ES2906617T3

ES2906617T3 - Supervisión de desviaciones de un estado en biorreactores

Info

Publication number: ES2906617T3
Application number: ES16788131T
Authority: ES
Inventors: Christian Klinger; Detlef Eisenkraetzer; Katrin Greppmair; Claudia Schmidberger
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2015-10-30
Filing date: 2016-10-28
Publication date: 2022-04-19
Anticipated expiration: 2036-10-28
Also published as: EP3368652A1; WO2017072340A1; EP3368652B1; HRP20220153T1; US20190367854A9; HK1252112A1; JP2022064917A; JP2018533936A; CN108138111B; US20180273885A1; CN108138111A; US11473042B2; JP7338971B2; SI3368652T1; PL3368652T3

Abstract

Un sistema (100) para supervisar desviaciones de un estado de un cultivo celular en un biorreactor (104, 106) a partir de un estado de referencia de un cultivo celular en un biorreactor de referencia (102), comprendiendo el biorreactor el mismo medio (M1) que el biorreactor de referencia, comprendiendo el sistema: - un medio de almacenamiento (114) que comprende: - un perfil de referencia de PACO (116), siendo el perfil de referencia de PACO una representación de la variación en un valor de PACO de referencia (PACOR-ti) frente al tiempo (ti), indicando el perfil de referencia de PACO la diferencia de una tasa de gas de escape CO2 (ACOR-M-ti) medida en el biorreactor de referencia a partir de una tasa de gas de escape CO2 predicha (ACOR-EXP-ti) del biorreactor de referencia, siendo dicha tasa de gas de escape CO2 predicha la tasa de gas de escape predicha de dicho medio en el biorreactor de referencia en estado de equilibrio pH-CO2 en ausencia del cultivo celular y bajo la condición de que el valor de pH del medio en estado de equilibrio sea idéntico al valor de pH (pHR-ti) del biorreactor de referencia medido cuando se mide la tasa de gas de escape CO2 (ACOR-M-ti) en el biorreactor de referencia, dependiendo el perfil de referencia de PACO de la cantidad de gas de escape CO2 producido por las células del cultivo celular en el biorreactor de referencia mientras se cultiva el cultivo celular; - un objeto de datos que comprende una relación específica de medio (136), siendo la relación específica de medio específica para el medio (M1) e indicando una relación entre el valor de pH del medio (M1) y una fracción respectiva de gas CO2 en un volumen de gas cuando dicho medio está en estado de equilibrio pH-CO2 con dicho volumen de gas y carece de cultivo celular; - una interfaz (128) para recibir repetidamente (212), en un momento (ti) actual, una tasa de gas de escape CO2 actual (ACOB1-M-ti, ACOB2-M-ti) del biorreactor (104, 106) y un valor de pH actual (pHB1-ti, pHB2-ti) del medio del biorreactor (104, 106) medidos durante el cultivo del cultivo celular en el biorreactor; - una unidad de comparación (130) configurada para calcular (214, 216), para cada una de las tasas de gas de escape CO2 actuales recibidas: - un valor de PACO (PACOB1-ti, PACOB2-ti), indicando el valor de PACO la diferencia de una tasa de gas de escape CO2 (ACOB1-M-ti, ACOB2-M-ti) medida en el biorreactor (104, 106) a partir de una tasa de gas de escape CO2 predicha (ACOB1-EXP-ti, ACOB2-EXP-ti), siendo la tasa de gas de escape CO2 predicha la tasa de gas de escape predicha de dicho medio en dicho biorreactor (104, 106) en estado de equilibrio pH-CO2 en ausencia del cultivo celular y bajo la condición de que el valor de pH del medio en estado de equilibrio sea idéntico al valor de pH actual (pHB1-ti, pHB2-ti) del biorreactor (104, 106) medido cuando se mide la tasa de gas de escape CO2 en el biorreactor (104, 106), dependiendo el valor de PACO de la cantidad de gas de escape CO2 producido por las células del cultivo celular en el biorreactor mientras se cultiva el cultivo celular, usando el cálculo del valor de PACO (PACOB1-ti, PACOB2-ti) como entrada: - la tasa de gas de escape CO2 actual recibida (ACOB1-M-ti, ACOB2-M-ti); - el valor de pH actual recibido (pHB1-ti, pHB2-ti); - la tasa de entrada de gas total (TGIB1, TGIB2) del biorreactor en el momento (ti) de recepción de la tasa de gas de escape CO2 actual; y - la relación específica de medio (136); - una diferencia entre el valor de PACO calculado (PACOB1-ti, PACOB2-ti) y un valor de PACO de referencia (PACOR-ti) respectivo en el perfil de referencia de PACO (116); estando configurada la unidad de comparación (130) para emitir (218) la diferencia calculada, siendo la diferencia calculada indicativa de una desviación del estado del cultivo celular en el biorreactor (104, 106) a partir del estado de referencia.

Description

DESCRIPCIÓN

Supervisión de desviaciones de un estado en biorreactores

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la ingeniería bioquímica y, más en particular, a un sistema para supervisar biorreactores.

Antecedentes y técnica relacionada

Se usan comúnmente biorreactores para llevar a cabo procesos químicos, en particular, procesos realizados por organismos vivos, de manera controlada, por ejemplo, para obtener un compuesto químico, por ejemplo, un péptido, proteína u otra clase de sustancia química particular. Un objetivo común es hacer funcionar el biorreactor de una manera que los microorganismos o células puedan realizar su función deseada con una producción limitada de impurezas y/o de manera rápida y rentable. Las condiciones ambientales en el interior del biorreactor, tales como temperatura, concentraciones de nutrientes, pH y gases disueltos, además de los parámetros de las células cultivadas y los parámetros del biorreactor, tales como su conformación y tamaño, afectan al crecimiento y productividad de los organismos. Por tanto, el crecimiento y productividad de los organismos dependen de una pluralidad de parámetros que, a menudo, se influyen entre sí. Por tanto, mantener todos los parámetros constantes para proporcionar condiciones definidas para cultivar células en un biorreactor es, a menudo, una tarea muy difícil. Además, la compleja interdependencia de la pluralidad de parámetros que tienen un impacto sobre el crecimiento y metabolismo de un cultivo celular en un biorreactor es un obstáculo para reproducir exactamente el entorno físico-químico en un biorreactor de referencia en otro biorreactor.

Por ejemplo, el documento WO2007/085880 A1 describe un procedimiento para la predicción en línea del futuro rendimiento de una unidad de fermentación usando una pluralidad de parámetros como concentración de producto, biomasa, azúcar en el caldo de la unidad de fermentación por lotes/por lotes alimentados que contiene bacterias y nutrientes, con lo que un modelo informático predice la futura concentración de producto en base a los datos de la planta actuales. Cada pocas horas se toma una muestra de caldo y analiza en el laboratorio para determinar el rendimiento de biomasa.

El documento WO 2007/085880 A1 describe un procedimiento para la predicción en línea del rendimiento de una unidad de fermentación, en particular, parámetros como concentración de producto, biomasa, azúcar en el caldo de la unidad de fermentación por lotes/por lotes alimentados que contiene bacterias y nutrientes. Un modelo informático predice la futura concentración de producto en base a los datos de la planta actuales. Mientras el lote está en progreso, los parámetros del modelo se ajustan en línea en base a los datos de la planta para reducir la discordancia entre la planta y el modelo. El modelo de fermentador del procedimiento se implementa como un programa informático en un Pc que se puede conectar a los sistemas de control de la planta para su empleo en línea en un entorno real de la planta. Un sistema para supervisar el rendimiento en línea es útil para el personal que hace funcionar la planta, para conocer el rendimiento del lote con antelación para implementar cualquier medida correctiva requerida.

MICHAEL J. GRAMER ETAL : "A semi-empirical mathematical model useful for describing the relationship between carbon dioxide, pH, lactate and base in a bicarbonate-buffered cell-culture process", BIOTECHNOLOGY AND APPLIED BIOCHEMISTRY, vol. 47, n.° 4, 15 de marzo de 2007 (15-03-2007), XP055270826, US ISSN: 0885-4513, DOI: 10.1042/BA20070001, describe un estudio que se realizó para desarrollar una relación cuantitativa entre los principales factores del estado que afectan al control de pH en un medio tamponado con bicarbonato.

Sin embargo, a menudo no es posible hacer funcionar un biorreactor particular con exactamente los mismos parámetros que se usaron para hacer funcionar un biorreactor de referencia, y, en este caso, una comparación del estado del cultivo celular en dicho biorreactor particular con un estado "deseado" de un cultivo celular de referencia en un biorreactor de referencia es difícil o propensa a errores o incluso imposible.

Sumario

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un sistema y procedimiento mejorados para supervisar un biorreactor como se especifica en las reivindicaciones independientes. Los modos de realización de la invención se dan en las reivindicaciones dependientes. Los modos de realización de la presente invención se pueden combinar libremente entre sí si no son mutuamente excluyentes.

Un "biorreactor" como se usa en el presente documento es un recipiente en el que se lleva a cabo un proceso químico que implica organismos o sustancias bioquímicamente activas derivadas de dichos organismos. Este proceso puede ser, por ejemplo, aeróbico o anaeróbico. Existe una pluralidad de tipos de biorreactores diferentes que varían en conformación (por ejemplo, cilíndrica u otra), tamaño (por ejemplo, mililitros, de litros a metros cúbicos) y material (acero inoxidable, vidrio, plástico, etc.). De acuerdo con modos de realización, el biorreactor está adaptado para cultivar células o tejido en cultivos celulares. Dependiendo del modo de realización y/o del modo de funcionamiento, un biorreactor puede ser un biorreactor por lotes, un biorreactor por lotes alimentados o un biorreactor continuo (por ejemplo, un modelo de reactor de depósito agitado continuo). Un ejemplo de un biorreactor continuo es el quimiostato.

En un aspecto, la invención se refiere a un sistema para supervisar desviaciones de un estado de un cultivo celular en un biorreactor a partir de un estado de referencia de un cultivo celular en un biorreactor de referencia. El biorreactor comprende el mismo medio que el biorreactor de referencia. El sistema comprende:

- un medio de almacenamiento que comprende:

■ un perfil de referencia de PACO, siendo el perfil de referencia de PACO una representación de la variación en un valor de PACO de referencia frente al tiempo, siendo el perfil de referencia de PACO indicativo de una desviación de una tasa de gas de escape CO2 medida en el biorreactor de referencia a partir de una tasa de gas de escape CO2 predicha del biorreactor de referencia, siendo la tasa de gas de escape CO2 predicha la tasa de gas de escape predicha de dicho medio en estado de equilibrio pH-CO2 en el biorreactor de referencia en ausencia del cultivo celular y bajo la condición de que el valor de pH del medio en estado de equilibrio sea idéntico al valor de pH del biorreactor de referencia medido cuando se mide la tasa de gas de escape CO2 en el biorreactor de referencia, dependiendo el perfil de referencia de PACO de la cantidad de gas de escape CO2 producido por las células del cultivo celular en el biorreactor de referencia mientras se cultiva el cultivo celular;

■ un objeto de datos que comprende una relación específica de medio, siendo la relación específica de medio específica para el medio e indicando una relación entre el valor de pH del medio y una fracción respectiva de gas CO2 en un volumen de gas cuando dicho medio está en estado de equilibrio pH-CO2 con dicho volumen de gas y carece de cultivo celular;

- una interfaz para recibir repetidamente, en un momento actual, una tasa de gas de escape CO2 actual del biorreactor y un valor de pH actual del medio del biorreactor medidos durante el cultivo del cultivo celular en el biorreactor;

- una unidad de comparación configurada para calcular, para cada una de las tasas de gas de escape CO2 actuales recibidas:

■ un valor de PACO, siendo el valor de PACO indicativo de una desviación de una tasa de gas de escape CO2 medida en el biorreactor a partir de una tasa de gas de escape CO2 predicha del biorreactor, siendo la tasa de gas de escape CO2 predicha la tasa de gas de escape predicha de dicho medio en el biorreactor en estado de equilibrio pH-CO2 en ausencia del cultivo celular y bajo la condición de que el valor de pH del medio en estado de equilibrio sea idéntico al valor de pH del biorreactor medido cuando se mide la tasa de gas de escape CO2 en el biorreactor, dependiendo el valor de PACO de la cantidad de gas de escape CO2 producido por las células del cultivo celular en el biorreactor mientras se cultiva el cultivo celular, usando el cálculo del valor de PACO como entrada:

o la tasa de gas de escape CO2 actual recibida;

o el valor de pH actual recibido;

o la tasa de entrada de gas total del biorreactor en el momento de recibir la tasa de gas de escape CO2 actual; y

o la relación específica de medio;

■ en modos de realización de acuerdo con los que el volumen del medio del biorreactor difiere del volumen del medio del biorreactor de referencia, el peso o volumen del medio o suspensión celular en el biorreactor se puede usar, además, como parámetro de entrada como factor de normalización (para calcular un valor de PACO normalizado ("NPACO"));

■ una diferencia entre el valor de PACO calculado y un valor de PACO de referencia respectivo en el perfil de referencia de PACO.

La unidad de comparación está configurada para emitir la diferencia calculada, siendo la diferencia calculada indicativa de una desviación del estado del cultivo celular en el biorreactor a partir del estado de referencia.

Dichos rasgos característicos pueden ser ventajosos por múltiples motivos:

el valor de PACO incorpora el "conocimiento" de la desviación de una tasa de gas de escape CO2 medida (paralelamente o en el pasado) en un biorreactor de referencia a un valor de pH particular a partir de una tasa de gas de escape CO2 que se espera (predice) para el biorreactor de referencia que comprende dicho medio particular, con lo que la predicción supone que el medio en el biorreactor de referencia está en equilibrio pH-CO2 y no comprende el cultivo celular o cualquier otro factor que pueda tener impacto sobre el equilibrio pH-CO2 de dicho medio.

Por tanto, el valor de PACO es un valor de parámetro "integrador" que refleja cualquier variación de una tasa de gas de escape CO2 medida a partir de una tasa de gas de escape CO2 esperada ("predicha") provocada por cualquier factor que tenga un efecto causal sobre el equilibrio pH-CO2 de dicho medio. Un valor de PACO no discrimina si dicho efecto causal se relaciona con el metabolismo celular y/o una modificación de temperatura o presión y/o al incrementar o disminuir el flujo de entrada de fluidos o gases que tienen un impacto sobre el estado de equilibrio pH-CO2. Por tanto, el valor de PACO se puede abstraer del efecto de muchos parámetros individuales que tienen un impacto sobre la condición de cultivo de un cultivo celular y, por tanto, también tienen un impacto sobre el estado del equilibrio pH-CO2 y sobre la concentración de CO2 en el volumen de gas y gas de escape de un biorreactor. A un valor de pH dado, la PACO típicamente asciende en caso de metabolismo celular aeróbico y/o crecimiento incrementado de un cultivo celular bajo condiciones aeróbicas. Si el pH del medio disminuye significativamente, la PACO típicamente disminuye. Pude ocurrir una situación de este tipo como resultado del metabolismo celular, por ejemplo, si la generación de CO2 de las células, así como los metabolitos secretados, como el lactato, compensan en exceso la retirada de CO2 del biorreactor por medio de los conductos y tuberías de desgasificación.

Por tanto, el valor de PACO puede reflejar con mayor exactitud el "estado del sistema global" de un biorreactor que tiene un impacto sobre las condiciones de crecimiento de un cultivo celular que un conjunto de valores de múltiples parámetros (temperatura, presión, presión de CO2, valor de pH medido individualmente). Por tanto, se observó que se puede usar el valor de PACO como un indicador más exacto del estado de un biorreactor y/o del estado de un cultivo celular en el biorreactor que un conjunto de múltiples parámetros del biorreactor considerados paralela, pero individualmente.

El valor de PACO puede facilitar y mejorar la tarea de comparar el estado de un biorreactor o un cultivo celular en dicho biorreactor con un estado ("deseado") de un cultivo celular de referencia en un biorreactor de referencia y, por tanto, puede permitir comparar los estados de dos cultivos celulares incluso en casos en que uno o más de los parámetros que tienen un impacto sobre el crecimiento celular, por ejemplo, el tamaño, dimensión y/o mecanismo de agitación de los dos biorreactores comparados, difieren significativamente. Por tanto, los perfiles de referencia de PACO se pueden obtener supervisando un biorreactor de referencia bajo parámetros de control "conocidos" para proporcionar condiciones muy buenas u óptimas para cultivar un cultivo celular particular para un propósito particular (aislamiento de péptidos o proteínas, etc.). Este perfil se puede usar como perfil de referencia de PACO y, por tanto, como una clase de estándar u "objetivo" para un tipo particular de proyecto de cultivo celular. Cuando se intenta cultivar el cultivo celular para el mismo propósito o "proyecto" (por ejemplo, obtener una gran cantidad de la misma sustancia que se obtuvo en el biorreactor de referencia) en otro biorreactor, el valor de PACO en dicho otro biorreactor se calcula repetidamente para permitir una comparación exacta del estado de un cultivo celular de dicho otro biorreactor con el estado de un cultivo celular en el biorreactor de referencia en un punto de tiempo correspondiente (por ejemplo, una hora, 5 horas, 10 horas después de la inoculación del biorreactor con el cultivo celular o en cada momento actual en el tiempo en caso de que el biorreactor y el biorreactor de referencia se hagan funcionar en paralelo y aproximadamente de forma sincrónica). Hacer funcionar el biorreactor y el biorreactor de referencia de forma aproximadamente sincrónica puede implicar que los valores de PACO de referencia del perfil de PACO de referencia se reciban continuamente desde el biorreactor de referencia, y cada valor de PACO determinado actualmente del biorreactor se compara frente al valor de PACO de referencia más actual. Al comparar continuamente los valores de PACO actuales y los valores de PACO de referencia actuales y al controlar el funcionamiento del valor del biorreactor de una manera que se minimice la diferencia de PACO, se puede lograr un funcionamiento aproximadamente sincrónico del biorreactor y del biorreactor de referencia.

Este enfoque de comparación es mucho más exacto que la comparación de múltiples parámetros (temperatura, pH, densidad celular en el medio, tasa de gas de escape CO2, etc.) individualmente, porque típicamente, dichos parámetros no serán completamente idénticos. En particular, en caso de que uno o más de dichos parámetros se determinen por medio de mediciones fuera de línea (comúnmente usadas en muchos tipos de biorreactores), dichas mediciones, a menudo, están enturbiadas por errores de medición que resultan, por ejemplo, de diferencias de temperatura en la muestra donde se realiza la medición en comparación con la temperatura en el medio de los biorreactores. Además, el retraso provocado por el procedimiento de muestreo antes de determinar dichos valores de parámetro en la muestra puede prohibir una acción inmediata frente a cualquier desviación de un parámetro de estado del biorreactor a partir de un valor de parámetro de referencia.

Como las diferencias individuales de los parámetros en el biorreactor supervisado de los parámetros respectivos en el biorreactor de referencia se pueden reforzar mutuamente o se pueden nivelar entre sí, dependiendo de la situación concreta, una comparación individual de los parámetros del biorreactor supervisado con los parámetros del biorreactor de referencia son mucho menos exactos, ya que ahora proporcionan algún entendimiento sobre cómo dichos parámetros se influyen entre sí. Por ejemplo, una temperatura incrementada puede disminuir la solubilidad del CO2 en el medio y, por tanto, puede incrementar la tasa de gas de escape CO2, pero también puede incrementar el crecimiento celular y, por tanto, dar como resultado una cantidad incrementada de CO2 generado por las células. La disminución de la temperatura también incrementa el pH, lo que, de nuevo, tiene un impacto sobre la PACO (directamente o desencadenando una respuesta de un controlador que contrarresta el valor de pH disminuido, por ejemplo, incrementando la tasa de flujo de entrada de CO2). El metabolismo (dependiente de la temperatura) de las células puede tener, de nuevo, un efecto sobre el pH del medio, por ejemplo, excretando sustancias básicas o ácidas, tales como lactato. El valor de pH del medio, de nuevo, puede tener un impacto sobre la cantidad de CO2 disuelto en el medio. Un valor de PACO, sin embargo, integra las dependencias mutuas de los parámetros que tienen un impacto sobre el equilibrio pH-CO2 del medio e incorpora información sobre el impacto del valor pH de dicho medio sobre el equilibrio pH-CO2 de dicho medio.

El solicitante ha observado, de forma sorprendente, que un mínimo conjunto de datos de entrada que solo comprenda la tasa de gas de escape CO2 actual, el valor de pH actual, la tasa de entrada de gas total del biorreactor en el momento de recibir la tasa de gas de escape CO2 actual y la relación específica de medio es suficiente para comparar con exactitud los estados de dos biorreactores y los cultivos celulares respectivos. Como todos dichos valores de datos de entrada se pueden obtener en forma de valores de medición en línea, ya no es necesario tomar muestras para comparar el estado (lo que puede dar como resultado una contaminación del biorreactor o la generación de valores de medición que sean inexactos debido a los efectos de muestreo, como pérdida de temperatura, cambio de pH en la muestra debido al intercambio de gases con el aire ambiental, etc.).

En otro aspecto beneficioso, los modos de realización de la invención permiten comparar los estados de cultivos celulares cultivados en biorreactores que tienen diferente dimensión o conformación. Por tanto, el perfil de referencia de PACO también se puede usar para aumentar a escala o reducir a escala un proceso bioquímico que se optimizó o examinó en un biorreactor de referencia con respecto a un biorreactor que tiene tamaño y dimensión diferentes.

En otro aspecto, el uso de las tasas de gas de escape CO2 como entrada para calcular un valor de PACO actual puede ser beneficioso, porque los medidores de gas de escape CO2 ("analizadores de gas de escape CO2") no son invasivos, no necesitan un muestreo, se pueden obtener de forma fácil en tiempo real y suministran un valor, la tasa de gas de escape CO2 (o una concentración de CO2 en el gas de escape de la que se puede derivar la tasa de gas de escape CO2), que puede integrar parámetros específicos de célula (CO2 emitido por las células) y parámetros de diseño (tasa de flujo de entrada de gas total, pH actual, presión, temperatura, tasa de agitación, configuración de agitación, tamaño y distribución de las burbujas, etc.). Por tanto, los analizadores de gas de escape CO2 pueden dar una respuesta inmediata a los cambios de proceso intencionados o no intencionados (a diferencia, por ejemplo, con densidades celulares o recuentos celulares).

Por tanto, calcular un valor de PACO para un reactor de referencia para generar un perfil de referencia de PACO y comparar de forma dinámica los valores de PACO obtenidos de un biorreactor supervisado y/o controlado con los valores de PACO de referencia respectivos permite identificar si las condiciones en el biorreactor supervisado constituyen un "entorno", en gran medida, similar o idéntico para cultivar células como el entorno proporcionado por el biorreactor de referencia.

En muchos tipos de biorreactores, los gases de flujo de entrada se alimentan (como una mezcla de gases o por medio de aberturas separadas) al biorreactor por medio de una o más entradas de gas sumergidas. En caso de que el biorreactor comprenda una aireación de espacio libre superior adicional, la tasa de flujo de entrada de dicha fracción de gas de flujo de entrada de "espacio libre superior" y/o la circulación de aire de la fase gaseosa por encima del medio se tienen que configurar de modo que todos los gases alimentados al biorreactor por medio de aireación de espacio libre superior alcancen el equilibrio pH-CO2 con el medio del biorreactor antes de abandonar el biorreactor. Además, en caso de que la aireación de espacio libre superior sea el único mecanismo de aireación del biorreactor, la tasa de flujo de entrada de dicha fracción de gas de flujo de entrada de "espacio libre superior" se tiene que configurar de modo que todos los gases alimentados al biorreactor alcancen el equilibrio pH-CO2 con el medio del biorreactor antes de abandonar el biorreactor.

De forma alternativa (por ejemplo, en caso de que no se pueda alcanzar a tiempo un equilibrio pH-CO2 de los gases de aireación de espacio libre con el medio), la aireación de espacio libre adicional se desconecta antes de medir la tasa de gas de escape CO2 en un biorreactor. Esto puede permitir que se evite el cálculo de un valor de PACO erróneo provocado por la aireación de espacio libre superior adicional que puede dar como resultado una concentración de gas de escape CO2 que difiera de la concentración de CO2 en equilibrio pH-CO2 actual del medio.

De acuerdo con modos de realización, la temperatura y presión del biorreactor de referencia y de cada biorreactor supervisado y/o controlado usando el perfil de referencia de PACO obtenido de dicho biorreactor de referencia es idéntica a la presión y temperatura del medio usado para determinar empíricamente la relación específica de medio al menos en el momento de inocular el biorreactor de referencia o el biorreactor con el cultivo celular. En una etapa posterior del cultivo de un cultivo celular, la temperatura y/o presión del/de los biorreactor(es) supervisado(s) y/o controlado(s) puede diferir de la temperatura y/o presión usada durante la inoculación e incluso puede diferir de la temperatura y/o presión del biorreactor de referencia en un punto de tiempo correspondiente en el perfil de PACO de referencia.

De acuerdo con modos de realización, la tasa de gas de escape CO2 actual recibida, el valor de pH actual recibido, la tasa de entrada de gas total del biorreactor en un momento ti particular (t0, t1,..., tmáx) y la relación específica de medio son los únicos parámetros de entrada para calcular los valores de PACO para el biorreactor supervisado. En modos de realización donde el volumen del medio del biorreactor de referencia difiere del volumen del medio del biorreactor supervisado y/o controlado, el volumen o masa del medio en el biorreactor se puede usar, además, como entrada para calcular los valores de PACO del biorreactor. En este caso, el cálculo del perfil de PACO de referencia comprende usar el volumen o masa del medio en el biorreactor de referencia, además, como entrada para calcular los valores de PACO de referencia del biorreactor de referencia. El parámetro "i" puede representar un número predefinido de minutos u horas transcurridas desde la inoculación o desde un intervalo de tiempo predefinido antes de la inoculación. Por ejemplo, el valor de pH actual se puede usar como entrada para la relación específica de medio para calcular una fracción esperada de CO2 en el gas de escape del biorreactor supervisado a dicho valor de pH bajo la suposición de que el medio en el biorreactor está en estado de equilibrio pH-CO2 con el volumen de gas por encima del medio y no comprende ninguna célula u otro factor que tenga un impacto sobre el equilibrio pH-CO2. La fracción de volumen de CO2 calculada del gas de escape CO2 del biorreactor se correlaciona con la presión parcial de CO2 del volumen de gas por encima del medio en el biorreactor, con lo que la presión parcial de CO2 depende del valor de pH en el medio y se puede caracterizar por un equilibrio químico pH-CO2 de acuerdo con la ecuación de Henderson-Hasselbalch. La fracción de volumen de CO2 predicha/esperada calculada y la tasa de entrada de gas total medida (que es idéntica a la tasa de desgasificación total) se pueden usar para calcular una tasa de desgasificación de CO2 esperada para el biorreactor.

El valor de pH y la fracción de volumen de CO2 ("concentración de CO2") en el gas de escape se pueden medir de forma fácil sin tomar ninguna muestra del medio que comprende el cultivo celular y, por tanto, sin riesgo de que el biorreactor se infecte por hongos y bacterias no deseados. Además, a diferencia de las mediciones de pH fuera de línea en muestras del biorreactor, la medición de la fracción de volumen de CO2 en el gas de escape es una medición en línea. Por tanto, se puede evitar cualquier efecto de compensación de tiempo provocado por el tiempo necesario para el procedimiento de muestreo hasta que se pueda determinar un valor de medición. Los efectos de compensación en las mediciones fuera de línea pueden reducir la exactitud de controlar el estado del biorreactor controlado de una manera que sigua de cerca un perfil de estado del biorreactor de referencia. La tasa de flujo de entrada de gas total es básicamente idéntica a la tasa de gas de escape total de un biorreactor y está predefinida o se puede determinar y usar de forma fácil en combinación con la fracción de volumen de CO2 medida en el gas de escape para determinar la tasa de gas de escape CO2 medida actualmente.

En otro aspecto beneficioso, muchos sistemas de biorreactor actuales ya comprenden o se pueden acoplar de forma fácil con sensores para la concentración de CO2 en el gas de escape y/o para la tasa de gas de escape CO2 actual, la tasa de entrada de gas total y/o un valor de pH actual en el medio del biorreactor. Por tanto, el enfoque se puede implementar de forma fácil en una variedad de biorreactores existentes y estructuras de supervisión y/o control en biorreactores sin tener que instalar sensores adicionales u otros módulos de equipo informático.

En otro aspecto beneficioso, el valor de PACO proporciona una indicación inmediata de cambios en el medio bioquímico de un biorreactor. Este no es el caso de los recuentos celulares, mediciones de partículas, mediciones de metabolitos y toda clase de mediciones fuera de línea (es decir, mediciones realizadas en una muestra del medio del biorreactor extraída del biorreactor en modo de producción). Usando un valor de PACO que sea una derivada de una relación específica de medio, una tasa de gas de escape CO2 medida actualmente y un valor de pH medido actualmente, se puede lograr la comparabilidad del biorreactor a pesar de las desviaciones de la sonda (cantidades cambiantes de CO2 disuelto en el medio, cambios en el valor de pH del medio). Además, se pueden realizar comprobaciones de plausibilidad superiores.

Otro aspecto beneficioso de uso de la tasa de gas de escape CO2 como entrada es que los analizadores de gas de escape se pueden calibrar en cualquier momento y no tienen que esterilizarse en autoclave.

En otro aspecto beneficioso, el valor de PACO se calcula específicamente para el medio usado en el biorreactor (y que se usa o se usó en el biorreactor de referencia) y, por lo tanto, incorpora conocimientos sobre la correlación entre el pH y el dióxido de carbono del gas de escape. Eso significa que la PACO no solo está influenciada por el cambio de pH, sino también por la tasa de gas de escape CO2 típica de dicho medio a un valor de pH particular. Eso hace que PACO sea perfectamente adecuada no solo para abordar las diferencias de desgasificación de CO2 provocadas por la configuración del biorreactor, sino también provocadas por cambios en el valor de pH del medio.

En otro aspecto beneficioso, se puede usar el valor de PACO para comparar los estados de biorreactores diferentes con todos los modos de aireación (tanto variable como constante) y/o en situaciones en las que la temperatura o presión del biorreactor supervisado difiere de la temperatura y/o presión del biorreactor de referencia.

De acuerdo con modos de realización, un módulo de control del biorreactor modifica el valor de pH en el biorreactor modificando exclusivamente la tasa de flujo de entrada de CO2. Esto puede tener la ventaja de que la composición del medio no se modifica por ninguna sustancia ácida o básica adicional (solo la concentración del CO2 disuelto y sus productos de disociación variará con la concentración de gas CO2 variable).

De acuerdo con modos de realización, el procedimiento comprende controlar el valor de pH del medio en el biorreactor de una manera que el valor de pH permanezca dentro de un intervalo predefinido de valores de pH permitidos, también denominada "banda inactiva de pH". Por ejemplo, el intervalo de valores de pH permitidos puede ser [6,8-7,2] en algunos modos de realización, o [6,95-7,05] en otros modos de realización. En caso de que el valor de pH del medio esté por debajo del valor de pH más bajo permitido o esté por encima del valor de pH más alto permitido, el controlador del biorreactor, independientemente del valor de PACO actual del biorreactor, toma las acciones apropiadas para variar el valor de pH en el medio en el intervalo permitido, por ejemplo, modificando la cantidad de flujo de entrada de CO2. Siempre que el valor de pH del medio del biorreactor esté dentro del intervalo de pH permitido, el controlador modifica el valor de pH exclusivamente en dependencia de una desviación determinada de un valor de PACO actual a partir de un valor de PACO de referencia correspondiente.

Esto puede tener la ventaja de que se logra un control más sencillo y más preciso del valor de pH en el medio del biorreactor y se pueden disminuir las fluctuaciones del valor de pH en el medio en comparación con un control del valor del pH de un biorreactor basado puramente en "banda inactiva de pH"/umbral.

De acuerdo con modos de realización, la relación específica de medio es una ecuación FCO2M1(pH)=REL-M1(pH) obtenida ajustando de forma matemática múltiples pares determinados empíricamente de un valor de pH de una muestra del medio usado en el biorreactor y en el biorreactor de referencia y una fracción de gas CO2 medida respectivamente en un volumen de gas por encima de dicha muestra. La muestra puede ser, por ejemplo, la totalidad de un medio libre de células en un biorreactor o una alícuota libre de células de dicho medio.

FCO2m1-exp(pH) es la fracción de gas CO2 predicha ("concentración de CO2 predicha") en un volumen de gas de una muestra del medio cuando dicho medio tiene un valor de pH dado y está en estado de equilibrio pH-CO2 con dicho volumen de gas y carece de cultivo celular. FCO2m1-m es la fracción medida de gas CO2 ("concentración de CO2 medida") en un volumen de gas que está en estado de equilibrio CO2-pH con un medio M1, por ejemplo, en el gas de escape de un biorreactor que comprende el medio M1.

Un valor "valor de PACO" es un valor de datos. Como se especifica anteriormente, el valor de PACO es un valor de datos que es indicativo de una desviación de una tasa de gas de escape CO2 medida en el biorreactor a partir de una tasa de gas de escape CO2 predicha del biorreactor. La tasa de gas de escape CO2 predicha es la tasa de gas de escape predicha de dicho medio en el biorreactor en estado de equilibrio pH-CO2 en ausencia del cultivo celular y bajo la condición de que el valor de pH del medio en estado de equilibrio sea idéntico al valor de pH del biorreactor medido cuando se mide la tasa de gas de escape CO2 en el biorreactor. El valor de PACO depende de la cantidad de gas de escape CO2 producido por las células del cultivo celular en el biorreactor mientras se cultiva el cultivo celular. El cálculo del valor de PACO usa exclusivamente como entrada preferentemente los siguientes datos: la tasa de gas de escape CO2 actual y el valor de pH actual y la tasa de entrada de gas total del biorreactor en el momento de recibir (medir) la tasa de gas de escape CO2 actual. Además, se usa como entrada una relación específica de medio.

De acuerdo con modos de realización, el sistema usado para supervisar y/o comparar estados en un biorreactor está configurado para calcular el valor de PACO ("PACOB1-ti", "PACOb2-m"). El cálculo del valor de PACO comprende:

- introducir el valor de pH actual recibido en la relación específica de medio para obtener una concentración de CO2 predicha ("FCO2exp", por ejemplo, FCO2m1-m para el biorreactor B1 o FCO2m2-m para el biorreactor B2) en el volumen de gas del biorreactor en estado de equilibrio con el medio en el momento de medir la tasa de gas de escape CO2 actual y el valor de pH actual;

- multiplicar la concentración de CO2 predicha ("FCO2exp") por la tasa de entrada de gas total del biorreactor para obtener la tasa de gas de escape CO2 predicha ("ACOexp") del biorreactor; la tasa de gas de escape CO2 predicha es la tasa de gas de escape predicha de dicho agente de medio en estado de equilibrio pH-CO2 en ausencia del cultivo celular y bajo la condición de que el valor de pH del medio en estado de equilibrio sea idéntico al valor de pH actual medido recibido de la entrada del biorreactor en la relación específica de medio;

- restar la tasa de gas de escape CO2 medida (ACOb1-m-m, ACOb2-m-m) del biorreactor de la tasa de gas de escape CO2 predicha ("ACOmedida", por ejemplo, ACOb1-exp-m, ACOb2-exp-m) del biorreactor para obtener el valor de PACO como la diferencia de la tasa de gas de escape CO2 medida y la esperada.

El valor de PACO depende de la cantidad de gas de escape CO2 producido por las células del cultivo celular en el biorreactor mientras se cultiva el cultivo celular y representa un parámetro "integrador" que también depende del valor de pH actual y del conocimiento derivado empíricamente sobre la interdependencia entre pH y la concentración de CO2 en equilibrio del medio particular usado.

De acuerdo con modos de realización, el cálculo de la tasa de gas de escape CO2 predicha ACOb1-exp-m del biorreactor B1 en el momento (ti) actual se realiza de acuerdo con:

AC O Bi-EXP-t¡[mol/min]= ^FCO2Bi-ExP-ti [%]~j ^{x j q i B1} jmOj, en la que TGIb1 es la cantidad total de flujo de entrada de gas del biorreactor B1 en el momento (ti) actual, y en la que FC02bi-exp-m es la concentración de CO2 predicha en el volumen de gas del biorreactor en % en estado de equilibrio con el medio en el momento de medir la tasa de gas de escape CO2 actual y el valor de pH actual.

El cálculo mencionado anteriormente del valor de PACO puede suponer, en algunos modos de realización, que la relación entre un mol de CO2 y su volumen sea la de un gas ideal. Otros modos de realización pueden comprender además etapas de cálculo adicionales para compensar los efectos de la temperatura y/o presión del biorreactor supervisado actualmente sobre el volumen molar de CO2, para compensar errores de medición, humedad y/u otras fuentes potenciales de error.

De acuerdo con modos de realización, las etapas de cálculo mencionadas anteriormente se realizan de forma análoga para el biorreactor de referencia para calcular los valores de PACO de referencia y para generar el perfil de PACO de referencia.

Una "relación específica de medio" como se usa en el presente documento es una función, por ejemplo, una ecuación, que predice una concentración de CO2 en un volumen de gas que está en estado de equilibrio pH-CO2 con un medio particular (libre de células), teniendo el medio un valor de pH dado. La función se obtiene empíricamente para dicho medio particular y está adaptada para predecir las tasas de gas de escape CO2 para muchos valores de pH diferentes proporcionados como entrada.

Un "medio", también denominado "medio de crecimiento" o "medio de cultivo" es un líquido diseñado para soportar el crecimiento de microorganismos o células. Existen diferentes tipos de medios para cultivar diferentes tipos de células. Existen medios usados para el cultivo celular, que usan tipos de células específicas derivados de plantas o animales, y para el cultivo microbiológico, que se usan para cultivar microorganismos, tales como bacterias u hongos. Algunos organismos requieren entornos especializados debido a los complejos requisitos nutricionales. Por ejemplo, el medio puede consistir en agua que comprenda bicarbonato de sodio o carbonato de calcio que básicamente esté libre de cualquier otro componente. Asimismo, el medio puede ser un "medio rico" que comprenda componentes adicionales como nutrientes, factores de crecimiento, hormonas u otras proteínas, etc. Por ejemplo, el medio puede ser un medio de nutrientes, un medio mínimo, un medio diferencial o un medio enriquecido.

Un "valor de FCO2" es un valor de datos. Un "valor de ACO" es un valor de datos. El significado y cálculo de los valores de datos respectivos se describen en el presente documento para diversos modos de realización de la invención. "FCO2" o "[%] de CO2", también denominado "concentración de CO2", es la "fracción de gas CO2" en un volumen de gas, por ejemplo, en el gas de escape de un biorreactor.

Un "perfil" es un conjunto de valores de datos o una relación matemática que indica la variación de un valor de parámetro a lo largo del tiempo. El valor de parámetro puede ser, por ejemplo, un valor de PACO, una concentración de CO2 en el gas de escape ("fracción de CO2" o "FCO2"), una tasa de gas de escape CO2 ("valor de ACO") o el valor de pH obtenido de un biorreactor.

La predicción del valor de ACO es específica para el medio usado en el biorreactor de referencia y en el biorreactor en comparación con el biorreactor de referencia.

El valor de "pH" es un valor de parámetro de entrada usado para especificar un valor de pH del medio M i en estado de equilibrio pH-CO2 en ausencia del cultivo celular.

"REL-M1" es un conjunto de uno o varios parámetros conectados por operadores. Los parámetros se obtienen: - ajustando muestras del medio que carece de cultivo celular, a múltiples valores de pH diferentes, dejando, de este modo, que las muestras alcancen el equilibrio pH-CO2 con el volumen de gas,

- determinando la fracción de gas CO2 en un volumen de gas respectivo que está en equilibrio pH-CO2 con el medio en las muestras,

- representando las fracciones de gas CO2 determinadas frente a los valores de pH en equilibrio respectivos de las muestras,

- ajustando una curva en los valores representados y

- derivando los parámetros de la relación específica de medio de la curva ajustada.

Por tanto, la relación específica de medio se puede identificar empíricamente, por ejemplo, antes de que se inocule el biorreactor de referencia con el cultivo celular de referencia. De acuerdo con modos de realización, también es posible determinar empíricamente la relación específica de medio después de que el cultivo celular se cultivara y creciera en el biorreactor de referencia. En este caso, sin embargo, es necesario que el valor de pH, la tasa de flujo de entrada de gas total y la fracción de CO2 en el gas de escape del biorreactor de referencia se supervisen y almacenen para permitir calcular el perfil de referencia de PACO para dicho biorreactor de referencia tan pronto como se determine empíricamente la relación específica de medio.

De acuerdo con algunos modos de realización, la relación específica de medio se obtiene llenando un biorreactor, por ejemplo, el biorreactor de referencia, con el medio, con lo que el medio no comprende las células del cultivo celular, y estableciendo la temperatura y presión del biorreactor de referencia en valores predefinidos, por ejemplo, 20 °C y presión atmosférica estándar. A continuación, se puede establecer el medio en diferentes valores de pH, por ejemplo, incrementando o disminuyendo la concentración de CO2 en el volumen de gas por encima del medio por medio de una tasa de flujo de entrada de gas CO2 modificada, y después de algún tiempo (típicamente minutos u horas), cuando el medio se haya equilibrado (alcanzado el estado de equilibrio pH-CO2 al pH y a la temperatura y presión predefinidas dados), se mide la concentración de CO2 en el volumen de gas por encima de dicho medio (que se correlaciona con la presión parcial de CO2 en dicho estado de equilibrio). Dicha medición se realiza, por ejemplo, analizando la concentración de CO2 en el volumen de gas por encima del medio o por medio de la fracción de volumen de CO2 en el gas de escape. Los pares adquiridos de valores de pH y concentraciones de CO2 (o valores de gas de escape CO2) en equilibrio medidos en la muestra (biorreactor o alícuota) se representan en un sistema de coordenadas. La representación se puede realizar automáticamente por un sistema informático que, además, puede emitir el gráfico en forma de una impresión basada en papel y/o un gráfico presentado en una pantalla de ordenador. La representación también se puede realizar manualmente. Se ajusta una curva automática o manualmente a dicho gráfico y se calculan los parámetros que son descriptivos de dicha curva ajustada. Los parámetros definen la relación específica de medio del valor de pH y la concentración de CO2 de un volumen de gas por encima de dicho medio cuando dicho medio está en equilibrio pH-CO2 a un valor de pH particular. Después de haber calculado los parámetros, el medio en el biorreactor de referencia se puede establecer en un valor de pH deseado, se puede inocular con el cultivo celular y se puede supervisar (con respecto a un valor de pH actual en el medio, una tasa de gas de escape CO2 actual y tasa de flujo de entrada total de gas actual) para obtener el perfil de referencia de PACO. Este enfoque tiene la ventaja de que no es posible ningún equipo adicional para la determinación empírica de la relación específica de medio y que el medio se puede usar para obtener dicha relación y para cultivar las células.

De acuerdo con otros modos de realización, la relación específica de medio se obtiene creando múltiples muestras en forma de alícuotas de dicho medio, teniendo cada muestra un valor de pH diferente. Las muestras se dejan a una temperatura y presión predefinidas durante algún tiempo (por ejemplo, varios minutos u horas) para permitir el equilibrio pH-CO2 entre el gas y el medio líquido en cada muestra.

Las muestras se pueden obtener secuencialmente, por ejemplo, cambiando el valor de pH de una única muestra y realizando mediciones secuenciales, o se pueden obtener creando múltiples muestras de dicho medio en paralelo, estableciéndose cada alícuota a un valor de pH diferente modificando la concentración de CO2 del volumen de gas por encima del medio. La muestra se puede llenar en cualquier recipiente que permita el establecimiento y medición de un valor de pH actual y permita la modificación de la concentración de CO2 y la medición de una concentración de CO2 o una tasa gas de escape CO2 en estado de equilibrio.

De acuerdo con algunos modos de realización, la ecuación FCO2Mi(pH) = REL-M1(pH) es una ecuación lineal de acuerdo con [%] de FCO2Mi(pH) = a i x pH a2. En este caso, los parámetros a i y a2 son los parámetros derivados de la curva ajustada. La unidad [%] se refiere a la fracción de gas CO2 del volumen de gas por encima del medio en una muestra en estado de equilibrio pH-CO2.

De acuerdo con otros modos de realización, la ecuación FCO2Mi(pH) = REL-M1(pH) es una ecuación polinómica de acuerdo con [%] de FCO2Mi(pH) = b i x pH2 b2 x pH b3. En este caso, los parámetros b i, b2 y b3 son los parámetros derivados de la curva ajustada.

Determinar empíricamente la relación específica de medio y los parámetros específicos de medio correspondientes puede tener el efecto beneficioso de que incluso en caso de que no se conozca la composición exacta del medio (que es comúnmente el caso para muchos medios en el mercado), se puede determinar experimentalmente el impacto de un valor de pH particular sobre la concentración de CO2 en equilibrio en un volumen de aire en equilibrio pH-CO2 con dicho medio. Por tanto, el valor de PACO se puede calcular también cuando se usan medios en los que su composición no sea conocida.

De acuerdo con modos de realización preferentes, el cultivo celular del biorreactor comprende el mismo tipo de células o muy similar que el cultivo celular cultivado en el biorreactor de referencia. El metabolismo y los perfiles de cultivo de diferentes tipos de células, por ejemplo, bacterias y levaduras, normalmente no son comparables. Por ejemplo, las células pueden ser células eucariotas, por ejemplo, células de levadura, células vegetales o células de mamífero, en particular, células humanas. De acuerdo con otros modos de realización, las células pueden ser bacterias o células de arquea.

De acuerdo con modos de realización, en caso de que la diferencia calculada entre el valor de PACO calculado y un valor de PACO de referencia respectivo en el perfil de referencia de PACO supere un valor umbral, la emisión de la diferencia calculada comprende emitir automáticamente una señal de alarma. La señal de alarma puede ser, por ejemplo, una señal acústica y/u óptica, un mensaje comunicado a un dispositivo de usuario (por ejemplo, un ordenador o teléfono móvil) o una unidad de control de biorreactor automatizada. El mensaje se puede comunicar por medio de una red, por ejemplo, Internet o una intranet.

Dichos rasgos característicos pueden permitir a un usuario tomar acciones manualmente para modificar los parámetros del biorreactor o el medio contenido en el mismo de modo que se minimice la diferencia con el valor de PACO de referencia y/o pueda permitir que una unidad de control automatizada realice automáticamente las acciones que se espera que reduzcan la diferencia en el valor de PACO comparado.

De acuerdo con modos de realización, el medio usado en el biorreactor de referencia y en el biorreactor supervisado y/o controlado es un medio tamponado con carbonato.

En su sentido más amplio, cualquier solución que pueda disolver al menos una pequeña cantidad de CO2 es un medio tamponado con carbonato, ya que el CO2 disuelto se disociará en iones HCO3- y H+ de acuerdo con la siguiente ecuación de equilibrio pH-CO2: CO2 H2O ^ HCO3' H+.

De acuerdo con modos de realización, un "medio tamponado con carbonato" es un medio que comprende al menos 10 mMol de una sal de carbonato por litro de medio, con lo que el medio es un medio libre de células (el metabolismo de las células puede modificar el valor de pH y, por tanto, la cantidad de sal de carbonato en el medio). La sal de carbonato puede ser, por ejemplo, bicarbonato de sodio o carbonato de calcio.

El uso de un medio tamponado tiene la ventaja de reducir las fluctuaciones de pH, en particular, en el intervalo de pH biológico de 6-8.

Los tampones de carbonato tienen la desventaja de que el valor de pH en el equilibrio pH-CO2 depende de la presión parcial de dióxido de carbono en el aire y de las cantidades de Co generadas más tarde en el medio por las células, y el CO2 tiene una solubilidad limitada. Por tanto, el uso de tampones de carbonato en biorreactores de acuerdo con enfoques del estado de la técnica prohibía, a menudo, una comparación exacta de los estados de cultivos celulares cultivados en biorreactores que comprendían un medio tamponado con carbonato a diferentes condiciones de temperatura y/o presión. El uso de un medio tamponado con carbonato en combinación con la comparación de estados basada en PACO de los biorreactores tiene el efecto beneficioso de que es posible usar un medio en el que su tampón no interfiere con el metabolismo celular con tanta fuerza como, por ejemplo, los tampones de fosfato, pero que, no obstante, permite comparar biorreactores que funcionan a temperaturas y/o presiones diferentes. Incluso en caso de que la sal de carbonato del tampón interfiera con el metabolismo celular, el valor de PACO integra dicho efecto y todavía permite una comparación y/o sincronización exacta de los estados en un biorreactor.

De acuerdo con modos de realización, el biorreactor de referencia difiere del biorreactor con respecto a uno o más de los siguientes rasgos característicos:

a) el volumen de gas en el biorreactor,

b) el volumen del medio en el biorreactor,

c) el número de Reynolds del biorreactor,

d) el número de Newton del biorreactor,

e) las dimensiones del biorreactor (por ejemplo, proporción de altura con respecto a diámetro),

f) rasgos característicos geométricos del biorreactor y/o deflectores del biorreactor (por ejemplo, la conformación cilíndrica o poligonal de un biorreactor, el tamaño, conformación, orientación y posición de los deflectores y otros componentes dentro del biorreactor, tales como sensores, bombas, agitadores, etc.),

g) la configuración del agitador (por ejemplo, el tamaño, orientación y conformación de un agitador en el biorreactor, los intervalos de agitación, la duración del intervalo de agitación, el número y orientación relativa de las unidades de agitación),

h) la tasa de agitación,

i) el coeficiente de transferencia de masa volumétrica para oxígeno (kLa) del biorreactor,

j) tasa de flujo de entrada de gas total y/o tasa de flujo de entrada de O2 y/o tasa de flujo de entrada de N2 y/o tasa de flujo de entrada de CO2,

k) entrada de potencia,

l) presión en el biorreactor,

m) tiempo de retención de las burbujas de gas en el medio,

n) tamaño y distribución de las burbujas de gas en el medio,

o) velocidad superficial (se puede expresar en metros por segundo [m/s] y puede representar la velocidad relativa entre un eje y un cojinete del medio en un biorreactor),

p) un parámetro calculado como una derivada de uno o más de los parámetros a)-o).

El parámetro "entrada de potencia" como se usa en el presente documento especifica la cantidad de entrada de potencia de un agitador de un biorreactor. Las diferentes configuraciones de agitador pueden tener diferentes entradas de potencia a velocidades periféricas idénticas o de agitación idénticas. La entrada de potencia a velocidades de agitador idénticas puede depender de la viscosidad del medio.

Por tanto, los modos de realización de la invención pueden permitir comparar el estado de un biorreactor con el estado de otro biorreactor (de "referencia") incluso en caso de que los dos biorreactores comparados difieran con respecto a muchos parámetros de diseño diferentes. Esto puede ser muy ventajoso, ya que se ha observado que mantener todos dichos parámetros idénticos para permitir una comparación y/o control de los estados en un biorreactor, a menudo, no era factible en la práctica. Al usar un valor de PACO, el estado de dos biorreactores se puede comparar de forma fácil (un valor de PACO idéntico significa un estado idéntico con respecto a los parámetros pertinentes) incluso en caso de que los dos biorreactores tengan diferentes números de Reynolds y/o de Newton, tengan una velocidad o configuración diferente del agitador o similares.

De acuerdo con modos de realización, el biorreactor supervisado y/o controlado se hace funcionar usando la tasa de aireación como parámetro de control para contrarrestar las desviaciones del valor de PACO actual del biorreactor a partir de un valor de PACO de referencia.

De forma sorprendente, se observó que en caso de que se use la tasa de aireación como parámetro de control para contrarrestar cualquier desviación de un valor de PACO de un valor de PACO de referencia deseado, el valor de PACO permite comparar los estados de los biorreactores también en caso de que existan diferencias de presión (en el intervalo que típicamente se encuentra cuando se hacen funcionar los biorreactores, por ejemplo, variaciones de presión provocadas por cambios inducidos por el clima en la presión atmosférica) entre los dos biorreactores. En general, la presión tiene un impacto sobre el equilibrio pH-CO2 de un medio. Una presión ascendente da como resultado una reducción de la tasa de gas de escape CO2 mientras que el valor de pH permanece constante. En efecto, el valor de PACO disminuye en caso de que la presión ascienda. Para compensar el efecto de la presión ascendente, se usa una unidad de controlador, de acuerdo con modos de realización, que reduce automáticamente la tasa de aireación (medida, por ejemplo, en vvm = flujo volumétrico de gas por unidad de volumen del medio líquido por minuto) hasta que la diferencia de PACO sea idéntica a un valor de PACO de referencia deseado o haya alcanzado cero o haya alcanzado una tasa de aireación mínima predefinida (para garantizar que las células se complementen con una cantidad suficiente de oxígeno). Al reducir la tasa de aireación, también se reduce la tasa de gas de escape CO2 y se incrementa la PACO. Por tanto, al usar la tasa de aireación como parámetro de control, las desviaciones de presión se pueden compensar de forma fácil y la PACO se puede usar como indicador de estado fiable de un biorreactor y su cultivo celular.

De acuerdo con algunos modos de realización, el biorreactor de referencia y el biorreactor están localizados en diferentes regiones geográficas, por ejemplo, diferentes edificios, ciudades o países. En un aspecto beneficioso, la comparación de los valores de PACO permite comparar con exactitud estados de cultivos celulares cultivados (secuencialmente o en paralelo) en biorreactores que difieren entre sí con respecto a uno o más de los parámetros mencionados anteriormente. Por tanto, los modos de realización de la invención pueden permitir reproducir un cultivo celular en un biorreactor que tenga dimensiones completamente diferentes como biorreactor de referencia y se pueda desviar del biorreactor de referencia en muchos aspectos.

Preferentemente, las tasas de flujo de entrada de gas CO2 del biorreactor supervisado y/o controlado y el biorreactor de referencia en un momento ti respectivo en el perfil son idénticas para permitir el establecimiento de equilibrios pH-CO2 dinámicos comparables en ambos biorreactores.

En otro aspecto beneficioso, se reducen los costes y se incrementa la flexibilidad: previamente, para cultivar células en un biorreactor particular en condiciones similares o idénticas a las que se observaban en un reactor de referencia, a menudo, era necesario garantizar que el tamaño, conformación, mecanismo de agitación y una pluralidad de otros rasgos característicos del biorreactor eran idénticos al biorreactor de referencia para garantizar que cada parámetro individual del biorreactor particular sea lo más similar como sea posible al biorreactor de referencia. Esto incrementaba los costes porque los biorreactores disponibles no se podían usar si su tamaño, el tipo de biorreactor y/o la versión de dicho biorreactor o algunas de sus partes no eran idénticos a los rasgos característicos respectivos de los parámetros de referencia. A menudo, existen diferentes estándares y normas para válvulas y otros elementos del biorreactor en diferentes países. Por tanto, en varios casos, no es prácticamente posible poner en marcha un biorreactor en el que sus dimensiones y/o componentes sean idénticos a los del biorreactor de referencia, lo que dificulta o imposibilita la comparación de biorreactores de diferentes países. Usando un valor de referencia de PACO como se describe anteriormente, se observó que se nivelan las diferencias con respecto al tamaño o conformación o cualquier otro rasgo característico que tenga un impacto sobre el equilibrio pH-CO2 del medio y, por tanto, tenga un impacto sobre el crecimiento de las células en dicho medio y es posible una comparación exacta de los estados de un cultivo celular incluso en caso de que los dos biorreactores comparados o sus componentes difieran significativamente.

De acuerdo con modos de realización, el cálculo del valor de PACO del biorreactor supervisado y/o controlado en un momento actual comprende calcular, para cada uno de las tasas de gas de escape CO2 y los valores de pH actuales recibidos del biorreactor supervisado y/o controlado:

- la fracción de gas de escape CO2 esperada FCO2b1-exp-m de un volumen de desgasificación actual del biorreactor (104) de acuerdo con: FCO2B1-EXP-ti = REL-M1 (pHB1-ti), en la que FCO2B1-EXP-ti es una fracción de gas de escape CO2 predicha del volumen de gas de escape total (t GOb1) del biorreactor (104) en % en el momento (ti) actual, calculándose la predicción usando el valor de pH actual recibido (pHB1-ti) como entrada para REL-M1(pHB1-ti), en la que REL-M1 es la relación específica de medio (136) del medio (M1), en la que pHB1-ti es el valor de pH actual recibido en el medio del biorreactor (104, 106) en un momento ti; por tanto, la fracción de gas de escape CO2 esperada en el biorreactor se calcula bajo la suposición de que el medio del biorreactor carece de cultivo celular, tiene el valor de pH usado como entrada de la relación específica de medio y está en estado de equilibrio pH-CO2 con la fase gaseosa en el biorreactor por encima de dicho medio y, por tanto, también está en equilibrio con el volumen de gas de escape total de dicho biorreactor.

- un valor de la tasa de gas de escape CO2 esperada ACOb1-exp-m [mol/min] de acuerdo con:

(^{FCO2 \} _{-----10C)EXP~") x TG/B1, en la que el valor de ACOb1-exp-m es la tasa de gas de escape CO2}esperada del biorreactor (104) cuando el medio del biorreactor tiene el valor de pH medido actualmente y está en equilibrio pH-CO2 con la fase gaseosa por encima de dicho medio, en la que la t G|b1 es la cantidad total de flujo de entrada de gas del biorreactor (104) en el momento (ti); la cantidad total de flujo de entrada de gas del biorreactor es aproximadamente idéntica a la cantidad total de salida de gas;

- el valor de PACObuí de acuerdo con: PACObuí = ACOb1-exp-m - ACOB1-M-ti, en la que ACOB1-M-ti es la tasa de gas de escape CO2 medida en el momento ti en el biorreactor.

De acuerdo con modos de realización, el medio en el biorreactor de referencia tiene un primer volumen y una primera masa total. El medio en el biorreactor supervisado y/o controlado tiene un segundo volumen y una segunda masa total. El primer volumen y el segundo volumen difieren entre sí. En consecuencia, la primera masa y la segunda masa difieren entre sí. El cálculo de la diferencia entre cada uno de los valores de PACO calculados y su valor de PACO de referencia respectivo en el perfil de referencia de PACO comprende:

- dividir, por el procesador, el valor de PACO calculado entre el segundo volumen; y dividir, por el procesador, el valor de PACO de referencia respectivo en el perfil de referencia de PACO entre el primer volumen; o

- dividir, por el procesador, el valor de PACO calculado entre la segunda masa; y dividir, por el procesador, el valor de PACO de referencia respectivo en el perfil de referencia de PACO entre la primera masa.

Dichos rasgos característicos pueden ser ventajosos, ya que permiten comparar el estado de un cultivo celular cultivado en biorreactores que comprenden respectivamente diferentes volúmenes del medio. Por ejemplo, el biorreactor de referencia puede ser un biorreactor de prueba que comprenda 100 litros del medio. El biorreactor de referencia se puede usar para identificar parámetros adecuados (temperatura, presión, tasa de alimentación, tasa de flujo de entrada de O2, pH, tasa de agitación y similares) para cultivar eficazmente un cultivo celular, por ejemplo, para purificar un péptido particular. Por tanto, el reactor de referencia se puede haber usado múltiples veces bajo diferentes condiciones para encontrar los parámetros óptimos para cultivar las células en el biorreactor de referencia. Después de haber identificado el conjunto de parámetros "óptimo" o "adecuado" para el biorreactor de referencia, se cultiva al menos un cultivo celular en el reactor de referencia bajo dicho conjunto de parámetros "óptimo". El perfil de PACO de referencia se obtiene del reactor de referencia mientras se cultiva el cultivo celular bajo dichas condiciones "óptimas" o "adecuadas".

En el "modo de producción" (que típicamente sigue al modo de prueba), el cultivo celular se cultiva a gran escala ("modo de producción") en un biorreactor más grande o incluso en múltiples biorreactores más grandes que se hacen funcionar en paralelo. Como la dimensión y, opcionalmente, también otros parámetros del biorreactor, como la configuración de dirección, tasa de flujo de entrada de O2 y/u otros parámetros del biorreactor más grande, pueden diferir del biorreactor de referencia, el uso del perfil de referencia de PACO calculado de la manera dependiente del volumen descrita anteriormente permite una comparación exacta de los estados de un cultivo celular incluso en caso de que los cultivos celulares se cultiven en biorreactores de tamaños significativamente diferentes. Por ejemplo, algunos parámetros, como la tasa de agitación, configuración de agitación, etc. pueden ser específicos para el biorreactor de referencia y pueden no ser reproducibles en otro biorreactor en el que el cultivo celular se cultivará a mayor escala. De acuerdo con otro ejemplo, el volumen del medio en el biorreactor usado para propósitos de producción puede ser 10 veces, 100 veces o incluso más de 1000 veces mayor que el volumen del medio en el biorreactor de referencia. Por tanto, los modos de realización de la invención permiten aumentar a escala con exactitud el cultivo de cultivos celulares con respecto a diferencias a gran escala. De forma análoga, los modos de realización de la invención permiten reducir a escala el cultivo de cultivos celulares con respecto a diferencias a gran escala normalizando el valor de PACO y el valor de PACO de referencia con los diferentes volúmenes de los medios o masas de los medios.

De acuerdo con modos de realización, el perfil de referencia de PACO cubre múltiples fases de funcionamiento del biorreactor de referencia. Las fases comprenden:

- una fase libre de alimentación durante la que el cultivo celular se cultiva en el biorreactor de referencia sin alimentación;

- una fase de alimentación durante la que el cultivo celular se cultiva en el biorreactor de referencia en presencia de una tasa de alimentación dada, no excretando el cultivo celular un metabolito que afecta al valor de pH del medio; un metabolito que afecta al valor de pH podría ser, por ejemplo, iones lactato y/o H+.

- una fase de alimentación durante la que el cultivo celular se cultiva en el biorreactor de referencia en presencia de una tasa de alimentación dada, excretando el cultivo celular un metabolito que afecta al valor de pH del medio.

De acuerdo con modos de realización, el sistema comprende una unidad de control configurada para modificar automáticamente uno o más parámetros de control del biorreactor de modo que se minimice la diferencia entre los valores de PACO calculados y los valores de PACO de referencia respectivos en el perfil de referencia de PACO.

Por tanto, los modos de realización de la invención no solo pueden supervisar y comparar el estado de cultivos celulares cultivados en biorreactores con propiedades y parámetros significativamente diferentes, sino también permiten usar esta información para controlar el biorreactor de una manera en que las condiciones en el biorreactor que son pertinentes para el crecimiento celular sean muy similares a las condiciones en el biorreactor de referencia mientras se obtiene el perfil de PACO de referencia.

La unidad de control puede ser, por ejemplo, un ordenador de control que se acople de forma funcional al biorreactor que se controla. De forma alternativa, la unidad de control puede ser un dispositivo de procesamiento de datos de un usuario, por ejemplo, de un operario del biorreactor, habiendo instalado el dispositivo de procesamiento de datos una aplicación de programa informático de gestión del biorreactor que supervisa y/o controla automática o semiautomáticamente el biorreactor de una manera que se minimice la diferencia entre los valores de PACO obtenidos de forma dinámica del biorreactor y los valores de PACO de referencia en el perfil de PACO de referencia. Por ejemplo, el sistema de procesamiento de datos puede ser un ordenador de sobremesa, un teléfono inteligente, una tableta o similares. La unidad de comparación puede ser una pieza de lógica de programa ejecutable automáticamente, por ejemplo, en forma de lógica de equipo informático, programa informático y/o microprograma. La unidad de comparación se puede acoplar de forma funcional a la unidad de control, por ejemplo, puede ser una parte integrante de la unidad de control o puede ser un programa de aplicación configurado para interoperarse con la unidad de control.

De acuerdo con modos de realización, la unidad de control puede controlar el biorreactor como sigue:

En caso de que los valores de PACO obtenidos en el biorreactor supervisado y/o controlado sean mayores que los valores de PACO de referencia respectivos en el perfil de referencia de PACO, la unidad de control modifica automáticamente uno o más parámetros de control del biorreactor realizando una o más de las siguientes operaciones:

- reducir la tasa de flujo de entrada de aire total y/o reducir la tasa de flujo de entrada de gas O2 y/o reducir la tasa de flujo de entrada de gas CO2 y/o reducir la tasa de flujo de entrada de base en el biorreactor y/o modificar la presión o la temperatura del biorreactor.

En caso de que los valores de PACO sean menores que los valores de PACO de referencia respectivos en el perfil de referencia de PACO, la unidad de control modifica automáticamente uno o más parámetros de control del biorreactor realizando una o más de las siguientes operaciones:

- incrementar la tasa de flujo de entrada de aire total y/o incrementar la tasa de flujo de entrada de gas O2 y/o

- incrementar la tasa de flujo de entrada de gas CO2 y/o incrementar la tasa de flujo de entrada de base en el biorreactor y/o modificar la presión o la temperatura del biorreactor.

El uso de una desviación de PACO como parámetro de control para, por ejemplo, añadir sustancias ácidas o básicas para modificar el valor de pH de un medio en lugar de minimizar las diferencias de parámetros individualmente (por ejemplo, minimizando las diferencias de pH a un pH de referencia en el biorreactor de referencia) puede tener la ventaja de que se mejora la calidad del control: El valor de PACO depende del valor de pH, pero no es idéntico al valor de pH. Por tanto, el valor de pH, de acuerdo con modos de realización, se controla indirectamente por medio del parámetro de control de diferencias de PACO. Esto introduce una clase de solidez en el bucle de control que prohíbe, o al menos reduce, el bien conocido problema de oscilación del parámetro controlado sobre un valor de punto de ajuste debido a la latencia del controlador.

De acuerdo con modos de realización, el sistema comprende además el biorreactor controlado y/o supervisado. El sistema puede comprender además opcionalmente un biorreactor adicional y el biorreactor de referencia, y/o un dispositivo de visualización para presentar la diferencia de perfiles de PACO en una pantalla.

En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para supervisar desviaciones de un estado de un cultivo celular en un biorreactor, también denominado en el presente documento "biorreactor supervisado y/o controlado", a partir de un estado de referencia de un cultivo celular en un biorreactor de referencia. El biorreactor comprende el mismo medio que el biorreactor de referencia. El procedimiento comprende:

- recibir, por una unidad de comparación de un sistema para supervisar estados en un biorreactor, un perfil de referencia de PACO, siendo el perfil de referencia de PACO una representación de la variación en un valor de PACO de referencia frente al tiempo, siendo el perfil de referencia de PACO indicativo de una desviación de una tasa de gas de escape CO2 medida en el biorreactor de referencia a partir de una tasa de gas de escape CO2 predicha del biorreactor de referencia, siendo la tasa de gas de escape CO2 predicha la tasa de gas de escape predicha de dicho medio en el biorreactor de referencia en estado de equilibrio pH-CO2 en ausencia del cultivo celular y bajo la condición de que el valor de pH del medio en estado de equilibrio sea idéntico al valor de pH del biorreactor de referencia medido cuando se mide la tasa de gas de escape CO2 en el biorreactor de referencia, dependiendo el perfil de referencia de PACO de la cantidad de gas de escape CO2 producido por las células del cultivo celular en el biorreactor de referencia mientras se cultiva el cultivo celular;

- recibir, por la unidad de comparación, un objeto de datos que comprende una relación específica de medio, siendo la relación específica de medio específica para el medio e indicando una relación entre el valor de pH del medio y una fracción respectiva de gas CO2 en un volumen de gas cuando dicho medio está en estado de equilibrio pH-CO2 con dicho volumen de gas y carece de cultivo celular;

- recibir repetidamente, en un momento actual, una tasa de gas de escape CO2 actual del biorreactor y un valor de pH actual del medio del biorreactor medidos durante el cultivo del cultivo celular en el biorreactor;

- calcular, por la unidad de comparación, para cada una de las tasas de gas de escape CO2 actuales recibidas:

■ un valor de PACO, siendo el valor de PACO indicativo de una desviación de una tasa de gas de escape CO2 medida en el biorreactor a partir de una tasa de gas de escape CO2 predicha, siendo la tasa de gas de escape CO2 predicha la tasa de gas de escape predicha de dicho medio en estado de equilibrio pH-CO2 en el biorreactor en ausencia del cultivo celular y bajo la condición de que el valor de pH del medio en estado de equilibrio sea idéntico al valor de pH del biorreactor (104, 106) medido cuando se mide la tasa de gas de escape CO2 en el biorreactor, dependiendo el valor de PACO de la cantidad de gas de escape CO2 producido por las células del cultivo celular en el biorreactor mientras se cultiva el cultivo celular, usando el cálculo del valor de PACO como entrada:

o la tasa de gas de escape CO2 actual recibida;

o el valor de pH actual recibido;

o la relación específica de medio;

■ una diferencia entre el valor de PACO calculado y un valor de PACO de referencia respectivo en el perfil de referencia de PACO;

- emitir, por la unidad de comparación, la diferencia calculada, siendo la diferencia calculada indicativa de una desviación del estado del cultivo celular en el biorreactor a partir del estado de referencia.

De acuerdo con modos de realización, el perfil de referencia de PACO comprende una pluralidad de valores de PACO de referencia. El procedimiento comprende además calcular los valores de PACO de referencia:

- recibiendo un objeto de datos que comprende la relación específica de medio;

- recibiendo repetidamente, en un momento actual, una tasa de gas de escape CO2 actual del biorreactor de referencia en [ L—minJ 1 y 1 un valor de r pH actual del medio del biorreactor de referencia medido en dicho momento actual durante el cultivo del cultivo celular en el biorreactor de referencia;

- calculando, para cada uno de los pares recibidos de una tasa de gas de escape CO2 actual y de un valor de pH actual, uno de los valores de PACO de referencia, usando el cálculo del valor de PACO de referencia como entrada:

o la tasa de gas de escape CO2 actual recibida del biorreactor de referencia;

o el valor de pH actual recibido del biorreactor de referencia;

o la tasa de entrada de gas total del biorreactor de referencia en el momento de recepción de la tasa de gas de escape CO2 actual; y

o la relación específica de medio.

Por ejemplo, los valores de PACO de referencia se pueden calcular por la unidad de comparación que compara el perfil de PACO de referencia con los valores de PACO calculados actualmente del biorreactor supervisado y/o controlado. De forma alternativa, los valores de PACO de referencia del perfil de PACO de referencia se pueden calcular por una unidad de procesamiento de datos diferente, por ejemplo, un ordenador de control del biorreactor de referencia.

De acuerdo con modos de realización, el procedimiento comprende además crear el perfil de referencia de PACO del biorreactor de referencia:

- representando los valores de PACO de referencia en un gráfico de tasa de gas de escape CO2 frente al tiempo; - ajustando una curva en los valores de PACO de referencia representados, constituyendo dicha curva el perfil de PACO de referencia.

Dependiendo del modo de realización, la representación y ajuste se pueden realizar de forma completamente automática por un ordenador u otro dispositivo de procesamiento de datos, semiautomática o manualmente. El perfil de PACO de referencia obtenido se puede almacenar en un medio de almacenamiento no transitorio, por ejemplo, en forma de una estructura de datos electrónica. La unidad de supervisión del biorreactor supervisado y/o controlado puede recibir automáticamente dicha estructura de datos por medio de una red o al leer dicha estructura de datos del almacenamiento.

De acuerdo con modos de realización, el cálculo de cada uno de los valores de PACO de referencia PACOR-ti en los momentos ti actuales respectivos en el momento que comprende calcular, para cada uno de las tasas de gas de escape CO2 ACOr-m-m y los valores de pH actuales recibidos del biorreactor de referencia:

- un [%] de la fracción de gas de escape CO2 esperada FCO2R-EXP-ti de un volumen de desgasificación actual del biorreactor de referencia de acuerdo con: [%] de FCO2R-EXP-ti = REL-M1, en la que [%] de FCO2r-exp-m es una fracción de gas de escape CO2 predicha del volumen de gas de escape total del biorreactor de referencia en % en el momento actual, calculándose la predicción usando el valor de pH actual recibido como entrada para REL-M1 (pHR-ti), en la que REL-M1 es la relación específica de medio del medio (M1), en la que pHR-ti es el valor de pH actual recibido en el medio del biorreactor de referencia en un momento ti, por tanto, la fracción de gas de escape CO2 esperada en el biorreactor de referencia se calcula bajo la suposición de que el medio del biorreactor de referencia carece de cultivo celular, tiene el valor de pH usado como entrada de la relación específica de medio y está en estado de equilibrio pH-CO2 con la fase gaseosa en el biorreactor por encima de dicho medio y, por tanto, también está en equilibrio con el volumen de gas de escape total de dicho biorreactor;

- un valor de la tasa de gas de escape CO2 esperada ACOr-exp-m [mol/min] de acuerdo con: ACOR-EXP-ti [mol/min]= ^FCO2R-Exp-ti [%^ x TGIR [m n j, en la que valor de ACOr-exp-m [mol/min] es la tasa de gas de escape CO2 esperada del biorreactor de referencia (102) en [m n j, en la que TGIr es la cantidad total de flujo de entrada de gas del biorreactor de referencia (102) en el momento ti actual,

- el valor de PACOR-ti[^j] de acuerdo con: PACOR-ti = ACOr -EXP-ti [mol/min] - ACOR-M-ti [mol/min], en la que ACOR-M-ti [mol/min] es la tasa de gas de escape CO2 en [mOJ medida en el momento ti en el biorreactor de referencia.

En términos generales, el valor de PACO de un biorreactor particular (por ejemplo, el biorreactor de referencia o biorreactor supervisado B1 o B2) en un momento ti particular se calcula como: PACOti = ACOexp-m - ACOmedida-m, en la que ACOexp-s es la tasa de gas de escape CO2 "predicha" (o "esperada") de dicho medio en el momento ti en dicho biorreactor en estado de equilibrio pH-CO2 en ausencia del cultivo celular y bajo la condición de que el valor de pH del medio en estado de equilibrio sea idéntico al valor de pH actual del biorreactor medido cuando se mide la tasa de gas de escape CO2 en el biorreactor. Por ejemplo, la tasa de gas de escape CO2 predicha se puede obtener introduciendo el valor de pH actual recibido del biorreactor en el momento ti en la relación específica de medio. La tasa de gas de escape CO2 medida se puede obtener de un dispositivo de medición de CO2. La tasa de gas de escape CO2 predicha y la tasa de gas de escape CO2 medida pueden tener la unidad [mol de CO2/min].

La tasa de gas de escape CO2 esperada/predicha del biorreactor de referencia representa, por tanto, una clase de "tasa de gas de escape CO2 libre de células" predicha para el medio a un valor de pH proporcionado como entrada, careciendo el medio de células del cultivo celular y cualquier otro componente que podría modificar el estado de equilibrio pH-CO2 del medio.

Un "dispositivo de medición de pH" como se usa en el presente documento es un dispositivo y/o sustancia usada para medir un valor de pH actual en un medio. Un dispositivo de medición de pH puede ser, por ejemplo, un indicador de pH (como fenolftaleína), en forma de solución o tiras de pH, o un aparato potenciométrico. De acuerdo con modos de realización preferentes, el dispositivo de medición de pH es un medidor de pH. El medidor de pH puede ser, por ejemplo, un medidor de pH continuo, es decir, un medidor de pH que puede medir continua y repetidamente el pH del medio de un biorreactor sin tener que extraer muestras y sin tener que insertar dicho medidor de pH en el medio para cada medición individual. Por ejemplo, un dispositivo de medición de pH puede ser un voltímetro preciso, conectado al medio y a un electrodo de referencia, y a escala de tal manera que no presente el potencial medido, sino el valor de pH listo. Preferentemente, el dispositivo de medición de pH se sumerge en el medio y se usa para medir repetidamente el valor de pH actual en el medio durante todo el tiempo mientras se cultivan células en el biorreactor. Por ejemplo, el dispositivo de medición de pH puede medir un valor de pH actual cada minuto, o cada 30 minutos, o cada hora. En los típicos medidores de pH actuales usados como dispositivos de medición de pH, un electrodo de referencia está integrado en el electrodo de pH, lo que hace que el dispositivo sea compacto.

Una "medición en línea" como se usa en el presente documento es un procedimiento de obtención de un valor de medición que es descriptivo de los rasgos característicos de estado de un biorreactor o de un cultivo celular contenido en el mismo, con lo que la duración requerida para realizar la medición es más corta que el tiempo durante el que dichos rasgos característicos cambian significativamente. Un cambio significativo puede ser un cambio en más de un valor umbral predefinido. Por ejemplo, un cambio en más de un 5 % se puede considerar como un cambio significativo. El umbral puede variar para diferentes rasgos característicos. Las mediciones en línea pueden permitir controlar un biorreactor en tiempo real.

Una "medición fuera de línea" es un procedimiento de obtención de un valor de medición que es descriptivo de los rasgos característicos de estado de un biorreactor o de un cultivo celular contenido en el mismo, con lo que la duración requerida para realizar la medición es más larga que el tiempo durante el que dichos rasgos característicos cambian significativamente. Un cambio significativo puede ser un cambio en más de un valor umbral predefinido. Por ejemplo, un cambio en más de un 5 % se puede considerar como un cambio significativo. Un ejemplo típico para una medición fuera de línea es el muestreo automatizado, semiautomatizado o manual de una sonda del medio, por ejemplo, para medir un valor de pH actual. Las mediciones fuera de línea se basan en un procedimiento de muestreo discontinuo. Ya que los rasgos característicos del biorreactor pueden haber cambiado entretanto desde que se tomó la muestra, el control del biorreactor en base a datos de medición fuera de línea tiende a ser de baja calidad debido a tiempos de latencia significativos entre el momento de medición y el momento de realizar una operación de control respectiva.

De acuerdo con modos de realización, el valor de pH actual del biorreactor supervisado y/o controlado se mide por un dispositivo de medición de pH continuo, por ejemplo, un medidor de pH sumergido en el medio de dicho biorreactor. Además, o de forma alternativa, el valor de pH actual del biorreactor de referencia se mide por un dispositivo de medición de pH continuo, por ejemplo, un medidor de pH sumergido en el medio de dicho biorreactor de referencia.

Un "dispositivo de medición de CO2", también denominado "medidor de CO2" o "analizador de CO2" es un dispositivo usado para medir una concentración de CO2 actual en un volumen de gas, por ejemplo, el volumen de gas por encima del medio de un biorreactor o el gas de escape de un biorreactor. De acuerdo con modos de realización, la tasa de gas de escape CO2 actual del biorreactor supervisado y/o controlado se mide por un medidor de gas de escape CO2 continuo, es decir, un dispositivo que puede medir la concentración de CO2 actual en el gas de escape de un biorreactor repetidamente sin tener que insertar o reemplazar un módulo de equipo informático en el biorreactor o su tubería o tuberías de gas de escape conectadas para cada medición de la concentración de CO2. En combinación con la tasa de flujo de entrada de gas total o tasa de gas de escape total, la tasa de gas de escape CO2 se puede determinar automáticamente por el medidor de gas de escape CO2 o un dispositivo de procesamiento de datos conectado a dicho medidor de gas de escape CO2. Además, o de forma alternativa, la tasa de gas de escape CO2 actual del biorreactor de referencia se mide por un medidor de gas de escape CO2 continuo. La tasa de gas de escape actual medida se puede derivar de forma matemática de una concentración de CO2 actual en el gas de escape del biorreactor y un volumen de gas de escape total actual del biorreactor. No obstante, dicha tasa de gas de escape CO2 derivada se denomina en el presente documento "tasa de gas de escape CO2 medida", ya que se puede calcular de forma fácil a partir de la concentración de CO2 medida y la tasa de flujo de entrada de gas total (o tasa de gas de escape total). De acuerdo con algunos modos de realización, dicho cálculo usa, además, el volumen o masa del biorreactor respectivo como entrada para normalizar la tasa de gas de escape CO2 calculada de una manera que se nivele el impacto del volumen del medio.

El uso de dispositivos de medición de pH continuos y/o medidores de gas de escape CO2 continuos puede ser ventajoso, ya que cada valor de PACO o valor de PACO de referencia se puede derivar de parámetros que se pueden medir de forma fácil y repetidamente. Muchos de los biorreactores existentes ya comprenden uno o más medidores de pH sumergidos y/o comprenden o están acoplados con dispositivos de medición que pueden medir la tasa de gas de escape CO2 y/o la tasa de flujo de entrada de gas total. Dependiendo del modo de realización, el biorreactor (o biorreactor de referencia) comprende un único conducto o tubería de entrada de gas o múltiples conductos o tuberías de entrada de gas. Por ejemplo, se puede usar un único conducto o tubería de entrada de gas para suministrar aire ambiental o aire comprimido (ya expandido) de proveedores especiales al biorreactor (biorreactor de referencia). Dicho aire ambiental o aire comprimido puede consistir en una mezcla de gases, en particular, N2, O2 y CO2 que sea típica de la atmósfera terrestre. Además, o de forma alternativa, el único conducto o tubería de entrada de gas o cualquiera de los demás conductos o tuberías de entrada de gas se pueden usar para suministrar gases individuales, tales como N2, O2 y CO2 al biorreactor, por ejemplo, para controlar el crecimiento celular. En cualquier caso, se determina la tasa de flujo de entrada de gas total, por ejemplo, la cantidad total de todos los gases suministrados a un biorreactor por unidad de tiempo por medio de cualquiera de los conductos o tuberías de entrada de gas de un biorreactor.

De acuerdo con modos de realización, el biorreactor (el biorreactor supervisado y/o controlado y/o el biorreactor de referencia) comprende uno o más microburbujeadores para generar burbujas de gas muy finamente dispersadas a partir del gas entrante para acelerar el establecimiento de un equilibrio pH-CO2 entre el medio y el volumen de gas en el biorreactor. Por ejemplo, se puede usar un microburbujeador para una mezcla de gas de flujo de entrada o para cada componente de gas de flujo de entrada individual por separado. Además, o de forma alternativa, uno o cada uno de los dos biorreactores está configurado y se hace funcionar de modo que el dióxido de carbono y uno o más de otros gases (por ejemplo, nitrógeno, oxígeno y/o aire) se añadan juntos simultáneamente al biorreactor como una mezcla de gases. Por ejemplo, se pueden introducir todos los gases de flujo de entrada en el biorreactor como una mezcla de gases, por ejemplo, por medio de una abertura de tubería sumergida o un microburbujeador.

Preferentemente, todos los gases de proceso se introducen en el biorreactor por medio de un microburbujeador y/o en forma de una mezcla de gases en caso de que el volumen del biorreactor esté por debajo de un volumen umbral, por ejemplo, de 400 litros o, por ejemplo, 200 litros.

De acuerdo con modos de realización, la tasa de aireación y el tamaño de las burbujas de los gases de flujo de entrada en el medio del biorreactor se elige de modo que todas las burbujas de gas alcancen el equilibrio pH-CO2 con el medio antes de abandonar el biorreactor o se disuelvan completamente en el medio.

Dichos rasgos característicos pueden ser ventajosos, ya que garantizan que las burbujas de gas alcanzan el estado de equilibrio antes de que su contenido de gas abandone el biorreactor: un microburbujeador genera burbujas de gas muy finamente dispersadas del gas entrante, acelerando, de este modo, el establecimiento de un equilibrio pH-CO2 entre el medio y el volumen de gas en el biorreactor. Introducir el gas CO2 como una mezcla de gases evita la situación de que la tasa de transición de CO2 de una burbuja de gas CO2 puro en el medio sea mayor que la tasa de transición de CO2 desde el medio a, por ejemplo, burbujas de aire o N2 (la tasa de transición puede depender de la cantidad de diferencia de concentración de CO2 entre el medio y diferentes tipos de burbujas). Por tanto, dichas medidas garantizan la comparabilidad del estado de los biorreactores con respecto a una amplia gama de volúmenes de biorreactor, incluyendo los volúmenes por debajo de, por ejemplo, 400 litros.

De acuerdo con modos de realización, el perfil de PACO de referencia comprende al menos un valor de PACO de referencia que se ha obtenido para el biorreactor de referencia (midiendo un valor de pH actual y una tasa de gas de escape CO2 actual) en un momento tR-0 en el momento en que el medio en el biorreactor de referencia ha alcanzado el equilibrio pH-CO2 a una temperatura y presión determinadas antes de que el biorreactor de referencia se inocule con el cultivo celular. La temperatura y presión predefinidas en el biorreactor de referencia en el momento tR-0 deben ser idénticas a la temperatura y presión de la(s) muestra(s) del medio usada(s) para determinar empíricamente la relación específica de medio, por ejemplo, 20 °C y la presión atmosférica normal. Dicho valor de PACO de referencia se denomina "valor de PACO de referencia de inicialización".

Cuando se inicia el biorreactor supervisado y/o controlado, se obtiene un valor de PACO actual de dicho biorreactor (midiendo un valor de pH actual y una tasa de gas de escape CO2 actual) en un momento tB1-0 cuando el medio en dicho biorreactor ha alcanzado el equilibrio pH-CO2 a la misma temperatura y presión que el biorreactor de referencia en tR-0. Dicho valor de PACO actual se denomina "valor de PACO de inicialización" del biorreactor supervisado y/o controlado.

La inicialización del biorreactor supervisado y/o controlado comprende comparar el valor de PACO de referencia de inicialización con el valor de PACO de inicialización del biorreactor supervisado y/o controlado. En caso de que la comparación devuelva que la diferencia entre dichos dos valores de PACO comparados supera un umbral predefinido, por ejemplo, un 5 % del menor de los dos valores de PACO de inicialización comparados, se determina que el dispositivo de medición de pH del biorreactor supervisado está calibrado erróneamente o es defectuoso. Además, en caso de que los dos biorreactores estén en estado de equilibrio pH-CO2 a la misma temperatura y presión y se hayan establecido en el mismo valor de pH (por ejemplo, eligiendo la tasa de flujo de entrada de CO2 en consecuencia), pero tengan una concentración de CO2 diferente en el gas de escape, se determina que los dispositivos de medición de pH de los dos biorreactores se han calibrado de forma diferente. De este modo, se supone que los dos biorreactores comprenden el mismo medio libre de células y que los analizadores de CO2 están calibrados de forma correcta. Por ejemplo, la comparación y la determinación se pueden ejecutar manualmente. Más preferentemente, dicha comparación y determinación se ejecuta automáticamente por un sistema de procesamiento de datos, por ejemplo, un ordenador. El ordenador puede generar y emitir un mensaje de advertencia que sea indicativo de un error de calibración del biorreactor supervisado y/o controlado y/o puede iniciar automáticamente una calibración del dispositivo de medición de pH del biorreactor supervisado y/o controlado.

Esto puede tener el efecto ventajoso de que se puede prohibir desde el comienzo la inicialización de un biorreactor que comprende un dispositivo de medición de pH calibrado de forma incorrecta. Un dispositivo de medición de pH calibrado de forma incorrecta puede dar como resultado un escaso rendimiento del cultivo celular e incluso un completo fracaso de los procesos biológicos o bioquímicos que deberían tener lugar en el biorreactor, porque los valores de pH incorrectos darán como resultado valores de PACO erróneos y pueden dar como resultado señales de control de errores que dependen de la diferencia calculada de los valores de PACO obtenidos actualmente con valores de PACO de referencia. Los medios y las células del cultivo celular son costosos, por lo que prevenir la inoculación de un biorreactor en caso de errores de calibración del dispositivo de medición de pH puede ahorrar tiempo y costes asociados con el funcionamiento de un cultivo celular en un biorreactor bajo parámetros de control erróneos y/o puede permitir tomar las acciones correctivas apropiadas, por ejemplo, intercambiar el dispositivo de medición de pH calibrado de forma incorrecta o defectuoso.

En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para someter a prueba la calibración de un medidor de pH. El procedimiento comprende:

- recibir, en un momento ti antes de que un medio de un biorreactor se inocule con un cultivo celular, un valor de pH medido actual del medio desde un dispositivo de medición de pH y recibir una tasa de gas de escape CO2 medida actual del biorreactor, teniendo el biorreactor una presión y temperatura predefinidas;

- recibir una relación específica de medio, siendo la relación específica de medio específica para el tipo de medio e indicando una relación entre el valor de pH del medio y una fracción respectiva de gas CO2 en un volumen de gas cuando dicho medio está en estado de equilibrio pH-CO2 con dicho volumen de gas y carece de un cultivo celular;

- usar el valor de pH medido actual como entrada para la relación para predecir la tasa de gas de escape CO2 actual del biorreactor esperada para el medio en el biorreactor en estado de equilibrio pH-CO2 en ausencia del cultivo celular en el valor de pH actual medido;

- determinar un valor de PACO actual, indicando el valor de PACO actual la diferencia entre la tasa de gas de escape CO2 medida actual del biorreactor y la tasa de gas de escape CO2 predicha del biorreactor;

- determinar una diferencia entre un valor de PACO de referencia y el valor de PACO actual determinado del biorreactor, siendo el valor de PACO de referencia indicativo de una desviación de una tasa de gas de escape CO2 medida en el biorreactor de referencia a partir de una tasa de gas de escape CO2 predicha del biorreactor de referencia, siendo la tasa de gas de escape CO2 predicha la tasa de gas de escape predicha de dicho tipo de medio en el biorreactor de referencia en estado de equilibrio pH-CO2 en ausencia del cultivo celular y bajo la condición de que el valor de pH del medio en estado de equilibrio sea idéntico al valor de pH del biorreactor de referencia medido cuando se mide la tasa de gas de escape CO2 en el biorreactor de referencia,

- si la diferencia determinada supera un valor umbral, determinar que el dispositivo de medición de pH está calibrado erróneamente.

De forma alternativa, en lugar de comparar los valores de PACO, se comparan la concentración de CO2 del gas de escape de los dos biorreactores y los valores de pH del medio en los dos biorreactores para determinar si los dispositivos de medición de pH de los dos biorreactores comparados estaban calibrados de forma idéntica. Los dos biorreactores se inician y llenan con el mismo medio libre de células a la misma presión y temperatura, y se miden un valor de pH actual y una concentración de CO2 actual del medio en los dos biorreactores y se comparan cuando los dos biorreactores han alcanzado el equilibrio pH-CO2. Si la concentración de CO2 en el gas de escape de los dos biorreactores es idéntica, aunque que el valor de pH no lo sea, o si los valores de pH de los dos biorreactores son idénticos y la concentración de CO2 en el gas de escape no lo sea, la unidad de comparación determina automáticamente que los dos biorreactores se calibraron de forma diferente e inicia las acciones apropiadas, por ejemplo, emite un mensaje de advertencia o inicia el reemplazo o una recalibración de un dispositivo de medición de pH.

Esto puede tener la ventaja de que es posible determinar errores de calibración del dispositivo de medición de pH antes de que se inocule un biorreactor con un cultivo celular, previniendo, de este modo, la pérdida de tiempo y esfuerzo implicados en el cultivo celular en un biorreactor durante múltiples días con parámetros de control subóptimos dependientes del pH.

De acuerdo con modos de realización, se usa el procedimiento de prueba de calibración de pH para someter a prueba si un dispositivo de medición de pH del biorreactor supervisado y/o controlado está calibrado de forma correcta antes de inocular el biorreactor con el cultivo celular. El procedimiento comprende determinar que la diferencia no supera el valor umbral, determinar que el dispositivo de medición de pH del biorreactor está calibrado de forma correcta e inocular selectivamente el biorreactor con el cultivo celular en caso de que se determine que el dispositivo de medición de pH está calibrado de forma correcta. Después de la inoculación del cultivo celular en el biorreactor supervisado y/o controlado, dicho biorreactor se supervisa y/o controla minimizando una diferencia de un valor de PACO calculado de forma dinámica de dicho biorreactor y un valor de PACO de referencia especificado en un perfil de PACO de referencia.

La temperatura y presión predefinidas en el biorreactor en el momento ti son idénticas a la temperatura y presión de una o más muestras del medio que se han usado previamente para determinar empíricamente la relación específica de medio.

De acuerdo con algunos modos de realización, se comparan los siguientes pares de valores del biorreactor de referencia 102 y un biorreactor supervisado y/o controlado en un momento después de la inoculación del cultivo celular:

- los valores de PACO calculados respectivamente o las concentraciones de CO2 medidas respectivamente en el gas de escape de los dos biorreactores;

- los valores de pH del medio en los dos biorreactores;

- la tasa de absorción de oxígeno (OUR) del cultivo celular en los biorreactores respectivos.

La OUR se considera un indicador del estado del metabolismo de un cultivo celular. Los dos biorreactores se hacen funcionar a la misma presión y temperatura. La concentración de gas de escape CO2 y/o el valor de PACO pueden estar influenciados por el metabolismo de los cultivos celulares. Las concentraciones de gas de escape CO2 o valores de PACO actuales y los valores de pH y tasas OUR actuales se miden y comparan cuando los dos biorreactores han alcanzado el equilibrio pH-CO2. Si las concentraciones de CO2 en el gas de escape de los dos biorreactores (o los valores de PACO) son idénticas, las dos tasas OUR son idénticas, aunque el valor de pH no lo sea, o si los valores de pH de los dos biorreactores son idénticos, las tasas OUR son idénticas, y las concentraciones de CO2 en el gas de escape (o los valores de PACO) no lo sean, la unidad de comparación determina automáticamente que los dos biorreactores se calibraron de forma diferente e inicia las acciones apropiadas, por ejemplo, emite un mensaje de advertencia o inicia el reemplazo o una recalibración de un dispositivo de medición de pH.

Dichos rasgos característicos pueden ser ventajosas ya que permiten determinar cualquier diferencia de calibración entre dispositivos de medición de pH de dos biorreactores comparados incluso en caso de que ambos biorreactores se hayan iniciado y en caso de que el metabolismo de las células pueda modificar el valor de pH actual. En caso de que la o Ur sea idéntica en ambos biorreactores, cualquier desviación de PACO o concentración de gas de escape CO2 se considera como resultado de una diferencia de calibración y no como resultado del metabolismo celular.

Un "perfil" como se usa en el presente documento es una representación de la variación en un valor de parámetro frente al tiempo.

Un "perfil de referencia" como se usa en el presente documento es un perfil que se ha obtenido de un biorreactor de referencia. El perfil de referencia se puede haber obtenido antes de hacer funcionar el biorreactor, el estado de un cultivo celular del que se va a comparar con el estado de un cultivo celular del biorreactor de referencia. Por ejemplo, el cultivo celular en el biorreactor de referencia se puede cultivar varios meses o incluso años antes del cultivo de un cultivo celular en el biorreactor supervisado. De forma alternativa, el cultivo celular en el biorreactor de referencia y el cultivo celular en el biorreactor "supervisado" se pueden cultivar paralelamente, permitiendo, por tanto, una comparación "en tiempo real" del estado de los cultivos celulares en los dos biorreactores comparados. En algunos modos de realización, el cultivo celular en el biorreactor de referencia y el cultivo celular en el biorreactor "supervisado" se pueden cultivar paralelamente, pero con una variación temporal, en la que el biorreactor supervisado se inocula con el cultivo celular más tarde que el biorreactor de referencia. El retraso puede ser, por ejemplo, de varias horas o incluso días. Preferentemente, cuando se compara el estado de un cultivo celular en el biorreactor supervisado y/o controlado con el estado de un cultivo celular en el biorreactor de referencia, se compara un valor de PACO actual del biorreactor supervisado con un valor de PACO de referencia en el perfil de PACO de referencia. De este modo, el valor de PACO actual se compara con uno de los valores de PACO de referencia en el perfil que se obtuvo después del mismo intervalo de tiempo, comenzando a partir del momento de inocular el cultivo celular en el biorreactor respectivo, como el valor de PACO actual del biorreactor supervisado.

El "equilibrio pH-CO2" indica un estado de un sistema que comprende una solución acuosa (por ejemplo, un medio de cultivo celular) y un volumen de aire por encima de dicha solución (por ejemplo, el volumen de gas en un biorreactor) con un valor de pH y presión parcial de CO2 que están en equilibrio químico de acuerdo con la ecuación de Henderson-Hasselbalch. La presión parcial de CO2 corresponde a la fracción de gas CO2 en el volumen de gas total por encima del medio. La ecuación de Henderson-Hasselbalch describe la relación del pH como una medida de acidez con la constante de disociación ácida (pKa) en sistemas biológicos y químicos. Si un gas que comprende CO2 está en contacto con un líquido acuoso, por ejemplo, un medio de cultivo, al menos una pequeña fracción del CO2 se disuelve en dicho líquido. A temperatura ambiente, por ejemplo, la solubilidad del dióxido de carbono es de aproximadamente 90 cm3 de CO2 por 100 ml de agua (cl/cg = 0,8). Cualquier gas soluble en agua se vuelve más soluble a medida que disminuye la temperatura. Una pequeña fracción (aprox. 0,2 - 1 %) del CO2 disuelto se convierte en H2CO3. La mayor parte del CO2 permanece como CO2 molecular solvatado. Este proceso se puede describir por las siguientes fórmulas:

equilibrio para ácido carbónico (H2CO3):

[CO2] x [H2O] <— ► [H2CO3] ^ ^ [H+] x [HCO3-]

[H+] x [HCO3-] = K x [CO2] x [H2O], en la que K = constante de equilibrio

pH = pK log ([HCO3-] / [CO2])

Un "medio" o "medio de cultivo celular" es un líquido o gel diseñado para soportar el cultivo y típicamente el crecimiento de microorganismos o células, o plantas pequeñas, como el musgo Physcomitrella. Existen diferentes medios para cultivar diferentes tipos de células. Existe una pluralidad de diferentes medios en el mercado, por ejemplo, para el cultivo celular de tipos de células específicas derivados de plantas o animales, y para el cultivo microbiológico para cultivar microorganismos, tales como bacterias o levaduras. Un medio puede ser, por ejemplo, un medio de nutrientes, por ejemplo, un medio LB (caldo de lisogenia), un medio mínimo, un medio selectivo, un medio diferencial o un medio enriquecido. Algunos medios pueden requerir un entorno de CO2, por ejemplo, de un 5-10 % de CO2 para mantener el pH fisiológico.

De acuerdo con algunos modos de realización, la expresión "siendo dos medios iguales" implica que los dos medios (por ejemplo, el medio en el biorreactor de referencia, por una parte, y el medio en el biorreactor supervisado y/o controlado, por otra parte) comprenden, dadas una presión, temperatura y concentración de CO2 en el volumen de gas por encima de dicho medio particulares, la misma composición y concentración de compuestos y disolventes orgánicos e inorgánicos y se han fabricado usando los mismos protocolos y condiciones de fabricación dentro del contexto de la exactitud de medición.

De acuerdo con algunos modos de realización, dicha expresión implica que los dos medios pueden diferir con respecto a cualquiera de dichos criterios (composición, concentración, protocolo de fabricación) solo en la medida en que dicha diferencia (a una temperatura, presión y concentración de CO2 en el volumen de gas por encima de dicho medio dadas) no tenga ningún o aproximadamente ningún impacto sobre el equilibrio pH-CO2 de dicho medio a una pluralidad de valores de pH diferentes y en la medida en que las relaciones específicas de medio derivadas empíricamente de dichos dos medios sean idénticas respectivamente.

Una "tasa de gas de escape" o "tasa de desgasificación" como se usa en el presente documento es la cantidad de gas que abandona alguna entidad, por ejemplo, un biorreactor, en unidad de tiempo. En consecuencia, una "tasa de gas de escape CO2" es la cantidad de gas CO2 que abandona dicha entidad en unidad de tiempo. Se puede especificar, por ejemplo, como [mol de CO2/min].

Una "tasa de entrada de gas total" como se usa en el presente documento es la cantidad total de gas que entra en alguna entidad, por ejemplo, un biorreactor, en unidad de tiempo. El gas puede ser una mezcla de gases. Por ejemplo, el gas puede ser aire ambiental que consista en aproximadamente un 78 % en vol. de gas N2, un 21 % en vol. de gas O2 y aproximadamente un 1 % en vol. de otros gases, incluyendo aproximadamente un 0,04 % en vol. de gas CO2. Se puede especificar, por ejemplo, como [litros/min].

Una "fracción de volumen de CO2" como se usa en el presente documento es la fracción de gas CO2 en un volumen de gas total. La unidad puede ser, por ejemplo, % en vol. También se denomina "concentración de CO2" de un volumen de gas, especificándose la concentración en % en vol.

"Cultivar un cultivo celular" como se usa en el presente documento típicamente significa que se hacer crecer el cultivo celular, es decir, se incrementa el número de células del cultivo celular. En algunas ocasiones, sin embargo, el número de células también se puede estancar o incluso disminuir.

Breve descripción de los dibujos

En lo que sigue, se explican modos de realización de la invención en más detalle, solo a modo de ejemplo, haciendo referencia a los dibujos, en los que:

la figura 1 muestra un diagrama de bloques de un sistema para supervisar y/o controlar uno o más biorreactores;

la figura 2 muestra diagramas de flujo de procedimientos para supervisar y/o controlar un biorreactor; la figura 3 muestra los componentes de un biorreactor;

la figura 4 muestra diversas fases de cultivo y crecimiento de un cultivo celular;

la figura 5 muestra diagramas que ilustran la dependencia de la concentración de CO2 en el gas de escape de un biorreactor de otros parámetros;

la figura 6 muestra un gráfico usado para obtener una relación de pH-concentración de CO2 específica de medio;

la figura 7a muestra los valores de pH de cuatro biorreactores diferentes mientras se cultiva un cultivo celular en cuatro biorreactores diferentes;

la figura 7b muestra la fracción de CO2 en el gas de escape predicha para cada uno de los cuatro biorreactores usando los valores de pH y la relación específica de medio como entrada;

la figura 7c muestra la fracción de gas de escape CO2 medida realmente en cada uno de los cuatro biorreactores;

la figura 7d muestra un perfil de PACO que resulta de la diferencia de las fracciones de gas de escape CO2 predichas y medidas realmente;

la figura 8a es un diagrama que muestra los perfiles de PACO de dos biorreactores y un biorreactor de referencia, con lo que el perfil de PACO de un biorreactor difiere del perfil de PACO del biorreactor de referencia ya antes de la inoculación;

la figura 8b es un diagrama que muestra diferencias de perfil de PACO de los dos biorreactores de la fig. 8a con respecto a dicho biorreactor de referencia.

Descripción detallada

La figura 1 muestra un diagrama de bloques de un sistema 100 para supervisar y/o controlar uno o más biorreactores de acuerdo con un modo de realización de la invención. A continuación, dicho modo de realización se describirá haciendo referencia a un procedimiento correspondiente para supervisar y/o controlar un biorreactor como se indica en los diagramas de flujo de las figuras 2a y 2b.

La figura 1 muestra un sistema 100 que permite una comparación exacta y en tiempo real de dichos estados de un cultivo de biorreactores diferentes incluso en caso de que el tamaño, conformación, temperatura u otros parámetros de diseño o ambientales de los dos biorreactores comparados difieran entre sí. La comparación se basa en un parámetro llamado "PACO" calculado para un biorreactor particular como una derivada de un valor de pH actual y una tasa de gas de escape CO2 actual de dicho biorreactor y de una relación 136, 138 que es específica para el medio de cultivo celular usado en dicho biorreactor.

El sistema 100 comprende un procesador 110, una memoria 112 principal y un medio de almacenamiento 114 no transitorio. El medio de almacenamiento comprende instrucciones legibles por ordenador que, cuando se ejecutan por el procesador 110, provocan que el procesador realice un procedimiento para supervisar y/o controlar automáticamente uno o más biorreactores 104, 106 como se describe para modos de realización de la invención.

El medio de almacenamiento 114 comprende al menos un perfil de PACO de referencia específico para un medio M1 particular y un proyecto particular para cultivar un cultivo celular particular en dicho medio M1 durante un intervalo de tiempo predefinido y con un objetivo predefinido. Por ejemplo, el proyecto podría ser cultivar células CHO (células de ovario de hámster chino) durante 14 días en el medio de cultivo celular M1 bajo condiciones de crecimiento celular óptimas o casi óptimas hasta que se alcanza una densidad celular de aproximadamente 100 x 105 células/mililitro. Además, el medio de almacenamiento 114 comprende una estructura de datos 136, por ejemplo, un archivo o un registro de base de datos, que es indicativa de una relación pH-concentración de CO2 que es particular para dicho medio de cultivo celular M1.

Además, el medio de almacenamiento puede comprender relaciones específicas de medio 138 de otros medios de cultivo celular y/o puede comprender perfiles de PACO de referencia 118 de otros proyectos de cultivo celular con diferentes tipos de células y/o con un medio M2 diferente. Los perfiles de PACO de referencia y las relaciones específicas de medio se pueden recibir por medio de una interfaz de comunicación de datos 120, por ejemplo, una interfaz de red, un puerto USB, una unidad de CDROM o similares. De acuerdo con algunos modos de realización, el perfil de PACO de referencia se puede recibir de forma dinámica para posibilidad una comparación en tiempo real de los estados de un cultivo celular de dos biorreactores supervisados.

El sistema 100 puede comprender además una interfaz 126 para recibir de forma dinámica valores de medición actuales desde uno o más biorreactores supervisados y/o controlados 104, 106. Los valores de medición son, en particular, un valor de pH actual y una tasa de gas de escape CO2 actual. Una unidad de comparación por PACO 130 usa los valores de medición recibidos y la relación específica de medio 136 del medio M1 en el biorreactor supervisado 104, 106 para calcular repetidamente los valores de PACO actuales y comparar dichos valores de PACO actuales con un perfil de referencia de PACO 116 de un proyecto de cultivo celular en un biorreactor de referencia 102 que se repetirá en el biorreactor supervisado 104. Cualquier diferencia en los valores de PACO actuales a partir de los valores de PACO de referencia respectivos se puede presentar a un usuario por medio de un dispositivo de visualización 134, por ejemplo, un monitor de ordenador o un monitor de un teléfono inteligente.

Opcionalmente, el sistema 100 comprende además una unidad de control 132 que controla uno o más parámetros de los biorreactores 104, 106 de modo que se minimice la diferencia de los valores de PACO obtenidos actualmente a partir de un valor de PACO de referencia respectivo. La unidad de control puede ser, por ejemplo, un módulo de programa informático y/o equipo informático que se acople de forma funcional a la unidad de comparación 130 para recibir los resultados de la comparación por el valor de PACO. La unidad de control puede controlar la configuración y el funcionamiento de uno o más procesos y parámetros de diseño. Por ejemplo, la unidad de control 132 se puede hacer funcionar para incrementar o disminuir el flujo de entrada de líquidos que tienen un impacto sobre el valor de pH, por ejemplo, puede incrementar o disminuir el flujo de entrada de un ácido cítrico o de una solución de NaOH 1 M.

El medio M1 puede ser, por ejemplo, la modificación de Kaighn del medio F-12 de Ham que comprende, por ejemplo, putrescina, timidina, hipoxantina, cinc y mayores niveles de todos los aminoácidos y piruvato de sodio. Estas adiciones permiten que el medio se complemente con niveles muy bajos de suero o componentes definidos para algunos tipos de células. El medio F-12K de Ham (de Kaighn) no contiene proteínas ni factores de crecimiento y, por lo tanto, se complementa, a menudo, con factores de crecimiento y suero fetal bovino (FBS) que se pueden optimizar para una línea celular particular. El medio F-12K de Ham (de Kaighn) usa un sistema tampón de bicarbonato de sodio (2,5 g/l).

El medio M2 puede ser un medio LB, y pueden existir perfiles de referencia para una pluralidad de otros medios M3, M4, por ejemplo, para cultivar bacterias o plantas para una variedad de propósitos y "proyectos" correspondientes.

El sistema está acoplado de forma funcional a uno o más biorreactores 104 106 que se van a supervisar y/o controlar. Las dimensiones y otros parámetros de diseño (tasa y configuración de agitación, tamaño de las burbujas, dimensión, etc.) de los biorreactores supervisados o controlados pueden diferir entre sí y/o pueden diferir de los parámetros respectivos del biorreactor de referencia. El acoplamiento funcional puede comprender el envío de datos de supervisión (pH y tasas de gas de escape CO2 actuales) a la unidad de comparación 130 y, opcionalmente, también el envío de datos de control desde la unidad de control 132 al biorreactor 104, 106 respectivo. El biorreactor de referencia puede, pero no tiene que, estar acoplado al sistema 100. Es suficiente que el perfil de referencia de PACO recopilado del biorreactor de referencia sea accesible por la unidad de comparación 130.

En los siguientes párrafos, se da una visión general de cómo el sistema 100 y un procedimiento correspondiente de acuerdo con modos de realización de la invención permite controlar el funcionamiento de un biorreactor 104, 106 que comprende un medio M1 de una manera que se cultive el cultivo celular en dicho biorreactor bajo condiciones fisiológicas casi idénticas a un cultivo celular de referencia cultivado en un biorreactor de referencia en el mismo medio incluso en caso de que la dimensión y otros parámetros de diseño de dichos dos biorreactores difieran.

En una primera etapa 202, se determina empíricamente una relación específica de medio 136 entre un valor de pH de un medio libre de células y una presión parcial de CO2 correspondiente en un volumen de aire por encima de dicho medio cuando el medio está en estado de equilibrio pH-CO2 en condiciones predefinidas (por ejemplo, 20 °C y presión atmosférica normal). Esta etapa se describe con más detalle en las figuras 5 D) y 6. Como el objetivo es cultivar células CHO durante 14 días en la modificación de Kaighn del medio F-12 de Ham, se determina una relación específicamente para dicho medio.

En la etapa 204, se obtiene un perfil de PACO de referencia del biorreactor de referencia 102. Al principio, el biorreactor de referencia se llena con el medio M1 libre de células y se inicia al comenzar a añadir continuamente gas, por ejemplo, transportando aire ambiental y/o sus componentes individuales (N2, O2 y/o CO2) al biorreactor y opcionalmente también al comenzar a añadir continuamente líquidos (el medio libre de células, opcionalmente líquidos adicionales tales como alimentación, bases, etc.). Además, se pueden poner en marcha los agitadores. El biorreactor de referencia se puede hacer funcionar a una temperatura y presión que difieran de la temperatura y la presión usadas para obtener la relación específica de medio. Después de algún tiempo (típicamente minutos u horas), el medio en el biorreactor de referencia y el volumen de aire en el biorreactor de referencia por encima del medio habrán alcanzado el estado de equilibrio pH-CO2 y se calcularán uno o más valores de PACO para el biorreactor de referencia a partir de la relación específica de medio 136 y valores de pH y CO2 actuales del biorreactor de referencia.

De acuerdo con modos de realización, durante la generación del perfil de PACO de referencia, el biorreactor de referencia se alimenta con uno o más líquidos, tales como una solución de alimentación o una base, además, de un medio libre de células. En este caso, se generan perfiles de referencia adicionales en algunos modos de realización. Dichos perfiles adicionales indican respectivamente la cantidad de solución de alimentación o base añadida al biorreactor de referencia en un momento dado del perfil. Cuando se inicia y hace funcionar el biorreactor supervisado y/o controlado, se añade la misma cantidad de solución de alimentación o base por unidad de volumen del medio y por unidad de tiempo a dicho biorreactor como se especifica en los perfiles respectivos. Por tanto, se garantiza que, incluso en caso de que cambie la composición del medio en el biorreactor, el medio en el biorreactor sea "el mismo" o "aproximadamente el mismo" que en el biorreactor de referencia en un momento dado en el momento ti. Como la solución de alimentación y/o la base típicamente no modifican significativamente la composición del medio, la relación específica de medio se puede usar para calcular los valores de PACO actuales incluso en caso de que la relación específica de medio se haya determinado empíricamente para un medio que carezca de dicha solución de alimentación. Sin embargo, si la composición del medio en el biorreactor de referencia cambia drásticamente mientras se cultivan las células en el medio de referencia, por ejemplo, debido a una alternancia de un primer medio a otro segundo medio de una composición completamente diferente, de hecho, se necesitan determinar gráficos de referencia de PACO consecutivas y dos relaciones específicas de medio diferentes y transferirse a una unidad de control del biorreactor supervisado y/o controlado.

Preferentemente, el biorreactor supervisado y/o controlado 104, 106 al menos en el punto de tiempo de inicialización se hace funcionar bajo la misma temperatura y presión que el biorreactor de referencia. Sin embargo, es posible que, mientras se hace funcionar el biorreactor 104, 106, la temperatura y/o presión se modifique para minimizar la diferencia de PACO.

A continuación, en la etapa 206, el perfil de referencia de PACO y la relación específica de medio 136 se usan para supervisar y/o controlar el estado de un cultivo celular en un biorreactor 104, 106 diferente, por ejemplo, transfiriendo el perfil de PACO de referencia obtenido y la relación 136 por medio de Internet o por un medio de almacenamiento portátil al sistema 100 y almacenando el perfil y la relación en el medio de almacenamiento 114. Como se puede inferir a partir de la fig.1, los uno o más biorreactores supervisados 104, 106 pueden diferir del biorreactor de referencia 102 con respecto a muchos parámetros, por ejemplo, el tamaño y conformación del biorreactor, parámetros de agitación, tasa de flujo de entrada de gas total, la temperatura, la presión, la velocidad superficial, tamaño y distribución de las burbujas, y otros parámetros. El uso 206 del perfil de referencia de PACO en modos de realización de la invención puede comprender las etapas 208-220 representadas en la figura 2b.

El sistema 100 puede supervisar el estado de un cultivo celular en un biorreactor 104, 106 y comparar el estado de un cultivo celular de dicho biorreactor con el estado de un cultivo celular en el biorreactor de referencia en un momento correspondiente después de la inoculación. El biorreactor de referencia y cada uno de los biorreactores supervisados 104, 106 comprenden el mismo medio M1 y se inoculan con el mismo tipo de cultivo celular. El perfil de PACO de referencia se puede recopilar del biorreactor de referencia antes de que el/los biorreactor(es) supervisado(s) se inicialice(n) e inocule(n) con un cultivo celular, pero también es posible que el biorreactor de referencia y los uno o más biorreactores supervisados se hagan funcionar en paralelo o con un retraso de, por ejemplo, uno o más días. En este caso, el perfil de PACO de referencia se recibe de forma dinámica mientras se cultiva el cultivo celular en el biorreactor supervisado.

En una primera etapa 208, la unidad de comparación 130 del sistema para supervisar estados en un biorreactor 100 recibe el perfil de referencia de PACO 116, por ejemplo, al leer un archivo que comprende el perfil del medio de almacenamiento 114 o al recibir dicho perfil por medio de la interfaz 120 desde una fuente de datos externa al sistema, por ejemplo, Internet. El perfil de referencia de PACO es una representación de la variación en un valor de referencia de PACO PACOR-ti frente al tiempo ti, i indica uno de una serie de tiempos, por ejemplo, t0, t1, t2, ..., tmáx. El momento t0 es preferentemente un punto de tiempo que se encuentra en un intervalo de tiempo predefinido antes del punto de tiempo de inocular el biorreactor de referencia con el cultivo celular. Por ejemplo, t0 puede representar 1 h antes de la inoculación del biorreactor de referencia, t i puede representar 45 minutos antes de la inoculación, t2 puede representar 30 minutos antes de la inoculación, t3 puede representar 15 minutos antes de la inoculación, t4 puede representar el momento de inoculación, t6 puede representar 15 minutos después de la inoculación y así sucesivamente hasta que se alcance el tmáx al final de la duración del proyecto de cultivo celular.

Además, el perfil de referencia de PACO es indicativo de una desviación de la tasa de gas de escape CO2 medida en el biorreactor de referencia a partir de una tasa de gas de escape CO2 predicha para dicho biorreactor de referencia. La tasa de gas de escape CO2 medida se puede obtener midiendo la concentración de CO2 del biorreactor de referencia y la tasa de flujo de entrada de gas total TGlR-ti del biorreactor de referencia en un momento dado. La tasa de gas de escape CO2 predicha se obtiene introduciendo el valor de pH medido actualmente pHR-M-ti del medio en el biorreactor de referencia en la relación específica de medio, asumiendo, de este modo, que dicho medio estaría libre de células y que está en estado de equilibrio pH-CO2 bajo la temperatura y presión predefinidas (por ejemplo, 20 °C y presión atmosférica normal) usadas cuando se genera la relación específica de medio. Por tanto, el perfil de referencia de PACO es indicativo de una desviación de la tasa de gas de escape CO2 esperada a partir de la medida y depende de la cantidad de gas de escape CO2 producido por las células del cultivo celular en el biorreactor de referencia mientras se cultiva el cultivo celular y depende de otros factores que tienen un impacto sobre el equilibrio pH-CO2, tales como temperatura, pH, presión y similares.

En la etapa 210, la unidad de comparación 130 recibe un objeto de datos que comprende una relación específica de medio 136 del medio M1 en el biorreactor 104, 106 que se va a supervisar. La relación específica de medio indica una relación entre múltiples valores de pH diferentes del medio M1 que carece de cultivo celular y la fracción de CO2 respectiva en un volumen de gas en estado de equilibrio pH-CO2 con dicho medio a la presión y temperatura predefinidas.

En la etapa 212, la unidad de comparación 130 recibe repetidamente, en un momento ti actual, una tasa de gas de escape CO2 actual ACOB1-M-ti del biorreactor supervisado 104 y un valor de pH actual pHB1-ti del medio M1 del biorreactor 104 por medio de la interfaz 128. Las tasas de gas de escape CO2 y los valores de pH medidos se reciben al menos durante el cultivo del cultivo celular en el biorreactor 104 y opcionalmente ya se pueden recibir antes de la inoculación para comparar el estado de los biorreactores en un estado libre de células.

Para cada uno de los pares recibidos de tasas de gas de escape CO2 y valores de pH en el biorreactor 104, la unidad de comparación 130 en la etapa 214 calcula un valor de PACO PACObuí. El valor de PACO es indicativo de una desviación de la tasa de gas de escape CO2 medida en el biorreactor 104 a partir de una tasa de gas de escape CO2 predicha. Dicha tasa de gas de escape CO2 predicha se deriva de la fracción de CO2 predicha para el volumen de gas por encima de una muestra de dicho medio M1 en estado de equilibrio pH-CO2 con dicho volumen en ausencia del cultivo celular, bajo la temperatura y presión predefinidas y bajo la condición de que el valor de pH del medio en estado de equilibrio sea idéntico al valor de pH del biorreactor supervisado 104 en el momento ti. El valor de PACO calculado es indicativo de la desviación de la tasa de gas de escape CO2 predicha producida por las células del cultivo celular en el biorreactor en un momento ti particular mientras se cultiva el cultivo celular a partir de la tasa de gas de escape CO2 medida realmente en ese momento. El cálculo del valor de PACO usa como entrada:

- la tasa de gas de escape CO2 actual recibida del biorreactor supervisado 104 en el momento ti;

- la tasa de valor de pH actual recibido del biorreactor supervisado 104 en el momento ti;

- la tasa de entrada de gas total TGIb1 del biorreactor 104 en el momento ti; y

- la relación específica de medio 136 del medio M1;

En la etapa 216, la unidad de comparación 130 calcula una diferencia entre el valor de PACO calculado PACOB1-ti del biorreactor supervisado 104 y un valor de PACO de referencia PACOR-ti respectivo en el perfil de referencia de PACO 116. Por ejemplo, la PACOB1-t100 del biorreactor supervisado 104 se compara con una PACOR-t100 respectiva en el perfil de referencia de PACO 116, con lo que t100 corresponde al comienzo de la 24.a hora después de la inoculación.

En la etapa 220, la unidad de comparación 130 emite la diferencia calculada, por ejemplo, en la pantalla 134. La diferencia calculada es indicativa de una desviación del estado del cultivo celular en el biorreactor 104 a partir del estado de referencia del cultivo celular en el biorreactor de referencia 102 de acuerdo con el perfil 116.

De acuerdo con modos de realización, la unidad de comparación 130 o una unidad de control acoplada a la unidad de comparación puede supervisar, además, el estado de uno o más biorreactores 106 adicionales como se describe anteriormente.

La figura 3 muestra un modo de realización de un biorreactor 102, 104, 106. El biorreactor está acoplado a una primera tubería para transferir líquidos, tales como ácidos, bases, medio recién preparado y similares al biorreactor y a un flujo de salida. El biorreactor está acoplado, además, a una o más segundas tuberías para transferir gases, por ejemplo, aire ambiental y/o gas N2 y/o gas O2 y/o gas CO2 al biorreactor y está acoplado a una tercera tubería para el gas de escape. La segunda tubería puede comprender un sensor 144 para determinar una tasa de flujo de entrada de gas total actual. La tercera tubería puede incluir un sensor 122, por ejemplo, un analizador de gas de escape CO2, para medir selectivamente la cantidad de gas CO2 transferido a través de la tercera tubería por unidad de tiempo. De acuerdo con otros modos de realización, puede que no existan tuberías para el flujo de entrada y flujo de salida de líquidos y se pueden alimentar los nutrientes al biorreactor por medio de adición escalonada de bolos de una solución de alimentación.

La figura 4 muestra diversas fases de cultivo y crecimiento de un cultivo celular en un biorreactor de referencia 102 de acuerdo con un proyecto de cultivo celular particular (por ejemplo, cultivar células CHO durante 18 días) y un perfil de referencia de PACO 402 que se ha derivado de dicho proyecto. Durante el proyecto se añadieron diferentes alimentaciones (alimentación 1, alimentación 2, alimentación 3) y/o líquidos básicos y se muestra el impacto del valor de PACO sobre el perfil de PACO de referencia. Para reproducir el proyecto en otro biorreactor 104, 106, se tienen que añadir las mismas alimentaciones y/o sustancias básicas al medio de cultivo en intervalos de tiempo respectivos, y cualquier desviación de los valores de PACO en el biorreactor supervisado 104 a partir de los valores de PACO de referencia respectivos en el perfil 402 se determina y opcionalmente minimiza modificando parámetros de diseño y configuraciones del biorreactor supervisado y controlado 104, 106.

El perfil de PACO402 representado en la figura 4 muestra claramente fases del proceso diferentes que se pueden observar cuando se cultiva el cultivo establecido en el biorreactor de referencia 102 durante ese proyecto. Por tanto, el perfil muestra que un único parámetro, el parámetro PACO calculado a partir de valores de medición derivables de forma fácil y dinámica, puede identificar fases del proceso diferentes que se correlacionan con diferentes estados de las células del cultivo celular. No obstante, el valor de PACO no cuantifica los únicos efectos de los parámetros individuales (alimentación básica, adición de base, producción de lactato, etc.) que tienen un impacto sobre el equilibrio pH-CO2 del medio M1 en el biorreactor de referencia 102.

Como se puede observar en la figura 4, el crecimiento de dichas células del cultivo después de la inoculación da lugar a una diferencia incrementada en la versión medida de una tasa de gas de escape CO2 predicha ("ACO" (tasa de gas de escape CO2), medida, por ejemplo, en [mol de CO2/min]). Mientras se cultivan las células, el pH del medio típicamente disminuye y la tasa de gas de escape CO2 se puede incrementar en dependencia de la disminución del valor de pH y otros parámetros. El perfil 402 cubre cuatro fases diferentes: en una primera fase tras la inoculación, no se añade ninguna alimentación y el valor de PACO asciende. El ascenso puede estar provocado por el metabolismo celular. En una segunda fase, se añade una primera alimentación al medio y el valor de PACO disminuye. A continuación, en una tercera fase, se añade una segunda alimentación básica que incrementa el valor de PACO. Más tarde, en dicha fase de "tercera alimentación", sin embargo, el metabolismo celular da como resultado una reducción del valor de PACO y el cultivo celular puede entrar en una cuarta fase. En la cuarta fase, la segunda alimentación básica todavía se añade al medio M1. Además, las células del cultivo celular comienzan a producir lactato y/u otras sustancias que disminuyen el valor de pH del medio. Como resultado, el valor de PACO del biorreactor de referencia asciende en la cuarta fase.

"DB inferior" indica el valor de pH más bajo permitido del medio. En caso de que el valor de pH del medio descienda por debajo del umbral de "DB inferior", una unidad de controlador puede disminuir automáticamente la tasa de flujo de entrada de CO2 para incrementar el valor de pH. "DB superior" indica el valor de pH más alto permitido del medio. En caso de que el valor de pH del medio supere el umbral de "DB superior", una unidad de controlador puede incrementar automáticamente la tasa de flujo de entrada de CO2 para incrementar el valor de pH. Entre dichos umbrales, el control de la tasa de flujo de entrada de CO2 se puede controlar exclusivamente en base a el valor de PACO.

La figura 4 muestra que, cuando se cultiva un cultivo celular, la concentración de CO2 real diferirá significativamente de la concentración de CO2 esperada para el medio libre de células porque la adición de base, adición de alimento, generación de lactato, diferentes tasas de acumulación y retirada de CO2 en el medio, y así sucesivamente, afectarán al equilibrio pH-CO2 del medio y la concentración de CO2 en un volumen de gas por encima de dicho medio en un biorreactor.

La figura 5 muestra los diagramas A, B, C y D que ilustran la dependencia de la concentración de CO2 en el gas de escape (y, por tanto, implícitamente, las tasas de gas de escape) de cuatro biorreactores diferentes del valor de pH y la independencia de dicha concentración de CO2 de los parámetros de diseño y tamaño de los biorreactores respectivos.

Los cuatro biorreactores diferentes tienen las siguientes propiedades de diseño:

Cada uno de dichos biorreactores l-IV se llenó con un medio de cultivo celular M1 particular que no comprendía ninguna célula. El valor de pH original de dicho medio fue de 6,85 (véase el diagrama B). A continuación, el valor de pH se incrementó en cada uno de los biorreactores disminuyendo la concentración de CO2 en el volumen de gas por encima de dicho medio en el biorreactor respectivo. Al comienzo de la prueba y para cada uno de un conjunto de valores de pH predefinidos, se permitió que el medio en cada biorreactor alcanzara el equilibrio pH-CO2 con el volumen de gas por encima del medio a una temperatura y presión predefinidas, por ejemplo, 20 °C y presión atmosférica normal. Después de que se alcanzara el equilibrio, se determinó la concentración de CO2 en % en vol. del gas de escape total ("fracción de gas CO2", "[%] de FCO2", "concentración de CO2") para cada uno de dichos cuatro biorreactores (véase el diagrama A que muestra, en combinación con el diagrama B, el impacto del valor de pH sobre la concentración de CO2 medida en el gas de escape). El diagrama C) muestra el impacto del valor de pH sobre la concentración de CO2 medida de cada uno de los cuatro biorreactores en forma de un gráfico de barras. La desviación máxima del [%] de FCO2 obtenido para cada uno de los cuatro biorreactores fue menor de un 0,4 % de la tasa de gas de escape total del biorreactor.

El diagrama D) es un gráfico que comprende los valores de [%] de CO2 medidos en cada uno de los cuatro biorreactores l-IV en cada uno del conjunto de valores de pH (6,85, 6,95, 7,05, 7,15, 7,25, 7,35) en un momento cuando el medio M1 de dicho biorreactor alcanzó el estado de equilibrio pH-CO2.

Cabe destacar que el equilibrio pH-CO2 en un biorreactor se puede poner a prueba por la tasa de gas CO2 que entra y/o abandona el biorreactor, por lo que el equilibrio pH-CO2 puede ser, de hecho, un equilibrio dinámico. No obstante, es posible controlar un biorreactor de manera que se establezca el equilibrio pH-CO2 dinámico a un valor de pH particular, por ejemplo, disminuyendo o incrementando la concentración de CO2 en el volumen de gas por encima del medio en el biorreactor modificando la tasa de flujo de entrada de CO2 total en el biorreactor.

Se puede modificar el valor de pH añadiendo sustancias o líquidos ácidos o básicos. Sin embargo, como dichas sustancias pueden modificar la composición del medio, preferentemente el estado de equilibrio pH-CO2 dinámico se establece en un biorreactor a un valor de pH particular exclusivamente controlando la tasa de flujo de entrada de CO2 de manera que se alcance un valor de pH deseado. El uso de la tasa de flujo de entrada de CO2 para establecer el equilibrio pH-CO2 en lugar de una sustancia básica o una ácida tiene la ventaja de que la composición del medio no se altera (excepto la concentración del CO2 disuelto y sus productos de disociación) y, por tanto, la relación específica de medio se puede derivar empíricamente del mismo medio a valores de pH diferentes.

A continuación, se ajusta una curva 502 al gráfico para determinar empíricamente los parámetros para una relación 316 que es específica para el medio M1 contenido en los cuatro biorreactores. Este enfoque permite determinar empíricamente, para un medio de cultivo celular particular, una relación específica de medio usada como entrada para predecir la fracción de volumen de CO2 esperada en una fase gaseosa por encima de dicho medio cuando dicho medio tiene un valor de pH, presión y temperatura particulares (por ejemplo, 20 °C y presión atmosférica normal), carece de células y está en equilibrio pH-CO2. La relación obtenida es independiente de la escala del biorreactor, tasa de aireación y otros parámetros de diseño en procesos que usan gas CO2 como componente ácido para el control de pH. La relación específica de medio se determina solo una vez para un medio M1 particular. La determinación se puede realizar en un único biorreactor, por ejemplo, en el biorreactor de referencia antes de que el biorreactor de referencia se inocule. Para incrementar la exactitud, también es posible realizar la determinación en múltiples biorreactores u otros recipientes que permitan la medición de un valor de pH y una fracción de gas CO2 (concentración de CO2) y, a continuación, usar la información obtenida en los múltiples biorreactores o recipientes para obtener una curva ajustada 502 más exacta. En el ejemplo representado en la figura 5, se usaron cuatro biorreactores diferentes para determinar empíricamente una curva ajustada 502 y una relación específica de medio correspondiente entre el valor de pH en equilibrio y la concentración de CO2 en equilibrio.

La figura 6 muestra el diagrama de la fig. 5 D) con más detalle. La relación específica de medio 136 del medio M1 es una ecuación FCO2M1(pH)=REL-M1(pH) obtenida ajustando de forma matemática múltiples pares determinados empíricamente de un valor de pH y una concentración de CO2 respectiva en la fase gaseosa por encima de dicho medio, estando la concentración de CO2 en la fase gaseosa en equilibrio pH-CO2 con dicho medio de acuerdo con la ecuación de Henderson-Hasselbalch mencionada anteriormente.

El parámetro "[%] de FCO2M1(pH)" es la concentración de CO2 predicha a la temperatura predefinida y a la presión predefinida en un volumen de gas en estado de equilibrio pH-CO2, teniendo dicho medio un valor de pH dado, siendo la predicción específica para el medio M1 para el que se obtuvo empíricamente la relación.

El parámetro "pH" indica el valor de pH usado como entrada de dicha ecuación, considerándose el valor de pH de entrada como el valor de pH del medio en estado de equilibrio pH-CO2 del medio en base al que se realiza la predicción de la concentración de CO2.

"REL-M1" es un conjunto de uno o más parámetros a1, a2, b1, b2, b3 conectados por operadores. Los parámetros se han obtenido ajustando muestras del medio M1 que carecen del cultivo celular a múltiples valores de pH diferentes como se describe anteriormente, dejando, de este modo, que las muestras alcancen el equilibrio pH-CO2 a la presión y temperatura predefinidas, determinando las concentraciones de CO2 en equilibrio en los volúmenes de gas respectivos que están en contacto con el medio en las muestras, representando las concentraciones de CO2 en equilibrio medidas frente a los valores de pH en equilibrio respectivos de las muestras (véase la fig. 5 D y 6), ajustando una curva 502 en los valores representados y derivando los parámetros a1, a2 o b1, b2, b3 de la curva ajustada.

De acuerdo con algunos modos de realización, la ecuación FCO2M1(pH) = REL-M1(pH) es una ecuación lineal de acuerdo con [%] de FCO2M1(pH) = a1 x pH a2. En este caso, los parámetros a1 y a2 son los parámetros derivados de la curva ajustada. En el ejemplo representado, un ajuste lineal proporcionaría la siguiente ecuación:

FCO2M1(pH) = -19,177x pH 143,61. En este ejemplo, a1=-19,177 y a2= 143,61.

De acuerdo con otros modos de realización, la ecuación FCO2M1(pH) = REL-M1(pH) es una ecuación polinómica de acuerdo con [%] de FCO2M1(pH) = b1 x pH2 b2 x pH b3. En este caso, los parámetros b1, b2 y b3 son los parámetros derivados de la curva ajustada. En el ejemplo representado, un ajuste polinómico proporcionaría la siguiente ecuación:

FCO2M1(pH) = 19,969x pH2 - 302,25 x pH 1146,2. En este ejemplo, b1=19,969 y b2= - 302,25 y b3= 1146,2. El uso de un ajuste polinómico tiene la ventaja de que es más exacto que un ajuste lineal, aunque un ajuste lineal ya es lo suficientemente exacto para una comparación y supervisión de cultivos celulares basadas en PACO.

Las figuras 7a-d ilustran cómo se puede calcular un valor de PACO de un biorreactor 104, 106 a partir de una relación específica de medio 136 y algunos valores de medición obtenibles de forma fácil y dinámica.

La figura 7a muestra la variación de un valor de pH medido en cuatro biorreactores diferentes I-IV mientras se cultiva un cultivo celular en un medio M1 particular durante múltiples días. Preferentemente, cada valor de pH se mide usando un dispositivo de medición de pH, por ejemplo, un medidor de pH potenciométrico, sumergido en el medio M1 del biorreactor en equilibrio pH-CO2 de dicho medio.

La figura 7b muestra la concentración de CO2 en [%] del gas de escape total de un biorreactor predicha para cada uno de los cuatro biorreactores usando los valores de pH reales medidos de la fig. 7a y la relación específica de medio como entrada. Por ejemplo, la relación específica de medio para el medio M1 sigue una ecuación polinómica de acuerdo con [%] de FCO2M1(pH)=b1 x pH2 b2 x pH b3. Los parámetros b1, b2 y b3 son los parámetros derivados de la curva ajustada representada en las figuras 5D y 6.

Por ejemplo, 4 días después de t0 (el comienzo del proyecto), el valor de pH medido en todos los biorreactores es de aproximadamente 6,95. En consecuencia, la concentración de CO2 esperada al cuarto día se calcula usando el valor de pH 6,95 como entrada: [%] de FCO2m1(pH) = b1 x 6-952 b2 x 6,95 b3.

b1, b2 y b3 son los parámetros determinados empíricamente del medio M1. La unidad [%] significa: la fracción del volumen de desgasificación de C02 del volumen de gas de escape total (correspondiente al flujo de entrada de gas total TGI í L—min 1J)' del biorreactor en un momento determinado.

La figura 7c muestra la fracción de gas de escape C02 real ("medida") medida en cada uno de los cuatro biorreactores. Como se puede inferir a partir de una comparación del [%] de las fracciones de gas de escape C02 predichas y las fracciones de gas de escape C02 reales (medidas) de cada biorreactor, existen diferencias significativas que pueden proceder del impacto del metabolismo de las células en el cultivo celular y otros factores que tienen un impacto sobre el equilibrio pH-C02 de un medio.

Por ejemplo, se puede usar un dispositivo analizador de C02 122, también denominado "sensor de dióxido de carbono", como se representa en la fig. 3, para medir repetidamente la concentración de C02 en el gas de escape por unidad de tiempo. Los ejemplos comunes para sensores de C02 son los sensores de gas infrarrojos (NDIR) y los sensores de gas químicos. Los sensores NDIR son sensores espectroscópicos para detectar C02 en un entorno gaseoso por su absorción característica. De forma alternativa, el sensor de C02 puede ser un sensor microelectromecánico.

La figura 7d muestra un perfil de PACO de uno de los biorreactores generado como la diferencia de las concentraciones de gas de escape C02 predichas de la fig. 7b y las concentraciones de gas de escape C02 medidas de la fig. 7c de dicho biorreactor.

Para calcular los valores de PACO del perfil 402, las concentraciones de gas de escape CO2 predichas y medidas ([%] de "CO2" o "FCO2") se transforman, de acuerdo con modos de realización de la invención, en tasas de gas de escape CO2 [mol/min].

Por ejemplo, el cálculo se puede realizar para cada uno de los valores de pH medidos de la fig. 7a) de acuerdo con:

tasa de gas de escape CO2 esperada:

molí _ FCO2m1-exp(pH)[%] _ T_G_IÍ L—minJ1

ACO ^M1 -ESPERADA(pH) J _ 100 ]=> 1000 x 22,4141-

tasa de gas de escape C02 medida ("real"):

m

FCO2Mⁱ-^m(^pH)[%] TGII-ACOmi-m (pH ) ^ = min

₁₀₀] = > 1000 x 22,4141L—mol

^ml De este modo, TGI I— I es el volumen de gas de escape total del biorreactor para el que se calcula el valor de

PACO actual, con lo que la cantidad total de flujo de entrada de gas TGI J en el biorreactor se puede usar como el volumen de gas de escape total. En caso de que el volumen de gas de escape total del biorreactor no sea constante, se necesita determinar TGI [mi] cada vez que se mida el valor de pH usado como entrada para calcular la tasa de gas de escape C02. Por ejemplo, en caso de que el biorreactor tenga una primera tubería de flujo de entrada de gas para c O2, una segunda tubería de flujo de entrada de gas para 02, una tercera tubería de flujo de entrada de gas para N2 y una cuarta tubería de flujo de entrada de gas para aire ambiental, siendo modificable individualmente el flujo de gas en cada una de las cuatro tuberías, TGI J se puede calcular como C02 ^ml J 02 — min 1l + N2 í L—minJ 1 a LirmeinJ [— 1. El val Lomro/J 2,414 í— 1 es el volumen ° de un mol de un gas ideal.

A continuación, el valor de PACO [mn| se calcula para cada uno de los valores de pH medidos (correspondientes a un momento ti) como la diferencia entre la tasa de gas de escape C02 esperada en dicho valor de pH en un medio MI libre de células y la tasa de gas de escape C02 medida realmente [m i] del biorreactor.

PACOmmi-« [m in i_ A c o M i-Exp(ti) _[m n _- A c o M i-M(ti) _[m n

El cálculo del valor de PACO de acuerdo con las fórmulas anteriores puede tener la ventaja de que las fórmulas se puedan aplicar de forma válida para comparar estados de dos o más biorreactores que tienen diferentes escalas, tipos o equipos. El valor de PACo se calcula a partir de datos de entrada que no implican una medición fuera de línea. Las mediciones de compensación, por ejemplo, para determinar el valor de pH o contenido de biomasa de una muestra de acuerdo con enfoques previos para determinar el estado de un biorreactor, podrían añadir compensaciones a los valores de medición. Dichas compensaciones dependen, a menudo, del equipo usado en la planta y sitio de producción respectivos y, por tanto, podrían ser un obstáculo al comparar de forma fiable los estados de biorreactores localizados en diferentes sitios de producción. Por tanto, las fórmulas anteriores pueden proporcionar una comparación global sólida con respecto a errores de los estados en un biorreactor.

Sin embargo, la fórmula anterior se puede ajustar de muchas maneras:

- la fórmula se puede modificar para que incluya factores de corrección para el volumen de gas: la fórmula anterior supone un gas ideal que tiene un volumen molar de 22,414 litros a 273,15 K y una presión de 1,01325*105 Pa. En realidad, la temperatura, la presión y, por lo tanto, los volúmenes podrían diferir. Por lo tanto, se pueden usar factores de corrección o datos medidos para ajustar la fórmula y la exactitud de la emisión.

- la fórmula se puede modificar para que incluya factores de corrección para las concentraciones de gas de escape C02 medidas para compensar los efectos de la presión: de este modo, el impacto de los cambios de presión ambiental sobre la concentración de gas de escape C02 se puede compensar;

- la fórmula se puede modificar para que incluya factores de corrección para la humedad del gas de escape para compensar los efectos de la humedad en las mediciones de la concentración de C02 en el gas de escape;

- la fórmula se puede modificar para que incluya factores de corrección para la temperatura para compensar los efectos de la temperatura sobre el dispositivo de medición de pH usado; los valores de pH medidos por dos o más medidores de pH en línea se pueden recibir simultáneamente y usar para calcular un valor de pH medido promedio para incrementar la exactitud de la medición de pH;

- la fórmula se puede modificar para que explique o compense el efecto de la calibración de la sonda, la compensación se puede implementar, por ejemplo, en forma de una curva de compensación que, si se superpone a un voltaje medido de un medidor de pH, varía el voltaje medido por unidad de pH (por ejemplo, mV/pH); la curva puede tener una pendiente y una amplitud adecuadas para compensar las compensaciones actuales de una medición de pH obtenida de sondas a pH neutro. Por ejemplo, una función de compensación de temperatura del medidor de pH podría dar lugar a diferentes lecturas de pH si se enciende y se apaga. De forma alternativa, el medidor de pH puede admitir algoritmos diferentes para calcular el pH a partir de una diferencia de voltaje medida. Todos dichos efectos se pueden compensar introduciendo uno o más factores de compensación en la fórmula.

Preferentemente, el cálculo de un valor de PACO de referencia se realiza de la misma manera que el cálculo del valor de PACO, con lo que los valores de pH y las tasas de gas de escape CO2 actuales se miden en el biorreactor de referencia.

De acuerdo con modos de realización, la unidad de controlador controla el biorreactor supervisado 104 de modo que se minimice la diferencia entre un valor de PACO calculado actualmente para el biorreactor controlado 104 (a partir de un valor de pH y una concentración de CO2 en [%] medidos en un momento ti después de la inoculación) y un valor de PACO de referencia correspondiente en un perfil de referencia 402.

Valores de PACO normalizados

De acuerdo con algunos modos de realización, se calcula un valor de PACO normalizado que tiene en cuenta el volumen del medio M1 en el biorreactor para el que se calcula el valor de PACO.

Esto puede permitir nivelar diferentes volúmenes de biorreactor y, por tanto, puede permitir aumentar o reducir a escala un proceso de biorreactor y/o comparar cultivos celulares de biorreactores que tienen diferentes dimensiones.

Al principio, las tasas de gas de escape CO2 normalizadas "NACO ^m ¹" se calculan de acuerdo con:

ac

m ol' °m1-exp(ph)[%]]_.. TGI[m .

min 100 J 1000 x 22,414 ^l

_mol

NAC°M1-EXP(pH) l volumen del medio M1 en el biorreactor [l]'

ac° m1-m(ph)[%]]_.. TG|[mn

mol

min
100 J 1000 x 22,414 ^_

_m ^l_

_l

NACOM1-M ( pH) l volumen del medio M1 en el biorreactor [l]

En caso de que se calcule la PACO para el biorreactor de referencia 102, el volumen del medio M1 en el biorreactor es el "volumen del medio en el biorreactor de referencia". En caso de que se calcule la PACO para el biorreactor supervisado y/o controlado 104, el volumen del medio M1 en el biorreactor controlado y/o supervisado es el "volumen del medio en el biorreactor". Dicho volumen no comprende la fase gaseosa por encima del medio.

A continuación, se calcula un valor de PACO normalizado con respecto al volumen para un momento ti particular cuando se midió el valor de pH usado para predecir el valor de gas de escape CO2:

De acuerdo con modos de realización, las tasas de gas de escape CO2 y los valores de PACO normalizados también se pueden calcular usando la masa total del medio M1 en el biorreactor en lugar del volumen del medio en el biorreactor. De este modo, 1 l del medio típicamente corresponde a una masa de 1 kg.

La figura 7d muestra un perfil de PACO que resulta de la diferencia de la tasa de gas de escape CO2 predicha y medida realmente.

La figura 8a es un diagrama que muestra un perfil de PACO de referencia 402 de un biorreactor de referencia 102, un perfil de PACO 802 de un primer biorreactor supervisado y/o controlado 104 y otro perfil de PACO 804 de un segundo biorreactor supervisado/y controlado 106. El diagrama indica que ya en el momento t0 (en el ejemplo representado en la fig. 8, el momento t0 es el momento de inoculación de un biorreactor con el cultivo celular), el valor de PACO del biorreactor 104 ("B1") difiere significativamente del valor de PACO en t0 del biorreactor de referencia. De acuerdo con modos de realización, esto se puede usar como una indicación de que los medidores de pH de los biorreactores en los que sus perfiles se comparan se han calibrado de forma diferente. Suponiendo que el dispositivo de medición de pH del biorreactor de referencia se calibrara de forma correcta, se puede usar la desviación de PACO en t0 (es decir, en o antes de que el medio comprenda cualquier célula del cultivo celular que pudiera modular la PACO) como una indicación de que el dispositivo de medición de pH del biorreactor supervisado 106 ("B2"), 104 ("B1") se calibró erróneamente y se debe calibrar de forma correcta antes de comenzar a cultivar el cultivo celular.

En el ejemplo representado, el valor de PACO del perfil 804 del biorreactor supervisado 106 ("B2") en el momento t0 es idéntico al valor de PACO de referencia del perfil de PACO de referencia 402 en el momento t0. El valor de PACO del perfil 802 del biorreactor supervisado 104 ("B4") en el momento t0 difiere significativamente del valor de PACO de referencia del perfil de PACO de referencia 402 en el momento t0.

De forma alternativa, en lugar de los valores de PACO, se puede comparar la concentración de CO2 del gas de escape de los dos biorreactores para determinar si los dispositivos de medición de pH de los dos biorreactores comparados se calibraron de forma idéntica. Los dos biorreactores se inician y llenan con el mismo medio libre de células a la misma presión y temperatura, y se miden un valor de pH actual y una concentración de CO2 actual del medio en los dos biorreactores y se comparan cuando los dos biorreactores han alcanzado el equilibrio pH-CO2. Si la concentración de CO2 en el gas de escape de los dos biorreactores es idéntica, aunque que el valor de pH no lo sea, o si los valores de pH de los dos biorreactores son idénticos y la concentración de CO2 en el gas de escape no lo sea, la unidad de comparación determina que los dos biorreactores se calibraron de forma diferente.

Los medidores de pH calibrados de forma incorrecta pueden dar como resultado resultados inexactos cuando se comparan los estados de un cultivo celular de dos cultivos celulares en base a valores de PACO. Esto se debe a que el valor de PACO es una derivada del valor de pH. Como consecuencia, además, cualquier acción tomada por el controlador para minimizar la diferencia de PACO puede hacer que no se minimicen las diferencias de PACO (este efecto no se muestra en las figuras 8a y 8b, porque durante el cultivo del cultivo celular en el biorreactor B2, se modificó el equilibrio pH-CO2 añadiendo una base e incrementando la tasa de flujo de entrada de gas total; por tanto, el perfil de PACO de B2 difiere significativamente del perfil de PACO de referencia, aunque los medidores de pH del biorreactor de referencia y del biorreactor B2 se calibraran de la misma manera).

La figura 8b es un diagrama que muestra las diferencias de perfil de PACO de los perfiles de PACO 802, 804 de dos biorreactores 104, 106 con respecto al perfil de PACO de referencia 402 del biorreactor de referencia 102. La curva 810 representa las diferencias de perfil de PACO del biorreactor 104 y el biorreactor de referencia y la curva 808 representa las diferencias de perfil de PACO del biorreactor 106 y el biorreactor de referencia. Las diferencias de perfil de PACO del biorreactor 106 con respecto al perfil de referencia de PACO 402 son significativamente mayores que las diferencias de PACO del biorreactor 104, porque mientras se cultivó el cultivo celular en B2, se modificó el equilibrio pH-CO2.

Lista de números de referencia

100 sistema para supervisar y/o controlar estados de un cultivo celular en un biorreactor

102 biorreactor de referencia

104 biorreactor supervisado y/o controlado B1

106 biorreactor supervisado y/o controlado B2

108 dispositivo de medición de pH

110 procesador

112 memoria

114 medio de almacenamiento

116 perfil de PACO de referencia

118 perfil de PACO de referencia

120 interfaz para recibir uno o más perfiles de PACO de referencia y relaciones específicas de medio 122 analizador de gas de escape CO2

124 analizador de gas de escape CO2

126 analizador de gas de escape CO2

128 interfaz para recibir parámetros medidos en uno o más biorreactores

130 unidad de comparación por PACO

132 unidad de control

134 pantalla

136 relación específica de medio para el medio M1

138 relación específica de medio para el medio M2

140 sensor para flujo de entrada de gas total

142 dispositivo de medición de pH

144 sensor para flujo de entrada de gas total

146 dispositivo de medición de pH

202-220 etapas

402 perfil de referencia de PACO

502 relación específica de medio representada para cuatro biorreactores

802 perfil de PACO de un biorreactor supervisado

804 perfil de PACO de un biorreactor supervisado

808 diferencia de perfil con respecto al perfil de PACO de referencia

810 diferencia de perfil con respecto al perfil de PACO de referencia

M1 medio de cultivo celular

TGIbi flujo de entrada de gas total en el biorreactor B1

TGI B2 flujo de entrada de gas total en el biorreactor B2

TGIr flujo de entrada de gas total en el biorreactor de referencia TGOb1 gas de escape total del biorreactor B1

TGOb2 gas de escape total del biorreactor B2

TGOR gas de escape total del biorreactor de referencia

TLI B1 flujo de entrada de líquido total en el biorreactor B1

TLI B2 flujo de entrada de líquido total en el biorreactor B2

TLIr flujo de entrada de líquido total en el biorreactor de referencia TLOb1 salida (de líquido) total del biorreactor B1

TLOb2 salida (de líquido) total del biorreactor B2

TLOr salida (de líquido) total del biorreactor de referencia

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un sistema (100) para supervisar desviaciones de un estado de un cultivo celular en un biorreactor (104, 106) a partir de un estado de referencia de un cultivo celular en un biorreactor de referencia (102), comprendiendo el biorreactor el mismo medio (M1) que el biorreactor de referencia, comprendiendo el sistema:

- un medio de almacenamiento (114) que comprende:

■ un perfil de referencia de PACO (116), siendo el perfil de referencia de PACO una representación de la variación en un valor de PACO de referencia (PACOR-ti) frente al tiempo (ti), indicando el perfil de referencia de PACO la diferencia de una tasa de gas de escape CO2 (ACOr-m-m) medida en el biorreactor de referencia a partir de una tasa de gas de escape CO2 predicha (ACOr-exp-m) del biorreactor de referencia, siendo dicha tasa de gas de escape CO2 predicha la tasa de gas de escape predicha de dicho medio en el biorreactor de referencia en estado de equilibrio pH-CO2 en ausencia del cultivo celular y bajo la condición de que el valor de pH del medio en estado de equilibrio sea idéntico al valor de pH (pHR-ti) del biorreactor de referencia medido cuando se mide la tasa de gas de escape CO2 (ACOr-m-m) en el biorreactor de referencia, dependiendo el perfil de referencia de PACO de la cantidad de gas de escape CO2 producido por las células del cultivo celular en el biorreactor de referencia mientras se cultiva el cultivo celular;

■ un objeto de datos que comprende una relación específica de medio (136), siendo la relación específica de medio específica para el medio (M1) e indicando una relación entre el valor de pH del medio (M1) y una fracción respectiva de gas CO2 en un volumen de gas cuando dicho medio está en estado de equilibrio pH-CO2 con dicho volumen de gas y carece de cultivo celular;

- una interfaz (128) para recibir repetidamente (212), en un momento (ti) actual, una tasa de gas de escape CO2 actual (ACOB1-M-ti, ACOB2-M-ti) del biorreactor (104, 106) y un valor de pH actual (pHB1-ti, pHB2-ti) del medio del biorreactor (104, 106) medidos durante el cultivo del cultivo celular en el biorreactor;

- una unidad de comparación (130) configurada para calcular (214, 216), para cada una de las tasas de gas de escape CO2 actuales recibidas:

■ un valor de PACO (PACObuí, PACOB2-ti), indicando el valor de PACO la diferencia de una tasa de gas de escape CO2 (ACOB1-M-ti, ACOB2-M-ti) medida en el biorreactor (104, 106) a partir de una tasa de gas de escape CO2 predicha (ACOb1-exp-m, ACOb2-exp-m), siendo la tasa de gas de escape CO2 predicha la tasa de gas de escape predicha de dicho medio en dicho biorreactor (104, 106) en estado de equilibrio pH-CO2 en ausencia del cultivo celular y bajo la condición de que el valor de pH del medio en estado de equilibrio sea idéntico al valor de pH actual (pHB1-ti, pHB2-ti) del biorreactor (104, 106) medido cuando se mide la tasa de gas de escape CO2 en el biorreactor (104, 106), dependiendo el valor de PACO de la cantidad de gas de escape CO2 producido por las células del cultivo celular en el biorreactor mientras se cultiva el cultivo celular, usando el cálculo del valor de PACO (PACOB1-ti, PACOB2-ti) como entrada:

o la tasa de gas de escape CO2 actual recibida (ACOB1-M-ti, ACOB2-M-ti);

o el valor de pH actual recibido (pHB1-t¡, pHB2-ti);

o la tasa de entrada de gas total (TGIb1, TGIb2) del biorreactor en el momento (ti) de recepción de la tasa de gas de escape CO2 actual; y

o la relación específica de medio (136);

■ una diferencia entre el valor de PACO calculado (PACObuí, PACOb2-m) y un valor de PACO de referencia (PACOR-ti) respectivo en el perfil de referencia de PACO (116);

estando configurada la unidad de comparación (130) para emitir (218) la diferencia calculada, siendo la diferencia calculada indicativa de una desviación del estado del cultivo celular en el biorreactor (104, 106) a partir del estado de referencia.

2. El sistema (100) de la reivindicación 1, siendo la relación específica de medio una ecuación FCO2M1(pH) =REL-M1(pH) obtenida ajustando de forma matemática múltiples pares determinados empíricamente de un valor de pH del medio (M1) y una fracción de gas CO2 medida respectivamente en un volumen de gas, en la que:

- FCO2M1(pH) es la fracción de gas CO2 predicha en un volumen de gas por encima de una muestra del medio (M1) cuando dicho medio tiene un valor de pH dado y está en estado de equilibrio pH-CO2 con dicho volumen de gas y carece de cultivo celular;

- el valor del pH es un valor de parámetro de entrada y representa el valor del pH del medio (M1) en estado de equilibrio pH-CO2 en ausencia del cultivo celular;

- en la que REL-M1 es un conjunto de uno o más parámetros (a1, a2, b1, b2, b3) conectados por operadores, habiéndose obtenido los parámetros:

■ ajustando las muestras del medio (M1) que carece de cultivo celular a múltiples valores de pH diferentes, dejando, de este modo, que las muestras alcancen el equilibrio pH-CO2 con el volumen de gas,

■ determinando la fracción de gas CO2 en un volumen de gas respectivo que está en equilibrio pH-CO2 con el medio en las muestras,

■ representando las fracciones de gas CO2 determinadas frente a los valores de pH en equilibrio respectivos de las muestras,

■ ajustando una curva (502) en los valores representados y derivando los parámetros (a1, a2 o b1, b2, b3) de la relación específica de medio de la curva ajustada.

3. El sistema (100) de una cualquiera de las reivindicaciones previas, siendo la tasa de gas de escape CO2 actual recibida, el valor de pH actual recibido, la tasa de entrada de gas total del biorreactor en un momento ti particular (t0, t1,..., tmáx) y la relación específica de medio los únicos parámetros de entrada para calcular el valor de PACO (PACOb-uí, PACOB2-ti) para el biorreactor supervisado.

4. El sistema (100) de una cualquiera de las reivindicaciones previas, estando configurado el sistema para calcular el valor de PACO (PACOb-uí, pAc Ob2-m), comprendiendo el cálculo del valor de PACO:

- introducir el valor de pH actual recibido en la relación específica de medio para calcular una concentración de CO2 predicha ("FCO2exp") en el volumen de gas del biorreactor (104, 106) en estado de equilibrio con el medio en el momento de medir la tasa de gas de escape CO2 actual y el valor de pH actual;

- multiplicar la concentración de CO2 predicha ("FCO2exp") por la tasa de entrada de gas total del biorreactor para obtener la tasa de gas de escape CO2 predicha ("ACOexp") del biorreactor, siendo la tasa de gas de escape CO2 predicha la tasa de gas de escape predicha de dicho medio en estado de equilibrio pH-CO2 en ausencia del cultivo celular y bajo la condición de que el valor de pH del medio en estado de equilibrio sea idéntico al valor de pH actual recibido introducido en la relación específica de medio; y

- restar la tasa de gas de escape CO2 medida (ACObi-m-m, ACOb2-m-m) del biorreactor de la tasa de gas de escape CO2 predicha (ACObi-exp-m, ACOb2-exp-m) del biorreactor para obtener el valor de PACO.

5. El sistema (100) de la reivindicación 4, realizándose el cálculo de la tasa de gas de escape CO2 predicha (ACObi -Exp-ti, ACOBi-EXp-ti) del biorreactor en el momento (ti) actual de acuerdo con: ACOEXP-ti[mol/min]= ( FCO2 [%^ x TGIB1 en la que TGIbi es la cantidad total de flujo de entrada de gas del biorreactor (104, 106) en el momento (ti) actual, y en la que FCO2exp es la concentración de CO2 predicha en el volumen de gas del biorreactor (104, 106) en equilibrio estado con el medio en el momento de medir la tasa de gas de escape CO2 actual y el valor de pH actual.

6. El sistema (100) de una cualquiera de las reivindicaciones previas, comprendiendo la emisión de la diferencia calculada:

- en caso de que la diferencia calculada (808, 810) entre el valor de PACO calculado (PACOBi-ti, PACOB2-ti) y un valor de PACO de referencia (PACOR-ti) respectivo en el perfil de referencia de PACO (116) supere un umbral valor, emitir automáticamente una señal de alarma.

7. El sistema (100) de una cualquiera de las reivindicaciones previas, siendo el medio un medio tamponado con carbonato.

8. El sistema (100) de una cualquiera de las reivindicaciones previas, difiriendo el biorreactor de referencia del biorreactor (104, 106) con respecto a uno o más de los siguientes rasgos característicos:

a) el volumen de gas en el biorreactor,

b) el volumen del medio en el biorreactor,

c) el número de Reynolds del biorreactor,

d) el número de Newton del biorreactor,

e) las dimensiones del biorreactor,

f) rasgos característicos geométricos del biorreactor y/o deflectores del biorreactor,

g) la configuración del agitador,

h) la tasa de agitación,

k) entrada de potencia,

l) presión en el biorreactor,

m) tiempo de retención de las burbujas de gas en el medio,

n) tamaño y distribución de las burbujas de gas en el medio,

o) velocidad superficial,

9. El sistema (100) de una cualquiera de las reivindicaciones previas, comprendiendo el cálculo del valor de PACO (PACOb-uí) en el momento (ti) actual calcular, para cada uno de las tasas de gas de escape CO2 (ACObi-m-m) y los valores de pH (pHBi-ti) actuales recibidos del biorreactor (104):

- el [%] de la fracción de gas de escape CO2 esperada FCO2bi-exp-m de un volumen de desgasificación actual del biorreactor (104) de acuerdo con: [%] de FCO2bi-exp-m = REL-M1 (pHBi-ti), en la que [%] de FCO2bi-exp-m es una fracción de gas de escape CO2 predicha del volumen de gas de escape total (TGObi) del biorreactor (104) en % en el momento (ti) actual, calculándose la predicción usando el valor de pH actual recibido (pHBi-ti) como entrada para REL-MI(pHBi-ti), en la que REL-M1 es la relación específica de medio (136) del medio (M i), en la que pHBi-ti es el valor de pH actual recibido en el medio del biorreactor (104, 106) en el momento (ti) actual,

- un valor de la tasa de gas de escape CO2 esperada ACObi-exp-m [mol/min] de acuerdo con: ACOB1-EXP-ti[mol/min]= ^FCO2Bi-Exp-ti [%]~j x TGIB1 en la que el valor de ACObi-exp-m [mol/min] es la tasa de gas de escape CO2 esperada del biorreactor (104) cuando el medio del biorreactor tiene el valor de pH medido actualmente y está en equilibrio pH-CO2 con la fase gaseosa por encima de dicho medio en \ j ^ , en la que TGIB1 es la cantidad total de flujo de entrada de gas del biorreactor (104) en el momento (ti) actual,

- el valor de PACOBi-ti [mol/min] de acuerdo con: PACOBi-ti = ACObi-exp-m [mol/min] - ACObi-m-m [mol/min], en la que ACOBi-M-ti [mol/min] es la tasa de gas de escape CO2 en [mOJ medida en el momento ti en el biorreactor (104).

10. El sistema (100) de una cualquiera de las reivindicaciones previas, teniendo el medio en el biorreactor de referencia un primer volumen (VRM) y una primera masa total, teniendo el medio en el biorreactor (104, 106) un segundo volumen (V1M) y una segunda masa total, difiriendo el primer volumen y el segundo volumen entre sí, comprendiendo el cálculo de la diferencia entre cada uno de los valores de PACO calculados (PACOBi-ti) y su valor de PACO de referencia (PACOR-ti) respectivo en el perfil de referencia de PACO (116, 402):

- dividir, por el procesador, el valor de PACO calculado (PACOBi-ti) entre el segundo volumen (VB1M); y dividir, por el procesador, el valor de PACO de referencia (PACOR-ti) respectivo en el perfil de referencia de PACO (116) entre el primer volumen (VRM); o

- dividir, por el procesador, el valor de PACO calculado (PACOBi-ti) entre la segunda masa; y dividir, por el procesador, el valor de PACO de referencia (PACOR-ti) respectivo en el perfil de referencia de PACO (116) entre la primera masa.

11. El sistema (100) de una cualquiera de las reivindicaciones previas, cubriendo el perfil de referencia de PACO (116, 402) múltiples fases de funcionamiento del biorreactor de referencia, comprendiendo las fases:

- una fase de alimentación durante la que el cultivo celular se cultiva en el biorreactor de referencia en presencia de una tasa de alimentación dada, no excretando el cultivo celular un metabolito que afecta al valor de pH del medio;

12. El sistema (100) de una cualquiera de las reivindicaciones previas, comprendiendo el sistema una unidad de control (132) configurada para modificar automáticamente uno o más parámetros de control del biorreactor (104, 106) de modo que se minimice la diferencia entre los valores de PACO calculados (PACObuí) y los valores de PACO de referencia (PACOR-ti) respectivos en el perfil de referencia de PACO (116).

13. El sistema (100) de la reivindicación 12,

- en el que, en caso de que los valores de PACO (PACObuí) sean mayores que los valores de PACO de referencia (PACOR-ti) respectivos en el perfil de referencia de PACO, la unidad de control modifica automáticamente uno o más parámetros de control del biorreactor (104, 106) realizando una o más de las siguientes operaciones: reducir la tasa de flujo de entrada de aire total y/o reducir la tasa de flujo de entrada de gas O2 y/o reducir la tasa de flujo de entrada de gas CO2 y/o reducir la tasa de flujo de entrada de base en el biorreactor (104, 106) y/o modificar la presión o la temperatura del biorreactor;

- en el que, en caso de que los valores de PACO (PACObuí) sean menores que los valores de PACO de referencia (PACOR-ti) respectivos en el perfil de referencia de PACO, la unidad de control modifica automáticamente uno o más parámetros de control del biorreactor (104, 106) realizando una o más de las siguientes operaciones: incrementar la tasa de flujo de entrada de aire total y/o incrementar la tasa de flujo de entrada de gas O2 y/o incrementar la tasa de flujo de entrada de gas CO2 y/o incrementar la tasa de flujo de entrada de base en el biorreactor (104, 106) y/o modificar la presión o la temperatura del biorreactor.

14. El sistema (100) de una cualquiera de las reivindicaciones previas, que comprende además el biorreactor (104, 106).

15. Un procedimiento para supervisar desviaciones de un estado de un cultivo celular en un biorreactor (104, 106) a partir de un estado de referencia de un cultivo celular en un biorreactor de referencia (102), comprendiendo el biorreactor el mismo medio (M1) que el biorreactor de referencia, comprendiendo el procedimiento:

- recibir, por una unidad de comparación (130) de un sistema para supervisar estados en un biorreactor (100), un perfil de referencia de PACO (116), siendo el perfil de referencia de PACO una representación de la variación en un valor de PACO de referencia (PACOR-ti) frente al tiempo (ti), indicando el perfil de referencia de PACO la diferencia de una tasa de gas de escape CO2 (ACOr-m-m) medida en el biorreactor de referencia a partir de una tasa de gas de escape CO2 predicha (ACOr-exp-m) del biorreactor de referencia, siendo dicha tasa de gas de escape CO2 predicha la tasa de gas de escape predicha de dicho medio en el biorreactor de referencia en estado de equilibrio pH-CO2 en ausencia del cultivo celular y bajo la condición de que el valor de pH (pHR-M-ti) del medio en estado de equilibrio sea idéntico al valor de pH del biorreactor de referencia medido cuando se mide la tasa de gas de escape CO2 (ACOR-M-ti) en el biorreactor de referencia, dependiendo el perfil de referencia de PACO de la cantidad de gas de escape CO2 producido por las células del cultivo celular en el biorreactor de referencia mientras se cultiva el cultivo celular;

- recibir, por la unidad de comparación, un objeto de datos que comprende una relación específica de medio (136), siendo la relación específica de medio específica para el medio (M1) e indicando una relación entre el valor de pH del medio (M1) y una fracción respectiva de gas CO2 en un volumen de gas cuando dicho medio está en estado de equilibrio pH-CO2 con dicho volumen de gas y carece de cultivo celular;

- recibir repetidamente (212), en un momento (ti) actual, una tasa de gas de escape CO2 actual (ACOB1-M-ti, ACOB2-M-ti) del biorreactor (104, 106) y un valor de pH actual (pHB1-ti, pHB2-ti) del medio del biorreactor (104, 106) medidos durante el cultivo del cultivo celular en el biorreactor;

■ un valor de PACO (PACObuí, PACOB2-ti), indicando el valor de PACO la diferencia de una tasa de gas de escape CO2 (ACOB1-M-ti, ACOB2-M-ti) medida en el biorreactor a partir de una tasa de gas de escape CO2 predicha (ACOb1 -Exp-ti, ACOB2-EXp-ti), siendo la tasa de gas de escape CO2 predicha la tasa de gas de escape predicha de dicho medio en el biorreactor en estado de equilibrio pH-CO2 en ausencia del cultivo celular y bajo la condición de que el valor de pH del medio en estado de equilibrio sea idéntico al valor de pH (pHB1-ti, pHB2-ti) del biorreactor (104, 106) medido cuando se mide la tasa de gas de escape CO2 en el biorreactor (104, 106), dependiendo el valor de PACO de la cantidad de gas de escape CO2 producido por las células del cultivo celular en el biorreactor mientras se cultiva el cultivo celular, usando el cálculo del valor de PACO (PACOBi-ti, PACOB2-ti) como entrada:

o la tasa de gas de escape CO2 actual recibida (ACOB1-M-t¡, ACOB2-M-ti);

o el valor de pH actual recibido (pHB1-t¡, pHB2-ti);

o la tasa de entrada de gas total (TGIbi, TGIb2) del biorreactor en el momento (ti) de recepción de la tasa de gas de escape CO2 actual; y

o la relación específica de medio (136);

■ una diferencia entre el valor de PACO calculado (PACObuí, PACOB2-t¡) y un valor de PACO de referencia (PACOR-ti) respectivo en el perfil de referencia de PACO (116);

- emitir, por la unidad de comparación (130), la diferencia calculada, siendo la diferencia calculada indicativa de una desviación del estado del cultivo celular en el biorreactor (104, 106) a partir del estado de referencia.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, comprendiendo el perfil de referencia de PACO una pluralidad de valores de PACO de referencia, comprendiendo además el procedimiento calcular los valores de PACO de referencia:

- recibiendo repetidamente, en un momento (ti) actual, una tasa de gas de escape CO2 actual (ACOr-m-m) del biorreactor de referencia (102) en y un valor de pH actual (pHR-t¡) del medio del biorreactor de referencia (102) medido en dicho momento (ti) actual mientras se cultiva el cultivo celular en el biorreactor de referencia;

- calculando, para cada uno de los pares recibidos de una tasa de gas de escape CO2 actual (ACOr-m-m) y de un valor de pH actual (pHR-t¡), uno de los valores de PACO de referencia (PACOR-ti), usando el cálculo del valor de PACO de referencia como entrada:

o la tasa de gas de escape CO2 actual recibida (ACOr-m-m) del biorreactor de referencia;

o el valor de pH actual recibido (pHR-t¡); del biorreactor de referencia;

o la tasa de entrada de gas total (TGIr) del biorreactor de referencia en el momento (ti) de recepción de la tasa de gas de escape CO2 actual; y

o la relación específica de medio (136).

17. El procedimiento de la reivindicación 16, que comprende además crear el perfil de referencia de PACO del biorreactor de referencia (102):

- representando los valores de PACO de referencia (PACOR-ti) en un gráfico de tasa de gas de escape CO2 frente al tiempo;

- ajustando una curva en los valores de PACO de referencia representados, constituyendo dicha curva el perfil de PACO de referencia.

18. El procedimiento de la reivindicación 16 o 17, comprendiendo el cálculo de cada uno de los valores de PACO de referencia (PACOR-ti) en los momentos (ti) actuales respectivos calcular, para cada uno de las tasas de gas de escape CO2 (Ac Or-m-m) y los valores de pH actuales recibidos del biorreactor de referencia (102):

- un [%] de la fracción de gas de escape CO2 esperada FCO2r-exp-m de un volumen de desgasificación actual del biorreactor de referencia (102) de acuerdo con: [%] de FCO2r-exp-m = REL-M1 (pHR-t¡), en la que [%] de FCO2r-exp-m es una fracción de gas de escape CO2 predicha del volumen de gas de escape total (TGOr) del biorreactor de referencia (102) en % en el momento (ti) actual, calculándose la predicción usando el valor de pH actual recibido (pHR-ti) como entrada para REL-M1 (pHR-t¡), en la que REL-M1 es la relación específica de medio (136) del medio (M1), en la que pHR-t¡ es el valor de pH actual en el medio del biorreactor de referencia (102) recibido en el momento ti,

- un valor de la tasa de gas de escape CO2 esperada ACOr-exp-m [mol/min] de acuerdo con: ACOR-EXP-ti [mol/min]= [%l~j x j q ir en la que valor de ACOr-exp-m [mol/min] es la tasa de gas de escape CO2 esperada del biorreactor de referencia (102) en [m“ ],, en la que TGIr es la cantidad total de flujo de entrada de gas del biorreactor de referencia (102) en el momento (ti) actual,

- el valor de PACOR-ti [mol/min] de acuerdo con: PACOR-ti = ACOr-exp-m [mol/min] - ACOr-m-m [mol/min], en la que ACOR-M-ti [mol/min] es la tasa de gas de escape CO2

medida en el momento ti en el biorreactor de referencia (102);

- el valor de PACOR-ti [mol/min] de acuerdo con: PACOR-ti = ACOr-exp-m [mol/min] - ACOR-M-ti [mol/min].