BR112018003852B1 - Métodos, método para calibrar ou recalibrar um primeiro dispositivo, método de operação de um tanque, método para determinar os efeitos de deslocamento de ph, unidades de comparação e sistema - Google Patents
Métodos, método para calibrar ou recalibrar um primeiro dispositivo, método de operação de um tanque, método para determinar os efeitos de deslocamento de ph, unidades de comparação e sistema Download PDFInfo
- Publication number
- BR112018003852B1 BR112018003852B1 BR112018003852-0A BR112018003852A BR112018003852B1 BR 112018003852 B1 BR112018003852 B1 BR 112018003852B1 BR 112018003852 A BR112018003852 A BR 112018003852A BR 112018003852 B1 BR112018003852 B1 BR 112018003852B1
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- medium
- value
- tank
- concentration
- measuring device
- Prior art date
Links
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims description 67
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 title claims description 45
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims abstract description 189
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 136
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 94
- 238000001139 pH measurement Methods 0.000 claims abstract description 53
- 230000036740 Metabolism Effects 0.000 claims abstract description 34
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims abstract description 34
- 230000035786 metabolism Effects 0.000 claims abstract description 34
- 239000002609 media Substances 0.000 claims description 440
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 342
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 81
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 47
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 16
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N oxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 14
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 239000001963 growth media Substances 0.000 claims description 12
- 238000011049 filling Methods 0.000 claims description 11
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 11
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 9
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 4
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 55
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 26
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 25
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 24
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N Carbonic acid Chemical compound OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 19
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 13
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 239000003570 air Substances 0.000 description 10
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 9
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000006143 cell culture media Substances 0.000 description 7
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 239000012080 ambient air Substances 0.000 description 5
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 5
- 230000036947 Dissociation constant Effects 0.000 description 4
- 210000003135 Vibrissae Anatomy 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating Effects 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 244000052616 bacterial pathogens Species 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate dianion Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 239000012088 reference solution Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N DEOXYTHYMIDINE Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N Flutamide Chemical compound CC(C)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C(C(F)(F)F)=C1 MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N Putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M Sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710023470 TPKB Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 2
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory Effects 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 2
- 230000001264 neutralization Effects 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001745 non-dispersive infrared spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 235000019738 Limestone Nutrition 0.000 description 1
- 230000036091 Metabolic activity Effects 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 210000001672 Ovary Anatomy 0.000 description 1
- KJFMBFZCATUALV-UHFFFAOYSA-N Phenolphthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2C(=O)O1 KJFMBFZCATUALV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000195888 Physcomitrella Species 0.000 description 1
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 1
- 229940054269 Sodium Pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 Thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000009529 body temperature measurement Methods 0.000 description 1
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012482 calibration solution Substances 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000002596 correlated Effects 0.000 description 1
- 238000007872 degassing Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 1
- 230000001809 detectable Effects 0.000 description 1
- 239000006160 differential media Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 239000007792 gaseous phase Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001867 inorganic solvent Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004301 light adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000006028 limestone Substances 0.000 description 1
- 230000028744 lysogeny Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cells Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010943 off-gassing Methods 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral Effects 0.000 description 1
- 239000007793 ph indicator Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920005629 polypropylene homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000596 recommended exposure limit Toxicity 0.000 description 1
- 238000004805 robotic Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000001052 transient Effects 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Abstract
MÉTODOS, UNIDADES DE COMPARAÇÃO E SISTEMA. A invenção se refere a uma unidade de comparação (130) configurada para determinar se um primeiro dispositivo de medição de pH de um primeiro tanque (104; 106) é afetado por um problema de medição de pH, sendo a unidade de comparação configurada para: - receber uma primeira concentração de CO2 e um primeiro valor de pH, sendo a primeira concentração de CO2 uma concentração de CO2 de um primeiro volume de gás acima de um meio em um primeiro tanque, a primeira concentração de CO2 e o primeiro valor de pH sendo medidos em um primeiro tempo em que o meio no primeiro tanque está em estado de equilíbrio de pH-CO2 com o primeiro volume de gás e antes de dito estado de equilíbrio ser modificado pelo metabolismo de uma cultura celular no primeiro tanque, sendo o primeiro valor de pH um valor medido fornecido por um primeiro dispositivo de medição de pH acoplado operativamente ao primeiro tanque (102); - receber uma segunda concentração de CO2 e um segundo valor de pH, sendo a segunda concentração de CO2 uma concentração de CO2 de um segundo volume de gás acima de um meio em um segundo tanque, a segunda concentração (...).
Description
[001] A presente invenção se refere ao campo de utilização e calibração de dispositivos de medição de pH, e mais particularmente à identificação de erros de calibração e/ou efeitos de deslocamento de pH resultantes de um processo de amostragem.
[002] O uso de dispositivos de medição de pH precisamente calibrados é útil ou crítico em muitas situações, incluindo trabalhos de laboratório químico ou biológico, para o funcionamento de biorreatores, para o monitoramento de reatores de colheita, etc.
[003] Os biorreatores são comumente usados para a realização de processos químicos, em particular processos realizados por organismos vivos, de maneira controlada, por exemplo, de modo a obter um composto químico, por exemplo, um peptídeo particular, proteína ou outro tipo de substância química. Um objetivo comum é operar o biorreator de maneira a que os microrganismos ou células possam desempenhar sua função desejada com produção limitada de impurezas e/ou de maneira eficiente em termos de tempo e custo. As condições ambiente dentro do biorreator, tais como temperatura, concentrações de nutrientes, pH e gases dissolvidos, entre outros parâmetros, são tipicamente escolhidas de tal forma que o crescimento e a produtividade dos organismos são otimizados.
[004] Para determinar se o estado de um biorreator e/ou o estado de uma cultura celular em um biorreator está em um estado desejado, por exemplo, um estado correspondente a um estado de um biorreator de referência em um dado momento no tempo ao realizar um projeto de cultura celular, o valor do pH é medido repetidamente. Caso o valor de pH esteja fora de uma faixa de valor de pH desejada, vários parâmetros dos biorreatores (tais como taxa de alimentação, taxa de aeração, temperatura, taxa de agitação ou similares) podem ser adaptados para alterar o estado do biorreator de uma maneira que o valor de pH medido no meio se encontra dentro do intervalo desejado de valor de pH.
[005] Vários parâmetros de controle de um biorreator podem ser ajustados em função de um valor de pH atualmente medido no meio de um biorreator. A configuração correta de ditos parâmetros determina se uma cultura celular específica será cultivada sob condições muito semelhantes/aproximadamente idênticas como uma cultura de referência em outro biorreator. Portanto, para sincronizar o estado de um biorreator com o estado de outro biorreator (de referência), é de importância crucial que os dispositivos de medição de pH dos dois biorreatores comparados produzam o mesmo valor de pH para meios possuindo o mesmo valor de pH.
[006] Existem muitos outros cenários de casos de uso onde a determinação do valor correto de pH é de importância crucial. Por exemplo, no final de um projeto de cultura celular, a cultura celular e/ou seus produtos podem ser armazenados em um tanque de coleta antes de serem processados mais adiante para extrair os produtos de cultura celular desejados. Os tanques de colheita precisam ser monitorados de perto para prevenir ou, pelo menos, identificar imediatamente qualquer infecção ou outra modificação das condições dentro do tanque de coleta que possa resultar em uma degradação de seu conteúdo. Portanto, o valor de pH em tanques de colheita é medido repetidamente tomando amostras e medindo o valor de pH das amostras.
[007] Muitas vezes, os dispositivos de medição de pH externos ao tanque são usados para medir o valor de pH de uma amostra do meio contida em um tanque, por exemplo, um biorreator ou tanque de coleta.
[008] Por exemplo, Heather Evans et al.: “Dealing with Disparity in On-line and Off-line pH measurements Genentech found pH drift in its on-line measurements for a cell culture process, and continues to investigate its cause” 1 de Janeiro de 2006, XP 055271377, é direcionado à detecção de problemas em medições de pH em biorreatores com medidores de pH fora de linha (offline). Para operar esses medidores de pH fora de linha (offline), as amostras do tanque de cultura são tomadas e transportadas para um ponto de medição.
[009] No entanto, o processo de retirada de amostras de meio tem o risco de uma infecção do tanque. Além disso, o valor de pH medido em uma amostra pode se desviar do valor real do pH do meio dentro do tanque devido aos chamados “efeitos de deslocamento”. Os efeitos de deslocamento podem ser causados, por exemplo, durante o processo de retirar a amostra e transportá- la para o dispositivo de medição de pH, uma vez que a temperatura da amostra, a pressão do ambiente ou a composição do ar ambiente pode diferir dos respectivos parâmetros dentro do tanque. Isso pode resultar em um valor de pH medido na amostra que difere - devido aos efeitos de deslocamento - significativamente do valor real do pH do meio no tanque. Como consequência, o valor de pH medido na amostra não reflete com precisão o estado atual no tanque.
[010] Os dispositivos de medição de pH incorretamente calibrados são uma outra fonte potencial de erro: tipicamente, os dispositivos de medição de pH são calibrados com soluções de referência comercialmente disponíveis com um valor de pH definido. Esta abordagem normalmente requer a retirada e reintrodução do dispositivo de medição de pH do tanque. Após a reintrodução do dispositivo de medição de pH, o tanque e o dispositivo de medição de pH nele contido devem ser autoclavados. Este processo pode ter um efeito no dispositivo de medição de pH já calibrado, resultando em um dispositivo de medição de pH no tanque que pode indicar um valor de pH diferente para a solução de referência do que antes da autoclavagem. Mesmo no caso de o dispositivo de medição de pH não ter sido afetado pelo processo de autoclavagem, não há garantia de que o dispositivo de medição de pH não tenha sido afetado pela autoclavagem. Como resultado, os valores de pH medidos podem não ser considerados fidedignos e uma nova calibração do medidor de pH interno ao tanque pode ser realizada para calibrar o medidor de pH interno ao tanque usando um medidor de pH de referência externo ao tanque que mede o pH em uma amostra do meio do tanque. No entanto, devido a efeitos de deslocamento durante o processo de amostragem, isso também não garante que o medidor de pH interno ao tanque esteja calibrado corretamente.
[011] Tomar amostras regularmente para realizar medições de pH fora de linha (offline) é oneroso e aumenta o risco de infectar o biorreator com germes indesejados.
[012] É um objetivo de a presente invenção proporcionar um sistema e método melhorados para determinar se um dispositivo de medição de pH é afetado por um problema de medição de pH e para recalibrar um medidor de pH conforme especificado nas reivindicações independentes. As formas de realização da invenção são dadas nas reivindicações dependentes. As formas de realização da presente invenção podem ser combinadas livremente entre si, se não forem mutuamente exclusivas. As formas de realização da invenção podem tirar proveito da facilidade com que uma concentração de CO2 no volume de ar em um tanque pode ser medida para melhorar e facilitar a identificação de problemas de medição de pH e problemas de calibração. De acordo com um aspecto útil, as concentrações de CO2 medidas em dois ou mais tanques diferentes podem ser usadas para identificar desvios de medição de pH dos dispositivos de medição de pH que estão acoplados operativamente aos diferentes tanques.
[013] Em um aspecto, a invenção se refere a um método para determinar se um primeiro dispositivo de medição de pH acoplado operativamente a um primeiro tanque é afetado por um problema de medição de pH. O problema de medição de pH é que o primeiro dispositivo de medição de pH está calibrado de forma diferente a de um segundo dispositivo de medição de pH acoplado operativamente a um segundo tanque. Por exemplo, esta situação pode ser problemática se o segundo tanque for um biorreator de referência e o primeiro tanque for outro biorreator cujo estado deve ser comparado e sincronizado com o estado do biorreator de referência. O método compreende: - receber, através de uma unidade de comparação, uma primeira concentração de CO2 e um primeiro valor de pH, sendo a primeira concentração de CO2 uma concentração de CO2 de um primeiro volume de gás acima de um meio (M1) no primeiro tanque, a primeira concentração de CO2 e o primeiro valor de pH sendo medidos em um primeiro tempo, sendo o primeiro tempo um tempo em que o meio no primeiro tanque está em estado de equilíbrio de pH-CO2 com o primeiro volume de gás a uma temperatura e pressão predefinidas, sendo dito estado de equilíbrio não afetado pelo metabolismo de qualquer cultura celular, sendo o primeiro valor de pH um valor medido fornecido pelo primeiro dispositivo de medição de pH (108; 146); - receber, através da unidade de comparação, uma segunda concentração de CO2 e um segundo valor de pH, sendo a segunda concentração de CO2 uma concentração de CO2 de um segundo volume de gás acima do mesmo tipo de meio (M1) contido no segundo tanque, a segunda concentração de CO2 e o segundo valor de pH sendo medidos em um segundo tempo, sendo o segundo tempo um tempo em que o meio no segundo tanque está em estado de equilíbrio de pH-CO2 com o segundo volume de gás à temperatura e pressão predefinidas, sendo dito estado de equilíbrio não afetado pelo metabolismo de qualquer cultura celular, o segundo valor de pH sendo um valor medido fornecido pelo segundo dispositivo de medição de pH; - comparar, através da unidade de comparação, o primeiro e segundo valor de pH e comparar a primeira e a segunda concentração de CO2 para determinar se o primeiro dispositivo de medição de pH é afetado pelo problema de medição de pH.
[014] De acordo com as formas de realização, a determinação de que o primeiro dispositivo de medição de pH tem um problema de medição de pH é feita no caso em que: - a primeira e segunda concentração de CO2 são idênticas e o primeiro e segundo valor de pH diferem um do outro por mais do que um valor limite; ou - o primeiro e o segundo valor de pH são idênticos e a primeira e a segunda concentração de CO2 diferem uma da outra por mais do que um valor limite adicional; ou - um primeiro valor de dados difere de um segundo valor de dados por mais do que um limite adicional, sendo o primeiro valor de dados derivado a partir do primeiro valor de pH e da primeira concentração de CO2, sendo o segundo valor de dados derivado a partir do segundo valor de pH e da segunda concentração de CO2.
[015] O primeiro tanque pode ser, por exemplo, um biorreator ou um tanque de coleta. O segundo tanque pode ser, por exemplo, um biorreator, em particular um biorreator de referência, ou um tanque de coleta, em particular um tanque de coleta de referência.
[016] As formas de realização da invenção podem ser vantajosas, uma vez que permitem comparar mais precisamente os valores de pH dos meios em dois ou mais tanques, por exemplo, um tanque de referência e um ou mais tanques monitorados ou controlados. O perfil de pH de referência do tanque de referência pode ser obtido vários dias, semanas ou anos antes da obtenção dos valores de medição no(s) tanque(s) a ser(em) monitorado(s). Alternativamente, o primeiro e segundo tanque pode ser operado de forma basicamente concomitante. Em outro aspecto útil, medições fora de linha (offline) do pH podem ser omitidas, evitando assim uma contaminação dos tanques e evitando uma comparação imprecisa dos valores de pH, pois os efeitos de amostragem podem criar uma variabilidade significativa do valor de pH medido.
[017] De acordo com outro aspecto útil, as concentrações de CO2 medidas em um tanque particular podem ser utilizadas para calcular um valor de pH absoluto e esperado e podem permitir identificar quaisquer desvios do valor de pH efetivamente medido a partir do valor de pH esperado. Dito desvio pode ser um indicador para um problema de medição de pH, por exemplo, um problema de calibração.
[018] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para determinar se um primeiro dispositivo de medição de pH acoplado operativamente a um primeiro tanque é afetado por um problema de medição de pH. O problema é que o primeiro dispositivo de medição de pH está calibrado erroneamente (e, portanto, não produz apenas um valor de pH que é errado em relação ao valor de pH fornecido por um dispositivo de medição de pH de referência, mas produz um valor de pH que está errado em termos absolutos). O método compreende: - receber, através de uma unidade de comparação, uma primeira concentração de CO2 e um primeiro valor de pH, sendo a primeira concentração de CO2 uma concentração de CO2 de um primeiro volume de gás acima de um meio (M1) no primeiro tanque, a primeira concentração de CO2 e o primeiro valor de pH sendo medidos em um primeiro tempo, sendo o primeiro tempo um tempo em que o meio no primeiro tanque está em estado de equilíbrio de pH-CO2 com o primeiro volume de gás a uma temperatura e pressão predefinidas, sendo dito estado de equilíbrio não afetado pelo metabolismo de qualquer cultura celular, sendo o primeiro valor de pH um valor medido fornecido pelo primeiro dispositivo de medição de pH; - calcular, através da unidade de comparação, um segundo valor de pH como uma função da primeira concentração de CO2, o segundo valor de pH sendo o valor de pH previsto para dito tipo de meio (M1) quando dito meio está em estado de equilíbrio de pH-CO2 com um segundo volume de gás acima de dito meio (M1) à temperatura e pressão predefinidas, o segundo volume de gás em dito equilíbrio tendo uma segunda concentração de CO2 que é idêntica à primeira concentração de CO2, sendo dito estado de equilíbrio não afetado pelo metabolismo de qualquer cultura celular; - comparar, através da unidade de comparação, o primeiro e segundo valor de pH para determinar se o primeiro dispositivo de medição de pH é afetado pelo problema de medição de pH.
[019] Isso pode ser vantajoso, pois este método permite determinar, desde que sejam conhecidas algumas propriedades do meio, o valor de pH absoluto correto do meio usando a concentração de CO2 no volume de ar do tanque que pode ser medida no efluente gasoso (offgas) como entrada. Ao comparar o valor de pH calculado e preciso derivado da concentração de CO2 com o valor de pH realmente medido, é possível detectar erros de calibração.
[020] De acordo com as formas de realização, a unidade de comparação produz um sinal de aviso no caso de se determinar que o primeiro dispositivo de medição de pH é afetado pelo problema de medição de pH. Isso pode permitir que um operador tome medidas adequadas, por exemplo, recalibrar o dispositivo de medição de pH, substituir o dispositivo de medição de pH, etc.
[021] De acordo com alguns exemplos relacionados com o uso de meios “minimalistas”, por exemplo, as soluções salinas sendo basicamente isentas de substâncias que atuam como um tampão, o cálculo de um valor de pH baseado em dióxido de carbono na fase gasosa em sistemas tamponados de carbonato pode ser realizado da seguinte forma:
[022] A concentração de dióxido de carbono que é dissolvido em um líquido é proporcional à pressão parcial de dióxido de carbono (pCO2) na fase gasosa e pode ser calculada utilizando os respectivos fatores proporcionais. Os fatores proporcionais dependem do líquido e da temperatura, bem como da pressão.
[023] Por exemplo, o coeficiente de solubilidade para o CO2 em vários líquidos é conhecido e pode ser derivado da literatura ou pode ser determinado experimentalmente. O coeficiente de solubilidade no sangue a 37 °C é cerca de 0,0304 mmol x L-1 x mmHg-1 [Loffler, G., Petrides, P.E., Physiologische Chemie, Springer-Verlag, 2013]. De acordo com Sazonov e Shaw, o coeficiente de Bunsen é definido como o volume de gás saturado reduzido de 273,15 e 1 bar, que é absorvido pelo volume unitário de solvente puro à temperatura de medição e pressão parcial de 1 bar. A dimensão é, portanto, volume/volume ou sem dimensão. Esse coeficiente baseia-se na Lei de Henry, alegando que, em equilíbrio, a pressão parcial de um gás é diretamente proporcional à concentração deste gás que é dissolvido em uma solução correlacionada. Os coeficientes de solubilidade dependem da solução respectiva [Gros, J.B., Dussap, C.G., Catté, M., Estimation of O2 and CO2 solubility in microbial culture media. Biotechnology Progress 1999, 15, 923-927].
[024] Se o coeficiente de solubilidade de um meio for conhecido, a concentração de dióxido de carbono dissolvido pode ser calculada por concentrações de dióxido de carbono na fase gasosa. Concentrações na fase gasosa, por exemplo, em biorreatores, podem ser medidas diretamente usando um analisador de efluente gasoso. EQUILÍBRIOS DE DIÓXIDO DE CARBONO E ÁCIDO CARBÔNICO-BASE: Equação 1 CO2(g) → CO2(aq)
[025] O CO2(aq) dissolvido é hidratado em água (H2O) para ácido carbônico (H2CO3). Equação 2 CO2(aq) + H2O ↔ H2CO3
[026] Em soluções aquosas a pH neutro e 37 °C, ácido carbônico de espécies hidratadas é quase inexistente; ambas as espécies podem, portanto, ser combinadas para H2CO3* (CO2(aq) + H2CO3 = H2CO3). Em pH de fermentação típico em torno de 7,00, H2CO3* se dissocia a bicarbonato (HCO3-) e a um próton (H+). O carbonato (CO32-), as espécies desprotonadas são quase inexistentes em valores de pH neutros.
[027] CO2 aquoso (aq) pode dissolver calcário CaCO3 + CO2 (aq) + H2O ↔ Ca2+ (aq) + 2 HCO3- (aq) e pode reagir com a água para formar ácido carbônico CO2 (aq) + H2O ↔ H2CO3 (aq).
[028] Apenas uma pequena fração existe como ácido, então a constante de dissociação K é
[029] O CO2 dissolvido na forma de H2CO3 pode perder até dois prótons através dos equilíbrios ácidos: Equação 3 H2CO3+ ↔ HCO3- + H+ Ks1 = 10-6,35 Equação 4 HCO3- ↔ CO32- + H+ Ks2 = 10-10,33
[030] As constantes de dissociação KS1 e KS2 são dadas aqui para condições padrão (298,15 K, força iônica Ic = 0 M) [Goudar, C.T.C., Matanguihan, R., Long, E., Cruz, C., et al., Decreased pCO2 accumulation by eliminating bicarbonate addition to high cell-density cultures. Biotechnology and Bioengineering 2007, 96, 1107-1117].
[031] Para condições de cultura celular, podem ser utilizadas temperaturas de 37 °C, bem como forças iônicas de 0,1 M. Isso mudará as constantes de dissociação respectivas para 10-6,07 e 10-10,04, respectivamente.
[032] A proporção de todas as espécies de dióxido de carbono (H2CO3*), bicarbonato HCO3- e carbonato CO32- pode ser calculada usando a Equação de Henderson-Hasselbalch.
[033] Equações de equilíbrio:
[034] As equações de equilíbrio de ácido podem ser resolvidas para dar a fração α dos respectivos carbonatos como uma função da concentração de prótons, portanto, pH:
[035] A concentração relativa de H2CO3 é, de fato, CO2 (aq) em equilíbrio com água.
[036] A seguir, será descrito um cálculo exemplificativo de um pH esperado com base na concentração de dióxido de carbono em água a 37 graus Celsius:
[037] Se a concentração de dióxido de carbono na fase gasosa é conhecida, a concentração de dióxido de carbono dissolvido pode ser calculada pelo uso do coeficiente de Bunsen, válido a pressão atmosférica a 37 °C [Loffler, G., Petrides, P.E., Physiologische Chemie, Springer-Verlag, 2013].
[038] CO2aq = 0,0304 [mmol/L x mmHg] x pressão x concentração de fase gasosa de dióxido de carbono / 100.
[039] A pressão neste caso é a pressão atmosférica de 750,06 mmHg.
[040] Pode haver 10% de dióxido de carbono na fase gasosa de um tanque. O dióxido de carbono é dado em [%]. A pressão parcial de CO2 em mmol/L (CO2aq [mmol/L]) é, neste caso, calculada de acordo com 750,06 mmHg x 10% / 100 = 75,006 mmHg. Temos então mmol/L CO2aq.
[041] Então, a concentração de prótons da primeira equação H2CO3 => H+ + HCO3- é calculada através da equação 5 e da equação 6: Concentração de H+, equação 5 = 1,01468E-06 mmol/L; Concentração de H+, equação 6 = 1,06941E-10 mmol/L.
[042] A concentração global de H+ é, portanto, 1,01468E-06 mmol/L + 1,06941E-10 mmol/L = 1,01479E-06 mmol/L.
[043] A contribuição da equação 5 para a concentração global de H+ é maior que a da equação 6.
[044] O pH é então calculado de acordo com pH = -log (1,01479E-06) = 5,99.
[045] A concentração de CO2 na fase gasosa pode ser calculada com base na concentração de bicarbonato e pH de acordo com:
[046] Com b sendo o coeficiente de Bunsen de 0,0304 mmol/L x mmHg a pressão atmosférica normal de 750,06 mmHg, pH sendo o valor de pH da solução e C sendo a concentração de bicarbonato em [mmol/L].
[047] Primeiramente, a quantidade de CO2 dissolvida em água (aq) sob atmosfera normal de pressão é calculada usando a Lei de Henry: Equação 10: [CO2(aq)] = KCO2 x H, em que KCO2 é a concentração de CO2 medida na fase gasosa/ efluente gasoso e H é a solubilidade de Henry.
[048] Após determinar [CO2(aq)] (equação 10) e KS1 (equação 5), a fórmula da Equação 11:
pode ser resolvida para calcular o pH como: 
[049] De acordo com as formas de realização, a unidade de comparação, para calcular o segundo valor de pH, lê uma relação meio- específica a partir de um meio de armazenamento de dados. A relação meio- específica é específica para o meio M1 do primeiro tanque e indica uma relação entre o valor de pH do meio M1 e uma fração respectiva de gás CO2 em um volume de gás quando dito meio está em estado de equilíbrio de pH-CO2 com dito volume de gás e não possui uma cultura celular. A unidade de comparação insere a primeira concentração de CO2 na relação específica de meio para calcular um valor de pH absoluto esperado para o meio em equilíbrio de pH-CO2 à temperatura e pressão predefinidas e sob a ausência de uma cultura celular. O valor de pH absoluto é usado como o segundo valor de pH calculado.
[050] Isto pode ser vantajoso, uma vez que uma relação específica de meio que correlaciona o valor de pH no meio com uma concentração de CO2 no efluente gasoso em estado de equilíbrio de CO2-pH pode ser obtida empiricamente para qualquer tipo de meio, incluindo meios compreendendo uma pluralidade de substâncias que possuem um impacto no equilíbrio de pH-CO2.
[051] De acordo com as formas de realização, a relação meio- específica é uma equação PPHM1(CO2) = REL-M1(CO2) obtida por ajustar matematicamente vários pares empiricamente determinados de um valor de pH do meio (M1) e uma fração de gás CO2 medida respectivamente em um volume de gás. PPHM1(CO2) é o valor de pH previsto em um meio (M1) quando dito meio não possui uma cultura celular e está em equilíbrio de pH-CO2 com um volume de gás acima de dito meio, dito volume de gás compreendendo a concentração de CO2 utilizada como parâmetro de entrada. O CO2 é um valor de parâmetro de entrada e representa a concentração de CO2 em um volume de gás acima do meio (M1) em estado de equilíbrio de pH-CO2 sob a ausência da cultura celular. REL-M1 é um conjunto de um ou mais parâmetros (a1, a2, b1, b2, b3) conectados por operadores. Os parâmetros tendo sido obtidos empiricamente por um método que compreende: - ajustar amostras do meio (M1) que não possuem a cultura celular para vários valores de pH diferentes, permitindo assim que as amostras alcancem o equilíbrio de pH-CO2 com o volume de gás acima do meio na respectiva amostra, - determinar a fração de gás CO2 em um respectivo volume de gás em equilíbrio de pH-CO2 com o meio nas amostras, - traçar as frações de gás CO2 determinadas contra os respectivos valores de pH de equilíbrio das amostras, - ajustar uma curva nos valores traçados e derivar os parâmetros (a1, a2 ou b1, b2, b3) da relação meio-específica a partir da curva ajustada.
[052] Por exemplo, a relação específica de meio pode ser determinada em um recipiente especial ou biorreator que compreende um sensor de efluentes gasosos de CO2 e um dispositivo de medição de pH em linha (online). As condições utilizadas para determinar a relação específica de meio, por exemplo, temperatura e pressão, são preferencialmente iguais ou muito similares à temperatura e pressão prevalecentes ao medir o primeiro valor de pH.
[053] De acordo com as formas de realização, o meio M1 no tanque cujo valor de pH é medido é um meio de composição definida que é conhecido por ter a mesma composição, como o meio utilizado para gerar empiricamente a relação meio-específica. Por exemplo, o meio no tanque e o meio utilizado para gerar a relação específica de meio podem ser preparados pelo operador do tanque ou podem ser recuperados de um provedor que revele todos os componentes do meio e as respectivas concentrações. Assim, as expressões “mesmo tipo de meio” ou o “mesmo meio”, tal como aqui utilizado, referem-se a meios que possuem a mesma composição pelo menos em relação a todos os componentes que têm impacto no equilíbrio de pH-CO2.
[054] Por exemplo, o meio pode ser um tampão de bicarbonato que está isento de quaisquer outras substâncias (exceto o bicarbonato) que tenham impacto no equilíbrio de pH-CO2. Alguns provedores de meios comercialmente disponíveis não revelam a lista completa de ingredientes. Ao preparar o tampão tendo um conjunto de componentes definido e limitado, o operador de um tanque pode garantir que o meio no tanque possui exatamente a mesma composição, como o meio usado para gerar a relação específica de meio. Isso pode impedir uma detecção errônea de um problema de medição de pH ou poderia a falta de um problema de medição de pH real.
[055] De acordo com as formas de realização, a determinação de que o primeiro dispositivo de medição de pH tem um problema de medição de pH é feita no caso de o primeiro e segundo valor de pH diferirem um do outro por mais do que um valor limite. Do mesmo modo, a determinação de que o primeiro dispositivo de medição de pH tem um problema de medição de pH é feita no caso de um primeiro valor de dados diferir de um segundo valor de dados por mais do que um limite adicional, sendo o primeiro valor de dados derivado a partir do primeiro valor de pH, sendo o segundo valor de dados derivado a partir do segundo valor de pH. Por exemplo, o limite pode ser definido por um operador do tanque ao qual o primeiro dispositivo de medição de pH está acoplado e pode depender dos requisitos de precisão do operador ou do projeto para o qual o tanque e o meio são usados.
[056] De acordo com as formas de realização, o primeiro tanque é um biorreator ou um tanque de coleta ou uma caixa de calibração.
[057] De acordo com outro aspecto útil, as concentrações de CO2 medidas em um tanque particular podem ser usadas para calibrar ou recalibrar um dispositivo de medição de pH erroneamente calibrado.
[058] Em um aspecto adicional, a invenção se refere a um método para calibrar ou recalibrar um primeiro dispositivo de medição de pH. O método compreende comparar valores de pH e concentrações de CO2 medidos no primeiro e no segundo tanque, como descrito acima para formas de realização da invenção, para determinar que o primeiro dispositivo de medição de pH é afetado por um problema de medição de pH; e calibrar o primeiro dispositivo de medição de pH de modo que ele produza o mesmo valor de pH como o segundo dispositivo de medição de pH no caso de a primeira e segunda concentração de CO2 serem idênticas. Alternativamente, o método compreende o cálculo de um segundo valor de pH esperado a partir de uma primeira concentração de CO2 medida nos efluentes gasosos de um primeiro tanque, como descrito acima para formas de realização da invenção, para determinar que o primeiro dispositivo de medição de pH no primeiro tanque é afetado por um problema de medição de pH; e calibrar o primeiro dispositivo de medição de pH de modo que ele produza o mesmo valor de pH como o valor do pH calculado como uma função da primeira concentração de CO2.
[059] De acordo com outro aspecto útil, as concentrações de CO2 medidas em um tanque particular podem ser usadas para calibrar ou recalibrar um dispositivo de medição de pH erroneamente calibrado sem remover e reinserir o dispositivo de medição de pH de e para o tanque.
[060] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método de operação de um tanque que compreende um primeiro dispositivo de medição de pH. O primeiro dispositivo de medição de pH é um dispositivo de medição em linha (online), em que o método compreende: - cultivar uma cultura celular no tanque, o tanque compreendendo um meio de crescimento, medindo assim repetidamente o pH no meio de crescimento pelo primeiro dispositivo de medição de pH; - substituir o meio de crescimento e a cultura celular contida no tanque com um meio (M1) para o qual é conhecida uma relação entre pH e CO2 em equilíbrio; por exemplo, dito meio M1 pode ser um meio cuja relação meio- específica correspondente é armazenada em um meio de armazenamento de dados acessível a uma unidade de comparação que executa a determinação se existir um problema de medição de pH ou o meio M1 pode ser um único meio tamponado de bicarbonato que permite o cálculo do valor absoluto do pH a partir da concentração de efluentes gasosos de CO2 no equilíbrio de pH-CO2; - após ter substituído o meio de crescimento, calcular um segundo valor de pH esperado a partir da concentração de efluentes gasosos de CO2 medida, como descrito acima para formas de realização da invenção, para determinar se o primeiro dispositivo de medição de pH é afetado por um problema de medição de pH; - se um problema de medição de pH for detectado, calibrar o primeiro dispositivo de medição de pH de modo que ele produza o mesmo valor de pH, como o valor de pH calculado como uma função da primeira concentração de CO2 para o meio (M1); - após ter calibrado o primeiro dispositivo de medição de pH, substituir o meio no tanque pelo meio de crescimento.
[061] Ditas características podem ser vantajosas, já que não é mais necessário retirar o dispositivo de medição do pH do tanque, executar alguns testes de calibração, recalibrá-lo opcionalmente, autoclavar o medidor de pH e reintroduzir o medidor de pH autoclavado no tanque. Em vez disso, o dispositivo de medição de pH, que pode ser um dispositivo de medição de pH em linha (online) localizado dentro do tanque, pode ser verificado e recalibrado no tanque. Isso pode reduzir o risco de contaminação e economizar tempo.
[062] De acordo com outro aspecto útil, as concentrações de CO2 medidas em um tanque particular podem ser utilizadas para identificar os efeitos de deslocamento de pH causados pela tomada de uma amostra do meio no tanque.
[063] Em um outro aspecto, a invenção se refere a um método para determinar os efeitos de deslocamento de pH causados pela tomada de uma amostra de meio a partir de um primeiro tanque. O método compreende o fornecer um dispositivo de medição de pH externo ao tanque e fora de linha (offline) e fornecer o primeiro tanque. O primeiro tanque compreende um primeiro dispositivo de medição de pH. O primeiro dispositivo de medição de pH é um dispositivo de medição de pH em linha (online) localizado dentro do primeiro tanque e é pelo menos parcialmente cercado pelo meio (M1) no primeiro tanque. O método compreende ainda: - calibrar o primeiro dispositivo de medição de pH (interno ao tanque) calculando um valor de pH absoluto previsto a partir de uma concentração de efluentes gasosos de CO2 medida do primeiro tanque para determinar se o primeiro dispositivo de medição de pH (interno ao tanque) é afetado por um problema de medição de pH; e calibrar (se um problema de medição de pH foi detectado) o primeiro dispositivo de medição de pH (interno ao tanque), de modo que ele produza o mesmo valor de pH como o valor de pH calculado como uma função da primeira concentração de CO2; - transferir o dispositivo de medição de pH externo ao tanque e fora de linha (offline) para uma caixa de calibração que compreende o mesmo tipo de meio (M1) como o primeiro tanque; e calibrar (se um problema de medição de pH foi detectado) o dispositivo de medição de pH externo ao tanque e fora de linha (offline) calculando um valor de pH absoluto previsto a partir de uma concentração de efluente gasoso de CO2 medida da caixa de calibração para determinar se dispositivo de medição de pH externo ao tanque e fora de linha (offline) é afetado por um problema de medição do pH; e calibrar (se um problema de medição de pH foi detectado) o dispositivo de medição de pH externo ao tanque e fora de linha (offline) de modo que ele produza o mesmo valor de pH como o valor de pH calculado como uma função da concentração de CO2 medida no efluente gasoso da caixa de calibração; assim, a caixa de calibração é usada como o tanque que compreende o dispositivo de medição de pH a ser calibrado e é usada como um recipiente cujo sensor de efluente gasoso de CO2 é usado para medir a concentração de CO2 usada como entrada para calcular o segundo valor de pH a ser usado para calibrar o dispositivo de medição de pH externo ao tanque e fora de linha (offline).
[064] Após ter calibrado o primeiro dispositivo de medição de pH e o dispositivo de medição de pH externo ao tanque, o método compreende: - medir, através do primeiro dispositivo de medição de pH, um primeiro valor de pH atual do meio no primeiro tanque, sendo o primeiro valor de pH atual um valor de medição em linha (online); - tomar uma amostra do meio do primeiro tanque e preencher a amostra em um recipiente portátil; - posicionar o dispositivo de medição de pH externo ao tanque, de modo que esteja pelo menos parcialmente cercado com o meio no recipiente de amostra; - medir, através do dispositivo de medição de pH externo ao tanque, um segundo valor de pH atual do meio no recipiente de amostra, o segundo valor de pH atual sendo um valor de medição fora de linha (offline); - no caso de o primeiro e o segundo valor de pH atuais diferirem por mais do que um limite, determinar que o processo de amostragem causou um efeito de deslocamento de pH.
[065] De acordo com as formas de realização, o método compreende ainda: - receber uma terceira concentração de CO2 e um terceiro valor de pH, sendo a terceira concentração de CO2 uma concentração de CO2 de um terceiro volume de gás acima do meio no primeiro tanque, sendo a terceira concentração de CO2 e o terceiro valor de pH medidos em um terceiro tempo, sendo o terceiro tempo um tempo em que o meio no primeiro tanque está em estado de equilíbrio de pH-CO2 a uma temperatura e pressão predefinidas com o terceiro volume de gás e após dito estado de equilíbrio ser modificado pelo metabolismo da cultura celular no primeiro tanque, sendo o terceiro valor de pH um valor medido fornecido pelo primeiro dispositivo de medição de pH; - receber uma quarta concentração de CO2 e um quarto valor de pH, sendo a quarta concentração de CO2 uma concentração de CO2 de um quarto volume de gás acima do meio no segundo tanque, sendo a quarta concentração de CO2 e o quarto valor de pH medidos em um quarto tempo, sendo o quarto tempo um tempo em que o meio no segundo tanque está em estado de equilíbrio de pH-CO2 à temperatura e pressão predefinidas com o segundo volume de gás e após dito estado de equilíbrio ser modificado pelo metabolismo da cultura celular no segundo tanque, sendo o quarto valor de pH um valor medido fornecido pelo segundo dispositivo de medição de pH, o tempo decorrido entre o terceiro tempo e a inoculação do primeiro tanque sendo idêntico ao tempo decorrido entre o quarto tempo e a inoculação do segundo tanque; - receber uma primeira taxa de absorção de oxigênio medida da cultura celular no primeiro tanque no terceiro tempo; - receber uma segunda taxa de absorção de oxigênio medida da cultura celular no segundo tanque no quarto tempo; - no caso de a primeira e a segunda taxa de absorção de oxigênio serem idênticas, comparar o terceiro e quarto valor de pH e de concentração de CO2 para determinar se o primeiro e o segundo dispositivo de medição de pH estão calibrados de forma diferente.
[066] Por exemplo, ditas etapas podem ser realizadas por uma unidade de comparação, por exemplo, uma peça de lógica de programa que monitora e/ou controla as medições de pH e os estados de calibração de um ou mais dispositivos de medição de pH. Além disso, a unidade de comparação ou uma unidade de controle acoplada à unidade de comparação pode monitorar e/ou controlar o estado de um ou mais tanques.
[067] Medir e minimizar com precisão os efeitos de deslocamento de um processo de amostragem pode ser altamente vantajoso, pois o valor de pH medido em uma amostra pode ser usado frequentemente como um parâmetro de controle importante de biorreatores. O valor de pH medido em uma amostra do meio de um biorreator pode frequentemente ser a base para a tomada de ações corretivas, por exemplo, adicionar uma substância básica, aumentar ou diminuir a temperatura ou taxa de alimentação podem ser realizadas. Ao calibrar o dispositivo de medição de pH interno ao tanque, bem como o dispositivo de medição de pH externo ao tanque com base em uma concentração de CO2 medida, ambos os dispositivos de medição de pH podem ser calibrados em relação a um valor de pH absoluto altamente exato que pode ser derivado exatamente da concentração de CO2. Assim, as diferenças de calibração podem ser minimizadas. Como consequência, ao operar o tanque e tomar amostras de meio regularmente, qualquer diferença no valor de pH do dispositivo de medição de pH interno ao tanque e do dispositivo de medição de pH externo ao tanque pode ser claramente atribuído a efeitos de amostragem e não a diferenças de calibração. Assim, o efeito do processo de amostragem pode ser determinado de forma mais precisa e pode ser filtrado (por exemplo, adicionando ou subtraindo de forma computacional a diferença de pH causada pelo processo de amostragem) a partir do valor de pH medido pelo dispositivo de medição de pH externo ao tanque.
[068] De acordo com as formas de realização, o primeiro dispositivo de medição de pH está pelo menos parcialmente cercado pelo meio dentro do primeiro tanque. O primeiro tanque não possui meios para tomar, manual ou automaticamente, uma amostra do meio no segundo tanque. Alternativamente, o primeiro tanque compreende meios para tomar, manual ou automaticamente, uma amostra do meio no primeiro tanque, mas todas as aberturas dos meios de amostragem são mantidas fechadas durante um intervalo de tempo após o preenchimento do meio no primeiro tanque e antes de adicionar uma cultura celular ao meio no primeiro tanque. Isso pode reduzir o risco de contaminar o tanque com micróbios.
[069] De acordo com as formas de realização, o segundo dispositivo de medição de pH está pelo menos parcialmente cercado pelo meio dentro do segundo tanque. O segundo tanque não possui meios para tomar, manual ou automaticamente, uma amostra do meio no segundo tanque. Alternativamente, o segundo tanque compreende meios para tomar, manual ou automaticamente, uma amostra do meio no segundo tanque, mas todas as aberturas dos meios de amostragem são mantidas fechadas durante um intervalo de tempo após o preenchimento do meio no segundo tanque e antes de adicionar uma cultura celular ao meio no segundo tanque.
[070] De acordo com as formas de realização, o método para determinar os problemas de medição de pH, aqui descrito por formas de realização da invenção, utilizado para determinar se o segundo dispositivo de medição de pH está calibrado de forma diferente do primeiro dispositivo de medição de pH, a determinação se o primeiro e o segundo dispositivo de medição de pH estão calibrados de forma diferente sendo realizada enquanto o segundo dispositivo de medição de pH está pelo menos parcialmente cercado com o meio no segundo tanque e sem tomar uma amostra do meio do segundo tanque para realizar dita determinação.
[071] De acordo com as formas de realização, comparando os valores de pH medidos por dois ou mais dispositivos de medição de pH diferentes, a determinação de se o primeiro dispositivo de medição de pH é afetado por um problema de medição de pH é realizada usando a primeira e segunda concentração de CO2 e o primeiro e o segundo valor de pH como a única entrada de dados para dita determinação.
[072] De acordo com as formas de realização, comparando o valor de pH medido por um dispositivo de medição de pH particular com um valor de pH esperado calculado a partir da concentração de CO2 medida, a determinação de se o primeiro dispositivo de medição de pH é afetado por um problema de medição de pH é realizada usando o valor de pH medido e a concentração de CO2 medida do tanque compreendendo dito dispositivo de medição de pH como a única entrada de dados para dita determinação.
[073] Essas características podem ser vantajosas, pois nenhuma medida fora de linha (offline) pode ser necessária mais para determinar problemas de medição de pH.
[074] De acordo com as formas de realização, a medição do primeiro valor de pH é realizada como medição em linha (online) e o primeiro dispositivo de medição de pH é pelo menos parcialmente cercado com o meio no primeiro tanque. Neste caso, o primeiro dispositivo de medição de pH estando acoplado operativamente ao primeiro tanque é um dispositivo de medição de pH interno ao tanque do primeiro tanque.
[075] Além disso, ou, alternativamente, a medição do segundo valor de pH é realizada como medição em linha (online) e o segundo dispositivo de medição de pH é pelo menos parcialmente cercado pelo meio no segundo tanque. Neste caso, o segundo dispositivo de medição de pH estando acoplado operativamente ao segundo tanque é um dispositivo de medição de pH interno ao tanque do segundo tanque.
[076] De acordo com as formas de realização, a medição da primeira concentração de CO2 é realizada como uma medição em linha (online) por um primeiro sensor de CO2 no efluente gasoso do primeiro tanque para fornecer a primeira concentração de CO2.
[077] De acordo com as formas de realização, a medição da segunda concentração de CO2 é realizada como uma medição em linha (online) por um segundo sensor de CO2 no efluente gasoso do segundo tanque para fornecer a segunda concentração de CO2.
[078] De acordo com as formas de realização, a unidade de comparação realiza, no caso de determinar que o primeiro dispositivo de medição de pH é afetado por um problema de medição de pH, uma ou mais das seguintes etapas: produzir uma mensagem de aviso; realizar ou provocar automaticamente a realização de uma recalibração do primeiro dispositivo de medição de pH; ou realizar ou provocar automaticamente a realização de uma substituição do primeiro dispositivo de medição de pH por um novo primeiro dispositivo de medição de pH.
[079] De acordo com as formas de realização, o primeiro tanque difere do segundo tanque em relação a uma ou mais das seguintes características: a) o volume de gás no tanque; b) o volume do meio no tanque; c) o número de Reynolds do tanque; d) o número de Newton do tanque; e) as dimensões do tanque; f) características geométricas do tanque e/ou defletores do tanque; g) a configuração do agitador; h) a taxa de agitação; i) o coeficiente volumétrico de transferência de massa para oxigênio (kLa) do tanque; j) taxa de influxo de gás total e/ou taxa de influxo de O2 e/ou taxa de influxo N2 e/ou taxa de influxo de CO2; k) entrada de energia; l) pressão no tanque; m) tempo de retenção de bolha de gás no meio; n) tamanho e distribuição de bolha de gás no meio; o) velocidade de superfície; p) um parâmetro calculado como uma derivada de um ou mais dos parâmetros (a)-(o); q) a localização geográfica dos dois tanques.
[080] Em outro aspecto, a invenção se refere a uma unidade de comparação configurada para: - receber uma primeira concentração de CO2 e um primeiro valor de pH, sendo a primeira concentração de CO2 uma concentração de CO2 de um primeiro volume de gás acima de um meio (M1) em um primeiro tanque, a primeira concentração de CO2 e o primeiro valor de pH sendo medidos em um primeiro tempo, sendo o primeiro tempo um tempo em que o meio no primeiro tanque está em estado de equilíbrio de pH-CO2 com o primeiro volume de gás a uma temperatura e pressão predefinidas, sendo dito estado de equilíbrio não afetado pelo metabolismo de qualquer cultura celular, sendo o primeiro valor de pH um valor medido fornecido pelo primeiro dispositivo de medição de pH; - receber uma segunda concentração de CO2 e um segundo valor de pH, sendo a segunda concentração de CO2 uma concentração de CO2 de um segundo volume de gás acima do mesmo tipo de meio (M1) contido no segundo tanque, a segunda concentração de CO2 e o segundo valor de pH sendo medidos em um segundo tempo, sendo o segundo tempo um tempo em que o meio no segundo tanque está em estado de equilíbrio de pH-CO2 com o segundo volume de gás à temperatura e pressão predefinidas, sendo dito estado de equilíbrio não afetado pelo metabolismo de qualquer cultura celular, o segundo valor de pH sendo um valor medido fornecido pelo segundo dispositivo de medição de pH; - comparar o primeiro e segundo valor de pH e comparar a primeira e a segunda concentração de CO2 para determinar se o primeiro dispositivo de medição de pH é afetado pelo problema de medição de pH.
[081] Em outro aspecto, a invenção se refere a uma unidade de comparação configurada para: - receber uma primeira concentração de CO2 e um primeiro valor de pH, sendo a primeira concentração de CO2 uma concentração de CO2 de um primeiro volume de gás acima de um meio (M1) no primeiro tanque, a primeira concentração de CO2 e o primeiro valor de pH sendo medidos em um primeiro tempo, sendo o primeiro tempo um tempo em que o meio no primeiro tanque está em estado de equilíbrio de pH-CO2 com o primeiro volume de gás a uma temperatura e pressão predefinidas, sendo dito estado de equilíbrio não afetado pelo metabolismo de qualquer cultura celular, sendo o primeiro valor de pH um valor medido fornecido pelo primeiro dispositivo de medição de pH; - calcular um segundo valor de pH como uma função da primeira concentração de CO2, o segundo valor de pH sendo o valor de pH previsto para dito tipo de meio (M1) quando dito meio está em estado de equilíbrio de pH-CO2 com um segundo volume de gás acima de dito meio (M1) à temperatura e pressão predefinidas, o segundo volume de gás em dito equilíbrio tendo uma segunda concentração de CO2 que é idêntica à primeira concentração de CO2, sendo dito estado de equilíbrio não afetado pelo metabolismo de qualquer cultura celular; - comparar o primeiro e segundo valor de pH para determinar se o primeiro dispositivo de medição de pH é afetado pelo problema de medição de pH.
[082] Em outro aspecto, a invenção se refere a um sistema configurado para monitorar e/ou controlar um estado de um primeiro tanque. O sistema compreende: - a unidade de comparação, de acordo com as formas de realização da invenção; - uma unidade de controle acoplada operativamente à unidade de comparação; e - o primeiro tanque e o primeiro dispositivo de medição de pH; - a unidade de controle sendo configurada para monitorar e/ou controlar um estado de uma cultura celular no primeiro tanque, usando assim valores de pH repetidamente medidos pelo primeiro dispositivo de medição de pH como entrada.
[083] De acordo com as formas de realização, o sistema é configurado para usar os valores de pH do primeiro e segundo dispositivo de medição de pH e a primeira e segunda concentração de CO2 como um parâmetro de entrada para monitorar e/ou minimizar os desvios de um estado do primeiro tanque a partir do estado do segundo tanque, analisando pelo menos ditos parâmetros de entrada.
[084] A seguir, formas de realização e exemplos serão descritos fazendo referência a biorreatores. No entanto, os biorreatores são apenas um tipo de tanque onde as formas de realização da invenção podem ser aplicadas. Outros exemplos são tanques de coleta e caixas de calibração.
[085] Em um aspecto, a invenção se refere a um método que compreende: - receber, através de uma unidade de comparação, uma primeira concentração de CO2 e um primeiro valor de pH. A primeira concentração de CO2 é uma concentração de CO2 de um primeiro volume de gás acima de um meio no primeiro biorreator. A primeira concentração de CO2 e o primeiro valor de pH são medidos em um primeiro tempo. O primeiro tempo é um tempo em que o meio no primeiro biorreator está em estado de equilíbrio de pH-CO2 a uma temperatura e pressão predefinidas com o primeiro volume de gás e antes de dito estado de equilíbrio ser modificado pelo metabolismo de uma cultura celular no primeiro biorreator. O primeiro valor de pH é um valor medido fornecido por um primeiro dispositivo de medição de pH acoplado operativamente a um primeiro biorreator; - receber, através da unidade de comparação, uma segunda concentração de CO2 e um segundo valor de pH. A segunda concentração de CO2 é uma concentração de CO2 de um segundo volume de gás acima de um meio no segundo biorreator. A segunda concentração de CO2 e o segundo valor de pH são medidos em um segundo tempo. O segundo tempo é um tempo em que o meio no segundo biorreator está em estado de equilíbrio de pH-CO2 à temperatura e pressão predefinidas com o segundo volume de gás e antes de dito estado de equilíbrio ser modificado pelo metabolismo de uma cultura celular no segundo biorreator. O segundo valor de pH é um valor medido fornecido pelo segundo dispositivo de medição de pH acoplado operativamente a um segundo biorreator. O meio no primeiro biorreator é o mesmo que o meio no segundo biorreator; - comparar, através da unidade de comparação, o primeiro e segundo valor de pH e a segunda concentração de CO2 para determinar se o primeiro e segundo dispositivo de medição de pH são calibrados de forma diferente ou para determinar se o primeiro e segundo dispositivo de medição de pH produzem diferentes valores de pH devido a efeitos de deslocamento de um processo de amostragem realizado para medir o primeiro ou segundo valor de pH em uma amostra do meio de um respectivo dos primeiro e segundo biorreatores.
[086] Por exemplo, o segundo biorreator pode ser utilizado como biorreator de referência e o primeiro biorreator pode ser usado como outro biorreator, em que um projeto de cultura celular deve ser executado basicamente da mesma maneira que uma cultura celular de referência tendo sido cultivada anteriormente no biorreator de referência. Também pode ser o caso que o primeiro e o segundo biorreatores devem ser executados sincronicamente, pelo que os respectivos valores de pH são repetidamente medidos para comparar o estado dos biorreatores. A comparação de parâmetros pode ser realizada, por exemplo, para iniciar automaticamente, semi-automaticamente ou manualmente ações apropriadas para evitar um desvio de estado dos dois biorreatores.
[087] Observou-se que os erros de calibração do primeiro ou segundo dispositivo de medição de pH são fontes de erro comuns, resultando em uma falha na comparação precisa dos estados dos dois biorreatores e/ou na reprodução precisa de um perfil de estado derivado do segundo biorreator no primeiro biorreator. Os erros de calibração são fontes de erro comuns, tanto para abordagens de medição de pH fora de linha (offline) quanto em linha (online).
[088] Além disso, observou-se que, no caso de medições de pH fora de linha (offline) serem realizadas no primeiro e/ou segundo biorreator, o valor de pH fora de linha (offline) obtido pode não refletir com precisão o valor de pH atual do meio no biorreator. Por exemplo, uma amostra de meio pode ser regularmente extraída de um biorreator para realizar regularmente uma medição de pH fora de linha (offline) em ditas amostras. O processo de amostragem antes do valor de pH poder ser medido na amostra de meio leva tempo. Entretanto, o valor de pH no biorreator a partir do qual a amostra foi extraída pode ter mudado significativamente. Além disso, pode acontecer que a temperatura na amostra caia durante o processo de amostragem ou o valor de pH na amostra mude devido a uma alteração na concentração de CO2 no volume de gás acima do meio da amostra em comparação com o volume de gás acima do médio no biorreator. Todos os ditos fatores podem influenciar o valor de pH na amostra de meio e levar a um chamado “efeito de deslocamento”.
[089] Um “efeito de deslocamento”, tal como aqui utilizado, é um deslocamento de valor de pH pelo qual um valor de pH medido em uma amostra de meio de um biorreator em um determinado tempo difere de um valor de pH que seria medido em dito determinado tempo diretamente no meio do biorreator. Assim, os erros de calibração do primeiro ou segundo dispositivo de medição de pH e/ou efeitos de deslocamento (no caso de o primeiro e/ou segundo dispositivo de medição de pH ser um dispositivo de medição fora de linha (offline) podem resultar em falha na comparação e/ou sincronização precisas do estado de dois biorreatores com base em valores de medição de pH.
[090] As formas de realização da invenção aproveitam o fato de que, no caso de duas soluções/meios idênticos estarem em estado de equilíbrio de pH-CO2 a uma dada temperatura e pressão e um dado valor de pH, o volume acima de ditos meios tem a mesma concentração de CO2. Do mesmo modo, dada uma concentração de CO2 particular nos volumes acima de ditos dois meios em estado de equilíbrio, os valores de pH de ditos dois meios são idênticos, uma vez que os dois meios estão em equilíbrio de pH-CO2. Como os dois meios estão livres de quaisquer células cujo metabolismo poderia deslocar o estado de equilíbrio de pH-CO2, qualquer desvio do primeiro e segundo valor de pH, dado concentrações de CO2 medidas idênticas, é usado como uma indicação de que os dois dispositivos de medição de pH são calibrados de forma diferente e/ou que a diferença é causada por um efeito de deslocamento de uma medida de pH fora de linha (offline).
[091] Por exemplo, a temperatura “predefinida” ou “dada” do segundo biorreator pode ser qualquer temperatura e pressão que seja adequada para iniciar e/ou operar o segundo biorreator. Por exemplo, a segunda temperatura poderia ser de 20 °C e a segunda pressão poderia ser a pressão atmosférica normal. A segunda temperatura e pressão podem ser medidas e a temperatura e a pressão do primeiro biorreator (aqui referidas como “primeira temperatura” e “primeira pressão”), podem ser controladas e adaptadas de modo que a primeira e a segunda temperatura sejam idênticas ou aproximadamente idênticas e a primeira e a segunda pressão sejam idênticas ou aproximadamente idênticas.
[092] As formas de realização da invenção podem ser vantajosas por múltiplos motivos: - A comparação das concentrações de CO2 e os valores de pH a um tempo antes que o valor de pH do meio seja afetado por qualquer atividade metabólica da cultura celular, permite verificar se o primeiro dispositivo de medição de pH está calibrado de forma diferente do segundo dispositivo de medição de pH e permite determinar, no caso de um ou ambos os ditos dispositivos de medição de pH serem dispositivos fora de linha (offline), se um ou ambos os valores de pH medidos podem estar defeituosos por um efeito de deslocamento.
[093] Uma detecção precoce de diferenças de calibração e/ou efeitos de deslocamento podem permitir recalibrar, reparar ou trocar o dispositivo de medição de pH antes que o meio seja inoculado com a cultura celular. A recalibração pode incluir a opção de calibrar o primeiro dispositivo de medição de pH de forma que compense qualquer efeito de deslocamento. Assim, o cultivo de uma cultura celular em um biorreator cujo dispositivo de medição de pH está calibrado de forma diferente de um dispositivo de medição de pH de um biorreator de referência (ou cujos valores de pH medidos são defeituosos por um efeito de deslocamento) pode ser evitado e/ou corrigido desde o início, assim economizando tempo e dinheiro que seriam perdidos no caso de um erro de calibração de um dispositivo de medição de pH resultar em uma falha na reprodução das condições ambiente do biorreator de referência (“segundo”) no outro (“primeiro”) biorreator.
[094] Em outro aspecto útil, as formas de realização da invenção permitem a comparação de valores de pH de diferentes biorreatores mesmo no caso de os dois biorreatores comparados e os respectivos dispositivos de medição de pH estarem distantes uns dos outros, por exemplo, estão localizados em diferentes edifícios ou cidades diferentes ou mesmo países diferentes. Em vez de confiar em soluções de calibração padronizadas disponíveis comercialmente com um valor de pH definido, o valor de CO2 (que pode ser determinado facilmente e com grande precisão) é usado como base para comparar os valores de pH medidos e para identificar diferenças de calibração e/ou efeitos de deslocamento em uma medição de pH. A primeira concentração de CO2 medida e o primeiro valor de pH medido podem ser comunicados facilmente à unidade de comparação, por exemplo, através de uma conexão à internet. Não é necessário que o primeiro e o segundo dispositivo de medição de pH sejam calibrados e comparados ao mesmo tempo. Não é ainda necessário que o valor de pH absoluto seja determinado corretamente. Dado um primeiro valor de pH e um primeiro valor de CO2 medido por um primeiro dispositivo de medição de pH em um primeiro biorreator em estado de equilíbrio de pH-CO2, como descrito acima, é possível determinar, medindo um segundo valor de pH e segundo valor de CO2 por um segundo dispositivo de medição de pH em um segundo biorreator em estado de equilíbrio de pH-CO2, como descrito acima, se o primeiro e segundo dispositivo de medição de pH estão calibrados de forma idêntica, mesmo no caso de o segundo valor de pH e o segundo valor de CO2 serem determinados semanas ou anos antes do primeiro valor de pH e segundo valor de CO2 serem observados.
[095] Em um aspecto adicional, no caso de o primeiro biorreator dever ser operado basicamente com os mesmos parâmetros ambientais, como o segundo biorreator, determinar a ausência de diferenças de calibração do segundo e do primeiro dispositivo de medição de pH e determinar a ausência de efeitos de deslocamento nas medições de pH pode ser muito mais importante do que uma medida correta de um valor de pH absoluto. Assim, mesmo no caso em que o segundo biorreator (cujos parâmetros operacionais podem fornecer um tipo de “perfil de referência” para operar o primeiro biorreator) foi operado com um dispositivo de medição de pH incorretamente calibrado e/ou o segundo valor de pH é influenciado por um efeito de deslocamento enquanto o primeiro dispositivo de medição de pH (do primeiro biorreator que deve ser operado conforme especificado no “perfil de referência”) é calibrado corretamente/ não tem efeito de deslocamento, as formas de realização da invenção permitem identificar uma diferença de calibração e/ou a existência de um efeito de deslocamento ao medir o segundo dispositivo de medição de pH. A identificação da diferença de calibração e/ou efeito de deslocamento ao medir o segundo ou o primeiro valor de pH permite que um operador ou um sistema de controle automatizado tome as ações apropriadas para evitar o crescimento da cultura celular no primeiro biorreator sob diferentes parâmetros ambientais (em particular, sob diferentes valores de pH do meio) do que as células do segundo biorreator (referência).
[096] Assim, as formas de realização da invenção podem permitir um monitoramento e/ou controle preciso do estado de um biorreator identificando diferenças de calibração do dispositivo de medição de pH e/ou efeitos de deslocamento já na fase de inicialização de um biorreator.
[097] De acordo com outras formas de realização, o primeiro biorreator compreende meios para tomar, manual ou automaticamente, uma amostra do meio no primeiro biorreator. Durante um intervalo de tempo após o preenchimento do meio no primeiro biorreator e antes de adicionar a cultura celular ao meio no primeiro biorreator, o método compreende manter fechadas todas as aberturas dos meios de amostragem.
[098] Isso pode ser útil, uma vez que a contaminação do meio do primeiro biorreator é evitada. A abertura dos meios de amostragem para determinar o valor de pH em uma solução de referência de valor de pH conhecido não é mais necessária: as diferenças de calibração são identificadas através dos valores de CO2 e os valores de pH são medidos, de acordo com as formas de realização da invenção, pelo dispositivo de medição de pH no biorreator. Isso pode ser útil porque o risco de infectar o biorreator com micróbios indesejados no processo de amostragem é reduzido e nenhum efeito de deslocamento é causado pelo processo de amostragem.
[099] De acordo com as formas de realização, a segunda e a primeira concentração de CO2 do efluente gasoso dos respectivos biorreatores e a taxa de influxo de gás total são utilizadas para calcular uma segunda taxa de efluente gasoso de CO2 para o segundo biorreator e para calcular uma primeira taxa de efluente gasoso de CO2 do primeiro biorreator. Em seguida, a segunda e a primeira taxas de efluente gasoso de CO2 são comparadas em vez da segunda e primeira concentração de CO2. Esta abordagem pode ser aplicada no caso de as taxas de efluente gasoso total no segundo e primeiro biorreator serem idênticas. Alguns analisadores de efluente gasoso de CO2 podem medir uma taxa de efluente gasoso de CO2 em vez de uma concentração de CO2 e retornar uma taxa de efluente gasoso de CO2 para a unidade de comparação. Desde que a taxa de efluente gasoso total dos dois biorreatores comparados seja idêntica, a taxa de efluente gasoso de CO2 (“ACO”) dos dois biorreatores pode ser comparada em vez dos dois valores de CO2 e uma diferença de calibração ou deslocamento de medidor de pH é detectado se - dadas taxas de efluente gasoso total idênticas e valores de pH medidos idênticos, as taxas de efluente gasoso de CO2 medidas dos dois biorreatores diferem.
[0100] De acordo com as formas de realização, o método é utilizado para determinar se o primeiro dispositivo de medição de pH está calibrado de forma diferente do segundo dispositivo de medição de pH. O primeiro dispositivo de medição de pH é pelo menos parcialmente cercado pelo meio dentro do primeiro biorreator. Por exemplo, o primeiro dispositivo de medição de pH pode ser um dispositivo de medição de pH imerso no meio do primeiro biorreator. O primeiro biorreator não possui meios para tomar, manual ou automaticamente, uma amostra do meio no primeiro biorreator.
[0101] Isso pode ter o benefício de permitir o uso de um tipo de biorreator que impede a contaminação do meio e/ou a geração de efeitos de deslocamento, tomando amostras com o objetivo de medir o valor de pH como uma medição fora de linha (offline).
[0102] De acordo com outras formas de realização, o primeiro biorreator compreende meios para tomar, manual ou automaticamente, uma amostra do meio no primeiro biorreator. Ditos meios podem consistir, por exemplo, em uma abertura para tomar amostras de meio a partir do biorreator manualmente, ou podem consistir em braços ou drenos robóticos para extrair automaticamente ou semi-automaticamente uma amostra. O método compreende ainda: durante um intervalo de tempo após o preenchimento do meio no primeiro biorreator e antes de adicionar a cultura celular ao meio no primeiro biorreator, manter todas as aberturas dos meios de amostragem fechadas. Isso pode impedir a contaminação do meio no biorreator. À medida que o método utiliza um primeiro dispositivo de medição de pH que reside dentro do biorreator em combinação com uma concentração de CO2 do volume de gás acima do meio que pode ser facilmente medido sem tirar amostras, as formas de realização da invenção permitem a detecção de diferenças de calibração sem tomar uma amostra do biorreator e, portanto, sem o risco de uma infecção.
[0103] De acordo com as formas de realização, o método é utilizado para determinar se o primeiro dispositivo de medição de pH está calibrado de forma diferente do segundo dispositivo de medição de pH. A determinação de se o segundo e o primeiro dispositivo de medição de pH estão calibrados de forma diferente é realizada enquanto o primeiro dispositivo de medição de pH está pelo menos parcialmente cercado com o meio no primeiro biorreator (assim, por um dispositivo de medição de pH completamente ou pelo menos parcialmente localizado dentro do biorreator) e sem tomar uma amostra do meio do primeiro biorreator para realizar dita determinação.
[0104] De acordo com as formas de realização, a determinação é realizada usando a segunda e a primeira concentração de CO2 e o segundo e o primeiro valor de pH como a única entrada de dados para dita determinação. Isto pode ser vantajoso, uma vez que ditos valores de parâmetros podem ser facilmente obtidos através da realização de medições em linha (online) do valor de pH e da concentração de CO2.
[0105] De acordo com as formas de realização, o método compreende ainda a realização de uma medição em linha (online) com o primeiro dispositivo de medição de pH para medir o primeiro valor de pH, o primeiro dispositivo de medição de pH sendo pelo menos parcialmente cercado com o meio no primeiro biorreator.
[0106] Além ou alternativamente, o método compreende realizar uma medição em linha (online) através de um primeiro sensor de CO2 no efluente gasoso do primeiro biorreator para fornecer a primeira concentração de CO2.
[0107] Este método pode, em particular, ser usado determinando se o primeiro dispositivo de medição de pH está calibrado de forma diferente do segundo dispositivo de medição de pH (como o primeiro dispositivo de medição de pH é capaz de realizar medições em linha (online), normalmente não há efeito de deslocamento e qualquer desvio do resultado do segundo dispositivo de medição de pH é causado por diferenças de calibração ou, no caso de o segundo dispositivo de medição de pH ser um dispositivo de medição fora de linha (offline), por efeitos de deslocamento do segundo dispositivo de medição de pH.
[0108] Em muitos tipos de biorreatores utilizados atualmente, os respectivos dispositivos de medição de pH e concentração de CO2 já estão presentes e podem ser facilmente empregados não apenas para fins de monitoramento e controle do estado do biorreator, mas também para o propósito de identificar diferenças de calibração e efeitos de deslocamento. Não é necessário extrair amostras de meio para a medição do pH nem retirar ou reintroduzir o dispositivo de medição de pH de ou para um biorreator. Assim, o risco de infectar o biorreator com micróbios indesejados é reduzido. O método pode permitir identificar as diferenças de calibração de dois medidores de pH de dois biorreatores sem tomar amostras do meio de qualquer um dos dois biorreatores.
[0109] O uso de um sensor de CO2 que mede a concentração de CO2 no efluente gasoso de um biorreator pode ser vantajoso, porque os medidores de efluente gasoso de CO2 (“Analisadores de efluente gasoso de CO2”, “Sensores de efluente gasoso de CO2”) não são invasivos, não precisam de uma amostragem, pode ser facilmente obtido em tempo real e fornecer um valor, a concentração de CO2 no efluente gasoso e/ou a taxa de efluente gasoso de CO2. Assim, os analisadores de efluente gasoso de CO2 podem dar resposta imediata às mudanças de processo planejadas ou não planejadas em um biorreator (em contraste com, por exemplo, densidades celulares ou contagens celulares). Além disso, os analisadores de efluente gasoso podem ser calibrados a qualquer momento e não precisam ser autoclavados.
[0110] De acordo com as formas de realização, o método compreende a realização de uma medição em linha (online) com o segundo dispositivo de medição de pH para medir o segundo valor de pH. O segundo dispositivo de medição de pH está pelo menos parcialmente cercado com o meio no segundo biorreator. Além disso, ou alternativamente, o método compreende a realização de uma medição em linha (online) por um segundo sensor de CO2 no efluente gasoso do segundo biorreator para fornecer a segunda concentração de CO2. Isto pode ter a vantagem de que também os valores de concentração de CO2 e pH do segundo (ou “referência”) biorreator podem ser coletados por meio de medições em linha (online), por exemplo, por meio de um medidor de pH contínuo imerso, evitando assim os efeitos de deslocamento de pH e reduzindo o risco de infecções causadas pelo processo de amostragem.
[0111] De acordo com as formas de realização, o método é utilizado para determinar se o primeiro dispositivo de medição de pH produz um valor de pH diferente do segundo dispositivo de medição de pH devido a efeitos de deslocamento de um processo de amostragem realizado para medir o primeiro valor de pH em uma amostra do meio do primeiro biorreator. O método compreende ainda a realização de uma medição fora de linha (offline) com o primeiro dispositivo de medição de pH para medir o primeiro valor de pH. O primeiro dispositivo de medição de pH está fora do primeiro biorreator e é pelo menos parcialmente cercado com o meio em uma amostra de meio do primeiro biorreator.
[0112] Ditas características podem ser úteis se for utilizado um tipo de biorreator que esteja tecnicamente equipado com dispositivos de medição fora de linha (offline), em particular dispositivos de medição de pH fora de linha (offline). Neste contexto, qualquer efeito de deslocamento determinado por uma comparação do segundo e primeiro valor de pH e segunda e primeira concentração de CO2 pode ser usado para produzir um aviso e/ou modificar a saída do primeiro dispositivo de medição de pH de maneira a que o efeito de deslocamento causado pelo processo de amostragem é compensado.
[0113] De acordo com as formas de realização, o método compreende determinar que o segundo e o primeiro dispositivo de medição de pH são calibrados de forma diferente, ou determinar que o segundo e o primeiro dispositivo de medição de pH produzem diferentes valores de pH devido a efeitos de deslocamento de um processo de amostragem no caso de ocorrer uma das seguintes situações: - segundas e a primeira concentração de CO2 são idênticas e o segundo e primeiro valor de pH diferem um do outro por mais do que um valor limite; ou - o segundo e o primeiro valor de pH são idênticos e a segunda e a primeira concentração de CO2 diferem umas das outras por mais do que um valor limite adicional; ou - um segundo valor de dados difere de um primeiro valor de dados por mais do que um limite adicional, o segundo valor de dados sendo derivado a partir do segundo valor de pH e da segunda concentração de CO2, o primeiro valor de dados sendo derivado a partir do primeiro valor de pH e da primeira concentração de CO2. Por exemplo, no caso de as taxas efluente gasoso totais serem idênticas para dois biorreatores cujos dispositivos de medição de pH devem ser calibrados para permitir uma comparação do valor de pH no meio em ambos os biorreatores, as taxas de efluente gasoso de CO2 podem ser comparadas em vez das concentrações de CO2.
[0114] De acordo com as formas de realização, caso o valor de pH nem as concentrações de CO2 sejam idênticos, uma unidade de controle de um sistema de monitoramento e/ou controle de biorreator pode modificar a taxa de influxo de gás CO2. Assim, tanto a concentração de CO2 na fase gasosa como o valor de pH no meio podem ser afetados. Assim que o primeiro valor de pH é idêntico ao segundo valor de pH ou a primeira concentração de CO2 é idêntica à segunda concentração de CO2, a determinação acima descrita é realizada.
[0115] De acordo com as formas de realização, o método compreende ainda a observação de que a segunda e a primeira concentração de CO2 são idênticas e a calibração do primeiro dispositivo de medição de pH de modo que o primeiro dispositivo de medição de pH indique o mesmo valor de pH que o segundo dispositivo de medição de pH.
[0116] Por exemplo, no caso de a segunda e a primeira concentração de CO2 serem idênticas e o segundo e primeiro valor de pH diferem um do outro por uma quantidade “delta”, dito valor de deslocamento de pH “delta” pode ser adicionado a cada valor de pH medido pelo primeiro dispositivo de medição de pH no futuro (ou seja, em um momento posterior ao primeiro tempo). Os valores de pH resultantes produzidos pelo primeiro dispositivo de medição de pH compensam assim o deslocamento do pH causado por um processo de amostragem para medir o segundo ou primeiro valor de pH e/ou compensar quaisquer diferenças de calibração entre o segundo e o primeiro dispositivo de medição de pH.
[0117] De acordo com as formas de realização, uma unidade de controle de um sistema configurado para monitorar e/ou minimizar desvios de um estado do primeiro biorreator a parti do estado do segundo biorreator utiliza valores de pH do primeiro dispositivo de medição de pH como uma entrada. A minimização das diferenças de estado e/ou a comparação dos estados dos dois biorreatores é realizada pela unidade de comparação que analisa pelo menos ditos parâmetros de entrada. A unidade de comparação pode ser uma peça implementada por software, firmware e/ou hardware de lógica de programa, por exemplo, um programa de aplicação executado em um sistema eletrônico de processamento de dados. De acordo com as formas de realização, a unidade de comparação é operativamente acoplada à unidade de controle. Por exemplo, a unidade de comparação pode ser parte integrante da unidade de controle ou pode ser um programa de aplicação configurado para interoperar com a unidade de controle. A unidade de controle e a unidade de monitoramento podem ser hospedadas na mesma ou em diferentes máquinas eletrônicas de processamento de dados.
[0118] Isto pode ser vantajoso, uma vez que o uso de um primeiro dispositivo de medição de pH que está calibrado de forma diferente do segundo dispositivo de medição de pH e/ou cujos valores de pH têm um efeito de deslocamento devido ao processo de amostragem pode ser evitado.
[0119] De acordo com as formas de realização, a recepção do segundo e primeiro valor de pH, a recepção da segunda e primeira concentração de CO2 e a comparação de ditos valores de concentração de pH e CO2 são realizadas pela unidade de comparação. No caso de determinar que o segundo e o primeiro dispositivo de medição de pH estão calibrados de forma diferente, a unidade de comparação pode executar uma ou mais das seguintes etapas: - produzir uma mensagem de aviso; - realizar ou provocar automaticamente a realização de uma recalibração do primeiro dispositivo de medição de pH; - realizar ou provocar automaticamente a realização de uma substituição do primeiro dispositivo de medição de pH por um novo primeiro dispositivo de medição de pH.
[0120] Assim, um operador ou um componente automatizado do primeiro biorreator é capacitado para tomar as ações apropriadas, por exemplo, trocar ou recalibrar o primeiro dispositivo de medição de pH e atrasar a inoculação do primeiro biorreator até o problema ser resolvido.
[0121] A unidade de comparação pode ser, por exemplo, fornecida ou executada em um aparelho eletrônico de processamento de dados ou parte do mesmo. O aparelho compreende um processador, memória e instruções eletrônicas armazenadas no mesmo. Ao processar as instruções pelo processador, o método de formas de realização da invenção é realizado pela unidade de comparação. Em algumas formas de realização, a unidade de comparação é operativamente acoplada a um ou mais programas de aplicação de monitoramento e/ou controle de biorreator. A unidade de comparação pode ser parte integrante de um sistema que compreende o primeiro e, opcionalmente, também o segundo biorreator. O sistema, de acordo com algumas formas de realização, compreende outros biorreatores cujo estado deve ser monitorado e comparado com o estado do segundo biorreator.
[0122] De acordo com as formas de realização, a unidade de comparação lê uma relação meio-específica a partir de um meio de armazenamento de dados. A relação meio-específica é específica para o meio no segundo e no primeiro biorreator e indica uma relação entre o valor de pH do meio e a respectiva fração de gás CO2 em um volume de gás quando dito meio está em estado de equilíbrio de pH-CO2 com dito volume de gás e não possui uma cultura celular. Em seguida, a unidade de comparação utiliza a primeira concentração de CO2 como entrada para a relação específica de meio para o cálculo de um valor de pH absoluto esperado para o meio no primeiro biorreator em equilíbrio de pH-CO2 à temperatura e pressão predefinidas e sob a ausência de uma cultura celular. Em seguida, a unidade de comparação (ou um operador que usa o resultado de cálculo da relação específica de meio) configura o primeiro dispositivo de medição de pH de modo que o valor de pH absoluto calculado seja produzido por dito primeiro dispositivo de medição de pH. Por exemplo, o primeiro dispositivo de medição de pH é calibrado, de modo que, em futuras medições de pH, o primeiro dispositivo de medição de pH produz uma soma de um primeiro valor de pH medido e um delta pH, o delta pH sendo a diferença entre o primeiro valor de pH medido e o valor de pH esperado calculado usando a relação específica de meio.
[0123] A relação meio-específica pode ser, por exemplo, uma equação PPHM1(CO2) = REL-M1(CO2) obtida por ajustar matematicamente vários pares empiricamente determinados de um valor de pH do meio (M1) e uma fração de gás CO2 medida respectivamente em um volume de gás acima de dito meio. Assim: - PPHM1(CO2) é o valor de pH previsto em um meio (M1) quando dito meio não possui uma cultura celular e está em equilíbrio de pH-CO2 com um volume de gás acima de dito meio, dito volume de gás compreendendo a concentração de CO2 utilizada como parâmetro de entrada; - o CO2 é um valor de parâmetro de entrada e representa a concentração de CO2 em um volume de gás acima do meio (M1) em estado de equilíbrio de pH-CO2 sob a ausência da cultura celular; - REL-M1 é um conjunto de um ou mais parâmetros conectados por operadores.
[0124] Os parâmetros são obtidos, por exemplo, executando manualmente, automaticamente ou semi-automaticamente as seguintes etapas: - ajustar amostras do meio (M1) que não possuem a cultura celular para vários valores de pH diferentes, permitindo assim que as amostras alcancem o equilíbrio de pH-CO2 com o volume de gás acima do meio na respectiva amostra, - determinar a fração de gás CO2 em um respectivo volume de gás que está em equilíbrio de pH-CO2 com o meio nas amostras, - traçar as frações de gás CO2 determinadas contra os respectivos valores de pH de equilíbrio das amostras, - ajustar uma curva nos valores traçados e derivar os parâmetros da relação meio-específica a partir da curva ajustada.
[0125] Assim, a relação meio-específica pode ser identificada empiricamente, por exemplo, antes do segundo ou primeiro biorreator ser inoculado com a cultura celular de referência.
[0126] De acordo com algumas formas de realização, a relação específica de meio é obtida por preenchimento de um biorreator, por exemplo, o segundo biorreator, com o meio, por meio do qual o meio não compreende as células de cultura celular, e a configuração da temperatura e pressão do segundo biorreator para valores predefinidos, por exemplo, 20 °C e pressão atmosférica padrão. O meio no biorreator usado para determinar empiricamente a relação meio-específica é aqui referido também como uma das amostras cujo valor de pH deve ser ajustado.
[0127] Em seguida, o meio pode ser ajustado para valores de pH diferentes, aumentando ou diminuindo a concentração de CO2 no volume de gás acima do meio através de uma taxa de influxo de gás CO2 modificada, e após algum tempo (geralmente minutos ou horas) quando o meio se equilibrou (alcançou estado de equilíbrio de pH-CO2 no dado pH e temperatura e pressão predefinidas), a concentração de CO2 no volume de gás acima de dito meio (que se correlaciona com a pressão parcial de CO2 em dito estado de equilíbrio) é medida. Dita medição é realizada, por exemplo, analisando a concentração de CO2 no volume de gás acima do meio ou através da fração de volume de CO2 no efluente gasoso. Os pares adquiridos de valores de pH de equilíbrio e as concentrações de CO2 (ou os valores de efluente gasoso de CO2) medidos na amostra (biorreator ou alíquota) são plotados, isto é, representados em um sistema de coordenadas. O enredo pode ser executado automaticamente por um sistema eletrônico de processamento de dados que, além disso, pode produzir o gráfico na forma de uma impressão em papel e/ou um gráfico exibido em uma tela de exibição. O enredo também pode ser realizado manualmente. Uma curva é ajustada automaticamente ou manualmente para dito gráfico e os parâmetros que são descritivos de dita curva ajustada são calculados. Os parâmetros definem a relação meio-específica de valor de pH e concentração de CO2 de um volume de gás acima de dito meio quando dito meio está em equilíbrio de pH- CO2 a um valor de pH particular. O valor de pH é de preferência ajustado por ajuste da taxa de influxo de CO2, não pela adição de substâncias básicas ou ácidas para evitar uma modificação da composição do meio.
[0128] Após ter calculado os parâmetros, a relação específica de meio pode ser transferida para a unidade de comparação, por exemplo, através de uma interface de usuário gráfica que permite ao usuário inserir a relação manualmente, através de um meio de armazenamento portátil ou através de uma conexão de rede.
[0129] De acordo com outras formas de realização, a relação meio- específica é obtida criando múltiplas amostras na forma de alíquotas de dito meio, cada amostra possuindo um valor de pH diferente. As amostras são deixadas a uma temperatura e pressão predefinidas por algum tempo para permitir equilíbrio de pH-CO2 entre o gás e o meio líquido em cada amostra.
[0130] As amostras podem ser obtidas sequencialmente, por exemplo, alterando o valor de pH de uma única amostra e realizando medições sequenciais, ou podem ser obtidas criando múltiplas amostras de dito meio em paralelo, cada alíquota sendo ajustada para um valor de pH diferente modificando a concentração de CO2 do volume de gás acima do meio. A amostra pode ser preenchida em qualquer recipiente, permitindo a definição e medição de um valor de pH atual e permitindo a modificação da concentração de CO2 e a medição de uma concentração de CO2 ou taxa de efluente gasoso de CO2 em estado de equilíbrio. Preferencialmente, o valor de pH nas respectivas amostras é ajustado adaptando a taxa de influxo de CO2 e, portanto, a concentração de CO2 na fase gasosa de um biorreator de forma a que o valor do pH se adapte adequadamente. Isto pode ser vantajoso uma vez que uma modificação da composição do meio (exceto o produto de dissociação do CO2 dissolvido) não muda quando se utiliza CO2 em vez de ácidos ou bases para a adaptação do pH.
[0131] De acordo com algumas formas de realização, a equação PPHM1(CO2) = REL-M1(CO2) é uma equação linear de acordo com PPHM1(CO2) = a1 x pH + a2. Neste caso, os parâmetros a1 e a2 são os parâmetros derivados da curva ajustada. O PPHM1(CO2) indica o valor de pH previsto em um meio em estado de equilíbrio com um volume de gás com a concentração de CO2 particular utilizada como entrada para dita equação.
[0132] De acordo com outras formas de realização, a equação PPHM1(CO2) = REL-M1(CO2) é uma equação polinomial de acordo com PPHM1(CO2) = b1 x pH2 + b2 x pH + b3. Nesse caso, os parâmetros b1, b2 e b3 são os parâmetros derivados da curva ajustada.
[0133] Determinar empiricamente a relação meio-específica e os parâmetros meio-específicos correspondentes pode ter o efeito benéfico que, mesmo no caso de a composição exata do meio não ser conhecida (o que é geralmente o caso de muitos meios no mercado), o impacto de um valor de pH particular na concentração de CO2 de equilíbrio em um volume de ar em equilíbrio de pH-CO2 com dito meio pode ser determinado experimentalmente. Assim, um valor de pH absoluto pode ser calculado e pode ser usado para calibrar um dispositivo de medição de pH também quando se utilizam tipos de meios cuja composição não é conhecida.
[0134] De acordo com as formas de realização, as células das culturas celulares são células procarióticas ou eucarióticas, em particular células de cultura celular de mamífero.
[0135] De acordo com as formas de realização, o segundo biorreator difere do primeiro biorreator em relação a uma ou mais das seguintes características: a) o volume de gás no biorreator; b) o volume do meio no biorreator; c) o número de Reynolds do biorreator; d) o número de Newton do biorreator; e) as dimensões do biorreator; f) características geométricas do biorreator e/ou defletores do biorreator; g) a configuração do agitador; h) a taxa de agitação; i) o coeficiente volumétrico de transferência de massa para oxigênio (kLa) do biorreator; j) taxa de influxo de gás total e/ou taxa de influxo de O2 e/ou taxa de influxo N2 e/ou taxa de influxo de CO2; k) entrada de energia; l) pressão no biorreator; m) tempo de retenção de bolha de gás no meio; n) tamanho e distribuição de bolha de gás no meio; o) velocidade de superfície; p) um parâmetro calculado como uma derivada de um ou mais dos parâmetros (a)-(o); q) a localização geográfica dos dois biorreatores (por exemplo, países, cidades, edifícios diferentes).
[0136] O parâmetro “entrada de energia”, como aqui utilizado, especifica a quantidade de entrada de energia de um agitador de um biorreator. Diferentes configurações de agitador podem ter diferentes entradas de energia com agitação idêntica ou velocidades periféricas idênticas. A entrada de energia a velocidades de agitação idênticas pode depender da viscosidade do meio.
[0137] Ao comparar as concentrações de efluente gasoso de CO2, o estado de calibração dos dispositivos de medição de pH de dois biorreatores pode ser facilmente comparado: concentrações de CO2 idênticas no efluente gasoso indicam a calibração idêntica de dispositivos de medição de pH de diferentes biorreatores, mesmo no caso de ditos biorreatores possuírem diferentes números de Reynolds e/ou Newton, possuírem uma velocidade ou configuração diferente do agitador ou similar.
[0138] De acordo com as formas de realização, a unidade de comparação recebe uma terceira concentração de CO2 e um terceiro valor de pH. A terceira concentração de CO2 é uma concentração de CO2 de um terceiro volume de gás acima do meio no segundo biorreator. A terceira concentração de CO2 e o terceiro valor de pH são medidos em um terceiro tempo. O terceiro tempo é um tempo em que o meio no segundo biorreator está em estado de equilíbrio de pH-CO2 a uma temperatura e pressão predefinidas com o terceiro volume de gás e após dito estado de equilíbrio ser modificado pelo metabolismo da cultura celular no segundo biorreator. O terceiro valor de pH é um valor medido fornecido pelo segundo dispositivo de medição de pH.
[0139] Então, a unidade de comparação recebe uma quarta concentração de CO2 e um quarto valor de pH. A quarta concentração de CO2 é uma concentração de CO2 de um quarto volume de gás acima do meio no primeiro biorreator. A quarta concentração de CO2 e o quarto valor de pH são medidos em um quarto tempo. O quarto tempo é um tempo em que o meio no primeiro biorreator está em estado de equilíbrio de pH-CO2 à temperatura e pressão predefinidas com o primeiro volume de gás e após dito estado de equilíbrio ser modificado pelo metabolismo da cultura celular no primeiro biorreator. Por exemplo, após algumas horas ou mesmo dias, algumas células começam a excretar substâncias, por exemplo, lactato, no meio, o que altera o pH e/ou a composição do meio. O quarto valor de pH é um valor medido fornecido pelo primeiro dispositivo de medição de pH. O tempo decorrido entre o terceiro tempo e a inoculação do segundo biorreator é idêntico ao tempo decorrido entre o quarto tempo e a inoculação do primeiro biorreator.
[0140] Além disso, a unidade de comparação recebe uma segunda taxa de absorção de oxigênio medida da cultura celular no segundo biorreator no terceiro tempo e recebe uma primeira taxa de absorção de oxigênio medida da cultura celular no primeiro biorreator no quarto tempo.
[0141] Caso a segunda e a primeira taxa de absorção de oxigênio sejam idênticas, a unidade de comparação compara o terceiro e o quarto valor de pH e compara a terceira e a quarta concentração de CO2 para determinar se o segundo e o primeiro dispositivo de medição de pH estão calibrados de forma diferente ou para determinar se o segundo e o primeiro dispositivo de medição de pH produzem diferentes valores de pH devido aos efeitos de deslocamento de um processo de amostragem realizado para medir o terceiro ou o quarto valor de pH em uma amostra do meio de um dentre o segundo e o primeiro biorreatores respectivos.
[0142] O segundo e o primeiro dispositivo de medição de pH são determinados a serem calibrados de forma diferente ou são determinados a produzir diferentes valores de pH devido aos efeitos de deslocamento de um processo de amostragem no caso de ocorrer uma das seguintes situações: - a terceira e a quarta concentração de CO2 são idênticas e o terceiro e quarto valor de pH diferem um do outro por mais do que um valor limite; ou - o terceiro e o quarto valor de pH são idênticos e a terceira e a quarta concentração de CO2 diferem uma das outra por mais do que um valor limite adicional.
[0143] As formas de realização da invenção assumem que, no caso de a temperatura e a pressão serem idênticas no segundo e primeiro biorreator e, no caso em adição, a taxa de absorção de oxigênio ser idêntica, então as diferenças nos valores de pH medidos resultam de erros de calibração ou efeitos de deslocamento de um processo de amostragem para medir um valor de pH.
[0144] Ditas características podem ser particularmente vantajosas, uma vez que permitem determinar se dois dispositivos de medição de pH são calibrados de forma diferente ou apresentam efeitos de deslocamento de amostragem mesmo no caso de o metabolismo das células ter começado a modificar o estado de equilíbrio de pH-CO2 de um biorreator, por exemplo, excretando lactato (e sem tomar amostras para medições de pH fora de linha (offline). Observou-se que, muitas vezes, a taxa de absorção de oxigênio das células se correlaciona com o estado de uma cultura celular específica, então no caso de o OUR das culturas celulares em dois biorreatores ser idêntico e também as concentrações de CO2 no efluente gasoso, temperatura e pressão são idênticas, quaisquer diferenças de pH observadas são causadas por erros de calibração ou efeitos de deslocamento baseados em amostragem.
[0145] Em outro aspecto, a invenção se refere a uma unidade de comparação configurada para: - receber uma segunda concentração de CO2 e um segundo valor de pH, sendo a segunda concentração de CO2 uma concentração de CO2 de um segundo volume de gás acima de um meio no segundo biorreator, sendo a segunda concentração de CO2 e o segundo valor de pH medidos em um segundo tempo, o segundo tempo sendo um tempo em que o meio no segundo biorreator está em estado de equilíbrio de pH-CO2 a uma temperatura e pressão predefinidas com o segundo volume de gás e antes de dito estado de equilíbrio ser modificado pelo metabolismo de uma cultura celular no segundo biorreator; o segundo valor de pH sendo um valor medido fornecido por um segundo dispositivo de medição de pH acoplado operativamente a um segundo biorreator; - receber uma primeira concentração de CO2 e um primeiro valor de pH, sendo a primeira concentração de CO2 uma concentração de CO2 de um primeiro volume de gás acima de um meio no primeiro biorreator; a primeira concentração de CO2 e o primeiro valor de pH sendo medidos em um primeiro tempo, sendo o primeiro tempo um tempo em que o meio no primeiro biorreator está em estado de equilíbrio de pH-CO2 à temperatura e pressão predefinidas com o primeiro volume de gás e antes de dito estado de equilíbrio ser modificado pelo metabolismo de uma cultura celular no primeiro biorreator; o primeiro valor de pH sendo um valor medido fornecido por um primeiro dispositivo de medição de pH acoplado operativamente a um primeiro biorreator; - comparar o segundo e o primeiro valor de pH e as concentrações de CO2 para determinar se o segundo e o primeiro dispositivo de medição do pH estão calibrados de forma diferente, ou determinar se o segundo e o primeiro dispositivo de medição de pH produzem diferentes valores de pH devido aos efeitos de deslocamento de um processo de amostragem realizado para a medição do segundo ou primeiro valor de pH em uma amostra do meio de um dentre o segundo e o primeiro biorreatores respectivos.
[0146] Em outro aspecto, a invenção se refere a um sistema configurado para monitorar e/ou minimizar os desvios de um estado do primeiro biorreator a partir do estado do segundo biorreator. O sistema compreende uma unidade de controle para monitorar e/ou controlar pelo menos o primeiro e, opcionalmente, também o segundo e um ou mais biorreatores adicionais e compreende uma unidade de comparação de acordo com qualquer uma das formas de realização aqui descritas. O sistema compreende ainda pelo menos o primeiro biorreator e o primeiro dispositivo de medição de pH. A unidade de controle está configurada para monitorar e/ou controlar um estado de uma cultura celular pelo menos no primeiro biorreator, usando assim valores de pH repetidamente medidos pelo primeiro dispositivo de medição de pH.
[0147] De acordo com as formas de realização, o sistema compreende ainda o segundo biorreator, por meio do qual o segundo e o primeiro biorreatores estão localizados em regiões geográficas diferentes e opcionalmente acoplados à unidade de comparação através de uma rede, por exemplo, a internet, para transmitir as concentrações de CO2 e os valores de pH.
[0148] De acordo com as formas de realização, o segundo tempo é um tempo antes do segundo biorreator ser inoculado com uma cultura celular. O segundo tempo também pode ser um tempo na ou após a inoculação do segundo biorreator com a cultura celular e antes do metabolismo de dita cultura celular modificar o valor de pH do meio no segundo biorreator.
[0149] O primeiro tempo é um tempo antes de o primeiro biorreator ser inoculado com uma cultura celular. Alternativamente, o primeiro tempo é um tempo na ou após a inoculação do primeiro biorreator com a cultura celular e antes do metabolismo de dita cultura celular modificar o valor de pH do meio no primeiro biorreator.
[0150] Um “perfil”, tal como aqui utilizado, é uma representação da variação em um valor de parâmetro versus tempo.
[0151] Um “tanque”, tal como aqui utilizado, é um recipiente para reter, transportar ou armazenar líquidos. Um tanque pode ser, por exemplo, um biorreator ou um tanque de coleta ou de transporte que compreende o meio, cultura celular e produtos de reação de um biorreator. Um tanque também pode ser uma caixa de calibração que é preenchida com meio isento de células e é usada para calibrar um dispositivo de medição de pH.
[0152] Uma “caixa de calibração”, tal como aqui utilizada, é um tanque com um meio conhecido, por meio do qual o tanque é acoplado operativamente a um sensor de CO2 e está configurado para alojar temporariamente um ou mais dispositivos de medição de pH para calibrar os dispositivos de medição de pH usando a concentração de efluente gasoso de CO2 medida pelo sensor. Por exemplo, a caixa de calibração pode ser um biorreator que atualmente não é usado para cultivar uma cultura celular, mas é usado exclusivamente ou predominantemente para a calibração de dispositivos de medição de pH. Alternativamente, a caixa de calibração pode ser um recipiente de propósito especial, em particular um recipiente portátil que pode ser transportado por uma pessoa para diferentes locais para calibrar os medidores de pH em diferentes laboratórios. A caixa de calibração compreende um meio com propriedades conhecidas (temperatura atual, pressão, relação específica de meio conhecida ou composição conhecida no caso de meios tamponados puramente de bicarbonato) e compreende um sensor de CO2 no volume de gás acima do meio ou no efluente gasoso da caixa de calibração. Ela compreende ainda uma abertura para inserir e remover facilmente um dispositivo de medição de pH e pode compreender um ou mais dispositivos de fixação para fixar temporariamente um ou mais dispositivos de medição de pH na caixa de calibração, de modo que estejam pelo menos parcialmente cercados pelo meio na calibração caixa.
[0153] Uma temperatura e pressão “predefinidas”, tal como aqui utilizado, especifica uma temperatura e pressão que é controlada ou pelo menos conhecida por um operador do primeiro e/ou segundo tanque ou que é controlada por, ou pelo menos, “conhecida” por uma lógica de programa configurada para operar o primeiro e/ou o segundo tanque ou os dispositivos de medição de pH neles contidos. Assim, a temperatura e a pressão “predefinidas” também podem ser chamadas de temperatura e pressão “determinadas”. Pode ser necessário garantir que o primeiro e o segundo valor de pH e o primeiro e o segundo valor de CO2 sejam medidos à mesma dada temperatura e pressão.
[0154] Uma “unidade de comparação”, tal como aqui utilizada, é uma peça de lógica de programa, por exemplo, um programa ou módulo de aplicação, um chip de computador ou outra peça de hardware ou firmware que é configurado para receber e processar um ou mais valores de pH medidos e uma ou mais concentrações de CO2 medidas no efluente gasoso de um tanque para determinar se um erro de medição de pH ocorreu. Por exemplo, a unidade de comparação pode ser um módulo de programa que faz parte ou interopera com um software de calibração ou um software de monitoramento ou controle de biorreator.
[0155] Um dispositivo de medição de pH que é “acoplado operativamente” a um tanque pode ser, por exemplo, um dispositivo de medição de pH que está permanentemente ou temporariamente localizado dentro do tanque e está configurado para realizar medições de pH em linha (online).
[0156] Um “biorreator”, tal como aqui utilizado, é um recipiente no qual é realizado um processo químico que envolve organismos ou substâncias bioquimicamente ativas derivadas de tais organismos. Este processo pode ser, por exemplo, aeróbico ou anaeróbico. Existe uma pluralidade de tipos de biorreatores diferentes que variam em forma (por exemplo, cilíndrica ou outra), tamanho (por exemplo, mililitros, litros a metros cúbicos) e material (aço inoxidável, vidro, plástico etc.). De acordo com as formas de realização, o biorreator é adaptado para cultivar células ou tecido em culturas celulares. Dependendo da forma de realização e/ou do modo de operação, um biorreator pode ser biorreator não contínuo, biorreator não contínuo alimentado ou biorreator contínuo (por exemplo, um modelo contínuo de reator de tanque agitado). Um exemplo de biorreator contínuo é o quimiostato.
[0157] Uma “medição em linha (online)“, tal como aqui utilizado, é um processo de obtenção de um valor de medição que é descritivo das características de estado de um biorreator ou de uma cultura celular contida no mesmo, pelo que a duração necessária para realizar a medição é menor que o tempo durante o qual ditas características mudam significativamente. Uma mudança significativa pode ser uma mudança em mais do que um valor limite predefinido. Por exemplo, uma mudança em mais de 5% pode ser considerada como uma mudança significativa. O limite pode variar para diferentes características. Medições em linha (online) podem permitir o controle de um biorreator em tempo real.
[0158] Uma “medição fora de linha (offline)” é um processo de obtenção de um valor de medição que é descritivo das características de estado de um biorreator ou de uma cultura celular contida no mesmo, pelo que a duração necessária para realizar a medição é maior que o tempo durante o qual ditas características podem mudar significativamente. Uma mudança significativa pode ser uma mudança em mais do que um valor limite predefinido. Um exemplo típico para uma medição fora de linha (offline) é a amostragem automatizada, semi-automatizada ou manual de um meio, por exemplo, para medir um valor de pH atual. As medições fora de linha (offline) são baseadas em um processo de amostragem descontínuo. Como as características do biorreator podem, entretanto, terem mudado desde que a amostra foi tomada, o controle do biorreator com base em dados de medição fora de linha (offline) tende a ser de baixa qualidade devido a tempos de latência significativos entre o momento de medição e o momento da realização de uma operação de controle respectiva.
[0159] Uma mudança significativa pode ser uma mudança em mais do que um valor limite predefinido, por exemplo 2% ou qualquer outro valor percentual, dependendo da respectiva característica de estado. Um exemplo típico para uma medição fora de linha (offline) é a amostragem automatizada, semi-automatizada ou manual de uma sonda do meio, por exemplo, para medir um valor de pH atual para calibrar um dispositivo de medição de pH ao iniciar um biorreator.
[0160] Um processo de amostragem descontínuo para obter o valor de medição de uma amostra pode ter a desvantagem de que as características do biorreator possam, entretanto, ter mudado. Assim, controlar o biorreator com base em dados de medição fora de linha (offline) tende a ser de baixa qualidade devido a tempos de latência significativos entre o momento de medição e o momento da realização de uma operação de controle respectiva.
[0161] Um “dispositivo de medição de pH” ou “medidor de pH”, tal como aqui utilizado, é um dispositivo e/ou substância utilizada para medir um valor de pH atual em um meio. Um medidor de pH pode ser, por exemplo, um indicador de pH (como fenolftaleína) - na forma de uma solução ou tiras de pH - ou um aparelho potenciométrico. De acordo com as formas de realização preferidas, o medidor de pH é um medidor de pH contínuo, isto é, um medidor de pH capaz de medir de forma contínua e repetida o pH do meio de um biorreator sem ter que extrair amostras e sem ter que inserir dito medidor de pH no meio para cada medida individual. Por exemplo, um medidor de pH pode ser um voltímetro preciso, conectado ao meio e a um eletrodo de referência, e dimensionado de forma a que não exiba o potencial medido, mas sim o valor de pH pronto. Preferencialmente, o medidor de pH é imerso no meio e é usado para medir repetidamente o valor de pH atual no meio durante todo o tempo enquanto se cultivam células no biorreator. Por exemplo, o medidor de pH pode medir um valor de pH atual a cada minuto, ou a cada 30 minutos, ou a cada hora. No medidor de pH típico de hoje, o eletrodo de referência é estabelecido no eletrodo de pH, o que torna o dispositivo compacto.
[0162] Um “dispositivo de medição de CO2”, “sensor de CO2”, “medidor de CO2” ou “analisador de CO2”, tal como aqui utilizado, é um dispositivo usado para medir uma concentração de CO2 atual em um volume de gás, por exemplo, o volume de gás acima do meio de um biorreator ou o efluente gasoso de um biorreator. De acordo com as formas de realização, a concentração de CO2 atual do segundo e/ou primeiro biorreator é medida por um medidor de efluente gasoso de CO2 contínuo, isto é, um dispositivo capaz de medir a concentração de CO2 atual no efluente gasoso de um biorreator repetidamente sem ter que inserir ou substituir um módulo de hardware no biorreator ou seu tubo ou tubos de efluente gasoso conectados para cada medida de concentração de CO2. O uso de dispositivos de medição de pH contínuos e/ou medidores de efluente gasoso de CO2 contínuos pode ser vantajoso, uma vez que as respectivas medições podem ser realizadas facilmente e repetidamente sem causar efeitos de deslocamento e/ou sem a necessidade de tomar uma amostra do meio. Muitos biorreatores existentes já compreendem um ou mais medidores de pH imersos e/ou compreendem ou são acoplados com dispositivos de medição capazes de medir a concentração de CO2 e/ou a taxa de efluente gasoso de CO2.
[0163] Dependendo da forma de realização, o biorreator (ou biorreator de referência) compreende uma única linha ou tubo de influxo de gás ou múltiplas linhas ou tubos de influxo de gás. Por exemplo, uma única linha ou tubo de influxo de gás pode ser usado para distribuir ar ambiente ou ar comprimido (já expandido) a partir de fornecedores especiais para o biorreator (biorreator de referência). Dito ar ambiental ou ar comprimido pode consistir em uma mistura de gases, em particular N2, O2 e CO2, que é típico da atmosfera terrestre ou ter uma composição diferente. Além ou, alternativamente, a única linha ou tubo de influxo de gás ou qualquer uma das outras linhas ou tubos de influxo de gás pode ser usada para fornecer gases individuais, tais como N2, O2 e CO2 ao biorreator, por exemplo, para controlar o crescimento celular.
[0164] De acordo com as formas de realização, um ou cada um dos dois biorreatores, respectivamente, compreende um micro-pulverizador (microsparger) para gerar bolhas de gás muito finamente dispersas a partir do gás de influxo para acelerar o estabelecimento de um equilíbrio de pH-CO2 entre o meio e o volume de gás no biorreator. Por exemplo, um micro-pulverizador pode ser usado para uma mistura de gás de influxo ou para cada componente de gás de influxo individual separadamente. Além disso, ou alternativamente, um ou cada um dos dois biorreatores é configurado e operado de tal modo que o dióxido de carbono e um ou mais outros gases (por exemplo, nitrogênio, oxigênio e/ou ar) são adicionados juntos, simultaneamente, ao biorreator como uma mistura de gás. Por exemplo, todos os gases de influxo podem ser introduzidos no biorreator como mistura de gás, por exemplo, através de uma abertura de tubo submersa ou de um micro-pulverizador.
[0165] Preferencialmente, todos os gases do processo são inseridos no biorreator através de um micro-pulverizador e/ou na forma de uma mistura de gás no caso de o volume do biorreator estar abaixo de um volume limite de, por exemplo, 400 litros ou, por exemplo, 200 litros.
[0166] De acordo com as formas de realização, a taxa de aeração e o tamanho de bolha dos gases de influxo no meio do biorreator são escolhidos de tal modo que todas as bolhas de gás atingem o equilíbrio de pH-CO2 com o meio antes de deixar o biorreator ou são completamente dissolvidas no meio.
[0167] Ditas características podem ser vantajosas à medida que asseguram que as bolhas de gás atingem o estado de equilíbrio antes de o seu teor de gás deixar o biorreator: um micro-pulverizador gera bolhas de gás muito finamente dispersas do gás de influxo, acelerando assim o estabelecimento de um equilíbrio de pH-CO2 entre o meio e o volume de gás no biorreator. A entrada do gás CO2 como uma mistura de gás evita a situação de que a taxa de transição de CO2 de uma bolha de gás CO2 puro no meio seja maior do que a taxa de transição de CO2 do meio para, por exemplo, bolhas de ar ou N2 (a taxa de transição pode depender da quantidade de diferença de concentração de CO2 entre o meio e diferentes tipos de bolhas). Assim, ditas medidas garantem a comparabilidade do estado dos biorreatores em uma ampla gama de volumes de biorreator, incluindo volumes abaixo de, por exemplo, 400 litros.
[0168] Um “perfil”, tal como aqui utilizado, é uma representação da variação em um valor de parâmetro versus tempo.
[0169] O “equilíbrio de pH-CO2” indica um estado de um sistema que compreende uma solução aquosa (por exemplo, um meio de cultura celular) e um volume de ar acima de dita solução (por exemplo, o volume de gás em um biorreator) cujo valor de pH e pressão parcial de CO2 estão em equilíbrio químico de acordo com a equação de Henderson-Hasselbalch. A pressão parcial de CO2 corresponde à fração de gás CO2 no volume de gás total acima do meio. A equação de Henderson-Hasselbalch descreve a relação de pH como medida de acidez com a constante de dissociação de ácido (pKa), em sistemas biológicos e químicos. Se um gás compreendendo CO2 estiver em contato com um líquido aquoso, por exemplo, um meio de cultura, pelo menos uma pequena fração do CO2 dissolve-se em dito líquido. À temperatura ambiente, por exemplo, a solubilidade do dióxido de carbono é de cerca de 90 cm3 de CO2 por 100 ml de água (cl/cg = 0,8). Qualquer gás solúvel em água torna-se mais solúvel à medida que a temperatura diminui. Uma pequena fração (aproximadamente 0,2 - 1%) do CO2 dissolvido é convertida em H2CO3. A maior parte do CO2 permanece como CO2 molecular solvatado. Este processo pode ser descrito pelas seguintes fórmulas:
[0170] Equilíbrio de ácido carbônico (H2CO3): [CO2] x [H2O] ←→ [H2CO3] ←→ [H+] x [HCO3-] [H+] x [HCO3-] = K x [CO2] x [H2O], em que K = constante de equilíbrio pH = pK + log ([HCO3-] / [CO2]).
[0171] Uma “fração de volume de CO2”, tal como aqui utilizado, é a fração de gás CO2 em um volume de gás total. A unidade pode ser, por exemplo, vol.%. Também é referido como “concentração de CO2” de um volume de gás, sendo a concentração especificada em vol.%.
[0172] Um “meio” ou “meio de cultura celular” é um líquido ou gel projetado para suportar o cultivo e, tipicamente, o crescimento de microrganismos ou células, ou pequenos vegetais como o musgo Physcomitrella. Existem diferentes meios para cultivar diferentes tipos de células. Tipicamente, um meio é uma solução à base de água compreendendo uma mistura de uma ou mais substâncias tais como sal(is), carboidratos, oligoelementos, peptídeos e/ou proteínas. Existe uma pluralidade de diferentes meios no mercado, por exemplo, para cultura celular de tipos de células específicas derivados de vegetais ou animais e cultura microbiológica para cultivar microrganismos, tais como bactérias ou leveduras. Um meio pode ser, por exemplo, um meio nutriente, por exemplo, um meio LB (Lysogeny Broth), um meio mínimo, um meio seletivo, um meio diferencial ou um meio enriquecido. Alguns meios podem exigir um ambiente de CO2 de, por exemplo, 5-10% de CO2 para manter o pH fisiológico.
[0173] De acordo com algumas formas de realização, a expressão “dois meios sendo o mesmo” implica que os dois meios (por exemplo, o meio no biorreator de referência, por um lado, e o meio no biorreator monitorado e/ou controlado, por outro lado) compreendem - dados uma pressão, temperatura e concentração de CO2 particulares no volume de gás acima de dito meio - a mesma composição e concentração de compostos e solventes orgânicos e inorgânicos e/ou foram fabricados usando os mesmos protocolos e condições de fabricação dentro do contexto de precisão de medição.
[0174] De acordo com algumas formas de realização, dita expressão implica que os dois meios podem diferir em relação a qualquer um dos ditos critérios (composição, concentração, protocolo de fabricação) somente na medida em que dita diferença (a uma determinada temperatura, pressão e concentração de CO2 no volume de gás acima de dito meio) não tem, ou aproximadamente, nenhum impacto no equilíbrio de pH-CO2 de dito meio em uma pluralidade de valores de pH diferentes e na medida em que as relações meio-específicas derivadas empiricamente de ditos dois meios, respectivamente, são idênticas.
[0175] Para “cultivar uma cultura celular”, tal como aqui utilizado, tipicamente significa que a cultura celular é cultivada, isto é, o número das células da cultura celular aumenta. Em algumas ocasiões, no entanto, o número de células também pode estagnar ou mesmo diminuir.
[0176] Nas seguintes formas de realização da invenção são explicados, em maior detalhe, apenas a título de exemplo, fazendo referência às figuras, nas quais: - A Figura 1 mostra um diagrama de blocos de um sistema para monitorar e/ou controlar um ou mais biorreatores configurados para detectar um desvio de calibração do dispositivo de medição de pH ou um efeito de deslocamento de medição de pH; - A Figura 2 mostra um fluxograma de métodos para detectar desvios de calibração do dispositivo de medição de pH ou efeitos de deslocamento de medição de pH; - A Figura 3 mostra componentes de um biorreator; - A Figura 4 mostra diagramas que ilustram a dependência da concentração de CO2 no efluente gasoso de um biorreator do valor de pH; - A Figura 5 mostra um gráfico usado para obter uma relação de concentração de pH-CO2 meio-específica; - A Figura 6 mostra valores de pH de quatro biorreatores diferentes medidos pelos respectivos medidores de pH enquanto se cultiva uma cultura celular nos respectivos biorreatores; - A Figura 7 mostra a fração de CO2 medida no efluente gasoso de cada um dos quatro biorreatores; - A Figura 8a é um diagrama que mostra os perfis de estado derivados de efluente gasoso de CO2 de dois biorreatores e de um biorreator de referência; - A Figura 8b é um diagrama que mostra as diferenças de perfil de estado dos dois biorreatores da Figura 8a para dito biorreator de referência; e - A Figura 9 é um gráfico que ilustra que o processo de amostragem resulta em um desvio do valor de pH medido na amostra a partir do valor de pH no tanque e que a forma como os dispositivos de medição de pH são calibrados também tem um impacto no valor de pH medido.
[0177] A Figura 1 mostra um diagrama de blocos de um sistema (100) compreendendo uma unidade de controle (132) para monitorar e/ou controlar um ou mais biorreatores. O sistema (100) compreende uma unidade de comparação (130) para comparar valores de pH medidos e concentrações de CO2 recebidas através de uma interface (128) de dois ou mais biorreatores. A seguir, as formas de realização da invenção serão descritas fazendo referência a um método correspondente para identificar diferenças de calibração e efeitos de deslocamento de amostragem de medição de pH, tal como indicado no fluxograma da Figura 2.
[0178] A Figura 1 mostra um sistema (100) que permite a comparação em tempo real e precisa de valores de pH medidos por dispositivos de medição de pH de dois ou mais biorreatores e de concentrações de CO2 medidas por analisadores de efluente gasoso dos respectivos biorreatores para identificar diferenças de calibração e efeitos de deslocamento em dois biorreatores comparados imediatamente, sem ter que tomar amostras de meio de um dos biorreatores e sem a necessidade de usar uma solução “padrão” de um valor de pH conhecido para determinar erros de calibração ou efeitos de deslocamento.
[0179] O sistema (100) compreende um processador (110), uma memória principal (112) e um meio de armazenamento não transitório (114). O meio de armazenamento compreende instruções legíveis por computador que, quando executadas pelo processador (110), fazem com que o processador execute um método para monitorar e/ou controlar automaticamente um ou mais biorreatores (102, 104, 106), tal como descrito para formas de realização da invenção.
[0180] O meio de armazenamento (114) compreende pelo menos uma estrutura de dados (136), por exemplo, um arquivo ou um registro de banco de dados, sendo indicativo de uma relação de concentração pH-CO2 que é particular para o meio M1 contido em qualquer dos biorreatores (102, 104, 106).
[0181] Além disso, o meio de armazenamento pode compreender relações meio-específicas (138) de outros meios de cultura celular M2. As relações meio-específicas (136, 138) podem ser recebidas através de uma interface de comunicação de dados (120), por exemplo, uma interface de rede, uma porta USB, uma unidade de disco CD-ROM ou similar.
[0182] O sistema (100) pode ainda compreender uma interface (126) para receber dinamicamente valores de medição atuais de um ou mais biorreatores monitorados e/ou controlados (102, 104, 106). A interface (126) também pode ser uma interface de rede, por exemplo, a Internet ou uma Intranet. Os valores de medição são, em particular, um valor de pH atual e uma concentração de CO2 atual medidos no efluente gasoso do respectivo biorreator. Uma unidade de comparação (130) utiliza os valores de medição recebidos a partir dos biorreatores monitorados e/ou controlados (102, 104, 106) para determinar se os respectivos dispositivos de medição de pH estão calibrados da mesma forma e estão livres de efeitos de deslocamento que impedem uma comparação correta dos valores de pH medidos recebidos de diferentes biorreatores. Opcionalmente, a unidade de comparação (130) também usa a relação meio-específica (136) do meio M1 como entrada para determinar se um dispositivo de medição de pH produz um valor de pH absoluto correto.
[0183] O primeiro biorreator (104) é inicializado preenchendo o primeiro biorreator com o meio livre de células M1 e iniciando continuamente a adição de gás, por exemplo, transportando ar ambiente e/ou seus componentes individuais (N2, O2 e/ou CO2) para o biorreator e, opcionalmente, também iniciando continuamente a adição de líquidos (o meio livre de células, opcionalmente líquidos adicionais, como alimentação etc.). Além disso, os agitadores podem ser iniciados. O primeiro biorreator é operado, por meio disso, a uma temperatura e pressão que são idênticas à temperatura e pressão utilizadas para iniciar o segundo biorreator.
[0184] Após algum tempo (geralmente minutos ou horas), o meio no primeiro biorreator e o volume de ar no primeiro biorreator acima do meio terão atingido o estado de equilíbrio de pH-CO2 e os primeiros valores de concentração de CO2 e pH são medidos no meio e no efluente gasoso do primeiro biorreator. Para ajustar o meio no primeiro biorreator a um valor de pH particular, a taxa de influxo de CO2 para o primeiro biorreator pode ser modificada em conformidade, porque a concentração de CO2 no volume de gás tem um impacto no valor de pH do meio.
[0185] Em uma segunda etapa (202), a unidade de comparação (130) recebe uma segunda concentração de CO2, CO2-R-M-ti, e um segundo valor de pH, pHR-M-ti. A segunda concentração de CO2 é uma concentração de CO2 de um segundo volume de gás acima de um meio em um segundo biorreator (102). A segunda concentração de CO2 e o segundo valor de pH sendo medidos em um segundo tempo ti. O segundo tempo é um tempo em que o meio no segundo biorreator está em estado de equilíbrio de pH-CO2 a uma temperatura e pressão predefinidas (por exemplo, 20 °C e pressão atmosférica normal) com o segundo volume de gás e antes de dito estado de equilíbrio ser modificado pelo metabolismo de uma cultura celular no segundo biorreator. Por exemplo, o segundo instante ti é um tempo antes do biorreator (102) ser inoculado com a cultura celular ou um tempo logo após a inoculação, de modo que o metabolismo das células não tem impacto no equilíbrio de pH-CO2 no biorreator (102) ainda. O segundo valor de pH é um valor medido fornecido por um segundo dispositivo de medição de pH em linha (online) ou fora de linha (offline) (142) acoplado operativamente ao segundo biorreator (102). No exemplo representado, o segundo dispositivo de medição de pH é um medidor de pH em linha (online), imerso no meio M1 do segundo biorreator (102).
[0186] Em uma etapa seguinte (204), a unidade de comparação recebe uma primeira concentração de CO2, CO2B1-M-ti, e um primeiro valor de pH, pH B1-M-ti. A primeira concentração de CO2 é uma concentração de CO2 de um primeiro volume de gás acima de um meio em um primeiro biorreator que pode ser medida, por exemplo, no efluente gasoso do primeiro biorreator (104). A primeira concentração de CO2 e o primeiro valor de pH são medidos em um primeiro tempo. O primeiro tempo é um tempo em que o meio no primeiro biorreator (104) está em estado de equilíbrio de pH-CO2, à temperatura e pressão predefinidas, com o primeiro volume de gás e antes de dito estado de equilíbrio ser modificado pelo metabolismo de uma cultura celular no primeiro biorreator .
[0187] Por exemplo, um dispositivo analisador de CO2 (122), também referido como “sensor de dióxido de carbono”, pode ser usado para medir repetidamente a concentração de CO2 no efluente gasoso. Exemplos comuns para sensores de CO2 são sensores de gás infravermelho (NDIR) e sensores de gás químicos. Os sensores NDIR são sensores espectroscópicos para detectar CO2 em um ambiente gasoso por sua absorção característica. Alternativamente, o sensor de CO2 pode ser um sensor microeletromecânico.
[0188] O primeiro valor de pH é um valor medido fornecido por um primeiro dispositivo de medição de pH (108) acoplado operativamente ao primeiro biorreator (104). O meio no segundo e no primeiro biorreator são os mesmos.
[0189] Em algumas formas de realização, o segundo biorreator (102), também referido como “biorreator de referência”, é usado para cultivar uma cultura celular dias, semanas ou mesmo anos antes do primeiro biorreator (104) ser inoculado de modo a cultivar uma cultura celular sob basicamente as mesmas condições como no biorreator de referência antes. Neste caso, o segundo e o primeiro tempo podem ficar anos separados, mas representam respectivamente um tempo em que o biorreator respectivo é inicializado e não compreende (ainda) uma cultura celular com impacto no equilíbrio de pH-CO2. Neste caso, o segundo valor de pH e a segunda concentração de CO2 são medidos antes do primeiro valor de pH e da primeira concentração de CO2 serem medidos. Em outras formas de realização, o segundo e o primeiro biorreator são operados em paralelo e o segundo e o primeiro valores de pH e CO2 podem ser medidos e recebidos pela unidade de comparação aproximadamente ao mesmo tempo.
[0190] Na etapa (206), a unidade de comparação compara o segundo e o primeiro valor de pH e as concentrações de CO2 para determinar se o segundo e o primeiro dispositivo de medição de pH estão calibrados de forma diferente.
[0191] A unidade de comparação determinará que o segundo e o primeiro dispositivo de medição de pH estão calibrados de forma diferente ou que, pelo menos um de ditos dispositivos, é afetado por um efeito de deslocamento (causado pelo procedimento de amostragem) no caso: - a segunda e a primeira concentração de CO2 são idênticas e o segundo e primeiro valor de pH diferem um do outro por mais do que um valor limite; ou - o segundo e o primeiro valor de pH são idênticos e a segunda e a primeira concentração de CO2 diferem uma da outra por mais do que um valor limite adicional.
[0192] Caso o segundo e o primeiro dispositivo de medição de pH sejam ambos dispositivos de medição em linha (online), não existem quaisquer efeitos de deslocamento causados por um processo de amostragem. Neste caso, a unidade de comparação determina que há uma diferença de calibração entre o segundo e o primeiro dispositivo de medição de pH e pode produzir uma mensagem de aviso e/ou um delta do segundo e primeiro valor de pH no exibidor (134). O dispositivo de exibição pode ser, por exemplo, um monitor de computador ou um monitor de um smartphone. Assim, um operador pode impedir a inoculação do primeiro biorreator e realizar uma recalibração ou troca do primeiro dispositivo de medição de pH. Também é possível que o moderador ou a unidade de comparação reconfigure o primeiro dispositivo de medição de pH de forma a que ele produza um valor idêntico ao segundo valor de pH para o meio no primeiro biorreator cuja concentração de CO2 de equilíbrio na fase (de efluente) gasoso foi determinado a ser idêntica à concentração de CO2 de equilíbrio na fase (de efluente) gasoso do segundo biorreator. Em algumas formas de realização, a unidade de controle (132) controla um ou mais parâmetros de um ou mais dos biorreatores (102, 104, 106) de tal modo que o a diferença de condições ambientais para as células no primeiro biorreator para as condições ambientais para as células no segundo (referência) biorreator é minimizada. A unidade de controle pode ser, por exemplo, um módulo de software e/ou hardware que está operacionalmente acoplado à unidade de comparação (130) para receber os resultados da comparação. A unidade de controle é capaz de controlar a configuração e operação de um ou mais processos e parâmetros de engenharia. Por exemplo, a unidade de controle (132) pode ser operável para aumentar ou diminuir o influxo de líquidos com impacto no valor de pH, por exemplo, pode aumentar ou diminuir o influxo de um ácido cítrico ou de uma solução de NaOH 1M e/ou pode aumentar ou diminuir o influxo de gás CO2 para modificar o valor de pH no meio de um biorreator.
[0193] O meio M1 pode ser, por exemplo, modificação de Kaighn do meio Ham F-12 (Kaighn's Modification of Ham's F-12 medium) compreendendo, por exemplo, putrescina, timidina, hipoxantina, zinco e níveis mais altos de todos os aminoácidos e piruvato de sódio. Essas adições permitem que o meio seja complementado com níveis muito baixos de soro ou componentes definidos, para alguns tipos de células. O meio Ham F-12K (Kaighn) não contém proteínas ou fatores de crescimento e, portanto, muitas vezes é complementado com fatores de crescimento e Soro Bovino Fetal (FBS - Fetal Bovine Serum) que podem ser otimizados para uma linhagem celular particular. O meio Ham F-12K (Kaighn) usa um sistema tampão de bicarbonato de sódio (2,5 g/L). O meio M2 pode ser um meio LB, e podem existir perfis de referência para uma pluralidade de outros meios M3, M4, por exemplo, para cultivar bactérias ou vegetais para uma variedade de propósitos e “projetos” correspondentes.
[0194] O sistema (100) compreende a unidade de comparação e um ou mais biorreatores (104, 106) que devem ser monitorados e/ou controlados por uma unidade de controle (132) acoplada operativamente ao um ou mais biorreatores. Como pode ser inferido a partir da Figure 1, as dimensões e os parâmetros de engenharia (taxa de agitação e configuração, tamanho de bolha, dimensão, volume do meio etc.) dos biorreatores monitorados ou controlados podem diferir uns dos outros e/ou podem diferir dos respectivos parâmetros do biorreator de referência. Os biorreatores (102, 104, 106) podem estar localizados em diferentes regiões geográficas. Um ou mais dos biorreatores enviam dados de monitoramento (pH e concentração de CO2 atuais no efluente gasoso e/ou taxas de efluente gasoso de CO2) para a unidade de comparação (130) e/ou a unidade de controle (132) e, opcionalmente, também recebem dados de controle a partir da unidade de controle (132) ou recebem dados de controle para reconfigurar, recalibrar ou trocar um dispositivo de medição de pH a partir da unidade de comparação. O biorreator de referência pode, mas não tem de ser acoplado ao sistema (100). É suficiente que o segundo valor de concentração de CO2 e pH coletados a partir do biorreator de referência sejam acessíveis pela unidade de comparação (130) ao iniciar o primeiro biorreator (ou qualquer biorreator adicional (106) cujo dispositivo de medição de pH deve ser calibrado do mesmo modo que o segundo dispositivo de medição de pH e deve estar livre de quaisquer efeitos de deslocamento em relação aos valores de pH medidos pelo segundo dispositivo de medição de pH (142)). O segundo biorreator e cada um dos primeiros biorreatores (104, 106) compreendem o mesmo meio M1 e são inoculados com o mesmo tipo de cultura celular.
[0195] Preferencialmente, o biorreator monitorado e/ou controlado (104, 106) pelo menos no instante de inicialização é operado sob a mesma temperatura e pressão que o biorreator de referência. No entanto, é possível que, enquanto se opera o biorreator (104, 106), a temperatura e/ou a pressão sejam modificadas para minimizar as diferenças de estado em relação ao estado da cultura celular no biorreator de referência.
[0196] A Figura 3 mostra uma forma de realização de um biorreator (102, 104, 106). O biorreator é acoplado a um segundo tubo ou mangueira para transferir o meio fresco e, opcionalmente, um ou mais líquidos adicionais para o biorreator. O biorreator é adicionalmente acoplado a uma saída de fluxo e a um ou mais primeiros tubos ou mangueiras para transferir gases, por exemplo, ar ambiente e/ou gás N2 e/ou gás O2 e/ou gás CO2 para o biorreator. Além disso, o biorreator é acoplado a um terceiro tubo ou mangueira para o efluente gasoso. O primeiro tubo ou mangueira pode compreender um sensor (144) para determinar uma taxa de influxo de gás total atual. O terceiro tubo ou mangueira pode compreender um sensor (122), por exemplo, um analisador de efluente gasoso de CO2, para medir seletivamente a concentração de CO2 de efluente gasoso e a quantidade de gás CO2 transferido através do terceiro tubo por unidade de tempo. De acordo com outras formas de realização, pode não haver tubos para o influxo e saída de fluxo de líquidos e os nutrientes podem ser alimentados ao biorreator por meio da adição gradual de bolo de uma solução de alimentação.
[0197] Em muitos tipos de biorreatores, os gases de influxo são alimentados (como uma mistura de gás ou através de aberturas separadas) no biorreator através de uma ou mais entradas de gás submersas. No caso de o biorreator compreender uma aeração adicional do espaço livre (headspace), a taxa de influxo de dita fração de gás de influxo de “espaço livre” e/ou a circulação de ar da fase gasosa acima do meio devem ser configuradas de modo que todos os gases alimentados no biorreator através da aeração do espaço livre atinjam equilíbrio de pH-CO2 com o meio do biorreator antes de sair do biorreator. Também no caso de a aeração do espaço livre ser o único mecanismo de aeração do biorreator, a taxa de influxo de dita fração de gás de influxo de “espaço livre” deve ser configurada de tal modo que todos os gases alimentados no biorreator atinjam o equilíbrio de pH-CO2 com o meio do biorreator antes de sair do biorreator.
[0198] Alternativamente (por exemplo, no caso de um equilíbrio de pH-CO2 dos gases de aeração do espaço livre com o meio não puder ser alcançado em tempo), a aeração adicional do espaço livre é desligada antes de medir a concentração de CO2 no efluente gasoso para executar a calibração do dispositivo de medição de pH ou a detecção de deslocamento. Isso pode permitir evitar erros de calibração que poderiam resultar a partir de um desvio da concentração de CO2 de equilíbrio na fase gasosa do biorreator causado pela aeração adicional do espaço livre.
[0199] No caso de, durante a fase de inicialização do segundo biorreator não se adicionar apenas meio fresco, mas também líquidos adicionais, tais como soluções de alimentação e/ou líquidos ácidos ou básicos, ao segundo biorreator, a mesma quantidade e composição de ditos líquidos adicionais é adicionada ao primeiro biorreator durante a inicialização para garantir que no segundo e primeiro tempo, o meio (incluindo todos os líquidos e substâncias adicionais) no segundo e primeiro biorreator seja idêntico.
[0200] A Figura 4 mostra os diagramas A, B, C e D que ilustram a dependência da concentração de CO2 no efluente gasoso de quatro diferentes biorreatores I-IV a partir do valor de pH e a independência de dita concentração de CO2 dos parâmetros de engenharia e tamanho dos respectivos biorreatores.
[0201] Os quatro diferentes biorreatores possuem as seguintes propriedades de engenharia:
[0202] Cada um de ditos biorreatores I-IV foi preenchido com um meio de cultura celular particular M1 que não compreendia quaisquer células. O valor de pH original de dito meio foi de 6,85 (ver diagrama B). Em seguida, o valor de pH foi aumentado em cada um dos biorreatores, diminuindo a concentração de CO2 no volume de gás acima de dito meio no respectivo biorreator. No início do teste e para cada um de um conjunto de valores de pH predefinidos, o meio em cada biorreator foi deixado alcançar o equilíbrio de pH- CO2 com o volume de gás acima do meio a uma temperatura e pressão predefinidas, por exemplo, 20 °C e pressão atmosférica normal. Após dito equilíbrio ser alcançado, a concentração de CO2 em vol.% do efluente gasoso total (também referido como “fração de gás CO2”, “CO2 [%]” ou “FCO2”) foi determinada para cada um de ditos quatro biorreatores (ver diagrama A mostrando, em combinação com o diagrama B, o impacto do valor do pH na concentração de CO2 medida no efluente gasoso). O diagrama 4 C) mostra o impacto do valor do pH na concentração de CO2 medida de cada um dos quatro biorreatores na forma de um gráfico de barras. O desvio máximo do CO2 [%] obtido para cada um dos quatro biorreatores foi inferior a 0,4% do efluente gasoso total do biorreator.
[0203] O diagrama 4 D) é um gráfico que compreende os valores de CO2 [%] medidos em cada um dos quatro biorreatores I-IV em cada um de um conjunto de valores de pH (6,85, 6,95, 7,05, 7,15, 7,25, 7,35) em um tempo em que o meio M1 de dito biorreator atingiu o estado de equilíbrio de pH-CO2.
[0204] Deve notar-se que o equilíbrio de pH-CO2 em um biorreator pode ser desafiado pela taxa de gás CO2 que entra e/ou deixa o biorreator, de modo que o equilíbrio de pH-CO2 pode, de fato, ser um equilíbrio dinâmico. No entanto, é possível controlar um biorreator de um modo que o equilíbrio dinâmico pH-CO2 seja estabelecido a um valor de pH particular, por exemplo, diminuindo ou aumentando a concentração de CO2 no volume de gás acima do meio no biorreator modificando a taxa de influxo de CO2 total no biorreator. Alternativamente, o valor de pH pode ser modificado pela adição de substâncias ou líquidos ácidos ou básicos.
[0205] Preferencialmente, o estado de equilíbrio de pH-CO2 dinâmico é estabelecido em um biorreator a um valor de pH particular, apenas controlando a taxa de influxo de CO2 e a taxa de saída de fluxo de gás total de uma maneira que é alcançado um valor de pH desejado. O uso da concentração de CO2 para estabelecer o equilíbrio de pH-CO2 ao invés de adicionar uma substância básica ou acida tem a vantagem de que a composição do meio não é alterada (exceto a concentração do CO2 dissolvido e seus produtos de dissociação) e, portanto, a relação específica de meio pode ser empiricamente derivada a partir do mesmo meio em diferentes valores de pH.
[0206] Em seguida, uma curva (502) é ajustada ao gráfico de modo a determinar empiricamente parâmetros para uma relação (316) específica para o meio M1 contido nos quatro biorreatores. Esta abordagem permite determinar empiricamente, para um meio de cultura celular particular, uma relação meio- específica (136) utilizada como entrada pela unidade de comparação para prever o valor de pH absoluto de um meio dado uma concentração de efluente gasoso de CO2 medida quando dito meio tem uma pressão e temperatura particular (por exemplo, 20 °C e pressão atmosférica normal), não possui quaisquer células e está em equilíbrio de pH-CO2 com a fase gasosa. A relação obtida é independente da escala do biorreator, da taxa de aeração e de outros parâmetros de engenharia.
[0207] A relação meio-específica é determinada apenas uma vez para um meio particular M1. A determinação pode ser realizada em um único biorreator, por exemplo, no segundo biorreator (102) antes do segundo biorreator ser inoculado com a cultura celular. Para aumentar a precisão, também é possível realizar a determinação em vários biorreatores ou outros recipientes, permitindo a medição de um valor de pH e uma fração de gás CO2 (concentração de CO2) e, em seguida, usar a informação obtida nos vários biorreatores ou recipientes para obter uma curva mais precisa e ajustada (502). No exemplo representado na Figura 4D e 5, foram utilizados quatro biorreatores diferentes para determinar empiricamente uma curva ajustada (502) e uma relação correspondente meio-específica entre o valor de pH de equilíbrio e a concentração de CO2 de equilíbrio.
[0208] Outro teste semelhante (não mostrado) foi realizado com quatro biorreatores com um volume de 400 L, 100 L, 2 L e 2 L e compreendendo o mesmo tipo de meio. Os biorreatores compreendiam dispositivos de medição de pH de diferentes tipos (por exemplo, sondas Knick e Mettler), compreendiam diferentes configurações de ligação de controlador (Siemens S7 vs. Sartorius DCU) e diferentes analisadores de efluente gasoso do mesmo tipo (Dasgip / Eppendorf GA4). Os dispositivos de medição de pH foram calibrados, respectivamente, utilizando tampões de calibração convencionais em dois pontos de pH conhecidos (4 e 7) antes de serem submersos no meio do respectivo biorreator. Em uma etapa seguinte, cada um dos quatro dispositivos de medição de pH foi recalibrado pelo uso de um quinto dispositivo de medição de pH pré-calibrado que foi inserido sequencialmente nos meios dos quatro biorreatores comparados. Todos os quatro dispositivos de medição de pH foram recalibrados para valor do quinto dispositivo de medição de pH. Após essa recalibração, a concentração de CO2 no efluente gasoso (valor “FCO2”) de todos os quatro biorreatores foi medida. Os quatro valores de medição de FCO2 obtidos mostraram uma diferença (“delta”) do valor máximo de todos os quatro valores para o valor mínimo de todos os quatro valores de cerca de 0,75%.
[0209] Em seguida, o desvio do controlador dos quatro biorreatores foi minimizado para estabelecer valores de pH reais comparáveis em todos os quatro biorreatores. Após essa minimização, a concentração de CO2 no efluente gasoso (“FCO2” ou “CO2[%]”) de todos os quatro biorreatores foi medida. Os quatro valores de medição de FCO2 obtidos mostraram uma diferença (“delta”) do valor máximo de todos os quatro valores para o valor mínimo de todos os quatro valores de cerca de 0,27%. Os resultados confirmaram que os biorreatores, cujos meios estão em estado de equilíbrio de pH-CO2, têm a mesma concentração de CO2 nos mesmos valores de pH independente do volume do meio, volume total, taxa de aeração e parâmetros que dependem da taxa de aeração, da velocidade do agitador e dos parâmetros que dependem de velocidade do agitador e outros parâmetros que dependem da escala, da dimensão do biorreator e similares.
[0210] Portanto, em dito estado de equilíbrio, com uma variabilidade de 0,27%, os deslocamentos de pH de menos de 0,02 unidades de escala de pH foram detectáveis neste cenário de teste. Assim, é fornecido um método altamente preciso para a calibração de dispositivos de medição de pH.
[0211] A Figura 5 é uma versão transformada do diagrama na Figura 4 D). A relação meio-específica (136) do meio M1 é uma equação PPH(pH) = REL-M1(CO2) obtida por ajustar matematicamente vários pares empiricamente determinados de um valor de pH e uma concentração de CO2 [%] respectiva na fase gasosa acima de dito meio, a concentração de CO2 na fase gasosa estando em equilíbrio de pH-CO2 com dito meio, de acordo com a equação de Henderson-Hasselbalch.
[0212] A equação derivada empiricamente ajustando uma curva linear ou polinomial ao gráfico da Figura 5 permite prever um valor de pH de um meio à temperatura predefinida e à pressão predefinida no caso de o volume de gás acima de dito meio estar em estado de equilíbrio de pH-CO2 com dito meio e possuir uma concentração de CO2 particular. A predição é específica para o meio M1 para o qual a relação foi empiricamente obtida.
[0213] O parâmetro “CO2” é um parâmetro de entrada de dita equação para inserir uma concentração de CO2 medida em uma fase gasosa estando em estado de equilíbrio de pH-CO2 com o meio de um biorreator.
[0214] “REL-M1” é um conjunto de um ou mais parâmetros a1, a2, b1, b2, b3 conectados por operadores. Os parâmetros foram obtidos ajustando as amostras do meio M1 que não possui a cultura celular para vários valores de pH diferentes, tal como descrito acima, permitindo assim que as amostras atinjam o equilíbrio de pH-CO2 à pressão e temperatura predefinidas, determinando as concentrações de CO2 de equilíbrio nos respectivos volumes de gás estando em contato com o meio nas amostras, traçando as concentrações de CO2 de equilíbrio medidas contra os respectivos valores de pH de equilíbrio das amostras para gerar o gráfico representado na Figura 5, ajustando uma curva (502) nos valores traçados e derivando os parâmetros a1, a2 ou b1, b2, b3 a partir da curva ajustada.
[0215] De acordo com algumas formas de realização, a equação PPHM1(CO2) = REL-M1(CO2) é uma equação linear de acordo com PPHM1(CO2) [%] = a1 x CO2 [%] + a2. Neste caso, os parâmetros a1 e a2 são os parâmetros derivados a partir da curva ajustada. No exemplo representado, um ajuste linear renderia a seguinte equação: PPHM1(CO2) = -0,046 x CO2 [%] + 7,45;
[0216] Neste exemplo, a1 = -0,046 e a2 = 7,45.
[0217] De acordo com outras formas de realização, a equação PPHM1(CO2) = REL-M1(CO2) é uma equação polinomial de acordo com PPHM1(CO2) = b1 x CO2 [%]2 + b2 x CO2 [%] + b3.
[0218] O uso de um ajuste polinomial tem a vantagem de ser mais preciso do que um ajuste linear, embora um ajuste linear já seja suficientemente preciso para calcular um valor de pH absoluto usando apenas a relação meio- específica (136) e uma concentração de CO2 CO2R-M-ti medida, por exemplo, no efluente gasoso de um biorreator como entrada.
[0219] A Figura 6 mostra a variação de um valor de pH medido em quatro diferentes biorreatores I-IV enquanto cultiva uma cultura celular em um meio particular M1 durante vários dias para um projeto particular de cultura celular. Preferencialmente, cada valor de pH é medido usando um dispositivo de medição de pH, por exemplo, um medidor de pH potenciométrico, imerso no meio M1 do biorreator a um equilíbrio de pH-CO2 de dito meio. Em cada biorreator, pelo menos um valor de pH atual e uma concentração de CO2 atual no efluente gasoso são medidos repetidamente antes e após a inoculação e durante todo o projeto.
[0220] Por exemplo, o projeto poderia ser o crescimento de células CHO (células de ovário de hamster chinês) durante 14 dias no meio de cultura celular M1 sob condições de crescimento celular ideais ou quase ideais até atingir uma densidade celular de cerca de 100 x 105 células/mililitro.
[0221] A Figura 7 mostra a fração de CO2 (“concentração de CO2”) medida no efluente gasoso de cada um dos quatro biorreatores cujos perfis de valor de pH são mostrados na Figura 6. Os valores de pH e as concentrações de efluente gasoso de CO2 medidos para um biorreator particular em um determinado momento no tempo depende um do outro, uma vez que a concentração de CO2 no volume de gás acima do meio influencia o valor de pH de acordo com a equação de Henderson-Hasselbalch. Além disso, o metabolismo celular pode ter um impacto tanto no valor do pH (através de metabólitos excretados como o lactato) quanto na concentração de CO2 na fase gasosa (através da degradação aeróbica de substratos).
[0222] Enquanto cultiva as células em um dos biorreatores, por exemplo, em um biorreator de referência (102), o valor de pH atual e as concentrações de efluente gasoso de CO2 atuais no biorreator de referência (102) podem ser determinados repetidamente e um valor de parâmetro derivado é calculado a partir de pelo menos ditos dois valores de parâmetro de entrada e utilizado como um parâmetro que é indicativo de um estado atual da cultura celular no biorreator de referência. É gerado um perfil de ditos valores de parâmetros derivados. Um perfil é uma representação da variação de ditos valores de parâmetros versus tempo.
[0223] A Figura 8a é um diagrama que mostra um perfil de estado de referência (402) de um biorreator de referência (102), um perfil de estado (802) de um primeiro biorreator monitorado e/ou controlado (104) e um outro perfil de estado (804) de um primeiro biorreator monitorado/controlado (106). Cada perfil de estado é indicativo do estado de um biorreator e da sua cultura celular, por meio do qual o estado em um instante particular ti é calculado como uma derivada de pelo menos um valor de pH atualmente medido e uma concentração de CO2 atualmente medida no efluente gasoso do biorreator. Todos os biorreatores R, B1 e B2 compreendem o mesmo meio M1, são operados à mesma temperatura e pressão e estão em estado de equilíbrio de pH com um respectivo volume de gás no instante t0. O instante t0 representa um momento no tempo, logo antes do biorreator respectivo ser inoculado com uma cultura celular.
[0224] No instante t0, o biorreator de referência R, também referido como “segundo biorreator”, o primeiro biorreator B1 e o terceiro biorreator B2 estão configurados e operados de modo que tenham a mesma concentração de CO2 no efluente gasoso. Os medidores de pH dos respectivos biorreatores R e B2 podem medir um valor de pH quase idêntico no instante t0. No entanto, o dispositivo de medição de pH do biorreator B1 pode medir um valor de pH diferente em t0 do que o medido pelo dispositivo de medição de pH do biorreator de referência (não mostrado). Os dispositivos de medição de pH dos três biorreatores podem ser medidores de pH em linha (online) imersos no meio do respectivo biorreator. Neste caso, a unidade de comparação pode determinar que não há diferença de calibração entre os medidores de pH do segundo biorreator R (de referência) e o medidor de pH do primeiro biorreator B2, mas existe um desvio de calibração entre os medidores de pH do biorreator de referência R e o biorreator B1.
[0225] No exemplo representado, o valor de perfil do perfil de estado (804) do biorreator monitorado (106) (“B2”) no instante t0 é idêntico ao valor de referência do perfil de referência (402) no instante t0. O valor do perfil (802) do biorreator monitorado (104) (“B4”) no instante t0 difere significativamente do valor de referência do perfil de referência (402) no instante t0.
[0226] Alternativamente, em vez dos valores de perfil, a concentração de CO2 do efluente gasoso dos dois biorreatores, como representado na Figura 7, pode ser comparada para determinar se os dispositivos de medição de pH dos dois biorreatores comparados foram calibrados de forma idêntica. Os dois biorreatores são iniciados e preenchidos com o mesmo meio livre de células com a mesma pressão e temperatura, e um valor de pH atual e uma concentração de CO2 atual do meio nos dois biorreatores são medidos e comparados quando os dois biorreatores atingiram equilíbrio de pH-CO2. Se a concentração de CO2 no efluente gasoso dos dois biorreatores for idêntica enquanto o valor de pH não for, ou se os valores de pH dos dois biorreatores forem idênticos e a concentração de CO2 no efluente gasoso não for, a unidade de comparação determina que os dois biorreatores foram calibrados de forma diferente.
[0227] Os dispositivos de medição de pH incorretamente calibrados podem resultar em resultados imprecisos ao comparar os estados de cultura celular de duas culturas celulares com base em perfis de cultura celular que foram derivado - exclusivamente ou além de outros parâmetros - a partir dos valores de pH. Como consequência, também qualquer ação tomada pelo controlador para minimizar a diferença de estado pode falhar em minimizar as diferenças de estado (este efeito não é mostrado nas Figuras 8a e 8b, porque durante o crescimento da cultura celular no biorreator B2, o equilíbrio de pH-CO2 foi modificado adicionando uma base e aumentando a taxa de influxo de gás total; assim, o perfil de B2 difere significativamente do perfil de referência, embora os medidores de pH do biorreator de referência e do biorreator B2 tenham sido calibrados da mesma maneira.
[0228] Medidores de pH calibrados de forma errada podem resultar em resultados imprecisos ao comparar os estados de cultura celular de duas culturas celulares com base nos valores de pH dos respectivos biorreatores ou qualquer outro parâmetro de monitoramento ou controle sendo uma derivada de ditos valores de pH. Como consequência, também qualquer ação tomada pelo controlador para minimizar a diferença de pH pode falhar ou pode resultar em um desvio de estado ainda maior dos dois biorreatores comparados (este efeito não é mostrado nas Figuras 8a e 8b, porque durante o crescimento da cultura celular no biorreator B2, o equilíbrio de pH-CO2 foi modificado pela adição de uma base e pelo aumento da taxa de influxo de gás total; assim, o perfil de estado de cultura celular de B2 difere significativamente do perfil de estado de referência, embora os medidores de pH do biorreator de referência e do biorreator B2 foram calibrados da mesma maneira).
[0229] Por exemplo, o perfil de estado de um biorreator antes e após a inoculação com uma cultura celular pode ser calculado como um perfil PACO. Um valor PACO, PACOB1-ti, PACOB2-ti é indicativo de um desvio de uma taxa de efluente gasoso de CO2, ACOB1-M-ti, ACOB2-M-ti medida no biorreator a partir de uma taxa de efluente gasoso de CO2 prevista, ACOB1-EXP-ti, ACOB2-EXP- ti. A taxa de efluente gasoso de CO2 prevista é a taxa de efluente gasoso de dito meio no biorreator em estado de equilíbrio de pH-CO2 sob ausência da cultura celular e sob a condição de que o valor de pH do meio em estado de equilíbrio seja idêntico ao valor de pH do biorreator (104, 106) ao medir a taxa de efluente gasoso de CO2 no biorreator. O valor PACO depende da quantidade de efluente gasoso de CO2 produzida pelas células da cultura celular no biorreator ao cultivar a cultura celular. O cálculo do valor PACO, PACOB1-ti, PACOB2-ti utiliza como entrada: - a taxa de efluente gasoso de CO2 atual recebida, ACOB1-M-ti, ACOB2-M-ti; - o valor de pH atual recebido, pHB1-ti, pHB2-ti; - a taxa de influxo de gás total, TGIB1, TGIB2 do biorreator no instante ti da recepção da taxa de efluente gasoso de CO2 atual; e - a relação meio-específica (136).
[0230] O cálculo do valor PACO do biorreator monitorado e/ou controlado a um tempo atual compreende o cálculo para cada uma das taxas de efluente gasoso de CO2 atuais recebidas e os valores de pH do biorreator monitorado e/ou controlado: - a fração estimada de efluente gasoso de CO2, FCO2B1-EXP-ti, de um volume de desgaseificação atual do biorreator (104) de acordo com: FCO2B1- EXP-ti = REL-M1 (pHB1-ti), em que FCO2B1-EXP-ti é uma fração de efluente gasoso de CO2 prevista do volume de efluente gasoso total (TGOB1) do biorreator (104) em % no instante atual ti, sendo a predição calculada usando o valor de pH atual recebido, pHB1-ti, como entrada para REL-M1 (pHB1-ti), em que REL-M1 é uma relação meio-específica do meio M1 empiricamente derivada, ajustando um gráfico tal como representado, por exemplo, na Figura 4 D. O parâmetro pHB1-ti é o valor de pH atual recebido no meio do biorreator (104, 106) em um instante ti; assim, a fração esperada de efluente gasoso de CO2 no biorreator é calculada sob a hipótese de que o meio do biorreator não possui a cultura celular, tem o valor de pH usado como entrada da relação meio-específica e está em estado de equilíbrio de pH-CO2 com a fase gasosa no biorreator acima de dito meio e, portanto, também está em equilíbrio com o volume de efluente gasoso total de dito biorreator. - uma taxa esperada de efluente gasoso de CO2, valor ACOB1-EXP-ti [mol/min], de acordo com: ACOB1-EXP-ti [mol/min] = (FCO2B1-EXP-ti [%] / 100) x TGIB1, em que o valor ACOB1-EXP-ti é a taxa de efluente gasoso de CO2 esperada do biorreator (104) quando o meio do biorreator tem o valor de pH atualmente medido e está em equilíbrio de pH-CO2 com a fase gasosa acima de dito meio, em que o TGIB1 é a quantidade total de influxo de gás do biorreator (104) no instante atual (ti); a quantidade total de influxo de gás do biorreator é aproximadamente idêntica à quantidade total de saída de fluxo de gás; - o valor PACOB1-ti de acordo com: PACOB1-ti = ACOB1-EXP-ti - ACOB1- M-ti, em que ACOB1-M-ti é a taxa de efluente gasoso de CO2 medida no instante ti no biorreator (104).
[0231] Um valor de referência PACOB1-ti do biorreator de referência (102) pode ser calculado em conformidade com: PACOR-ti = ACOR-EXP-ti - ACOR- M-ti, em que ACOR-M-ti é a taxa de efluente gasoso de CO2 medida no instante ti no biorreator (102).
[0232] De acordo com algumas formas de realização, a comparação dos valores PACO acima mencionada é realizada repetidamente após a inoculação da cultura celular para identificar desvios de estado da cultura celular no biorreator (104) em comparação com o estado de cultura celular correspondente no biorreator de referência (102).
[0233] Um valor de “valor PACO” é um valor de dados. Um “valor FCO2” é um valor de dados. Um “valor ACO” é um valor de dados. “FCO2” ou “CO2 [%]”, também referido como “concentração de CO2”, é a “fração de gás CO2” em um volume de gás, por exemplo, no efluente gasoso de um biorreator.
[0234] Um “perfil” é um conjunto de valores de dados ou uma relação matemática que indica a variação de um valor de parâmetro ao longo do tempo. O valor do parâmetro pode ser, por exemplo, um valor PACO, uma concentração de CO2 no efluente gasoso (“FCO2”), uma taxa de efluente gasoso de CO2 (“valor ACO”) ou o valor de pH obtido de um biorreator.
[0235] A Figura 8b é um diagrama que mostra as diferenças de perfil dos perfis de estado de cultura celular (802, 804) de dois biorreatores (104, 106) para o perfil de referência (402) do biorreator de referência (102). A curva (810) representa diferenças de perfil do biorreator (104) e do biorreator de referência e a curva (808) representa diferenças de perfil do biorreator (106) e do biorreator de referência. As diferenças de perfil do biorreator (106) para o perfil de referência (402) são significativamente maiores do que as diferenças do biorreator (104), porque ao cultivar a cultura celular em B2, o equilíbrio de pH- CO2 foi modificado. A comparação de um perfil PACO com um perfil PACO de referência permite identificar desvios de estado da cultura celular em dois biorreatores comparados e automaticamente, semi-automaticamente ou manualmente, tomar as ações apropriadas para minimizar as diferenças de perfil. Foi observado que as diferenças de calibração entre os dispositivos de medição de pH podem resultar em diferenças significativas nos perfis de parâmetros de controle, por exemplo, perfis PACO. Assim, o uso de um método de calibração de acordo com as formas de realização da invenção na fase de inicialização do biorreator pode aumentar significativamente a precisão de comparar e sincronizar estados de cultura celular e biorreator em um momento posterior no tempo.
[0236] A Figura 9 representa dois diagramas de caixa e bigodes que ilustram que o processo de amostragem tem um efeito no valor de pH medido.
[0237] Ao realizar um primeiro projeto de cultura celular P1, o valor de pH do meio de um biorreator que compreende a cultura celular foi repetidamente medido com um medidor de pH interno ao biorreator. Os valores de pH medidos pelo medidor de pH interno ao biorreator em vários instantes t1, t2, ..., tn foram comparados com valores de pH medidos por um segundo medidor de pH externo ao biorreator em amostras de meio extraídas em ditos instantes respectivos t1, ..., tn. Assim, os valores de dados representados pelo diagrama de caixa e bigodes do projeto P1 representam, respectivamente, a diferença entre o valor de pH medido pelo medidor de pH interno ao biorreator e externo ao biorreator em um tempo respectivo t1, ..., tn. Assim, o diagrama de caixa e bigodes para o projeto P1 representa a variabilidade e distribuição das diferenças de pH (“efeitos de deslocamento de pH”) geradas pelo processo de amostragem. As amostras foram ajustadas a 32 °C para garantir uma temperatura constante de medição de pH para todas as medições.
[0238] O medidor de pH interno ao biorreator do projeto P1 foi calibrado de acordo com o método do estado da técnica, isto é, removendo o medidor de pH interno ao biorreator do biorreator, calibrando o medidor de pH fora do biorreator com uma solução de referência de pH conhecido, reintroduzindo o medidor de pH calibrado no biorreator e autoclavando o biorreator.
[0239] Além disso, no projeto P1, os valores de pH medidos pelo medidor de pH interno ao biorreator foram comparados repetidamente com os valores de pH medidos pelo medidor de pH externo ao biorreator em amostras do meio do biorreator. No caso em que a comparação revelou que uma diferença (ou seja, “deslocamento”) entre os dois valores de pH comparados é superior a um determinado limite, o medidor de pH interno ao biorreator foi recalibrado. Antes da inoculação, a recalibração do medidor de pH interno ao biorreator ocorreu independentemente do deslocamento (“calibração de foco”). O deslocamento de pH do projeto P1 produz em média cerca de “- 0,01” e, portanto, é muito próximo de zero. Isso não é surpreendente, pois os valores de medição de pH obtidos pelo medidor de pH externo ao biorreator foram utilizados como referência para a calibração do medidor de pH interno ao biorreator, igualando por meio disso basicamente os efeitos de deslocamento. Uma desvantagem desta abordagem de calibração é, no entanto, que o valor de pH “real” absoluto do meio no biorreator e a força do efeito de deslocamento permanecem desconhecidos. A variabilidade é muito alta, com apenas 50% de todos os pontos de dados dentro de +/- 0,05 pH, enquanto que mais de 25% de todas os deslocamentos são superiores a 0,07 unidades de escala de pH.
[0240] Foi também observada e confirmada uma disparidade entre as medições de pH em linha (online) e fora de linha (offline) (realizadas por medidores de pH externo ao biorreator e interno ao biorreator), por exemplo, por Heather Evans et al.: “Dealing with Disparity in On-line and Off-line pH measurements Genentech found pH drift in its on-line measurements for a cell culture process, and continues to investigate its cause”, ao realizar medidas de pH semelhantes e testes de calibração de medidor de pH, como descrito para o projeto P1. Heather Evans et al. considerou a capacidade de controlar o pH dentro de uma faixa de +/- 0,10 unidades de pH como crítica para garantir um desempenho de processo consistente e robusto em termos de produtividade e qualidade do produto.
[0241] O diagrama de caixa e bigodes do segundo projeto P2 foi obtido conforme descrito para o projeto P1. No entanto, em vez de calibrar o medidor de pH interno ao biorreator, de acordo com a abordagem do estado da técnica, o medidor de pH interno ao biorreator é calibrado de acordo com uma forma de realização da invenção usando uma taxa de efluente gasoso de CO2 calculada esperada que foi calculada para o meio utilizado e para a temperatura e pressão atuais, tomando como entrada uma concentração de CO2 medida no efluente gasoso do biorreator. Assim, a calibração do medidor de pH interno ao biorreator foi realizada repetidamente (após o preenchimento dos meios e o estabelecimento de um equilíbrio de pH-CO2 e antes da inoculação com uma cultura celular, já que metabólitos celulares deslocariam o equilíbrio) usando uma relação específica de meio entre o valor de pH e a taxa de efluente gasoso de CO2, como descrito para as formas de realização da invenção.
[0242] O deslocamento de pH observado entre o medidor de pH de fora e dentro do biorreator produz em média cerca de + 0,11, revelando assim que a força do efeito de deslocamento é superior a 0,1 unidades de pH altas. Quanto a P1, as amostras foram tomadas a 32 °C e os medidores de pH utilizados foram eletrodos de vidro. A variabilidade da medição de pH fora de linha (offline) permanece comparável, já que o procedimento de amostragem e o método de medição de pH fora de linha (offline) em P1 e P2 são os mesmos.
[0243] No total, 1070 valores de dados foram obtidos para gerar os dois diagramas de caixa e bigodes para os projetos P1, P2 na Figura 9 (P1: N = 607 e P2: N = 463). Em ambos os projetos, os eletrodos de vidro foram utilizados a temperatura definida como medidores de pH de fora e dentro do biorreator.
[0244] Como pode ser inferido a partir dos dois diagramas, a variabilidade dos deslocamentos de pH determinada em ambos os projetos P1, P2 é similar. Os deslocamentos de valor de pH são causados pelo processo de amostragem em ambos os casos.
[0245] No entanto, como também pode ser inferido a partir da Figura 9, a média dos deslocamentos de pH do projeto P1 difere da média dos deslocamentos obtidas para o projeto P2 em quase 0,1 unidades escalar. Esta “diferença de média de deslocamento de pH” é causada por diferentes métodos utilizados para calibrar os medidores de pH internos ao biorreator nos projetos P1 e P2. As diferenças dos valores médios de pH também seriam causadas pela alteração do método de amostragem, por exemplo, aumentando o tempo entre tomar uma amostra e realmente realizar a medição de pH na amostra.
[0246] Como pode ser inferido a partir da Figura 9, as medições de pH fora de linha (offline) podem ser admitidas como a raiz da variabilidade do pH. A mudança no deslocamento médio é devida a deslocamentos gerais que são adicionados por amostragem, tempos de retenção de amostra, quedas de temperatura, desgaseificação de dióxido de carbono durante a amostragem e medição fora de linha (offline), bem como deslocamentos específicos do método de medição fora de linha (offline) usado. Os dados do analisador de gases sanguíneos (não mostrados) liberam diferentes deslocamentos. Outros métodos de medição de pH fora de linha (offline) (não mostrados) liberam deslocamentos novamente diferentes. LISTA DE NÚMEROS DE REFERÊNCIA 100 Sistema para monitorar e/ou controlar estados de cultura celular em um biorreator 102 Primeiro biorreator (“referência”) 104 Segundo biorreator B1 106 Biorreator adicional B2 108 Dispositivo de medição de pH 110 Processador 112 Memória 114 Meio de armazenamento 120 Interface para receber uma ou mais relações meio- específicas 122 Analisador de efluente gasoso de CO2 124 Analisador de efluente gasoso de CO2 126 Analisador de efluente gasoso de CO2 128 Interface para receber parâmetros de medição de dois ou mais biorreatores 130 Unidade de comparação 132 Unidade de controle 134 Exibidor 136 Relação meio-específica para o meio M1 138 Relação meio-específica para o meio M2 140 Sensor para influxo de gás total 142 Dispositivo de medição de pH 144 Sensor para influxo de gás total 146 Dispositivo de medição de pH 202-206 Etapas 402 Perfil de estado do biorreator de referência (102) 502 Relação meio-específica traçada para quatro biorreatores 802 Perfil de estado de um biorreator 804 Perfil de estado de um biorreator 808 Diferença de perfil de estado para o perfil de referência 810 Diferença de perfil de estado para o perfil de referência M1 Meio de cultura celular TGIB1 Influxo de gás total no biorreator B1 TGIB2 Influxo de gás total no biorreator B2 TGIR Influxo de gás total no biorreator de referência TGOB1 Efluente gasoso total do biorreator B1 TGOB2 Efluente gasoso total do biorreator B2 TGOR Efluente gasoso total do biorreator de referência TLIB1 Influxo de líquido total no biorreator B1 TLIB2 Influxo de líquido total no biorreator B2 TLIR Influxo de líquido total no biorreator de referência TLOB1 Saída de fluxo (líquido) total do biorreator B1 TLOB2 Saída de fluxo (líquido) total do biorreator B2 TLOR Saída de fluxo (líquido) total do biorreator de referência
Claims (22)
1. MÉTODO, para determinar se um primeiro dispositivo de medição de pH (108; 146) acoplado operativamente a um primeiro tanque (104; 106) é afetado por um problema de medição de pH, sendo o problema que o primeiro dispositivo de medição de pH está calibrado de forma diferente a de um segundo dispositivo de medição de pH (142) acoplado operativamente a um segundo tanque (102), caracterizado por compreender: - receber (202), através de uma unidade de comparação (130), uma primeira concentração de CO2 e um primeiro valor de pH, sendo a primeira concentração de CO2 uma concentração de CO2 de um primeiro volume de gás acima de um meio (M1) no primeiro tanque, a primeira concentração de CO2 e o primeiro valor de pH sendo medidos em um primeiro tempo, sendo o primeiro tempo um tempo em que o meio no primeiro tanque está em estado de equilíbrio de pH-CO2 com o primeiro volume de gás a uma temperatura e pressão predefinidas, sendo dito estado de equilíbrio não afetado pelo metabolismo de qualquer cultura celular, sendo o primeiro valor de pH um valor medido fornecido pelo primeiro dispositivo de medição de pH (108; 146); - receber (202), através da unidade de comparação (130), uma segunda concentração de CO2 e um segundo valor de pH, sendo a segunda concentração de CO2 uma concentração de CO2 de um segundo volume de gás acima do mesmo tipo de meio (M1) contido no segundo tanque, a segunda concentração de CO2 e o segundo valor de pH sendo medidos em um segundo tempo, sendo o segundo tempo um tempo em que o meio no segundo tanque está em estado de equilíbrio de pH-CO2 com o segundo volume de gás à temperatura e pressão predefinidas, sendo dito estado de equilíbrio não afetado pelo metabolismo de qualquer cultura celular, o segundo valor de pH sendo um valor medido fornecido pelo segundo dispositivo de medição de pH (142); - comparar (206), através da unidade de comparação, o primeiro e segundo valor de pH e comparar a primeira e a segunda concentração de CO2 para determinar se o primeiro dispositivo de medição de pH é afetado pelo problema de medição de pH.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela determinação de que o primeiro dispositivo de medição de pH tem um problema de medição de pH ser feita no caso em que: - a primeira e segunda concentração de CO2 são idênticas e o primeiro e segundo valor de pH diferem um do outro por mais do que um valor limite; ou - o primeiro e o segundo valor de pH são idênticos e a primeira e a segunda concentração de CO2 diferem uma da outra por mais do que um valor limite adicional; ou - um primeiro valor de dados difere de um segundo valor de dados por mais do que um limite adicional, sendo o primeiro valor de dados derivado a partir do primeiro valor de pH e da primeira concentração de CO2, sendo o segundo valor de dados derivado a partir do segundo valor de pH e da segunda concentração de CO2.
3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por: - o primeiro tanque ser um biorreator ou um tanque de coleta; e/ou - o segundo tanque ser um biorreator, em particular um biorreator de referência, ou um tanque de coleta, em particular um tanque de coleta de referência.
4. MÉTODO, para determinar se um primeiro dispositivo de medição de pH (108; 146; 160) acoplado operativamente a um primeiro tanque (104; 106) é afetado por um problema de medição de pH, sendo o problema que o primeiro dispositivo de medição de pH está calibrado erroneamente, caracterizado por compreender: - receber (202), através de uma unidade de comparação (130), uma primeira concentração de CO2 e um primeiro valor de pH, sendo a primeira concentração de CO2 uma concentração de CO2 de um primeiro volume de gás acima de um meio (M1) no primeiro tanque, a primeira concentração de CO2 e o primeiro valor de pH sendo medidos em um primeiro tempo, sendo o primeiro tempo um tempo em que o meio no primeiro tanque está em estado de equilíbrio de pH-CO2 com o primeiro volume de gás a uma temperatura e pressão predefinidas, sendo dito estado de equilíbrio não afetado pelo metabolismo de qualquer cultura celular, sendo o primeiro valor de pH um valor medido fornecido pelo primeiro dispositivo de medição de pH (108; 146); - calcular (204), através da unidade de comparação, um segundo valor de pH como uma função da primeira concentração de CO2, o segundo valor de pH sendo o valor de pH previsto para dito tipo de meio (M1) quando dito meio está em estado de equilíbrio de pH-CO2 com um segundo volume de gás acima de dito meio (M1) à temperatura e pressão predefinidas, o segundo volume de gás em dito equilíbrio tendo uma segunda concentração de CO2 que é idêntica à primeira concentração de CO2, sendo dito estado de equilíbrio não afetado pelo metabolismo de qualquer cultura celular, e o cálculo do segundo valor de pH compreender: - ler, através da unidade de comparação (130), uma relação meio- específica (136) a partir de um meio de armazenamento de dados (114), sendo a relação meio-específica específica para o meio (M1) e indicando uma relação entre o valor de pH do meio (M1) e uma fração respectiva de gás CO2 em um volume de gás quando dito meio está em estado de equilíbrio de pH-CO2 com dito volume de gás e não possui uma cultura celular; - inserir a primeira concentração de CO2 na relação específica de meio para calcular um valor de pH absoluto esperado para o meio em equilíbrio de pH-CO2 à temperatura e pressão predefinidas e sob a ausência de uma cultura celular, o valor absoluto de pH sendo usado como o segundo valor de pH calculado; - comparar (206), através da unidade de comparação, o primeiro e segundo valor de pH para determinar se o primeiro dispositivo de medição de pH é afetado pelo problema de medição de pH.
5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela relação meio-específica ser uma equação PPHM1(CO2) = REL-M1(CO2) obtida por ajustar matematicamente vários pares empiricamente determinados de um valor de pH do meio (M1) e uma fração de gás CO2 medida respectivamente em um volume de gás, em que: - PPHM1(CO2) é o valor de pH previsto em um meio (M1) quando dito meio não possui uma cultura celular e está em equilíbrio de pH-CO2 com um volume de gás acima de dito meio, dito volume de gás compreendendo a concentração de CO2 utilizada como parâmetro de entrada; - o CO2 é um valor de parâmetro de entrada e representa a concentração de CO2 em um volume de gás acima do meio (M1) em estado de equilíbrio de pH-CO2 sob a ausência da cultura celular; - em que REL-M1 é um conjunto de um ou mais parâmetros (a1, a2, b1, b2, b3) conectados por operadores, os parâmetros tendo sido obtidos por: - ajustar amostras do meio (M1) que não possuem a cultura celular para vários valores de pH diferentes, permitindo assim que as amostras alcancem o equilíbrio de pH-CO2 com o volume de gás acima do meio na respectiva amostra, - determinar a fração de gás CO2 em um respectivo volume de gás que está em equilíbrio de pH-CO2 com o meio nas amostras, - traçar as frações de gás CO2 determinadas contra os respectivos valores de pH de equilíbrio das amostras, - ajustar uma curva (502) nos valores traçados e derivar os parâmetros (a1, a2 ou b1, b2, b3) da relação meio-específica a partir da curva ajustada.
6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pela determinação de que o primeiro dispositivo de medição de pH tem um problema de medição de pH ser feita no caso em que: - o primeiro e o segundo valor de pH diferem um do outro por mais do que um valor limite; ou - um primeiro valor de dados difere de um segundo valor de dados por mais do que um limite adicional, sendo o primeiro valor de dados derivado a partir do primeiro valor de pH, sendo o segundo valor de dados derivado a partir do segundo valor de pH.
7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizado pelo primeiro tanque ser um biorreator ou um tanque de coleta ou uma caixa de calibração.
8. MÉTODO PARA CALIBRAR OU RECALIBRAR UM PRIMEIRO DISPOSITIVO, de medição de pH (108; 146), caracterizado por compreender: a) realizar o método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, para determinar que o primeiro dispositivo de medição de pH é afetado por um problema de medição de pH; e calibrar o primeiro dispositivo de medição de pH de modo que ele produza o mesmo valor de pH como o segundo dispositivo de medição de pH no caso de a primeira e segunda concentração de CO2 serem idênticas; ou b) realizar o método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 7, para determinar que o primeiro dispositivo de medição de pH é afetado por um problema de medição de pH; e calibrar o primeiro dispositivo de medição de pH de modo que ele produza o mesmo valor de pH como o valor do pH calculado como uma função da primeira concentração de CO2.
9. MÉTODO DE OPERAÇÃO DE UM TANQUE, que compreende um primeiro dispositivo de medição de pH (108; 146), sendo o primeiro dispositivo de medição de pH um dispositivo de medição em linha (online), caracterizado por compreender: - cultivar uma cultura celular no tanque, o tanque compreendendo um meio de crescimento, medindo assim repetidamente o pH no meio de crescimento pelo primeiro dispositivo de medição de pH; - substituir o meio de crescimento e a cultura celular contida no tanque com um meio (M1) para o qual é conhecida uma relação entre pH e CO2 em equilíbrio; - após ter substituído o meio de crescimento, realizar o método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 8, para determinar se o primeiro dispositivo de medição de pH é afetado por um problema de medição de pH; - se um problema de medição de pH for detectado, calibrar o primeiro dispositivo de medição de pH de modo que ele produza o mesmo valor de pH, como o valor de pH calculado como uma função da primeira concentração de CO2 para o meio (M1); - após ter calibrado o primeiro dispositivo de medição de pH, substituir o meio no tanque pelo meio de crescimento.
10. MÉTODO PARA DETERMINAR OS EFEITOS DE DESLOCAMENTO DE PH, causados pela tomada de uma amostra de meio de um primeiro tanque, caracterizado por compreender fornecer um dispositivo de medição de pH externo ao tanque e fora de linha (offline) (160) e fornecer o primeiro tanque (104, 106), o primeiro tanque compreendendo um primeiro dispositivo de medição de pH (108, 146), sendo o primeiro dispositivo de medição de pH um dispositivo de medição de pH em linha (online) localizado dentro do primeiro tanque e sendo pelo menos parcialmente cercado pelo meio (M1) no primeiro tanque, em que o método compreende ainda: - realizar o método, conforme definido na reivindicação 8, opção (b), para calibrar o primeiro dispositivo de medição de pH; - transferir o dispositivo de medição de pH externo ao tanque e fora de linha (offline) (160) para uma caixa de calibração que compreende o mesmo tipo de meio (M1) como o primeiro tanque; e realizar o método, conforme definido na reivindicação 8 opção (b), usando a caixa de calibração como o tanque que compreende o dispositivo de medição de pH a ser calibrado (160), usando assim a caixa de calibração como um recipiente cujo sensor de efluente gasoso (offgas) de CO2 é usado para medir a primeira concentração de CO2 e usar a mesma função para calcular o segundo valor de pH usado para calibrar o primeiro dispositivo de medição de pH; - após ter calibrado o primeiro dispositivo de medição de pH (108, 146) e o dispositivo de medição de pH externo ao tanque (160): - medir, através do primeiro dispositivo de medição de pH, um primeiro valor de pH atual do meio no primeiro tanque, sendo o primeiro valor de pH atual um valor de medição em linha (online); - tomar uma amostra do meio do primeiro tanque e preencher a amostra em um recipiente portátil (162); - posicionar o dispositivo de medição de pH externo ao tanque, de modo que esteja pelo menos parcialmente cercado com o meio no recipiente de amostra; - medir, através do dispositivo de medição de pH externo ao tanque, um segundo valor de pH atual do meio no recipiente de amostra, o segundo valor de pH atual sendo um valor de medição fora de linha (offline); - no caso do primeiro e do segundo valor de pH atuais diferirem por mais do que um limite, determinar que o processo de amostragem causou um efeito de deslocamento de pH e, opcionalmente, determinar a força do efeito de deslocamento como a diferença entre o primeiro e o segundo valor de pH atual.
11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por compreender ainda: - receber (202) uma terceira concentração de CO2 e um terceiro valor de pH, sendo a terceira concentração de CO2 uma concentração de CO2 de um terceiro volume de gás acima do meio no primeiro tanque, sendo a terceira concentração de CO2 e o terceiro valor de pH medidos em um terceiro tempo, sendo o terceiro tempo um tempo em que o meio no primeiro tanque está em estado de equilíbrio de pH-CO2 a uma temperatura e pressão predefinidas com o terceiro volume de gás e após dito estado de equilíbrio ser modificado pelo metabolismo da cultura celular no primeiro tanque, sendo o terceiro valor de pH um valor medido fornecido pelo primeiro dispositivo de medição de pH (142); - receber (204) uma quarta concentração de CO2 e um quarto valor de pH, sendo a quarta concentração de CO2 uma concentração de CO2 de um quarto volume de gás acima do meio no segundo tanque, sendo a quarta concentração de CO2 e o quarto valor de pH medidos em um quarto tempo, sendo o quarto tempo um tempo em que o meio no segundo tanque está em estado de equilíbrio de pH-CO2 à temperatura e pressão predefinidas com o segundo volume de gás e após dito estado de equilíbrio ser modificado pelo metabolismo da cultura celular no segundo tanque, sendo o quarto valor de pH um valor medido fornecido pelo segundo dispositivo de medição de pH (108, 146), o tempo decorrido entre o terceiro tempo e a inoculação do primeiro tanque sendo idêntico ao tempo decorrido entre o quarto tempo e a inoculação do segundo tanque; - receber uma primeira taxa de absorção de oxigênio medida da cultura celular no primeiro tanque no terceiro tempo; - receber uma segunda taxa de absorção de oxigênio medida da cultura celular no segundo tanque no quarto tempo; - no caso de a primeira e a segunda taxa de absorção de oxigênio serem idênticas, comparar (206) o terceiro e quarto valor de pH e de concentração de CO2 para determinar se o primeiro e o segundo dispositivo de medição de pH estão calibrados de forma diferente.
12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo primeiro dispositivo de medição de pH estar pelo menos parcialmente cercado pelo meio dentro do primeiro tanque, em que: - o primeiro tanque não possui meios para tomar, manual ou automaticamente, uma amostra do meio no segundo tanque; ou - o primeiro tanque compreende meios para tomar, manual ou automaticamente, uma amostra do meio no primeiro tanque, em que o método compreende ainda: durante um intervalo de tempo após o preenchimento do meio no primeiro tanque e antes de adicionar uma cultura celular ao meio no primeiro tanque, manter fechadas todas as aberturas dos meios de amostragem.
13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo segundo dispositivo de medição de pH estar pelo menos parcialmente cercado pelo meio dentro do segundo tanque, em que: - o segundo tanque não possui meios para tomar, manual ou automaticamente, uma amostra do meio no segundo tanque; ou - o segundo tanque compreende meios para tomar, manual ou automaticamente, uma amostra do meio no segundo tanque, em que o método compreende ainda: durante um intervalo de tempo após o preenchimento do meio no segundo tanque e antes de adicionar uma cultura celular ao meio no segundo tanque, manter fechadas todas as aberturas dos meios de amostragem.
14. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 10 a 13, caracterizado por ser utilizado para determinar se o segundo dispositivo de medição de pH está calibrado de forma diferente do primeiro dispositivo de medição de pH, a determinação se o primeiro e o segundo dispositivos de medição de pH estão calibrados de forma diferente sendo realizada enquanto o segundo dispositivo de medição de pH está pelo menos parcialmente cercado com o meio no segundo tanque e sem tomar uma amostra do meio do segundo tanque para realizar dita determinação.
15. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 10 a 14, caracterizado pela determinação de se o primeiro dispositivo de medição de pH é afetado por um problema de medição de pH ser realizada usando a primeira e segunda concentração de CO2 e o primeiro e o segundo valor de pH como a única entrada de dados para dita determinação.
16. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo por compreender ainda: - realizar uma medição em linha (online) com o primeiro dispositivo de medição de pH para medir o primeiro valor de pH, sendo o primeiro dispositivo de medição de pH pelo menos parcialmente cercado com o meio no primeiro tanque; e/ou - realizar uma medição em linha (online) através de um primeiro sensor de CO2 (124, 126) no efluente gasoso do primeiro tanque para fornecer a primeira concentração de CO2.
17. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 10 a 16, caracterizado por compreender ainda: - realizar uma medição em linha (online) com o segundo dispositivo de medição de pH para medir o segundo valor de pH, sendo o segundo dispositivo de medição de pH pelo menos parcialmente cercado com o meio no segundo tanque; e/ou - realizar uma medição em linha (online) através de um segundo sensor de CO2 (122) no efluente gasoso do segundo tanque para fornecer a segunda concentração de CO2.
18. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo método compreender, no caso de determinar que o primeiro dispositivo de medição de pH é afetado por um problema de medição de pH, realizar uma ou mais das seguintes etapas pela unidade de comparação: - produzir uma mensagem de aviso; - realizar ou provocar automaticamente a realização de uma recalibração do primeiro dispositivo de medição de pH; - realizar ou provocar automaticamente a realização de uma substituição do primeiro dispositivo de medição de pH por um novo primeiro dispositivo de medição de pH.
19. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 10 a 18, caracterizado pelo primeiro tanque (104, 106) diferir do segundo tanque (102) em relação a uma ou mais das seguintes características: a) o volume de gás no tanque; b) o volume do meio no tanque; c) o número de Reynolds do tanque; d) o número de Newton do tanque; e) as dimensões do tanque; f) características geométricas do tanque e/ou defletores do tanque; g) a configuração do agitador; h) a taxa de agitação; i) o coeficiente volumétrico de transferência de massa para oxigênio (kLa) do tanque; j) taxa de influxo de gás total e/ou taxa de influxo de O2 e/ou taxa de influxo N2 e/ou taxa de influxo de CO2; k) entrada de energia; l) pressão no tanque; m) tempo de retenção de bolha de gás no meio; n) tamanho e distribuição de bolha de gás no meio; o) velocidade de superfície; p) um parâmetro calculado como uma derivada de um ou mais dos parâmetros (a)-(o); q) a localização geográfica dos dois tanques.
20. UNIDADE DE COMPARAÇÃO (130), caracterizada por ser configurada para: - receber (202), uma primeira concentração de CO2 e um primeiro valor de pH, sendo a primeira concentração de CO2 uma concentração de CO2 de um primeiro volume de gás acima de um meio (M1) em um primeiro tanque, a primeira concentração de CO2 e o primeiro valor de pH sendo medidos em um primeiro tempo, sendo o primeiro tempo um tempo em que o meio no primeiro tanque está em estado de equilíbrio de pH-CO2 com o primeiro volume de gás a uma temperatura e pressão predefinidas, sendo dito estado de equilíbrio não afetado pelo metabolismo de qualquer cultura celular, sendo o primeiro valor de pH um valor medido fornecido pelo primeiro dispositivo de medição de pH (108; 146); - receber (202) uma segunda concentração de CO2 e um segundo valor de pH, sendo a segunda concentração de CO2 uma concentração de CO2 de um segundo volume de gás acima do mesmo tipo de meio (M1) contido no segundo tanque, a segunda concentração de CO2 e o segundo valor de pH sendo medidos em um segundo tempo, sendo o segundo tempo um tempo em que o meio no segundo tanque está em estado de equilíbrio de pH-CO2 com o segundo volume de gás à temperatura e pressão predefinidas, sendo dito estado de equilíbrio não afetado pelo metabolismo de qualquer cultura celular, o segundo valor de pH sendo um valor medido fornecido pelo segundo dispositivo de medição de pH (142); - comparar (206) o primeiro e segundo valor de pH e comparar a primeira e a segunda concentração de CO2 para determinar se o primeiro dispositivo de medição de pH é afetado pelo problema de medição de pH.
21. UNIDADE DE COMPARAÇÃO (130), caracterizada por ser configurada para: - receber (202) uma primeira concentração de CO2 e um primeiro valor de pH, sendo a primeira concentração de CO2 uma concentração de CO2 de um primeiro volume de gás acima de um meio (M1) no primeiro tanque, a primeira concentração de CO2 e o primeiro valor de pH sendo medidos em um primeiro tempo, sendo o primeiro tempo um tempo em que o meio no primeiro tanque está em estado de equilíbrio de pH-CO2 com o primeiro volume de gás a uma temperatura e pressão predefinidas, sendo dito estado de equilíbrio não afetado pelo metabolismo de qualquer cultura celular, sendo o primeiro valor de pH um valor medido fornecido pelo primeiro dispositivo de medição de pH (108; 146); - calcular (204) um segundo valor de pH como uma função da primeira concentração de CO2, o segundo valor de pH sendo o valor de pH previsto para dito tipo de meio (M1) quando dito meio está em estado de equilíbrio de pH-CO2 com um segundo volume de gás acima de dito meio (M1) à temperatura e pressão predefinidas, o segundo volume de gás em dito equilíbrio tendo uma segunda concentração de CO2 que é idêntica à primeira concentração de CO2, sendo dito estado de equilíbrio não afetado pelo metabolismo de qualquer cultura celular, e calcular o segundo valor de pH compreender: - ler, através da unidade de comparação (130), uma relação meio- específica (136) a partir de um meio de armazenamento de dados (114), sendo a relação meio-específica específica para o meio (M1) e indicando uma relação entre o valor de pH do meio (M1) e uma fração respectiva de gás CO2 em um volume de gás quando dito meio está em estado de equilíbrio de pH-CO2 com dito volume de gás e não possui uma cultura celular; - inserir a primeira concentração de CO2 na relação específica de meio para calcular um valor de pH absoluto esperado para o meio em equilíbrio de pH-CO2 à temperatura e pressão predefinidas e sob a ausência de uma cultura celular, o valor absoluto de pH sendo usado como o segundo valor de pH calculado - comparar (206) o primeiro e segundo valor de pH para determinar se o primeiro dispositivo de medição de pH é afetado pelo problema de medição de pH.
22. SISTEMA (100), configurado para monitorar e/ou controlar um estado de um primeiro tanque, caracterizado por compreender: - a unidade de comparação (130), conforme definida em qualquer uma das reivindicações 20 a 21; - uma unidade de controle (132) acoplada operativamente à unidade de comparação (130); e - o primeiro tanque (104, 106) e o primeiro dispositivo de medição de pH; - a unidade de controle sendo configurada para monitorar e/ou controlar um estado de uma cultura celular no primeiro tanque, usando assim valores de pH repetidamente medidos pelo primeiro dispositivo de medição de pH como entrada.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP15192389.3 | 2015-10-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR112018003852B1 true BR112018003852B1 (pt) | 2021-12-14 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11866686B2 (en) | Identification of calibration deviations of pH-measuring devices | |
| ES2906617T3 (es) | Supervisión de desviaciones de un estado en biorreactores | |
| CN108663347A (zh) | 光学溶解氧传感器多参数干扰补偿校正系统及方法 | |
| ES2848701T3 (es) | Control de la proliferación de células eucariotas | |
| KR20090106431A (ko) | 원위치 측정 장치, 시스템 및 방법 | |
| CN101498713B (zh) | 血液-气体反应监测与控制装置 | |
| CN207567234U (zh) | 一种平行反应器系统 | |
| CN211348202U (zh) | 一种海水二氧化碳传感器的简易校准装置 | |
| BR112018003852B1 (pt) | Métodos, método para calibrar ou recalibrar um primeiro dispositivo, método de operação de um tanque, método para determinar os efeitos de deslocamento de ph, unidades de comparação e sistema | |
| US20240132829A1 (en) | IDENTIFICATION OF CALIBRATION DEVIATIONS OF pH-MEASURING DEVICES | |
| CN209673712U (zh) | Bod快速测定仪 | |
| CN109709197A (zh) | Bod快速测定仪以及精确补偿测定方法 | |
| US20150093775A1 (en) | System and method for analyte sensing and monitoring | |
| BR112012019814B1 (pt) | método de determinação de um indicador da taxa metabólica de uma população celular | |
| RU2552598C1 (ru) | Устройство для воспроизведения и передачи единиц массовой концентрации кислорода и водорода в жидких средах | |
| CN212622384U (zh) | 一种在线溶解氧表零点校准系统 | |
| RU148393U1 (ru) | Устройство для воспроизведения и передачи единиц массовой концентрации кислорода и водорода в жидких средах | |
| CN108102906B (zh) | 一种平行反应器系统以及平行对照实验的方法 | |
| Joeris et al. | DEVELOPMENT OF A NEW PROBE FOR IN-SITU OXYGEN UPTAKE RATE (OUR) MEASUREMENT IN MAMMALIAN CELL CULTURE PROCESSES |