pH da cultura, porque 0 equilíbrio nas equações 3 e 4 se deslocaria para a esquerda. Assumindo um
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17/45 tempo de resposta suficientemente rápido para a sonda de pH on-line, o perfil de pH que gera um estudo de transferência de CO2(aq) dinâmica deve fornecer uma estimativa indireta da taxa de retirada de CO2(aq).
[072] Para aumentar o pH da cultura, poderiamos aumentar a taxa de retirada de CO2 no WAVE Bioreactor™ (equação 5) tanto por aumento do ki_aC02 para 0 sistema, como por aumento da força motriz (CO2(aq) - CO2(g)) para a transferência de CO2, ou aumentando ambos. Especificamente, para aumentar ' para 0 sistema WAVE Bioreactor™, poderiamos aumentar a taxa de balanço e 0 ângulo de balanço. Para aumentar a força motriz (CO2(aq) CO2(g)), poderiamos diminuir a porcentagem de CO2 na entrada de gás para diminuir CO2(g). Consequentemente, com a lei de Henry, a pressão parcial de CO2(g) (pCO2(g)) no espaço vazio da Cellbag™ limitaria a concentração de
CO2(aq) no meio:
CO
2{aq) (6) onde H = constante da lei de Henry para CO2.
[073] Por outro lado, para diminuir 0 pH da cultura, poderiamos aumentar a concentração de CO2 (g) na entrada de gás para aumentar CO2(aq) e através disso mudar 0 equilíbrio na equação 4 para a direita.
Método da Presente Invenção [074] No método da invenção, as células eucariontes são cultivadas em um meio e temperatura de cultura adequados para permitir a viabilidade das células. Como é conhecido na técnica, diferentes tipos de células podem ser cultivadas em diferentes meios. O técnico no assunto pode facilmente escolher qual 0 meio é mais adequado para um tipo específico de célula e/ou aplicação específica. No método da invenção, 0 meio deve conter um sistema tamponante de bicarbonato de forma a permitir a modulação do pH por CO2. O meio pode conter agentes adicionais que atuam como um tampão.
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18/45 [075] As células eucariontes que podem ser usadas no método da invenção incluem células animais, que podem ser invertebrados, bem como células de vertebrados. Células de invertebrados incluem células de inseto (por exemplo, células de Spodoptera frugiperda, Bombyx mori e Tríchoplusia ni). Células de vertebrados incluem células de mamíferos e não mamíferos. Células de vertebrados incluem, mas não se limitam a, células de sapos (por exemplo, Xenopus laevis), lagomorfos (por exemplo, coelho e lebres), roedores (por exemplo, ratos, hamsters, Meriones persicus, gerbils e camundongos), gatos, cães, carneiros, bovinos, cabras, porcos, cavalos, primatas não humanos e humanos.
[076] As células usadas no método da invenção podem ser células recombinantes ou não recombinantes. Células recombinantes podem incluir células elaboradas geneticamente para expressar proteínas específicas (como células com estabilidade ou transitoriamente transfectadas) ou células elaboradas geneticamente para produzir RNAs específicos (por exemplo, siRNA, ribozimas, e seus semelhantes).
[077] As células no meio apropriado são colocadas dentro do recipiente de cultura e gás e é infundida no espaço vazio. Em algumas realizações, a taxa de depuração do espaço vazio está dentro de uma faixa de cerca de 0,002 a 0,1 hvm. Em algumas realizações, a taxa de depuração do espaço vazio está dentro de uma faixa de cerca de 0,007 a 0,08 hvm. Em algumas realizações, a taxa de depuração do espaço vazio está dentro de uma faixa de cerca de 0,009 a 0,06 hvm. Em algumas realizações, a taxa de depuração do espaço vazio está dentro de uma faixa de cerca de 0,01 a 0,04 hvm. Em algumas realizações, a taxa de depuração do espaço vazio está dentro de uma faixa de cerca de 0,02 a 0,03 hvm. Em ainda outras realizações, a taxa de depuração do espaço vazio está dentro de uma faixa de cerca de 0,009 a 0,024 hvm. Em realizações adicionais, a taxa de depuração do espaço
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19/45 vazio está dentro de uma faixa de cerca de 0,007 a 0,02 hvm. O “hvm” é a relação de taxa de fluxo volumétrico de gás (l/min) e o volume do espaço vazio (D[078] Em algumas realizações, por exemplo, em uma bolsa WAVE Bioreactor™ de 50 I, com um volume de cultura de 20 I e um volume de espaço vazio de 30 I, a taxa de fluxo de gás dentro do recipiente é de 0,1 l/min a 1 l/min. Em algumas realizações, a taxa de fluxo de gás dentro da bolsa é de 0,2 l/min. Em algumas realizações, a taxa de fluxo é de 0,3 l/min. Em algumas realizações, a taxa de fluxo de gás é de 0,4 l/min. Em ainda outras realizações, a taxa de fluxo de gás é de 0,5 l/min. Em outras realizações, a taxa de fluxo de gás é de 0,6 l/min. Em outras realizações, a taxa de fluxo de gás é de 0,7 l/min. Em ainda outras realizações, a taxa de fluxo é de 0,8 l/min. Em outras realizações, a taxa de fluxo é de 0,9 l/min.
[079] Em geral, a cultura celular deve ser mantida dentro de uma faixa de cerca de 6 a 8. Em algumas realizações, o pH é mantido dentro de uma faixa de cerca de 6,6 a 7,6. Em algumas realizações, o pH é mantido dentro de uma faixa de cerca de 6,9 a 7,5. Em algumas realizações, o pH é mantido dentro de uma faixa de cerca de 6,8 a 7,2. Em algumas realizações, o pH é mantido dentro de uma faixa de cerca de 7,0 a 7,3. Enquanto o método da invenção não requer monitoramento de pH para manter um pH que é propício para o crescimento das células em cultura, em algumas realizações do método da invenção, o pH da cultura pode ser monitorado (de forma intermitente ou contínua). A medição pode ser tomada in situ ou fora do ambiente natural.
[080] Em algumas realizações do método da invenção, o OD é mantido acima de 10%. Em outras realizações, o OD é mantido acima de 20%. Em outras realizações, o OD é mantido acima de 30%. Em outras realizações, o OD é mantido acima de 40%. Em outras realizações, o OD é mantido acima de 50%. Em outras realizações, o OD é mantido acima de 60%. Em outras
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20/45 realizações, o OD é mantido acima de 70%. Em outras realizações, o OD é mantido acima de 80%. Em outras realizações, o OD é mantido acima de 90%.
[081] O monitoramento da concentração de CO2 em meio líquido é bem conhecida na técnica e pode ser realizada usando-se tecnologia disponível comercialmente. A medição pode ser tomada in situ ou fora do ambiente natural.
[082] Em uma realização ilustrativa específica do método da presente invenção, um processo em batelada é usado, sendo que as células são cultivadas de modo escalonado. Nesse método um sistema WAVE Bioreactor™ com bolsa de 50 I é usado com um volume de trabalho de 20 I de cultura em que 0 espaço vazio é infundido com gás suplementado com 8% de CO2 (v/v) de gás durante 0 primeiro dia, 5% de gás CO2 (v/v) no segundo dia e 2% de CO2 (v/v) de gás subsequentemente. O WAVE Bioreactor™ é balançado a 21 rpm a 10s e 0,2 l/min para a inoculação e em seguida a 23 rpm, 10s de ângulo de balanço e 0,2 l/min para a etapa de aumento da escala. Nesse arranjo, não é necessário monitorar 0 pH a medida que 0 pH será mantido pelos parâmetros utilizados.
[083] Em uma realização específica ilustrativa do método da presente invenção, é utilizado um processo de perfusão. Nesse método, um WAVE Bioreactor™ com bolsa de 50 I é usado com um volume de trabalho de 20 I de cultura. A bolsa é infundida com gás que é suplementado com 30% de O2 (v/v), dois dias após 0 início da perfusão. A taxa de fluxo de gás é aumentada passo a passo de 0,2 l/min no dia 0, e depois aumentada para 0,4 l/min no dia 3, e depois aumentada para 0,6 l/min no dia 6. Nesse arranjo, não é necessário monitorar 0 pH a medida que 0 pH será mantido pelos parâmetros utilizados.
[084] Em outra realização ilustrativa específica do método da presente invenção, é utilizado um processo de perfusão. Nesse método, um
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WAVE Bioreactor™ com bolsa de 50 I é usado com um volume de trabalho de 20 I de cultura. A bolsa é infundida com gás que é suplementado com 30% de O2 (v/v, dois dias após 0 início da perfusão. A taxa de fluxo de gás é mantida a uma taxa de fluxo constante de 0,6 l/min. Nesse arranjo, não é necessário monitorar 0 pH a medida que 0 pH será mantido pelos parâmetros utilizados.
[085] Em ainda outra realização ilustrativa específica do método da invenção, é utilizado um processo de perfusão. Nesse método, um WAVE Bioreactor™ com bolsa de 50 I é usado com um volume de trabalho de 20 I de cultura. A bolsa é infundida com gás que é suplementado com 30% de O2 (v/v), dois dias após 0 início da perfusão. A taxa de fluxo de gás é mantida a uma taxa de fluxo constante de 1,0 l/min. Nesse arranjo, não é necessário monitorar 0 pH a medida que 0 pH será mantido pelos parâmetros utilizados.
[086] Será evidente para um técnico no assunto que os parâmetros das condições de cultura (concentrações de gás, taxas de fluxo, hvm, taxa de balanço, ângulos de balanço, etc.) podem ser ajustados usandose os ensinamentos do presente pedido para conseguir um pH com 0 intervalo desejado.
Aparelho [087] O recipiente para conter 0 meio de cultura celular não se limita a qualquer tamanho específico. O recipiente da presente invenção pode ser adaptado ao tamanho de biorreatores e bolsas de cultura descartáveis frequentemente usados conforme utilizado na técnica e pode ser adaptado para as culturas maiores ou menores.
[088] O recipiente não se limita ao material usado para criar 0 recipiente. O recipiente pode ser feito de um material sólido, como vidro ou plástico rígido, ou pode ser feito de um material dobrável como um plástico
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22/45 macio assim como aquele usado para produzir bolsas de biorreator descartáveis.
[089] O recipiente pode opcionalmente conter defletores para aumentar a turbulência do meio quando agitado.
[090] O recipiente pode ser equipado com uma ou mais portas para permitir a adição ou remoção de gases e líquidos. O gás pode ser carregado no espaço vazio e removido do espaço vazio através de uma ou mais portas. Em uma realização, existe uma única porta que permite tanto a entrada como a saída de gás. Em outras realizações existem duas portas: uma para entrada de gás e uma para saída de gás. Em outras realizações, uma pluralidade de portas é utilizada para permitir a entrada e saída de gás.
[091] Em algumas realizações, o aparelho também pode compreender um monitor de pH que continuamente ou intermitentemente monitora o pH do meio de cultura celular. O monitor de pH pode ser usado na comunicação com um sistema automatizado para inserir gás ou retirar gás do espaço vazio do recipiente para alterar a concentração de CO2 e, através disso, ajustar 0 pH do meio de cultura celular.
[092] Em algumas realizações, 0 aparelho da invenção compreende um monitor de CO2 que monitora continuamente ou intermitentemente a pressão parcial de CO2 dissolvido conforme uma indicação da concentração de CO2 no meio. O monitor de CO2 pode ser usado na comunicação com um sistema automatizado para inserir gás ou retirar gás do espaço vazio do recipiente para alterar a concentração de CO2 dissolvido de modo que a concentração atual de CO2, conforme medida pelo monitor de CO2 seja modulada para ajustar a concentração para um valor pré-determinado.
[093] Em algumas realizações, 0 aparelho também da invenção compreender um monitor de temperatura que monitora continuamente ou intermitentemente a temperatura do meio de cultura celular. O monitor de
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23/45 temperatura pode ser usado na comunicação com um sistema automatizado para aumentar ou diminuir a temperatura de modo que a temperatura atual medida pelo monitor seja modulada para ajustar um valor pré-determinado.
[094] Os diversos monitores de parâmetros podem ser usados sozinhos ou em combinação e podem ser controlados usando-se um sistema automatizado controlado por um computador. O computador pode ser programado para executar os cálculos necessários para determinar a quantidade de CO2 a ser infundida com 0 gás ou retirada do gás do espaço vazio, a fim de ajustar 0 pH do meio de cultura celular. O computador também pode executar cálculos com relação à temperatura, taxa de agitação, perfusão de meio e outros parâmetros, bem como controlar os meios para ajustar os parâmetros de forma automatizada.
[095] Opcionalmente, 0 aparelho da invenção inclui um agitador para agitar 0 recipiente de modo que 0 meio de cultura celular não seja estático, mas esteja em interface dinâmica com 0 gás do espaço vazio. A agitação facilita a difusão de gás dentro e fora do meio de cultura celular. O agitador pode ser qualquer forma conhecida na técnica, mas inclui esses exemplos não limitantes de agitadores, agitadores orbitais, rotador, agitadores em forma de oito, plataformas de balanço, plataformas de rotação, e seus semelhantes.
[096] O fornecimento de gás automatizado e 0 sistema de purga de gás podem incluir uma válvula e um sistema de bomba para fornecer gás pressurizado através de filtros estéreis com um medidor de controle para controlar a taxa de fluxo de gás dentro do recipiente. Pode ser empregado qualquer meio conhecido na técnica para fornecimento de gás e remoção de gás. O gás pode ser introduzido em resposta a um sinal calculado em um computador quando a concentração de CO2 dissolvido no meio de cultura celular desvia de um valor pré-determinado. Se a concentração medida de CO2
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24/45 desvia do valor pré-determinado, o sistema automatizado calcula a quantidade de CO2 necessária para ser adicionada ao sistema ou removida do sistema e 0 gás com a quantidade adequada de CO2 é introduzido no espaço vazio conforme 0 gás residente é purgado para fora através da porta de saída. O computador pode realizar cálculos envolvendo as Equações 1, 2 e/ou 3, conforme definido no presente pedido e outros cálculos para a regular 0 sistema, como seria conhecido por um técnico no assunto com base na literatura disponível, sistemas comercialmente disponíveis e os ensinamentos no presente pedido.
[097] Alternativamente ou em conjunto com um sistema de resposta usando-se uma concentração de CO2 monitorada, 0 sistema automatizado também pode medir 0 pH do meio de cultura e responder quando 0 pH medido se desvia de um pH pré-determinado para cultivo das células. O sistema automatizado pode responder a um desvio na concentração de CO2 e/ou pH e introduzir uma quantidade apropriada de CO2 com 0 gás enquanto 0 gás residente é purgado para fora de modo a modular de forma correta 0 pH do meio de cultura.
[098] O aparelho e método serão agora descritos em um exemplo não limitante com referência à Figura 1. Recipiente de cultura (40) contém meio de cultura celular e células (110) e espaço vazio (130). Uma porta de entrada de gás (70) com filtro (50) é conectada ao recipiente (40) para permitir a infusão de gás no espaço vazio (130). Uma porta de saída de gás (80) com filtro (60) é conectada ao recipiente (40) para permitir a saída de gás fora do espaço vazio (130). Recipiente repousa na plataforma (30) que é conectada ao balançador (20) e base (10) para permitir um movimento de balanço e agitação do meio de cultura celular (110). Agitação e fluxo de gás dentro do espaço de cabeça (130) permitem a difusão de O2 e CO2 em uma saída do meio de cultura celular (110). O filtro de perfusão opcional (90) para
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25/45 reter as células no recipiente de cultura é conectado através de tubulação (100) a uma porta média (120) para permitir a remoção do meio de cultura usado da cultura celular, conforme necessário.
[099] As células sáo cultivadas em meio de cultura celular (110) em um recipiente (40). O espaço vazio (130) no recipiente (40) é preenchido com gás. O fluxo de gás através da porta de entrada de gás (70) e saída da porta de saída de gás (80) permite que o gás flua através do espaço vazio (130) e o fluxo de saída de CO2 que se difunde pelo meio de cultura celular (110) dentro do espaço vazio (130) conforme a cultura é agitada pelo movimento de balanço da plataforma (30) sobre 0 balançador (20) anexado à base (10). A reduçáo de CO2 dissolvido no meio de cultura celular (110) causa um aumento no pH do meio de cultura celular (110).
[0100] O meio de cultura celular (110) pode ser opcionalmente suplementado com 0 meio fresco fornecido através do tubo do meio (140) através da porta do meio (150) e removido através do filtro de perfusáo (90) subindo através do tubo do meio (100) e para fora através porta de saída do meio (120). Nesse recurso opcional do método da invenção, 0 meio fresco é fornecido conforme 0 meio de cultura celular original é empobrecido de nutrientes e conforme acúmulo de produtos de resíduos celulares e diminuição do pH. O meio fresco é fornecido com um pH pré-determinado que é suficiente para causar um aumento no pH do meio de cultura celular total após a mistura trazer 0 meio de cultura celular para uma variação de pH ideal predeterminada.
Exemplos
A. Princípios [0101] Visto que a maioria dos sistemas de cultura celular de mamíferos utiliza um meio de cultura celular contendo bicarbonato, 0 controle de pH em cultura celular de mamíferos é predominantemente realizado por
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26/45 adições de base/C02. O controle de pH tira vantagem do sistema tampão ácido carbônico-bicarbonato. Foi revelado que em tal sistema, por exemplo, uma bolsa de biorreator descartável, o pH da cultura pode ser modulado por manipulação da concentração de CO2 dissolvido no meio, que pode ser modulado por modulação de concentração de CO2 no espaço vazio. O ajuste de pH bi-direcional é apresentado possível nos exemplos do presente pedido pela modulação da concentração de CO2 no espaço vazio. Esse método irá eliminar 0 uso de base para aumentar 0 pH em um sistema de biorreator de cultura celular. Se 0 pH da cultura celular no biorreator descartável necessitar ser diminuído, a concentração de CO2 no espaço vazio pode ser aumentada pela suplementação do gás de entrada com CO2. Isso permitirá 0 CO2 ser transferido para a cultura celular. Se 0 pH da cultura celular na bolsa descartável necessitar ser aumentado, a concentração de CO2 no espaço vazio pode ser diminuída ou a taxa de depuração de espaço vazio pode ser aumentada para facilitar a remoção de CO2 da cultura celular.
[0102] Esse método de manutenção de pH pode ser estendido para um sistema de biorreator e em que a transferência de gás no biorreator é facilitada principalmente pela grande área de superfície criada no biorreator.
Adição/Remoção de CO2 com Base na Estratégia de Manutenção de pH em um Processo de Banco de Células [0103] Durante as etapas iniciais de cultura celular, quando há um número relativamente menor de células, 0 pH da cultura celular tipicamente aumenta. Para controlar 0 pH, CO2 é tipicamente adicionado ao biorreator para reduzir 0 pH. Normalmente, essa adição é realizada por pulverização de gás CO2 através da cultura celular em um biorreator com tanque agitador normal. Em um biorreator descartável da invenção, a concentração de CO2 no espaço vazio é alterada de modo que a direção da transferência de CO2 é da fase gasosa para a fase líquida. Como a concentração de células aumenta no
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27/45 decorrer da cultura, a concentração de CO2 na cultura celular também aumenta e, portanto, 0 pH tipicamente diminui. Em um biorreator com tanque agitador normal com 0 controle de realimentação de pH normal, será adicionado base para controlar 0 pH. Adição de base aumenta 0 pH da cultura celular. No biorreator descartável da invenção, 0 aumento do pH pode ser realizado, por reversão da direção de transferência de CO2, diminuindo a concentração de CO2 no espaço vazio, bem como aumentando a taxa de depuração de espaço vazio. Esse método de manutenção do pH da cultura celular, por gerenciamento da concentração de CO2 na meio permite a eliminação do uso de base. Com base no requisito (tanto aumento como diminuição do pH) a concentração de CO2 no espaço vazio pode ser diminuída ou aumentada, respectivamente.
[0104] Um sistema de biorreator descartável pode ser usado como 0 sistema de biorreator para gerar bancos de células de densidade celular alta, como, mas não limitado ao Master Cell Banks (MCB) e Working Cell Banks (WCB). Um processo de cultura celular de perfusão é considerado para permitir a produção de bancos de células de densidade celular alta no biorreator descartável. O método de adição/remoção de CO2 é proposto para a manutenção do pH embora desenvolvido 0 processo de cultura celular para a geração de MCBs e WCBs. Além disso, 0 método de transferência de gás para manter 0 pH, a perfusão da cultura celular permita oportunidades extras para manter 0 pH. Em um processo de cultura celular de perfusão, 0 meio de cultura de células frescas é continuamente adicionado ao biorreator, enquanto 0 meio de cultura usado é continuamente removido. A perfusão permite a remoção de subprodutos da cultura celular que podem potencialmente afetar 0 pH da cultura celular. Além disso, a remoção de subprodutos de cultura celular, a entrada de pH do meio de cultura de células frescas também podem alterar 0 pH da cultura celular. Se sabe que 0 pH da cultura celular irá diminuir, 0 pH do
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28/45 meio de entrada pode ser aumentado para compensar a diminuição no pH. Alternativamente, a taxa de perfusão também pode ser alterada para gerenciar o pH da cultura. Todas as abordagens acima têm um impacto no pH, mas o fator mais importante que afetará o pH é o método de transferência de CO2. A transferência de CO2 é também uma abordagem mais confiável em relação à taxa de fluxo de gás e suplementação de CO2 em um biorreator descartável pode ser controlada eficazmente sem muitos problemas.
[0105] Durante nossas tentativas iniciais para cultura de células CHO no WAVE Bioreactor™ sem pH e controles de realimentação de OD, identificamos diversos desafios (Figura 5): (1) crescimento lento durante a etapa de cultivo em batelada (dias 0 a 6) em aproximadamente 0,3 dia1, (2) crescimento progressivamente mais lento durante a etapa de cultivo em perfusão (dia 6 em diante), decaindo de aproximadamente 0,5 dia-1 durante os primeiros 3 dias para menos de 0,3 dia1, dali para frente, (3) pH da cultura inicial, as vezes, excedeu 7,3, e 0 pH da cultura subsequente frequentemente caiu abaixo de pH 6,8 e (4) níveis de OD eram muitas vezes abaixo de 20% de saturação de ar após 0 início da perfusão no dia 6. Encontramos os mesmos desafios usando linhagens de células CHO produzindo outros MAbs (dados não mostrados). Nós atribuímos 0 crescimento lento do cultivo em batelada para 0 pH inicial elevado e 0 declínio da taxa de crescimento no cultivo em perfusão para a diminuição de pH e OD.
[0106] Na ausência de controle de realimentação de pH no WAVE Bioreactor™, 0 pH nessas culturas tamponadas de bicarbonato devem depender do teor de CO2 no espaço vazio da Cellbag™. Apesar da presença de tampões de bicarbonato e HEPES no meio, 0 pH da cultura deve eventualmente cair com 0 tempo como resultado do acúmulo de lactato. Para manter 0 pH da cultura em nossa faixa desejada de 6,8 a 7,2, nossa estratégia foi manipular a concentração de CO2 na Cellbag™. Gostaríamos de aumentar a
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29/45 transferência de CO2 no meio para diminuir 0 pH durante os estágios iniciais do cultivo em batelada. Por outro lado, gostaríamos de tirar CO2 do meio para aumentar 0 pH durante as etapas posteriores de batelada ou do cultivo em perfusão. Na ausência de controle de realimentação de OD no WAVE Bioreactor™, os níveis de OD devem cair com densidades celulares cada vez maiores. Para manter OD > 20% de saturação de ar, aumentaríamos a transferência de O2 para as culturas pelo aumento do coeficiente de transferência volumétrica de oxigênio (ki_a) para 0 sistema WAVE Bioreactor™ e suplementando 0 gás de entrada com O2.
B. Materiais e Métodos
1. Linhagens de Células CHO e Meio de Cultura [0107] Todas as linhagens celulares usadas nos Exemplos foram obtidas a partir de um CHO deficiente em diidrofolato redutase (DHFR-) hospedeiro adaptado para crescer na cultura em suspensão sem soro. Cada linhagem celular que produz um anticorpo monoclonal específico (MAb) foi gerada por transfecção do DHFR-hospedeiro com um DNA de plasmídeo que codifica genes para DHFR, MAb de cadeia leve (LC) e MAb de cadeia pesada (HC). As células estavelmente transfectadas foram posteriormente mantidas por passagem a cada 2 a 5 dias em meios seletivos quimicamente definidos de propriedade exclusiva contendo metotrexato. O mesmo meio que contém 1,0 g/l de Pluronic F-68, 2,44 g/l de bicarbonato de sódio, e 15 mM de HEPES, além de uma mistura própria de nutrientes - foram usadas para cultivar células WAVE Bioreactor™ em ambos os modos de batelada e perfusão.
2. Sistema WAVE Bioreactor™ [0108] O sistema WAVE Bioreactor™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA) utilizado para cultivar as células CHO em modo de batelada ou perfusão consistia de uma plataforma de balanço, uma unidade controladora e uma bolsa pré-esterilizada, flexível e descartável com filtros de
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30/45 gás na entrada e na saída e portas de amostragem múltiplas (Singh, 1999; Tang et al., 2007). Cada sistema foi equipado com uma almofada de aquecimento e uma caixa de mistura de gás para fornecer controle de temperatura e composição do gás de entrada exigido (O2 e/ou CO2 misturado com 0 ar), respectivamente. Todos os experimentos de cultura celular foram conduzidos usando-se uma Cellbag™ de 50 I em um volume de trabalho de 6 ou 20 I, um ponto de ajuste de temperatura de 37SC, uma taxa de balanço de 19 a 25 rpm e um ângulo de balanço de 8 a 12. PH on-line ou sondas de OD não foram instalados no WAVE Bioreactor™, ao invés disso, foram testadas diferentes estratégias de taxa de fluxo de gás e de misturas de gás para sua capacidade de manter os níveis de pH e OD da cultura dentro da faixa alvo.
3. Cultivo em Batelada no WAVE Bioreactor™ [0109] O cultivo em batelada foi iniciado em um WAVE Bioreactor™ de 6 I por inoculação tanto em uma Cellbag™ regular como uma de perfusão a ~7,5 x 105 células/ml. Poucos dias após a inoculação, quando a cultura acumulou massa celular suficiente, foi adicionado meio fresco para aumentar 0 volume de trabalho para 20 I. Para cada passagem, a cultura foi mantida por 2 a 5 dias em modo de batelada.
4. Cultivo em Perfusão no WAVE Bioreactor™ [0110] A menos que estabelecido de outra forma, a cultura em perfusão foi iniciada após 0 cultivo em batelada ter acumulado massa celular suficiente em 20 I de volume de trabalho em uma Cellbag™ de perfusão com uma taxa de balanço de 23 rpm e um ângulo de balanço de 10s e uma taxa de perfusão de 1 volume de trabalho por dia. O dispositivo de retenção celular na Cellbag™ de perfusão consistia de um filtro que flutuava na superfície do líquido durante 0 processo de cultura (Tang et al., 2007). O filtro de perfusão retinha as células na Cellbag™ enquanto tanto 0 meio fresco foi adicionado como 0 filtrado foi removido continuamente. Foi
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31/45 mantido volume constante no WAVE Bioreactor™ de perfusão por compatibilização da taxa de adição do meio fresco com a taxa de remoção de filtrado de um volume de trabalho por dia.
5. Cultivo em Biorreator com Tanque Agitador [0111] Para comparar o desempenho entre culturas em um WAVE Bioreactor™ e um biorreator com tanque agitador, as células da mesma fonte de série germinal foram inoculadas tanto em um biorreator WAVE Bioreactor™ como em um biorreator com tanque agitador de aço inoxidável (Applikon, Foster City, CA, EUA) at ~7.5 x 105 células/ml. As células foram primeiro cultivadas em modo de batelada e depois foi iniciada perfusão sobre o acúmulo de massa celular suficiente. O volume de trabalho foi de 7 I em modo de batelada e 15 I em modo de perfusão no biorreator com tanque agitador. A temperatura da cultura, OD e agitação foram mantidas em pontos de ajustes de 37SC, 30% de saturação de ar e 125 rpm, respectivamente. O pH da cultura foi mantido em 7,15, com uma zona morta de 0,03, tanto por adição de carbonato de sódio 1M para aumentar o pH como por pulverização de gás CO2 para diminuir 0 pH. Durante a operação de perfusão, 0 sistema de centrífuga Centritech (Centritech AB, Norsborg, Suécia) foi usado para separar células do meio de crescimento, as células foram retidas pela centrífuga e retornaram para 0 biorreator, enquanto 0 sobrenadante foi removido (Johnson et al., 1996). Foi mantido volume constante no biorreator por compatibilização da taxa de adição do meio fresco com a taxa de remoção de sobrenadante de um volume de trabalho por dia.
6. Análises de Amostras Off-Line [0112] As culturas foram amostradas e analisadas para a concentração de células viáveis (VCC) e viabilidade (Vi Cell-AS, Beckman
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Coulter, Fullerton, CA, EUA), bem como para o pH, OD, pCO2, glicose e lactato (Bioprofile 400, Nova Biomedical, Waltham, MA, EUA).
Exemplo 1
Estudos Livre de Células Medições de Transferência de Gás [0113] As características de transferência de gás na Cellbag™ afetam o desempenho da cultura devido aos seus efeitos sobre os níveis de OD e pH. Como a primeira etapa dirigida à manutenção do pH e OD dentro de nossas faixas desejadas, foram realizados estudos livre de células na Cellbag™ para medir a transferência de O2 e CO2.
A. Estudos de Transferência de O2 [0114] Foi caracterizada transferência de O2 nas Cellbag™ de 50 I usando-se um meio de cultura simulada por cálculo do coeficiente de transferência volumétrica de O2 (ki_a) em várias combinações de taxas de balanço (20, 30 e 40 rpm), ângulos de balanço (8S, 10s e 12s) e taxas de fluxo de gás (0,1,0,2 e 0,3 l/min). O método de purga dinâmico clássico foi utilizado para calcular 0 ki_a (Dunn e Einsele, 1975). O meio de teste utilizado para esses estudos foi projetado para simular 0 meio de cultura de células patenteado: ele foi composto de 1,0 g/l de Pluronic F-68, 2,44 g/l de bicarbonato de sódio e 15 mM de HEPES. Uma sonda OD OxyProbe® conectada a um transmissor Modelo 40 do mesmo fabricante (BroadleyJames Corporation, Irvine, CA, EUA) foi usada para fornecer medições de O D on-line.
[0115] Na preparação para 0 teste de transferência de O2, após ser preenchida uma Cellbag™ de 50I com 25 I de meio simulado, a porta de entrada de gás passou por uma experiência com nitrogênio (N2). A bolsa foi balançada para facilitar a transferência de N2 no meio de simulação. O fluxo de N2 no espaço vazio foi interrompido quando 0 conteúdo de OD do meio de simulação caiu abaixo de 10% de saturação
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33/45 do ar. Na sequência desse processo de desoxigenação, a bolsa foi pressionada para expelir ο N2 residual espaço vazio. Foi então adicionado gás comprimido ao espaço vazio da bolsa, enquanto se reduzia a perturbação da interface líquido-gás. Assim que a bolsa estava completamente inflada, 0 teste de transferência de O2 foi iniciado nas condições de teste definidas para a taxa de balanço, ângulo de balanço e taxa de fluxo de gás. O aumento resultante na concentração de OD foi gravado e foi utilizado para determinar 0 ki_a do sistema. Além disso, foi medido OD off-line a cada minuto durante os primeiros cinco minutos, e a cada cinco minutos posteriormente para verificar a precisão das leituras de O D on-line.
[0116] A uma taxa de fluxo de ar constante, aumentando a taxa de balanço ou ângulo de balanço aumentou 0 kLa (Figura 2A), presumidamente pelo aumento da área de superfície para transferência de oxigênio. Os números kLa que obtivemos na menor taxa de balanço testada (20 rpm) são comparáveis aos que outros pesquisadores relataram para 0 WAVE Bioreactor™ (Mikola et al., 2007;. Singh, 1999). Esses números kLa também são comparáveis àqueles obtidos para 0 nosso biorreator com tanque agitador doméstico (dados não mostrados).
[0117] Em um estudo de transferência de O2 do sistema WAVE Bioreactor™ a uma taxa de balanço constante de 20 rpm, aumentando a taxa de fluxo de ar de 0,01 vvm para 0,05 vvm aumentou 0 kLa de ~2 Ir1 para ~3 h1 na escala de 2 I e aumentando a taxa de fluxo de ar de 0,01 vvm para 0,1 vvm aumentou 0 kLa de ~0,5 h1 para ~3 h1 na escala de 20 I, (Singh, 1999). Por outro lado, em nosso estudo na escala de 50 I, aumentando a taxa de fluxo de ar de 0 vvm para 0,02 vvm em duas combinações diferentes de taxa de balanço e de ângulo de balanço, não aumentou 0 kLa (Figura 2B). As taxas de fluxo de ar máximas que usamos
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34/45 podem ter sido muito baixas para afetar a mobilidade do líquido na interface gásHíquido para ter qualquer efeito significante sobre o ki_a.
[0118] A capacidade de transferência de oxigênio da bolsa descartável de 50 I foi avaliada por determinação do coeficiente de transferência de massa, ki_a. A Figura 2C mostra a concentração de OD ao longo do tempo para uma taxa constante de fluxo de gás e a Figura 2D mostra o efeito da taxa de fluxo de gás no oxigênio dissolvido. Para as condições de balanço agressivas (taxa de balanço e ângulo de balanço maiores) o coeficiente de transferência de massa é alto. Surpreendentemente, a taxa de depuração do espaço vazio, no entanto, não tem um efeito sobre o ki_a em relação a transferência de oxigênio. O meio simulado foi desoxigenado antes de começar o experimento. A concentração de oxigênio no gás foi maior do que a concentração de oxigênio no meio simulado. Então, o oxigênio foi transferido da fase gasosa para a fase líquida. Com condições de balanço agressivas, a interface gáslíquido aumenta devido ao fato de mais formações de onda (isto é citado no presente pedido como ter uma interface dinâmica). Esse aumento da área superficial parece causar a alta taxa de transferência de oxigênio. Quando a taxa de fluxo de gás é aumentada ou diminuída, a taxa de depuração do espaço vazio é consequentemente alterada. A alteração na liberação de espaço vazio não muda a concentração diferencial de oxigênio entre o gás e a fase líquida. Então, essa taxa de fluxo de gás parece não ter efeito sobre o coeficiente de transferência de massa para oxigênio. Quando a concentração de oxigênio no meio simulado é igual a do espaço vazio, a transferência de oxigênio irá parar.
B. Estudos de Transferência de CO2 [0119] Depois que 0 meio simulado foi desoxigenado pelo método utilizado para os estudos de transferência de O2, foi fornecido CO2
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35/45 à Cellbag™ através da mesma porta de entrada usada para fornecer N2. Foi interrompido 0 fornecimento de CO2 quando a sonda de pH on-line leu 7,0 e 0 espaço vazio foi liberado usando-se 0 mesmo método descrito nos estudos de transferência de O2. Quando a bolsa estava completamente inflada, 0 teste de transferência de CO2 foi iniciado nas condições de teste definidas para a taxa de balanço, ângulo de balanço e taxa de fluxo de gás. O aumento resultante em pH foi registrado com uma sonda de pH on-line descartável conectada a um transmissor pH20 fornecido pelo mesmo fabricante (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA). O pH aumentou porque 0 CO2 foi retirado do meio simulado a base de bicarbonato. Para verificar a precisão das leituras de pH on-line, foi medido 0 meio simulado no pH offline a cada minuto durante os primeiros cinco minutos e posteriormente a cada cinco minutos. Plotando as medições do pH on-line contra 0 tempo, a inclinação da linha de melhor ajuste forneceu a taxa de alteração do pH e, através disso, indicou a taxa de transferência de CO2 do meio simulado para 0 espaço vazio na Cellbag™.
[0120] Embora outros pesquisadores tenham caracterizado a transferência de O2 no WAVE Bioreactor™ (Mikola et al., 2007; Singh, 1999), não encontramos relatos sobre a transferência de CO2 em sistemas de cultura celular com agitação induzida por onda. Para caracterizar a transferência de CO2 no WAVE Bioreactor™, usamos meio simulado contendo bicarbonato de sódio na mesma concentração (2,44 g/l) como em nosso meio de cultura celular. Nesse sistema livre de células tamponado com bicarbonato, a remoção de CO2 da fase líquida aumentaria 0 pH do sistema na ausência de controle de pH ativo. Ao invés vez de confiar em sondas de CO2 para medições diretas de CO2 no meio simulado, utilizou-se 0 perfil de pH de uma sonda de pH on-line no WAVE Bioreactor™ para avaliar a taxa relativa de esvaziamento de CO2.
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36/45 [0121] Nesse estudo, o perfil de pH no WAVE Bioreactor™ separado em duas fases (Figuras 3A e 3B). Na primeira fase, o pH aumentou rapidamente entre 0 e 5 minutos em ~1 a 4 unidades de pH por hora. Na segunda fase, o pH aumentou de forma mais gradual de 5 a 60 minutos em 0,5 unidades de pH por hora. Durante essa segunda fase (5 a 60 minutos), diferentes taxas de balanço e ângulos de balanço tiveram um impacto insignificante sobre a taxa de aumento do pH: a uma taxa de fluxo de ar constante de 0,2 l/min, o pH aumentou em 0,2 unidades por hora, sem considerar a condição de balanço (Figura 3A). Por contraste, maiores taxas de fluxo de ar aumentaram a taxa de variação do pH durante essa segunda fase (5 a 60 minutos): quando a taxa de fluxo de ar aumentou de 0 l/min para 0,6 l/min, a taxa de variação do pH aumentou de 0 a 0,1 unidades por hora para 0,4 unidades por hora (Figura 3B). Na ausência de fluxo de ar (0 l/min), o aumento do pH mínimo (<0,1 unidades por hora) observado durante a segunda fase (5 a 60 minutos) sugere que a troca de CO2 entre 0 meio simulado e 0 espaço vazio na Cellbag™ aproximou-se de um equilíbrio em aproximadamente 5 minutos. Para conseguir aumentar 0 pH adicionais para além dos primeiros 5 minutos, a força motriz para esvaziamento de CO2 pode ser aumentada através do aumento da taxa de fluxo de ar para aumentar a taxa de depuração de espaço vazio e através disso, minimizar a concentração de CO2 no espaço vazio.
[0122] A Figura 3C mostra a taxa calculada de alteração de pH para dados da Figura 3A. A Figura 3D mostra a taxa calculada de alteração de pH para dados da Figura 3B. O comportamento bifásico pode ser explicado pelas altas taxas de transferência de gás criado tanto pela grande área de superfície das ondas quanto pela varredura contínua do espaço vazio pelo gás de entrada. A grande área de superfície facilita a rápida transferência de CO2 da fase líquida para a fase gasosa. A rápida
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37/45 transferência é um resultado da concentração diferencial de CO2 entre 0 gás e a fase líquida. Essa diferença de concentração foi ao máximo durante 0 início do experimento e essa diferença foi reduzida continuamente à medida que mais CO2 foi transferido da fase líquida para a fase gasosa. Conforme a concentração diferencial de CO2 entre 0 gás e a fase líquida foi reduzida, a taxa de mudança no pH também foi reduzida. Na Figura 3A, a taxa de mudança no pH foi muito alta para a primeira fase (0 a 5 minutos) em comparação a segunda fase (5 a 60 minutos). A taxa de fluxo de gás foi mantida a mesma para os casos mostrados na Figura 3A. Após a transferência inicial de CO2, a taxa de transferência de CO2 depende da concentração de CO2 no espaço vazio. Para a mesma taxa de depuração de espaço vazio, a taxa de mudança no pH após os 5 minutos iniciais foi a mesma, sem considerar as condições de balanço. O valor calculado para a taxa de mudança no pH é mostrado na Figura 3C.
[0123] Quando a taxa de fluxo de gás foi alterada, a taxa de depuração do espaço vazio também foi alterada. Os dados para aumento de pH para diferentes taxas de fluxo de gás é mostrado na Figura 3B. Comportamento bifásico também foi observado para esses casos. No entanto, entre os casos com a mesma taxa de fluxo de gás e os casos onde a taxa de fluxo de gás foi variada, a diferença é que a taxa de mudança do pH da segunda fase (5 a 60 minutos) variou dependendo da taxa de fluxo de gás em comparação ao similar para casos com a mesma taxa de fluxo de gás. Uma vez que a alteração da taxa de fluxo de gás altera a taxa de depuração de espaço vazio, 0 CO2 no espaço vazio foi removido em taxas diferentes.
[0124] A rápida transferência de gás inicial é 0 resultado da propriedade da bolsa descartável para criar grande área de superfície. Essa transferência de gás inicial depende principalmente das condições de
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38/45 balanço (taxa de balanço e ângulo de balanço). No entanto, a remoção sustentada de CO2 do meio depende da concentração de CO2 no espaço vazio. A taxa de depuração de espaço vazio depende da taxa de fluxo de gás.
Exemplo 2
Estudos das Características de Crescimento Celular
A. Cultivo em Batelada
1. Experimento Inicial Meio de Cultura Celular [0125] Um meio de cultura celular livre de soro foi usado para cultivo de células de Ovário de Hamster Chinês (CHO). O meio de cultura celular foi derivado de um mistura 1:1 de meio com base DMEM e F-12 de Ham por modificação de alguns dos componentes, como aminoácidos, sais, açúcares e vitaminas. Esse meio carece de glicina, hipoxantina e timidina. Esse meio consistiu de 15 mM de HEPES (4-(2-hidroxietil)-1-ácido piperazineetanesulfonico) e 2,44 g/l de bicarbonato de sódio. A concentração desses sais pode ser modificada. O meio foi suplementado com elementos traço, insulina humana recombinante e um agente protetor de célula, Lutrol F68 Prill (pode ser usado um equivalente).
Cultivo de Células de Mamíferos [0126] Células de Ovário de Hamster Chinês Transfectadas (CHO) foram cultivadas a partir de um frasco de 1 ml ou 10 ml de banco armazenado em nitrogênio líquido. O frasco congelado selecionado foi derretido em um meio de cultura contendo bicarbonato de sódio tanto em um frasco giratório, como em um frasco de agitação como em um biorreator com tanque agitador. As células foram passadas a cada 2 a 7 dias. Essa cultura foi citada como “série germinal”. Células da série germinal foram transferidas para a bolsa descartável para iniciar a cultura celular na bolsa descartável.
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Análise [0127] Um analisador de gases sanguíneos (NOVA BioProfile® 400) foi utilizado para análise off-line. O pH da cultura celular, pressão parcial de oxigênio dissolvido e CO2, concentração de glicose, lactato e amônia foram medidos usando-se esse analisador off-line. Foram feitas medições de viabilidade celular e concentração celular viável (VCC) usando-se Beckman-Coulter’s ViCell™ AS ou ViCell™ XR. Além das medições de concentração celular, a quantidade de biomassa também foi medida por gravação do percentual do volume de células empacotadas (% de PCV).
Exemplo 3
Análise Detalhada Usando-se Diversas Linhagens Celulares de CHO A. Processo de Batelada [0128] Diminuindo a concentração de CO2 no gás fornecido para a Cellbag™ ao longo do curso do cultivo em batelada, devemos ser capazes de diminuir 0 pH inicial elevado (> 7,3) e minimizar a subsequente diminuição do pH no sistema WAVE Bioreactor™. Depois de testar diferentes estratégias de revestimento com gás CO2 em cultivo em batelada no WAVE Bioreactor™ usando-se diversas linhagens de células de CHO (dados não mostrados), definimos uma estratégia escalonada “8-
5-2” tanto para as etapas de inoculação como para escala aumentada: 0 ar bombeado dentro da Cellbag™ foi suplementado com gás CO2 a 8% (v/v) durante 0 primeiro dia, a 5% (v/v) durante 0 segundo dia e a 2% (v/v) posteriormente.
[0129] Com base nos resultados de estudos livre de células, selecionamos as seguintes taxas de balanço, ângulo de balanço e taxa de fluxo de ar conforme os pontos de ajuste do processo para 0 nosso cultivo em batelada no WAVE Bioreactor™: 21 rpm, 10s de ângulo de balanço e
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0,2 l/min para a inoculação; 23 rpm, 10s de ângulo de balanço e 0,2 l/min a etapa de escala aumentada. Para testar a confiabilidade desses pontos de ajuste de processo, projetamos um experimento fatorial completo (Tabela
1). Quando as condições de processo desviaram dos pontos centrais, observamos efeito desprezível sobre o crescimento celular e perfis de pCO2, e o pH da cultura manteve-se dentro de 6,8 a 7,2 e OD > 50% para ambas as linhagens celulares testadas (Figura 4).
Tabela 1
Condições Testadas no Cultivo em Batelada no WAVE Bioreactor™ para Linhagens Celulares que Produzem MAb B e MAb C (Figura 4) [0130] O experimento fatorial completo foi projetado em torno de três parâmetros de processo - taxa de balanço, ângulo de balanço e taxa de fluxo de ar dentro do espaço vazio - tanto para etapas de inoculação como para escala aumentada no cultivo em batelada.
Inoculação Escala aumentada
Símbolo Taxa de balanço (rpm) Ângulo de balanço (s) Taxa de Fluxo de Ar no Espaço Vazio (l/min) Símbolo Taxa de balanço (rpm) Ângulo de balanço (a) Taxa de Fluxo de Ar no Espaço Vazio (l/min)
- -D· - 19 8 0,1 - -u- - 21 8 0,1
o 19 12 0,1 - -o- 21 12 0,1
- - 19 8 0,3 - - 21 8 0,3
- - 19 12 0,3 - - 21 12 0,3
r-1 23 8 0,1 r-1 25 8 0,1
23 12 0,1 25 12 0,1
23 8 0,3 25 8 0,3
♦ 23 12 0,3 ♦ 25 12 0,3
21 10 0,2 23 10 0,2
B. Cultivo de Perfusão [0131] Nas nossas tentativas de cultivo em perfusão no WAVE
Bioreactor™, o pH da cultura tipicamente caiu abaixo de 6,8 e o OD caiu abaixo de 30% de saturação de ar após o início da perfusão no dia 6 (Figura 5). Para minimizar a queda de pH sem aumento da taxa de perfusão, nós investigamos
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41/45 a possibilidade de aumentar a taxa de fluxo de ar no Cellbag™ porque os estudos de transferência de gás livre de célula mostraram que a taxa de fluxo de ar aumentou o pH (Figura 3). Para superar o declínio do OD, nós suplementamos o fluxo de ar no Cellbag™ com 30% de O2 (v/v) dois dias após 0 início da perfusão. Nós selecionamos este momento porque coincidiu com 0 declínio do OD observado anteriormente (Figura 5).
Exemplo 4
Um Processo de Perfusão em Batelada [0132] Este processo de perfusão compreendeu duas etapas de batelada seguido por uma etapa de perfusão. Uma bolsa descartável de 50 I foi inoculada com um volume de trabalho de 6 I em uma densidade de célula alvo de 5 a 7,5 x 105 células/ml na etapa de inoculação. Três dias após a inoculação, 0 meio fresco foi adicionado para aumentar 0 volume da bolsa descartável para 20 I para a etapa de aumento de escala. A etapa de inoculação e a etapa de elevação de escala constituíram as etapas de batelada. A estratégia de queda de CO2 para as etapas de batelada foi empregada conforme descrito no Processo de Batelada. No final dos 3 dias da etapa de elevação de escala, a perfusão foi iniciada. O meio fresco foi continuamente adicionado à bolsa descartável e 0 meio de cultura usado foi continuamente removido da bolsa descartável, ao mesmo tempo retendo as células. O meio de cultura celular foi perfundido a uma taxa de 20 litros por dia (1 volume por dia). O ponto de ajuste de pH do meio de perfusão foi de 7,2 unidades. No início da perfusão, a concentração de CO2 no gás de entrada foi definida como zero. A taxa de depuração do espaço vazio foi aumentada para facilitar a remoção de CO2. O aumento na taxa de depuração do espaço vazio, tanto seguido por uma única etapa de aumento como por uma multi-etapa de aumento, é mostrado na Figura 7. A faixa da taxa de balanço foi entre 19 a 25 rpm. A faixa do ângulo de balanço foi entre 8 a 12 graus. A temperatura foi
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42/45 mantida a 37 °C. O oxigênio foi suplementado 48 horas após o início de a perfusão encontrar a demanda de oxigênio das células. A concentração de oxigênio no gás de entrada foi estabelecida a 30% em 48 horas após o início da perfusão.
[0133] A Figura 6 mostra o desempenho da cultura celular para o processo de perfusão em batelada (etapa de batelada (dias 0 a 6) e etapa de perfusão (dias 6 a 14)) (Figura 6A). A Figura 6B mostra a % de viabilidade celular. A Figura 7A mostra os pontos de ajuste das taxas de liberação do espaço vazio para três experimentos diferentes. Os pontos de ajuste das taxas de liberação do espaço vazio para a etapa de perfusão seguiu perfis diferentes (dias 6 a 14): (1) duas taxas constantes de liberação do espaço vazio : 0,02 hvm (-A-) e 0,1 hvm (♦); e (2) uma etapa de aumento da taxa de depuração do espaço vazio: 0,007 hvm até 0,013 hvm até 0,02 hvm (--). Tanto o aumento de única etapa como o aumento de multi-etapa foram estudados. A Figura 7B mostra a concentração de CO2 dissolvido off-line. A Figura 6D mostra 0 crescimento celular na contagem de célula viável (VCC). Legenda para Figuras 6 e 7: ♦, , ▲ mostram três execuções diferentes. Conforme mostrado na Figura 6C, 0 pH poderia ser mantido dentro de uma faixa desejada pela modulação do CO2 pela liberação do espaço vazio.
Exemplo 5 Comportamento de Seis Linhagens Celulares de CHO mediante Condições “8-5-2” [0134] Para testar a confiabilidade deste processo WAVE Bioreactor™ para suportar 0 crescimento celular e manter 0 pH e OD nas faixas desejadas, foram selecionadas seis linhagens de células que cobrem a faixa de crescimento celular e comportamentos metabólicos tipicamente observados em nossas linhagens internas de células CHO.
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43/45 [0135] Com as condições do processo otimizado, todas as seis linhagens celulares cresceram com alta viabilidade ao longo de toda batelada e os estágios de cultivo de perfusão (Figura 8). Em todos os casos, o pH manteve-se dentro da faixa desejada de 6,8 a 7,2, e o OD não excedeu 20% de saturação do ar.
Exemplo 6
Comparação entre o Método WAVE Bioreactor™ “8-5-2” e os Cultivos em Biorreator com Tanque Agitador Convencional [0136] Para comparar o desempenho de cultivo entre o processo WAVE Bioreactor™ da invenção e o processo de biorreator com tanque agitador com controle de pH e OD, realizamos cultivos paralelos em ambos os sistemas (Figura 9). Os perfis de crescimento e de viabilidade foram semelhantes entre os dois sistemas de biorreatores: as taxas de crescimento no WAVE Bioreactor™ e no biorreator com tanque agitador foram semelhantes em ~0,5 dia-1. Apesar da falta de controle de realimentação on-line para pH e OD no sistema WAVE Bioreactor™, os perfis de pH e OD não diferiram significativamente entre os dois biorreatores de cultivo.
[0137] A invenção fornece um método de controle de processo para manter o pH da cultura na faixa de 6,8 a 7,2, e OD > 20% de saturação do ar no sistema WAVE Bioreactor™ - operado tanto no modo batelada como de perfusão - sem depender de controle de realimentação de pH e OD. Depois de identificar os desafios no cultivo de células de CHO no sistema WAVE Bioreactor™ sem controle de pH e OD, realizamos livre de células estudos para determinar os efeitos da taxa de balanço, ângulo de balanço e taxa de fluxo de gás na transferência de O2 e CO2 no sistema WAVE Bioreactor™. Ao ajustar esses parâmetros de processo, juntamente com a concentração de CO2 e O2 no gás de entrada, mantivemos 0 pH e OD da cultura dentro da nossa faixa desejada para cultivo em batelada e perfusão de seis linhagens celulares de
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CHO recombinantes. Ao eliminar a necessidade de sondas de pH e OD, esse processo fornece um método mais simples e mais econômico para o cultivo de células no sistema WAVE Bioreactor™. Ele também fornece um método alternativo para o cultivo de células em caso de falha na sonda de pH ou OD em WAVE Bioreactors™ equipados com essas sondas.
[0138] Também é preciso entender que os exemplos específicos descritos no presente pedido são apenas ilustrativos e não pretendem limitar o escopo da invenção. A invenção é limitada apenas pelas reivindicações anexas.

Claims (16)

  1. Reivindicações
    1. MÉTODO PARA CULTIVO EM BATELADA DE CÉLULAS EUCARIONTES, caracterizado por compreender:
    fornecer inoculante de cultura celular que compreende células eucariontes em um líquido de cultura contendo bicarbonato para um recipiente;
    dito recipiente possuindo paredes que encapsulam dita cultura celular e um espaço vazio de fase gasosa acima da dita cultura celular, e em que dito recipiente compreende uma porta que fornece uma entrada e uma saída de gás para e a partir do dito espaço vazio;
    agitar dito recipiente; e fornecer gás para dito espaço vazio através da dita porta, em que dito gás contém uma quantidade de CO2, e em que dita quantidade de CO2 no dito gás é modulada ao longo do tempo para ajustar 0 pH da dita cultura celular para manter um pH pré-determinado da dita cultura celular entre 6,8 e 7,2 sem monitoramento contínuo do pH, em que 0 dito CO2 é fornecido em uma quantidade de 8% (v/v) de dito gás no dia 1, em uma quantidade de 5% (v/v) de dito gás no dia 2, e em uma quantidade de 2% (v/v) de dito gás subsequentemente.
  2. 2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela dita agitação ser por balanço do dito recipiente a uma taxa de balanço de 15 a 30 rpm e um ângulo de balanço de 50 a 15 °.
  3. 3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela taxa de balanço ser entre 19 e 25 rpm e 0 ângulo de balanço ser entre 8 o a 12°.
  4. 4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela taxa de depuração de dito gás ser entre 0,002 a 0,1 volume de espaço livre por minuto (hvm).
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  5. 5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela taxa de depuração de dito gás ser entre 0,007 a 0,08 hvm.
  6. 6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela taxa de depuração de dito gás ser 0,007 a 0,02 hvm.
  7. 7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelas ditas células eucariontes serem células de vertebrado.
  8. 8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelas ditas células de vertebrado serem selecionadas a partir do grupo que consiste em células de rã, células de coelho, células de roedor, células de carneiro, células de cabra, células de cão, células de gato, células de vaca, células de cavalo, células de primata não humano e células humanas.
  9. 9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo dito recipiente ser um reservatório rígido.
  10. 10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo dito recipiente ser um reservatório dobrável.
  11. 11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo dito recipiente ser uma bolsa de cultura descartável.
  12. 12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente o monitoramento intermitente do pH da cultura celular.
  13. 13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo dito gás ser fornecido a dito espaço vazio de modo que a cultura celular mantenha uma pressão parcial de CO2 dissolvido a um nível de cerca de 1 a 200 mmHg (0,13 a 26,66 kPa).
  14. 14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo dito gás ser fornecido a dito espaço vazio de modo que a cultura celular mantenha uma pressão parcial de CO2 dissolvido a um nível de cerca de 10 a 150 mmHg (1,33 a 19,99 kPa).
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  15. 15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo dito gás ser fornecido a dito espaço vazio de modo que a cultura celular mantenha uma pressáo parcial de CO2 dissolvido a um nível de cerca de 20 a 120 mmHg (2,66 a 15,99 kPa).
  16. 16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo dito gás ser fornecido a dito espaço vazio de modo que a cultura celular mantenha uma pressáo parcial de CO2 dissolvido a um nível de cerca de 20 a 80 mmHg (2,66 a 10,66 kPa).
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