ES2848701T3 - Control de la proliferación de células eucariotas - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para controlar la proliferación de células eucariotas, comprendiendo el procedimiento: - recibir, mediante una lógica de control (116), una densidad celular objetivo (114) y un plazo objetivo (112), representando la densidad celular objetivo una densidad celular deseada de las células eucariotas en el plazo objetivo, representando el plazo objetivo un punto futuro en el tiempo; - cultivar las células eucariotas en un medio de cultivo (M1) de un primer depósito (130); para cada uno de una pluralidad de intervalos de tiempo: - medir la densidad celular (122) de las células eucariotas en el medio de cultivo; - calcular, mediante la lógica de control, una densidad celular prevista en el plazo objetivo como una función de al menos la densidad celular medida; - comparar, mediante la lógica de control, la densidad celular prevista y la densidad celular objetivo; - ajustar, mediante la lógica de control, la temperatura del medio de cultivo en el primer depósito si la densidad celular prevista se desvía de la densidad celular objetivo - incrementando la temperatura en 0,1 °C a 1 °C si la densidad celular prevista es menor que la densidad celular objetivo; o - disminuyendo la temperatura en 0,1 °C a 1 °C si la densidad celular prevista es mayor que la densidad celular objetivo.

Description

DESCRIPCIÓN
Control de la proliferación de células eucariotas
Campo de la invención
La invención se refiere al campo de la biotecnología y, más en particular, al campo del control de la proliferación de células, en particular células eucariotas.
Antecedentes y técnica relacionada
Las proteínas importantes desde el punto de vista terapéutico o comercial se producen a menudo cultivando células de mamífero que contienen un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante de interés. Por ejemplo, se usan procedimientos de cultivo en serie de siembra para generar una cantidad suficiente de células de mamífero para sembrar un biorreactor de producción grande que se usa realmente para producir y extraer la proteína de interés. Los procedimientos de cultivo en serie de siembra convencionales comienzan con una muestra de células pequeña, por ejemplo, un vial de banco de células crioconservado, seguido de múltiples etapas de expansión del cultivo celular en recipientes o depósitos de cultivo progresivamente más grandes.
Los procedimientos de producción discontinua y semicontinua comprenden una fase de proliferación improductiva, cuando se acumula la masa celular, y una fase estacionaria más productiva, cuando la mayor parte de la proteína u otro bioproducto se genera dentro o fuera de las células. Aunque la fase de proliferación y la fase estacionaria también se pueden observar en células procariotas, las dos fases diferentes son de particular relevancia para el cultivo de células eucariotas, ya que los bioproductos generados por las células eucariotas son en particular sensibles al estado metabólico de la célula productora (que puede tener, por ejemplo, un impacto en el patrón de glucosilación de un producto proteínico).
La proliferación de células en un cultivo celular es un procedimiento que es muy sensible a muchos factores diferentes: pequeñas diferencias en la composición del medio de cultivo o de las soluciones nutritivas, pequeñas diferencias en la densidad celular de una muestra de células usada para sembrar un biorreactor o una calibración inexacta de diversos dispositivos que miden parámetros del procedimiento como el pH, la temperatura, la concentración de oxígeno o dióxido de carbono, pueden dar como resultado diferencias importantes con respecto a la tasa de proliferación de las células, con respecto a la cantidad de proteína producida por cada célula e incluso con respecto a la composición química o modificación del producto. Las proteínas generadas por células eucariotas están sujetas a muchos procedimientos de modificación bioquímica diferentes, tales como glucosilación, fosforilación y otros. Cualquier cambio en los parámetros del procedimiento y las condiciones de proliferación puede tener un impacto importante en el metabolismo celular y, por tanto, también puede tener un impacto en el patrón de glucosilación de la proteína generada. Por ejemplo, Gammell P, Barron N, Kumar N, Clynes M (2007) en "Initial identification of low temperature and culture stage induction of miRNA expression in suspension CHO-K1 cells". J Biotechnol 130:213-218 han identificado que miR-21, un miARN inhibidor de la proliferación, se regula por incremento durante la proliferación en fase estacionaria inducida por un cambio en la temperatura a baja temperatura o durante el cultivo discontinuo normal. Por tanto, cambiar la temperatura en un proyecto de cultivo de células eucariotas en ejecución puede tener un impacto en el estado celular.
El documento US 2009/0104594 A1 describe un biorreactor que incluye un sensor vinculado a un controlador u optimizador adaptativo sin modelo. El sensor puede proporcionar una medición instantánea de una cantidad que se correlaciona con el valor cuantitativo del producto final u otro atributo cualitativo del producto deseado. Además, se describe un procedimiento de cultivo de células vivas. El procedimiento incluye incubar las células en un recipiente, medir una pluralidad de condiciones dentro del recipiente, comparar la pluralidad de mediciones, individualmente, con una pluralidad de puntos de ajuste con un controlador adaptativo sin modelo, y ajustar una condición dentro del recipiente basándose en al menos una comparación.
En el contexto del cultivo de células eucariotas, las empresas farmacéuticas, por lo tanto, tratan de mantener los parámetros del procedimiento lo más constantes posible para garantizar una producción reproducible y segura del bioproducto deseado en un intervalo de tiempo definido.
A menudo, las células eucariotas se cultivan en dos condiciones de temperatura diferentes para la fase de proliferación y para la fase estacionaria: la fase de proliferación se realiza típicamente a 37 °C, mientras que la fase de producción se realiza típicamente bajando la temperatura hasta aproximadamente 34 °C y manteniendo la temperatura constante a 34 °C durante todo el procedimiento de producción para garantizar un procedimiento de producción estandarizado y reproducible, una concentración y calidad de producto estandarizadas al final del procedimiento de producción. Asimismo, la temperatura se mantiene constante durante la fase de proliferación para asegurar la reproducibilidad del procedimiento.
Por tanto, los enfoques del estado de la técnica para cultivar células eucariotas se basan en mantener constantes los parámetros de cultivo, en particular la temperatura (al menos durante toda la fase de proliferación y la fase estacionaria, respectivamente).
Sin embargo, dado que las pequeñas variaciones en la densidad celular inicial, la composición del medio y las propiedades de calibración de los dispositivos de medición no se pueden evitar por completo, todavía existe una variabilidad con respecto a la duración de los proyectos de cultivo celular y la cantidad total de bioproducto que se puede extraer después de un periodo de tiempo dado, lo que dificulta mucho a las empresas biotécnicas y farmacéuticas la planificación del procedimiento de producción.
Sumario
Un objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento y un sistema mejorados para controlar la proliferación de células como se especifica en las reivindicaciones independientes. Los modos de realización de la invención se dan en las reivindicaciones dependientes. Los modos de realización de la presente invención se pueden combinar libremente entre sí si no son mutuamente excluyentes.
En un aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para controlar la proliferación de células eucariotas. Una lógica de control recibe una densidad celular objetivo y un plazo objetivo. La densidad celular objetivo representa una densidad celular deseada de las células eucariotas en el plazo objetivo. El plazo objetivo representa un punto futuro en el tiempo. Las células eucariotas se cultivan en un medio de cultivo de un primer depósito. El procedimiento comprende, para cada uno de una pluralidad de intervalos de tiempo (por ejemplo, al comienzo o al final de cada intervalo de tiempo):
- medir la densidad celular de las células eucariotas en el medio de cultivo;
- calcular, mediante la lógica de control, una densidad celular prevista en el plazo objetivo como una función de al menos la densidad celular medida;
- comparar, mediante la lógica de control, la densidad celular prevista y la densidad celular objetivo;
- ajustar, mediante la lógica de control, la temperatura del medio de cultivo en el primer depósito si la densidad celular prevista se desvía de la densidad celular objetivo. El ajuste se realiza incrementando la temperatura en 0,1 °C a 1 °C si la densidad celular prevista es menor que la densidad celular objetivo; o disminuyendo la temperatura en 0,1 °C a 1 °C si la densidad celular prevista es mayor que la densidad celular objetivo.
Dichos rasgos característicos pueden ser ventajosos, ya que permiten controlar activamente la proliferación de células eucariotas para producir un número definido de células en un momento definido. Se ha observado sorprendentemente que, aunque la temperatura no se mantuviera constante durante la proliferación del cultivo celular, la densidad celular deseada se alcanzaba en el plazo objetivo para muchos proyectos de cultivo celular diferentes incluso en caso de que las condiciones de partida (temperatura de partida, concentración celular de partida) fueran ligeramente diferentes. Aunque las células eucariotas y su metabolismo son muy sensibles a los cambios en la temperatura ambiental, se ha observado que el bioproducto generado no difiere del bioproducto generado en condiciones de temperatura constante, al menos siempre que los ajustes de temperatura no excedan 1 °C de diferencia de temperatura por intervalo de tiempo de predicción y no excedan o desciendan por debajo de un intervalo de temperatura fisiológicamente tolerable.
Además, se ha observado que las células toleran los cambios de temperatura y se pueden recuperar rápidamente de los mismos dentro del intervalo de temperatura especificado anteriormente. Por tanto, el tiempo total para un proyecto de cultivo celular no se prolonga ajustando la temperatura del medio dentro del intervalo de temperatura especificado anteriormente. Esto es diferente para el ajuste de otros parámetros de producción, por ejemplo, el pH, que se ha observado que reduce la eficacia de producción celular, ya que se ha observado que las células requieren algún tiempo adicional para recuperarse de los cambios de pH antes de poder continuar acumulando masa celular y produciendo el bioproducto deseado.
Al predecir repetidamente el plazo en que un cultivo celular en ese momento desarrollado probablemente alcanzará una densidad celular deseada, comparando el plazo previsto con un plazo objetivo especificado y adaptando la temperatura del medio de cultivo celular en consecuencia, los modos de realización de la invención permiten compensar pequeñas variaciones en las condiciones de partida de un cultivo celular y pueden permitir garantizar que un cultivo celular alcanzará una densidad celular deseada y liberará una cantidad deseada de bioproducto en un plazo futuro particular y definido ("plazo objetivo"). Dependiendo de la línea celular, del medio de cultivo, de las condiciones en el depósito y del tipo de bioproducto que se produce, la duración típica de un proyecto de cultivo celular desde la siembra del cultivo celular hasta el momento en que el cultivo celular haya alcanzado la densidad celular objetivo variará. Muchos proyectos tienen una duración típica en un intervalo de 3 a 5 días, por ejemplo, 4,5 días. Se ha observado que los modos de realización de la invención pueden compensar hasta un 20 % de desviación de uno o más parámetros del procedimiento en el momento inicial con respecto a los parámetros del procedimiento "típicos" o "de referencia" de un proyecto de cultivo celular de referencia. Por ejemplo, si un proyecto de referencia se ejecutó a una temperatura constante de 37 °C y requirió exactamente 4 días (96 horas) hasta que se alcanzó la densidad celular deseada, los modos de realización de la invención que usan el enfoque dinámico de adaptación de temperatura basado en predicciones pueden permitir conseguir la misma densidad celular en un intervalo de tiempo un 20 % más corto, es decir, en 3,2 días (77 horas). Asimismo, en caso de que la cantidad de células usada para sembrar el biorreactor fuera un 20 % inferior a la cantidad de células usada para sembrar el biorreactor de referencia, la adaptación dinámica de temperatura de acuerdo con los modos de realización de la invención puede permitir compensar el número reducido de células de partida y proporcionar la densidad celular deseada en el plazo objetivo deseado.
Asimismo, se ha observado que los modos de realización de la invención compensan con éxito varias fuentes de error (fallo del suministro de oxígeno o nutrientes, fallo del sistema de control de pH, etc.) que habrían dado como resultado, basándose en técnicas convencionales de cultivo celular a temperatura constante, una disminución de la densidad del producto o celular de hasta un 20 %.
Por tanto, los modos de realización de la invención pueden permitir compensar fallos del sistema y desviaciones de parámetros del procedimiento en relación con un proyecto de cultivo de referencia y, por tanto, pueden permitir un mejor control y previsibilidad de un proyecto de cultivo celular.
El cálculo de la densidad celular prevista en el plazo objetivo como una función de al menos la densidad celular medida se puede realizar basándose únicamente en la densidad celular medida en ese momento. Preferentemente, la densidad celular en el plazo objetivo se predice como una función de múltiples densidades celulares medidas que se han medido en intervalos de tiempo anteriores.
De acuerdo con modos de realización preferentes, los ajustes de temperatura no disminuyen la temperatura del medio de cultivo por debajo de una temperatura de 32 °C y no aumentan la temperatura del medio de cultivo por encima de aproximadamente la temperatura de 38 °C.
Realizar ajustes de temperatura solo dentro de dicho intervalo de temperatura puede ser beneficioso, ya que se ha observado que los ajustes de temperatura dentro de dicho intervalo pueden afectar a la tasa de proliferación de manera controlada, pero no cambian significativamente el metabolismo celular en dirección a otras vías metabólicas, por ejemplo, de producción de proteínas de choque térmico. Se ha observado que los ajustes de temperatura dentro de dicho intervalo son completa y rápidamente reversibles, ya que las células no necesitan tiempo adicional para recuperarse de una temperatura usada previamente.
De acuerdo con modos de realización, el procedimiento para controlar la proliferación celular y el ajuste de la temperatura, si es necesario, se realiza durante toda la fase de proliferación al completo o durante toda la fase estacionaria al completo o durante todo el tiempo de proliferación y estacionario.
Esto puede ser beneficioso, ya que, cuanto mayor sea el periodo de tiempo usado para ajustar dinámicamente la temperatura del cultivo celular, mejor será la capacidad de compensar los fallos de los componentes del sistema y las condiciones de partida subóptimas.
De acuerdo con modos de realización, el primer depósito comprende un medidor para realizar mediciones en línea de la densidad celular en el medio de cultivo. En consecuencia, las densidades celulares de las células eucariotas que se miden en cada uno de la pluralidad de intervalos de tiempo son mediciones en línea.
Por ejemplo, para contar automáticamente las células vivas en el medio se pueden usar dispositivos de medición que miden las propiedades dieléctricas del medio de cultivo para determinar el número de células en un volumen dado del medio o técnicas ópticas, por ejemplo, en forma de microscopio en línea.
Por ejemplo, el sistema de biomasa FOGALE se puede usar para determinar la densidad celular en el depósito sin tomar una muestra. El uso de un sensor dieléctrico tiene la ventaja de que, a diferencia de las técnicas ópticas, el sistema no es sensible a las burbujas de gas, los desechos celulares y otras partículas en suspensión. Al hacer uso del sensor de biomasa FOGALE o de dispositivos sensores similares, la concentración de biomasa viable (biovolumen) se puede determinar como una medición en línea independientemente de la variación del tamaño de la cubeta.
Otro ejemplo de un medidor de densidad celular en línea es un microscopio in situ. Un microscopio in situ es un sistema desarrollado para adquirir imágenes de células de mamífero directamente dentro de un biorreactor (in situ) durante un proyecto de cultivo celular. Requiere solo una mínima intervención del operario. Un ejemplo de microscopio in situ y de su uso se describe en Joeris K, Frerichs JG, Konstantinov K, Scheper T: "ln-situ microscopy: Online process monitoring of mammalian cell cultures" Cytotechnology. Ene 2002; 38(1-3): 129-34. doi: 10.1023/A: 1021170502775.
Otro ejemplo de un medidor de densidad celular en línea es un espectrómetro Raman. El uso de espectrómetros Raman para la determinación de densidades celulares en biorreactores ha sido descrito, por ejemplo, por Justin Moretto et al. en "Process Raman Spectroscopy for In-Line CHO Cell Culture Monitoring" (ejemplar de abril de 2011 de American Pharmaceutical Review - volumen 14).
Realizar una medición en línea de la densidad celular puede tener la ventaja de evitar problemas asociados con la medición fuera de línea: los datos de medición fuera de línea tienden a ser de baja calidad debido a tiempos de latencia importantes entre el momento de la medición y el momento de realizar una operación de control respectiva. Además, el procedimiento de muestreo para obtener el valor de medición de una muestra puede incrementar el riesgo de infección del cultivo celular por gérmenes no deseados y puede reducir la exactitud de la medición debido a los efectos del muestreo (por ejemplo, un cambio en la temperatura).
En otro aspecto beneficioso, usar densidades celulares en línea en lugar de densidades fuera de línea permite un control de la proliferación del cultivo celular completamente automatizado. Además, usar densidades celulares en línea puede proporcionar un gran número de mediciones de densidad celular durante un proyecto de cultivo celular y, por tanto, puede proporcionar una mejor base de datos para predecir la densidad celular en el plazo objetivo, lo que de nuevo puede aumentar la exactitud de la predicción.
De acuerdo con modos de realización, la lógica de control se configura para finalizar al menos el ajuste de la temperatura cuando se cumple un criterio de finalización. El criterio de finalización puede ser, por ejemplo, la determinación de que se ha alcanzado el plazo objetivo, o que la densidad celular medida es igual a o mayor que la densidad celular objetivo.
Opcionalmente, la lógica de control no solo puede dejar de ajustar la temperatura, sino que también puede detener la proliferación del cultivo celular. Por ejemplo, la lógica de control puede enviar uno o más comandos de control a elementos de control automatizados que hacen que los elementos de control dejen de alimentar y airear las células en el depósito de cultivo celular y comiencen un procedimiento de extracción celular automatizado. De forma alternativa, la lógica de control envía un mensaje a uno o más dispositivos de comunicación móviles del personal técnico habilitado para informar al personal de que las células en el depósito se deben extraer o se deben procesar adicionalmente. Además, o de forma alternativa, el mensaje se muestra en una pantalla acoplada operativamente a la lógica de control. El procesamiento adicional puede comprender transferir las células o el medio de cultivo al completo que comprende las células desde el primer depósito a un depósito diferente, preferentemente más grande, por ejemplo, otro biorreactor de preproducción o un biorreactor de producción. Dependiendo del modo de realización, el procedimiento de extracción y/o el procedimiento de transferencia se pueden realizar de forma manual, automática o semiautomática.
Preferentemente, la predicción repetida de la densidad celular futura en el plazo objetivo, la comparación con el plazo objetivo y el ajuste de la temperatura, si fuera necesario, se realizan de forma totalmente automática. De acuerdo con modos de realización preferentes, la transferencia repetida de células de un depósito de preproducción a otro depósito de preproducción o a un depósito de producción y la extracción final de las células o del bioproducto generado se realizan también de forma totalmente automática, es decir, sin ningún tipo de intervención humana. Esto puede ser ventajoso, ya que se puede proporcionar un sistema y procedimiento completamente automatizados que sean consistentes frente a ligeras variaciones en las condiciones de partida, consistentes frente a fallos de los componentes del sistema durante la fase de cultivo celular y que puedan liberar de manera fiable una densidad celular definida y una calidad del producto definida en un plazo futuro especificado sin ninguna intervención humana.
De acuerdo con modos de realización, la lógica de control recibe un umbral de desviación de la concentración celular para ajustar la temperatura. La lógica de control adapta la temperatura del medio de cultivo en el primer depósito solo en caso de que la concentración celular prevista en el plazo objetivo se desvíe en más de dicho umbral de la concentración celular objetivo. Esto puede ser beneficioso, ya que el umbral introduce algo de inercia en el bucle de control y garantiza que la temperatura se adapte solo en caso de que se prediga que la desviación de la concentración celular objetivo alcance un nivel significativo. Por ejemplo, la lógica de control recibe un umbral inferior de desviación de la concentración celular, por ejemplo, el 95 % de la densidad celular objetivo, y puede incrementar la temperatura del medio en el primer depósito solo en caso de que la concentración celular prevista sea inferior al 95 % de la concentración celular objetivo. Además, de forma alternativa, la lógica de control recibe un umbral superior de desviación de la concentración celular, por ejemplo, el 105 % de la densidad celular objetivo, y puede disminuir la temperatura del medio en el primer depósito solo en caso de que la concentración celular prevista sea mayor del 105 % de la concentración celular objetivo. También se puede usar otros valores de umbral inferior y superior, por ejemplo, un 99 % y 101 %, o 98 % y 102 %, o valores de umbral asimétricos como un 99 % para el umbral inferior de densidad celular y un 105 % para el umbral superior de densidad celular.
De acuerdo con modos de realización, la lógica de control proporciona una interfaz gráfica de usuario (GUI). La GUI permite que un usuario introduzca el plazo objetivo y la densidad celular objetivo antes de que la lógica de control comience a calcular las densidades celulares previstas. La GUI permite que el usuario modifique el plazo objetivo y/o la densidad celular objetivo mientras la lógica de control calcula las densidades celulares previstas en la pluralidad de intervalos de tiempo.
De acuerdo con algunos modos de realización, el procedimiento comprende además transferir el medio de cultivo del primer depósito y las células eucariotas contenidas en el mismo desde el primer depósito a un segundo depósito después de que se alcance la densidad celular objetivo. El segundo depósito es más grande que el primer depósito. La lógica de control recibe otra densidad celular objetivo y otro plazo objetivo. La otra densidad celular diana representa una densidad celular deseada de las células eucariotas en el otro plazo objetivo. Como el otro procedimiento de control de la proliferación en el segundo depósito se realiza después de que las células en el primer depósito alcancen la densidad celular objetivo, el otro plazo objetivo representa un momento posterior al momento de transferencia de las células al segundo depósito.
Por ejemplo, la lógica de control puede recibir la densidad celular objetivo, la otra densidad objetivo, el plazo objetivo y/o el otro plazo objetivo directamente del usuario por medio de una GUI instalada localmente (en la misma máquina que la lógica de control) o desde una GUI instalada de forma remota por medio de una red. De forma alternativa, la lógica de control puede leer dichos (otros) plazos objetivo y la densidad celular objetivo de un archivo de configuración que ha creado o modificado un usuario antes de que se instanciara la lógica de control.
Las células eucariotas transferidas se cultivan a continuación en el segundo depósito. Para cada uno de una pluralidad de otros intervalos de tiempo (por ejemplo, al principio o al final de cada intervalo de tiempo), se realiza el siguiente subprocedimiento:
- medir la densidad celular de las células eucariotas en un medio de cultivo del segundo depósito;
- calcular, mediante la lógica de control, otra densidad celular prevista en el otro plazo objetivo como una función de al menos dicha densidad celular medida;
- comparar, mediante la lógica de control, la otra densidad celular prevista y la otra densidad celular objetivo;
- ajustar, mediante la lógica de control, la temperatura del medio de cultivo en el segundo depósito si la otra densidad celular prevista se desvía de la otra densidad celular objetivo. El ajuste se realiza incrementando la temperatura en 0,1 °C a 1 °C si la otra densidad celular prevista es menor que la otra densidad celular objetivo. Si la otra densidad celular prevista es mayor que la otra densidad celular objetivo, la lógica de control disminuye la temperatura en 0,1 °C a 1 °C.
Dependiendo del modo de realización, la primera y la segunda densidad celular objetivo pueden ser idénticas o pueden diferir entre sí.
De acuerdo con algunos modos de realización, el primer y segundo depósito, respectivamente, son biorreactores configurados para hacer proliferar el cultivo celular como cultivo discontinuo. El procedimiento se usa en un procedimiento de cultivo en serie de siembra para generar un número mínimo definido de células para la siembra de un biorreactor de producción.
Esto puede ser ventajoso, ya que el cultivo celular se puede hacer proliferar hasta una primera densidad celular objetivo en un primer plazo objetivo de forma semiautomática o completamente automática. A continuación, el cultivo celular se puede transferir a otro depósito más grande, por ejemplo, otro biorreactor o recipiente de preproducción. A continuación, las células se hacen proliferar hasta una segunda densidad celular objetivo en otro segundo plazo objetivo. Dichas etapas se pueden repetir para tres, cuatro o incluso más recipientes o biorreactores de preproducción hasta que se obtenga un número suficiente de células para sembrar un biorreactor de gran producción. Por tanto, el procedimiento se puede usar para hacer proliferar un cultivo celular en un proyecto de cultivo en serie de siembra.
De acuerdo con modos de realización, el primer depósito es un biorreactor configurado para hacer proliferar el cultivo celular como un cultivo discontinuo de preproducción. El segundo depósito es más grande que el primer depósito y es un biorreactor configurado para hacer proliferar el cultivo celular como cultivo de producción.
El cultivo de producción puede ser, por ejemplo, un cultivo semicontinuo. En algunos modos de realización, el cultivo de producción también puede ser un cultivo discontinuo.
De acuerdo con modos de realización, las células eucariotas son células de mamífero, en particular células de ovario de hámster chino (CHO). De forma alternativa, las células eucariotas son células de riñón de cría de hámster (BHK) o una línea celular humana. Un ejemplo de una línea celular humana es Per.C6, una línea celular derivada de la inmortalización de células embrionarias de retina humana con el gen E1 de adenovirus. A menudo se usan para producir anticuerpos monoclonales (MAb) usando G418 como agente de selección. Además, las células eucariotas pueden ser células NS0, células Sp2/0, células COS, células K562 o células HEK.
Asimismo, todos los modos de realización descritos en el presente documento se pueden usar para controlar la proliferación de células procariotas, en particular células bacterianas, por ejemplo, células de Escherichia coli.
De acuerdo con modos de realización, el medio de cultivo en el primer depósito tiene un volumen de 500 litros o menos.
De acuerdo con modos de realización, el procedimiento comprende además, para cada uno de la pluralidad de intervalos de tiempo (por ejemplo, al comienzo o al final de cada intervalo de tiempo):
- definir un intervalo de observación actual para el intervalo de tiempo actual, teniendo el intervalo de observación actual una duración predefinida y terminando al final del intervalo de tiempo actual; y recibir todas las densidades celulares que se han medido durante el intervalo de observación actual.
La densidad celular prevista se calcula como una función de al menos la densidad celular medida. El cálculo comprende extrapolar las densidades celulares medidas durante el intervalo de observación actual hasta el plazo objetivo.
Por ejemplo, la lógica de control puede definir el intervalo de observación actual determinando una hora actual proporcionada por un reloj y analizando un archivo de configuración o una entrada del usuario para determinar la duración del intervalo de observación. A continuación, la lógica de control identifica el intervalo de tiempo de observación actual como un intervalo de tiempo que finaliza en la hora actual y cuya duración determinada comienza antes de la hora actual. En la figura 2 se describen ejemplos de intervalos de observación determinados en diferentes horas actuales.
De acuerdo con modos de realización, la extrapolación comprende realizar una operación de ajuste de curva o un análisis de regresión sobre las densidades celulares medidas durante el tiempo de observación actual.
De acuerdo con modos de realización, todos los intervalos de tiempo de la pluralidad de intervalos de tiempo son de la misma duración.
De acuerdo con modos de realización, todos los intervalos de tiempo de la pluralidad de intervalos de tiempo tienen diferente duración.
De acuerdo con modos de realización, el procedimiento comprende determinar si la hora actual está cerca del plazo objetivo. Por ejemplo, la lógica de control puede determinar que la hora actual está cerca del plazo objetivo en caso de que a) haya transcurrido una duración predefinida desde la siembra del medio de cultivo o en caso de que b) ya se haya realizado un número predefinido de predicciones de la densidad celular en el plazo objetivo o c) que se haya alcanzado un porcentaje predefinido de la densidad celular objetivo o d) se haya alcanzado un tiempo predefinido antes del plazo objetivo, por ejemplo, 13 horas antes del plazo objetivo (típicamente, dicho tiempo predefinido antes del plazo objetivo está en un intervalo de 12 h - 14 h). Existen otras formas de determinar de forma automática si la hora actual está cerca del plazo objetivo. De forma alternativa, el usuario puede, por medio de la GUI, introducir una indicación de que la hora actual está cerca del plazo objetivo.
En respuesta a la determinación de que la hora actual está cerca del plazo objetivo, la lógica de control reduce la duración de todos los futuros intervalos de tiempo de la pluralidad de intervalos de tiempo.
Esto puede ser beneficioso, ya que la exactitud de la predicción de la densidad celular y la exactitud del control de la proliferación se pueden aumentar: al final del tiempo de cultivo, la densidad celular ya es alta y pequeños errores en una predicción en combinación con intervalos de tiempo largos entre las predicciones pueden dar como resultado un fallo en producir exactamente la densidad celular deseada en el plazo objetivo. Para incrementar la exactitud de la predicción y el control de la proliferación, los modos de realización de la invención usan intervalos de tiempo de predicción más cortos al final de un proyecto de cultivo. Por ejemplo, el acortamiento de los intervalos de tiempo de predicción se puede realizar de forma totalmente automática mediante la lógica de control como se describe anteriormente o se puede realizar manualmente por un usuario.
De acuerdo con modos de realización, cada uno de la pluralidad de intervalos de tiempo tiene una duración de menos de 30 minutos, preferentemente menos de 10 minutos. Por ejemplo, cada uno de los intervalos de tiempo tiene una duración en el intervalo de 1 minuto a 10 minutos.
De acuerdo con modos de realización, la duración predefinida del intervalo de observación está en un intervalo de 60 minutos a 480 minutos, en particular de 80 a 100 minutos, por ejemplo, 90 minutos.
Se ha observado que las duraciones anteriores de los intervalos de tiempo de predicción y los intervalos de observación proporcionan un buen equilibrio entre una alta exactitud de predicción y el consumo de recursos (obtener valores de medición, hacer una predicción y comparar las densidades celulares previstas puede consumir potencia de procesamiento y generar tráfico de red, y la actualización de una pantalla que comprende una curva que muestra las densidades celulares medidas y previstas puede consumir capacidades adicionales de red, de memoria y de CPU).
De acuerdo con modos de realización, el medio de cultivo en el primer depósito (y opcionalmente también en el segundo depósito y otros depósitos) es un medio CD-CHO AGT. Sin embargo, el medio adecuado depende en gran medida del tipo de células, de la fase de proliferación celular (por ejemplo, fase de proliferación o fase estacionaria), del tipo de producto que se va a producir, del tipo de recipiente o biorreactor usado y de otros factores. Por lo tanto, también se pueden usar los otros medios, por ejemplo, d Me M, RPMI, Hams F12 y otros.
De acuerdo con otro modo de realización, el ajuste de la temperatura comprende incrementar la temperatura en 0,1 °C a 0,5 °C, preferentemente en 0,1 °C a 0,2 °C o disminuir la temperatura en 0,1 °C a 0,5 °C, preferentemente en 0,1 °C a 0,2 °C.
De acuerdo con modos de realización, la GUI u otro componente del sistema de control permiten que el usuario introduzca parámetros de control adicionales antes de y/o durante un proyecto de cultivo celular en ejecución. Por ejemplo, el usuario puede especificar la duración de los intervalos de tiempo de predicción, la duración de los intervalos de observación, la duración de un intervalo de ajuste, los valores de umbral superior y/o inferior para considerar que una densidad celular prevista sea (suficientemente) menor o mayor que la densidad celular objetivo y/o la cantidad de ajuste de temperatura por cada acción de ajuste. Preferentemente, el usuario puede introducir diferentes valores para etapas de ajuste de temperatura positivo y etapas de ajuste de temperatura negativo. Esto puede mejorar la adaptación del control de temperatura a las características de calentamiento y enfriamiento del biorreactor.
En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para proporcionar células eucariotas a una densidad celular deseada en un plazo futuro definido. El procedimiento comprende introducir, por parte de un usuario humano, la densidad celular deseada y el plazo futuro por medio de una interfaz de una lógica de control. La densidad celular deseada representa una densidad celular deseada de las células eucariotas en el plazo futuro introducido. La lógica de control se usa para controlar la proliferación de células eucariotas de acuerdo con un procedimiento de uno cualquiera de los modos de realización descritos en el presente documento. El control de la proliferación se realiza de modo que la densidad celular deseada introducida se usa como la densidad celular objetivo, el plazo futuro introducido se usa como el plazo objetivo y las células eucariotas se proporcionan a la densidad celular objetivo en el plazo objetivo.
En otro aspecto, la invención se refiere a un sistema para controlar la proliferación de células eucariotas. El sistema se tiene que controlar de modo que produzca un número definido de células en un plazo futuro definido. El sistema comprende una lógica de control y un procesador configurado para ejecutar la lógica de control. La lógica de control se acopla operativamente a un primer depósito que comprende células eucariotas en un medio de cultivo. La lógica de control se configura para recibir una densidad celular objetivo y un plazo objetivo. Por ejemplo, la densidad celular objetivo y el plazo objetivo se pueden recibir desde una interfaz de red, se pueden leer desde un archivo de configuración de la lógica de control o se pueden recibir como entradas del usuario por medio de una interfaz gráfica de usuario. La densidad celular objetivo representa una densidad celular deseada de las células eucariotas en el plazo objetivo. El plazo objetivo representa un punto futuro en el tiempo.
El sistema se configura para realizar, para cada uno de una pluralidad de intervalos de tiempo (por ejemplo, al inicio o al final de cada intervalo de tiempo), un subprocedimiento que comprende:
- recibir una densidad celular medida de las células eucariotas en el medio de cultivo del primer depósito;
- calcular una densidad celular prevista en el plazo objetivo como una función de al menos la densidad celular medida;
- comparar la densidad celular prevista y la densidad celular objetivo;
- ajustar, mediante la lógica de control, la temperatura del medio de cultivo en el primer depósito si la densidad celular prevista se desvía de la densidad celular objetivo; si la densidad celular prevista es menor que la densidad celular objetivo, la lógica de control incrementa la temperatura en 0,1 °C a 1 °C; si la densidad celular prevista es mayor que la densidad celular objetivo, la lógica de control disminuye la temperatura en 0,1 °C a 1 °C.
De acuerdo con modos de realización, el sistema comprende además el primer depósito y opcionalmente también uno o más depósitos adicionales (los depósitos adicionales pueden recibir el cultivo celular del primer depósito o de otro depósito una vez que las células hayan alcanzado una densidad celular deseada en un depósito usado previamente).
De acuerdo con modos de realización, el primer depósito comprende un medidor para realizar mediciones en línea de la densidad celular en el medio de cultivo. Las densidades celulares de las células eucariotas medidas en cada uno de la pluralidad de intervalos de tiempo son mediciones en línea.
De acuerdo con modos de realización, la lógica de control se configura para finalizar al menos el ajuste de la temperatura cuando se cumple un criterio de finalización. El criterio de finalización puede ser, por ejemplo, que se ha alcanzado el plazo objetivo, o que la densidad celular medida es igual a o mayor que la densidad celular objetivo.
De acuerdo con modos de realización, el sistema o uno de sus componentes, por ejemplo, la lógica de control, se configura para proporcionar una interfaz gráfica de usuario (GUI). La GUI permite que un usuario introduzca el plazo objetivo y la densidad celular objetivo antes de que la lógica de control comience a calcular las densidades celulares previstas. La GUI también puede permitir que el usuario modifique el plazo objetivo y/o la densidad celular objetivo mientras la lógica de control calcula las densidades celulares previstas en la pluralidad de intervalos de tiempo.
De acuerdo con modos de realización, el sistema comprende al menos el primer y un segundo depósito. El primer depósito se adapta para que un usuario pueda transferir el medio de cultivo del primer depósito y las células eucariotas contenidas en el mismo desde el primer depósito a un segundo depósito. Por ejemplo, el primer depósito puede comprender una abertura o una tubería para transferir de forma manual o automática el medio con las células desde el primer al segundo depósito.
El segundo depósito es más grande que el primer depósito y se adapta para recibir el medio con las células y medio sin células adicional y hacer proliferar las células eucariotas transferidas.
La lógica de control se configura para recibir otra densidad celular objetivo y otro plazo objetivo, por ejemplo, leyendo el otro plazo objetivo de un medio de almacenamiento o recibiendo el plazo objetivo por medio de una GUI o una interfaz de red de un usuario. La otra densidad celular objetivo representa una densidad celular deseada de las células eucariotas en el otro plazo objetivo. El otro plazo objetivo representa un punto futuro en el tiempo (posterior al momento de transferir las células desde el primer al segundo depósito).
Un medidor de densidad celular del segundo depósito se configura para medir la densidad celular de las células eucariotas en el medio de cultivo del segundo depósito para cada uno de una pluralidad de intervalos de tiempo denominados en el presente documento "otros intervalos de tiempo" u "otros intervalos de tiempo de predicción". La lógica de control se configura, para cada uno de los otros intervalos de tiempo, para:
- calcular otra densidad celular prevista en el otro plazo objetivo como una función de al menos dicha densidad celular medida;
- comparar la otra densidad celular prevista y la otra densidad celular objetivo;
- ajustar la temperatura del medio de cultivo en el segundo depósito si la otra densidad celular prevista se desvía de la otra densidad celular objetivo. El ajuste comprende incrementar la temperatura en 0,1 °C a 1 °C si la otra densidad celular prevista es menor que la otra densidad celular objetivo; o disminuir la temperatura en 0,1 °C a 1 °C si la otra densidad celular prevista es mayor que la otra densidad celular objetivo.
De acuerdo con modos de realización, el primer depósito es un biorreactor configurado para hacer proliferar el cultivo celular como cultivo discontinuo. El segundo depósito es más grande que el primer depósito y es un biorreactor configurado para hacer proliferar el cultivo celular como cultivo discontinuo. El primer y segundo depósito se adaptan para usarlos en un procedimiento de cultivo en serie de siembra para generar un número mínimo definido de células para la siembra de un biorreactor de producción.
De acuerdo con modos de realización, el segundo depósito comprende un medidor para medir la densidad celular en el segundo depósito y comprende una unidad de control de temperatura para ajustar la temperatura del medio en el segundo depósito de acuerdo con un comando de control de temperatura de la lógica de control.
De acuerdo con modos de realización, el primer depósito es un biorreactor configurado para hacer proliferar el cultivo celular como un cultivo discontinuo de preproducción. El segundo depósito es más grande que el primer depósito y es un biorreactor configurado para hacer proliferar el cultivo celular como cultivo de producción.
De acuerdo con modos de realización, las células eucariotas son células de mamífero, en particular células de ovario de hámster chino (CHO).
De acuerdo con modos de realización, el medio de cultivo en el primer depósito tiene un volumen de 500 l o menos. De acuerdo con modos de realización, la lógica de control se configura para realizar, para cada uno de la pluralidad de intervalos de tiempo:
- definir un intervalo de observación actual para el intervalo de tiempo actual, teniendo el intervalo de observación actual una duración predefinida y terminando al final del intervalo de tiempo actual; y
- recibir todas las densidades celulares que se han medido durante el intervalo de observación actual.
El cálculo de la densidad celular prevista como una función de al menos la densidad celular medida comprende extrapolar las densidades celulares medidas durante el intervalo de observación actual hasta el plazo objetivo. De acuerdo con modos de realización, la extrapolación comprende realizar una operación de ajuste de curva o un análisis de regresión sobre las densidades celulares medidas durante el tiempo de observación actual.
De acuerdo con modos de realización, los intervalos de tiempo son de la misma duración.
De acuerdo con modos de realización, los intervalos de tiempo son de diferente duración. En particular, al menos algunos intervalos de tiempo en el último tercio del proyecto de cultivo celular son más cortos que los intervalos de tiempo en el primer tercio del proyecto de cultivo celular.
De acuerdo con algunos modos de realización, la lógica de control se configura para determinar si la hora actual está cerca del plazo objetivo. En respuesta a la determinación de que la hora actual está cerca del plazo objetivo, la lógica de control reduce la duración de todos los futuros intervalos de tiempo de la pluralidad de intervalos de tiempo.
De acuerdo con modos de realización, cada uno de la pluralidad de intervalos de tiempo tiene una duración en un intervalo de menos de 30 minutos, preferentemente menos de 10 minutos, por ejemplo, una duración en un intervalo de 1 a 10 minutos.
De acuerdo con modos de realización, la duración predefinida del intervalo de observación está en un intervalo de 60 minutos a 480 minutos.
De acuerdo con modos de realización, el ajuste de la temperatura comprende incrementar la temperatura en 0,1 °C a 0,5 °C, preferentemente en 0,1 °C a 0,2 °C o disminuir la temperatura en 0,1 °C a 0,5 °C, preferentemente en 0,1 °C a 0,2 °C.
De acuerdo con modos de realización, la lógica de control se configura para realizar el ajuste de temperatura del primer depósito solo en caso de que haya transcurrido al menos un intervalo de tiempo de ajuste desde el ajuste previo de temperatura de la lógica de control de dicho primer depósito. La duración del intervalo de tiempo de ajuste está en un intervalo de 60 a 120 minutos.
De acuerdo con modos de realización, la lógica de control se configura para que un usuario humano (por ejemplo, proporcionando una GUI) pueda introducir la densidad celular deseada y un plazo futuro en que se alcanzará dicha densidad celular deseada por medio de una interfaz de la lógica de control. La densidad celular deseada representa una densidad celular deseada de las células eucariotas en el plazo futuro introducido. La lógica de control se configura además para controlar la proliferación de células eucariotas de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización descritos en el presente documento. El control de la proliferación se realiza de modo que la densidad celular deseada introducida se usa como la densidad celular objetivo, el plazo futuro introducido se usa como el plazo objetivo y de modo que las células eucariotas se proporcionan a la densidad celular objetivo en el plazo objetivo.
Un "depósito", como se usa en el presente documento, es un recipiente para contener, transportar o almacenar líquidos. Un depósito puede ser, por ejemplo, un biorreactor, en particular un biorreactor de preproducción o de producción, un vial o un depósito de extracción o de transporte. Por ejemplo, un depósito puede ser un recipiente que tiene un volumen interior adecuado para cultivar una pluralidad de células (por ejemplo, células de mamífero recombinantes) en un medio de cultivo líquido en un conjunto controlado de condiciones físicas que permiten el mantenimiento o la proliferación de las células.
Ejemplos no limitantes de depósitos son biorreactores (por ejemplo, cualquiera de los biorreactores ejemplares descritos en el presente documento o conocidos en la técnica).
Un "biorreactor" como se usa en el presente documento es un recipiente en el que se lleva a cabo un proceso químico que implica organismos o sustancias bioquímicamente activas derivadas de dichos organismos. Este proceso puede ser, por ejemplo, aeróbico o anaeróbico. Existe una pluralidad de tipos de biorreactores diferentes que varían en forma (por ejemplo, cilíndrica u otra), tamaño (por ejemplo, mililitros, de litros a metros cúbicos) y material (acero inoxidable, vidrio, plástico, etc.). De acuerdo con modos de realización, el biorreactor se adapta para hacer proliferar células o tejido en cultivos celulares. Dependiendo del modo de realización y/o del modo de funcionamiento, un biorreactor puede ser un biorreactor discontinuo, un biorreactor semicontinuo o un biorreactor continuo (por ejemplo, un modelo de reactor de depósito agitado continuo). Un ejemplo de un biorreactor continuo es el quimiostato.
Una "lógica de control", como se usa en el presente documento, es una parte de lógica de programa, por ejemplo, un programa o módulo de aplicación, un chip de ordenador u otra parte de programa informático, equipo o soporte lógico inalterable o una combinación de los mismos que se configura para recibir y procesar uno o más valores de medición desde un depósito que comprende un cultivo celular, para procesar los valores de medición y para enviar uno o más comandos de control al depósito o a los módulos del equipo acoplados operativamente al depósito para controlar la proliferación del cultivo celular. Por ejemplo, la lógica de control puede ser un módulo de programa que es parte de o interactúa con un programa informático de supervisión y control de biorreactor. La lógica de control también puede ser parte de un sistema de gestión de información de laboratorio (LIMS).
Un "dispositivo de medición" o "medidor" que está "acoplado operativamente" a un depósito puede ser, por ejemplo, un dispositivo de medición que se encuentra localizado permanente o temporalmente dentro del depósito o acoplado a la pared del depósito y que se configura para medir uno o más parámetros físicos o químicos del depósito o del cultivo celular o medio de cultivo contenido en el mismo. La medición se puede realizar en respuesta a un comando o automáticamente de forma regular.
Una "medición en línea", como se usa en el presente documento, es un procedimiento de obtención de un valor de medición que es descriptivo de los rasgos característicos de estado de un depósito o de un cultivo celular o medio de cultivo contenido en el mismo, con lo que la duración requerida para realizar la medición es menor que el tiempo durante el cual dichos rasgos característicos cambian significativamente. Un cambio significativo puede ser un cambio en más de un valor de umbral predefinido. Por ejemplo, un cambio en más de un 5 % se puede considerar un cambio significativo. El umbral puede variar para diferentes rasgos característicos. Las mediciones en línea pueden permitir controlar un biorreactor en tiempo real. En particular, una "medición en línea", como se usa, puede ser una medición que se realiza directamente en el depósito o el cultivo celular o medio de cultivo celular contenido en el mismo directamente, es decir, sin tomar una muestra del medio y medir la muestra.
Una "medición fuera de línea" es un procedimiento de obtención de un valor de medición que es descriptivo de los rasgos característicos de estado de un depósito o de un cultivo celular o un medio de cultivo celular contenido en el mismo, con lo que la duración requerida para realizar la medición es mayor que el tiempo durante el cual dichos rasgos característicos pueden cambiar significativamente. Un cambio significativo puede ser un cambio en más de un valor de umbral predefinido. Un ejemplo típico para una medición fuera de línea es el muestreo automatizado, semiautomatizado o manual del medio, por ejemplo, para medir una densidad celular actual. Las mediciones fuera de línea se basan en un procedimiento de muestreo discontinuo. Como los rasgos característicos del biorreactor pueden haber cambiado desde que se tomó la muestra, controlar el biorreactor basándose en datos de medición fuera de línea tiende a ser de baja calidad debido a tiempos de latencia significativos entre el momento de la medición y el momento de realizar una operación de control respectiva. Un cambio significativo puede ser un cambio en más de un valor de umbral predefinido, por ejemplo, un 2 % o cualquier otro valor porcentual, dependiendo del rasgo característico de estado respectivo.
"Incrementar o disminuir una temperatura en X °C" significa, por ejemplo, que la temperatura de un objeto se incrementa o disminuye con respecto a la temperatura actual medida, por ejemplo, al mismo tiempo en que se realiza la predicción de la densidad celular. De acuerdo con modos de realización, el depósito comprende un termómetro en línea.
El procedimiento de "ajuste de curva", como se usa en el presente documento, es el procedimiento de construcción de una curva, o función matemática, que tenga el mejor ajuste a una serie de puntos de datos (aquí: densidades celulares medidas) posiblemente sujetos a restricciones. El ajuste de curva puede implicar un ajuste exacto a los datos, o un suavizado, en el que se construye una función "suave" que se ajusta aproximadamente a los datos.
Un "análisis de regresión", como se usa en el presente documento, es un procedimiento que se centra más en cuestiones de inferencia estadística, tales como cuánta incertidumbre está presente en una curva que se ajusta a los datos observados con errores aleatorios. Las curvas ajustadas se pueden mostrar opcionalmente en una GUI. Las curvas ajustadas se usan para deducir valores de una función cuando no hay datos disponibles y para resumir las relaciones entre dos o más variables.
El término "análisis de regresión", como se usa en el presente documento, se refiere a un procedimiento estadístico para estimar las relaciones entre variables y para representar la relación en una función, por ejemplo, una función de curva lineal o no lineal. Más comúnmente, el análisis de regresión estima el valor esperado condicional de la variable dependiente dadas las variables independientes, es decir, el valor promedio de la variable dependiente cuando las variables independientes son fijas. Por ejemplo, la densidad celular medida en el momento y un modelo de proliferación, por ejemplo, un modelo de proliferación lineal o exponencial, se pueden usar para estimar la relación entre plazos futuros y la densidad celular prevista. Se han desarrollado muchas técnicas para realizar análisis de regresión. Por ejemplo, se puede usar regresión lineal y regresión de mínimos cuadrados ordinarios. Realizar un análisis de regresión puede comprender la estimación de variables de respuesta continuas, a diferencia de las variables de respuesta discretas usadas en la clasificación (regresión métrica).
El término "extrapolación", como se usa en el presente documento, se refiere al uso de datos observados o al uso de una curva que se ha derivado de datos observados (por ejemplo, ajustando o interpolando de otro modo los datos observados) para calcular valores de datos predichos que se extienden más allá del intervalo de los datos observados. Por ejemplo, la extrapolación puede predecir valores de datos futuros ajustando una curva a través de valores de datos observados obtenidos en un intervalo de tiempo pasado. La curva puede ser una curva lineal o no lineal. El intervalo de datos observados puede ser, por ejemplo, un intervalo de tiempo en el pasado durante el cual se han medido densidades celulares en un depósito particular. Dicho intervalo de tiempo también se denomina en el presente documento "intervalo de observación". Como el intervalo de tiempo de observación se determina de novo para cada predicción, también se denomina "intervalo de observación actual". El cálculo de las futuras secciones de la curva está sujeto a cierto grado de incertidumbre, ya que puede reflejar el procedimiento usado para construir la curva tanto como refleja los datos observados.
La célula eucariota puede ser, en particular, una célula derivada de cualquier mamífero humano y no humano (por ejemplo, un ser humano, un hámster, un ratón, un mono verde, una rata, un cerdo, una vaca o un conejo). Por ejemplo, una célula de mamífero puede ser una célula inmortalizada. En algunos modos de realización, la célula de mamífero es una célula diferenciada. En algunos modos de realización, la célula de mamífero es una célula indiferenciada. Son conocidos en la técnica ejemplos adicionales de células de mamífero.
La expresión "procedimiento de cultivo en serie de siembra", como se usa en el presente documento, es un procedimiento de múltiples etapas por el que un número de partida de células (por ejemplo, células de mamífero recombinantes) en un primer cultivo celular se expande en un cultivo celular N -1 que contiene un número suficiente de células para sembrar un biorreactor de producción típico a una densidad celular inicial mayor de 0,25 x 106 células/ml. En consecuencia, un depósito de cultivo en serie de siembra es un recipiente o biorreactor adaptado para usarlo en un procedimiento de cultivo en serie de siembra. El propósito de un cultivo en serie de siembra es la generación de un número adecuado de células para la siembra de un biorreactor de producción. A partir de los volúmenes descongelados usados para el mantenimiento de la línea celular, el número de células se tiene que aumentar pasando las células a través de muchos sistemas de cultivo que se hacen más grandes con cada pase (por ejemplo, matraces en T, frascos giratorios o matraces de agitación, sistemas de biorreactor a pequeña escala y posteriormente biorreactores más grandes). Se pueden aplicar sistemas de un solo uso y los sistemas que se siembran en un estado parcialmente lleno y el volumen de cultivo se incrementan posteriormente mediante la adición de medio. Típicamente, un biorreactor de producción se siembra a partir de la escala de cultivo en serie de siembra más grande. Una serie de siembra ofrece espacio para la optimización, por ejemplo, la elección de puntos óptimos en el tiempo para pasar células de una escala a la siguiente más grande. De acuerdo con algunos modos de realización, las células de cada depósito usado en un procedimiento de cultivo en serie de siembra se hacen proliferar hasta la misma densidad celular en un plazo definido que la densidad celular objetivo del biorreactor de producción. En cada uno de los depósitos de serie de siembra y el depósito de producción, el procedimiento de control de la proliferación de acuerdo con modos de realización descritos en el presente documento se puede aplicar basándose en la misma densidad celular objetivo compartida (pero típicamente con diferentes plazos objetivo dependiendo de las particularidades del procedimiento de cada etapa de la serie de siembra). En otros modos de realización, las diferentes etapas del procedimiento de cultivo en serie de siembra usan diferentes densidades celulares objetivo.
Un "cultivo discontinuo", como se usa en el presente documento, es un cultivo celular desarrollado en un depósito que funciona en modo discontinuo. Cuando un depósito, por ejemplo, un biorreactor, funciona en modo discontinuo, el medio permanece igual durante todo el periodo de cultivo. Por tanto, el medio de cultivo no se complementa ni se repone (como es el caso en un procedimiento semicontinuo), ni se remplaza parcialmente (como es el caso en un biorreactor quimiostato). En un cultivo discontinuo, la proliferación de células, definida como un incremento en el número de células en un cultivo discontinuo, típicamente se incrementa muy fuertemente (fase exponencial) después de la constancia inicial (fase de latencia), a continuación disminuye gradualmente (fase de transición/'fase estacionaria") y, si fuera necesario, se vuelve negativa (fase de declive). La causa del estancamiento de la proliferación en un cultivo discontinuo es el agotamiento del medio nutritivo y la acumulación de sustancias tóxicas.
Un "cultivo semicontinuo", como se usa en el presente documento, es un cultivo celular desarrollado en un depósito que funciona en modo semicontinuo. El depósito puede ser, en particular, un depósito de producción que incluye una pluralidad de células en un medio de cultivo líquido. En el modo semicontinuo, se añade medio de cultivo líquido recién preparado periódica o continuamente al depósito sin retirada sustancial o significativa del medio de cultivo líquido del depósito durante el cultivo. El medio de cultivo recién preparado puede ser el mismo que el medio de cultivo presente en el depósito al comienzo del cultivo. En algunos ejemplos de cultivo semicontinuo, el medio de cultivo líquido recién preparado es una forma concentrada del medio de cultivo líquido presente en el depósito al comienzo del cultivo.
Una "interfaz gráfica de usuario (GUI)", como se usa en el presente documento, es un tipo de interfaz de usuario que permite a los usuarios interactuar con dispositivos electrónicos, por ejemplo, ordenadores o teléfonos inteligentes a través de iconos gráficos e indicadores visuales. Una GUI permite que el usuario controle funciones basadas en un programa informático y/o un equipo, por ejemplo, una lógica de control o un módulo del equipo de un depósito (por ejemplo, un termostato) a través de la manipulación directa de los elementos gráficos (por ejemplo, iconos, botones, barras, campos de texto, etc.) de la GUI.
La expresión "cultivar' o "cultivar células" significa el mantenimiento o proliferación de una célula de mamífero (por ejemplo, una célula de mamífero recombinante) en un conjunto controlado de condiciones físicas. La expresión "cultivo de células de mamífero" o "cultivo celular" significa un medio de cultivo líquido que contiene una pluralidad de células de mamífero que se mantiene o prolifera en un conjunto controlado de condiciones físicas.
La expresión "medio de cultivo líquido" o "medio de cultivo" significa un fluido que contiene suficientes nutrientes para permitir que una célula (por ejemplo, una célula de mamífero o bacteria) se multiplique o prolifere in vitro. Por ejemplo, un medio de cultivo líquido puede contener: aminoácidos, purinas, pirimidinas, colina, inositol, tiamina, ácido fólico, biotina, calcio, niacinamida, piridoxina, riboflavina, timidina, cianocobalamina, piruvato, ácido lipoico, magnesio, glucosa, oligoelementos metálicos o sales y tampones metálicos. En algunos modos de realización, un medio de cultivo líquido puede contener suero de un mamífero. En algunos modos de realización, un medio de cultivo líquido puede contener una hormona de crecimiento de mamífero y/o un factor de proliferación de mamífero. De forma alternativa, un medio de cultivo puede ser un medio mínimo (por ejemplo, un medio que contiene solo sales inorgánicas, una fuente de carbono y agua). El medio puede comprender suero derivado de un mamífero. El medio puede ser un medio de cultivo definido químicamente en el que todos los componentes químicos son conocidos.
De acuerdo con modos de realización, las células se adaptan para producir proteínas o péptidos recombinantes, por ejemplo, inmunoglobulinas, u otras formas de bioproductos. El término "recombinante" o "genomanipulado" significa un péptido o polipéptido que no está codificado de forma natural por un ácido nucleico endógeno presente dentro de un organismo (por ejemplo, un mamífero). Ejemplos de proteínas genomanipuladas incluyen enzimas, proteínas de fusión, anticuerpos, proteínas de unión a antígeno y otros tipos de péptidos o proteínas que se usan en la industria farmacéutica o la investigación biomédica.
De acuerdo con modos de realización, la lógica de control comienza ajustando la temperatura del primer depósito en función del resultado de comparación después de que se midiera una densidad celular mínima predefinida en el medio del primer depósito. La densidad celular mínima puede ser, por ejemplo, 100.000 células/ml. Esto puede ser beneficioso, ya que la exactitud de la predicción es menor para valores de densidad celular bajos que para valores de densidad altos. Además, en particular al comienzo de un proyecto de cultivo celular, la temperatura puede permanecer, por tanto, a una temperatura que es óptima para una tasa de proliferación rápida, y el "ajuste fino" de la tasa de proliferación se puede posponer para fases posteriores de un proyecto de cultivo celular para evitar retrasos innecesarios.
De acuerdo con algunos modos de realización, la lógica de control realiza el ajuste de temperatura de un depósito particular solo en caso de que haya transcurrido al menos un intervalo de tiempo de ajuste desde el ajuste previo de temperatura de la lógica de control de dicho depósito.
De acuerdo con algunos modos de realización, el sistema permite que el usuario especifique el intervalo de ajuste antes de que se inicie un proyecto de cultivo celular y, opcionalmente, permite que el usuario modifique dinámicamente el intervalo de ajuste durante el tiempo de ejecución del proyecto. Por ejemplo, la GUI puede permitir que un usuario especifique también un "intervalo de ajuste" además del plazo objetivo, la densidad celular objetivo y otros parámetros de control opcionales.
Un "intervalo de ajuste", como se usa en el presente documento, es el tiempo mínimo que debe haber transcurrido desde un ajuste de temperatura ejercido previamente por la lógica de control hasta que la lógica de control se habilite para reajustar la temperatura del mismo depósito. Preferentemente, el intervalo de ajuste tiene una duración en el intervalo de aprox. 60-120 min.
Usar un intervalo de ajuste en el intervalo especificado anteriormente puede ser beneficioso, ya que el intervalo de ajuste impide que la lógica de control cambie la temperatura con demasiada frecuencia. Esto podría tener un impacto negativo en la tasa de proliferación global de las células, ya que el metabolismo de las células se tendría que adaptar con mucha frecuencia a diferentes temperaturas.
La expresión "depósito de producción", como se usa en el presente documento, se refiere a un depósito a gran escala, en particular un biorreactor a gran escala adaptado para cultivar células en fase estacionaria. Los depósitos de producción se usan típicamente para producir y, opcionalmente, extraer el bioproducto deseado, por ejemplo, una proteína o péptido. El depósito a gran escala tiene, por ejemplo, un volumen interno de más de 500 l, 1000 l, 5000 l, 10.000 l, 20.000 l, 50.000 l o 100.000 l. Por ejemplo, un depósito de producción puede ser un biorreactor de perfusión.
La expresión "biorreactor de perfusión", como se usa en el presente documento, es un biorreactor que tiene un volumen interior para cultivar una pluralidad de células (por ejemplo, células de mamífero recombinantes) en un medio de cultivo líquido, y que tiene un medio (por ejemplo, una salida, una entrada, una bomba u otro dispositivo de ese tipo) para retirar de forma periódica o continua el medio de cultivo líquido del biorreactor y que tiene un medio (por ejemplo, una salida, una entrada, una bomba u otro dispositivo de ese tipo) para añadir sustancialmente el mismo volumen de un medio de cultivo líquido de remplazo al biorreactor. La adición del medio de cultivo líquido de remplazo se puede realizar sustancialmente al mismo tiempo o poco después de retirar el medio de cultivo líquido del biorreactor. Los medios para retirar el medio de cultivo líquido del biorreactor y los medios para añadir el medio de cultivo líquido de remplazo pueden ser un único dispositivo o sistema.
Breve descripción de los dibujos
En lo que sigue, se explican modos de realización de la invención en mayor detalle, solo a modo de ejemplo, haciendo referencia a los dibujos, en los que:
Descripción detallada
Figura 1 es un diagrama de bloques de un sistema para controlar la proliferación celular en un primer depósito y en un segundo depósito;
Figura 2 representa los intervalos de tiempo de predicción y varios intervalos de observación actuales diferentes;
Figura 3 es un diagrama de flujo de un procedimiento para controlar la proliferación celular ajustando la temperatura;
Figura 4 representa un sistema que comprende múltiples depósitos de preproducción y un depósito de producción;
Figura 5 ilustra los perfiles de densidad celular de seis proyectos de cultivo celular;
Figura 6 muestra con mayor detalle el efecto de la temperatura sobre la señal de densidad celular obtenida para uno de los 6 proyectos de cultivo celular de la figura 5;
Figura 7 muestra con mayor detalle el efecto de la temperatura sobre la señal de densidad celular obtenida para uno de los 6 proyectos de cultivo celular de la figura 5;
Figura 8 representa una curva que revela la dependencia de las densidades celulares en línea y fuera de línea de los ajustes de temperatura para tres proyectos de cultivo celular;
Figura 9 representa otra curva que revela la dependencia de las densidades celulares de los ajustes de temperatura para otros proyectos de cultivo celular;
Figura 10 representa dos curvas que ilustran la capacidad de la lógica de control de compensar un fallo del suministro de oxígeno;
Figura 11 representa dos curvas que ilustran la capacidad de la lógica de control de compensar un fallo del suministro de oxígeno;
Figura 12 representa dos curvas que ilustran la capacidad de la lógica de control de compensar un fallo del control del pH;
Figura 13 representa dos curvas que ilustran la capacidad de la lógica de control de compensar un fallo del control del pH;
Figura 14 representa tres curvas que ilustran la capacidad de la lógica de control de compensar un fallo tanto del suministro de oxígeno como del control del pH;
Figura 15 representa dos curvas que ilustran la capacidad de la lógica de control de compensar un fallo tanto del suministro de oxígeno como del control de temperatura.
La figura 1 es un diagrama de bloques de un sistema 102 para controlar la proliferación celular en un primer depósito 130 y en un segundo depósito 132. El control de la proliferación para cada uno de los depósitos se puede realizar de acuerdo con un procedimiento ilustrado por el diagrama de flujo en la figura 3. Por tanto, el sistema de la figura 1 se describirá a continuación haciendo referencia también a la figura 3.
El sistema de procesamiento de datos 102 comprende uno o más procesadores 104, una memoria principal 106 y un reloj 108. El reloj 108 se configura para determinar la hora en términos absolutos o relativos. Se usa para determinar los intervalos de tiempo de predicción y los intervalos de observación como se representa, por ejemplo, en las figuras 2a-2d. Además, el sistema 102 comprende un medio de almacenamiento no volátil 114 que comprende instrucciones legibles por ordenador que implementan una lógica de control 116. La lógica de control puede ser un programa de aplicación independiente o un submódulo o unidad de un programa de aplicación o marco de programa informático usado para controlar uno o más biorreactores y/o dispositivos de laboratorio.
Además, el medio de almacenamiento 114 comprende instrucciones legibles por ordenador que implementan una interfaz gráfica de usuario GUI 110. La GUI permite que un usuario 118 especifique e introduzca un plazo objetivo 112 y una densidad celular objetivo 114. Opcionalmente, la GUI permite además que el usuario especifique la duración de un intervalo de observación 138 durante el cual se miden y extrapolan las densidades celulares para predecir el plazo futuro cuando un cultivo celular controlado alcanza la densidad celular objetivo 114. Por ejemplo, la g U i 110 puede ser una interfaz HTML o una lógica de programa basada en Java o C#. De acuerdo con algunos modos de realización, la GUI 110 no solo permite que el usuario especifique la densidad celular objetivo, el plazo objetivo y el intervalo de observación antes de iniciar un proyecto de cultivo celular, sino que también permite que el usuario modifique la densidad celular objetivo, el plazo objetivo y/o el intervalo de observación ya introducidos y almacenados durante un proyecto de cultivo celular en curso.
El sistema 102 comprende además una interfaz 120 para recibir datos de medición de uno o más depósitos y/o para enviar comandos de control al uno o más depósitos. La interfaz envía los datos de medición recibidos a la lógica de control 116 y envía los comandos de control desde la lógica de control al uno o más depósitos.
El sistema de procesamiento de datos 102 se puede implementar como un sistema informático estándar, como un sistema informático servidor o como un dispositivo móvil de telecomunicaciones, por ejemplo, un teléfono inteligente o una tableta.
En el ejemplo representado en la figura 1, el sistema 102 está acoplado operativamente a un biorreactor 130 de preproducción y lo controla. El biorreactor 130 comprende un elemento 138 para incrementar o disminuir la temperatura del medio. Este elemento puede ser, por ejemplo, un termostato cuya temperatura objetivo se controla por la lógica de control 116. Además, el biorreactor de preproducción 130 comprende un medidor de densidad celular en línea 134 que se adapta para medir la densidad celular actual en el medio M1 del primer biorreactor 130 sin tomar ninguna muestra. El biorreactor 130 comprende un medio de cultivo M1 que no tiene células cuando comienza el proyecto de cultivo celular de preproducción.
Antes de comenzar a cultivar células en el biorreactor de preproducción 130, el usuario 118 instancia la GUI 110 y el sistema informático 102 e introduce una densidad celular objetivo para un tipo celular particular y un plazo objetivo que define el momento en que las células en el biorreactor 130 alcanzarán la densidad celular objetivo. Típicamente, el plazo objetivo está en el intervalo de /- 20 % del tiempo en que se sabe que dicho proyecto de cultivo celular entrará en una fase de proliferación particular, por ejemplo, el final de la fase de proliferación para biorreactores de preproducción o producción o el final de la fase estacionaria para reactores de producción.
Por ejemplo, el usuario puede instanciar la GUI el lunes a las 10:00 horas. El usuario puede querer hacer proliferar un cultivo de células CHO de preproducción que, de acuerdo con la literatura o con experimentos previos, típicamente requiere 48 horas para alcanzar la densidad celular deseada en condiciones de "temperatura constante" de 37 °C, una hora antes de comenzar un procedimiento de cultivo celular de preproducción en el biorreactor 130 a las 11:00 horas sembrando el biorreactor 130 con una muestra de células CHO descongelada. A las 10:00 horas, el usuario introduce el plazo objetivo 112, la densidad celular objetivo y el intervalo de tiempo de observación. Por ejemplo, el usuario puede introducir 4 millones de células por ml para la densidad celular objetivo y "lunes, 11:00 horas 48 horas" como plazo objetivo futuro. Además, el usuario puede establecer los intervalos de tiempo de predicción en, por ejemplo, aproximadamente 1 minuto y el intervalo de observación, por ejemplo, en 90 minutos. El usuario incluso puede establecer el plazo objetivo en "lunes, 11:00 horas 47 horas" para acortar en una hora el tiempo requerido para realizar el procedimiento de cultivo celular.
A las 11:00 horas, después de haber configurado la lógica de control por medio de la GUI 110, el usuario inicia el cultivo celular de preproducción sembrando el medio sin células M1 en el biorreactor 130 con una muestra de células CHO descongelada. La temperatura de partida del depósito puede ser de 37 °C.
En una primera etapa 302 del procedimiento de control descrito en el presente documento, por ejemplo, aproximadamente el lunes a las 11:00 horas, la lógica de control lee la densidad celular objetivo 114, el plazo objetivo 112 y, opcionalmente, la duración del intervalo de observación 138 que el usuario 118 ha introducido previamente desde el medio de almacenamiento 114. La densidad celular objetivo leída representa la densidad celular deseada de las células eucariotas en el plazo objetivo introducido (lunes, 11:00 horas 48 h). Por supuesto, el plazo se puede especificar en diversos formatos diferentes, dependiendo del modo de realización, por ejemplo, como un plazo absoluto o como un plazo relativo comenzando a partir de la hora actual o comenzando a partir de una hora futura particular.
En la etapa 304, las células eucariotas se cultivan en el medio de cultivo M1 del primer depósito 130. Por ejemplo, la etapa 304 puede comprender sembrar el medio M1 en el depósito 130 con células CHO. De acuerdo con otros modos de realización, también es posible que la etapa 304 se realice inmediatamente antes de la etapa 302 y que ambas etapas 302, 304 se realicen básicamente en paralelo.
A continuación, la lógica de control puede identificar automáticamente una serie de "intervalos de tiempo de predicción", también denominados "intervalos de tiempo" h, ..., I4367 de duración predefinida, por ejemplo, un minuto. El primer intervalo de tiempo puede comenzar, por ejemplo, en, poco antes o poco después del momento de la siembra.
Por cada uno 306 de una pluralidad de intervalos de tiempo (por ejemplo, al principio o al final de cada uno de los intervalos de tiempo), se realiza el siguiente subprocedimiento:
en la etapa 308, el medidor de densidad celular en línea 134 mide la densidad celular 122 de las células eucariotas en el medio de cultivo M1 en el primer depósito 130. El valor de medición 122 se envía por medio de la interfaz 122 a la lógica de control 116.
En respuesta a recibir el valor de densidad celular medido 122, la lógica de control calcula en la etapa 310 una densidad celular prevista en el plazo objetivo "lunes 11:00 horas 48 h" como una función de al menos la densidad celular medida en ese momento. En particular, la densidad celular en el plazo objetivo se puede predecir como una función de las múltiples densidades celulares que se han medido durante un intervalo de observación ajustable como se muestra en la figura 2.
Además, la lógica de control compara en la etapa 312 la densidad celular prevista y la densidad celular objetivo.
En la etapa 314, la lógica de control determina si la densidad celular prevista es mayor o menor o idéntica a la densidad celular objetivo. En caso de que la lógica de control determine que la densidad celular prevista es idéntica a la densidad celular objetivo introducida por el usuario o que está al menos dentro de una banda de umbral de tolerancia alrededor de la densidad celular objetivo, la temperatura actual del medio en el biorreactor 130 se mantiene activa o pasivamente en la etapa 318. En caso de que la lógica de control determine que la densidad celular prevista es menor que la densidad celular objetivo introducida por el usuario o que es menor que un umbral inferior de tolerancia por debajo de la densidad celular objetivo, la lógica de control envía un comando de control de ajuste de temperatura 126 al termostato 138 que provoca que el termostato incremente la temperatura actual del medio en el biorreactor 130 en la etapa 316, por ejemplo, en 0,4 °C. De forma alternativa, en caso de que la lógica de control determine que la densidad celular prevista es mayor que la densidad celular objetivo introducida por el usuario o que es mayor que un umbral superior de tolerancia por encima de la densidad celular objetivo, la lógica de control envía un comando de control de ajuste de temperatura 126 al termostato 138 que provoca que el termostato disminuya la temperatura actual del medio en el biorreactor 130 en la etapa 316, por ejemplo, en 0,4 °C. De acuerdo con modos de realización, la GUI uno 104 que permite que el usuario 118 especifique la cantidad de cambio de temperatura impuesto al medio por cada intervalo de tiempo de predicción para el que se consideró necesario un ajuste de temperatura.
El subprocedimiento que comprende las etapas 308-318 descritas anteriormente se puede realizar de forma totalmente automática para cada uno de una pluralidad de intervalos de tiempo de intervalo comparativamente corto, típicamente de uno a varios minutos.
De acuerdo con algunos modos de realización, el subprocedimiento, por ejemplo, la etapa 314, puede comprender otra verificación para determinar si se cumplió un criterio de finalización. Por ejemplo, la lógica de control determina que se cumple un criterio de finalización en caso de que haya transcurrido un número máximo predefinido de intervalos de tiempo de predicción, que se haya alcanzado la densidad celular objetivo o que se haya excedido una duración máxima predefinida para el proyecto de cultivo celular, etc.
El procedimiento descrito anteriormente, que incluye el subprocedimiento 306-318 realizado repetidamente, se puede usar para hacer proliferar células en un biorreactor de cultivo celular de preproducción 130 hasta una densidad celular deseada que sea apropiada para iniciar un proyecto de cultivo celular sucesivo en un segundo depósito 132, por ejemplo, un biorreactor de producción. El biorreactor de producción también comprende un termostato 140 controlado por la lógica de control por medio de respectivos comandos de control 128 y un medidor de densidad celular en línea 136 que envía los valores de densidad celular medidos a la lógica de control 116. Las densidades celulares medidas y los comandos de control de temperatura 128 se comunican hacia y desde la lógica de control por medio de la interfaz 120. El medio celular M1 en el segundo depósito puede tener básicamente una composición idéntica al medio en el primer depósito o puede tener una composición diferente. El segundo proyecto de cultivo celular en el segundo depósito se inicia transfiriendo las células y opcionalmente también el medio contenido en el primer depósito después de que se alcanzara la densidad celular objetivo al segundo depósito. Se añade medio sin células adicional al segundo depósito, lo que da como resultado una dilución de las células transferidas en el segundo depósito.
Antes de que las células proliferen en el segundo depósito 132, el usuario 118 reconfigura el plazo objetivo 112 de acuerdo con las peculiaridades de un procedimiento de cultivo celular de producción en el segundo depósito. Por ejemplo, el primer proyecto de cultivo celular puede haber terminado exactamente a la hora prevista, es decir, "lunes 11:00 horas 48 h", es decir, "miércoles 11:00 horas". Transferir las células del primer depósito al segundo depósito, reconfigurar la lógica de control y complementar los medios adicionales puede requerir 30 minutos. Se sabe por la literatura que un proyecto de cultivo celular para hacer proliferar las células en el depósito objetivo a 37 °C comenzando con el número de células proporcionado por el primer depósito requiere 74 horas. Por tanto, el miércoles, a las 11:15 horas, el usuario puede reconfigurar la lógica de control introduciendo un nuevo plazo objetivo "miércoles 11:30 horas 74 h" o "sábado 13:30 horas". Después de haber transferido las células del primer al segundo depósito, el segundo proyecto de cultivo celular se inicia el miércoles a las 11:30 horas, con lo la proliferación celular se controla ajustando la temperatura del medio en el segundo depósito 132 como se describe anteriormente para el primer proyecto de cultivo celular.
La figura 2a representa una pluralidad de "intervalos de tiempo de predicción" h, ..., I4367, también denominados "intervalos de tiempo", que comienzan cuando el medio de cultivo celular se siembra con las células eucariotas. Para cada intervalo de tiempo, por ejemplo, al final de cada intervalo de tiempo, se mide una densidad celular actual en el medio en un biorreactor controlado. Por ejemplo, al final del primer intervalo de tiempo h, se mide la densidad celular CDm1. Al final del segundo intervalo de tiempo I2, se mide la densidad celular CDm2. Al final del tercer intervalo de tiempo I3, se mide la densidad celular CDm3. Y así sucesivamente. Además, para cada intervalo de tiempo o al menos para los intervalos de tiempo que comenzaron después de que transcurriera un intervalo de observación, se calcula una densidad celular prevista CDp extrapolando las mediciones de densidad celular obtenidas durante un intervalo de observación actual.
Por ejemplo, al final del intervalo de tiempo I6, se predice una densidad celular prevista CDp6 en el plazo objetivo 112 extrapolando las densidades celulares CDm1, CDm2, ..., CDm5, CDm6 medidas durante el intervalo de tiempo de observación. Además, la lógica de control compara la densidad celular prevista CDp6 con la densidad celular objetivo 114 y ajusta, al final del intervalo de tiempo I6, la temperatura del biorreactor controlado en caso de que la densidad celular prevista CDp6 difiera significativamente de la densidad celular objetivo 114.
La figura 2b ilustra las etapas de procesamiento de datos realizadas por la lógica de control al final del intervalo de tiempo I7. La densidad celular CDp7 en el plazo objetivo 112 se predice extrapolando las densidades celulares CDm2, CDm3, ..., CDm6, CDm7 medidas durante el intervalo de tiempo de observación. Además, la lógica de control compara la densidad celular prevista CDp7 con la densidad celular objetivo 114 y ajusta, al final del intervalo de tiempo I7, la temperatura del biorreactor controlado en caso de que la densidad celular prevista CDp7 difiera significativamente de la densidad celular objetivo 114.
La figura 2c ilustra las etapas de procesamiento de datos realizadas por la lógica de control al final del intervalo de tiempo I11. La densidad celular CDph en el plazo objetivo 112 se predice extrapolando las densidades celulares CDm6, CDm7, ..., CDm10, CDm h medidas durante el intervalo de tiempo de observación. Además, la lógica de control compara la densidad celular prevista CDph con la densidad celular objetivo 114 y ajusta, al final del intervalo de tiempo I11, la temperatura del biorreactor controlado en caso de que la densidad celular prevista CDph difiera significativamente de la densidad celular objetivo 114.
La figura 2d ilustra las etapas de procesamiento de datos realizadas por la lógica de control al final del intervalo de tiempo I4365. La densidad celular CDp4365 en el plazo objetivo 112 se predice extrapolando las densidades celulares CDm4358, ..., CDm4365 medidas durante el intervalo de tiempo de observación. Además, la lógica de control compara la densidad celular prevista CDp4365 con la densidad celular objetivo 114 y ajusta, al final del intervalo de tiempo I4365, la temperatura del biorreactor controlado en caso de que la densidad celular prevista CDp4365 difiera significativamente de la densidad celular objetivo 114. En comparación con los intervalos de tiempo representados en las figuras 2a-2c, los intervalos de tiempo representados en la figura 2d son significativamente más cortos. Por ejemplo, los intervalos de tiempo representados en 2a-2c pueden tener una duración de varios minutos, por ejemplo, 15 minutos, y los intervalos de tiempo representados en la parte derecha de la figura 2d pueden tener una duración de un solo minuto. Por ejemplo, la lógica de control puede usar automáticamente intervalos de tiempo más cortos al determinar que la hora actual está cerca del plazo objetivo, por ejemplo, 2-3 horas antes del plazo objetivo. Esto puede ser beneficioso, ya que la densidad celular ya es alta en esta fase del proyecto y errores de medición menores pueden tener un impacto importante en el plazo objetivo previsto. Usando intervalos de tiempo más cortos, el número de predicciones y la exactitud de las predicciones se pueden incrementar a medida que se incrementa la solidez del procedimiento frente a mediciones atípicas.
La figura 4 representa un sistema que comprende múltiples depósitos de preproducción 400, 412, 130 y un depósito de producción 132. Los depósitos de preproducción 400, 412, 130 se usan en un procedimiento de cultivo en serie de siembra para proporcionar un número suficiente de células para iniciar un proyecto de cultivo celular de producción en el biorreactor de producción 132. El primer biorreactor de preproducción se siembra con una muestra de línea celular descongelada 400 y se inicia un primer cultivo celular de preproducción en el primer depósito 410. Cuando se alcanza una primera concentración celular objetivo en el primer depósito, el medio y las células del primer depósito se transfieren al segundo depósito de preproducción 412 y se inicia un segundo cultivo celular de preproducción en el segundo depósito 412. Cuando se alcanza una segunda concentración celular objetivo en el segundo depósito, el medio y las células del segundo depósito se transfieren al tercer depósito de preproducción 130 y se inicia un tercer cultivo celular de preproducción en el tercer depósito 130. Cuando se alcanza una tercera concentración celular objetivo en el tercer depósito, el medio y las células del tercer depósito se transfieren al depósito de producción 132 y se inicia un cultivo celular de producción en el depósito de producción 132. Al menos el biorreactor de producción puede comprender una línea o tubería de entrada de gas. Por ejemplo, se puede usar una única línea o tubería de entrada de gas para suministrar aire ambiental o aire comprimido (ya expandido) de proveedores especiales al biorreactor. Dicho aire ambiental o aire comprimido puede consistir en una mezcla de gases, en particular N2, O2 y CO2 que es típica de la atmósfera terrestre o tiene una composición diferente. Además o de forma alternativa, la única línea o tubería de entrada de gas o cualquiera de las otras líneas o tuberías de entrada de gas se pueden usar para suministrar gases individuales tales como N2, O2 y CO2 al biorreactor. Por ejemplo, un biorreactor puede comprender un microrrociador para generar burbujas de gas muy finamente dispersas a partir del gas de entrada para mejorar la aireación de las células en el depósito.
Cada uno de los depósitos 410, 412, 130, 132 comprende un termostato 138, 406, 408, 140 y un medidor de densidad celular en línea 134, 402, 404, 136 y está acoplado operativamente a y tiene la temperatura controlada por la lógica de control 116. La GUI 110 permite que el usuario 118 especifique el plazo objetivo y la densidad celular objetivo para cada uno de los cuatro proyectos de cultivo celular individualmente. Por ejemplo, la GUI puede comprender una primera ventana W410 para establecer el plazo objetivo y la densidad celular objetivo y otros parámetros del procedimiento opcionales como la duración del intervalo, la duración del intervalo de observación, la cantidad de ajuste de temperatura por intervalo de tiempo, etc. para el primer depósito 410. La GUI puede comprender una segunda ventana W412 para establecer los valores de los parámetros anteriores para el segundo depósito 412, una tercera ventana W414 para establecer los valores de los parámetros anteriores para el tercer depósito 130 y una cuarta ventana W132 para establecer los valores de los parámetros anteriores para el depósito de producción 132.
La figura 5 representa seis proyectos de cultivo celular discontinuo diferentes que se realizaron para someter a prueba el impacto de los ajustes de temperatura en la tasa de proliferación de células eucariotas. En cada uno de los proyectos de cultivo celular descritos para las figuras 5 y siguientes, se hizo proliferar una línea celular CHO en un biorreactor B-DCU de 2 litros (Sartorius). El sistema EVO200 (Fogale, ahora Hamilton) se usó para realizar mediciones de densidad celular en línea. El cultivo de las células de todos los lotes se llevó a cabo en matraces agitados de acuerdo con protocolos de cultivo celular de referencia. El biorreactor usado para cada proyecto estaba equipado con un electrodo de pO2 (de tipo Clark) y un electrodo de gel de pH. El volumen de trabajo fue siempre de 1,3 litros y el biorreactor se aireó (aireación del espacio vacío y arandelas de rociado). A través del espacio vacío, se pasó constantemente nitrógeno enriquecido con dióxido de carbono con 50 ccm al biorreactor. Se introdujo oxígeno puro por medio de la arandela de rociado de acuerdo con un regulador de pO2. Los flujos de gas se ajustaron por medio de un controlador de flujo másico (MFC). Todas las mediciones en línea se registraron por medio del MFCS. Se usó el sistema Fogale EVO200 para la determinación del número de células en línea. La permitividad (conductividad dieléctrica) del cultivo se determinó y se convirtió mediante un factor constante en un valor de densidad celular. Estos valores se denominan densidades celulares "en línea". Los valores medidos del sistema EVO200 se leyeron por medio de un programa informático especialmente programado y se introdujeron en una lógica de control configurada para adaptar la temperatura de un biorreactor.
Para verificar si las densidades celulares basadas en la permitividad reflejan correctamente las densidades celulares reales, se compararon ocasionalmente con la concentración celular fuera de línea que se había determinado analizando muestras de medio de cultivo del biorreactor. Para el control fuera de línea de los cultivos, en primer lugar se tomaron muestras al menos una vez al día y se determinó la densidad celular con un analizador de células Cedex. En el ciclo posterior del proyecto, se omitió parcialmente la determinación diaria de la densidad celular fuera de línea. Aunque la permitividad no es constante durante todo el procedimiento de fermentación y depende de varios parámetros, fue posible no obstante trabajar con un solo valor de conversión en el intervalo de concentración celular pertinente.
Dos de los seis lotes fueron lotes de referencia que hicieron proliferar a temperatura constante durante todo el proyecto de cultivo celular. En los cuatro lotes restantes, se investigó la influencia de la temperatura sobre la proliferación celular bajando la temperatura durante intervalos de un día de acuerdo con diferentes esquemas. Cada uno de los cultivos de los dos lotes de referencia y los cuatro lotes de prueba siempre comenzó a una temperatura estándar de 36,5 °C durante aproximadamente un día para ajustar las células a altas tasas de proliferación. Después de esto, se llevó a cabo un cambio de temperatura en los cuatro lotes de prueba 3-6 como se indica en las figuras: el lote 3 se hizo proliferar durante 9,3 días a 36,5 °C y después de esto a 35 °C; el lote 4 se hizo proliferar durante 12 días a 36,5 °C, a continuación un día a 34,5 °C y el siguiente día y todos los días posteriores a 33 °C; el lote 5 se hizo proliferar durante 15 días a 36,5 °C y a continuación a 33 °C; el lote 6 se hizo proliferar durante 18 días a 36,5 °C, a continuación un día a 35 °C, a continuación un día a 34 °C y el siguiente día y todos los días posteriores a 32 °C.
Para cada uno de los lotes, una línea continua y suave 500 indica las densidades celulares medidas al convertir las medidas de permitividad mediante un único factor de corrección determinado empíricamente en una "densidad celular medida". La curva escalonada 502 indica las mediciones fuera de línea que se realizan ocasionalmente para garantizar que la permitividad refleja correctamente la densidad celular real en todo el intervalo de temperatura sometido a prueba. Para realizar las mediciones de control fuera de línea de las densidades celulares, se tomaron muestras y se determinó la densidad celular usando un analizador de células Cedex.
La figura 5 muestra que la tasa de proliferación celular se puede controlar mediante ajustes de temperatura en sistemas de biorreactores existentes y que la medida de permitividad refleja con exactitud la densidad celular en el intervalo de temperatura pertinente. Las proteínas y péptidos generados examinados hasta ahora no mostraron una desviación con respecto a los bioproductos de los cultivos celulares de referencia, aunque la temperatura del medio de cultivo celular se modificó durante el procedimiento de cultivo celular.
Las figuras 6 y 7 muestran con mayor detalle el efecto de la temperatura sobre la señal de densidad celular obtenida para dos de los 6 proyectos de cultivo celular. En ambas figuras, una disminución gradual de la temperatura 504 dio como resultado una disminución de la tasa de proliferación, con lo que la permitividad medida multiplicada por un único factor de conversión constante fue una medida fiable de la densidad celular 502 (es decir, el número de células en un volumen de medio dado) confirmada por mediciones ocasionales de densidad celular basadas en muestras fuera de línea 500.
Para evaluar la influencia de los cambios de pH en la tasa de proliferación, se realizaron proyectos ("lotes") de cultivo celular adicionales (no se muestran). Los lotes adicionales revelaron que no se pudieron observar influencias a corto plazo de un pH modificado en un amplio intervalo de pH de 6,75 a 7,1. El efecto de los cambios de pH aparecía solo con tiempos de latencia largos, si es que aparecía. Comenzando a un pH de 6,75 y cambiando a pH 6,8, se observó un efecto después de aproximadamente 1,5 días, a pH 6,7 después de aproximadamente un día y a pH 6,6 después de medio día (véase el lote 4). Si el pH disminuía por debajo de 6,75, era necesario regenerar el cultivo después de un nuevo incremento de pH a valores estándar (6,9-7,1) durante un tiempo considerable. Por tanto, se observó que, contrariamente al control de la proliferación basado en la temperatura, un control de la proliferación basado en el pH afronta los problemas de que, en el intervalo de pH fisiológico, los cambios de pH parecen no tener un efecto significativo e inmediato sobre la proliferación celular y, si se usa un pH fuera del intervalo fisiológico, las células necesitan tiempo adicional para recuperarse de los valores extremos de pH, ralentizando y reduciendo de este modo la flexibilidad de un proyecto de cultivo celular. Se observó que las tasas de proliferación del cultivo celular dependen más fuertemente de los cambios de temperatura en el intervalo de temperatura fisiológica de aproximadamente 32-38 °C que de los cambios de pH en el intervalo de pH fisiológico de aproximadamente 6,8-7,2. Además, las células se recuperan de los valores de pH no fisiológicos significativamente peor que de temperaturas inusualmente bajas. Por tanto, se observó que los ajustes de pH no eran adecuados para controlar de forma flexible las tasas de proliferación del cultivo celular.
Por tanto, de acuerdo con modos de realización, se usó la temperatura para proporcionar un control automatizado de los proyectos de cultivo celular, ya que, incluso los cambios pequeños de temperatura, tenían un efecto significativo e inmediatamente reversible sobre el comportamiento de proliferación.
De acuerdo con modos de realización, se configura una lógica de control para calcular la tasa de proliferación actual a partir de los valores de permitividad determinados por dispositivos de medición en línea (basados en la conductividad dieléctrica) (por ejemplo, el EVO200) o por medio de los valores de biomasa (valores de densidad celular) calculados a partir de los valores de permitividad al multiplicar el factor de permitividad por un factor de conversión.
El factor de conversión se determina en uno o más proyectos de cultivo celular de referencia realizando algunas mediciones de densidad celular fuera de línea en paralelo a las mediciones de permitividad e identificando un factor de conversión que, si se multiplica por el valor de permitividad, proporciona la densidad celular fuera de línea.
De acuerdo con modos de realización, los intervalos de tiempo para realizar mediciones de permitividad fuera de línea y para predecir la densidad celular en el plazo objetivo son 60 segundos. Los valores de permitividad obtenidos para un intervalo se transforman logarítmicamente por la lógica de control (base e) y se almacenan temporal o permanentemente en un medio de almacenamiento. Opcionalmente, las densidades celulares fuera de línea se miden de vez en cuando y se almacenan asociadas con una densidad celular en línea respectiva. Los valores de densidad celular transformados logarítmicamente se someten a una regresión lineal sobre un intervalo de observación predeterminado (por ejemplo, 90 minutos). Se realiza un nuevo cálculo después de cada nuevo valor de medición (por ejemplo, después de cada 60 segundos) de permitividad (y, por tanto, densidad celular en línea). La pendiente de la línea de regresión se usa a continuación para determinar la tasa de proliferación p de las células durante el intervalo de observación actual. Este valor p fluctúa de forma natural para unos pocos valores medidos, pero se consolida dentro del intervalo de observación especificado. Cuanto más largo sea el intervalo de observación, más estable será la tasa de proliferación calculada y más exacta será la densidad celular prevista en el plazo objetivo.
Usando la tasa de proliferación calculada, se calcula una predicción de la densidad celular previsible en el plazo objetivo y la densidad celular prevista se compara con la densidad celular objetivo establecida por un usuario. El plazo objetivo y la densidad celular objetivo se definen al comienzo del procedimiento discontinuo, que también puede ser el momento de iniciar la lógica de control. Si el pronóstico da una densidad celular por encima de la densidad celular objetivo, la temperatura se reduce en un valor pequeño (por ejemplo, 0,4 °C); si la densidad celular prevista está por debajo de la densidad celular objetivo, la temperatura se aumenta ligeramente (por ejemplo, 0,2 °C). Después del cambio de temperatura, se inicia automáticamente un nuevo intervalo de observación y el ciclo comienza de nuevo. Esto continúa hasta que se alcanza el plazo objetivo o se cumple otro criterio de finalización.
Por ejemplo, se puede usar un baño de agua controlable externamente (con contraenfriamiento) para ajustar la temperatura de un biorreactor. Sin embargo, se puede usar cualquier sistema de control que permita la transferencia de valores externos (puntos de ajuste, parámetros de control) a un elemento que puede incrementar y disminuir la temperatura de un medio en un depósito.
La figura 8 muestra las densidades celulares en línea (por ejemplo, basadas en permitividad o basadas en microscopio en línea) 802, 812, 822, los valores de densidad celular fuera de línea medidos ocasionalmente (símbolos) 800, 810, 820 y la señal de temperatura (líneas discontinuas) 804, 814, 824 de otros proyectos de cultivo de prueba (lote 6, 7 y 8) realizados como se describe para los lotes de prueba representados en las figuras 5, 6 y 7. Los valores de densidad celular en línea y fuera de línea se representan en escala logarítmica, la temperatura en escala lineal. Las flechas verticales indican el plazo objetivo en que se debe alcanzar la densidad celular objetivo, por ejemplo, 4.000.000 de células por ml (línea horizontal). La figura 8 muestra que la densidad en el plazo objetivo respectivo se alcanzó en el plazo objetivo deseado con buena exactitud.
Los lotes 6, 7 y 8 tienen básicamente las mismas condiciones de partida, la misma densidad celular objetivo, pero diferentes plazos objetivo. El objetivo respectivo se alcanzó casi exactamente. Los perfiles de temperatura de los lotes, en particular del lote 8, muestran que la lógica de control puede tener en cuenta las tasas de proliferación actuales de las células y, por tanto, si procede, también las diferentes fases de proliferación (fase de proliferación, fase estacionaria o fase transitoria después de la siembra).
La figura 9 muestra las densidades celulares en línea 902, 912, 922, los valores de densidad celular fuera de línea medidos ocasionalmente (símbolos) 900, 910, 920 y la señal de temperatura (líneas discontinuas) 904, 914, 924 de otros proyectos de cultivo de prueba (lotes 9 y 10) realizados como se describe para los lotes de prueba representados en las figuras 5, 6 y 7. La curva se genera como se describe para la figura 8 y comprende, como referencia, también los valores para el lote 8 (con números de referencia diferentes: 900, 902 y 904 en lugar de 820, 822 y 824). El lote 9, como un proyecto de cultivo celular que está diseñado para reproducir el plazo objetivo y la densidad celular objetivo del lote 8 (3 días de duración), aunque las temperaturas de la curva revelan que en el momento de la siembra, los medios de los lotes 8 y 9 tenían diferentes temperaturas. No obstante, la lógica del programa puede proporcionar la densidad celular objetivo en el plazo objetivo tanto para el lote 8 como para el lote 9 con mucha exactitud.
El lote 10 se inició con la misma densidad celular objetivo y temperatura de partida que el lote 9, pero con un plazo objetivo diferente (4 días). Con el resultado del lote 10, se pudo demostrar que se podía conseguir la misma densidad celular objetivo con un desplazamiento de un día completo, con la misma densidad celular que en el lote 9. Por tanto, modos de realización de la invención permiten definir claramente el punto final de la fermentación en una ventana de al menos un día, por ejemplo, para realizar la siembra del fermentador posterior en un momento apropiado y planificar todas las preparaciones.
Las pruebas anteriores se realizaron con la línea celular T074OPT B048WCB. Se realizaron otras pruebas basadas en cultivos celulares de la línea celular CHO T072. En los otros proyectos de cultivo celular de prueba, la duración del intervalo de ajuste (60-120 min), las densidades celulares de partida, los plazos objetivo (aproximadamente 3-4 días o 67-95 horas) y la cota del cambio de temperatura (0,2-0,5 °C) se variaron ligeramente. En todas las líneas celulares, la densidad celular objetivo podía alcanzarse en el plazo objetivo. Se observó que todas las curvas de temperatura diferían entre sí. Por tanto, el sistema de control de la proliferación controlaba cada cultivo celular de forma individual y con éxito. En el caso de ajustes importantes de temperatura, por ejemplo, de 0,5-1,0 °C, se incrementó la duración del intervalo de ajuste (preferentemente hasta al menos 90 minutos) de modo que las células tuvieran más tiempo para adaptarse a la nueva temperatura.
Las figuras 10-15 muestran que el control de la proliferación por medio del ajuste de temperatura realizado de acuerdo con modos de realización de la invención permite proporcionar una densidad celular deseada en un plazo objetivo aunque los proyectos de cultivo celular puedan afrontar uno o más problemas técnicos y fallos durante el proyecto.
Las alteraciones técnicas pueden poner en grave peligro el éxito de un proyecto de cultivo celular. Típicamente, las acciones correctivas se realizan manualmente lo antes posible. Típicamente, un error de funcionamiento se puede solucionar en 4 horas. Sin embargo, el retraso en la proliferación celular provocado por el fallo técnico a menudo daba como resultado una duración prolongada del proyecto de cultivo celular completo.
En un conjunto de pruebas, se evaluó la capacidad de la lógica de control de compensar los retrasos en la proliferación celular provocados por fallos técnicos típicos simulando un fallo de uno o más controles reguladores de los biorreactores. Los escenarios de fallo sometidos a prueba comprendieron un fallo del suministro de oxígeno, fallo del electrodo de oxígeno, fallo del control de temperatura, fallo del control de pH (suministro de CO2) y otros. En cada una de las pruebas, una o más funciones de control (por ejemplo, regulación de la presión parcial de O2, regulación de la presión parcial de CO2, etc.) se detuvieron durante 4 horas o un parámetro de funcionamiento (por ejemplo, pH) se estableció en un valor no deseado durante aprox. 4 horas. A continuación, se reactivaron las funciones de control o se reajustaron los parámetros de funcionamiento a un valor deseable o típico. Los ajustes de la lógica de control, en particular el plazo objetivo y la densidad celular objetivo, no se cambiaron durante dichas pruebas.
Los resultados de algunas de las pruebas se presentan en forma de curvas en las figuras 10-15. Los cultivos celulares usados para dichas pruebas que se representan en las figuras 10-15 se hicieron proliferar como se describe para los cultivos celulares mencionados en la descripción de figura de la figura 5. La numeración de los cultivos celulares ("lotes") usados para dichas pruebas comienza aquí desde el principio, de modo que los cultivos celulares 4-9 de las figuras 10-15 no son idénticos a los cultivos celulares cuyos datos forman la base de las figuras 5-9.
Las figuras 10 y 11 representan, respectivamente, dos curvas que ilustran la capacidad de la lógica de control de compensar un fallo del suministro de oxígeno. La prueba de la capacidad de la lógica de control de compensar fallos del suministro de oxígeno se realizó desactivando el regulador de oxígeno durante el intervalo de tiempo de 48 h-52 h (fig. 10) o durante el intervalo de tiempo de 55 h-59 h (fig. 11). Las figuras 10 y 11 muestran claramente que las células ya no proliferan (señal de oxígeno) sin oxígeno (curvas superiores, pendiente disminuida de la curva de densidad celular). La lógica de control determina una tasa de proliferación disminuida, predice que la densidad celular en el plazo objetivo estará por debajo de la densidad celular objetivo dada la baja tasa de proliferación y eleva la temperatura con un retraso de 1-2 h (curvas inferiores en las figuras 10 y 11). A pesar del fallo temporal del suministro de oxígeno, fue posible lograr la densidad celular deseada en el plazo objetivo establecido.
Las figuras 12 y 13 representan, respectivamente, dos curvas que ilustran la capacidad de la lógica de control de compensar un fallo del control del pH y un valor de pH no deseado resultante. La prueba de la capacidad de la lógica de control de compensar fallos del control del pH se realizó cambiando bruscamente el punto de ajuste del control de pH a un valor no deseado durante el intervalo de tiempo de 48 h-52 h (fig. 12) o durante el intervalo de tiempo de 72 h-76 h (fig. 13). Las figuras 12 y 13 muestran que el cambio de pH no tiene un gran efecto sobre la proliferación de las células y, como consecuencia, la lógica de control no tiene ningún problema para compensar los efectos en la proliferación inducidos por el pH y proporcionar la densidad celular objetivo en el plazo objetivo.
La figura 14 representa tres curvas que ilustran la capacidad de la lógica de control de compensar un fallo tanto del suministro de oxígeno como del control del pH. Una vez más, la lógica de control pudo proporcionar la densidad celular objetivo en el plazo objetivo.
La figura 15 representa dos curvas que ilustran la capacidad de la lógica de control de compensar un fallo tanto del suministro de oxígeno como del control de la temperatura. A las 26 horas después de la siembra, se simuló el fallo del suministro de oxígeno durante aproximadamente 4 horas. El sistema reaccionó muy fuertemente como se esperaba para compensar la proliferación celular reducida. La lógica de control reaccionó al suministro reducido de oxígeno incrementando la temperatura durante el tiempo de fallo. Aproximadamente 12 horas después, se simuló un fallo del control de temperatura apagando el regulador de temperatura. En un plazo de aproximadamente 4 horas, la temperatura del reactor bajó hasta un valor de entre 30 y 31 °C. Durante este tiempo, la lógica de control siguió prediciendo futuras densidades celulares y comparando las densidades calculadas con la densidad celular objetivo, pero no pudo pasar y hacer cumplir los respectivos nuevos puntos de ajuste de temperatura con éxito. Después de que el controlador de temperatura se volviera a encender, el controlador de temperatura recibió los nuevos puntos de ajuste de temperatura de la lógica de control. Esto dio como resultado un ligero desbordamiento de la temperatura real, que a continuación se compensó rápidamente. Durante el tiempo de ejecución restante del lote, el cultivo celular se hizo proliferar de manera controlada. Una vez más, la lógica de control pudo proporcionar la densidad celular objetivo en el plazo objetivo.
Por tanto, se demostró con éxito que la regulación de la proliferación basada en la temperatura de acuerdo con modos de realización de la invención es consistente y puede compensar diversos problemas y fallos técnicos. Un fallo intermitente del control del oxígeno o del pH se tolera sin problemas y se compensan sus efectos sobre la proliferación. Incluso un fallo del control de temperatura todavía se puede asimilar.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para controlar la proliferación de células eucariotas, comprendiendo el procedimiento:
- recibir, mediante una lógica de control (116), una densidad celular objetivo (114) y un plazo objetivo (112), representando la densidad celular objetivo una densidad celular deseada de las células eucariotas en el plazo objetivo, representando el plazo objetivo un punto futuro en el tiempo;
- cultivar las células eucariotas en un medio de cultivo (M1) de un primer depósito (130);
para cada uno de una pluralidad de intervalos de tiempo:
• medir la densidad celular (122) de las células eucariotas en el medio de cultivo;
• calcular, mediante la lógica de control, una densidad celular prevista en el plazo objetivo como una función de al menos la densidad celular medida;
• comparar, mediante la lógica de control, la densidad celular prevista y la densidad celular objetivo;
• ajustar, mediante la lógica de control, la temperatura del medio de cultivo en el primer depósito si la densidad celular prevista se desvía de la densidad celular objetivo
- incrementando la temperatura en 0,1 °C a 1 °C si la densidad celular prevista es menor que la densidad celular objetivo; o
- disminuyendo la temperatura en 0,1 °C a 1 °C si la densidad celular prevista es mayor que la densidad celular objetivo.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, comprendiendo el primer depósito un medidor (134) para realizar mediciones en línea de la densidad celular en el medio de cultivo, siendo las densidades celulares de las células eucariotas medidas en cada uno de la pluralidad de intervalos de tiempo mediciones en línea.
3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones previas, que comprende además:
- finalizar automáticamente, mediante la lógica de control, al menos el ajuste de la temperatura cuando se cumple un criterio de finalización, siendo el criterio de finalización uno de:
• se ha alcanzado el plazo objetivo;
• la densidad celular medida es igual a o mayor que la densidad celular objetivo.
4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones previas, que comprende además:
- proporcionar, mediante la lógica de control, una interfaz gráfica de usuario GUI (110), permitiendo la GUI que un usuario (118) introduzca el plazo objetivo y la densidad celular objetivo antes de que la lógica de control comience a calcular las densidades celulares previstas, permitiendo la GUI que el usuario modifique el plazo objetivo y/o la densidad celular objetivo mientras la lógica de control calcula las densidades celulares previstas en la pluralidad de intervalos de tiempo.
5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones previas, que comprende además:
- después de que se alcance la densidad celular objetivo, transferir el medio de cultivo del primer depósito y las células eucariotas contenidas en el mismo desde el primer depósito a un segundo depósito (132), siendo el segundo depósito más grande que el primer depósito;
- recibir, mediante la lógica de control, otra densidad celular objetivo y otro plazo objetivo, representando la otra densidad celular objetivo una densidad celular deseada de las células eucariotas en el otro plazo objetivo, representando el otro plazo objetivo un punto futuro en el tiempo;
- cultivar las células eucariotas transferidas en el segundo depósito; para cada uno de una pluralidad de otros intervalos de tiempo:
• medir la densidad celular (124) de las células eucariotas en un medio de cultivo del segundo depósito;
• calcular, mediante la lógica de control, otra densidad celular prevista en el otro plazo objetivo como una función de al menos dicha densidad celular medida;
• comparar, mediante la lógica de control, la otra densidad celular prevista y la otra densidad celular objetivo;
• ajustar, mediante la lógica de control, la temperatura del medio de cultivo en el segundo depósito si la otra densidad celular prevista se desvía de la otra densidad celular objetivo
- incrementando la temperatura en 0,1 °C a 1 °C si la otra densidad celular prevista es menor que la otra densidad celular objetivo; o
- disminuyendo la temperatura en 0,1 °C a 1 °C si la otra densidad celular prevista es mayor que la otra densidad celular objetivo.
6. El procedimiento de la reivindicación 5, siendo el primer depósito un biorreactor configurado para hacer proliferar el cultivo celular como cultivo discontinuo, siendo el segundo depósito más grande que el primer depósito y estando un biorreactor configurado para hacer proliferar el cultivo celular como cultivo discontinuo, usándose el procedimiento en un procedimiento de cultivo en serie de siembra para generar un número mínimo definido de células para la siembra de un biorreactor de producción.
7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones previas, siendo las células eucariotas células de mamífero, en particular células de ovario de hámster chino (CHO).
8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones previas, comprendiendo además el procedimiento: para cada uno de la pluralidad de intervalos de tiempo:
- definir un intervalo de observación actual (138) para el intervalo de tiempo actual, teniendo el intervalo de observación actual una duración predefinida y terminando al final del intervalo de tiempo actual;
- recibir todas las densidades celulares que se han medido durante el intervalo de observación actual; comprendiendo el cálculo de la densidad celular prevista como una función de al menos la densidad celular medida extrapolar las densidades celulares medidas durante el intervalo de observación actual hasta el plazo objetivo.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, comprendiendo la extrapolación realizar una operación de ajuste de curva o un análisis de regresión sobre las densidades celulares medidas durante el tiempo de observación actual.
10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones previas, siendo la pluralidad de intervalos de tiempo de la misma duración.
11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones previas 1-9, comprendiendo además el procedimiento: - determinar si la hora actual está cerca del plazo objetivo;
- en respuesta a la determinación de que la hora actual está cerca del plazo objetivo, reducir la duración de todos los futuros intervalos de tiempo de la pluralidad de intervalos de tiempo.
12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones previas 8-11, estando la duración predefinida del intervalo de observación en un intervalo de 60 minutos a 480 minutos.
13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones previas, comprendiendo el ajuste de la temperatura incrementar la temperatura en 0,1 °C a 0,5 °C, preferentemente en 0,1 °C a 0,2 °C o disminuir la temperatura en 0,1 °C a 0,5 °C, preferentemente en 0,1 °C a 0,2 °C.
14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones previas, realizando la lógica de control el ajuste de temperatura del primer depósito solo en caso de que haya transcurrido al menos un intervalo de tiempo de ajuste desde el ajuste previo de temperatura de la lógica de control de dicho primer depósito, estando la duración del intervalo de tiempo de ajuste en un intervalo de 60-120 minutos.
15. Un procedimiento para proporcionar células eucariotas a una densidad celular deseada en un plazo futuro definido, comprendiendo el procedimiento:
- introducir, por parte de un usuario humano (118), la densidad celular deseada (114) y el plazo futuro (112) por medio de una interfaz (110) de una lógica de control (116), representando la densidad celular deseada una densidad celular deseada de las células eucariotas en el plazo futuro introducido;
- realizar el procedimiento para controlar la proliferación de células eucariotas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones previas 1-14, realizándose el control de la proliferación de modo que la densidad celular deseada introducida se usa como densidad celular objetivo, el plazo futuro introducido se usa como plazo objetivo y que las células eucariotas se proporcionan a la densidad celular objetivo en el plazo objetivo.
16. Un sistema (100) para controlar la proliferación de células eucariotas, comprendiendo el sistema una lógica de control (116) y un procesador (104) configurados para ejecutar la lógica de control, estando la lógica de control acoplada operativamente a un primer depósito (130) que comprende células eucariotas en un medio de cultivo (M1), estando configurada la lógica de control para:
- recibir una densidad celular objetivo (114) y un plazo objetivo (112), representando la densidad celular objetivo una densidad celular deseada de las células eucariotas en el plazo objetivo, representando el plazo objetivo un punto futuro en el tiempo; para cada uno de una pluralidad de intervalos de tiempo:
• recibir una densidad celular medida (122) de las células eucariotas en el medio de cultivo del primer depósito; • calcular una densidad celular prevista en el plazo objetivo como una función de al menos la densidad celular medida;
• comparar la densidad celular prevista y la densidad celular objetivo;
• ajustar, mediante la lógica de control, la temperatura del medio de cultivo en el primer depósito si la densidad celular prevista se desvía de la densidad celular objetivo
- incrementando la temperatura en 0,1 °C a 1 °C si la densidad celular prevista es menor que la densidad celular objetivo; o
- disminuyendo la temperatura en 0,1 °C a 1 °C si la densidad celular prevista es mayor que la densidad celular objetivo.
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