KR20120047930A

KR20120047930A - 진핵 세포의 배양 방법

Info

Publication number: KR20120047930A
Application number: KR1020127003042A
Authority: KR
Inventors: 디네쉬 바스카르; 제니 시웅; 운-람 수잔 륭; 인 에이치. 육
Original assignee: 제넨테크, 인크.
Priority date: 2009-07-06
Filing date: 2010-07-06
Publication date: 2012-05-14
Also published as: AU2018250474A1; AU2021200110A1; US20190233790A1; BR112012000242A2; US20210130759A1; BR112012000242B1; US11939559B2; CA2766902C; WO2011005773A2; IL242092B; AU2016202997A1; AU2018250474B2; EP2451936B1; MX367489B; ES2752874T3; CN107043703B; JP2016063816A; JP6358999B2; IL267629A; IL217223A0

Abstract

본원은 염기를 첨가하지 않고 비카르보네이트-함유 세포 배양 시스템에서 세포 성장을 유도하는 범위 이내로 pH를 유지시키는 장치 및 방법을 개시한다. 상기 방법은 세포 배양물의 pH가 목적하는 범위 이내로 유지될 수 있도록 세포 배양물 안팎으로 CO₂ 전달을 조절하는 생물반응기 시스템의 기체 전달 특성에 의존한다.

Description

진핵 세포의 배양 방법 {METHOD OF CULTURING EUKARYOTIC CELLS}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2009년 7월 6일자로 출원된 미국 가출원 번호 61/223,313의 이익을 청구하며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 배양 배지에 염기를 직접 첨가하지 않고 세포 배양물의 pH가 유지되도록 하는, 비카르보네이트-함유 배지 중에서 진핵 세포를 배양하는 장치 및 방법에 관한 것이다.

세포 보관, 재조합 단백질 생산과 같은 세포 산물의 생산을 위한 세포 배양은 세포가 성장함에 따라 조건이 변화되어 방해를 받는다. 스테인레스 스틸 생물반응기가 세포 생산에 종종 사용되지만, 생물제제 제조의 모든 단계에서 일회용품 사용이 증가되고 있다 (문헌 [Rao et al., 2009]). 상류 공정에서, 일회용 생물반응기는 스테인레스 스틸에 비해 많은 장점을 제공한다 (그 범위는 교차오염 위험성의 감소에서 비용 및 시간 절감에 이름). 웨이브 바이오리액터(WAVE Bioreactor)™는 생물제약 산업에서 재조합 단백질을 생산하는데 사용되는 일회용 상류 기술의 널리 알려진 예이다 (문헌 [Cronin et al., 2007]; [Haldankar et al., 2006]; [Ling et al., 2003]; [Ye et al., 2009]).

신흐(Singh) (문헌 [Singh, 1999])에 의해 개발된 웨이브 바이오리액터™ 시스템은 사전 멸균되고 유연하고 일회용인 배양 챔버 (셀벡(Cellbag)™), CO₂- 및/또는 O₂-공기 혼합 제어기, 및 셀백™을 요동시키고 가열하기 위한 공기압 제어 플랫폼을 포함한다. 이러한 플랫폼에 의해 야기되는 요동 운동은 셀백™ 내에서의 혼합 및 기체 전달을 제공한다.

웨이브 바이오리액터™ 시스템은 온라인 pH 및 용존 산소 (DO) 모니터링 및 실시간 피드백 제어를 제공하기 위한 장치를 더 구비할 수 있다 (문헌 [Mikola et al., 2007]; [Tang et al., 2007]). 그러나, 요구되는 추가적인 장치 뿐만 아니라 pH 및 DO 프로브를 수용하기 위한 특수 설계된 백에 대한 필요는 이 시스템의 운용 비용 및 복잡성을 증가시킨다. 또한, pH-제어된 생물반응기 내에서 규정된 설정값으로 배양물 pH를 상승시키는데 요구되는 염기 첨가는 배양 오스몰랄농도를 증가시킨다. 생물반응기에서의 오스몰랄농도 증가의 정도에 따른 세포 성장 및 생존율에서의 연관 감소 (문헌 [deZengotita et al., 2002]; [Zhu et al., 2005])는 pH 제어의 이점을 상쇄시킬 수 있다. 또한, pH 프로브가 제대로 작동하지 않을 경우, 야기되는 pH 동요는 세포 대사를 변경시키고 세포 사멸을 촉진시킬 수 있다 (문헌 [Miller et al., 1988]; [Osman et al., 2002]).

엄격한 pH 및 DO 제어는 특정 세포 배양 분야, 예를 들어 세포 유지 및 증식을 위한 진탕 플라스크 및 스피너와 같은 소규모 배양 시스템에서의 세포의 일상적 계대배양에서는 필요하지 않을 수 있다. 그러나, pH 및 DO 극치는 세포 성장 및 생존에 유해하고 (문헌 [Lin et al., 1993]; [Link et al., 2004]; [Miller et al., 1988]; [Osman et al., 2001]), 생산물의 품질에 영향을 미칠 수 있다 (문헌 [Restelli et al., 2006]; [Yoon et al., 2005]). 따라서, 생물제제 제조의 모든 단계에서 세포의 이같은 성장 조건을 어느 정도 제어 유지하는 것은 매우 중요하다. 연구자들은 종전에 6.8-7.3의 pH 범위 및 공기 포화도 10-100％의 DO 범위에서 CHO 세포를 배양하는데 성공했음을 보여주었다 (문헌 [Link et al., 2004]; [Restelli et al., 2006]; [Trummer et al., 2006]; [Yoon et al., 2005]).

실시간 pH 모니터 및 DO 모니터링 제어와 같은 종래의 생물반응기에의 부가된 특성들은 생물학적 제조에 있어서 세포 배양의 비용 및 노동 강도를 현저하게 증가시킨다. 또한, 이들 특성의 불이행 또는 고장은 시간 및 자원이 매우 많이 들게 하는 세포 배양의 용납되지 않는 변경 및 잠재적 손실을 야기할 수 있다.

따라서, 강염기를 도입할 필요가 없고, pH 및 DO의 추가의 모니터링 및 실시간 제어가 필요없는, 개선된 진핵 세포 배양 방법이 요구된다.

발명의 개요

본 발명은 염기를 첨가하지 않고 세포 배양 시스템 내에서 pH를 유지하는 장치 및 방법을 제공한다. 비카르보네이트-함유 세포 배양 배지에서, 배지 중 CO₂의 양은 탄산-비카르보네이트 완충 평형 (방정식 1)을 기초로 배지의 pH에 영향을 미친다:

따라서, 본 발명은 강산 또는 염기를 첨가할 필요 없이, 이러한 관계를 이용하여 세포 배양 시스템의 액체상 및 기체상의 동적 경계면을 이용하여 용존 CO₂ 농도를 증가시키거나 감소시킴으로써 세포 배양 배지의 pH를 조정한다. 본 발명은 이러한 조절을 달성하는 방법 및 상기 방법을 실행하기 위한 장치를 제공한다.

일반적으로, 본 발명의 장치는 공기, 산소 또는 이들 기체의 조합을 공급하여 세포 배양물의 용존 산소를 유지시킨다. 장치의 헤드 스페이스에 기체 혼합물을 제공함으로써 (그의 조성 및 도입 속도는 조작될 수 있음), CO₂는 액체 및 기체 상 사이의 CO₂ 농도 차이에 따라 세포 배양 배지에 첨가되거나 또는 그로부터 제거될 수 있다. 헤드 스페이스로부터의 CO₂의 제거는 배지 중에 용존 CO₂가 헤드 스페이스로 발산됨에 따라 배양물 pH를 증가시킬 것이다. 반대로, CO₂가 배지의 농도 보다 높은 농도로 장치에 부가될 경우, CO₂는 배지에 용해되고 배양물 pH는 감소될 것이다. 본 발명은 세포 배양물 안팎으로 CO₂가 전달되게 하여, 염기의 첨가없이 배양물 pH를 유지시키는 방법을 제공한다.

따라서, 본 발명은 용기 내에서 비카르보네이트-함유 배양 액체 중에 진핵 세포를 포함하는 진핵 세포를 배양하는 방법을 제공하며, 상기 용기는 세포 배양물을 둘러싸는 벽 및 상기 세포 배양물 상부의 기체 상 헤드 스페이스를 갖는다. 용기는 또한 상기 헤드 스페이스로부터 기체의 유입 및 유출을 제공하는 적어도 하나의 포트를 포함한다. 용기는 액체 상 및 기체 상 사이에 동적 경계면이 제공되도록 교반된다. 배양물의 pH는 모니터링될 수 있고, 기체는 상기 포트를 통해 헤드 스페이스로 제공되거나 (이 경우 기체는 보다 많은 CO₂가 세포 배양물에 용해됨에 따라 pH를 감소시키기 위한 양으로 CO₂를 함유함), 또는 축적된 CO₂는 세포 배양물의 pH를 증가시키기 위해 포트를 통해 헤드 스페이스로부터 제거된다. 따라서 pH는 소정 범위로 유지된다.

일반적으로, 세포 배양 배지에 용존 CO₂의 분압은 1 내지 200 mmHg의 양으로 유지된다. 일부 실시양태에서, 용존 CO₂의 분압은 10 내지 180 mmHg이다. 일부 실시양태에서, 용존 CO₂의 분압은 20 내지 150 mmHg이다. 일부 실시양태에서, 용존 CO₂의 분압은 100-180 mmHg이다. 일부 실시양태에서, 용존 CO₂의 분압은 20 내지 80 mmHg이다. 일부 실시양태에서, 용존 CO₂의 분압은 30 내지 60 mmHg이다. 일부 실시양태에서, 용존 CO₂의 분압은 35 내지 50 mmHg이다. 일부 실시양태에서, 용존 CO₂의 분압은 40 mmHg이다.

헤드 스페이스 클리어런스는 계속적으로 또는 간헐적으로 이루어질 수 있다.

일반적으로, DO는 10％를 초과하여 유지된다. 일부 실시양태에서, DO는 20％를 초과하여 유지된다. 일부 실시양태에서, DO는 30％를 초과하여 유지된다. 일부 실시양태에서, DO는 40％를 초과하여 유지된다. 일부 실시양태에서, DO는 50％를 초과하여 유지된다. 일부 실시양태에서, DO는 60％를 초과하여 유지된다.

일부 실시양태에서, 용기로의 기체의 유량은 0.001 분당 헤드스페이스 부피 (hvm)이다. 일부 실시양태에서, 용기로의 기체의 유량은 0.005 hvm이다. 일부 실시양태에서, 용기로의 기체의 유량은 0.01 hvm이다. 일부 실시양태에서, 용기로의 기체의 유량은 0.02 hvm이다. 일부 실시양태에서, 용기로의 기체의 유량은 0.05 hvm이다. 일부 실시양태에서, 용기로의 기체의 유량은 0.1 hvm이다. 일부 실시양태에서, 용기로의 기체의 유량은 0.2 hvm이다. 일부 실시양태에서, 용기로의 기체의 유량은 0.5 hvm이다. 일부 실시양태에서, 용기로의 기체의 유량은 0.9 hvm이다. 일부 실시양태에서, 용기로의 기체의 유량은 1.0 hvm이다.

진핵 세포는 척추동물 세포, 예컨대 개구리, 토끼, 설치류, 양, 염소, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 비-인간 영장류 또는 인간으로부터의 세포일 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

상기 방법은 플라스틱 콘테이너 또는 일회용 배양 백과 같은 강성 또는 유연성 벽을 갖는 용기에서 행할 수 있다.

용기는 용기 내의 액체 상 및 기체 상 사이에 동적 경계면을 제공하는 임의의 수단에 의해 교반될 수 있다. 이같은 교반은 예를 들어 요동, 궤도 운동, 8자형 운동, 회전 운동, 진탕 등에 의할 수 있다.

일부 실시양태에서, 교반은 요동에 의해 이루어진다. 요동 속도 및 요동 각도는 목적하는 교반이 달성되도록 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 요동 각도는 20°, 19°, 18°, 17°, 16°, 15°, 14°, 13°, 12°, 11°, 10°, 9°, 8°, 7°, 6°, 5°, 4°, 3°, 2°, 또는 1°이다. 특정 실시양태에서, 요동 각도는 6-16°이다. 다른 실시양태에서, 요동 각도는 7-16°이다. 다른 실시양태에서, 요동 각도는 8-12°이다.

일부 실시양태에서, 요동 속도는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 rpm이다. 일부 실시양태에서, 요동 속도는 19-25 rpm이다. 일부 실시양태에서, 요동 속도는 20-24 rpm이다. 일부 실시양태에서, 요동 속도는 21-23 rpm이다.

상기 방법은 배양물의 헤드 스페이스로부터 기체가 유입 및 유출되게 하는 단일 포트를 함유하는 용기 내에서 수행될 수 있다. 다르게는, 용기는 복수개의 포트를 함유할 수 있다.

배양물의 pH는 계속적으로 또는 간헐적으로 모니터링되고, 기체는 배양물의 액체 상 용존 CO₂의 농도를 증가 또는 감소시키는 방향으로 헤드 스페이스 내에 기체의 CO₂ 수준이 제공되도록 헤드 스페이스로 주입되어, 액체 상의 pH는 소정의 값으로 조정된다.

대안적 실시양태에서, 상기 방법은 배지 포트를 통해 신선한 배양 배지를 세포 배양물로 관류시키는 단계를 포함할 수 있다. 신선한 배지는 첨가시에 세포 배양물의 전체 pH를 조정하는 pH를 가져, 신선한 배양물의 pH는 세포 배양물을 소정의 pH 범위로 부분적으로 유지시킨다. 소정의 pH를 갖는 신선한 배지를 이용한 pH 조절은 배양 방법에 도움이 되지만, pH를 완전하게 제어하는데 충분하지는 않다.

상기 방법은 임의의 크기의 배양물에 적용가능하다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 시판하는 일회용 생물반응 백에서 수행된다. 이같은 생물반응 백은 500 mL, 1 L, 2 L, 10 L, 20 L, 50 L, 100 L, 200 L, 500 L, 및 1000 L와 같은 부피로 이용가능하다.

다양한 배양 파라미터를 모니터링하고 제어할 수 있다. 이같은 파라미터는 컴퓨터에 의해 연산되는 자동화된 공정에서 제어될 수 있다. 제어될 수 있는 몇몇 단독 또는 조합 파라미터에는 기체 유동, pH, 용존 CO₂ 농도, 온도 및 교반이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법을 수행하기 위한 장치를 제공한다.

도 1은 관류 필터를 포함하는 본 발명의 장치의 예를 보여준다. 장치는 기체용 유입구 포트 및 유출구 포트, 배양물에 신선한 배지를 제공하기 위한 포트, 데크 및 베이스를 요동시켜 소비된 배지를 제거하는 관류 필터를 포함한다. 요동 운동은 세포 배양 배지의 안팎으로 O₂ 및 CO₂가 효율적으로 전달되도록 교반되게 한다.
도 2는 웨이브 바이오리액터™ 내의 산소 전달을 측정하기 위한 세포-비함유 연구를 보여준다. (패널 A) 0.2 L/min의 일정한 공기 유량에서의 요동 속도 및 요동 각도의 k_La에 대한 효과; (패널 B) k_La에 대한 요동 속도, 요동 각도, 및 공기 유량의 효과; (패널 C) 상이한 요동 각도, 요동 속도 및 0.2 L/min (본원에서는 또한 LPM라고도 함)의 일정한 기체 유량에 대한 원 DO 데이터; (패널 D) 2가지의 상이한 요동 설정점 및 상이한 기체 유량에 대한 원 DO 시간 경과 데이터.
도 3은 웨이브 바이오리액터™에서의 CO₂ 제거 속도를 평가하기 위한 세포-비함유 연구를 보여준다. (패널 A); 상이한 요동 각도, 요동 속도 및 0.2 LPM의 일정한 기체 유량에 대한 원 pH 상승 데이터; (패널 B) 2가지의 상이한 요동 설정점 및 상이한 기체 유량에 대한 원 pH 상승 시간 경과 데이터. (패널 C)는 패널 A에 나타낸 상이한 요동 조건에 대한 pH에서의 변화 속도를 계산한 것이고; (패널 D)는 패널 B에 나타낸 상이한 요동 조건 및 상이한 기체 유량에 대한 pH의 변화 속도를 계산한 것이다. 폐쇄 막대는 처음 5 분 동안의 pH에서의 변화 속도이고, 개방 막대는 다음 55 분 동안의 계산된 pH에서의 변화 속도이다.
도 4는 웨이브 바이오리액터™ 회분 배양물에 대한 (패널 A) VCC, (패널 B) 오프 라인 pH, (패널 C) 오프 라인 pCO₂, 및 (패널 D) 오프 라인 DO 프로파일을 보여준다. 공정 조건은 하기 표 2에 요약되어 있다. (i) MAb B를 생산하는 세포주에 대해서는 접종 단계만을 평가하였고, (ii) MAb C를 생산하는 세포주에 대해서는 접종 및 규모 확대 단계 (작업 부피가 6 L에서 20 L로 증가하는 동안) 둘 모두를 평가하였다. 각 단계 동안, 헤드스페이스로 펌핑되는 공기는 제1일 동안 CO₂ 8％ (v/v), 제2일 동안 5％ (v/v), 및 그 이후에는 2％ (v/v)로 보충된다.
도 5는 비최적의 조건하에서 구동한 MAb A를 생산하는 세포주를 이용한 2가지의 웨이브 바이오리액터™ 관류 배양물에 대한 (패널 A) VCC, (패널 B) 배양 생존율, (패널 C) 오프 라인 pH, 및 (패널 D) DO 농도를 보여준다. 세포는 처음 6일 동안은 회분 방식으로 배양되었고, 그 이후에는 관류 방식으로 배양되었다. 회분 배양 동안, 셀백™ 내의 작업 부피는 배양물 6 L로 처음 접종되었고, 제3일에 신선한 배지의 첨가에 의해 이 배양 부피는 25 L로 증가되었다. 관류 배양 동안, 배양 부피는 하루에 1 부피의 관류 속도로 25 L로 유지시켰다. 이러한 설정의 실험동안, 요동 속도는 18 rpm 및 요동 각도는 8 도였고, 헤드스페이스로의 공기 유량은 0.2 L/min이었다. 이 공기는 전체 배양 기간 동안 5％ CO₂ (v/v)로 보충되었다.
도 6은 회분 (제0일-제6일)/관류 (제6일-제14일) 공정 동안의 세포 배양물 성장 프로파일 및 pH 프로파일을 보여준다. (패널 A) 충전 세포 부피 (％PCV); (패널 B) 세포 생존율; (패널 C) pH 프로파일; (패널 D) 세포 성장 (생존 세포 계수 (VCC), 비셀(ViCell)™ AS로 측정함).
도 7은 다양한 헤드 스페이스 클리어런스율 (hvm)로부터의 배양 성능을 보여준다. (패널 A)는 공기 유동을 한 단계로 증가시켜 헤드 스페이스 클리어런스율을 증가시키는 2가지 실험을 보여준다 (0.1 hvm (

) 및 0.02 hvm (

). 다른 헤드 스페이스 클리어런스율 전략은 제10일 및 제11일에서의 다단계 증가 (0.007 hvm → 0.013 hvm → 0.02 hvm) (

)이다. (패널 B)는 노바 바이오프로파일(NOVA BioProfile)® 400으로 측정한 용존 CO₂ 분압을 보여준다.
도 8은 최적화된 공정을 이용하여 각각 상이한 MAb를 생산하는 6가지의 상이한 세포주의 웨이브 바이오리액터™ 배양물에 대한 (패널 A) VCC, (패널 B) 배양 생존율, (패널 C) 오프라인 pH, 및 (패널 D) DO를 보여준다. 6 L 접종 단계 동안, 배양물을 21 rpm으로 요동시켰고, 헤드스페이스로의 공기 유량의 속도는 0.2 L/min이었다. 이러한 공기는 제1일 동안 CO₂ 8％ (v/v), 제2일 동안 5％ (v/v), 및 그 이후에는 2％ (v/v)로 보충되었다. 이러한 공기 유동 전략을 20 L 규모 확대 단계 (제3일 - 제6일) 동안 반복하였다. 20 L 관류 방식으로의 배양 동안 (제6일 이후), 헤드스페이스로의 공기 유량은 CO₂를 보충하는 경우를 제외하고 0.6 L/min으로 유지시켰고, 유입구 기체 내의 공기에의 O₂ 혼합은 제8일째에 0％ (v/v)에서 30％ (v/v)로 증가시켰으며, 배양의 나머지 기간 동안에는 30％ (v/v)로 유지시켰다. 20 L 회분 및 관류 배양물을 23 rpm으로 요동시켰다. 모든 배양물의 요동 각도는 10°로 일정하게 하였다.
도 9는 웨이브 바이오리액터™ (

) 및 교반 탱크 생물반응기 (□) 내에서의 MAb E를 생산하는 세포주의 평행 배양물에 대한 (패널 A) VCC, (패널 B) 생존율, (패널 C) 오프라인 pH, 및 (패널 D) 오프라인 DO를 보여준다.

발명의 상세한 설명

당업자는 진핵 세포를 배양하기 위한 많은 프로토콜 및 방법을 잘 숙지하고 있으며, 동일하게 배지를 배양할 수 있다. 그러한 프로토콜 및 배양 배지는 문헌 [ANIMAL CELL CULTURE, A PRACTICAL APPROACH 2^ND ED., Rickwood, D. and Hames, B.D., eds., Oxford University Press, New York (1992)]와 같은 문헌 및 교재에 기재되어 있다. 일반적인 사용 방법을 또한 protocol-online.org/prot/Cell_Biology/Cell_Culture와 같은 인터넷 상에서 이용가능하다. 세포 배양 배지는 또한 널리 공지되어 있는 다양한 공급원으로부터 구입할 수 있다. 본원에서 인용되는 모든 문헌은 본원에 참고로 포함된다.

정의

본원에 기재되어 있거나 언급되어 있는 일반적인 세포 배양 기술 및 절차는 널리 이해되어 있으며, 당업자가 통상적인 방법론을 이용하여 흔히 이용한다. 적절한 경우, 시판되는 키트 및 시약을 이용하는데 수반되는 절차는, 달리 나타내지 않는 한 제조업체가 규정한 프로토콜 및/또는 파라미터에 따라 수행한다.

본 발명의 방법을 기재하기 전에, 본 발명은 본원에 기재된 특정 방법, 프로토콜, 세포주, 동물 종 또는 속, 구축물 및 시약으로 한정되지 않으며, 이들은 물론 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 또한 본원에 사용된 용어는 본 발명의 범주를 제한하기 위함이 아니라, 특정 실시양태만을 기재하기 위한 목적이라고 이해해야 할 것이며, 본 발명의 범주는 하기하는 특허청구범위에 의해서만 제한될 것이다.

본원 및 하기하는 특허청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 문맥상 달리 명백하게 나타내지 않는다면 복수 형태를 포함한다는 것을 주목한다. 명세서 및 하기하는 특허청구범위에서 언급된 모든 숫자 (예를 들어, 1 내지 200 mm Hg 등)는 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해해야 한다.

본원에서 언급된 모든 간행물들은 간행물에서 인용된 방법 및/또는 물질을 개시하고 기재하기 위해 본원에 참고로 포함된다. 본원에서 언급된 간행물은 본원의 출원일 이전의 그의 개시내용에 대해 인용된다. 여기서, 그 어느 것도 본 발명자들이 본 발명의 최우선일 또는 우선일에 의해 간행물보다 선행하지 않는다고 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 또한, 실제 공개일은 제시된 것과 상이할 수 있고, 별도의 확인을 필요로 할 수 있다.

본원에서 사용된 "약"은 언급된 값보다 10％ 더 많거나 또는 더 적은 값을 지칭한다.

본원에서 사용된 "교반하다"는 배양물의 액체 상이 배양물 상부의 기체 상과 동적 경계면을 이루도록 동요시키는 것을 지칭한다. 교반한다는 것은 액체 상을 정적이지 않게 하고 액체 상 안팎으로 기체의 확산을 증가시키는, 진탕, 교반, 요동, 궤도 진탕, 롤링, 8자형 진탕 또는 임의의 다른 수단과 같은 모션을 지칭할 수 있다.

본원에서 사용된 "기체"는 순수한 기체 또는 기체의 혼합물 (질소, 산소 및 이산화탄소를 포함할 수 있음)을 지칭한다. 전형적으로, 질소는 총 기체 농도의 약 60 내지 90％의 양으로 존재하고, 산소는 총 기체 농도의 약 10 내지 40％의 양으로 존재하며, 이산화탄소는 총 기체 농도의 약 0 내지 50％의 양으로 존재한다.

본원에서 사용된 "비카르보네이트-함유 세포 배양 액체"는 그의 조성 중 일부로서 비카르보네이트 완충 시스템을 함유하는, 진핵 세포 배양에 적합한 배양 배지를 지칭한다. 상기 배지는 또한 HEPES 또는 MOPS 등과 같은 추가의 완충제를 함유할 수 있지만, 비카르보네이트계 시스템도 또한 함유하여야 한다.

본원에서 사용된, "세포 배양물"은 완충제 및 생존 세포의 성장 및/또는 유지에 요구되는 영양분을 함유하는 액체 배지 중에 진핵 세포를 함유하는 액체 제제를 지칭한다.

본원에서 사용된, "용존 CO₂ 농도"는 CO₂의 상대적 측정 분압으로 표현된다 (단위 mmHg). 따라서, 용존 CO₂의 분압은 용존 CO₂ 농도가 반영된 것으로 사용된다.

"DO"는 용존 산소를 지칭한다.

본원에서 사용된 "동적 경계면"은 세포 배양물을 교반하는 것에 의해 제공되는 액체 상 및 기체 상 사이의 기체의 증강된 활발한 교환을 지칭한다.

본원에서 사용된 "진핵 세포"는 무척추동물 또는 척추동물 세포일 수 있는 동물 세포를 지칭한다.

본원에서 사용된 "헤드 스페이스"는 세포를 배양하는데 사용되는 용기가 갖는, 세포 배양물의 액체 상 상부의 기체 상을 지칭한다.

본원에서 사용된 hvm은 분당 헤드 스페이스 부피를 지칭하며, 헤드 스페이스에서 기체가 소실되는 속도를 나타낸다.

k_La 부피 산소 전달 계수를 지칭한다.

는 부피 이산화탄소 전달 계수를 지칭한다.

LPM은 기체 유동의 분당 리터를 지칭한다.

본원에서 사용된 "조절하다"는 값을 증가 또는 감소시키는 것을 지칭한다.

본원에서 사용된 "모니터링하다"는 샘플링 및 분석에 의해 특정 값을 추적하여 그러한 값을 간헐적으로 또는 계속적으로 결정하는 것을 지칭한다.

pCO₂는 용존 CO₂ 농도의 분압을 지칭한다.

본원에서 사용된 "포트"는 밀폐된 시스템으로의 다른 접근 지점을 지칭한다.

본원에서 사용된, "소정의"는 목표 값으로 사용된 특정 파라미터에 대해 사전에 선택된 값을 지칭한다.

본원에서 사용된 "rpm"은 분당 요동을 지칭한다.

VCC는 생존 세포 농도를 지칭한다.

본원에서 사용된 "용기"는 콘테이너를 지칭한다. 본원에서 사용되는 이같은 용기는, 예를 들어 플라스크, 생물반응기, 일회용 생물반응 백, 배양 챔버 등일 수 있다.

본원에서 사용된 "vvm"은 분당 용기 부피를 지칭한다.

이론적 측면

웨이브 바이오리액터™ 배양물내 O ₂ 전달

웨이브 바이오리액터™ 내 O₂ 전달 속도를 결정하기 위해, 본 발명자들은 온라인 DO 프로브, 셀벡™ 내에서의 이상적인 혼합, 및 액체상 경계면에 의한 물질 이동 저항의 지배에 대해 충분히 빠른 반응 시간을 가정한다. 이러한 가정하에서, 이하의 질량 균형 방정식은 기체 상에서 액체 상으로의 O₂ 전달 속도에 대해 근사치를 낼 것이다:

(1)

(상기 식에서, O₂ ^*는 배지 내의 포화 DO 농도이고, O₂는 배지 내의 DO 농도임). O₂를 시간 0에서 0으로 수렴시키면, 다음과 같은 방정식이 얻어질 것이다:

(2)

를 시간의 함수로서 플롯팅하면, 최적 맞춤선의 기울기는 시스템에 대한 k_La를 제공할 것이다.

웨이브 바이오리액터™ 내 O₂ 전달 속도를 증가시키기 위해 (방정식 1), 본 발명자들은 시스템의 k_La를 증가시키거나, 또는 농도 구배 (O₂ ^* - O₂)를 증가시키거나, 또는 둘 다를 증가시킬 수 있다. 웨이브 바이오리액터™ 시스템의 k_La를 증가시키기 위해, 본 발명자들은 요동 속도, 요동 각도, 또는 공기 유량을 증가시킬 수 있다 (문헌 [Mikola, 2007]; [Singh, 1999]). 기체로부터 액체 상으로의 O₂ 전달을 위한 구동력을 제공하는 농도 구배 (O₂ ^* - O₂)를 증가시키기 위해, 본 발명자들은 유입구 기체 중의 O₂ 백분율을 증가시켜 O₂ ^*를 증가시킬 수 있다.

웨이브 바이오리액터™ 배양물내 CO ₂ 전달

단순화된 모델에서, 셀백™ 내 기체상 CO₂ (CO_2(g))는 배양 배지 중의 용존 CO₂ (CO_2(aq))와 평형 상태로 존재한다:

(3)

차례로 CO_2(aq)는 탄산 (H₂CO₃)과 평행 상태로 존재하며, 이는 비카르보네이트 (HCO₃ ^-)로 해리될 수 있다:

(4)

HCO₃ ^-의 카르보네이트 (CO₃ ^2-)로의 추가의 해리는 pH 4-8 범위에서 무시해도 될 정도이어야 한다 (문헌 [Royce and Thornhill, 1991]).

배양 배지로부터 CO₂ 발생에 대한 속도 제한 단계는 기체-액체 물질 전달일 것이다 (방정식 3). 경계면에서의 액체 내 CO₂ 농도가 벌크 기체 내의 그것과 평형이라고 가정하면, 이하의 질량 균형 방정식은 액체 상에서 기체 상으로의 CO₂ 전달 속도에 대해 근사치를 낼 것이다:

(5)

(상기 식에서,

는 부피 용존 이산화탄소 전달 계수임).

웨이브 바이오리액터™ 내의 용존 CO₂ 프로브 없이, 본 발명자들은 실시간 CO₂ 측정치로 CO_2(aq) 전달 속도를 바로 계산할 수는 없다. 그러나, 본 발명자들의 배양 배지 내 비카르보네이트-완충 시스템에 대한 본 발명자들의 지식에 기초하여, 본 발명자들은 CO₂ 제거가 방정식 3 및 4에서의 평형을 좌측으로 이동시킬 것이기 때문에 배양물 pH를 증가시킬 것이라고 예상한다. 온라인 pH 프로브에 대해 충분히 빠른 반응 시간을 가정할 때, 동적 CO_2(aq) 전달 연구에서 생성된 pH 프로파일은 CO_2(aq) 제거 속도의 간접 추정치를 제공할 것이다.

배양물 pH를 증가시키기 위해, 본 발명자들은 시스템의

를 증가시키거나, 또는 CO₂ 전달을 위한 구동력 (CO_2(aq) - CO_2(g))을 증가시키거나, 또는 둘 모두를 증가시킴으로써 웨이브 바이오리액터™ 내의 CO₂ 제거 속도를 증가시킬 수 있다 (방정식 5). 구체적으로, 웨이브 바이오리액터™ 시스템의

를 증가시키기 위해, 본 발명자들은 요동 속도 및 요동 각도를 증가시킬 수 있다. 구동력 (CO_2(aq) - CO_2(g))을 증가시키기 위해, 본 발명자들은 유입구 기체 내의 CO₂ 백분율을 감소시켜 CO_2(g)를 감소시킬 수 있다. 헨리의 법칙에 따르면, 셀백™ 헤드스페이스 내의 CO_2(g) 분압 (pCO_2(g))은 배지 내의 CO_2(aq) 농도를 제한할 것이다:

(6)

(상기 식에서, H = CO₂에 대한 헨리 법칙 상수).

반대로, 배양물 pH를 감소시키기 위해, 본 발명자들은 유입구 기체 내의 CO_2(g) 농도를 증가시켜 CO_2(aq)를 증가시킴으로써, 방정식 4에서의 평형을 우측으로 이동시킬 수 있다.

본 발명의 방법

본 발명의 방법에서, 진핵 세포는 세포의 생존을 가능하게 하는 적합한 배양 배지 및 온도에서 배양된다. 당업자가 알고 있는 바와 같이, 상이한 세포 유형은 상이한 배지에서 성장할 수 있다. 당업자는 특정 세포 유형 및/또는 특정 적용에 적합한 배지를 쉽게 선택할 수 있다. 본 발명의 방법에서, 배지는 CO₂에 의한 pH 조절을 위해 비카르보네이트 완충 시스템을 함유하여야 한다. 배지는 완충제로서 작용하는 추가의 작용제를 함유할 수 있다.

본 발명의 방법에 사용될 수 있는 진핵 세포에는 동물 세포가 포함되며, 이는 무척추동물 세포 뿐만 아니라 척추동물 세포일 수 있다. 무척추동물 세포에는 곤충 세포 (예를 들어, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda), 봄빅스 모리(Bombyx mori), 및 트리코플루시아니(Trichoplusia ni) 세포)가 포함된다. 척추동물 세포에는 포유동물 및 비-포유동물 세포가 포함된다. 척추동물 세포에는 개구리 (예를 들어, 크세노포스 라에비스(Xenopus laevis)), 토끼류 (예를 들어, 집토끼 및 산토끼), 설치류 (예를 들어, 래트, 햄스터, 저드, 저빌 및 마우스), 고양이, 개, 양, 소, 염소, 돼지, 말, 비-인간 영장류 및 인간으로부터의 세포가 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 방법에 사용되는 세포는 재조합 또는 비-재조합 세포일 수 있다. 재조합 세포에는 특정 단백질을 발현하도록 조작된 세포 (예컨대, 안정적으로 또는 일시적으로 형질감염된 세포), 또는 특정 RNA (예를 들어, siRNA, 리보자임 등)를 생산하도록 조작된 세포가 포함될 수 있다.

적절한 배지 내의 세포는 배양 용기 내에 놓여지고, 헤드 스페이스로 기체가 주입된다. 일부 실시양태에서, 헤드 스페이스 클리어런스율은 약 0.002 내지 0.1 hvm의 범위내이다. 일부 실시양태에서, 헤드 스페이스 클리어런스율은 약 0.007 내지 0.08 hvm의 범위내이다. 일부 실시양태에서, 헤드 스페이스 클리어런스율은 약 0.009 내지 0.06 hvm의 범위내이다. 일부 실시양태에서, 헤드 스페이스 클리어런스율은 약 0.01 내지 0.04 hmv의 범위내이다. 일부 실시양태에서, 헤드 스페이스 클리어런스율은 약 0.02 내지 0.03 hvm의 범위내이다. 또 다른 실시양태에서, 헤드 스페이스 클리어런스율은 약 0.009 내지 0.024 hmv의 범위내이다. 추가의 실시양태에서, 헤드 스페이스 클리어런스율은 약 0.007 내지 0.02 hvm의 범위내이다. "hvm"은 기체의 부피 유량 (L/min) 대 헤드스페이스의 부피 (L) 비율이다.

일부 실시양태에서, 예를 들어 배양물 부피가 20 L이고 헤드스페이스 부피가 30 L인 50 L 웨이브 바이오리액터™ 백에서, 용기로의 기체의 유량은 0.1 L/min 내지 1 L/min이다. 일부 실시양태에서, 백으로의 기체 유량은 0.2 L/min이다. 일부 실시양태에서, 유량은 0.3 L/min이다. 다른 실시양태에서, 기체 유량은 0.4 L/min이다. 또 다른 실시양태에서, 기체 유량은 0.5 L/min이다. 다른 실시양태에서, 기체 유량은 0.6 L/min이다. 다른 실시양태에서, 기체 유량은 0.7 L/min이다. 또 다른 실시양태에서, 유량은 0.8 L/min이다. 다른 실시양태에서, 유량은 0.9 L/min이다.

일반적으로, 세포 배양물은 약 6 내지 8의 범위 내로 유지되어야 한다. 일부 실시양태에서, pH는 약 6.6 내지 7.6의 범위 내로 유지된다. 일부 실시양태에서, pH는 약 6.9 to 7.5의 범위 내로 유지된다. 일부 실시양태에서, pH는 약 6.8 내지 7.2의 범위 내로 유지된다. 일부 실시양태에서, pH는 약 7.0 내지 7.3의 범위 내로 유지된다. 본 발명의 방법이 배양물 중에서의 세포의 성장을 유도하는 pH를 유지시키기 위해 pH 모니터링을 필요로 하고 있지는 않지만, 본 발명의 방법의 일부 실시양태에서 배양물의 pH는 (간헐적으로 또는 계속적으로) 모니터링될 수 있다. 측정은 계내에서 또는 오프라인에서 이루어질 수 있다.

본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, DO는 10％를 초과하여 유지된다. 다른 실시양태에서, DO는 20％를 초과하여 유지된다. 다른 실시양태에서, DO는 30％를 초과하여 유지된다. 다른 실시양태에서, DO는 40％를 초과하여 유지된다. 다른 실시양태에서, DO는 50％를 초과하여 유지된다. 다른 실시양태에서, DO는 60％를 초과하여 유지된다. 다른 실시양태에서, DO는 70％를 초과하여 유지된다. 다른 실시양태에서, DO는 80％를 초과하여 유지된다. 다른 실시양태에서, DO는 90％를 초과하여 유지된다.

액체 배지 중의 CO₂ 농도를 모니터링하는 것은 당업계에 널리 알려져 있으며, 시중의 기술을 이용하여 달성할 수 있다. 측정은 계내에서 또는 오프라인에서 이루어질 수 있다.

본 발명의 방법의 특정한 예시적 실시양태에서, 세포를 단계적 방식으로 배양하는 회분 공정이 사용된다. 이러한 방법에서는 20 L의 배양 작업 부피를 갖는 웨이브 바이오리액터™ 시스템 50 L 백이 사용되며, 헤드스페이스에는 제1일 동안 8％ CO₂ (v/v) 기체가 보충된 기체, 제2일에는 5％ CO₂ (v/v) 기체가 보충된 기체 및 그 이후에는 2％ CO₂ (v/v) 기체가 보충된 기체가 주입된다. 웨이브 바이오리액터™는 접종 동안에는 10°에서 21 rpm 및 0.2 L/min으로, 이어서 규모 확대 단계 동안에는 23 rpm, 10° 요동 각도 및 0.2 L/min으로 요동된다. 이러한 방식에서는 사용된 파라미터에 의해 pH가 유지될 것이기 때문에 pH를 모니터링할 필요가 없다.

본 발명의 방법의 특정한 예시적 실시양태에서, 관류 공정이 사용된다. 이러한 방법에서는 20 L 배양 작업 부피를 갖는 웨이브 바이오리액터™ 50 L 백이 사용된다. 상기 백에는 관류를 개시하고 2일 후에 30％ O₂ (v/v)가 보충된 기체가 주입된다. 기체 유량은 제0일에 0.2 L/min에 이어서, 제3일에는 0.4 L/min으로 증가되고, 이후 제6일에는 다시 0.6 L/min으로 증가되는 단계적인 방식으로 증가된다. 이러한 방식에서는, 사용되는 파라미터에 의해 pH가 유지될 것이기 때문에 pH를 모니터링할 필요가 없다.

본 발명의 방법의 또 다른 특정한 예시적 실시양태에서, 관류 공정이 사용된다. 이 방법에서는 20 L 배양 작업 부피를 갖는 웨이브 바이오리액터™ 50 L 백이 사용된다. 상기 백에는 관류를 개시하고 2일 후에 30％ O₂ (v/v)가 보충된 기체가 주입된다. 기체 유량은 0.6 L/min의 유량으로 일정하게 유지된다. 이러한 방식에서는, 사용되는 파라미터에 의해 pH가 유지될 것이기 때문에 pH를 모니터링할 필요가 없다.

본 발명의 방법의 또 다른 특정한 예시적 실시양태에서, 관류 공정이 사용된다. 이 방법에서는 20 L 배양 작업 부피를 갖는 웨이브 바이오리액터™ 50 L 백이 사용된다. 상기 백에는 관류를 개시하고 2일 후에 30％ O₂ (v/v)가 보충된 기체가 주입된다. 기체 유량은 1.0 L/min의 유량으로 일정하게 유지된다. 이러한 방식에서는, 사용되는 파라미터에 의해 pH가 유지될 것이기 때문에 pH를 모니터링할 필요가 없다.

배양 조건의 파라미터 (기체 농도, 유량, hmv, 요동 속도, 요동 각도 등)는 목적하는 범위의 pH를 달성하기 위해 본원의 교시내용을 이용하여 조정할 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.

장치

세포 배양 배지를 수용하기 위한 용기는 임의의 특정 크기로 제한되지 않는다. 본 발명의 용기는 당업계에서 사용되는 바와 같은, 흔히 사용되는 생물반응기 및 일회용 배양 백의 크기로 조정될 수 있으며, 보다 크거나 작은 배양을 위해 조정될 수 있다.

용기는 용기 제작을 위해 사용된 물질로 제한되지 않는다. 용기는 유리 또는 강성 플라스틱과 같은 고체 물질로 제조될 수 있거나, 또는 일회용 생물반응 백을 생산하는데 사용되는 것과 같은 유연성 물질, 예컨대 연질 플라스틱으로 제조될 수 있다.

용기는 교반시 배지의 교란을 증가시키기 위한 배플을 임의로 함유할 수 있다.

용기에는 기체 및 액체의 첨가나 제거를 가능하게 하는 하나 이상의 포트가 장착될 수 있다. 기체는 하나 이상의 포트를 통해 헤드 스페이스에 충전되고 헤드 스페이스로부터 제거된다. 한 실시양태에서, 기체의 유입 및 유출을 둘 모두 가능하게 하는 단일 포트가 존재한다. 다른 실시양태에서는, 기체의 유입을 위한 1개의 포트 및 기체의 유출을 위한 1개의 포트, 2개의 포트가 존재한다. 다른 실시양태에서는, 기체의 유입 및 유출을 위해 복수개의 포트가 사용된다.

일부 실시양태에서, 장치는 또한 세포 배양 배지의 pH를 계속적으로 또는 간헐적으로 모니터링하는 pH 모니터를 포함할 수 있다. pH 모니터는 용기의 헤드 스페이스에 기체를 주입하거나 탈기시켜 CO₂의 농도를 변경시킴으로써 세포 배양 배지의 pH가 조정되게 하는 자동화된 시스템과 연계되어 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 장치는 배지 내 CO₂ 농도의 지표로서 용존 CO₂의 분압을 계속적으로 또는 간헐적으로 모니터하는 CO₂ 용 모니터를 포함한다. CO₂ 모니터는 용기의 헤드 스페이스에 기체를 주입하거나 탈기시켜 용존 CO₂의 농도를 변경시킴으로써, CO₂ 모니터에 의해 측정되는 실제 CO₂ 농도가 조절되어 그 농도를 소정의 값으로 조정되게 하는 자동화된 시스템과 연계되어 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 장치는 세포 배양 배지의 온도를 계속적으로 또는 간헐적으로 모니터링하는 온도용 모니터를 포함한다. 온도 모니터는 온도를 증가 또는 감소시켜 모니터에 의해 측정되는 실제 온도가 조절되어 소정의 값으로 조정되게 하는 자동화된 시스템과 연계되어 사용될 수 있다.

다양한 파라미터 모니터가 단독으로 또는 함께 사용될 수 있으며, 컴퓨터에 의해 제어되는 자동화 시스템에 의해 제어될 수 있다. 컴퓨터는 세포 배양 배지의 pH 조정을 위해, 헤드 스페이스에 주입되거나 그로부터 탈기되는 CO₂의 양을 결정하는데 필요한 연산을 수행하도록 프로그래밍될 수 있다. 컴퓨터는 또한 온도, 교반 속도, 배지 관류 및 다른 파라미터에 대한 연산을 수행할 수 있을 뿐만 아니라, 수단들을 제어하여 자동화된 방식으로 파라미터를 조정할 수 있다.

임의로, 본 발명의 장치는 세포 배양 배지가 정적이지 않으면서 헤드 스페이스의 기체와 동적 경계면을 이루도록 용기를 교반하기 위한 교반기를 포함한다. 교반은 세포 배양 배지 안팎으로의 기체의 확산을 용이하게 한다. 교반기는 당업계에 알려져 있는 임의의 형태일 수 있지만, 진탕기, 궤도 진탕기, 회전기, 8자형 진탕기, 요동 플랫폼, 회전 플랫폼 등의 비-제한적인 예를 포함한다.

자동화된 기체 전달 및 기체 퍼징 시스템은 용기로의 기체 유량을 제어하기 위한 제어 게이지가 장착된 멸균 필터를 통해 가압된 기체를 전달하기 위한 밸브 및 펌프 시스템을 포함할 수 있다. 기체를 전달하고 제거하기 위해 당업계에 공지되어 있는 임의의 수단을 이용할 수 있다. 기체는 세포 배양 배지 내 용존 CO₂의 농도가 소정의 값에서 벗어났을때 컴퓨터에서 연산되는 신호에 반응하여 도입될 수 있다. 측정된 CO₂의 농도가 소정의 값에서 벗어난 경우, 자동화된 시스템은 시스템에 추가되거나 시스템으로부터 제거될 필요가 있는 CO₂의 양을 연산하고, 적절한 양의 CO₂를 함유하는 기체는 상주 기체가 유출구 포트를 통해 퍼징됨에 따라 헤드스페이스로 도입된다. 컴퓨터는 본원에 규정된 바와 같은 방정식 1, 2 및/또는 3을 수반하는 연산, 및 이용가능한 문헌, 시중에서 구입가능한 시스템 및 본원의 교시내용에 기초하여 당업자가 숙지하고 있을 시스템 조절을 위한 다른 연산을 수행할 수 있다.

별법적으로, 또는 모니터링된 CO₂ 농도를 이용하는 반응 시스템과 연계하여, 자동화된 시스템은 또한 배양 배지의 pH를 측정하고, 측정된 pH가 세포를 배양하기 위한 소정의 pH에서 벗어난 경우 대응할 수 있다. 자동화된 시스템은 CO₂ 농도 및/또는 pH에서의 편차에 대응할 수 있고, 상주 기체를 퍼징해내면서 적절한 양의 CO₂를 기체와 함께 도입하여, 배양 배지의 pH가 적절하게 조절되도록 할 수 있다.

이하에서는 장치 및 방법을 도 1을 참조하여 비제한적인 예로 설명할 것이다. 배양 용기 (40)는 세포 배양 배지와 세포 (110) 및 헤드 스페이스 (130)를 함유한다. 필터 (50)가 장착된 기체 유입구 포트 (70)가 용기 (40)에 연결되어 헤드 스페이스 (130)로의 기체의 주입이 가능하다. 필터 (60)가 장착된 기체 유출구 포트 (80)는 용기 (40)에 연결되어 헤드 스페이스 (130)로부터의 기체의 유출이 가능하다. 용기는 플랫폼 (30)으로 받쳐지고, 플랫폼은 요동기 (20) 및 베이스 (10)와 연결되어 세포 배양 배지 (110)의 요동 운동 및 교반이 가능하다. 교반 및 헤드 스페이스 (130) 내에서의 기체 유동은 세포 배양 배지 (110) 안팎으로의 O₂ 및 CO₂의 확산을 가능하게 한다. 배양 용기 내에 세포를 체류시키기 위한 임의의 관류 필터 (90)는 튜브 (100)를 통해 배지 포트 (120)로 연결되어, 필요에 따라 세포 배양물로부터 소비된 배양 배지가 제거되도록 한다.

세포는 용기 (40) 내의 세포 배양 배지 (110)에서 배양된다. 용기 (40) 내의 헤드 스페이스 (130)는 기체로 채워진다. 기체 유입구 포트 (70)를 통한 기체의 유동 및 기체 유출구 포트 (80) 밖으로의 기체의 유동은 베이스 (10)에 부착된 요동기 (20) 상의 플랫폼 (30)의 요동 운동에 의해 배양물이 교반됨에 따라 헤드 스페이스 (130)를 통해 기체가 흐르게 하고, 세포 배양 배지 (110)로부터 확산된 CO₂가 헤드 스페이스 (130)로 흐르게 한다. 세포 배양 배지 (110) 내의 용존 CO₂의 감소는 세포 배양 배지 (110)의 pH를 증가시킨다.

세포 배양 배지 (110)는 임의로, 배지 튜브 (140)를 통해 배지 포트 (150)로 공급되는 신선한 배지로 보충될 수 있고, 관류 필터 (90)를 통과하여 상향 배지 튜브 (100)를 통해 배지 배출 포트 (120) 밖으로 제거될 수 있다. 이러한 본 발명의 방법의 임의의 특성에서, 본래의 세포 배양 배지의 영양소가 고갈되고 세포 폐기물이 축적되어 pH가 감소됨에 따라 신선한 배지가 공급된다. 신선한 배지는 세포 배양 배지가 소정의 최적 pH 범위에 있도록 혼합시 총 세포 배양 배지의 pH를 증가시키는데 충분한 소정의 pH로 공급된다.

실시예

A. 원칙:

대부분의 포유동물 세포 배양 시스템이 비카르보네이트-함유 세포 배양 배지를 사용하기 때문에, 포유동물 세포 배양물 내 pH 제어는 대부분 염기/CO₂ 첨가에 의해 이루어진다. pH 제어는 탄산-비카르보네이트 완충 시스템을 이용한다. 이같은 시스템, 예를 들어 일회용 백 생물반응기에서, 배양물의 pH는 배지 내 용존 CO₂의 농도를 조작하는 것에 의해 조절될 수 있고, 이는 CO₂의 헤드 스페이스 농도를 조절하는 것에 의해 조절될 수 있음을 발견하였다. 양방향 pH 조정은 본원의 실시예에서 헤드 스페이스 내 CO₂ 농도를 조절하는 것에 의해 가능한 것으로 나타났다. 이러한 방법은 세포 배양 생물반응기 시스템에서 pH를 증가시키기 위해 염기를 사용하는 것을 배제시킬 것이다. 일회용 생물반응기 내 세포 배양물의 pH를 감소시킬 필요가 있는 경우, CO₂를 함유하는 유입 기체를 보충하여 헤드 스페이스 내 CO₂의 농도를 증가시킬 수 있다. 이는 CO₂가 세포 배양물로 전달되게 할 수 있을 것이다. 일회용 백 내의 세포 배양물의 pH를 증가시킬 필요가 있는 경우, 헤드 스페이스 내 CO₂ 농도를 감소시킬 수 있거나, 또는 헤드 스페이스 클리어런스율을 증가시켜 세포 배양물로부터 CO₂ 제거가 용이하게 할 수 있다.

이러한 pH 유지 방법은, 생물반응기 내의 기체 전달이 주로 생물반응기 내에 생긴 넓은 표면적에 의해 용이하게 이루어지는 생물반응기 시스템으로 확장될 수 있다.

세포 보관 공정에서의 CO ₂ 첨가/제거에 기초한 pH 유지 전략:

세포 배양의 초기 단계 동안, 비교적 소수의 세포가 존재할 때, 세포 배양물의 pH는 전형적으로 상승한다. pH를 제어하기 위해, 전형적으로 CO₂를 생물반응기에 첨가하여 pH를 감소시킨다. 일반적으로 이러한 첨가는 정상 교반-탱크 생물반응기 내의 세포 배양물을 통해 CO₂ 기체를 살포하여 이루어진다. 본 발명의 일회용 생물반응기에서, 헤드 스페이스 내 CO₂ 농도는 CO₂ 전달 방향이 기체 상으로부터 액체 상 방향이 되도록 하는 것에 의해 변경된다. 배양 과정 동안 세포 농도가 증가함에 따라 세포 배양물 내 CO₂ 농도도 역시 증가하고, 따라서 전형적으로 pH가 감소된다. 정상 pH 피드백 제어가 되는 정상 교반-탱크 생물반응기에서는, pH 제어를 위해 염기가 첨가될 것이다. 염기의 첨가는 세포 배양물의 pH를 증가시킨다. 본 발명의 일회용 생물반응기에서, pH 증가는 헤드 스페이스 내의 CO₂ 농도를 감소시키고 뿐만 아니라 헤드 스페이스의 클리어런스율을 증가시킴으로써 CO₂ 전달 방향을 역전시키는 것에 의해 달성될 수 있다. 배지 내 CO₂ 농도를 관리하는 것에 의한 이러한 세포 배양물의 pH 유지 방법은 염기 사용을 배제시킨다. 요구사항 (pH 증가 또는 감소)에 기초하여, 헤드 스페이스 내 CO₂ 농도를 각각 감소시키거나 증가시킬 수 있다.

일회용 생물반응기 시스템은, 이들로 한정되는 것은 아니지만 마스터 세포 은행 (MCB) 및 워킹 세포 은행 (WCB)과 같은 고밀도 세포 은행을 생성하기 위한 생물반응기 시스템으로서 사용될 수 있다. 관류 세포 배양 공정은 일회용 생물반응기 내에서 고밀도 세포 은행의 생성을 가능하게 하는 것으로 여겨진다. CO₂ 첨가/제거 접근법은 pH 유지를 위해 제안되는 한편 MCB 및 WCB 생성을 위한 세포 배양 공정을 발달시킨다. pH를 유지하기 위한 기체 전달 접근법에 더하여, 세포 배양물의 관류는 pH를 유지시키기 위한 추가의 기회를 제공한다. 관류 세포 배양 공정에서, 신선한 세포 배양 배지는 계속적으로 생물반응기에 첨가되고, 소비된 배양 배지는 계속적으로 제거된다. 관류는 세포 배양물의 pH에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있는 세포 배양 부산물의 제거를 가능하게 한다. 세포 배양 부산물의 제거에 더하여, 도입되는 신선한 세포 배양 배지 pH는 또한 세포 배양물의 pH를 변경시킬 수 있다. 세포 배양물의 pH가 감소중이라는 것을 인지한 경우, 도입 배지의 pH를 증가시켜 pH 감소를 보상할 수 있다. 별법적으로, 또한 관류 속도를 변경시켜 배양물 pH를 관리할 수 있다. 모든 상기의 접근법들은 pH에 대해 영향력을 갖지만, pH에 영향을 미칠 가장 중요한 인자는 CO₂ 전달 방법이다. 일회용 생물반응기에서의 기체 유량 및 CO₂ 보충은 별 문제없이 효과적으로 제어될 수 있기 때문에, CO₂ 전달은 또한 가장 신뢰성있는 접근법이다.

pH 및 DO 피드백 제어없이 웨이브 바이오리액터™ 내에서 CHO 세포를 배양하는 본 발명자들의 첫 시도 동안, 본 발명자들은 여러 난제를 확인하였다 (도 5): (1) 회분 배양 단계 (제0일-제6일) 동안의 느린 성장 (대략 0.3 일^-1); (2) 관류 배양 단계 (제6일 이후) 동안 점점 더 느려지는 성장, 처음 3일 동안 대략 0.5 일^-1에서 그 이후에는 0.3 일^-1 미만으로 감소; (3) 초기 배양물 pH가 때때로 7.3을 초과하고, 이후 배양물 pH가 빈번하게 pH 6.8 아래로 떨어짐; 및 (4) 제6일에 관류를 개시한 후 DO 수준이 종종 공기 포화도의 20％ 아래로 떨어짐. 본 발명자들은 다른 MAb를 생산하는 CHO 세포주를 이용한 경우에도 동일한 난제와 맞닥뜨렸다 (데이터는 나타내지 않음). 본 발명자들은 회분 배양에서의 느린 성장이 높은 초기 pH로 인한 것이며, 관류 배양에서의 성장 속도의 감소는 pH 및 DO가 감소함으로 인한 것이라고 생각하였다.

웨이브 바이오리액터™ 내 pH 피드백 제어의 부재하에서, 이들 비카르보네이트-완충 배양물의 pH는 셀백™ 헤드스페이스 내의 CO₂ 함량에 의존할 것이다. 배지 중에의 비카르보네이트 및 HEPES 완충제의 존재에도 불구하고, 배양물 pH는 락테이트 축적으로 인해 시간의 경과에 따라 결국 강하될 것이다. 배양물 pH를 본 발명자들이 목적하는 6.8-7.2 범위로 유지시키기 위한 본 발명자들의 전략은 셀백™ 내의 CO₂ 농도를 조작하는 것이었다. 본 발명자들은 초기 회분 배양 단계 동안 pH를 감소시키기 위해, 배지로의 CO₂ 전달을 증가시킬 것이다. 반대로, 본 발명자들은 후기 회분 또는 관류 배양 단계 동안 pH를 증가시키기 위해, 배지로부터 CO₂를 제거할 것이다. 웨이브 바이오리액터™ 내 DO 피드백 제어의 부재하에서, DO 수준은 세포 밀도가 증가함에 따라 강하될 것이다. DO를 공기 포화도의 20％ 초과로 유지시키기 위해, 본 발명자들은 웨이브 바이오리액터™ 시스템에 대한 부피 산소 전달 계수 (k_La)를 증가시키고 유입 기체를 O₂로 보충함으로써 배양물로의 O₂ 전달을 증가시킬 것이다.

B. 물질 및 방법:

1. CHO 세포주 및 배양 배지

실시예에 사용된 모든 세포주는 혈청 비함유 현탁 배지에서 성장하도록 조작된 CHO 디히드로폴레이트 러덕타제-결함 (DHFR-) 숙주 유래의 것이다. 특정 모노클로날 항체 (MAb)를 생산하는 각 세포주는 DHFR- 숙주를 DHFR, MAb 경쇄 (LC), 및 MAb 중쇄 (HC) 유전자를 코딩하는 DNA 플라스미드로 형질감염시켜 생성하였다. 안정적으로 형질감염된 세포를 메토트렉세이트를 함유하는 독점 화학적으로 규명된 선택 배지 내에서 매 2-5일마다 계대배양하여 후속 유지시켰다. 영양소의 독점 블렌드에 더하여 1.0 g/L 플루로닉 F-68, 2.44 g/L 중탄산나트륨, 및 15 mM HEPES를 함유하는 동일한 배지를 웨이브 바이오리액터™ 내에서 세포를 회분 및 관류 방식 둘 모두로 배양하는데 사용하였다.

2. 웨이브 바이오리액터™ 시스템

회분 또는 관류 방식으로 CHO 세포를 배양하는데 사용된 웨이브 바이오리액터™ 시스템 (GE 헬쓰케어(GE Healthcare), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)은 요동 플랫폼, 제어 단위, 및 유입구 및 유출구 기체 필터와 다중 샘플링 포트가 장착된 사전 멸균된 유연한 일회용 백으로 이루어졌다 (문헌 [Singh, 1999]; [Tang et al., 2007]). 각 시스템에는 각각 온도 제어 및 요구되는 유입 기체 조성물 (공기와 혼합된 O₂ 및/또는 CO₂)을 제공하는 가열 패드 및 기체 혼합 박스가 구비되어 있다. 모든 세포 배양 실험은 50-L 셀벡™을 이용하여 6 또는 20 L의 작업 부피, 37℃의 온도 설정값, 19-25 rpm의 요동 속도, 및 8-12°의 요동 각도로 수행되었다. 온라인 pH 또는 DO 프로브는 웨이브 바이오리액터™에 설치되어 있지 않았고; 대신, 다른 기체 혼합 및 기체 유량 전략에 대해 배양물 pH 및 DO 수준을 표적 범위 내로 유지시키는 능력을 시험하였다.

3. 웨이브 바이오리액터™에서의 회분 배양

웨이브 바이오리액터™ 내에서 정규 또는 관류 셀벡™에 약 7.5 x 10⁵ 세포/mL를 접종하여 6 L로 회분 배양을 개시하였다. 접종하고 수일이 지난 후, 배양물에 충분한 세포 덩어리가 축적되었을때, 신선한 배지를 첨가하여 작업 부피를 20 L로 증가시켰다. 각 계대배양동안, 배양물을 회분 방식으로 2-5일 동안 유지시켰다.

4. 웨이브 바이오리액터™에서의 관류 배양

달리 언급되지 않는 한, 관류 배양은 20-L 작업 부피로 충분한 세포 덩어리가 축적된 회분 배양 이후에 관류 셀벡™에서 요동 속도 23 rpm 및 요동 각도 10°, 및 관류 속도 1 작업 부피/일로 개시하였다. 관류 셀벡™ 내의 세포 체류 장치는 배양 공정 동안 액체 표면 상에서 부유하는 필터로 이루어졌다 (문헌 [Tang et al., 2007]). 관류 필터는 신선한 배지가 첨가되고 여과물이 계속적으로 제거되는 동안 셀벡™ 내에 세포를 체류시킨다. 신선한 배지 첨가 속도를 1 작업 부피/일의 여과물 제거 속도와 맞춤으로써 관류 웨이브 바이오리액터™ 내에서 일정한 부피를 유지시켰다.

5. 교반 탱크 생물반응기 배양

웨이브 바이오리액터™ 및 교반 탱크 생물반응기에서의 배양 사이의 성능을 비교하기 위하여, 동일한 시드 트레인 공급원으로부터의 세포를 웨이브 바이오리액터™ 생물반응기 및 20-L 스테인레스 스틸 교반 탱크 생물반응기 (아플리콘(Applikon), 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재) 둘 모두에 약 7.5 x 10⁵ 세포/mL로 접종시켰다. 세포를 먼저 회분 방식으로 배양한 다음, 충분한 세포 덩어리가 축적되면 관류를 개시하였다. 교반 탱크 생물반응기 내 작업 부피는 회분 방식에서 7 L였고, 관류 방식에서 15 L였다. 배양 온도, DO, 및 교반은 37℃, 공기 포화도의 30％, 및 125 rpm의 설정값으로 각각 유지시켰다. 배양물 pH는 pH를 증가시키기 위해 1 M 탄산나트륨을 첨가하거나 또는 pH를 감소시키기 위해 CO₂ 기체를 제거하여 7.15로 유지시켰다 (데드밴드 0.03). 관류 작업 동안, 센트리테크(Centritech) 원심분리 시스템 (센트리테크 AB, 스웨덴 노르스보르크 소재)을 이용하여 성장 배지로부터 세포를 분리시켰고; 세포를 원심분리에 의해 체류시키고 상청액을 제거하는 동안 생물반응기로 되돌렸다 (문헌 [Johnson et al., 1996]). 신선한 배지 첨가 속도를 1 작업 부피/일의 상청액 제거 속도와 맞춤으로써 생물반응기 내에서 일정한 부피를 유지시켰다.

6. 오프라인 샘플 분석

배양물을 샘플링하고, 생존 세포 농도 (VCC) 및 생존율 (비-셀 에이에스(Vi-Cell AS), 베크만 쿨터(Beckman Coulter), 미국 캘리포니아주 풀러턴 소재), 뿐만 아니라 pH, DO, pCO₂, 글루코스 및 락테이트 (바이오프로파일(Bioprofile) 400, 노바 바이오메디칼(Nova Biomedical), 미국 메사추세츠주 월섬 소재)를 분석하였다.

실시예 1: 세포-비함유 연구: 기체 전달 측정

셀벡™ 내 기체 전달 특징은 DO 및 pH 수준에 대한 그의 효과로 인해 배양 성능에 영향을 미친다. 본 발명자들이 목적으로 하는 범위 이내로 pH 및 DO를 유지시키기 위한 첫번째 단계로서, O₂ 및 CO₂ 전달을 측정하기 위한 셀벡™ 내 세포-비함유 연구를 수행하였다.

A. O ₂ 전달 연구

50-L 셀벡™ 내에서의 O₂ 전달은 요동 속도 (20, 30, 및 40 rpm), 요동 각도 (8°, 10°, 및 12°), 및 기체 유량 (0.1, 0.2, 및 0.3 L/min)의 다양한 조합에서 부피 O₂ 전달 계수 (k_La)를 계산하여 모의 시험한 배양 배지를 이용하여 특징지어졌다. 전형적인 동적 기체 처리 방법을 사용하여 k_La을 계산하였다 (문헌 [Dunn and Einsele, 1975]). 본 연구에 사용된 시험 배지는 독점적 세포 배양 배지를 모의 시험하기 위해 설계되었고: 이는 1.0 g/L 플루로닉 F-68, 2.44 g/L 중탄산나트륨, 및 15 mM HEPES로 구성되었다. 동일한 제조업체 (브로드레이-제임스 코포레이션(Broadley-James Corporation), 미국 캘리포니아주 어빈 소재)의 모델(Model) 40 트랜스미터에 연결된 옥시프로브(OxyProbe)® DO 프로브를 온라인 DO 측정치를 제공하는데 사용하였다.

O₂ 전달 시험의 준비에 있어서, 50-L 셀벡™을 모의 시험 배지 25 L로 채운 후, 기체 유입구 포트를 통해 질소 (N₂)를 통과시켰다. 백을 요동시켜 모형 배지로의 N₂ 전달을 용이하게 하였다. 모형 배지의 DO 함량이 공기 포화도의 10％ 아래로 떨어지면 헤드스페이스로의 N₂ 유동을 정지시켰다. 이러한 탈-산소 공정 이후에, 백을 눌러서 헤드스페이스로부터 남은 N₂를 탈기시켰다. 이어서 액체-기체 경계면이 혼란되는 것을 최소화하면서 압축 기체를 백 내의 헤드스페이스에 첨가하였다. 백이 완전히 팽창되자마자, 요동 속도, 요동 각도 및 기체 유량에 대해 규정된 시험 조건에서 O₂ 전달 시험을 개시하였다. DO 농도에서 유발된 증가를 기록하고, 시스템의 k_La을 결정하는데 사용하였다. 또한, 오프라인 DO를 처음 5분 동안에는 매분마다, 그 이후에는 매 5분마다 측정하여 온라인 DO 판독치의 정확성을 확인하였다.

일정한 공기 유량에서, 요동 속도 또는 요동 각도를 증가시키면 k_La가 증가되었는데 (도 2a), 아마도 이는 산소 전달을 위한 표면적의 증가로 인한 것일 것이다. 시험한 가장 낮은 요동 속도 (20 rpm)에서 본 발명자들이 얻은 k_La 수치는 웨이브 바이오리액터™ 시스템에 대해 다른 연구자들이 보고한 것과 비슷하였다 (문헌 [Mikola et al., 2007]; [Singh, 1999]). 이러한 k_La 수치는 또한 본 발명자들의 사내 교반 탱크 생물반응기에서 수득한 것과도 비슷하였다 (데이터는 나타내지 않음).

20 rpm의 일정한 요동 속도에서의 웨이브 바이오리액터™ 시스템의 O₂ 전달 연구에서, 공기 유량을 0.01 vvm에서 0.05 vvm으로 증가시키면 k_La가 2-L 규모에서는 약 2 h^-1에서 약 3 h^-1로 증가되었고, 공기 유량을 0.01 vvm에서 0.1 vvm으로 증가시키면 k_La가 20-L에서 약 0.5 h^-1에서 약 3 h^-1로 증가되었다 (문헌 [Singh, 1999]). 이와 대조적으로, 50-L 규모에서의 본 발명자들의 연구에서는, 요동 속도 및 요동 각도의 2가지의 상이한 조합에서 공기 유량을 0 vvm에서 0.02 vvm로 증가시키면 k_La가 증가되지 않았다 (도 2b). 본 발명자들이 사용한 최대 공기 유량은 기체-액체 경계면에서의 액체 이동성에 영향을 미치기에 너무 적어서 k_La에 어떤 유의한 효과도 갖지 않을 수 있다.

50 L 일회용 백의 산소 전달 용량은 물질 전달 계수, k_La를 결정하여 평가하였다. 도 2c는 일정한 기체 유량에서의 시간의 경과에 따른 DO 농도를 보여주고, 도 2d는 용존 산소에 대한 기체 유량의 효과를 보여준다. 강한 요동 조건 (높은 요동 속도 및 요동 각도)에서, 물질 전달 계수는 높았다. 그러나, 놀랍게도, 헤드 스페이스 클리어런스율은 산소 전달과 관련하여 k_La에 효과가 없었다. 모의 시험 배지를 실험 시작 이전에 탈산소화시켰다. 기체 내 산소 농도는 모의 시험 배지 내 산소 농도보다 높았다. 따라서, 산소는 기체 상에서 액체 상으로 전달되었다. 강한 요동 조건에 의하면, 보다 많은 웨이브 형성으로 인해 기체-액체 경계면이 증가된다 (이를 본원에서는 동적 경계면이 생긴다고 지칭함). 표면적의 이같은 증가는 높은 산소 전달 속도를 유발하는 것으로 보인다. 기체 유량이 증가 또는 감소되면, 헤드 스페이스 클리어런스율도 따라서 변한다. 헤드 스페이스 클리어런스에서의 변화는 기체 및 액체 상 사이의 산소의 농도 차이를 변화시키지 않는다. 따라서 기체 유량은 산소의 경우 물질 전달 계수에 영향을 미치지 않는 것으로 보인다. 모의 시험 배지 내 산소 농도가 헤드 스페이스의 그것과 동일한 경우, 산소 전달은 멈출 것이다.

B. CO ₂ 전달 연구

O₂ 전달 연구에서 사용된 방법으로 모의 시험 배지를 탈산소화한 후, N₂ 공급에 사용된 것과 동일한 유입구 포트를 통해 셀벡™으로 CO₂를 공급하였다. 온라인 pH 프로브가 7.0로 판독되었을 때 CO₂ 공급을 멈추고, O₂ 전달 연구에서 기술한 것과 동일한 방법을 이용하여 헤드스페이스를 소거하였다. 백이 완전히 팽창되었을 때, 요동 속도, 요동 각도 및 기체 유량에 대해 규정된 시험 조건에서 CO₂ 전달 시험을 개시하였다. 동일한 제조업체 (GE 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)에서 제공된 pH20 트랜스미터에 연결된 일회용 온라인 pH 프로브를 이용하여 pH에서 유발된 증가를 기록하였다. 비카르보네이트계 모의 시험 배지로부터 CO₂가 제거됨으로 인해 pH가 증가되었다. 온라인 pH 판독치의 정확성을 확인하기 위해, 모의 시험 배지 내 오프라인 pH를 처음 5분 동안에는 매분마다, 그 이후에는 매 5분마다 측정하였다. 시간에 대해 온라인 pH 측정치를 플롯팅하는 것에 의해 최적 맞춤선의 기울기는 pH 변화 속도를 제공하였고, 이에 따라 모의 시험 배지로부터 셀백™ 내 헤드스페이스로의 CO₂ 전달 속도가 밝혀졌다.

다른 연구자들이 웨이브 바이오리액터™ 내에서의 O₂ 전달을 특징지은 바 있지만 (문헌 [Mikola et al., 2007]; [Singh, 1999]), 본 발명자들은 웨이브-유도된 교반에 의한 세포 배양 시스템에서의 CO₂ 전달에 대한 보고서는 발견하지 못했다. 웨이브 바이오리액터™ 내에서의 CO₂ 전달을 특징짓기 위해, 본 발명자들은 본 발명자들의 세포 배양 배지에서와 같은 농도 (2.44 g/L)로 중탄산나트륨을 함유하는 모의 시험 배지를 사용하였다. 이러한 비카르보네이트-완충된 세포-비함유 시스템에서, 액체 상으로부터의 CO₂ 제거는 적극적인 pH 제어의 부재하에서 시스템의 pH를 증가시킬 것이다. 모의 시험 배지에서 직접 CO₂ 측정을 위한 CO₂ 프로브에 의존하는 대신, 본 발명자들은 웨이브 바이오리액터™ 내의 온라인 pH 프로브로부터의 pH 프로파일을 사용하여 CO₂ 제거의 상대적 속도를 평가하였다.

이러한 연구에서, 웨이브 바이오리액터™에서의 pH 프로파일은 2 개의 상으로 분리되었다 (도 3a 및 3b). 제1상에서, pH는 0 내지 5분 사이에 시간 당 약 1-4 pH 단위로 신속하게 증가되었다. 제2상에서, pH는 5 내지 60분 사이에 시간당 0.5 미만의 pH 단위로 보다 점진적으로 증가되었다. 이러한 제2상 동안 (5-60분), 상이한 요동 속도 및 요동 각도는 pH 증가 속도에 무시해도 될 정도의 영향을 미쳤고 (공기 유량은 0.2 L/min으로 일정함), pH는 요동 조건에 관계없이 시간당 0.2 단위로 증가되었다 (도 3a). 이와 대조적으로, 보다 빠른 공기 유량은 이러한 제2상 동안 (5-60분) pH 변화 속도를 증가시켰고: 공기 유량을 0 L/min에서 0.6 L/min으로 증가시켰을때, pH 변화 속도는 시간당 0-0.1 단위에서 시간당 0.4 단위로 증가되었다 (도 3b). 공기 유동의 부재하에서 (0 L/min), 제2상 동안 (5-60 분) 최소 pH 증가 (시간당 0.1 단위 이하)가 관찰되었고, 이는 모의 시험 배지와 셀백™ 내 헤드스페이스 사이의 CO₂ 교환이 대략 5분 내에 평형에 이르렀음을 시사한다. 처음 5분을 넘어 추가의 pH 증가를 달성하기 위해서는, 공기 유량을 증가시킴으로써 CO₂ 제거를 위한 구동력을 높여 헤드스페이스 클리어런스율을 증가시킬 수 있고, 그에 의해 헤드스페이스 내의 CO₂ 농도를 최소화할 수 있다.

도 3c는 도 3a로부터의 데이터에 대해 계산된 pH 변화 속도를 보여준다. 도 3d는 도 3b로부터의 데이터에 대해 계산된 pH 변화 속도를 보여준다. 2-상 거동은 웨이브의 넒은 표면적 및 유입 기체로 인한 헤드 스페이스의 연속 소거 둘 모두로 인해 생긴 빠른 기체 전달 속도로 설명될 수 있다. 넒은 표면적은 액체 상으로부터 기체 상으로의 빠른 CO₂ 전달을 용이하게 한다. 빠른 전달은 기체 및 액체 상 사이의 상이한 CO₂ 농도의 결과이다. 농도에서의 이러한 차이는 실험을 시작하는 동안 가장 크고, 이러한 차이는 액체 상으로부터 기체 상으로 보다 많은 CO₂가 전달됨에 따라 계속해서 감소된다. 기체 및 액체 상 사이의 CO₂ 농도 차이가 감소됨에 따라, pH에서의 변화 속도도 또한 감소된다. 도 3a에서, pH에서의 변화 속도는 제2상 (5-60분)에 비해 제1상 (0-5분) 동안 매우 빠르다. 기체 유량은 도 3a에 나타낸 경우와 동일하게 유지시켰다. CO₂의 초기 전달 이후에, CO₂ 전달 속도는 헤드 스페이스 내의 CO₂ 농도에 의존한다. 헤드 스페이스 클리어런스율이 동일한 경우, 처음 5분 이후의 pH에서의 변화 속도는 요동 조건과 관계없이 동일하였다. pH에서의 변화 속도에 대한 계산치를 도 3c에 나타낸다.

기체 유량이 변화된 경우, 헤드 스페이스의 클리어런스율도 또한 변화되었다. 상이한 기체 유량에 대한 pH 상승 데이터를 도 3b에 나타낸다. 이러한 경우에서도 또한 2-상 거동이 관찰되었다. 그러나, 기체 유량이 동일한 경우 및 기체 유량이 변경된 경우 사이에서 차이로, 제2상 (5-60분)의 pH 변화 속도가 기체 유량이 동일한 경우에는 유사한 반면, 기체 유량에 의존하여 변경되었다. 기체 유량을 변화시키면 헤드 스페이스 클리어런스율이 변화되기 때문에, 헤드 스페이스 내의 CO₂가 상이한 속도로 제거되었다.

초기의 빠른 기체 전달은 큰 표면적을 만드는 일회용 백의 특성으로 인한 것이다. 이러한 초기의 기체 전달은 주로 요동 조건 (요동 속도 및 요동 각도)에 의존한다. 그러나, 배지로부터의 지속적인 CO₂ 제거는 헤드 스페이스 CO₂ 농도에 의존한다. 헤드 스페이스 클리어런스율은 기체 유량에 의존한다.

실시예 2: 세포 성장 특성 연구

A. 회분 배양

1. 초기 실험

세포 배양 배지:

혈청-비함유 세포 배양 배지를 사용하여 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포를 성장시켰다. 세포 배양 배지는 DMEM 및 햄의 F-12 기초 배지의 1:1 혼합물로부터 아미노산, 염, 당 및 비타민과 같은 몇몇 성분을 변경시키는 것에 의해 유래되었다. 이러한 배지는 글리신, 하이포크산틴, 및 티미딘이 결여되었다. 이러한 배지는 15 mM HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산) 및 2.44 g/L 중탄산나트륨으로 이루어졌다. 이들 염의 농도는 바뀔 수 있다. 배지에는 미량 원소, 재조합 인간 인슐린 및 세포 보호제, 루트롤 F-68 프릴(Lutrol F-68 Prill) (등가물을 사용할 수 있음)이 보충되었다.

포유동물 세포 배양:

형질감염된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포를 액체 질소 중에 보관된 1 mL 또는 10 mL 바이알 은행에서 성장시켰다. 선택한 동결 바이알을 스피너 플라스크, 진탕 플라스크 또는 교반 탱크 생물반응기 내에서 중탄산나트륨을 함유하는 배양 배지로 해동시켰다. 세포를 매 2-7일 마다 계대배양하였다. 이러한 배양을 "시드 트레인"이라고 지칭한다. 시드 트레인으로부터의 세포를 일회용 백으로 옮겨 일회용 백에서의 세포 배양을 개시하였다.

분석:

오프라인 분석을 위해 혈액 기체 분석기 (노바 바이오프로파일(NOVA BioProfile)® 400)를 사용하였다. 이러한 오프라인 분석기를 이용하여 세포 배양물 pH, 용존 산소 및 CO₂의 분압, 글루코스, 락테이트 및 암모니아 농도를 측정하였다. 베크만-쿨터의 비셀™ AS 또는 비셀™ XR을 이용하여 세포 생존율 및 생존 세포 농도 (VCC)를 측정하였다. 세포 농도 측정에 더하여, 퍼센트 충전 세포 부피 (％PCV)를 판독하여 바이오매스의 양을 또한 측정하였다.

실시예 3: 여러 CHO 세포주를 사용한 상세한 분석

A. 회분 공정:

회분 배양 과정에 걸쳐 셀백™으로 공급되는 기체 내 CO₂ 농도를 감소시킴으로써, 본 발명자들은 초기의 높은 pH (7.3 초과)를 낮추고 웨이브 바이오리액터™ 시스템에서의 후속 pH 감소를 최소화할 수 있을 것이다. 몇몇 CHO 세포주를 이용한 웨이브 바이오리액터™ 회분 배양에서의 상이한 CO₂ 기체 오버레이 전략을 시험한 후 (데이터는 나타내지 않음), 본 발명자들은 접종 및 규모 확대 단계 둘 모두를 위한 "8-5-2" 단계식 전략을 규정하고: 셀백™으로 펌핑되는 공기에 첫째날 동안에는 CO₂ 기체를 8％ (v/v)로, 둘째날 동안에는 5％ (v/v)로, 그 이후에는 2％ (v/v)로 보충하였다.

세포-비함유 연구로부터의 결과에 기초하여, 본 발명자들은 본 발명자들의 웨이브 바이오리액터™ 회분 배양을 위한 공정 설정값으로써 다음과 같은 요동 속도, 요동 각도 및 공기 유량을 선택하였다: 접종의 경우 21 rpm, 10° 요동 각도, 및 0.2 L/min; 규모 확대 단계의 경우 23 rpm, 10° 요동 각도, 및 0.2 L/min. 이들 공정 설정값의 신뢰도를 시험하기 위해, 본 발명자들은 완전 요인 실험을 설계하였다 (표 1). 공정 조건이 중심값을 벗어날 경우, 본 발명자들은 세포 성장 및 pCO₂ 프로파일에 대해 무시해도 될 만한 효과를 관찰하였고, 배양물 pH는 시험한 세포주 둘 모두에서 6.8-7.2 이내 및 DO 50％ 초과로 유지되었다 (도 4).

B. 관류 배양

본 발명자들의 웨이브 바이오리액터™에서의 관류 배양의 초기 시도에서, 관류를 개시한 후 제6일 째에 배양물 pH는 전형적으로 6.8 아래로 떨어졌고, DO는 종종 공기 포화도의 30％ 아래로 떨어졌다 (도 5). 관류 속도를 증가시키지 않고 pH 강하를 최소화하기 위해, 본 발명자들은 세포-비함유 기체 전달 연구가 공기 유량이 증가되면 pH가 증가됨을 보여주었기 때문에 (도 3) 셀백™으로 공기 유량을 증가시키는 방안을 연구하였다. DO 감소를 극복하기 위해, 본 발명자들은 관류를 개시하고 이틀 후에 셀백™으로의 공기 유동에 30％ O₂ (v/v)를 보충하였다. 이러한 타이밍이 종전에 관찰된 DO 감소와 일치하였으므로 (도 5) 본 발명자들은 이를 선택하였다.

실시예 4: 회분-관류 공정

이러한 관류 공정은 2회의 회분 단계에 이은 관류 단계로 구성되었다. 접종 단계에서는, 50 L 일회용 백에 5 내지 7.5 x 10⁵ 세포/mL 표적 세포 밀도의 6 L 작업 부피로 접종하였다. 접종 3일 후, 규모 확대 단계를 위해 신선한 배지를 첨가하여 일회용 백의 부피를 20 L로 증가시켰다. 접종 단계 및 규모 확대 단계는 회분 단계를 구성한다. 회분 단계의 경우 회분 공정에서 기재한 바와 같은 CO₂ 단계적 감소 전략을 이용하였다. 3일 규모 확대 단계의 말미에, 관류를 시작하였다. 신선한 배지를 일회용 백에 연속적으로 첨가하고, 소비된 배양 배지는 세포가 체류되게 하면서 일회용 백으로부터 연속적으로 제거하였다. 세포 배양 배지를 하루에 20 리터 (하루에 1 부피)의 속도로 관류시켰다. 관류 배지 pH 설정값은 7.2 단위였다. 관류 시작시에, 유입 기체의 CO₂ 농도는 0으로 설정하였다. 헤드 스페이스 클리어런스율을 증가시켜 CO₂ 제거를 용이하게 하였다. 헤드 스페이스 클리어런스율의 증가는 도 7에 나타낸 바와 같이 단일 단계 증가되거나 또는 다중 단계 증가되었다. 요동 속도 범위는 19 내지 25 rpm이었다. 요동 각도 범위는 8 내지 12°였다. 온도는 37℃로 유지시켰다. 관류를 개시하고 48시간 후에 산소를 보충하여 세포의 산소 요구를 충족시켰다. 유입 기체 중의 산소 농도는 관류를 시작한 후 48시간째에 30％로 설정하였다.

도 6은 회분-관류 공정 (회분 단계 (제0일-제6일) 및 관류 단계 (제6일-제14일))의 경우의 세포 배양 성능을 보여준다 (도 6a). 도 6b는 ％ 세포 생존율을 보여준다. 도 7a는 세 가지의 상이한 실험에 대한 헤드 스페이스 클리어런스율 설정값을 보여준다. 관류 단계의 경우 헤드 스페이스 클리어런스율 설정값은 상이한 프로파일을 따랐다 (제6일-제14일): (1) 2 가지의 일정한 헤드 스페이스 클리어런스율: 0.02 hvm (

) 및 0.1 hvm (

); 및 (2) 헤드 스페이스 클리어런스율의 단계적 증가: 0.007 hvm→0.013 hvm→0.02 hvm (

). 단일 단계 증가 뿐만 아니라 다중 단계 증가 둘 모두를 연구하였다. 도 7b는 오프라인 용존 CO₂ 농도를 보여준다. 도 6d는 세포 성장을 보여준다 (단위 생존 세포 계수 (VCC)). 도 6 및 7의 범례:

,

는 3가지의 상이한 구동을 보여준다. 도 6c에 나타낸 바와 같이, pH는 헤드 스페이스의 클리어런스에 의해 CO₂를 조절함으로써 목적하는 범위 내로 유지시킬 수 있었다.

실시예 5: "8-5-2" 조건하에서의 6종의 CHO 세포주의 거동

세포 성장을 지원하고 pH 및 DO를 목적하는 범위로 유지시키는데 있어서 이러한 웨이브 바이오리액터™ 공정의 신뢰성을 시험하기 위해, 본 발명자들은 본 발명자들의 사내 CHO 세포주에서 전형적으로 관찰된 세포 성장 및 대사 거동의 범위를 포괄하는 6종의 세포주를 선택하였다.

최적화된 공정 조건을 이용하여, 모든 6종의 세포주를 회분 및 관류 배양 단계 동안 높은 생존율로 성장시켰다 (도 8). 모든 경우에서, pH는 목적하는 6.8-7.2 범위 내로 유지되었고, DO는 공기 포화도의 20％를 초과하였다.

실시예 6: "8-5-2" 웨이브 바이오리액터™ 방법 및 종래의 교반 탱크 생물반응기 배양 사이의 비교

pH 및 DO 제어가 되는 본 발명의 웨이브 바이오리액터™ 공정 및 교반 탱크 생물반응기 공정 사이에서의 배양 성능을 비교하기 위해, 본 발명자들은 양 시스템에서의 평행 배양을 수행하였다 (도 9). 성장 및 생존율 프로파일은 두 생물반응기 시스템 사이에서 비슷하였고: 웨이브 바이오리액터™ 및 교반 탱크 생물반응기에서의 성장 속도가 약 0.5일^-1로 유사하였다. 웨이브 바이오리액터™ 시스템에는 pH 및 DO에 대한 온라인 피드백 제어가 결여되어 있음에도 불구하고, pH 및 DO 프로파일은 두 생물반응기 배양 사이에서 유의한 차이가 없었다.

본 발명은 회분 및 관류 방식 둘 모두로 작동되는 웨이브 바이오리액터™ 시스템에서 pH 및 DO 피드백 제어에 의존하지 않고 배양물 pH를 6.8-7.2 범위로, DO를 공기 포화도의 20％ 초과로 유지하기 위한 공정 제어 방법을 제공한다. pH 및 DO 제어없이 웨이브 바이오리액터™ 시스템에서 CHO 세포를 배양하는데 있어서의 난제를 확인한 후, 본 발명자들은 웨이브 바이오리액터™ 시스템에서 O₂ 및 CO₂ 전달에 대한 요동 속도, 요동 각도 및 기체 유량의 효과를 결정하기 위해 세포-비함유 연구를 수행하였다. 유입구 기체의 CO₂ 및 O₂ 농도와 더불어 이들 공정 파라미터를 조정함으로써, 본 발명자들은 6종의 재조합 CHO 세포주의 회분 및 관류 배양 동안 배양물 pH 및 DO를 본 발명자들이 목적하는 범위 내로 유지시켰다. pH 및 DO 프로브에 대한 필요를 없앰으로써, 이러한 공정은 보다 간단하고 보다 비용 효과적인 웨이브 바이오리액터™ 시스템에서의 세포 배양 방법을 제공한다. 이는 또한 pH 또는 DO 프로브가 장착된 웨이브 바이오리액터™에서 pH 또는 DO 프로브가 기능을 상실한 경우 대안적으로 세포를 배양하는 방법을 제공한다

본원에 기재된 구체적 실시예들은 단지 설명을 위한 것이며 본 발명의 범주를 제한하는 것은 아님을 또한 이해할 것이다. 본 발명은 하기하는 특허청구범위에 의해서만 제한된다.

인용된 참고문헌

Claims

비카르보네이트-함유 배양 액체 중에 진핵 세포를 포함하는 세포 배양 접종물을 용기로 제공하는 단계
(상기 용기는 상기 세포 배양물을 둘러싸는 벽 및 상기 세포 배양물 상부의 기체상 헤드 스페이스를 가지며, 상기 헤드 스페이스 안팎으로 기체의 유입 및 유출을 제공하는 하나 이상의 포트를 포함함);
상기 용기를 교반하는 단계; 및
상기 포트를 통해 상기 헤드 스페이스로 기체를 제공하는 단계 (상기 기체는 일정량의 CO₂를 함유하며, 상기 기체 중의 CO₂의 양은 상기 세포 배양물의 소정의 pH가 유지되도록 시간의 경과에 따라 조절되어 상기 세포 배양물의 pH를 조정함)
를 포함하는, 진핵 세포를 회분 배양하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 교반은 상기 용기를 15 내지 30 rpm의 요동 속도 및 5° 내지 15°의 요동 각도로 요동시키는 것에 의하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 요동 속도가 19 내지 25 rpm이고, 요동 각도가 8° 내지 12°인 방법.
제1항에 있어서, 상기 CO₂가 상기 기체의 10％ 내지 0％ (v/v)의 양으로 제공되는 방법.
제4항에 있어서, 상기 CO₂가 상기 기체의 8％ 내지 2％ (v/v)의 양으로 제공되는 방법.
제5항에 있어서, 상기 CO₂가 제1일에 상기 기체의 8％ (v/v)의 양으로 제공되고, 제2일에 상기 기체의 5％ (v/v)의 양으로 제공되고, 그 이후에는 상기 기체의 2％ (v/v)의 양으로 제공되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 기체의 유량이 0 내지 1.0 hvm인 방법.
제7항에 있어서, 상기 기체의 유량이 0.001 내지 0.002 hvm인 방법.
제8항에 있어서, 상기 기체의 유량이 0.007 hvm인 방법.
제1항에 있어서, 상기 진핵 세포가 척추동물 세포인 방법.
제10항에 있어서, 상기 척추동물 세포가 개구리 세포, 토끼 세포, 설치류 세포, 양 세포, 염소 세포, 개 세포, 고양이 세포, 소 세포, 말 세포, 비-인간 영장류 세포 및 인간 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
비카르보네이트-함유 배양 액체 중에 진핵 세포를 포함하는 세포 배양 접종물을 용기로 제공하는 단계
(상기 용기는 상기 세포 배양물을 둘러싸는 벽 및 상기 세포 배양물 상부의 기체상 헤드 스페이스를 가지며, 상기 헤드 스페이스 안팎으로 기체의 유입 및 유출을 제공하는 하나 이상의 포트를 포함함);
상기 용기를 교반하는 단계;
상기 용기로 신선한 배양 배지를 관류시키고, 소비된 배양 배지는 상기 용기로부터 제거하는 단계; 및
상기 세포 배양물의 소정의 pH가 유지되도록 상기 포트를 통해 상기 헤드 스페이스로 기체를 제공하여 상기 용기의 헤드 스페이스로부터 축적된 CO₂를 제거함으로써 상기 세포 배양물의 pH를 조절하는 단계
를 포함하는, 진핵 세포를 관류 배양하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 교반은 상기 용기를 15 내지 30 rpm의 요동 속도 및 5° 내지 15°의 요동 각도로 요동시키는 것에 의하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 요동 속도가 19 내지 25 rpm이고, 요동 각도가 8° 내지 12°인 방법.
제12항에 있어서, 상기 기체가 O₂를 상기 기체의 0％ 내지 50％ (v/v)의 양으로 함유하는 것인 방법.
제15항에 있어서, O₂가 상기 기체의 20％ 내지 40％ (v/v)의 양으로 제공되는 것인 방법.
제12항에 있어서, O₂가 제1일 및 제2일에 상기 기체의 0％ (v/v)의 양으로 제공되고, 그 이후에는 상기 기체의 30％ (v/v)의 양으로 제공되는 것인 방법.
제12항에 있어서, 상기 기체의 유량이 0 내지 1.0 hvm인 방법.
제18항에 있어서, 상기 기체의 유량이 0.001 내지 0.03 hvm인 방법.
제19항에 있어서, 상기 기체의 유량이 0.02 hvm인 방법.
제12항에 있어서, 상기 진핵 세포가 척추동물 세포인 방법.
제21항에 있어서, 상기 척추동물 세포가 개구리 세포, 토끼 세포, 설치류 세포, 양 세포, 염소 세포, 개 세포, 고양이 세포, 소 세포, 말 세포, 비-인간 영장류 세포 및 인간 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
제1항 또는 제12항에 있어서, 상기 용기가 강성 콘테이너인 방법.
제1항 또는 제12항에 있어서, 상기 용기가 유연성 콘테이너인 방법.
제24항에 있어서, 상기 용기가 일회용 배양 백인 방법.
제1항 또는 제12항에 있어서, 세포 배양물의 pH를 계속적으로 또는 간헐적으로 모니터링하기 위한 pH 모니터를 더 포함하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 신선한 배양 배지가 소정의 pH를 가져 상기 세포 배양물의 pH를 조절하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 상기 신선한 배양 배지의 관류가 상기 배양 배지 내에 세포가 체류되도록 하는 관류 장치를 통해 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 기체가, 상기 세포 배양물이 약 1 내지 200 mmHg 수준의 용존 CO₂ 분압을 유지하도록 상기 헤드 스페이스로 제공되는 방법.
제29항에 있어서, 상기 기체가, 상기 세포 배양물이 약 10 내지 150 mmHg 수준의 용존 CO₂ 분압을 유지하도록 상기 헤드 스페이스로 제공되는 방법.
제30항에 있어서, 상기 기체가, 상기 세포 배양물이 약 20 내지 120 mmHg 수준의 용존 CO₂ 분압을 유지하도록 상기 헤드 스페이스로 제공되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 기체가, 상기 세포 배양물이 약 20 내지 80 mmHg 수준의 용존 CO₂ 분압을 유지하도록 상기 헤드 스페이스로 제공되는 방법.
용기의 내부 공간을 한정하고 주위 환경으로부터 상기 내부 공간을 분리시키는 벽을 가진 용기;
상기 용기로부터의 기체의 유입 및 유출을 제공하는 하나 이상의 포트;
상기 용기에 가역적으로 부착되는 교반기; 및
임의로, 상기 내부 공간 내에 위치하는 프로브를 갖는 pH 모니터
를 포함하는 진핵 세포 배양 장치.
제33항에 있어서, 상기 용기가 일회용 생물반응 백인 장치.
제33항에 있어서, 상기 용기가 상기 용기로부터의 기체의 유입 및 유출을 제공하는 복수개의 포트를 포함하는 것인 장치.
제33항에 있어서, 상기 용기가 상기 용기로부터 소비된 배지를 제거하기 위한 소비 배지 포트 및 상기 용기로 신선한 배지를 제공하기 위한 관류 포트를 더 포함하는 것인 장치.
제33항에 있어서, 상기 pH 모니터가 컴퓨터화된 자동화 시스템에 연결되어 있고, 상기 시스템은 상기 pH 모니터에 의해 측정되는 pH의 조절에 반응하여 상기 용기의 헤드 스페이스 클리어런스를 조절하여 상기 용기 내 CO₂ 농도를 조절하는 것인 장치.
제37항에 있어서, 기체 유동, 온도, 교반, 신선한 배지의 관류 속도, 및 용존 CO₂로 이루어진 군으로부터 선택된 파라미터를 모니터링하기 위한 하나 이상의 다른 모니터를 더 포함하는 장치.
비카르보네이트-함유 배양 액체 중에 진핵 세포를 포함하는 세포 배양물을 용기로 제공하는 단계
(상기 용기는 상기 세포 배양물을 둘러싸는 벽 및 상기 세포 배양물 상부의 기체상 헤드 스페이스를 가지며, 상기 헤드 스페이스 안팎으로 기체의 유입 및 유출을 제공하는 하나 이상의 포트를 포함함);
상기 용기를 교반하는 단계; 및
상기 포트를 통해 상기 헤드 스페이스로 기체를 제공하는 단계 (상기 기체는 제1일 동안 기체 중 8％ CO₂ (v/v), 제2일에는 기체 중 5％ CO₂ (v/v) 및 그 이후에는 기체 중 2％ CO₂ (v/v)를 함유함)
를 포함하는, 진핵 세포를 회분 배양하는 방법.
제39항에 있어서, 상기 용기를 요동기 상에서 21-23 rpm의 요동 속도로 교반하는 방법.
제39항에 있어서, 상기 용기를 요동기 상에서 8-12°의 요동 각도로 교반하는 방법.
제41항에 있어서, 상기 용기를 요동기 상에서 10°의 요동 각도로 교반하는 방법.
비카르보네이트-함유 배양 액체 중에 진핵 세포를 포함하는 세포 배양물을 용기로 제공하는 단계
(상기 용기는 상기 세포 배양물을 둘러싸는 벽 및 상기 세포 배양물 상부의 기체상 헤드 스페이스를 가지며, 상기 헤드 스페이스 안팎으로 기체의 유입 및 유출을 제공하는 하나 이상의 포트를 포함함);
상기 용기를 교반하는 단계; 및
상기 포트를 통해 상기 헤드 스페이스로 기체를 제공하는 단계 (상기 기체는 관류를 개시한 지 2일 후에 30％ 이상의 O₂ (v/v)로 보충됨)
를 포함하는, 진핵 세포를 관류 배양하는 방법.