JP2018533936A - バイオリアクターにおける状態逸脱のモニタリング - Google Patents

Abstract

参照バイオリアクター(102)内にある細胞培養物の参照状態からの、バイオリアクター(104、106)内にある細胞培養物の状態の逸脱をモニタリングするためのシステム(100)に関する。バイオリアクターは参照バイオリアクターと同じ培地(M1)を含む。システムは、●- ●参照バイオリアクターのCO2オフガス速度予測値(ACO_R-EXP-ti)からの、参照バイオリアクターにおいて測定されたCO2オフガス速度(ACO_R-M-ti)の逸脱を示すPACO参照プロファイル(116)と、●培地(M1)がガス体積とpH-CO2平衡状態にありかつ細胞培養物を欠く時の、培地(M1)のpH値とガス体積中のそれぞれのCO2ガス分率との間の培地固有関係式(136)を含むデータオブジェクトと、を含む、記憶媒体(114); ●- バイオリアクター(104、106)の現在のCO2オフガス速度(ACO_B1-M-ti、ACO_B2-M-ti)および培地の現在のpH値(pH_B1-ti)を受信する(212)ためのインターフェイス(128); ●- ●CO2オフガス速度予測値(ACO_B1-EXP-ti、ACO_B2-EXP-ti)からの、バイオリアクターにおいて測定されたCO2オフガス速度(ACO_B1-M-ti、ACO_B2-M-ti)の逸脱を示すPACO値(PACO_B1-ti、PACO_B1-ti)、および算出されたPACO値(PACO_B1-ti、PACO_B2-ti)とPACO参照プロファイル(116)中のそれぞれの参照PACO値(PACO_R-ti)との差を算出する(214、216)ために構成された、比較ユニット(130)を備える。

Description

発明の分野
本発明は、生物化学工学の分野に関し、特に、バイオリアクターをモニタリングするためのシステムに関する。

背景および関連分野
バイオリアクターは、例えば、化合物、例えば、特定のペプチド、タンパク質、または他の種類の化学物質を得るために、化学プロセス、特に、生物が行うプロセスを制御された形で実施するためによく用いられる。共通の目標は、少ない不純物生産量で、ならびに/または時間対効果および費用対効果が大きなやり方で微生物または細胞が望ましい機能を果たすことができるようにバイオリアクターを操作することである。バイオリアクター内の環境条件は、温度、栄養分濃度、pH、および溶解ガスなどがあるが、培養細胞のパラメーターおよびバイオリアクターのパラメーター、例えば、バイオリアクターの形状およびサイズもあり、生物の増殖および生産性に影響を及ぼす。従って、生物の増殖および生産性は、互いに影響を及ぼすことが多い複数のパラメーターに依存する。従って、バイオリアクター内で細胞を増殖させる目的で、規定された条件を提供するために全パラメーターを一定に保つことは極めて難しいタスクであることが多い。さらに、参照バイオリアクターの物理化学的環境を別のバイオリアクター内で正確に再現するためには、バイオリアクター内での細胞培養物の増殖および代謝に影響を及ぼす複数のパラメーターの複雑な相互依存は障害である。

例えば、WO2007/085880A1（特許文献1）は、細菌および栄養分を含むバッチ/フェッドバッチ発酵ユニットのブロス中にある生成物、バイオマス、糖の濃度のような複数のパラメーターを用いて発酵ユニットの将来の性能をオンライン予測するための方法について述べている。この方法では、コンピュータモデルが、現在のプラントデータに基づいて将来の生成物濃度を予測する。数時間ごとにブロス試料が採取され、実験室でバイオマス収率について分析される。

しかしながら、多くの場合、参照バイオリアクターを操作するのに使用した正確に同じパラメーターで、特定のバイオリアクターを操作することは不可能である。この場合、前記の特定のバイオリアクター内での細胞培養物の状態と参照バイオリアクター内での参照細胞培養物の「望ましい」状態を比較することは難しいか、誤りがちであるか、もっと言うと不可能である。

WO2007/085880A1

概要
本発明の目的は、独立請求項に明記したようにバイオリアクターをモニタリングするための改善したシステムおよび方法を提供することである。本発明の態様は従属請求項に示される。本発明の態様は相互に排他的でなければ互いに自由に組み合わせることができる。

本明細書で使用する「バイオリアクター」とは、生物またはこのような生物に由来する生化学的に活性な物質が関与する化学プロセスが行われる容器である。このプロセスは、例えば、好気性でもよく、嫌気性でもよい。形状(例えば、円筒形または他の形状)、サイズ(例えば、ミリリットル、リットル〜立方メートル)、および材料(ステンレス鋼、ガラス、プラスチックなど)が異なる複数の異なるバイオリアクタータイプが存在する。態様によれば、バイオリアクターは、細胞培養中の細胞を増殖させるか、または組織を成長させるように合わせられる。態様および/または操作方式に応じて、バイオリアクターは、バッチバイオリアクター、フェドバッチバイオリアクター、または連続バイオリアクター(例えば、連続撹拌タンクリアクターモデル)でもよい。連続バイオリアクターの一例はケモスタットである。

一局面において、本発明は、参照バイオリアクター内にある細胞培養物の参照状態からの、バイオリアクター内にある細胞培養物の状態の逸脱をモニタリングするためのシステムに関する。バイオリアクターは参照バイオリアクターと同じ培地を含む。システムは、
- ■時間に対する参照PACO値の変動の表現であり、参照バイオリアクターのCO2オフガス速度予測値からの、参照バイオリアクターにおいて測定されたCO2オフガス速度の逸脱を示すPACO参照プロファイルであって、CO2オフガス速度予測値は、細胞培養物の非存在下での、かつ、平衡状態にある培地のpH値が、参照バイオリアクターのCO2オフガス速度を測定した時に測定された参照バイオリアクターのpH値と同一であるという条件下での、pH-CO2平衡状態にある参照バイオリアクター内の前記培地のオフガス速度予測値であり、PACO参照プロファイルが、細胞培養物の培養中に参照バイオリアクター内の細胞培養物の細胞によって生成されたCO2オフガスの量に依存する、PACO参照プロファイルと、
■培地固有関係式を含むデータオブジェクトであって、培地固有関係式が、培地に固有であり、前記培地がガス体積とpH-CO2平衡状態にありかつ細胞培養物を欠く時の、培地のpH値とガス体積中のそれぞれのCO2ガス分率との関係を示す、データオブジェクトと
を含む、記憶媒体;
- 現在の時間において、バイオリアクター内での細胞培養物の培養中に測定された、バイオリアクターの現在のCO2オフガス速度とバイオリアクターの培地の現在のpH値とを繰り返し受信するためのインターフェイス;
- 受信した現在のCO2オフガス速度のそれぞれについて、
■バイオリアクターのCO2オフガス速度予測値からの、バイオリアクターにおいて測定されたCO2オフガス速度の逸脱を示すPACO値であって、CO2オフガス速度予測値は、細胞培養物の非存在下での、かつ、平衡状態にある培地のpH値が、バイオリアクターのCO2オフガス速度を測定した時に測定されたバイオリアクターのpH値と同一であるという条件下での、pH-CO2平衡状態にあるバイオリアクター内の前記培地のオフガス速度予測値であり、PACO値が、細胞培養物の培養中にバイオリアクター内の細胞培養物の細胞によって生成されたCO2オフガスの量に依存し、PACO値の算出が、インプットとして、
○受信した現在のCO2オフガス速度、
○受信した現在のpH値、
○現在のCO2オフガス速度を受信した時間でのバイオリアクターの全ガス流入速度、および
○培地固有関係式
を使用する、PACO値と、
■バイオリアクターの培地体積が参照バイオリアクターの培地体積と異なる態様では、バイオリアクター内にある培地または細胞懸濁液の重量または体積が、(正規化PACO(「NPACO」)値を計算するための)正規化係数(normalization factor)としてインプットパラメーターとしてさらに用いられ得、
■算出されたPACO値とPACO参照プロファイル中のそれぞれの参照PACO値との差
を算出するために構成された比較ユニット
を備える。

比較ユニットは、算出された差を出力するために構成されており、算出された差は、参照状態からの、バイオリアクター内にある細胞培養物の状態の逸脱を示す。

前記特徴は多くの理由から有利な場合がある。

PACO値は、前記の特定の培地を含む参照バイオリアクターについて予想(予測)されたCO2オフガス速度からの、特定のpH値で参照バイオリアクターにおいて(同時に、または以前に)測定されたCO2オフガス速度の逸脱についての「知識」を組み込んでおり、この予測は、参照バイオリアクター内にある培地がpH-CO2平衡にあり、細胞培養物も、前記培地のpH-CO2平衡に影響を及ぼす可能性がある他のどんな要因も含まないと仮定する。

従って、PACO値は、前記培地のpH-CO2平衡に及ぼす原因作用がある任意の要因によって引き起こされる、CO2オフガス速度予想値(「予測値」)からCO2オフガス速度測定値へのあらゆるシフトを反映する「統合(integrative)」パラメーター値である。PACO値は、前記の原因作用が、pH-CO2平衡状態に影響を及ぼす細胞代謝、および/または温度もしくは圧力の変更、および/または液体もしくはガスの流入の増加もしくは減少に関連するかどうか区別しない。従って、PACO値は、細胞培養物の培養条件に影響を及ぼし、従って、バイオリアクターのpH-CO2平衡およびガス体積中およびオフガス中のCO2濃度にも影響を及ぼす多くの個々のパラメーターの作用を捨象し得る。所与のpH値では、好気性細胞代謝が増加する場合および/または細胞培養物が好気条件下で増殖する場合には、典型的にPACOは上昇する。培地のpHが大きく下がれば、典型的にPACOは低下する。このような状況は、細胞代謝の結果として、例えば、細胞のCO2発生ならびに乳酸塩のような分泌代謝産物が、アウトガスラインおよびパイプを介したバイオリアクターからのCO2除去を過剰補償(overcompensate)すれば起こり得る。

従って、PACO値は、複数のパラメーター値のセット(個々に測定された温度、圧力、CO2圧力、pH値)よりも正確に、細胞培養物の増殖条件に影響を及ぼすバイオリアクターの「全システム状態」を反映する可能性がある。従って、同時であるが、個々に考慮される複数のバイオリアクターパラメーターのセットよりも正確な、バイオリアクターの状態および/またはバイオリアクター内にある細胞培養物の状態の指標としてPACO値を用いることができると観察された。

PACO値は、バイオリアクターまたは前記バイオリアクター内にある細胞培養物の状態と、参照バイオリアクター内にある参照細胞培養物の(「望ましい」)状態を比較するタスクを容易化および改善する可能性があり、従って、細胞増殖に影響を及ぼすパラメーター、例えば、2種類の比較されるバイオリアクターのサイズ、寸法、および/または撹拌機構の1つまたは複数が大きく異なる場合でも、2種類の細胞培養物の状態を比較することが可能になる可能性がある。従って、PACO参照プロファイルは、特定の目的(ペプチドまたはタンパク質の単離など)のために、特定の細胞培養物を培養するために非常に良いか、または最適な条件を提供することが「知られている」制御パラメーターの下で参照バイオリアクターをモニタリングすることによって得られる場合がある。このプロファイルはPACO参照プロファイルとして用いられ、従って、特定のタイプの細胞培養プロジェクトの一種の基準または「目標」として用いられる場合がある。同じ目的または「プロジェクト」で(例えば、参照バイオリアクター内で得られた多量の同じ物質を得るために)別のバイオリアクター内で細胞培養物を培養しようと試みる時には、前記の他のバイオリアクターの細胞培養物状態と参照バイオリアクターの細胞培養物状態を、対応する時点で(例えば、バイオリアクターに細胞培養物を接種して1時間後、5時間後、10時間後に、またはバイオリアクターおよび参照バイオリアクターが並行して、およびほぼ同時に操作される時には現在の各時点で)正確に比較するために、前記の他のバイオリアクターにおいてPACO値が繰り返し計算される。バイオリアクターおよび参照バイオリアクターをほぼ同時に操作するとは、参照バイオリアクターから、参照PACOプロファイルの参照PACO値が連続して受信され、バイオリアクターの現在決定されたそれぞれのPACO値が最新の参照PACO値と比較されることを意味する場合がある。現在のPACO値および現在の参照PACO値を連続して比較することによって、ならびにPACO差が最小になるようにバイオリアクター値の操作を制御することによって、バイオリアクターおよび参照バイオリアクターをほぼ同時に操作することが可能になる場合がある。

この比較アプローチは、複数パラメーター(温度、pH、培地中の細胞密度、CO2オフガス速度など)を個々に比較するよりもかなり正確である。なぜなら、典型的に、前記パラメーターは完全に同一にならないからである。特に、前記パラメーターの1つまたは複数が、(多くのバイオリアクタータイプにおいてよく用いられる)オフライン測定によって決定される場合、前記測定は、測定誤差、例えば、バイオリアクターの培地の温度と比較される測定が行われた試料の温度の差に起因する測定誤差によって損なわれることが多い。さらに、試料の前記パラメーター値を決定する前のサンプリングプロセスによって引き起こされる遅れは、参照パラメーター値からの、バイオリアクターの状態パラメーターのあらゆる逸脱に対する速やかな措置を妨げる場合がある。

特定の状況に応じて、モニタリングされているバイオリアクターのパラメーターと、参照バイオリアクターのそれぞれのパラメーターとの個々の差が互いを相互に補強し合うか、または互いを均一化(level out)する可能性がある時、今や、前記パラメーターがどのように互いに影響を及ぼし合うかについて洞察が得られているので、モニタリングされているバイオリアクターのパラメーターと参照バイオリアクターのパラメーターを個別に比較するのは精度がかなり低い。例えば、温度が上がると培地へのCO2の溶解度が減少する可能性があり、従って、CO2オフガス速度が上がる可能性があるが、細胞増殖も増加し、従って、細胞によって生成されるCO2の量も増加する可能性がある。また、温度が下がるとpHが上昇し、これもまた、(直接的に、またはpH値の低下を打ち消す制御器の応答を誘発することによって、例えば、CO2流入速度を上げることによって)PACOに影響を及ぼす。細胞の(温度依存的な)代謝もまた、例えば、塩基性物質または酸性物質、例えば、乳酸塩の排出によって培地のpHに影響を及ぼす可能性がある。培地のpH値はまた、培地に溶解しているCO2量にも影響を及ぼす可能性がある。しかしながら、PACO値は、培地のpH-CO2平衡に影響を及ぼすパラメーターの相互依存性を統合しており、前記培地のpH-CO2平衡に及ぼす前記培地のpH値の影響に関する情報を組み込んでいる。

出願人は、驚いたことに、2つのバイオリアクターと、それぞれの細胞培養物の状態を正確に比較するには、現在のCO2オフガス速度、現在のpH値、現在のCO2オフガス速度を受信した時間でのバイオリアクターの全ガス流入速度、および培地固有関係式しか含まない最小インプットデータセットがあれば十分であることを観察した。前記インプットデータ値は全てオンライン測定値の形で入手することができるので、(バイオリアクターを汚染する可能性があるか、または温度低下、環境空気とのガス交換による試料中のpH変化などのようなサンプリング影響が原因で不正確な測定値を生じる可能性がある)状態を比較するための試料の採取はもはや必要ではない。

さらに有益な局面では、本発明の態様は、寸法または形状が異なるバイオリアクター内で培養された細胞培養物の状態を比較することを可能にする。従って、PACO参照プロファイルはまた、参照バイオリアクターにおいて最適化または調査された生化学的プロセスを、サイズおよび寸法が異なるバイオリアクターにスケールアップまたはスケールダウンするのにも用いられる可能性がある。

さらなる局面では、CO2オフガスメーター(「CO2オフガス分析器」)が非侵襲的であり、サンプリングを必要とせず、リアルタイムで容易に入手することができ、値であるCO2オフガス速度(またはCO2オフガス速度を導き出すことができるオフガス中のCO2濃度)を配信することができ、これにより、細胞特異的パラメーター(細胞が発したCO2)と、工学的パラメーター(全ガス流入速度、現在のpH、圧力、温度、撹拌速度、撹拌構成、バブルサイズおよび分布など)が統合され得るので、現在のPACO値を計算するためにインプットとしてCO2オフガス速度を使用することが有益な場合がある。従って、CO2オフガス分析器は、(例えば、細胞密度または細胞数とは対照的に)意図的な、または意図的でないプロセス変化に速やかに応答する可能性がある。

従って、PACO参照プロファイルを作成し、モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクターの動的に得られたPACO値と、それぞれの参照PACO値を比較するために参照リアクターのPACO値を計算すると、モニタリングされているバイオリアクターの中の状態が、参照バイオリアクターによって提供された環境に似た、ほぼ同じか、または同一の細胞培養「環境」を構成するかどうか突き止めることが可能になる。

多くのバイオリアクタータイプでは、流入ガスは、水中にある1つまたは複数のガス取り入れ口を介してバイオリアクターに(ガス混合物として、または別々の開口部を介して)供給される。バイオリアクターが、さらなるヘッドスペースエアレーションを備える場合、ヘッドスペースエアレーションを介してバイオリアクターに供給されたガスが全てバイオリアクターを離れる前にバイオリアクターの培地とpH-CO2平衡に到達するように、前記「ヘッドスペース」流入ガス分率および/または培地上にある気相の空気循環の流入速度は構成されなければならない。ヘッドスペースエアレーションがバイオリアクターの唯一のエアレーション機構である場合でも、バイオリアクターに供給されたガスが全てバイオリアクターを離れる前にバイオリアクターの培地とpH-CO2平衡に到達するように、前記「ヘッドスペース」流入ガス分率の流入速度は構成されなければならない。

または(例えば、遅れずに、ヘッドスペースエアレーションガスが培地とpH-CO2平衡に到達することができない場合)、バイオリアクターのCO2オフガス速度を測定する前に、さらなるヘッドスペースエアレーションはオフにされる。これにより、培地の現在のpH-CO2平衡CO2濃度とは異なるCO2オフガス濃度の原因となり得る、さらなるヘッドスペースエアレーションによって引き起こされる誤ったPACO値の算出を回避することができる可能性がある。

態様によれば、参照バイオリアクターの温度および圧力ならびに前記参照バイオリアクターから得られたPACO参照プロファイルを用いることによってモニタリングおよび/または制御されている各バイオリアクターの温度および圧力は、少なくとも、参照バイオリアクターまたはバイオリアクターに細胞培養物を接種する時間では、培地固有関係式を経験的に求めるのに用いられた培地の圧力および温度と同一である。細胞培養物のもっと後の培養段階では、モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクターの温度および/または圧力は、接種中に用いられる温度および/または圧力と異なってもよく、参照PACOプロファイルの対応する時点での参照バイオリアクターの温度および/または圧力ですら異なってもよい。

態様によれば、受信した現在のCO2オフガス速度、受信した現在のpH値、特定の時間ti(t0、t1、_…、tmax)でのバイオリアクターの全ガス流入速度、および培地固有関係式だけが、モニタリングされているバイオリアクターのPACO値を計算するためのインプットパラメーターである。参照バイオリアクターの培地体積が、モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクターの培地体積と異なる態様では、バイオリアクターのPACO値を計算するためのインプットとして、バイオリアクター内にある培地の体積または質量がさらに用いられる可能性がある。この場合、参照PACOプロファイルの計算は、参照バイオリアクターの参照PACO値を計算するためのインプットとして、参照バイオリアクター内にある培地の体積または質量をさらに使用する工程を含む。パラメーター「i」は、接種から経過したか、または接種前の予め規定された時間間隔から経過した、予め規定された数の分または時間を表すことがある。例えば、バイオリアクター内にある培地が、培地上にあるガス体積とpH-CO2平衡状態にあり、pH-CO2平衡に影響を及ぼす細胞も他の因子も含まないと仮定して、現在のpH値は、前記pH値での、モニタリングされているバイオリアクターのオフガス中のCO2分率予想値を計算するための培地固有関係式のインプットとして用いられる可能性がある。バイオリアクターのCO2オフガスのCO2体積分率計算値は、バイオリアクター内にある培地上にあるガス体積のCO2分圧と相関関係にあり、それによって、CO2分圧は培地のpH値に依存し、ヘンダーソン・ハッセルバルヒ式に従うpH-CO2化学平衡によって特徴付けることができる。バイオリアクターのCO2アウトガス速度予想値を計算するために、CO2体積分率予測値/予想値の計算値および(全アウトガス速度と同一の)全ガス流入速度測定値が用いられる可能性がある。

オフガス中のpH値およびCO2体積分率(「CO2濃度」)は、細胞培養物を含む培地から試料を全く採取することなく、従って、バイオリアクターが望ましくない菌類および細菌に感染する危険を冒すことなく容易に測定することができる。さらに、バイオリアクターの試料中でのオフラインpH測定とは反対に、オフガス中のCO2体積分率の測定はオンライン測定である。従って、測定値を求めることができるまでサンプリングプロセスに必要な時間によって引き起こされる、どんな時間オフセット作用(time offset effect)も回避することができる。オフライン測定におけるオフセット作用は、参照バイオリアクターの状態プロファイルに密接に従うやり方で、制御されているバイオリアクターの状態を制御する精度を下げる可能性がある。全ガス流入速度は、基本的には、バイオリアクターの全オフガス速度と同一であり、予め規定されているか、または容易に求めることができ、オフガス中のCO2体積分率の測定値と組み合わせて用いて、現在測定されたCO2オフガス速度を求めることができる。

さらに有益な局面では、多くの現在のバイオリアクターシステムは、オフガス中のCO2濃度用のセンサー、ならびに/または現在のCO2オフガス速度用のセンサー、全ガス流入速度用のセンサー、および/もしくはバイオリアクターの培地中の現在のpH値用のセンサーを既に備えているか、またはこれらと容易に結合させることができる。従って、このアプローチは、さらなるセンサーまたは他のハードウェアモジュールを取り付ける必要なく、既存の様々なバイオリアクターならびにバイオリアクターモニタリングフレームワークおよび/または制御フレームワークにおいて容易に実行することができる。

さらに有益な局面では、PACO値はバイオリアクターの生化学的環境の変化をすぐに指し示す。これは、細胞数、粒子測定、代謝産物測定、およびあらゆる種類のオフライン測定値(すなわち、生産モードでバイオリアクターから抽出されたバイオリアクターの培地の試料に対して行われる測定値)には当てはまらない。培地固有関係式、現在測定されたCO2オフガス速度、および現在測定されたpH値から導き出されるものであるPACO値を用いることによって、プローブのずれ(probe drift)(培地中にある溶解CO2量の変化、培地のpH値の変化)にもかかわらずバイオリアクターを比較することができる。さらに、優れた、もっともらしさ(plausibility)のチェックを行うことができる。

インプットとしてCO2オフガス速度を使用する、さらに有益な局面は、オフガス分析器をいつでも較正することができ、オートクレーブする必要がないことである。

さらに有益な局面では、PACO値は、特に、バイオリアクターに用いられる培地(および参照バイオリアクターに用いられる培地または参照バイオリアクターに用いられた培地)について計算され、従って、pHとオフガス二酸化炭素との相関関係に関する知識を組み込んでいる。これは、PACOがpH変化の影響を受けるだけでなく、特定のpH値での前記培地の代表的なCO2オフガス速度の影響も受けることを意味する。このために、PACOは、バイオリアクター構成によって引き起こされるCO2アウトガス差を扱うだけでなく、培地のpH値の変化によって引き起こされるCO2アウトガス差を扱うのにも申し分なく適している。

さらに有益な局面では、PACO値は、全てのエアレーションモード(可変および一定の両方)で、ならびに/またはモニタリングされているバイオリアクターの温度もしくは圧力が参照バイオリアクターの温度および/もしくは圧力と異なる状況において異なるバイオリアクターの状態を比較するのに使用することができる。

態様によれば、バイオリアクターの制御モジュールは単にCO2流入速度を変更することによってバイオリアクターのpH値を変更する。これには、培地の組成が、どんなさらなる酸性物質でも塩基性物質でも変わらないという利点がある場合がある(CO2ガス濃度の変化によって、溶解CO2とその解離生成物の濃度しか変わらない)。

態様によれば、前記方法は、pH値が「pHデッドバンド」とも呼ばれる許容pH値の予め規定された範囲内にとどまるようにバイオリアクター内にある培地のpH値を制御する工程を含む。例えば、許容pH値の範囲は一部の態様では[6.8〜7.2]でもよく、他の態様では[6.95〜7.05]でもよい。培地のpH値が最低許容pH値より少ないか、または最高許容pH値より高い場合、バイオリアクターの制御器は、バイオリアクターの現在のPACO値に関係なく、培地のpH値を許容範囲にシフトするために、例えば、CO2流入量を変更することによって適切な措置をとる。バイオリアクターの培地のpH値が許容pH範囲内にある限り、制御器は、対応する参照PACO値からの、現在のPACO値の決定された逸脱のみに依存してpH値を変更する。

これには、バイオリアクターの純粋に「pHデッドバンド」/閾値ベースのpH値制御と比較して、バイオリアクターの培地のpH値がスムーズに、かつきめ細やかに制御され、培地のpH値の増減が抑えられ得るという利点がある場合がある。

態様によれば、培地固有関係式は、バイオリアクターおよび参照バイオリアクターに使用した培地の試料のpH値と、前記試料上にあるガス体積中のそれぞれ測定されたCO2ガス分率との経験的に求められた複数のペアを数学的にフィットさせることによって得られた式FCO2_M1(pH)=REL-M1(pH)である。試料は、例えば、バイオリアクター内にある無細胞培地の全てでもよく、前記培地の無細胞アリコートでもよい。

FCO2_M1-EXP(pH)は、前記培地が所与のpH値を有しかつ前記ガス体積とpH-CO2平衡状態にありかつ細胞培養物を欠く時の、培地試料のガス体積中のCO2ガス分率予測値(「CO2濃度予測値」)である。FCO2_M1-Mは、培地M1とCO2-pH平衡状態にあるガス体積中の、例えば、培地M1を含むバイオリアクターのオフガス中のCO2ガス分率測定値(「CO2濃度測定値」)である。

「PACO値」値はデータ値である。上記で明記したように、PACO値は、バイオリアクターのCO2オフガス速度予測値からの、バイオリアクターにおいて測定されたCO2オフガス速度の逸脱を示すデータ値である。CO2オフガス速度予測値は、細胞培養物の非存在下での、かつ、平衡状態にある培地のpH値が、バイオリアクターにおいてCO2オフガス速度を測定した時に測定されたバイオリアクターのpH値と同一であるという条件下での、pH-CO2平衡状態にあるバイオリアクター内の前記培地のオフガス速度予測値である。PACO値は、細胞培養物の培養中にバイオリアクター内の細胞培養物の細胞によって生成されたCO2オフガスの量に依存する。PACO値の算出は、インプットとして、優先的に、以下のデータ:現在のCO2オフガス速度、および現在のpH値、および現在のCO2オフガス速度を受信した(測定した)時間でのバイオリアクターの全ガス流入速度しか使用しない。さらに、インプットとして培地固有関係式が用いられる。

態様によれば、バイオリアクター状態をモニタリングおよび/または比較するのに用いられるシステムはPACO値(「PACO_B1-ti」、「PACO_B2-ti」)を算出するために構成されている。PACO値の算出は、
- 現在のCO2オフガス速度および現在のpH値を測定した時間における、培地と平衡状態にあるバイオリアクターのガス体積中のCO2濃度予測値(「FCO2_EXP」、例えば、バイオリアクターB1の場合、FCO2_M1-MまたはバイオリアクターB2の場合、FCO2_M2-M)を得るために、受信した現在のpH値を培地固有関係式に入力する工程;
- バイオリアクターのCO2オフガス速度予測値(「ACO_EXP」)を得るためにCO2濃度予測値(「FCO2_EXP」)にバイオリアクターの全ガス流入速度を掛ける工程であって、CO2オフガス速度予測値は、細胞培養物の非存在下での、かつ、平衡状態にある培地のpH値が培地固有関係式に入力されたバイオリアクターの受信した現在のpH値測定値と同一であるという条件下での、pH-CO2平衡状態にある前記培地のオフガス速度予測値である、工程;
- CO2オフガス速度測定値とCO2オフガス速度予想値との差としてPACO値を得るために、バイオリアクターのCO2オフガス速度予測値(「ACO_MEASURED」、例えば、ACO_B1-EXP-ti、ACO_B2-EXP-ti)からバイオリアクターのCO2オフガス速度測定値(ACO_B1-M-ti、ACO_B2-M-ti)を差し引く工程
を含む。

PACO値は、細胞培養物の培養中にバイオリアクター内の細胞培養物の細胞によって生成されたCO2オフガスの量に依存し、現在のpH値、および使用した特定の培地のpHと平衡CO2濃度との間の相互依存に関する経験的に導き出された「知識」に同じく依存する統合パラメーターを表す。

態様によれば、現在の時間(ti)でのバイオリアクターB1のCO2オフガス速度予測値ACO_B1-EXP-tiの算出は、

に従って行われ、式中、TGI_B1は、現在の時間(ti)でのバイオリアクターB1のガス流入の総量であり、FCO2_B1-EXP-tiは、現在のCO2オフガス速度および現在のpH値を測定した時間における、培地と平衡状態にある、％の単位のバイオリアクターのガス体積中のCO2濃度予測値である。

上記で述べたPACO値の算出は、一部の態様では、CO2のmolとその体積の関係が理想気体の関係であると仮定する場合がある。他の態様は、CO2のmol体積に及ぼす、現在モニタリングされているバイオリアクターの温度および/または圧力の影響を補償するための、測定誤差、湿度、および/または可能性のある他の誤差の源を補償するための、さらなる算出工程をさらに含む場合がある。

態様によれば、上記で述べた算出工程は、参照バイオリアクターについても同様に、参照PACO値を算出し、参照PACOプロファイルを作成するために行われる。

本明細書で使用する「培地固有関係式」は、所与のpH値を有する特定の(無細胞)培地とpH-CO2平衡状態にあるガス体積中のCO2濃度を予測する関数、例えば、式である。この関数は前記特定の培地について経験的に得られ、インプットとして提供された多くの異なるpH値についてCO2オフガス速度を予測するように合わせられる。

「培地」は「増殖培地」または「培養培地」とも呼ばれ、微生物または細胞の増殖を支持するように設計された液体である。異なるタイプの細胞を増殖させるための異なるタイプの培地がある。植物または動物に由来する特定の細胞タイプを使用する細胞培養に用いられる培地、および細菌または菌類などの微生物を増殖させるのに用いられる微生物学的培養用の培地がある。生物の中には、複雑な栄養素要求性のために特殊な環境を必要とするものもある。例えば、培地は、基本的にさらなる成分を全く含まない、炭酸水素ナトリウムまたは炭酸カルシウムを含む水からなってもよい。同様に、培地は、栄養分、増殖因子、ホルモン、または他のタンパク質などのような追加成分を含む「富栄養培地(rich medium)」でもよい。例えば、培地は、栄養培地、最小培地、鑑別培地(differential medium)、または強化倍地(enriched medium)でもよい。

「FCO2値」はデータ値である。「ACO値」はデータ値である。それぞれのデータ値の意味および計算は本発明の様々な態様について本明細書中に説明されている。「FCO2」または「CO2[％]」は「CO2濃度」とも呼ばれ、ガス体積中の、例えば、バイオリアクターのオフガス中の「分率CO2ガス」である。

「プロファイル」は、ある期間にわたるパラメーター値の変動を示す一組のデータ値または数学的関係である。このパラメーター値は、例えば、バイオリアクターから得られた、PACO値、オフガス中のCO2濃度(「分率CO2」もしくは「FCO2」)、CO2オフガス速度(「ACO値」)、またはpH値でもよい。

ACO値の予測は、参照バイオリアクターに用いられた培地、および参照バイオリアクターと比較されるバイオリアクターに用いられた培地に特有のものである。

「pH」値は、細胞培養物の非存在下でph-CO2平衡状態にある培地M1のpH値を指定するのに用いられるインプットパラメーター値である。

「REL-M1」は、演算子によって結び付けられた1つまたは複数のパラメーターのセットである。パラメーターは、
- 細胞培養物を欠く培地の試料を複数の異なるpH値に調整し、それによって、試料をガス体積とのpH-CO2平衡に到達させること、
- 試料中の培地とph-CO2平衡にあるそれぞれのガス体積中のCO2ガス分率を求めること、
- 求められたCO2ガス分率を試料のそれぞれの平衡pH値に対してプロットすること、
- プロットされた値に曲線をフィットさせること、および
- フィットされた曲線から培地固有関係式のパラメーターを導き出すこと
によって得られる。

従って、培地固有関係式は、経験的に、例えば、参照バイオリアクターに参照細胞培養物が接種される前に突き止められる可能性がある。態様によれば、参照バイオリアクターにおいて細胞培養物が培養および増殖された後に培地固有関係式を経験的に求めることも可能である。しかしながら、この場合、培地固有関係式が経験的に求められたらすぐに前記参照バイオリアクターのPACO参照プロファイルを計算できるようにするには、参照バイオリアクターのpH値、全ガス流入速度、およびオフガス中のCO2分率がモニタリングおよび保存されていることが必要である。

一部の態様によれば、培地固有関係式は、バイオリアクター、例えば、参照バイオリアクターに、細胞培養細胞を含まない培地を充填し、参照バイオリアクターの温度および圧力を、予め規定された値、例えば、20℃および標準大気圧に設定することによって得られる。次いで、培地は、例えば、CO2ガス流入速度を変更することで、培地上にあるガス体積中のCO2濃度を増加または減少させることによって異なるpH値に設定されてもよく、培地が平衡化して(所与のpHで、予め規定された温度および圧力でpH-CO2平衡状態に到達して)しばらくして(典型的には数分後または数時間に)、(前記平衡状態にあるCO2分圧と相関関係にある)培地上にあるガス体積中のCO2濃度が測定される。前記測定は、例えば、培地上にあるガス体積中のCO2濃度を分析することによって、またはオフガス中のCO2体積分率を介して行われる。試料(バイオリアクターまたはアリコート)において測定された平衡pH値とCO2濃度(またはCO2オフガス値)との取得されたペアはプロットされる、すなわち、座標系に表される。プロッティングは、紙ベースの印字出力の形をとるプロットおよび/またはコンピュータスクリーン上に表示されたプロットをさらに出力し得るコンピュータシステムによって自動的に行われてもよい。プロッティングはまた手作業で行われてもよい。曲線は、自動的に、または手作業で前記プロットにフィットされ、前記フィットされた曲線を記述するパラメーターが算出される。パラメーターは、前記培地が特定のpH値でpH-CO2平衡にある時に、pH値および前記培地上にあるガス体積中のCO2濃度の培地固有関係式を規定する。パラメーターが算出された後に、参照バイオリアクター内にある培地を望ましいpH値に設定することができ、参照バイオリアクター内にある培地に細胞培養物を接種することができ、PACO参照プロファイルを得るために、参照バイオリアクター内にある培地を(現在の培地のpH値、現在のCO2オフガス速度、および現在の全ガス流入速度について)モニタリングすることができる。このアプローチには、培地固有関係式を経験的に求めるために余分な機器が必要とされる可能性はなく、前記関係式を得るために、および細胞を増殖させるために前記培地を使用できるという利点がある。

他の態様によれば、培地固有関係式は、前記培地のアリコートの形で複数の試料を作り出すことによって得られ、それぞれの試料は異なるpH値を有する。試料は、それぞれの試料においてガスと液体培地との間でpH-CO2が平衡になるように、ある時間(例えば、数分または数時間)にわたって、予め規定された温度および圧力で放置される。

試料は、例えば、1種類の試料のpH値を変え、連続して測定することによって連続して得られてもよく、前記培地の複数の試料を並行して作製することによって得られてもよく、それぞれのアリコートは、培地上にあるガス体積のCO2濃度を変更することによって異なるpH値に設定される。試料は、現在のpH値の設定および測定を可能にし、CO2濃度の変更と、平衡状態でのCO2濃度またはCO2オフガス速度の測定を可能にする任意の容器に充填することができる。

一部の態様によれば、式FCO2_M1(pH)=REL-M1(pH)は、FCO2_M1(pH)[％]=a1xpH+a2に従う1次方程式である。この場合、パラメーターa1およびa2は、フィットされた曲線から導き出されたパラメーターである。単位[％]は、pH-CO2平衡状態にある試料中の培地上にあるガス体積に対するCO2ガス分率に関連する。

他の態様によれば、式FCO2_M1(pH)=REL-M1(pH)は、FCO2_M1(pH)[％]=b1xpH²+b2xpH+b3に従う多項式である。この場合、パラメーターb1、b2、およびb3は、フィットされた曲線から導き出されたパラメーターである。

培地固有関係式および対応する培地に固有のパラメーターを経験的に求めることには、培地の正確な組成が分かっていない場合でも(一般的に、販売されている多くの培地に当てはまる)、前記培地とpH-CO2平衡にある空気体積中の平衡CO2濃度に及ぼす特定のpH値の影響を実験によって決定することができるという有益な効果がある場合がある。従って、PACO値は、組成が分かっていない培地を用いた時も計算することができる。

好ましい態様によれば、バイオリアクターの細胞培養物は、参照バイオリアクター内で培養された細胞培養物のような同じタイプまたは非常に似たタイプの細胞を含む。異なる細胞タイプ、例えば、細菌および酵母の代謝および増殖プロファイルは通常、比較することができない。例えば、細胞は、真核細胞、例えば、酵母細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞、特にヒト細胞でもよい。他の態様によれば、細胞は細菌または古細菌細胞でもよい。

態様によれば、算出されたPACO値とPACO参照プロファイル中のそれぞれの参照PACO値との算出された差が閾値を上回った場合、算出された差の出力は、アラームシグナルを自動的に出力する工程を含む。アラームシグナルは、例えば、音響信号および/または光信号、ユーザー装置(例えば、コンピュータもしくは携帯電話)または自動バイオリアクター制御ユニットに伝達されたメッセージでもよい。メッセージは、ネットワーク、例えば、インターネットまたはイントラネットを介して伝達されてもよい。

前記特徴を用いると、ユーザーは、参照PACO値との差が最小になるようにバイオリアクターもしくはバイオリアクターの中に含まれる培地のパラメーターを変更するために手作業で措置をとることが可能になる可能性がある、および/または自動制御ユニットは、比較されたPACO値の差を小さくすることが予想される措置を自動的に行うことが可能になる可能性がある。

態様によれば、参照バイオリアクターならびにモニタリングおよび/または制御されているバイオリアクターに用いられる培地は、炭酸塩で緩衝化された培地である。

最も広い意味では、以下のpH-CO2平衡方程式:CO₂+H₂O→HCO₃ ^-+H⁺に従って、溶解したCO2が解離してHCO₃ ^-イオンとH⁺イオンになるので、少なくとも少量のCO2を溶解することができる溶液はどれも、炭酸塩で緩衝化された培地である。

態様によれば、「炭酸塩で緩衝化された培地」とは、1リットルの培地あたり少なくとも10mMolの炭酸塩を含む培地である。この培地は無細胞培地である(細胞代謝によってpH値が変わり、従って、培地中の炭酸塩の量が変わることがある)。炭酸塩は、例えば、炭酸水素ナトリウムまたは炭酸カルシウムでもよい。

緩衝化された培地の使用には、特に、6〜8の生物学的pH範囲内にpH増減を抑えるという利点がある。

炭酸緩衝液には、pH-CO2平衡でのpH値が空気中の二酸化炭素分圧と、後になって細胞によって培地中に生成されたCO量に依存し、CO2の溶解度には限界があるという欠点がある。従って、最先端のアプローチに従ってバイオリアクターに炭酸緩衝液を使用しても、異なる温度条件および/または圧力条件で、炭酸塩で緩衝化された培地を含むバイオリアクターの中で培養された細胞培養物の状態を正確に比較できないことが多かった。炭酸塩で緩衝化された培地を、PACOに基づいたバイオリアクターの状態比較と併用することには、緩衝液が、例えば、リン酸緩衝液と同じくらい強力に細胞代謝を妨げないが、異なる温度および/または圧力で動いているバイオリアクターを比較することができる培地を用いることが可能だという有益な効果がある。緩衝液の炭酸塩が細胞代謝を妨げる場合でも、PACO値は前記の効果を統合し、それでもなお、バイオリアクター状態の正確な比較および/または同期化を可能にする。

態様によれば、参照バイオリアクターは、以下の特徴:
(a)バイオリアクター内のガス体積、
(b)バイオリアクター内の培地体積、
(c)バイオリアクターのレイノルズ数、
(d)バイオリアクターのニュートン数、
(e)バイオリアクターの寸法(例えば、高さ対直径の比)、
(f)バイオリアクターおよび/またはバイオリアクターバッフルの幾何学的特徴(例えば、バイオリアクターの円筒形または多角形の形状、バッフルおよびバイオリアクター内の他の部品、例えば、センサー、ポンプ、スターラーなどのサイズ、形状、方向、および位置)、
(g)スターラー構成(例えば、バイオリアクター内にあるスターラーのサイズ、方向、および形状、撹拌間隔、撹拌間隔の期間、撹拌ユニットの数および相対的な方向)、
(h)撹拌速度、
(i)バイオリアクターの酸素の物質移動容量係数(kLa)、
(j)全ガス流入速度および/またはO2流入速度および/またはN2流入速度および/またはCO2流入速度、
(k)動力投入量、
(l)バイオリアクター内の圧力、
(m)培地中でのガスバブル保持時間、
(n)培地中でのガスバブルサイズおよび分布、
(o)表面速度(メートル/秒[m/s]で表されることがあり、バイオリアクター内にある培地の軸と軸受けとの間の相対速度を表すことがある)、
(p)パラメーター(a)〜(o)のうちの1つまたは複数から導き出されるものとして計算されたパラメーター
のうちの1つまたは複数の点でバイオリアクターと異なる。

本明細書で使用する「動力投入量」パラメーターは、バイオリアクターのスターラーの動力投入の量を指定する。スターラー構成が異なると、同一の撹拌速度または同一の先端速度でも動力投入量が異なることがある。同一のスターラー速度で、動力投入量は培地の粘性に依存することがある。

従って、2つの比較されたバイオリアクターが多くの異なる工学的パラメーターの点で異なる場合でも、本発明の態様を用いると、バイオリアクターの状態と別の(「参照」)バイオリアクターの状態を比較することが可能になる可能性がある。バイオリアクター状態の比較および/または制御を可能にするために前記のパラメーターを全て同一にしておくことが実際には実現不可能なことが多いことが観察されているので、このことは極めて有利な場合がある。PACO値を使用することによって、2つのバイオリアクターのレイノルズ数および/またはニュートン数が異なり、スターラーなどの速度または構成が異なる場合でも、2つのバイオリアクターの状態を容易に比較することができる(同一のPACO値とは、関連パラメーターに関する同一の状態を意味する)。

態様によれば、モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクターは、参照PACO値からの、バイオリアクターの現在のPACO値の逸脱を防止するための制御パラメーターとしてエアレーション速度を使用することによって操作される。

驚いたことに、望ましい参照PACO値からのPACO値の逸脱を防止するための制御パラメーターとしてエアレーション速度が用いられる場合、2つのバイオリアクター間で圧力差(典型的には、バイオリアクターを操作する時に遭遇する範囲内での圧力差、例えば、天気によって引き起こされる大気圧変化に起因する圧力変動)が存在する場合でも、PACO値を用いるとバイオリアクターの状態の比較が可能になることが観察された。一般的に、圧力は培地のpH-CO2平衡に影響を及ぼす。圧力が上昇すると、pH値が一定のままでCO2オフガス速度が落ちる。要するに、圧力が上昇したらPACO値は減少する。圧力上昇の影響を補償するために、態様に応じて、PACO差が望ましい参照PACO値と同一になるまで、またはゼロになるまで、または(細胞に十分な量の酸素が加えられることを確かなものにするために)予め規定された最小エアレーション速度になるまで、エアレーション速度(例えば、vvm=ガス流入量/液体培地の単位体積/分の単位で測定される)を自動的に落とす制御器ユニットが用いられる。エアレーション速度を落とすことによって、CO2オフガス速度も低下し、PACOも増加する。従って、制御パラメーターとしてエアレーション速度を用いることによって、圧力の逸脱を容易に補償することができ、PACOを、バイオリアクターおよびその細胞培養物の信頼性の高い状態指標として使用することができる。

一部の態様によれば、参照バイオリアクターおよびバイオリアクターは異なる地理区域、例えば、異なる建物、都市、または国に配置される。有益な局面では、PACO値を比較することによって、上記で述べたパラメーターの1つまたは複数の点で互いに異なるバイオリアクターの中で(連続してまたは並行して)培養された細胞培養物の状態を正確に比較することが可能になる。従って、本発明の態様を用いると、参照バイオリアクターと全く異なる寸法を有し、多くの局面において参照バイオリアクターから逸脱し得るバイオリアクター内の細胞培養物を型にはめ込む(groove)ことが可能になる可能性がある。優先的に、モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクターと参照バイオリアクターの両方において、比較可能な動的pH-CO2平衡を確立するために、プロファイルにおける、それぞれの時間tiでの両バイオリアクターのCO2ガス流入速度は同一である。

さらに有益な局面では、コストが低下し、柔軟性が高まる。以前は、参照リアクターにおいて観察されていたものと同様の条件または同一の条件で特定のバイオリアクターの中で細胞を培養するためには、特定のバイオリアクターのそれぞれの個々のパラメーターが可能な限り参照バイオリアクターと似ていることを確実にするために、バイオリアクターのサイズ、形状、撹拌機構、および複数のさらなる特徴が参照バイオリアクターと同一であること確実にすることが必要なことが多かった。このためにコストは上昇した。なぜなら、前記バイオリアクターのサイズ、バイオリアクタータイプ、および/もしくはバージョン、またはその部品の一部が参照パラメーターのそれぞれの特徴と同一でなければ、利用可能なバイオリアクターを用いることができなかったからである。多くの場合、弁および他のバイオリアクター要素について異なる規格および規準が異なる国に存在する。従って、いくつかの場合では、実際には、参照バイオリアクターと寸法および/または部品が同一のバイオリアクターを動かすことは不可能であり、そのために、異なる国のバイオリアクターを比較することは難しいか、または不可能である。前記のようにPACO参照値を用いることによって、サイズもしくは形状、または培地のpH-CO2平衡に影響を及ぼし、従って、前記培地中にある細胞の増殖に影響を及ぼす他の任意の特徴についての差は均一化され、2つの比較されたバイオリアクターまたはこれらの部品が大きく異なる場合でも、細胞培養物状態の正確な比較が可能になることが観察された。

態様によれば、現在の時間での、モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクターのPACO値の算出は、モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクターの受信した現在のCO2オフガス速度およびpH値のそれぞれについて、
- FCO2_B1-EXP-ti=REL-M1(pH_B1-ti)に従ってバイオリアクター(104)の現在のアウトガス体積のCO2オフガス分率予想値FCO2_B1-EXP-tiを算出することであって、式中、FCO2_B1-EXP-tiは、現在の時間(ti)での、％の単位のバイオリアクター(104)の総オフガス体積(TGO_B1)に対するCO2オフガス分率予測値であり、予測が、受信した現在のpH値(pH_B1-ti)をREL-M1(pH_B1-ti)のインプットとして用いることによって計算され、REL-M1は培地(M1)の培地固有関係式(136)であり、pH_B1-tiは、時間tiでのバイオリアクター(104、106)の培地における受信した現在のpH値であり、従って、バイオリアクターの培地が細胞培養物を欠き、かつ培地固有関係式のインプットとして用いられたpH値を有し、かつ前記培地上にあるバイオリアクター中の気相とpH-CO2平衡状態にあり、従って、前記バイオリアクターの総オフガス体積とも平衡にあると仮定して、バイオリアクターにおけるCO2オフガス分率予想値が算出される、こと、
-

に従ってCO2オフガス速度予想値ACO_B1-EXP-ti[mol/min]を算出することであって、式中、ACO_B1-EXP-ti値は、バイオリアクターの培地が現在測定されたpH値を有しかつ前記培地上の気相とpH-CO2平衡にある時の、バイオリアクター(104)のCO2オフガス速度予想値であり、TGI_B1は、現在の時間(ti)でのバイオリアクター(104)のガス流入の総量であり、バイオリアクターのガス流入の総量がガス流出の総量とほぼ同一である、こと、
- PACO_B1-ti=ACO_B1-EXP-ti-ACO_B1-M-tiに従ってPACO_B1-ti値を算出することであって、式中、ACO_B1-M-tiは、バイオリアクターにおいて時間tiで測定されたCO2オフガス速度である、こと
を含む。

態様によれば、参照バイオリアクター内にある培地は第1の体積および第1の総質量を有する。モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクター内にある培地は第2の体積および第2の総質量を有する。第1の体積および第2の体積は互いに異なる。従って、第1の質量および第2の質量は互いに異なる。算出されたPACO値の1つ1つとPACO参照プロファイル中のそのそれぞれの参照PACO値との差の算出は、
- プロセッサによって、算出されたPACO値を第2の体積で割り、プロセッサによって、PACO参照プロファイル中のそれぞれの参照PACO値を第1の体積で割る工程、または
- プロセッサによって、算出されたPACO値を第2の質量で割り、プロセッサによって、PACO参照プロファイル中のそれぞれの参照PACO値を第1の質量で割る工程
を含む。

前記特徴は、それぞれ異なる体積の培地を含むバイオリアクターの中で培養された細胞培養物の状態の比較を可能にするので有利な場合がある。例えば、参照バイオリアクターは、100リットルの培地を含む試験バイオリアクターでもよい。参照バイオリアクターは、細胞培養物を効率的に培養するのに、例えば、特定のペプチドを精製するのに適したパラメーター(温度、圧力、供給速度、O2流入速度、pH、撹拌速度など)を特定するのに用いられる場合がある。従って、参照リアクターは、参照バイオリアクター内で細胞を培養するための最適なパラメーターを見つけ出すために異なる条件下で何回も用いられている場合がある。参照バイオリアクターに「最適な」または「適切な」パラメーターセットが特定された後、前記の「最適な」パラメーターセットの下で参照リアクター内で少なくとも1つの細胞培養物が培養される。参照PACOプロファイルは、前記の「最適な」または「適切な」条件下での細胞培養物の培養中に参照リアクターから得られる。

(典型的には試験モードに続く)「生産モード」では、もっと大きなバイオリアクターの中で、さらには、並行して操作される複数のもっと大きなバイオリアクターの中で細胞培養物が大規模に培養される(「生産モード」)。バイオリアクターの寸法が参照バイオリアクターと異なる場合があり、任意で、もっと大きなバイオリアクターのステアリング構成、O2流入速度、および/または他のパラメーターのようなバイオリアクターのさらなるパラメーターも参照バイオリアクターと異なる場合があるので、上記で説明された体積依存的なやり方で計算されたPACO参照プロファイルを用いると、細胞培養物が、大きく異なるサイズのバイオリアクターの中で培養された場合でも、細胞培養物の状態を正確に比較することが可能になる。例えば、撹拌速度、撹拌構成などのような一部のパラメーターは参照バイオリアクターに固有のものである場合があり、細胞培養物をもっと大きな規模で増殖することになっている別のバイオリアクターでは再現性がない場合がある。さらなる例によれば、生産目的で用いられるバイオリアクター内にある培地の体積は、参照バイオリアクター内にある培地の体積の10倍、100倍、さらには1000倍超になる場合がある。従って、本発明の態様を用いると、大きな規模の差で細胞培養物の培養を正確にスケールアップすることが可能になる。同様に、本発明の態様を用いると、PACO値および参照PACO値を異なる培地体積または培地質量で正規化することによって、大きな規模の差で細胞培養物の培養をスケールダウンすることが可能になる。

態様によれば、PACO参照プロファイルは、参照バイオリアクターを操作する複数の段階をカバーする。これらの段階は、
- 供給なしで細胞培養物が参照バイオリアクター内で培養される、無供給段階、
- 細胞培養物が、所与の供給速度の存在下で参照バイオリアクター内で培養され、培地のpH値に影響を及ぼす代謝産物を排出しない、供給段階であって、pH値に影響を及ぼす代謝産物が、例えば、乳酸塩および/またはH+イオンであり得る、供給段階、
- 細胞培養物が、所与の供給速度の存在下で参照バイオリアクター内で培養され、培地のpH値に影響を及ぼす代謝産物を排出する、供給段階
を含む。

態様によれば、システムは、算出されたPACO値とPACO参照プロファイル中のそれぞれの参照PACO値との差が最小になるようにバイオリアクターの1つまたは複数の制御パラメーターを自動的に変更するために構成された制御ユニットを備える。

従って、本発明の態様は、特性およびパラメーターが大きく異なるバイオリアクター内で培養されている細胞培養物の状態をモニタリングおよび比較する可能性があるだけでなく、細胞増殖に関連するバイオリアクター内の状態が、参照PACOプロファイルを入手している間の参照バイオリアクター内の状態と極めて類似するように、この情報を用いてバイオリアクターを制御することもできる。

制御ユニットは、例えば、制御されているバイオリアクターに動作可能に結合された制御コンピュータでもよい。または、制御ユニットは、バイオリアクターのユーザー、例えば、オペレーターのデータ処理装置でもよく、データ処理装置には、バイオリアクターの動的に得られたPACO値と参照PACOプロファイル中の参照PACO値との差が最小になるようにバイオリアクターを自動的または半自動的にモニタリングおよび/または制御するバイオリアクター管理ソフトウェアアプリケーションがインストールされていてもよい。例えば、データ処理システムは、デスクトップコンピュータ、スマートフォン、タブロイド(tabloid)コンピュータなどでもよい。比較ユニットは、例えば、ハードウェア、ソフトウェア、および/またはファームウェアロジックの形をとる、一点の自動的に実行可能なプログラムロジックでもよい。比較ユニットは制御ユニットに動作可能に結合されてもよく、例えば、制御ユニットに一体化している部分でもよく、制御ユニットと相互運用するように構成されたアプリケーションプログラムでもよい。

態様によれば、制御ユニットは以下の通りにバイオリアクターを制御してもよい。

モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクターにおいて得られたPACO値が、PACO参照プロファイル中のそれぞれの参照PACO値より大きい場合、制御ユニットは、以下の操作:
- バイオリアクターへの全空気流入速度を落とすこと、および/もしくはO2ガス流入速度を落とすこと、および/もしくはCO2ガス流入速度を落とすこと、および/もしくはベース流入速度(base influx rate)を落とすこと、ならびに/またはバイオリアクターの圧力もしくは温度を変更すること
のうちの1つまたは複数を行うことによってバイオリアクターの1つまたは複数の制御パラメーターを自動的に変更する。

PACO値が、PACO参照プロファイル中のそれぞれの参照PACO値より小さい場合、制御ユニットは、以下の操作:
- 全空気流入速度を上げること、および/もしくはO2ガス流入速度を上げること、ならびに/または
- バイオリアクターへのCO2ガス流入速度を上げること、および/もしくはベース流入速度を上げること、ならびに/またはバイオリアクターの圧力もしくは温度を変更すること
のうちの1つまたは複数を行うことによってバイオリアクターの1つまたは複数の制御パラメーターを自動的に変更する。

例えば、(例えば、参照バイオリアクター内の参照pHとのpH差を最小にすることによって)パラメーター差を個々に最小にするのではなく、培地のpH値を変更するために酸性物質または塩基性物質を添加する目的で、PACO逸脱を制御パラメーターとして使用することには制御の質が改善されるという利点がある場合がある。PACO値はpH値に依存するが、pH値と同一ではない。従って、pH値は、態様によれば、PACO差の制御パラメーターを介して間接的に制御される。これにより、制御器の待ち時間による、設定値を超えた周知の制御パラメーター変動問題を防止するか、または少なくとも小さくする一種のロバストネスが制御ループに導入される。

態様によれば、システムは、制御および/またはモニタリングされているバイオリアクターをさらに備える。任意で、システムは、さらなるバイオリアクターおよび参照バイオリアクター、ならびに/またはPACOプロファイルの差をスクリーンに表示するためのディスプレイ装置をさらに備えてもよい。

さらなる局面において、本発明は、参照バイオリアクター内にある細胞培養物の参照状態からの、本明細書では「モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクター」とも呼ばれるバイオリアクター内にある細胞培養物の状態の逸脱をモニタリングするための方法に関する。バイオリアクターは参照バイオリアクターと同じ培地を含む。前記方法は、
- バイオリアクター状態モニタリングシステムの比較ユニットによってPACO参照プロファイルを受信する工程であって、PACO参照プロファイルが、時間に対する参照PACO値の変動の表現であり、PACO参照プロファイルが、参照バイオリアクターのCO2オフガス速度予測値からの、参照バイオリアクターにおいて測定されたCO2オフガス速度の逸脱を示し、CO2オフガス速度予測値は、細胞培養物の非存在下での、かつ、平衡状態にある培地のpH値が、参照バイオリアクターのCO2オフガス速度を測定した時に測定された参照バイオリアクターのpH値と同一であるという条件下での、pH-CO2平衡状態にある参照バイオリアクター内の前記培地のオフガス速度予測値であり、PACO参照プロファイルが、細胞培養物の培養中に参照バイオリアクター内の細胞培養物の細胞によって生成されたCO2オフガスの量に依存する、工程;
- 比較ユニットによって、培地固有関係式を含むデータオブジェクトを受信する工程であって、培地固有関係式が、培地に固有であり、前記培地がガス体積とpH-CO2平衡状態にありかつ細胞培養物を欠く時の、培地のpH値とガス体積中のそれぞれのCO2ガス分率との関係を示す、工程;
- 現在の時間において、バイオリアクター内での細胞培養物の培養中に測定された、バイオリアクターの現在のCO2オフガス速度とバイオリアクターの培地の現在のpH値とを繰り返し受信する工程;
- 受信した現在のCO2オフガス速度のそれぞれについて、比較ユニットによって、
■CO2オフガス速度予測値からの、バイオリアクターにおいて測定されたCO2オフガス速度の逸脱を示すPACO値であって、CO2オフガス速度予測値は、細胞培養物の非存在下での、かつ、平衡状態にある培地のpH値が、バイオリアクターのCO2オフガス速度を測定した時に測定されたバイオリアクター(104、106)のpH値と同一であるという条件下での、pH-CO2平衡状態にあるバイオリアクター内の前記培地のオフガス速度予測値であり、PACO値が、細胞培養物の培養中にバイオリアクター内の細胞培養物の細胞によって生成されたCO2オフガスの量に依存し、PACO値の算出が、インプットとして、
○受信した現在のCO2オフガス速度、
○受信した現在のpH値、
○現在のCO2オフガス速度を受信した時間でのバイオリアクターの全ガス流入速度、および
○培地固有関係式
を使用する、PACO値と、
■算出されたPACO値とPACO参照プロファイル中のそれぞれの参照PACO値との差
を算出する工程;
- 比較ユニットによって、算出された差を出力する工程であって、算出された差が、参照状態からの、バイオリアクター内にある細胞培養物の状態の逸脱を示す、工程
を含む。

態様によれば、PACO参照プロファイルは複数の参照PACO値を含む。前記方法は、
- 培地固有関係式を含むデータオブジェクトを受信すること;
- 現在の時間において、参照バイオリアクター内での細胞培養物の培養中に前記現在の時間で測定された、

の単位の参照バイオリアクターの現在のCO2オフガス速度と、参照バイオリアクターの培地の現在のpH値とを繰り返し受信すること;
- 受信した現在のCO2オフガス速度と現在のpH値のペアのそれぞれについて参照PACO値の1つを算出することであって、参照PACO値の算出が、インプットとして、
○参照バイオリアクターの受信した現在のCO2オフガス速度、
○参照バイオリアクターの受信した現在のpH値、
○現在のCO2オフガス速度を受信した時間での参照バイオリアクターの全ガス流入速度、および
○培地固有関係式
を使用する、こと
によって、参照PACO値を計算する工程をさらに含む。

例えば、参照PACO値は、参照PACOプロファイルを、モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクターの現在計算されたPACO値と比較する比較ユニットによって計算することができる。または、参照PACOプロファイルの参照PACO値は、異なるデータ処理ユニット、例えば、参照バイオリアクターの制御コンピュータによって計算することができる。

態様によれば、前記方法は、
- CO2オフガス速度対時間のプロットで参照PACO値をプロットすること;
- プロットされた参照PACO値に曲線をフィットさせることであって、前記曲線は参照PACOプロファイルを構成する、こと
によって、参照バイオリアクターのPACO参照プロファイルを作成する工程をさらに含む。

態様によれば、プロッティングおよびフィッティングは、コンピュータまたは他のデータ処理装置によって完全に自動で行われてもよく、半自動的に行われてもよく、手作業で行われてもよい。得られた参照PACOプロファイルは、非一時的記憶媒体に、例えば、電子データ構造の形で保存されてもよい。モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクターのモニタリングユニットは、ネットワークを介して、または記憶装置から前記データ構造を読み取ることによって前記データ構造を自動的に受信してもよい。

態様によれば、それぞれの現在の時間tiでの、それぞれの参照PACO値PACO_R-tiの算出は、参照バイオリアクターの受信した現在のCO2オフガス速度ACO_R-M-tiおよびpH値のそれぞれについて、
- FCO2_R-EXP-ti[％]=REL-M1に従って参照バイオリアクターの現在のアウトガス体積のCO2オフガス分率予想値FCO2_R-EXP-ti[％]を算出することであって、式中、FCO2_R-EXP-ti[％]は、現在の時間での、％の単位の参照バイオリアクターの総オフガス体積に対するCO2オフガス分率予測値であり、予測が、受信した現在のpH値をREL-M1(pH_R-ti)のインプットとして用いることによって計算され、REL-M1は培地(M1)の培地固有関係式であり、pH_R-tiは、時間tiでの参照バイオリアクターの培地における受信した現在のpH値であり、従って、参照バイオリアクターの培地が細胞培養物を欠き、かつ培地固有関係式のインプットとして用いられるpH値を有し、かつ培地上にあるバイオリアクター中の気相とpH-CO2平衡状態にあり、従って、前記バイオリアクターの総オフガス体積とも平衡にあると仮定して、参照バイオリアクターにおけるCO2オフガス分率予想値が算出される、こと、
-

に従ってCO2オフガス速度予想値ACO_R-EXP-ti[mol/min]を算出することであって、式中、ACO_R-EXP-ti[mol/min]値は、

の単位の参照バイオリアクター(102)のCO2オフガス速度予想値であり、TGI_Rは、現在の時間tiでの参照バイオリアクター(102)のガス流入の総量である、こと、
- PACO_R-ti=ACO_R-EXP-ti[mol/min]-ACO_R-M-ti[mol/min]に従って

値を算出することであって、式中、ACO_R-M-ti[mol/min]は、時間tiで参照バイオリアクターにおいて測定された、

の単位のCO2オフガス速度である、こと
を含む。

一般的には、特定の時間t_iでの特定のバイオリアクター(例えば、参照バイオリアクターまたはモニタリングされているバイオリアクターB1もしくはB2)のPACO値は、以下:PACO_ti=ACO_EXP-ti-ACO_MEASURED-tiの通りに算出される。式中、ACO_EXP-tiは、細胞培養物の非存在下での、かつ、平衡状態にある培地のpH値が、バイオリアクターのCO2オフガス速度を測定した時に測定されたバイオリアクターの現在のpH値と同一であるという条件下での、pH-CO2平衡状態にある前記バイオリアクターの中での、時間t_iでの前記培地のCO2オフガス速度「予測値」(または「予想値」)である。例えば、CO2オフガス速度予測値は、時間tiでの、バイオリアクターの受信した現在のpH値を培地固有関係式に入力することによって得ることができる。CO2オフガス速度測定値はCO2測定装置から入手することができる。CO2オフガス速度予測値およびCO2オフガス速度測定値には単位[mol CO2/min]があってもよい。

従って、参照バイオリアクターのCO2オフガス速度予想値/予測値は、インプットとして提供されたpH値の培地について予測された一種の「無細胞CO2オフガス速度」を表し、この培地には細胞培養物が無く、培地のpH-CO2平衡状態を変更する可能性がある他のどの成分も無い。

本明細書で使用する「pH測定装置」は、培地中の現在のpH値を測定するのに用いられる装置および/または物質である。pH測定装置は、例えば、溶液もしくはpHストリップの形をとる(フェノールフタレインのような)pH指示薬でもよく、電位差計でもよい。好ましい態様によれば、pH測定装置はpHメーターである。pHメーターは、例えば、連続pHメーター、すなわち、それぞれの個々の測定のために試料を取り出す必要はなく、かつ前記pHメーターを培地に挿入する必要はなく、バイオリアクターの培地のpHを連続して繰り返し測定することができるpHメーターでもよい。例えば、pH測定装置は、培地および参照電極に接続され、かつ電位測定値を表示せず、即座にpH値を表示するようにスケール変更された高精度の電圧計でもよい。優先的に、pH測定装置は培地に沈められ、バイオリアクター中で細胞を培養している間ずっと、培地の現在のpH値を繰り返し測定するのに用いられる。例えば、pH測定装置は現在のpH値を数分ごとに、または30分ごとに、または数時間ごとに測定してもよい。pH測定装置として用いられる代表的な今日のpHメーターでは、参照電極はpH電極に組み込まれ、このため装置はコンパクトになっている。

本明細書で使用する「オンライン測定」とは、バイオリアクターまたはその中に含まれる細胞培養物の状態特徴を記述する測定値を得るプロセスであって、測定を行うのに必要な期間が、前記特徴が大きく変化する時間より短いプロセスである。大きく変化するとは、予め規定された閾値より大きく変化することでもよい。例えば、5％を超えて変化すると大きく変化したとみなされることがある。異なる特徴について閾値が異なることがある。オンライン測定を用いるとバイオリアクターをリアルタイムで制御することが可能になる可能性がある。

「オフライン測定」とは、バイオリアクターまたはその中に含まれる細胞培養物の状態特徴を記述する測定値を得るプロセスであって、測定を行うのに必要な期間が、前記特徴が大きく変化する時間より長いプロセスである。大きく変化するとは、予め規定された閾値より大きく変化することでもよい。例えば、5％を超えて変化すると大きく変化したとみなされることがある。オフライン測定の代表例は、例えば、現在のpH値を測定するための、培地のプローブの自動サンプリング、半自動サンプリング、または手動サンプリングである。オフライン測定は不連続なサンプリングプロセスに基づいている。試料を採取してから、その間に、バイオリアクター特徴が変化している可能性があるので、測定時間と、それぞれの制御操作を行う時間との間には、かなりの待ち時間があるために、オフライン測定データに基づくバイオリアクターの制御は低品質になる傾向がある。

態様によれば、モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクターの現在のpH値は、連続pH測定装置、例えば、前記バイオリアクターの培地に沈められたpHメーターによって測定される。さらに、もしくはまたは、参照バイオリアクターの現在のpH値は、連続pH測定装置、例えば、前記参照バイオリアクターの培地に沈められたpHメーターによって測定される。

「CO2測定装置」は「CO2メーター」または「CO2分析器」とも呼ばれ、ガス体積中の、例えば、バイオリアクターの培地上にあるガス体積中またはバイオリアクターのオフガス中の現在のCO2濃度を測定するのに用いられる装置である。態様によれば、モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクターの現在のCO2オフガス速度は、連続CO2オフガスメーターによって、すなわち、ハードウェアモジュールをバイオリアクターまたはその接続されたオフガスパイプまたはそれぞれのCO2濃度測定用のパイプに繰り返し挿入することも、交換することも必要なく、バイオリアクターのオフガス中の現在のCO2濃度を測定することができる装置によって測定される。全ガス流入速度または全オフガス速度と組み合わせて、CO2オフガス速度は、CO2オフガスメーターまたは前記CO2オフガスメーターに接続されたデータ処理装置によって自動的に求めることができる。さらに、もしくはまたは、参照バイオリアクターの現在のCO2オフガス速度は連続CO2オフガスメーターによって測定される。測定された現在のオフガス速度は、バイオリアクターのオフガス中の現在のCO2濃度およびバイオリアクターの現在の総オフガス体積から数学的に導き出すことができる。それにもかかわらず、このような導き出されたCO2オフガス速度はCO2濃度測定値および全ガス流入速度測定値(または全オフガス速度測定値)から容易に算出することができるので、本明細書では「CO2オフガス速度測定値」と呼ばれる。一部の態様によれば、さらに、前記算出では、培地の体積の影響が均一化されるように、CO2オフガス速度計算値を正規化するためのインプットとして、それぞれのバイオリアクターの体積または質量を使用する。

連続pH測定装置および/または連続CO2オフガスメーターを使用することは有利な場合がある。なぜなら、容易に、かつ繰り返し測定することができるパラメーターから、それぞれのPACO値または参照PACO値を導き出すことができるからである。多くの既存のバイオリアクターが1つもしくは複数の沈められたpHメーターを既に備える、ならびに/またはCO2オフガス速度および/もしくは全ガス流入速度を測定することができる測定装置を備えるか、もしくはこれと結合されている。態様に応じて、バイオリアクター(または参照バイオリアクター)は1本のガス流入ラインもしくはパイプまたは複数本のガス流入ラインもしくはパイプを備える。例えば、特別な供給業者からの環境空気または(既に膨張されている)圧縮空気をバイオリアクター(参照バイオリアクター)に送達するのに1本のガス流入ラインまたはパイプが用いられることがある。前記の環境空気または圧縮空気は、地球の大気によくあるガス、特にN2、O2、およびCO2の混合物からなってもよい。さらに、もしくはまたは、例えば、細胞増殖を制御するために、N2、O2、およびCO2などの個々のガスをバイオリアクターに送達するのに、1本のガス流入ラインもしくはパイプが用いられてもよく、他のどのガス流入ラインもしくはパイプも用いられてもよい。どんな場合でも、全ガス流入速度、例えば、バイオリアクターの任意のガス流入ラインまたはパイプを介して単位時間あたりにバイオリアクターに送達される全ガスの総量が求められる。

態様によれば、バイオリアクター(モニタリングおよび/もしくは制御されているバイオリアクターならびに/または参照バイオリアクター)は、バイオリアクター内にある培地とガス体積との間のpH-CO2平衡の確立を加速するために、流入しているガスから非常に細かく分散されたガスバブルを生じさせるための1つまたは複数のマイクロスパージャー(microsparger)を備える。例えば、マイクロスパージャーは流入ガス混合物に用いられてもよく、それぞれの個々の流入ガス成分に別々に用いられてもよい。さらに、もしくはまたは、2つのバイオリアクターのうちの1つは、または2つのバイオリアクターのそれぞれは、二酸化炭素と、1種類または複数種の他のガス(例えば、窒素、酸素、および/または空気)とが一緒になってガス混合物としてバイオリアクターに同時に添加されるように構成および操作される。例えば、全流入ガスが、ガス混合物として、例えば、水中にあるパイプ開口部またはマイクロスパージャーを介してバイオリアクターに投入されてもよい。

優先的に、バイオリアクターの体積が、例えば、400リットル、または、例えば、200リットルの閾値体積より少ない場合、全プロセスガスが、マイクロスパージャーを介して、および/またはガス混合物の形でバイオリアクターに投入される。

態様によれば、バイオリアクターの培地内にある流入ガスのエアレーション速度およびバブルサイズは、全てのガスバブルがバイオリアクターを離れる前に培地とpH-CO2平衡に到達するか、または培地に完全に溶解するように選択される。

前記特徴は有利な場合がある。なぜなら、前記特徴は、ガスバブルのガス内容物がバイオリアクターを離れる前にガスバブルが平衡状態に到達することを確かなものにするからである。マイクロスパージャーから、流入しているガスの非常に細かく分散されたガスバブルが生じ、それによって、バイオリアクター内にある培地とガス体積との間のpH-CO2平衡の確立が加速される。ガス混合物としてCO2ガスを投入すると、CO2が純粋なCO2ガスバブルから培地に移行する速度が、CO2が培地から、例えば、空気またはN2バブルに移行する速度より速くなる状況が回避される(移行速度は、培地と、種々のタイプのバブルとのCO2濃度差の量に依存する場合がある)。従って、前記測定は、例えば、400リットルより少ない体積を含む、広範囲のバイオリアクター体積にわたるバイオリアクター状態の比較を確かなものにする。

態様によれば、参照PACOプロファイルは、参照バイオリアクターに細胞培養物が接種される前の、参照バイオリアクター内にある培地が特定の温度および圧力でpH-CO2平衡に到達した時間t_R-0で、(現在のpH値および現在のCO2オフガス速度を測定することによって)参照バイオリアクターについて得られた少なくとも1つの参照PACO値を含む。時間t_R-0での、参照バイオリアクターにおける予め規定された温度および圧力は、培地固有関係式を経験的に求めるのに用いられた培地試料の温度および圧力、例えば、20℃および標準大気圧と同一でなければならない。前記参照PACO値は「初期化(initialization)参照PACO値」と呼ばれる。

モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクターが始動されるとき、前記バイオリアクター内にある培地が、t_R-0の参照バイオリアクターのような同じ温度および圧力でpH-CO2平衡に到達した時間t_B1-0で、(現在のpH値および現在のCO2オフガス速度を測定することによって)前記バイオリアクターから現在のPACO値が得られる。前記の現在のPACO値は、モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクターの「初期化PACO値」と呼ばれる。

モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクターの初期化は、初期化参照PACO値と、モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクターの初期化PACO値を比較する工程を含む。比較によって、前記の2つの比較されたPACO値間の差が予め規定された閾値、例えば、2つの比較された初期化PACO値の小さい方の5％を上回ることが分かった(return)場合、モニタリングされているバイオリアクターのpH測定装置が間違って較正されたか、または欠陥があると判定される。同様に、2つのバイオリアクターが同じ温度および圧力でpH-CO2平衡状態にあり、同じpH値に(例えば、それに応じてCO2流入速度を選択することによって)設定されているが、オフガス中の異なるCO2濃度を有する場合、2つのバイオリアクターのpH測定装置は異なって較正されたと判定される。それに関して、2つのバイオリアクターは同じ無細胞培地を含み、CO2分析器は正しく較正されていると想定される。例えば、この比較および判定は手作業で実行されてもよい。さらに優先的には、前記の比較および判定は、データ処理システム、例えば、コンピュータによって自動的に実行される。コンピュータは、モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクターの較正エラーを示す警告メッセージを作成および出力してもよく、ならびに/またはモニタリングおよび/もしくは制御されているバイオリアクターのpH測定装置の較正を自動的に開始してもよい。

これには、誤って較正されたpH測定装置を備えたバイオリアクターの初期化を最初から防止できるという有利な効果がある場合がある。誤って較正されたpH測定装置は細胞培養の不十分な性能の原因となり、バイオリアクターの中で行われなければならない生物学的プロセスまたは生化学的プロセスを完全に失敗さえする場合がある。なぜなら、誤ったpH値は間違ったPACO値の原因となり、現在得られたPACO値と参照PACO値の差の計算値に依存する制御シグナルのエラーの原因となる可能性があるからである。培地および細胞培養細胞は高価であり、そのために、pH測定装置の較正エラーが、間違った制御パラメーターの下でバイオリアクター内で細胞培養物を操作することに関連する時間と費用を節約する可能性がある場合、および/または適切な補正措置をとることができる、例えば、誤って較正されたpH測定装置もしくは欠陥があるpH測定装置を交換することができる可能性がある場合、バイオリアクターへの接種は妨げられる。

さらなる局面において、本発明は、pHメーターの較正を検査するための方法に関する。前記方法は、
- バイオリアクターの培地に細胞培養物が接種される前の時間tiで、pH測定装置から培地の現在のpH測定値を受信し、バイオリアクターの現在のCO2オフガス速度測定値を受信する工程であって、バイオリアクターが、予め規定された圧力および温度を有する、工程;
- 培地固有関係式を受信する工程であって、培地固有関係式が培地タイプに固有であり、前記培地がガス体積とpH-CO2平衡状態にありかつ細胞培養物を欠く時の、培地のpH値とガス体積中のそれぞれのCO2ガス分率との関係を示す、工程;
- 現在のpH測定値での、細胞培養物の非存在下での、pH-CO2平衡状態にあるバイオリアクター内の培地について予測された、バイオリアクターの現在のCO2オフガス速度を予測するために、関係式へのインプットとして現在のpH測定値を使用する工程;
- 現在のPACO値を求める工程であって、現在のPACO値が、バイオリアクターの現在のCO2オフガス速度測定値とバイオリアクターのCO2オフガス速度予測値との差を示す、工程;
- 参照PACO値とバイオリアクターの求められた現在のPACO値との差を求める工程であって、参照PACO値が、参照バイオリアクターのCO2オフガス速度予測値からの、参照バイオリアクターにおいて測定されたCO2オフガス速度の逸脱を示し、CO2オフガス速度予測値は、細胞培養物の非存在下での、かつ、平衡状態にある培地のpH値が、参照バイオリアクターのCO2オフガス速度を測定した時に測定された参照バイオリアクターのpH値と同一であるという条件下での、pH-CO2平衡状態にある参照バイオリアクター内の前記培地タイプのオフガス速度予測値である、工程、
- 求められた差が閾値を上回った場合、pH測定装置が間違って較正されたと判定する工程
を含む。

または、2つの比較されたバイオリアクターのpH測定装置が全く同じに較正されたかどうか判定するために、PACO値を比較するのではなく、2つのバイオリアクターのオフガスのCO2濃度および2つのバイオリアクター内にある培地のpH値が比較される。2つのバイオリアクターは始動され、同じ圧力および温度で同じ無細胞培地が充填され、2つのバイオリアクターがpH-CO2平衡に到達した時に、2つのバイオリアクター内にある培地の現在のpH値および現在のCO2濃度が測定および比較される。2つのバイオリアクターのオフガス中のCO2濃度が同一であるが、pH値が同一でなければ、または2つのバイオリアクターのpH値が同一であるが、オフガス中のCO2濃度が同一でなければ、比較ユニットは、2つのバイオリアクターが異なって較正されたと判定し、適切な措置を開始する、例えば、警告メッセージを出力するか、またはpH測定装置の交換もしくは再較正を開始する。

これには、バイオリアクターに細胞培養物が接種される前にpH測定装置の較正エラーを判定することができ、それによって、最適以下のpH依存的な制御パラメーターを用いて何日もわたってバイオリアクター内で細胞を培養することに伴う時間と手間の浪費が妨げられるという利点がある場合がある。

態様によれば、pH較正検査方法は、バイオリアクターに細胞培養物が接種される前に、モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクターのpH測定装置が正しく較正されたかどうか検査するのに用いられる。前記方法は、差が閾値を上回らないと判定する工程、バイオリアクターのpH測定装置が正しく較正されたと判定する工程、およびpH測定装置が正しく較正されたと判定された場合に、バイオリアクターに細胞培養物を選択的に接種する工程を含む。モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクターに細胞培養物が接種された後に、前記バイオリアクターの動的に計算されたPACO値と、参照PACOプロファイルに明記された参照PACO値の差を最小にすることによって、前記バイオリアクターはモニタリングおよび/または制御される。

時間tiでのバイオリアクターにおける予め規定された温度および圧力は、培地固有関係式を経験的に求めるために以前に用いられたことのある培地の1つまたは複数の試料の温度および圧力と同一である。

一部の態様によれば、細胞培養物が接種された後の時間で、参照バイオリアクター102ならびにモニタリングおよび/または制御されているバイオリアクターの以下の値のペア:
- 2つのバイオリアクターのそれぞれの算出されたPACO値、またはそれぞれ測定されたオフガス中のCO2濃度;
- 2つのバイオリアクター内にある培地のpH値;
- それぞれのバイオリアクター内にある細胞培養物の酸素取り込み速度(oxygen uptake rate)(OUR)
が比較される。OURは、細胞培養物の代謝の状態の指標とみなされる。2つのバイオリアクターは同じ圧力および温度で操作される。CO2オフガス濃度および/またはPACO値は細胞培養物の代謝の影響を受ける場合がある。2つのバイオリアクターがpH-CO2平衡に到達した時に、現在のCO2オフガス濃度またはPACO値および現在のpH値およびOUR速度は測定および比較される。2つのバイオリアクターのオフガス中のCO2濃度(もしくはPACO値)が同一であり、2つのOUR速度が同一であるが、pH値が同一でなければ、または2つのバイオリアクターのpH値が同一であり、OUR速度が同一であるが、オフガス中のCO2濃度(もしくはPACO値)が同一でなければ、比較ユニットは、2つのバイオリアクターが異なって較正されたと自動的に判定し、適切な措置を開始する、例えば、警告メッセージを出力するか、またはpH測定装置の交換もしくは再較正を開始する。

前記特徴は、2つの比較されたバイオリアクターが始動されていた場合でも、かつ細胞の代謝によって現在のpH値が変わる可能性がある場合でも、両バイオリアクターのpH測定装置間のどんな較正差でも判定することができるので有利な場合がある。OURが両バイオリアクターにおいて同一である場合、PACOまたはCO2オフガス濃度のどんな逸脱も細胞代謝の結果ではなく較正差の結果だとみなされる。

本明細書で使用する「プロファイル」とは時間に対するパラメーター値の変動の表現である。

本明細書で使用する「参照プロファイル」とは、参照バイオリアクターから得られたプロファイルである。参照プロファイルは、参照バイオリアクターの細胞培養物状態と比較しようとする細胞培養物状態があるバイオリアクターを操作する前に得られていてもよい。例えば、参照バイオリアクター内にある細胞培養物は、モニタリングされているバイオリアクターにおいて細胞培養物を培養する数ヶ月前にまたは数年前にでも培養されてもよい。または、参照バイオリアクター内にある細胞培養物および「モニタリングされている」バイオリアクター内にある細胞培養物は同時に培養されてもよく、従って、2つの比較されたバイオリアクター内の細胞培養物の状態を「リアルタイム」で比較することが可能になる。一部の態様では、参照バイオリアクター内にある細胞培養物および「モニタリングされている」バイオリアクター内にある細胞培養物は同時に、だが、タイムシフトを伴って培養されてもよく、モニタリングされているバイオリアクターには、参照バイオリアクターより後で細胞培養物が接種される。この遅れは、例えば、数時間でもよく、さらには数日でもよい。優先的に、モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクターにおける細胞培養物状態と、参照バイオリアクターにおける細胞培養物状態を比較する時に、モニタリングされているバイオリアクターの現在のPACO値は、参照PACOプロファイルにある参照PACO値と比較される。それによって、現在のPACO値は、モニタリングされているバイオリアクターの現在のPACO値と同じ時間間隔-それぞれのバイオリアクターに細胞培養物を接種した時間から開始する-の後に得られたプロファイル中の参照PACO値の1つと比較される。

「pH-CO2平衡」とは、pH値とCO2分圧がヘンダーソン・ハッセルバルヒ式に従う化学平衡にある、水溶液(例えば、細胞培養培地)と、前記溶液上にある空気体積(例えば、バイオリアクター内のガス体積)を含む系の状態を示す。CO2分圧は、培地上にある全ガス体積中のCO2ガスの分率に対応する。ヘンダーソン・ハッセルバルヒ式は、生物系および化学系における酸性度の尺度であるpHと酸解離定数(pKa)との関係を表している。CO₂を含むガスが水性液体、例えば、培養培地と接触していれば、少なくとも、わずかな割合のCO2が前記液体に溶解する。例えば、室温では、二酸化炭素の溶解度は、水100mlあたり約90cm³のCO₂(c_l/c_g=0.8)である。温度が下がるにつれて、どんな水溶性ガスもよく溶けるようになる。わずかな割合(約0.2〜1％)の溶解CO₂がH₂CO₃に変換される。CO₂のほとんどが溶媒和分子CO₂としてとどまる。このプロセスは、以下の式:
炭酸(H2CO3)平衡:
[CO2]x[H2O]←→[H2CO3]←→[H+]x[HCO3-]
[H+]x[HCO3-]=Kx[CO2]x[H2O]、式中、K=平衡定数
pH=pK+log([HCO3-]/[CO2])
で説明することができる。

「培地」または「細胞培養培地」とは、微生物もしくは細胞、または蘚類であるニセツリガネゴケ(Physcomitrella)のような小さな植物の培養、典型的には、増殖を支持するように設計された液体またはゲルである。異なるタイプの細胞を増殖させるために異なる培地がある。例えば、植物または動物に由来する特定の細胞タイプの細胞培養用に、および細菌または酵母などの微生物を増殖させるための微生物学的培養用に複数の異なる培地が販売されている。培地は、例えば、栄養培地、例えば、LB培地(Lysogeny Broth)、最小培地、選択培地、鑑別培地、または強化倍地でもよい。一部の培地は、生理学的pH維持するために、例えば、5〜10％CO2のCO2環境を必要とする場合がある。

一部の態様によれば、「2種類の培地は同じである」という表現は、2種類の培地(例えば、一方では、参照バイオリアクター内にある培地、他方では、モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクター内にある培地)が、所与の特定の圧力、温度、および前記培地上にあるガス体積中のCO2濃度、すなわち、同じ組成および濃度の有機化合物および無機化合物ならびに溶媒を含み、測定精度の文脈で同じ製造プロトコールおよび条件を用いて製造されていることを意味する。

一部の態様によれば、この表現は、(所与の温度、圧力、および前記培地上にあるガス体積中のCO2濃度での)前記の差が、複数の異なるpH値の前記培地のpH-CO2平衡に影響を及ぼさないか、またはほぼ影響を及ぼさない限り、ならびに前記2種類の培地それぞれから経験的に導き出された培地固有関係式が同一である限り、2種類の培地が前記のどの判断基準(組成、濃度、製造プロトコール)の点でも異なってもよいことを意味する。

本明細書で使用する「オフガス速度(off gas rate)」、「オフガス速度(off-gas rate)」、または「ガス放出速度(outgassing rate)」とは、単位時間内に、何らかの実体、例えば、バイオリアクターを離れたガスの量である。従って、「CO2オフガス速度」とは、単位時間内に前記実体を離れたCO2ガスの量である。これは、例えば、[molCO2/min]と明記されることがある。

本明細書で使用する「全ガス流入速度」とは、単位時間内に、何らかの実体、例えば、バイオリアクターに入るガスの総量である。ガスはガスの混合物でもよい。例えば、ガスは、約0.04Vol.％のCO2ガスを含む、約78Vol.％のN2ガス、21Vol.％のO2ガス、および約1Vol.％の他のガスからなる環境空気でもよい。ガスは、例えば、[リットル/min]で明記されることがある。

本明細書で使用する「CO2体積分率」とは全ガス体積中のCO2ガスの割合である。単位は、例えば、Vol.％になることがある。これはガス体積の「CO2濃度」とも呼ばれ、濃度はVol.％の単位で明記される。

本明細書で使用する「細胞培養物を培養する」とは、典型的には、細胞培養物が増殖する、すなわち、細胞培養物の細胞の数が増えることを意味する。しかしながら、場合によっては、細胞数は伸び悩むこともあり、さらには減少することもある。

以下において、一例にすぎないが、図面を参照することによって本発明の態様をさらに詳細に説明する。

1つまたは複数のバイオリアクターをモニタリングおよび/または制御するためのシステムのブロック図を示す。 バイオリアクターをモニタリングおよび/または制御するための方法のフローチャートを示す。 バイオリアクターの部品を示す。 細胞培養物を培養する、および増殖させる様々な段階を示す。 バイオリアクターのオフガス中のCO2濃度が他のパラメーターに依存することを図示した図表を示す。 培地に固有のpH-CO2濃度関係式を得るのに用いられたプロットを示す。 4つの異なるバイオリアクター内で細胞培養物を増殖させている間の4つの異なるバイオリアクターのpH値を示す。 インプットとしてpH値および培地固有関係式を用いた、4つのバイオリアクターそれぞれについて予測されたオフガス中のCO2分率を示す。 4つのバイオリアクターそれぞれにおいて実際に測定されたCO2オフガス分率を示す。 CO2オフガス分率予測値と、実際に測定されたCO2オフガス分率の差から得られたPACOプロファイルを示す。 図8aは、2つのバイオリアクターおよび参照バイオリアクターのPACOプロファイルを示した図表である。既に接種の前には、一方のバイオリアクターのPACOプロファイルは参照バイオリアクターのPACOプロファイルと差がある。図8bは、図8aの2つのバイオリアクターと前記参照バイオリアクターのPACOプロファイル差を示した図表である。

詳細な説明
図1は、本発明の態様による1つまたは複数のバイオリアクターをモニタリングおよび/または制御するためのシステム100のブロック図を示す。以下では、図2aおよび2bのフローチャートに示したようにバイオリアクターをモニタリングおよび/または制御するための対応する方法を参照することによって、前記態様が説明される。

図1は、2つの比較されるバイオリアクターのサイズ、形状、温度、または他の工学的パラメーターもしくは環境パラメーターが互いに異なる場合でも、異なるバイオリアクターの前記培養状態をリアルタイムでかつ正確に比較するのを可能にするシステム100を示す。この比較は、特定のバイオリアクターについて、前記バイオリアクターの現在のpH値および現在のCO2オフガス速度ならびに前記バイオリアクターに用いられた細胞培養培地に固有の関係式136、138から導き出されるものとして計算された、いわゆる「PACO」パラメーターに基づく。

システム100は、プロセッサ110、主メモリ112、および非一時的記憶媒体114を備える。記憶媒体は、プロセッサ110によって実行された時に、本発明の態様について述べたように1つまたは複数のバイオリアクター104、106を自動的にモニタリングおよび/または制御するための方法をプロセッサが行うようにする、コンピュータ読取可能な命令を含む。

記憶媒体114は、特定の培地M1に固有の、ならびに予め規定された時間間隔にわたって、および予め規定された目標をもって前記培地M1中で特定の細胞培養物を培養するための特定のプロジェクトに固有の、少なくとも1つの参照PACOプロファイルを含む。例えば、プロジェクトは、約100x10⁵細胞/ミリリットルの細胞密度に達するまで、最適な、または最適に近い細胞増殖条件下で、細胞培養培地M1中でCHO細胞(チャイニーズハムスター卵巣細胞)を14日間にわたって増殖させることでもよい。さらに、記憶媒体114は、前記細胞培養培地M1に特有のpH-CO2-濃度関係を示す、データ構造136、例えば、ファイルまたはデータベース記録を含む。

さらに、記憶媒体は、他の細胞培養培地の培地固有関係式138を含んでもよい、ならびに/または異なる細胞タイプおよび/もしくは異なる培地M2を用いた他の細胞培養プロジェクトの参照PACOプロファイル118を含んでもよい。参照PACOプロファイルおよび培地固有関係式は、データ通信インターフェイス120、例えば、ネットワークインターフェイス、USBポート、CDROMドライブなどを介して受信されてもよい。一部の態様によれば、参照PACOプロファイルは、2つのモニタリングされているバイオリアクターの細胞培養物状態のリアルタイム比較を可能にするために動的に受信されてもよい。

システム100は、1つまたは複数のモニタリングおよび/または制御されているバイオリアクター104、106から、現在の測定値を動的に受信するためのインターフェイス126をさらに備えてもよい。測定値は、特に、現在のpH値および現在のCO2オフガス速度である。PACO比較ユニット130は、モニタリングされているバイオリアクター104において繰り返される、現在のPACO値の反復計算および前記現在のPACO値と参照バイオリアクター102における細胞培養物プロジェクトのPACO参照プロファイル116との比較を行うために、モニタリングされているバイオリアクター104、106における受信した測定値および培地M1の培地固有関係式136を使用する。それぞれの参照PACO値からの、現在のPACO値のどんな差でも、ディスプレイ装置134、例えば、コンピュータモニターまたはスマートフォンモニターを介してユーザーに表示することができる。

任意で、システム100は、それぞれの参照PACO値からの、現在得られたPACO値の差が最小になるように、バイオリアクター104、106の1つまたは複数のパラメーターを制御する制御ユニット132をさらに備える。制御ユニットは、例えば、PACO値比較の結果を受信するために比較ユニット130に動作可能に結合されたソフトウェアおよび/またはハードウェアモジュールでもよい。制御ユニットは、1つまたは複数の工学的プロセスおよび工学的パラメーターの構成および操作を制御することができる。例えば、制御ユニット132は、pH値に影響を及ぼす液体の流入を増やすまたは減らすように動作できてもよく、例えば、クエン酸または1M NaOH溶液の流入を増やしてもよく、減らしてもよい。

例えば、培地M1は、例えば、プトレシン、チミジン、ヒポキサンチン、亜鉛、ならびに高レベルの全アミノ酸およびピルビン酸ナトリウムを含む、Kaighn's Modification of Ham's F-12培地でもよい。これらを添加すると、培地には、一部の細胞タイプのための非常に低いレベルの血清または規定された成分が加えられる。Ham's F-12K(Kaighn's)培地はタンパク質も増殖因子を含有せず、従って、特定の細胞株に最適化され得る増殖因子および胎仔ウシ血清(FBS)が加えられることが多い。Ham's F-12K(Kaighn's)培地では炭酸水素ナトリウム緩衝液系(2.5g/L)を用いる。

培地M2はLB培地でもよく、例えば、様々な目的で、および対応する「プロジェクト」のために細菌または植物を培養するために、他の複数の培地M3、M4について参照プロファイルが存在してもよい。

システムは、モニタリングおよび/または制御しようとする1つまたは複数のバイオリアクター104、106に動作可能に結合される。モニタリングまたは制御されているバイオリアクターの寸法ならびに他の工学的パラメーター(撹拌速度および撹拌構成、バブルサイズ、寸法など)は互いに異なってもよい、および/または参照バイオリアクターのそれぞれのパラメーターと異なってもよい。動作可能な結合は、モニタリングデータ(現在のpHおよびCO2オフガス速度)を比較ユニット130に送信すること、任意で、制御データを制御ユニット132からそれぞれのバイオリアクター104、106に送信することも含んでもよい。参照バイオリアクターをシステム100に結合させてもよいが、システム100に結合させる必要はない。参照バイオリアクターから集められたPACO参照プロファイルは比較ユニット130によってアクセスできれば十分である。

以下の段落では、バイオリアクター104、106および参照バイオリアクターの寸法および他の工学的パラメーターが異なる場合でも、バイオリアクター104、106内にある細胞培養物が、参照バイオリアクター内にある同じ培地中で培養された参照細胞培養物とほぼ同一の生理学的条件下で培養されるやり方で、システム100および本発明の態様に従う対応する方法が、培地M1を含むバイオリアクター104、106の操作をどのように制御できるかという概要を示す。

第1の工程202では、無細胞培地が、予め規定された条件(例えば、20℃および標準大気圧)でph-CO2平衡状態にある時の、無細胞培地のpH値と、前記培地上にある空気体積中の対応するCO2分圧との間の培地固有関係式136が経験的に求められる。この工程は図5Dおよび図6においてさらに詳細に説明される。目標はCHO細胞をKaighn's Modification of Ham's F-12培地中で14日間増殖させることなので、特に前記培地についての関係式が求められる。

工程204では、参照バイオリアクター102から参照PACOプロファイルが得られる。最初に、参照バイオリアクターに無細胞培地M1が充填され、参照バイオリアクターは、ガスの連続添加を開始することによって、例えば、環境空気ならびに/またはその個々の成分(N2、O2、および/もしくはCO2)をバイオリアクターに輸送することによって、および任意で、液体(無細胞培地、任意で、供給材料、塩基などのさらなる液体)の連続添加を開始することによっても、始動される。さらに、スターラーが開始されてもよい。参照バイオリアクターは、培地固有関係式を得るために用いられた温度および圧力とは異なる温度および圧力で操作されてもよい。しばらくして(典型的には数分後または数時間に)、参照バイオリアクター内の培地と、参照バイオリアクター内の培地上にある空気体積はpH-CO2平衡状態に到達し、参照バイオリアクターについて、培地固有関係式136ならびに参照バイオリアクターの現在のpH値およびCO2値から1つまたは複数のPACO値が計算される。

態様によれば、参照PACOプロファイルの作成中に、参照バイオリアクターには、無細胞培地に加えて、供給溶液または塩基などの1種類または複数種の液体が供給される。この場合、一部の態様では、さらなる参照プロファイルが作成される。前記のさらなるプロファイルはそれぞれ、プロファイルの所与の時点で参照バイオリアクターに添加された供給溶液または塩基の量を示す。モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクターを始動および操作している時には、それぞれのプロファイルにおいて明記されるように、培地の体積単位あたり、および単位時間あたり同量の供給溶液または塩基が前記バイオリアクターに添加される。従って、バイオリアクター内にある培地の組成が変わる場合でも、所与の時点tiで、バイオリアクター内にある培地は参照バイオリアクターと「同じ」または「ほぼ同じ」になることが保証される。供給溶液および/または塩基は典型的には培地の組成を大きく変えないので、培地固有関係式が前記供給溶液を欠く培地について経験的に求められた場合でも、現在のPACO値を算出するのに培地固有関係式を使用することができる。しかしながら、例えば、第1の培地から、組成の全く異なる別の第2の培地への切り替えのために、参照培地中での細胞の培養中に参照バイオリアクター内にある培地の組成が劇的に変化するのであれば、実際には、2つの連続したPACO参照プロットと、2つの異なる培地固有関係式が求められ、モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクターの制御ユニットに転送される必要がある。

優先的に、少なくとも初期化の時点での、モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクター104、106は参照バイオリアクターと同じ温度および圧力の下で操作される。しかしながら、バイオリアクター104、106の操作中には、PACO差を最小にするために温度および/または圧力を変更することが可能である。

次いで、工程206では、PACO参照プロファイルおよび培地固有関係式136は、異なるバイオリアクター104、106における細胞培養物状態をモニタリングおよび/または制御するために、例えば、得られた参照PACOプロファイルおよび関係式136をインターネットを介して、または携帯型の記憶媒体を介してシステム100に転送し、プロファイルおよび関係式を記憶媒体114に保存することによって用いられる。図1から推測できるように、1つまたは複数のモニタリングされているバイオリアクター104、106は、多くのパラメーター、例えば、バイオリアクターのサイズおよび形状、撹拌パラメーター、全ガス流入速度、温度、圧力、表面速度、バブルサイズおよび分布、ならびに他のパラメーターの点で参照バイオリアクター102と異なってもよい。本発明の態様におけるPACO参照プロファイルの使用206は、図2bに図示した工程208〜220を含んでもよい。

システム100は、接種後の対応する時間で、バイオリアクター104、106内にある細胞培養物の状態をモニタリングし、前記バイオリアクターの細胞培養物の状態と、参照バイオリアクター内の細胞培養物の状態を比較することができる。参照バイオリアクター、およびモニタリングされているバイオリアクター104、106のそれぞれは同じ培地M1を含み、同じタイプの細胞培養物が接種される。モニタリングされるバイオリアクターが初期化され、細胞培養物が接種される前に、参照バイオリアクターから参照PACOプロファイルが収集されてもよいが、参照バイオリアクターおよび1つまたは複数のモニタリングされるバイオリアクターが並行して操作されるか、または、例えば、1日もしくは複数日の遅れを伴って操作されることも可能である。この場合、モニタリングされているバイオリアクターにおいて細胞培養物を培養している間に、参照PACOプロファイルは動的に受信される。

第1の工程208では、バイオリアクター状態モニタリングシステム100の比較ユニット130は、例えば、記憶媒体114からPACO参照プロファイル116を含むファイルを読み取るか、またはインターフェイス120を介して、システム外部データ供給源、例えば、インターネットから前記プロファイルを受信することによってPACO参照プロファイル116を受信する。PACO参照プロファイルは時間tiに対するPACO参照値PACO_R-tiの変動の表現であり、iは、一続きの時間、例えば、t0、t1、t2、_…、tmaxのうちの1つを示す。時間t0は、優先的に、参照バイオリアクターに細胞培養物を接種する時点の前の、予め規定された時間間隔を置いた時点である。例えば、tmaxが細胞培養プロジェクトの期間の終わりに達するまで、t0は、参照バイオリアクターに接種する1時間前を表してもよく、t1は、接種する45分前を表してもよく、t2は、接種する30分前を表してもよく、t3は、接種する15分前を表してもよく、t4は、接種する時間を表してもよく、t6は、接種して15分後を表してもよい。

さらに、PACO参照プロファイルは、前記参照バイオリアクターのCO2オフガス速度予測値からの、参照バイオリアクターにおいて測定されたCO2オフガス速度の逸脱を示す。CO2オフガス速度測定値は、所与の時間での、参照バイオリアクターのCO2濃度および参照バイオリアクターの全ガス流入速度TGI_R-tiを測定することによって得ることができる。参照バイオリアクター内にある培地が無細胞であり、培地固有関係式を作成する時に用いられた予め規定された温度および圧力(例えば、20℃および標準大気圧)の下でpH-CO2平衡状態にあると仮定して、CO2オフガス速度予測値は、参照バイオリアクター内にある培地の現在測定されたpH値pH_R-M-tiを培地固有関係式に入力することによって導き出される。従って、PACO参照プロファイルは、CO2オフガス速度測定値からの予想値の逸脱を示し、細胞培養物の培養中に、参照バイオリアクター内にある細胞培養物の細胞によって生成されたCO2オフガスの量に依存し、温度、pH、圧力などのpH-CO2平衡に影響を及ぼす他の因子に依存する。

工程210では、比較ユニット130は、モニタリングしようとするバイオリアクター104、106内にある培地M1の培地固有関係式136を含むデータオブジェクトを受信する。培地固有関係式は、予め規定された圧力および温度での、細胞培養物を欠く培地M1の複数の異なるpH値と、前記培地とpH-CO2平衡状態にあるガス体積中のそれぞれのCO2分率との間の関係を示す。

工程212では、比較ユニット130は、現在の時間tiで、インターフェイス128を介して、モニタリングされているバイオリアクター104の現在のCO2オフガス速度ACO_B1-M-tiおよびバイオリアクター104の培地M1の現在のpH値pH_B1-tiを繰り返し受信する。CO2オフガス速度測定値およびpH測定値は、少なくとも、バイオリアクター104における細胞培養物の培養中に受信され、任意で、無細胞状態でのバイオリアクターの状態を比較するために既に接種前に受信されていてもよい。

バイオリアクター104における受信したCO2オフガス速度とpH値のペアそれぞれについて、工程214では比較ユニット130はPACO値PACO_B1-tiを算出する。PACO値は、CO2オフガス速度予測値からの、バイオリアクター104において測定されたCO2オフガス速度の逸脱を示す。前記CO2オフガス速度予測値は、細胞培養物の非存在下で、予め規定された温度および圧力の下で、ならびに平衡状態にある培地のpH値が、時間tiでのモニタリングされているバイオリアクター104のpH値と同一であるという条件下での、前記体積とpH-CO2平衡状態にある前記培地M1の試料上にあるガス体積について予測されたCO2分率から導き出される。算出されたPACO値は、細胞培養物の培養中の特定の時間tiで実際に測定されたCO2オフガス速度からの、細胞培養物の培養中の特定の時間tiでの、バイオリアクター内の細胞培養物の細胞によって生成されたCO2オフガス速度予測値の逸脱を示す。PACO値の算出では、インプットとして、
- 時間tiでの、モニタリングされているバイオリアクター104の受信した現在のCO2オフガス速度;
- 時間tiでの、モニタリングされているバイオリアクター104の受信した現在のpH値速度;
- 時間tiでのバイオリアクター104の全ガス流入速度TGI_B1;および
- 培地M1の培地固有関係式136
を使用する。

工程216では、比較ユニット130は、モニタリングされているバイオリアクター104の算出されたPACO値PACO_B1-tiとPACO参照プロファイル116中のそれぞれの参照PACO値PACO_R-tiとの差を算出する。例えば、モニタリングされているバイオリアクター104のPACO_B1-t100は、PACO参照プロファイル116中のそれぞれのPACO_R-t100と比較される。t100は、接種して24時間後の開始に対応する。

工程220では、比較ユニット130は、算出された差を、例えば、ディスプレイ134に出力する。算出された差は、プロファイル116に従う、参照バイオリアクター102内にある細胞培養物の参照状態からの、バイオリアクター104内にある細胞培養物の状態の逸脱を示す。

態様によれば、比較ユニット130または比較ユニットに結合された制御ユニットは、前記のように、1つまたは複数のさらなるバイオリアクター106の状態をさらにモニタリングしてもよい。

図3は、バイオリアクター102、104、106の態様を示す。バイオリアクターは、液体、例えば、酸、塩基、新鮮な培地などをバイオリアクターおよびアウトフロー(outflow)に移すために第1のパイプに結合される。さらに、バイオリアクターは、ガス、例えば、環境空気および/またはN2ガスおよび/またはO2ガスおよび/またはCO2ガスをバイオリアクターに移すために1本または複数本の第2のパイプに結合され、オフガスのために第3のパイプに結合される。第2のパイプは、現在の全ガス流入速度を求めるためのセンサー144を備えてもよい。第3のパイプは、第3のパイプを通って移される、単位時間あたりのCO2ガス量を選択的に測定するために、センサー122、例えば、CO2オフガス分析器を備えてもよい。他の態様によれば、液体を流入および流出するためのパイプはなくてもよく、供給溶液の段階的な大量(bolus)添加によって栄養分がバイオリアクターに供給されてもよい。

図4は、(例えば、18日にわたってCHO細胞を増殖させる)特定の細胞培養物プロジェクトに従って参照バイオリアクター102において細胞培養物を培養し増殖させる様々な段階を示し、前記プロジェクトからPACO参照プロファイル402が導き出された。このプロジェクトの間に、様々な供給材料(供給材料1、供給材料2、供給材料3)および/または塩基性液体を添加し、参照PACOプロファイルにおけるPACO値の影響を示した。このプロジェクトを別のバイオリアクター104、106において再現するためには、それぞれの時間間隔で、同じ供給材料および/または塩基性物質を培養培地に添加しなければならず、プロファイル402中のそれぞれの参照PACO値からの、モニタリングされているバイオリアクター104におけるPACO値のどんな逸脱も決定され、ならびに任意で、モニタリングおよび制御されているバイオリアクター104、106の工学的パラメーターおよび構成を変更することによって最小化される。

図4に図示したPACOプロファイル402は、このプロジェクトの間に、参照バイオリアクター102において所定の培養物を増殖させた時に観察することができる異なるプロセス段階をはっきりと示す。従って、このプロファイルから、容易にかつ動的に導き出せる測定値から算出された、たった1つのパラメーターであるPACOパラメーターによって、細胞培養細胞の異なる状態と相関関係にある異なるプロセス段階を特定できることが分かる。それにもかかわらず、PACO値は、参照バイオリアクター102内にある培地M1のpH-CO2平衡に影響を及ぼす個々のパラメーター(塩基性供給材料、塩基の添加、乳酸塩の生成など)の単一効果を定量しない。

図4から分かるように、接種後に前記培養細胞を増殖させると、CO2オフガス速度(例えば、[mol CO2/min]の単位で測定された「ACO」(CO2オフガス速度))予測値の測定バージョンの差が大きくなる。細胞を増殖させている間に典型的に培地のpHは下がり、pH値および他のパラメーターの低下に依存してCO2オフガス速度は上がる可能性がある。プロファイル402は4つの異なる段階をカバーする。接種後の第1の段階では、供給材料は添加されず、PACO値は上昇する。この上昇は細胞代謝によって引き起こされる場合がある。第2の段階では、第1の供給材料が培地に添加され、PACO値が小さくなる。次いで、第3の段階では、第2の塩基性供給材料が添加され、これによりPACO値が大きくなる。しかしながら、前記「第3の供給」段階のもっと後になると、細胞代謝によってPACO値が小さくなり、細胞培養物は第4の段階に入る可能性がある。第4の段階では、第2の塩基性供給材料は依然として培地M1に添加される。さらに、細胞培養細胞は、乳酸塩、および/または培地のpH値を下げる他の物質を産生し始める。結果として、第4の段階では参照バイオリアクターのPACO値は上がる。

「下限DB」とは培地の許容pH最低値を示す。培地のpH値が「下限DB」閾値より下になった場合、制御器ユニットはpH値を上げるためにCO2流入速度を自動的に落とすことができる。「上限DB」とは培地の許容pH最高値を示す。培地のpH値が「上限DB」閾値を上回った場合、制御器ユニットはpH値を上げるためにCO2流入速度を自動的に上げる。前記閾値の中間では、CO2流入速度の制御はPACO値だけに基づいて制御することができる。

図4から、細胞培養物を増殖させている時には、実際のCO2濃度は、無細胞培地について予想されたCO2濃度とは大きく異なることが分かる。なぜなら、塩基の添加、供給材料の添加、乳酸塩の発生、異なるCO2蓄積、および培地中での除去速度などが、バイオリアクターにおける培地のpH-CO2平衡および前記培地上にあるガス体積中のCO2濃度に影響を及ぼすからである。

図5は、4つの異なるバイオリアクターのオフガス中のCO2濃度(従って、暗黙的にはオフガス速度)がpH値に依存し、前記CO2濃度がそれぞれのバイオリアクターの工学的パラメーターおよびサイズパラメーターに依存しないことを図示した図表A、B、C、およびDを示す。

4つの異なるバイオリアクターは以下の工学的特性を有する。

前記バイオリアクターI〜IVにはそれぞれ、細胞を全く含まない特定の細胞培養培地M1が充填された。前記培地の元々のpH値は6.85であった(図表Bを参照されたい)。次いで、それぞれのバイオリアクターの前記培地上にあるガス体積中のCO2濃度を下げることによって、それぞれのバイオリアクターのpH値を上げた。試験の初めに、かつ一組の予め規定されたpH値それぞれについて、予め規定された温度および圧力、例えば、20℃および標準大気圧で、それぞれのバイオリアクター内にある培地を、培地上にあるガス体積とのpH-CO2平衡に到達させた。平衡に到達した後に、前記4つのバイオリアクターそれぞれについて、CO2濃度(「分率CO2ガス」すなわち「FCO2[％]」、「CO2濃度」)を総オフガスの体積％の単位で求めた(図表Bと組み合わせて、オフガス中のCO2濃度測定値に及ぼすpH値の影響を示した図表Aを参照されたい)。図表C)は、4つのバイオリアクターそれぞれのCO2濃度測定値に及ぼすpH値の影響を棒グラフの形で示す。4つのバイオリアクターそれぞれについて得られたFCO2[％]の最大逸脱はバイオリアクターの全オフガス速度の0.4％未満であった。

図表D)は、前記バイオリアクターの培地M1がpH-CO2平衡状態に到達した時の、設定された各pH値(6.85、6.95、7.05、7.15、7.25、7.35)での4つのバイオリアクターI〜IVそれぞれにおいて測定されたCO2[％]値を含むプロットである。

バイオリアクター中のpH-CO2平衡が、バイオリアクターに入るおよび/またはバイオリアクターを離れるCO2ガスの速度によって脅かされる可能性があり、そのため、pH-CO2平衡は実際には動的平衡である可能性があることに留意しなければならない。それにもかかわらず、例えば、バイオリアクターにおける全CO2流入速度を変更することによって、バイオリアクター内の培地上にあるガス体積中のCO2濃度を減らすかまたは増やすことによって、動的pH-CO2平衡が特定のpH値で確立されるように、バイオリアクターを制御することが可能である。

pH値は酸性または塩基性の物質または液体の添加によって変わる可能性がある。しかしながら、前記物質は培地の組成を変える可能性があるので、優先的には、望ましいpH値に到達するようにCO2流入速度を制御するだけで、バイオリアクター内で特定のpH値で動的pH-CO2平衡状態が確立される。塩基性物質または酸性物質ではなくpH-CO2平衡を確立するためにCO2流入速度を用いることには、(溶解CO2とその解離生成物の濃度以外には)培地の組成が変わらず、従って、異なるpH値の同じ培地から培地固有関係式を経験的に導き出すことができるという利点がある。

次いで、4つのバイオリアクターに含まれる培地M1に固有の関係式316についてパラメーターを経験的に求めるために、プロットに曲線502がフィットされる。このアプローチを用いると、特定の細胞培養培地について、前記培地が特定のpH値、圧力、および温度(例えば、20℃および標準大気圧)を有し、細胞が全くなく、pH-CO2平衡にある時に、前記培地上にある気相中で予想されるCO2体積分率を予測するためにインプットとして用いられる培地固有関係式が経験的に求められる。得られた関係式は、バイオリアクタースケール、エアレーション速度、およびpH制御のために酸性成分としてCO2ガスを用いるプロセス中の他の工学的パラメーターに依存しない。培地固有関係式は特定の培地M1について1回だけ求められる。この算出は、1つのバイオリアクターにおいて、例えば、参照バイオリアクターに接種する前の参照バイオリアクターにおいて行われてもよい。精度を高めるために、複数のバイオリアクター、またはpH値およびCO2ガス分率(CO2濃度)を測定することができる他の容器において算出を行い、次いで、もっと正確なフィットされた曲線502を得るために複数のバイオリアクターまたは容器において得られた情報を用いることも可能である。図5に図示した例では、フィットされた曲線502、および平衡pH値と平衡CO2濃度との間の対応する培地固有関係式を経験的に求めるために4つの異なるバイオリアクターを使用した。

図6は、図5Dの図表をさらに詳細に示す。培地M1の培地固有関係式136は、pH値と、前記培地上にある気相中のそれぞれのCO2濃度との経験的に求められた複数のペアを数学的にフィットさせることによって得られた式FCO2_M1(pH)=REL-M1(pH)であり、気相中のCO2濃度は、上記で述べたヘンダーソン・ハッセルバルヒ式に従って前記培地とpH-CO2平衡にある。

「FCO2M1(pH)[％]」パラメーターは、予め規定された温度および予め規定された圧力での、所与のpH値を有する前記培地とpH-CO2平衡状態にあるガス体積中のCO2濃度予測値である。この予測は、関係式が経験的に得られた培地M1に固有のものである。

「pH」パラメーターは、前記式のインプットとして用いられるpH値を示す。インプットpH値は、CO2濃度の予測が行われる培地のph-CO2平衡状態にある培地のpH値とみなされる。

「REL-M1」とは、演算子によって結び付けられた1つまたは複数のパラメーターa1、a2、b1、b2、b3のセットである。これらのパラメーターは、前記のように、細胞培養物を欠く培地M1の試料を複数の異なるpH値に調整し、それによって、試料を予め規定された圧力および温度でpH-CO2平衡に到達させること、試料中の培地と接しているそれぞれのガス体積中の平衡CO2濃度を求めること、試料のそれぞれの平衡pH値に対して平衡CO2濃度測定値をプロットし(図5Dおよび図6を参照されたい)、プロットされた値に曲線502をフィットさせ、フィットされた曲線からパラメーターa1、a2またはb1、b2、b3を導き出すことによって得られている。

一部の態様によれば、式FCO2_M1(pH)=REL-M1(pH)は、FCO2_M1(pH)[％]=a1xpH+a2に従う1次方程式である。この場合、パラメーターa1およびa2は、フィットされた曲線から導き出されたパラメーターである。図示した例では、線形フィット(linear fit)から、以下の式:FCO2_M1(pH)=-19,177xpH+143,61が得られる。この例では、a1=-19,177、およびa2=143,61。

他の態様によれば、式FCO2_M1(pH)=REL-M1(pH)は、FCO2_M1(pH)[％]=b1xpH²+b2xpH+b3に従う多項式である。この場合、パラメーターb1、b2、およびb3は、フィットされた曲線から導き出されたパラメーターである。図示した例では、多項式フィット(polynomial fit)から、以下の式:FCO2_M1(pH)=19,969xpH²-302,25xpH+1146,2が得られる。この例では、b1=19,969およびb2=-302,25およびb3=1146,2。多項式フィットを使用することには、線形フィットより精度が高いという利点があるが、PACOに基づく細胞培養物の比較およびモニタリングには線形フィットで既に十分な精度がある。

図7a〜dは、培地固有関係式136と、いくつかの容易かつ動的に入手可能な測定値から、どのようにバイオリアクター104、106のPACO値が計算できるかを図示する。

図7aは、数日間にわたって特定の培地M1の中で細胞培養物を増殖させている間の、4つの異なるバイオリアクターI〜IVにおいて測定されたpH値の変動を示す。優先的に、それぞれのpH値は、前記培地のpH-CO2平衡にあるバイオリアクターの培地M1に沈められたpH測定装置、例えば、電位差(potentiometric)pHメーターを用いて測定される。

図7bは、インプットとして図7aの実際のpH測定値と培地固有関係式を用いた、4つのバイオリアクターそれぞれについて予測されたバイオリアクターの総オフガスに対するCO2濃度を[％]の単位で示す。例えば、培地M1の培地固有関係式は、FCO2_M1(pH)[％]=b1xpH²+b2xpH+b3による多項式に従う。パラメーターb1、b2、およびb3は、図5Dおよび図6に図示した、フィットされた曲線から導き出されたパラメーターである。

例えば、t0(プロジェクトの開始)の4日後に、全バイオリアクターにおいて測定されたpH値は約6.95である。従って、4日目のCO2濃度予想値は、インプットとしてpH値6.95を用いることによって計算された。
FCO2_M1 (pH)[％]=b1x6-95²+b2x6.95+b3。

b1、b2、およびb3は培地M1の経験的に求められたパラメーターである。単位[％]とは、特定の時間でのバイオリアクターの総オフガス体積

に対するCO2アウトガス体積の割合を意味する。

図7cは、4つのバイオリアクターそれぞれにおいて測定された、実際の(「測定された」)CO2オフガス分率を示す。それぞれのバイオリアクターのCO2オフガス分率予測値[％]と、実際の(測定された)CO2オフガス分率との比較から推測できるように、細胞培養物内にある細胞の代謝と、培地のpH-CO2平衡に影響を及ぼす他の因子の影響に由来する可能性がある大きな差が存在する。

例えば、CO2分析装置122は図3に図示したように「二酸化炭素センサー」とも呼ばれ、単位時間あたりのオフガス中のCO2濃度を繰り返し測定するために用いられることがある。CO2センサーの一般的な例は赤外線ガスセンサー(NDIR)および化学ガスセンサーである。NDIRセンサーは、特徴的な吸収によって気体環境中のCO2を検出する分光センサーである。または、CO2センサーはマイクロエレクトロメカニカルセンサーでもよい。

図7dは、前記の1つのバイオリアクターの図7bのCO2オフガス濃度予測値と、図7cのCO2オフガス濃度測定値の差として作成された1つのバイオリアクターのPACOプロファイルを示す。

プロファイル402のPACO値を計算するために、CO2オフガス濃度の予測値および測定値(「CO2」または「FCO2」[％])は本発明の態様に従ってCO2オフガス速度[mol/min]に変換される。

例えば、
CO2オフガス速度予想値:

測定された(「実際の」)CO2オフガス速度:

に従って、図7a)のpH測定値のそれぞれについて計算を行うことができる。

それによって、

は、現在のPACO値が計算されているバイオリアクターの総オフガス体積であり、バイオリアクターにおけるガス流入の総量

は総オフガス体積として用いられてもよい。バイオリアクターの総オフガス体積が一定でない場合、CO2オフガス速度を計算するためにインプットとして用いられるpH値が測定されるたびに、

は求められる必要がある。例えば、バイオリアクターがCO2用の第1のガス流入パイプ、O2用の第2のガス流入パイプ、N2用の第3のガス流入パイプ、および環境空気用の第4のガス流入パイプを有する場合、4本のパイプそれぞれのガス流量は個々に変更することができ、

は、

として計算することができる。値

は理想気体のMolの体積である。

次いで、

は、pH測定値(時間tiに対応する)のそれぞれについて、無細胞培地M1中で前記pH値で予想された絶対CO2オフガス速度と、バイオリアクターの実際に測定された

との差として計算される。

上述の式に従うPACO値の算出には、スケール、タイプ、または機器が異なる2つ以上のバイオリアクターの状態を比較するために式が有効に適用され得るという利点がある場合がある。PACO値は、オフライン測定を伴わないインプットデータから算出される。オフセット測定、例えば、バイオリアクターの状態を確かめるために以前のアプローチに従って試料のpH値またはバイオマス含有量を求めるためのオフセット測定はオフセットを測定値に加える可能性がある。前記オフセットは、それぞれのプラントおよび生産現場において用いられる機器に左右されることが多く、従って、異なる生産現場に置かれたバイオリアクターの状態を信頼性をもって比較する際の障害となるかもしれない。従って、上述の式を用いると、バイオリアクターの状態がエラーに強く(error-robust)、包括的に比較される可能性がある。

しかしながら、上述の式は多くのやり方で調整することができる。
- 前記の式は、ガス体積の補正係数(correction factor)を含むように変更される場合がある。上述の式では、理想気体のモル体積が273,15Kおよび1,01325^*105Pa圧力で22.414リットルだと仮定する。実際には、温度、圧力、従って体積は異なる場合がある。従って、補正係数または測定されたデータを用いて式および出力の精度を調整することができる。
- 前記の式は、圧力効果を補償するためにCO2オフガス濃度測定値の補正係数を含むように変更される場合がある。それによって、CO2オフガス濃度に及ぼす環境圧力変化の影響が補償され得る。
- 前記の式は、オフガスCO2濃度測定における湿度の効果を補償するためにオフガス湿度の補正係数を含むように変更される場合がある。
- 前記の式は、使用したpH測定装置における温度の効果を補償するために温度の補正係数を含むように変更される場合がある。2つ以上のオンラインpHメーターによって測定されたpH値が同時に受信され、pH測定の精度を高めるためにpH測定値の平均を算出するのに用いられてもよい。
- 前記の式は、プローブ較正の効果を説明するかまたは補償するように変更される場合がある。この補償は、例えば、pHメーターの電圧測定値に重なったら、変更されたpHの単位あたりの電圧測定値(例えば、mV/pH)をシフトする補償曲線の形で実行されてもよい。この曲線には、中性pHプローブから得られたpH測定値の現在のオフセットを補償するのに適した傾きおよび振幅がある場合がある。一例として、pHメーターの温度補償設備はスイッチがオンまたはオフになったら、異なるpH読み取り値となる可能性がある。または、pHメーターは、電圧差測定値からpHを算出するための異なるアルゴリズムを支持してもよい。前記の効果は全て、1つまたは複数の補償係数(compensation factor)を式に導入することによって補償されてもよい。

優先的に、参照PACO値の計算はPACO値の計算と同じやり方で行われ、現在のpH値およびCO2オフガス速度が参照バイオリアクターにおいて測定される。

態様によれば、制御されているバイオリアクター104について(接種後の時間tiで測定されたpH値およびCO2濃度[％]から)現在計算されたPACO値と、参照プロファイル402中の対応する参照PACO値との差が最小になるように、制御器ユニットは、モニタリングされているバイオリアクター104を制御する。

正規化PACO値
一部の態様によれば、PACO値が計算されたバイオリアクター内にある培地M1の体積を考慮に入れた正規化PACO値が計算される。

これにより、異なるバイオリアクター体積を均一化することが可能になる可能性があり、従って、バイオリアクタープロセスをスケールアップもしくはスケールダウンする、および/または寸法が異なるバイオリアクターの細胞培養物を比較することが可能になる可能性がある。

最初に、正規化CO2オフガス速度「NACO_M1」は、

に従って計算される。

参照バイオリアクター102についてPACOが計算される場合、バイオリアクター内にある培地M1の体積は「参照バイオリアクター内にある培地の体積」である。モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクター104についてPACOが計算される場合、モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクター内にある培地M1の体積が「バイオリアクター内にある培地の体積」である。前記体積は培地上にある気相を含まない。

次いで、CO2オフガス値を予想するのに用いられるpH値が測定された特定の時間tiについて、体積で正規化されたPACO値が計算される。

態様によれば、正規化されたCO2オフガス速度およびPACO値はまた、バイオリアクター内にある培地の体積の代わりに、バイオリアクター内にある培地M1の総質量を用いることでも計算することもできる。それによって、1Lの培地は典型的には1kgの質量に対応する。

図7dは、CO2オフガス速度予測値と、実際に測定されたCO2オフガス速度との差から得られたPACOプロファイルを示す。

図8aは、参照バイオリアクター102の参照PACOプロファイル402、第1のモニタリングおよび/または制御されているバイオリアクター104のPACOプロファイル802、ならびに第2のモニタリング/および制御されているバイオリアクター106のさらなるPACOプロファイル804を示した図表である。この図表は、既に、時間t0で(図8に図示した例では、時間t0は、バイオリアクターに細胞培養物を接種した時間である)、バイオリアクター104(「B1」)のPACO値が参照バイオリアクターのt0でのPACO値と大きな差があることを示す。態様によれば、これは、プロファイルが比較されたバイオリアクターのpHメーターが異なって較正されていることを指し示すものとして使用することができる。参照バイオリアクターのpH測定装置が正しく較正されたと仮定して、t0での(すなわち、PACOを調整する可能性のある細胞培養細胞を培地が含んだ時、または含む前の)PACO逸脱は、モニタリングされているバイオリアクター106(「B2」)、104(「B1」)のpH測定装置が間違って較正され、細胞培養物の増殖を開始する前に正しく較正しなければならないことを指し示すものとして使用することができる。

図示した例では、時間t0での、モニタリングされているバイオリアクター106(「B2」)のプロファイル804のPACO値は、時間t0での参照PACOプロファイル402の参照PACO値と同一である。時間t0での、モニタリングされているバイオリアクター104(「B4」)のプロファイル802のPACO値は、時間t0での参照PACOプロファイル402の参照PACO値と大きな差がある。

または、PACO値の代わりに、2つのバイオリアクターのオフガスのCO2濃度を比較して、2つの比較されたバイオリアクターのpH測定装置が等しく較正されたかどうか判定することができる。2つのバイオリアクターは始動され、同じ圧力および温度で同じ無細胞培地が充填され、2つのバイオリアクターがpH-CO2平衡に到達した時に、2つのバイオリアクター内にある培地の現在のpH値および現在のCO2濃度が測定および比較される。2つのバイオリアクターのオフガス中のCO2濃度が同一であるが、pH値が同一でなければ、または2つのバイオリアクターのpH値が同一であるが、オフガス中のCO2濃度が同一でなければ、比較ユニットは、2つのバイオリアクターが異なって較正されたと判定する。

誤って較正されたpHメーターを用いると、PACO値に基づいて2つの細胞培養物の細胞培養状態を比較した時に不正確な結果が得られる可能性がある。これは、PACO値がpH値から導き出されるものだからである。結果として、PACO差を最小化するために制御器がとる措置はどれもPACO差を最小化できない可能性がある(この作用は図8aおよび図8bに示されなかった。なぜなら、バイオリアクターB2内での細胞培養物の増殖中に、塩基の添加および全ガス流入速度の上昇によってpH-CO2平衡が変わったからである。従って、B2のPACOプロファイルは参照PACOプロファイルと大きな差があるが、参照バイオリアクターおよびバイオリアクターB2のpHメーターは同じように較正された)。

図8bは、2つのバイオリアクター104、106のPACOプロファイル802、804と、参照バイオリアクター102の参照PACOプロファイル402とのPACOプロファイル差を示した図表である。曲線810は、バイオリアクター104と参照バイオリアクターのPACOプロファイル差を表し、曲線808は、バイオリアクター106と参照バイオリアクターのPACOプロファイル差を表す。バイオリアクター106とPACO参照プロファイル402とのPACOプロファイル差はバイオリアクター104のPACO差よりかなり大きい。なぜなら、B2中での細胞培養物の増殖中にpH-CO2平衡が変わったからである。

符番の説明
100 バイオリアクター内の細胞培養物状態をモニタリングおよび/または制御するためのシステム
102 参照バイオリアクター
104 モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクターB1
106 モニタリングおよび/または制御されているバイオリアクターB2
108 pH測定装置
110 プロセッサ
112 メモリ
114 記憶媒体
116 参照PACOプロファイル
118 参照PACOプロファイル
120 1つまたは複数の参照PACOプロファイルおよび培地固有関係式を受信するためのインターフェイス
122 CO2オフガス分析器
124 CO2オフガス分析器
126 CO2オフガス分析器
128 1つまたは複数のバイオリアクターにおいて測定されたパラメーターを受信するためのインターフェイス
130 PACO比較ユニット
132 制御ユニット
134 ディスプレイ
136 M1の培地固有関係式
138 M2の培地固有関係式
140 全ガス流入量用のセンサー
142 pH測定装置
144 全ガス流入量用のセンサー
146 pH測定装置
202〜220 工程
402 PACO参照プロファイル
502 4つのバイオリアクターについてプロットされた培地固有関係式
802 モニタリングされているバイオリアクターのPACOプロファイル
804 モニタリングされているバイオリアクターのPACOプロファイル
808 参照PACOプロファイルとのプロファイル差
810 参照PACOプロファイルとのプロファイル差
M1 細胞培養培地
TGI_B1 バイオリアクターB1への全ガス流入量
TGI_B2 バイオリアクターB2への全ガス流入量
TGI_R 参照バイオリアクターへの全ガス流入量
TGO_B1 バイオリアクターB1の総オフガス
TGO_B2 バイオリアクターB2の総オフガス
TGO_R 参照バイオリアクターの総オフガス
TLI_B1 バイオリアクターB1への総液体流入量
TLI_B2 バイオリアクターB2への総液体流入量
TLI_R 参照バイオリアクターへの総液体流入量
TLO_B1 バイオリアクターB1の総(液体)流出量
TLO_B2 バイオリアクターB2の総(液体)流出量
TLO_R 参照バイオリアクターの総(液体)流出量

Claims (18)

1. 参照バイオリアクター(102)内にある細胞培養物の参照状態からの、参照バイオリアクターと同じ培地(M1)を含むバイオリアクター(104、106)内にある細胞培養物の状態の逸脱をモニタリングするためのシステム(100)であって、
   - ■時間(t_i)に対する参照PACO値(PACO_R-ti)の変動の表現であり、参照バイオリアクターのCO2オフガス速度予測値(ACO_R-EXP-ti)と参照バイオリアクターにおいて測定されたCO2オフガス速度(ACO_R-M-ti)との差を示すPACO参照プロファイル(116)であって、CO2オフガス速度予測値は、細胞培養物の非存在下での、かつ、平衡状態にある培地のpH値が、参照バイオリアクターのCO2オフガス速度(ACO_R-M-ti)を測定した時に測定された参照バイオリアクターのpH値(pH_R-ti)と同一であるという条件下での、pH-CO2平衡状態にある参照バイオリアクター内の該培地のオフガス速度予測値であり、PACO参照プロファイルが、細胞培養物の培養中に参照バイオリアクター内の細胞培養物の細胞によって生成されたCO2オフガスの量に依存する、PACO参照プロファイル(116)と、
   ■培地固有関係式(136)を含むデータオブジェクトであって、培地固有関係式が、培地(M1)に固有であり、培地(M1)がガス体積とpH-CO2平衡状態にありかつ細胞培養物を欠く時の、培地(M1)のpH値とガス体積中のそれぞれのCO2ガス分率との関係を示す、データオブジェクトと
   を含む、記憶媒体(114);
   - 現在の時間(ti)において、バイオリアクター内での細胞培養物の培養中に測定された、バイオリアクター(104、106)の現在のCO2オフガス速度(ACO_B1-M-ti、ACO_B2-M-ti)とバイオリアクター(104、106)の培地の現在のpH値(pH_B1-ti、pH_B2-ti)とを繰り返し受信する(212)ためのインターフェイス(128);
   - 受信した現在のCO2オフガス速度のそれぞれについて、
   ■CO2オフガス速度予測値(ACO_B1-EXP-ti、ACO_B2-EXP-ti)とバイオリアクター(104、106)において測定されたCO2オフガス速度(ACO_B1-M-ti、ACO_B2-M-ti)との差を示すPACO値(PACO_B1-ti、PACO_B2-ti)であって、CO2オフガス速度予測値は、細胞培養物の非存在下での、かつ、平衡状態にある培地のpH値が、バイオリアクター(104、106)のCO2オフガス速度を測定した時に測定されたバイオリアクター(104、106)の現在のpH値(pH_B1-ti、pH_B2-ti)と同一であるという条件下での、pH-CO2平衡状態にある該バイオリアクター(104、106)内の該培地のオフガス速度予測値であり、PACO値が、細胞培養物の培養中にバイオリアクター内の細胞培養物の細胞によって生成されたCO2オフガスの量に依存し、PACO値(PACO_B1-ti、PACO_B2-ti)の算出が、インプットとして、
   ○受信した現在のCO2オフガス速度(ACO_B1-M-ti、ACO_B2-M-ti)、
   ○受信した現在のpH値(pH_B1-ti、pH_B2-ti)、
   ○現在のCO2オフガス速度を受信した時間(ti)でのバイオリアクターの全ガス流入速度(TGI_B1、TGI_B2)、および
   ○培地固有関係式(136)
   を使用する、PACO値(PACO_B1-ti、PACO_B2-ti)と、
   ■算出されたPACO値(PACO_B1-ti、PACO_B2-ti)とPACO参照プロファイル(116)中のそれぞれの参照PACO値(PACO_R-ti)との差
   を算出する(214、216)ために構成された比較ユニット(130)であって、比較ユニット(130)が、算出された差を出力する(218)ために構成されており、算出された差は、参照状態からの、バイオリアクター(104、106)内にある細胞培養物の状態の逸脱を示す、比較ユニット(130)
   を備える、システム(100)。
2. 培地固有関係式が、培地(M1)のpH値とガス体積中のそれぞれ測定されたCO2ガス分率との経験的に求められた複数のペアを数学的にフィットさせることによって得られた式FCO2_M1(pH)=REL-M1(pH)であり、式中、
   - FCO2_M1(pH)は、培地(M1)が所与のpH値を有しかつガス体積とpH-CO2平衡状態にありかつ細胞培養物を欠く時の、該培地の試料上にあるガス体積中のCO2ガス分率予測値であり;
   - pH値はインプットパラメーター値であり、細胞培養物の非存在下でph-CO2平衡状態にある培地(M1)のpH値を表し;
   - REL-M1は、演算子によって結び付けられた1つまたは複数のパラメーターのセット(a1、a2、b1、b2、b3)であり、該パラメーターが、
   ■細胞培養物を欠く培地(M1)の試料を複数の異なるpH値に調整し、それによって、試料をガス体積とのpH-CO2平衡に到達させること、
   ■試料中の培地とph-CO2平衡にあるそれぞれのガス体積中のCO2ガス分率を求めること、
   ■求められたCO2ガス分率を試料のそれぞれの平衡pH値に対してプロットすること、
   ■プロットされた値に曲線(502)をフィットさせ、フィットされた曲線から培地固有関係式のパラメーター(a1、a2またはb1、b2、b3)を導き出すこと
   によって得られたものである、請求項1記載のシステム(100)。
3. 受信した現在のCO2オフガス速度、受信した現在のpH値、特定の時間ti(t0、t1、_…、tmax)でのバイオリアクターの全ガス流入速度、および培地固有関係式だけが、モニタリングされているバイオリアクターのPACO値(PACO_B1-ti、PACO_B2-ti)を計算するためのインプットパラメーターである、前記請求項のいずれか一項記載のシステム(100)。
4. システムが、PACO値(PACO_B1-ti、PACO_B2-ti)を算出するために構成されており、PACO値の算出が、
   - 現在のCO2オフガス速度および現在のpH値を測定した時間における、培地と平衡状態にあるバイオリアクター(104、106)のガス体積中のCO2濃度予測値(「FCO2_EXP」)を算出するために、受信した現在のpH値を培地固有関係式に入力する工程;
   - バイオリアクターのCO2オフガス速度予測値(「ACO_EXP」)を得るためにCO2濃度予測値(「FCO2_EXP」)にバイオリアクターの全ガス流入速度を掛ける工程であって、CO2オフガス速度予測値は、細胞培養物の非存在下での、かつ、平衡状態にある培地のpH値が培地固有関係式に入力された受信した現在のpH値と同一であるという条件下での、pH-CO2平衡状態にある該培地のオフガス速度予測値である、工程;ならびに
   - PACO値を得るために、バイオリアクターのCO2オフガス速度予測値(ACO_B1-EXP-ti、ACO_B2-EXP-ti)からバイオリアクターのCO2オフガス速度測定値(ACO_B1-M-ti、ACO_B2-M-ti)を差し引く工程
   を含む、前記請求項のいずれか一項記載のシステム(100)。
5. 現在の時間(ti)でのバイオリアクターのCO2オフガス速度予測値(ACO_B1-EXP-ti、ACO_B1-EXP-ti)の算出が、
   

   

   に従って行われ、式中、TGI_B1は、現在の時間(ti)でのバイオリアクター(104、106)のガス流入の総量であり、FCO2_EXPは、現在のCO2オフガス速度および現在のpH値を測定した時間における、培地と平衡状態にあるバイオリアクター(104、106)のガス体積中のCO2濃度予測値である、請求項4記載のシステム(100)。
6. 算出された差の出力が、
   - 算出されたPACO値(PACO_B1-ti、PACO_B2-ti)とPACO参照プロファイル(116)中のそれぞれの参照PACO値(PACO_R-ti)との算出された差(808、810)が閾値を上回った場合、アラームシグナルを自動的に出力する工程
   を含む、前記請求項のいずれか一項記載のシステム(100)。
7. 培地が、炭酸塩で緩衝化された培地である、前記請求項のいずれか一項記載のシステム(100)。
8. 参照バイオリアクターが、以下の特徴:
   (a)バイオリアクター内のガス体積、
   (b)バイオリアクター内の培地体積、
   (c)バイオリアクターのレイノルズ数、
   (d)バイオリアクターのニュートン数、
   (e)バイオリアクターの寸法、
   (f)バイオリアクターおよび/またはバイオリアクターバッフルの幾何学的特徴、
   (g)スターラー構成、
   (h)撹拌速度、
   (i)バイオリアクターの酸素の物質移動容量係数(kLa)、
   (j)全ガス流入速度および/またはO2流入速度および/またはN2流入速度および/またはCO2流入速度、
   (k)動力投入量、
   (l)バイオリアクター内の圧力、
   (m)培地中でのガスバブル保持時間、
   (n)培地中でのガスバブルサイズおよび分布、
   (o)表面速度、
   (p)パラメーター(a)〜(o)のうちの1つまたは複数から導き出されるものとして計算されたパラメーター
   のうちの1つまたは複数の点でバイオリアクター(104、106)と異なる、前記請求項のいずれか一項記載のシステム(100)。
9. 現在の時間(ti)でのPACO値(PACO_B1-ti)の算出が、バイオリアクター(104)の受信した現在のCO2オフガス速度(ACO_B1-M-ti)およびpH値(pH_B1-ti)のそれぞれについて、
   - FCO2_B1-EXP-ti[％]=REL-M1(pH_B1-ti)に従ってバイオリアクター(104)の現在のアウトガス体積のCO2オフガス分率予想値FCO2_B1-EXP-ti[％]を算出することであって、式中、FCO2_B1-EXP-ti[％]は、現在の時間(ti)での、％の単位のバイオリアクター(104)の総オフガス体積(TGO_B1)に対するCO2オフガス分率予測値であり、予測が、受信した現在のpH値(pH_B1-ti)をREL-M1(pH_B1-ti)のインプットとして用いることによって計算され、REL-M1は培地(M1)の培地固有関係式(136)であり、pH_B1-tiは、現在の時間(ti)でのバイオリアクター(104、106)の培地における受信した現在のpH値である、こと、
   -
   

   

   に従ってCO2オフガス速度予想値ACO_B1-EXP-ti[mol/min]を算出することであって、式中、ACO_B1-EXP-ti[mol/min]値は、バイオリアクターの培地が現在測定されたpH値を有しかつ該培地上の気相とpH-CO2平衡にある時の、
   

   

   の単位のバイオリアクター(104)のCO2オフガス速度予想値であり、TGI_B1は、現在の時間(ti)でのバイオリアクター(104)のガス流入の総量である、こと、
   - PACO_B1-ti=ACO_B1-EXP-ti[mol/min]-ACO_B1-M-ti[mol/min]に従ってPACO_B1-ti[mol/min]値を算出することであって、式中、ACO_B1-M-ti[mol/min]は、バイオリアクター(104)において時間tiで測定された、
   

   

   の単位のCO2オフガス速度である、こと
   を含む、前記請求項のいずれか一項記載のシステム(100)。
10. 参照バイオリアクター内にある培地が第1の体積(VRM)および第1の総質量を有し、バイオリアクター(104、106)内にある培地が第2の体積(V1M)および第2の総質量を有し、第1の体積および第2の体積が互いに異なり、算出されたPACO値(PACO_B1-ti)の1つ1つとPACO参照プロファイル(116、402)中のそのそれぞれの参照PACO値(PACO_R-ti)との差の算出が、
    - プロセッサによって、算出されたPACO値(PACO_B1-ti)を第2の体積(VB1M)で割り、プロセッサによって、PACO参照プロファイル(116)中のそれぞれの参照PACO値(PACOR-ti)を第1の体積(VRM)で割る工程、または
    - プロセッサによって、算出されたPACO値(PACO_B1-ti)を第2の質量で割り、プロセッサによって、PACO参照プロファイル(116)中のそれぞれの参照PACO値(PACO_R-ti)を第1の質量で割る工程
    を含む、前記請求項のいずれか一項記載のシステム(100)。
11. PACO参照プロファイル(116、402)が、参照バイオリアクターを操作する複数の段階をカバーし、該段階が、
    - 供給なしで細胞培養物が参照バイオリアクター内で培養される、無供給段階、
    - 細胞培養物が、所与の供給速度の存在下で参照バイオリアクター内で培養され、培地のpH値に影響を及ぼす代謝産物を排出しない、供給段階、
    - 細胞培養物が、所与の供給速度の存在下で参照バイオリアクター内で培養され、培地のpH値に影響を及ぼす代謝産物を排出する、供給段階
    を含む、前記請求項のいずれか一項記載のシステム(100)。
12. 算出されたPACO値(PACO_B1-ti)とPACO参照プロファイル(116)中のそれぞれの参照PACO値(PACO_R-ti)との差が最小になるようにバイオリアクター(104、106)の1つまたは複数の制御パラメーターを自動的に変更するために構成された制御ユニット(132)を備える、前記請求項のいずれか一項記載のシステム(100)。
13. - PACO値(PACO_B1-ti)が、PACO参照プロファイル中のそれぞれの参照PACO値(PACO_R-ti)より大きい場合、制御ユニットが、以下の操作:バイオリアクター(104、106)への全空気流入速度を落とすこと、および/もしくはO2ガス流入速度を落とすこと、および/もしくはCO2ガス流入速度を落とすこと、および/もしくはベース流入速度を落とすこと、ならびに/またはバイオリアクターの圧力もしくは温度を変更すること、のうちの1つまたは複数を行うことによってバイオリアクター(104、106)の1つまたは複数の制御パラメーターを自動的に変更し、
    - PACO値(PACO_B1-ti)が、PACO参照プロファイル中のそれぞれの参照PACO値(PACO_R-ti)より小さい場合、制御ユニットが、以下の操作:バイオリアクター(104、106)への全空気流入速度を上げること、および/もしくはO2ガス流入速度を上げること、および/もしくはCO2ガス流入速度を上げること、および/もしくはベース流入速度を上げること、ならびに/またはバイオリアクターの圧力もしくは温度を変更すること、のうちの1つまたは複数を行うことによってバイオリアクター(104、106)の1つまたは複数の制御パラメーターを自動的に変更する、請求項12記載のシステム(100)。
14. バイオリアクター(104、106)をさらに備える、前記請求項のいずれか一項記載のシステム(100)。
15. 参照バイオリアクター(102)内にある細胞培養物の参照状態からの、参照バイオリアクターと同じ培地(M1)を含むバイオリアクター(104、106)内にある細胞培養物の状態の逸脱をモニタリングするための方法であって、
    - バイオリアクター状態モニタリングシステム(100)の比較ユニット(130)によってPACO参照プロファイル(116)を受信する工程であって、PACO参照プロファイルが、時間(ti)に対する参照PACO値(PACO_R-ti)の変動の表現であり、PACO参照プロファイルが、参照バイオリアクターのCO2オフガス速度予測値(ACO_R-EXP-ti)と参照バイオリアクターにおいて測定されたCO2オフガス速度(ACO_R-M-ti)との差を示し、CO2オフガス速度予測値は、細胞培養物の非存在下での、かつ、平衡状態にある培地のpH値(pH_R-M-ti)が、参照バイオリアクターにおいてCO2オフガス速度(ACO_R-M-ti)を測定した時に測定された参照バイオリアクターのpH値と同一であるという条件下での、pH-CO2平衡状態にある参照バイオリアクター内の該培地のオフガス速度予測値であり、PACO参照プロファイルが、細胞培養物の培養中に参照バイオリアクター内の細胞培養物の細胞によって生成されたCO2オフガスの量に依存する、工程;
    - 比較ユニットによって、培地固有関係式(136)を含むデータオブジェクトを受信する工程であって、培地固有関係式が、培地(M1)に固有であり、培地(M1)がガス体積とpH-CO2平衡状態にありかつ細胞培養物を欠く時の、培地(M1)のpH値とガス体積中のそれぞれのCO2ガス分率との関係を示す、工程;
    - 現在の時間(ti)において、バイオリアクター内での細胞培養物の培養中に測定された、バイオリアクター(104、106)の現在のCO2オフガス速度(ACO_B1-M-ti、ACO_B2-M-ti)とバイオリアクター(104、106)の培地の現在のpH値(pH_B1-ti、pH_B2-ti)とを繰り返し受信する(212)工程;
    - 受信した現在のCO2オフガス速度のそれぞれについて、比較ユニットによって、
    ■CO2オフガス速度予測値(ACO_B1-EXP-ti、ACO_B2-EXP-ti)とバイオリアクターにおいて測定されたCO2オフガス速度(ACO_B1-M-ti、ACO_B2-M-ti)との差を示すPACO値(PACO_B1-ti、PACO_B2-ti)であって、CO2オフガス速度予測値は、細胞培養物の非存在下での、かつ、平衡状態にある培地のpH値が、バイオリアクター(104、106)においてCO2オフガス速度を測定した時に測定されたバイオリアクター(104、106)のpH値(pH_B1-ti、pH_B2-ti)と同一であるという条件下での、pH-CO2平衡状態にあるバイオリアクター内の該培地のオフガス速度予測値であり、PACO値が、細胞培養物の培養中にバイオリアクター内の細胞培養物の細胞によって生成されたCO2オフガスの量に依存し、PACO値(PACO_B1-ti、PACO_B2-ti)の算出が、インプットとして、
    ○受信した現在のCO2オフガス速度(ACO_B1-M-ti、ACO_B2-M-ti)、
    ○受信した現在のpH値(pH_B1-ti、pH_B2-ti)、
    ○現在のCO2オフガス速度を受信した時間(ti)でのバイオリアクターの全ガス流入速度(TGI_B1、TGI_B2)、および
    ○培地固有関係式(136)
    を使用する、PACO値(PACO_B1-ti、PACO_B2-ti)と、
    ■算出されたPACO値(PACO_B1-ti、PACO_B2-ti)とPACO参照プロファイル(116)中のそれぞれの参照PACO値(PACO_R-ti)との差
    を算出する工程;
    - 比較ユニット(130)によって、算出された差を出力する工程であって、算出された差が、参照状態からの、バイオリアクター(104、106)内にある細胞培養物の状態の逸脱を示す、工程
    を含む、方法。
16. PACO参照プロファイルが複数の参照PACO値を含み、前記方法が、
    - 培地固有関係式を含むデータオブジェクトを受信すること;
    - 現在の時間(ti)において、参照バイオリアクター内での細胞培養物の培養中に該現在の時間(ti)で測定された、
    

    

    の単位の参照バイオリアクター(102)の現在のCO2オフガス速度(ACO_R-M-ti)と、参照バイオリアクター(102)の培地の現在のpH値(pH_R-ti)とを繰り返し受信すること;
    - 受信した現在のCO2オフガス速度(ACO_R-M-ti)と現在のpH値(pH_R-ti)のペアのそれぞれについて参照PACO値(PACO_R-ti)の1つを算出することであって、参照PACO値の算出が、インプットとして、
    ○参照バイオリアクターの受信した現在のCO2オフガス速度(ACO_R-M-ti)、
    ○参照バイオリアクターの受信した現在のpH値(pH_R-ti)、
    ○現在のCO2オフガス速度を受信した時間(ti)での参照バイオリアクターの全ガス流入速度(TGI_R)、および
    ○培地固有関係式(136)
    を使用する、こと
    によって、参照PACO値を計算する工程をさらに含む、請求項15記載の方法。
17. - CO2オフガス速度対時間のプロットで参照PACO値(PACO_R-ti)をプロットすること;
    - プロットされた参照PACO値に曲線をフィットさせることであって、該曲線が参照PACOプロファイルを構成する、こと
    によって、参照バイオリアクター(102)のPACO参照プロファイルを作成する工程をさらに含む、請求項16記載の方法。
18. それぞれの現在の時間(ti)での、それぞれの参照PACO値(PACO_R-ti)の算出が、参照バイオリアクター(102)の受信した現在のCO2オフガス速度(ACO_R-M-ti)およびpH値のそれぞれについて、
    - FCO2_R-EXP-ti[％]=REL-M1(pH_R-ti)に従って参照バイオリアクター(102)の現在のアウトガス体積のCO2オフガス分率予想値FCO2_R-EXP-ti[％]を算出することであって、式中、FCO2_R-EXP-ti[％]は、現在の時間(ti)での、％の単位の参照バイオリアクター(102)の総オフガス体積(TGO_R)に対するCO2オフガス分率予測値であり、予測が、受信した現在のpH値(pH_R-ti)をREL-M1(pH_R-ti)のインプットとして用いることによって計算され、REL-M1は培地(M1)の培地固有関係式(136)であり、pH_R-tiは、時間tiで受信した参照バイオリアクター(102)の培地における現在のpH値である、こと、
    -
    

    

    に従ってCO2オフガス速度予想値ACO_R-EXP-ti[mol/min]を算出することであって、式中、ACO_R-EXP-ti[mol/min]値は、
    

    

    の単位の参照バイオリアクター(102)のCO2オフガス速度予想値であり、TGI_Rは、現在の時間(ti)での参照バイオリアクター(102)のガス流入の総量である、こと、
    - PACO_R-ti=ACO_R-EXP-ti[mol/min]-ACO_R-M-ti[mol/min]に従ってPACO_R-ti[mol/min]値を算出することであって、式中、ACO_R-M-ti[mol/min]は、参照バイオリアクター(102)において時間tiで測定された、
    

    

    の単位のCO2オフガス速度である、こと、
    - PACO_R-ti=ACO_R-EXP-ti[mol/min]-ACO_R-M-ti[mol/min]に従ってPACO_R-ti[mol/min]値を算出すること
    を含む、請求項16または17記載の方法。

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