CN108138111B

CN108138111B - 监测生物反应器中的状态偏差

Info

Publication number: CN108138111B
Application number: CN201680058166.6A
Authority: CN
Inventors: C·克灵格尔; D·艾森克雷特泽尔; K·格雷普迈尔; C·施米德贝格尔
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2015-10-30
Filing date: 2016-10-28
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2036-10-28
Also published as: US20190367854A9; CN108138111A; HRP20220153T1; HK1252112A1; US20180273885A1; PL3368652T3; SI3368652T1; JP2018533936A; US11473042B2; JP7338971B2; WO2017072340A1; ES2906617T3; EP3368652B1; EP3368652A1; JP2022064917A

Abstract

本发明涉及一种用于监测生物反应器(104、106)中的细胞培养物状态与参考生物反应器(102)中的细胞培养物的参考状态的偏差的系统(100)。所述生物反应器包含与所述参考生物反应器相同的培养基(M1)。所述系统包含：■‑存储介质(114)，其包含：■PACO‑参考状态图(116)，其指示在参考生物反应器中测得的CO2排气速率(ACO_R‑M‑ti)与参考生物反应器的预测CO2排气速率(ACO_R‑EXP‑ti)的偏差；■包含当所述培养基与所述气体体积处于pH‑CO2平衡状态并且不含细胞培养物时培养基(M1)的pH值和气体体积中的各自CO2气体分数之间的培养基特异性关系(136)的数据对象；■‑用于接收(212)当前CO2排气速率(ACO_B1‑M‑ti、ACO_B2‑M‑ti)和生物反应器(104、106)的培养基的当前pH值(pH_B1‑ti)的接口(128)；■‑比较单元(130)，其配置成计算(214、216)：■PACO值(PACO_B1‑ti、PACO_B1‑ti)，所述PACO值指示在生物反应器中测得的CO2排气速率(ACO_B1‑M‑ti、ACO_B2‑M‑ti)与生物反应器的预测CO2排气速率(ACO_{B1‑EXP‑ti}、ACO_{B2‑EXP‑ti})的偏差，所述预测CO2排气速率是在不存在细胞培养物的情况下生物反应器中的所述培养基在pH‑CO2平衡状态下的预测排气速率；■计算出的PACO值(PACO_B1‑ti、PACO_B2‑ti)和PACO‑参考状态图(116)中的各自参考PACO值(PACO_R‑ti)之间的差值。比较单元(130)配置成输出(218)计算差值。

Description

监测生物反应器中的状态偏差

发明领域

本发明涉及生物化学工程领域，更特别涉及用于监测生物反应器的系统。

背景和相关技术

生物反应器常用于进行化学工艺，特别是由活生物体以受控方式进行的工艺，例如为了获得化学化合物，特别是特定的肽、蛋白质或其它种类的化学物质。共同的目标是以微生物或细胞能够发挥它们的所需功能并产生有限杂质的方式和/或以时间和成本有效的方式运行生物反应器。生物反应器内的环境条件，如温度、营养素浓度、pH和溶解的气体，以及培养的细胞的参数和生物反应器的参数，如其形状和尺寸，影响生物体的生长和生产力。因此，生物体的生长和生产力取决于许多参数，它们经常相互影响。因此，使所有参数保持恒定以提供用于在生物反应器中培养细胞的指定条件通常是非常困难的任务。此外，对生物反应器中的细胞培养物的生长和代谢具有影响的多个参数的复杂相互依赖性是在另一生物反应器中精确再现参考生物反应器中的物理化学环境的障碍。

例如，WO2007/085880 A1描述了使用多个参数，如含有细菌和营养素的分批/补料分批(fed-batch)发酵单元的肉汤中产物、生物质、糖的浓度在线预测发酵单元的未来性能的方法，由此计算机模型基于当前装置数据预测未来产物浓度。每几个小时提取肉汤样品并在实验室中分析生物质产率。

WO 2007/085880 A1描述了用于在线预测发酵单元的性能，特别是包含细菌和营养素的间歇/补料分批发酵单元的培养液中的产品浓度、生物质、糖等参数的方法。计算机模型根据当前工厂数据预测未来的产品浓度。在批次处理过程中，根据工厂数据在线调整模型参数以减少工厂与模型之间的不匹配。方法发酵罐模型作为PC中的可以连接到工厂控制系统以在实际工厂环境中进行在线部署的软件程序实现。在线性能监测系统对工厂操作人员提前了解该批次的性能、以执行任何所需的纠正措施非常有用。

MICHAEL J.GRAMER等：A semi-empirical mathematical model useful fordescribing the relationship between carbon dioxide.pH,lactate and base in abicarbonate-buffered cell-culture process”,BIOTECHNOLOGY AND APPLIEDCHEMISTRY，第47卷第4期，2007年三月15日(2007-03-15),XP055270826,US ISSN:0885-4513,DOI:10.1042/BA20070001描述了一项研究，其目的在于开发在碳酸氢盐缓冲介质中实现pH控制的状态的主要因素之间的定量关系。

但是，通常不可能用完全相同的用于运行参考生物反应器的参数运行特定生物反应器，并且在这种情况下，所述特定生物反应器中的细胞培养物状态与参考生物反应器中的参考细胞培养物的“所需”状态的比较是困难或易错或甚至不可能的。

概述

本发明的一个目标是提供用于监测如独立权利要求中规定的生物反应器的改进的系统和方法。在从属权利要求中提供本发明的实施方案。如果它们没有互相排斥，本发明的实施方案可以互相自由组合。

本文所用的“生物反应器”是在其中进行涉及生物体或衍生自此类生物体的生物化学活性物质的化学工艺的容器。这种工艺可以是例如需氧或厌氧的。存在许多不同的生物反应器类型，它们的形状(例如圆柱形或其它)、尺寸(例如毫升、升至立方米)和材料(不锈钢、玻璃、塑料等)不同。根据实施方案，该生物反应器适用于在细胞培养物中培养细胞或组织。根据实施方案和/或根据运行模式，生物反应器可以是分批生物反应器、补料分批生物反应器或连续生物反应器(例如连续搅拌釜反应器模型)。连续生物反应器的一个实例是化学稳定器。

在一个方面中，本发明涉及一种用于监测生物反应器中的细胞培养物状态与参考生物反应器中的细胞培养物的参考状态的偏差的系统。所述生物反应器包含与参考生物反应器相同的培养基。所述系统包含：

-存储介质，其包含：

■PACO-参考状态图(PACO-reference profile)，所述PACO-参考状态图代表参考PACO值相对于时间的变化，所述PACO-参考状态图指示在参考生物反应器中测得的CO2排气速率与参考生物反应器的预测CO2排气速率的偏差，所述预测CO2排气速率是在不存在细胞培养物的情况下和在平衡状态下的培养基的pH值等于在测量参考生物反应器中的CO2排气速率时测得的参考生物反应器的pH值的条件下参考生物反应器中的所述培养基在pH-CO2平衡状态下的预测排气速率，所述PACO参考状态图依赖于在培养细胞培养物时由参考生物反应器中的细胞培养物的细胞产生的CO2排气的量；

■包含培养基特异性关系(medium-specific relation)的数据对象，所述培养基特异性关系是所述培养基特有的并指示当所述培养基与所述气体体积处于pH-CO2平衡状态并且不含细胞培养物时所述培养基的pH值和气体体积中的各自CO2气体分数之间的关系；

-用于在当前时间下反复接收在生物反应器中的细胞培养物的培养过程中测得的生物反应器的当前CO2排气速率和生物反应器的培养基的当前pH值的接口；

-比较单元，其配置成对于各接收的当前CO2排气速率，计算：

■PACO值，所述PACO值指示在生物反应器中测得的CO2排气速率与生物反应器的预测CO2排气速率的偏差，所述预测CO2排气速率是在不存在细胞培养物的情况下和在平衡状态下的培养基的pH值等于在测量生物反应器中的CO2排气速率时测得的生物反应器的pH值的条件下生物反应器中的所述培养基在pH-CO2平衡状态下的预测排气速率，所述PACO值依赖于在培养细胞培养物的同时由生物反应器中的细胞培养物的细胞产生的CO2排气的量，使用下列这些作为输入计算PACO值：

о接收的当前CO2排气速率；

о接收的当前pH值；

о在接收当前CO2排气速率时生物反应器的总气体流入速率；和

о所述培养基特异性关系；

■在生物反应器的培养基体积不同于参考生物反应器的培养基体积的实施方案中，可以另外使用生物反应器中的培养基或细胞悬液的重量或体积作为充当归一化因子的输入参数(用于计算归一化PACO(“NPACO”)值)；

■计算出的PACO值和PACO-参考状态图中的各自参考PACO值之间的差值。

所述比较单元配置成输出计算差值，所述计算差值指示生物反应器中的细胞培养物的状态与参考状态的偏差。

所述特征由于许多原因是有利的：

该PACO值包含在参考生物反应器中在特定pH值下测得的CO2排气速率(同时或过去)与对包含所述特定培养基的参考生物反应器预期(预测)的CO2排气速率的偏差的“知识”，据此该预测假定参考生物反应器中的培养基在pH-CO2平衡下并且不包含细胞培养物或可影响所述培养基的pH-CO2平衡的任何其它因素。

因此，该PACO值是反映由对所述培养基的pH-CO2平衡具有成因性影响的任何因素造成的测得的CO2排气速率与预期(“预测”)CO2排气速率的任何偏离的“综合”参数值。PACO值不区分所述成因性影响是否涉及细胞代谢和/或温度或压力的改变和/或通过提高或降低影响pH-CO2平衡状态的流体或气体的流量。因此，PACO值可从对细胞培养物的培养条件具有影响并因此也对pH-CO2平衡状态和对生物反应器的气体体积和排气中的CO2浓度具有影响的许多独立参数的影响中抽提出来。在给定pH值下，PACO通常在需氧细胞代谢提高和/或在需氧条件下的细胞培养物生长的情况下提高。如果培养基的pH显著降低，PACO通常降低。这种情况可能由于细胞代谢而发生，例如如果细胞的CO2生成以及分泌的代谢物如乳酸盐过度补偿经排气线路和管道从生物反应器中除去CO2。

因此，PACO值可能比一组多个参数值(独立测得的温度、压力、CO2压力、pH值)更精确反映影响细胞培养物的生长条件的生物反应器的“整体系统状态”。因此，观察到PACO值可用作比同时但逐一考虑的一组多个生物反应器参数更精确的生物反应器的状态和/或生物反应器中的细胞培养物的状态的指示。

PACO值可改进比较生物反应器或所述生物反应器中的细胞培养物的状态与参考生物反应器中的参考细胞培养物的(“所需”)状态的任务和使之更容易并因此甚至在一种或多种影响细胞生长的参数，例如这两种比较的生物反应器的尺寸、维度和/或搅拌机制显著不同的情况下也能够比较两种细胞培养物的状态。因此，可通过监测在“已知”提供用于为特定目的(肽或蛋白质分离等)的培养特定细胞培养物的极好或最佳条件的控制参数下的参考生物反应器获得PACO参考状态图。这一状态图可用作PACO参考状态图并因此用作特定类型的细胞培养项目的某种标准或“目标”。当在另一生物反应器中尝试为相同目的或“项目”(例如获得大量在参考生物反应器中获得的相同物质)培养细胞培养物时，反复计算所述另一生物反应器中的PACO值以允许精确比较在相应时间点(例如用细胞培养物接种生物反应器后1小时、5小时、10小时或在在生物反应器和参考生物反应器平行并大致同步运行的情况下各当前时刻)所述另一生物反应器的细胞培养物状态与参考生物反应器中的细胞培养物状态。大致同步运行生物反应器和参考生物反应器可意味着从参考生物反应器连续接收参考PACO状态图的参考PACO值，并将生物反应器的各当前测定的PACO值与最新的参考PACO值比较。通过连续比较当前PACO值和当前参考PACO值和通过以使PACO差异最小化的方式控制生物反应器值的运行，可实现生物反应器和参考生物反应器的大致同步运行。

这种比较方法比逐一比较多个参数(温度、pH、培养基中的细胞密度、CO2排气速率等)更精确，因为通常，所述参数不完全相同。特别地，在借助离线测量(常用于许多生物反应器类型)测定一个或多个所述参数的情况下，例如由与生物反应器的培养基中的温度相比进行测量的样品中的温度差异造成的测量误差常使所述测量有缺陷。此外，由测定样品中的所述参数值之前的取样过程造成的延迟可能妨碍防止生物反应器的状态参数与参考参数值的任何偏差的即时手段。

由于监测的生物反应器中的参数与参考生物反应器中的各自参数的各个差异可能相互增强或可能相互抵消，根据具体情况，监测的生物反应器的参数与参考生物反应器的参数的逐一比较不精确得多，因为它们没有提示所述参数如何互相影响。例如，提高的温度可能降低CO2在培养基中的溶解度并因此提高CO2排气速率，但也可能提高细胞生长和因此使得细胞生成的CO2的量增加。降低温度也提高pH，这又影响PACO(直接或通过触发对抗降低的pH值的控制器响应，例如通过提高CO2流入速率)。细胞的(温度依赖性)代谢又可能影响培养基的pH，例如通过分泌碱性或酸性物质，如乳酸盐。培养基的pH值又可能影响溶解在培养基中的CO2的量。但是，PACO值整合了影响培养基的pH-CO2平衡的参数的相互依赖性和包含关于所述培养基的pH值对所述培养基的pH-CO2平衡的影响的信息。

申请人已经意外地观察到，仅包含当前CO2排气速率、当前pH值、在接收当前CO2排气速率时生物反应器的总气体流入速率和培养基特异性关系的最小输入数据集足以精确比较两个生物反应器和各自的细胞培养物的状态。由于所有所述输入数据值可以以在线测量值的形式获得，不再必须为比较状态而提取样品(这可能导致生物反应器的污染或导致生成不精确的测量值——归因于取样效应，如温度损失、由于与环境空气的气体交换造成的样品中的pH变化等)。

在另一有益方面中，本发明的实施方案能够比较在具有不同尺寸或形状的生物反应器中培养的细胞培养物的状态。因此，PACO参考状态图也可用于将在参考生物反应器中优化或检查的生物化学工艺扩大规模或缩小规模至具有不同尺寸和维度的生物反应器。

在另一方面中，使用CO2排气速率作为用于计算当前PACO值的输入值可能是有益的，因为CO2排气计(“CO2排气分析仪”)是非侵入性的，不需要取样，容易实时获得并传送数值，CO2排气速率(或可推导出CO2排气速率的排气中的CO2浓度)，其可能整合了细胞特异性参数(细胞排放的CO2)和工程参数(总气体流入速率、当前pH、压力、温度、搅拌速率、搅拌配置、气泡尺寸和分布等)。因此，CO2排气分析仪可对预期或意外的工艺变化(而非例如细胞密度或细胞数)作出即时响应。

因此，计算用于生成PACO参考状态图的参考反应器的PACO值和将监测和/或控制的生物反应器的动态获得的PACO值与各自的参考PACO值比较能够识别监测的生物反应器中的条件是否构成与参考生物反应器提供的环境基本类似或相同的用于培养细胞的“环境”。

在许多生物反应器类型中，经由一个或多个浸没式进气口将流入气体供入(作为气体混合物或经由分开的开口)生物反应器。在该生物反应器包含附加顶空曝气的情况下，必须配置所述“顶空”流入气体分数的流入速率和/或培养基上方的气相的空气循环以使经由顶空曝气供入生物反应器的所有气体在离开生物反应器之前达到与生物反应器的培养基的pH-CO2平衡。在顶空曝气是生物反应器的唯一曝气机制的情况下，必须配置所述“顶空”流入气体分数的流入速率以使供入生物反应器的所有气体在离开生物反应器之前达到与生物反应器的培养基的pH-CO2平衡。

或者(例如在无法及时达到顶空曝气气体与培养基的pH-CO2平衡的情况下)，在测量生物反应器中的CO2排气速率之前切断该附加顶空曝气。这可避免计算由该附加顶空曝气(其可能导致CO2排气浓度不同于培养基的当前pH-CO2平衡CO2浓度)造成的错误PACO值。

根据实施方案，至少在用细胞培养物接种参考生物反应器或生物反应器时，参考生物反应器和使用获自所述参考生物反应器的PACO参考状态图监测和/或控制的各生物反应器的温度和压力与用于经验测定培养基特异性关系的培养基的压力和温度相同。在细胞培养物的稍后培养阶段，监测和/或控制的生物反应器的温度和/或压力可能不同于在接种过程中使用的温度和/或压力并且可能甚至不同于在参考PACO状态图中的相应时间点参考生物反应器的温度和/或压力。

根据实施方案，接收的当前CO2排气速率、接收的当前pH值、生物反应器在特定时间ti(t0、t1、…、tmax)的总气体流入速率和培养基特异性关系是用于计算监测的生物反应器的PACO值的仅有输入参数。在参考生物反应器的培养基体积不同于监测和/或控制的生物反应器的培养基体积的实施方案中，可另外使用生物反应器中的培养基的体积或质量作为用于计算生物反应器的PACO值的输入值。在这种情况下，参考PACO状态图的计算包括另外使用参考生物反应器中的培养基的体积或质量作为用于计算参考生物反应器的参考PACO值的输入值。参数“i”可代表自接种以来或自接种前的预定时间间隔以来经过的预定分钟或小时数。例如，当前pH值可用作培养基特异性关系的输入值以在生物反应器中的培养基与培养基上方的气体体积处于pH-CO2平衡状态并且不包含任何影响pH-CO2平衡的细胞或其它因素的假设下计算在所述pH值下监测的生物反应器的排气中的预期CO2分数。生物反应器的CO2排气的计算CO2体积分数与生物反应器中的培养基上方的气体体积的CO2分压相关联，据此CO2分压依赖于培养基中的pH值并可通过根据Henderson-Hasselbalch方程的pH-CO2化学平衡表征。计算出的预计/预期CO2体积分数和测得的总气体流入速率(其与总排气速率相同)可用于计算生物反应器的预期CO2排气速率。

可容易地测量pH值和排气中的CO2体积分数(“CO2浓度”)而不用从包含细胞培养物的培养基中取样，因此没有生物反应器被不想要的真菌和细菌感染的风险。此外，不同于生物反应器的样品中的离线pH测量，测量排气中的CO2体积分数是一种在线测量。因此，可避免由直至可测定测量值的取样过程所需的时间造成的任何时间偏移效应。离线测量中的偏移效应可能降低以密切追随参考生物反应器的状态状态图的方式控制受控生物反应器的状态的精确度。总气体流入速率与生物反应器的总排气速率基本相同并且是预定的或可容易地确定的并与排气中的测得CO2体积分数结合用于测定当前测得的CO2排气速率。

在另一有益方面中，许多现有生物反应器系统已包含或容易与排气中的CO2浓度和/或当前CO2排气速率、总气体流入速率和/或生物反应器的培养基中的当前pH值的传感器耦合。因此，该方法容易在各种现有生物反应器和生物反应器监测和/或控制框架中实施而不必安装附加传感器或其它硬件模块。

在另一有益方面中，PACO值提供生物反应器的生化环境中的变化的即时指示。细胞数、粒子测量、代谢物测量和所有种类的离线测量(即在从生产模式中的生物反应器中提取的生物反应器的培养基样品上进行的测量)并非如此。通过使用由培养基特异性关系、当前测得的CO2排气速率和当前测得的pH值导出的PACO值，尽管探针漂移(改变培养基中溶解的CO2量、培养基的pH值改变)，仍可实现生物反应器可比较性。此外，可以进行优异的真实性检查。

使用CO2排气速率作为输入值的另一有益方面在于排气分析仪可以随时校准并且不必高压灭菌。

在另一有益方面中，专门对生物反应器中所用(和参考生物反应器中所用)的培养基计算PACO值，因此包含关于pH和排气二氧化碳之间的相关性的知识。这意味着PACO不仅受改变pH影响，还受所述培养基在特定pH值下的典型CO2排气速率影响。这使得PACO完美适用于解决不仅由生物反应器配置造成，还由培养基的pH值变化造成的CO2排气差异。

在另一有益方面中，PACO值可用于比较在所有曝气模式(可变和恒定)下和/或在监测的生物反应器的温度或压力不同于参考生物反应器的温度和/或压力的情况下不同生物反应器的状态

根据实施方案，生物反应器的控制模块仅通过改变CO2流入速率改变生物反应器中的pH值。这具有不通过任何附加酸性或碱性物质改变培养基的组成的优点(只有溶解的CO2及其离解产物的浓度随CO2气体浓度改变而变)。

根据实施方案，该方法包括以使pH值保持在容许pH值的预定范围，也称作“pH死区”内的方式控制生物反应器中的培养基的pH值。例如，容许pH值的范围可以在一些实施方案中是[6.8-7.2]，或在另一些实施方案中是[6.95-7.05]。在培养基的pH值低于最低容许pH值或高于最高容许pH值的情况下，生物反应器的控制器-无论生物反应器的当前PACO值如何-作出适当动作以使培养基中的pH值移动到容许范围内，例如通过改变CO2流入量。只要生物反应器的培养基的pH值在容许pH范围内，该控制器仅依赖于当前PACO值与相应的参考PACO值的测定偏差改变pH值。

这可具有实现生物反应器的培养基中的pH值的更平稳和更细粒度控制并与生物反应器的pH值的纯“pH死区”/阈值基控制相比可降低培养基中的pH值波动的优点。

根据实施方案，该培养基特异性关系是通过数学拟合生物反应器和参考生物反应器中所用的培养基样品的pH值和在所述样品上方的气体体积中各自测得的CO2气体分数的多个凭经验确定的对(pair)获得的方程FCO2_M1(pH)＝REL-M1(pH)。该样品可以是例如生物反应器中的整个无细胞培养基或所述培养基的无细胞等分试样。

FCO2_M1-EXP(pH)是在所述培养基具有给定pH值并与所述气体体积处于pH-CO2平衡状态并且不含细胞培养物时培养基样品的气体体积中的预测CO2气体分数(“预测CO2浓度”)。FCO2_M1-M是与培养基M1处于CO2-pH平衡状态的气体体积中，例如包含培养基M1的生物反应器的排气中的测得CO2气体分数(“测得CO2浓度”)。

“PACO值”是数据值。如上文规定，PACO值是指示在生物反应器中测得的CO2排气速率与生物反应器的预测CO2排气速率的偏差的数据值。预测CO2排气速率是在不存在细胞培养物的情况下和在平衡状态下的培养基的pH值等于在测量生物反应器中的CO2排气速率时测得的生物反应器的pH值的条件下生物反应器中的所述培养基在pH-CO2平衡状态下的预测排气速率。PACO值依赖于在培养细胞培养物的同时由生物反应器中的细胞培养物的细胞产生的CO2排气的量。PACO值的计算优先仅使用下列数据作为输入：当前CO2排气速率和当前pH值和在接收(测量)当前CO2排气速率时生物反应器的总气体流入速率。此外，使用培养基特异性关系作为输入。

根据实施方案，为计算PACO值(“PACO_B1-ti“、“PACO_B2-ti“)配置用于监测和/或比较生物反应器状态的系统。PACO值的计算包含：

-将接收的当前pH值输入培养基特异性关系以获得在测量当前CO2排气速率和当前pH值时与培养基处于平衡状态的生物反应器气体体积中的预测CO2浓度(“FCO2_EXP“，例如生物反应器B1的FCO2_M1-M或生物反应器B2的FCO2_M2-M)；

-将预测CO2浓度(“FCO2_EXP“)乘以生物反应器的总气体流入速率以获得生物反应器的预测CO2排气速率(“ACO_EXP“)；预测CO2排气速率是在不存在细胞培养物的情况下和在平衡状态下的培养基的pH值等于输入该培养基特异性关系的生物反应器的接收、测得的当前pH值的条件下所述培养基actor在pH-CO2平衡状态下的预测排气速率；

-从生物反应器的预测CO2排气速率(“ACO_MEASURED“，例如ACO_B1-EXP-ti、ACO_B2-EXP-ti)中减去生物反应器的测得CO2排气速率(ACO_B1-M-ti、ACO_B2-M-ti)以作为测得和预期CO2排气速率的差值获得PACO值。

PACO值依赖于在培养细胞培养物的同时由生物反应器中的细胞培养物的细胞产生的CO2排气的量并代表也依赖于当前pH值和凭经验推导出的关于所用特定培养基pH和平衡CO2浓度之间的相互依赖性的知识的“综合”参数。

根据实施方案，生物反应器B1在当前时间(ti)的预测CO2排气速率ACO_B1-EXP-ti的计算如下进行：

其中TGI_B1是生物反应器B1在当前时间(ti)的气体流入总量，且其中FCO2_B1-EXP-ti是在测量当前CO2排气速率和当前pH值时与培养基处于平衡状态的生物反应器的气体体积中的预测CO2浓度，以％计。

上文提到的PACO值的计算在一些实施方案中假设CO2的摩尔数及其体积之间的关系为理想气体的关系。其它实施方案也可能包含用于补偿当前监测的生物反应器的温度和/或压力对CO2的摩尔体积的影响、用于补偿测量误差、湿度和/或其它潜在误差来源的附加计算步骤。

根据实施方案，上文提到的计算步骤类似于用于计算参考PACO值和用于生成参考PACO状态图的参考生物反应器进行。

本文所用的“培养基特异性关系”是预测与特定(无细胞)培养基处于pH-CO2平衡状态的气体体积中的CO2浓度的函数，例如方程，所述培养基具有给定pH值。该函数凭经验对所述特定培养基获得并适用于预测在作为输入提供的许多不同pH值下的CO2排气速率。

“培养基(medium)”，也称作“生长培养基(growth medium)”或“培养介体(culturemedium)”，是旨在支持微生物或细胞生长的液体。许多不同类型的培养基用于生长不同类型的细胞。存在使用衍生自植物或动物的特定细胞类型的用于细胞培养的培养基，和用于生长微生物，如细菌或真菌的用于微生物培养的培养基。由于复杂的营养要求，一些生物体需要专用环境。例如，该培养基可由基本不含任何其它组分的包含碳酸氢钠或碳酸钙的水构成。同样地，该培养基可以是包含附加组分，如营养素、生长因子、激素或其它蛋白质等的“丰富培养基”。例如，该培养基可以是营养培养基、基本培养基、鉴别培养基或加富培养基。

“FCO2值”是一种数据值。“ACO值”是一种数据值。在本文中对本发明的各种实施方案描述了各数据值的含义和计算。“FCO2”或“CO2[％]”，也称作“CO2浓度”，是气体体积中，例如生物反应器的排气中的“CO2气体分数”。

“状态图(profile)”是指示随时间经过的参数值变化的一组数据值或数学关系。参数值可以是例如PACO值、排气中的CO2浓度(“CO2分数”或“FCO2”)、CO2排气速率(“ACO值”)或获自生物反应器的pH值。

ACO值的预测专门针对参考生物反应器和与参考生物反应器比较的生物反应器中所用的培养基。

“pH”值是用于指定在不存在细胞培养物的情况下在pH-CO2平衡状态下的培养基M1的pH值的输入参数值。

“REL-M1”是通过运算符(operator)连接的一个或多个参数的集合。

这些参数如下获得：

-将不含细胞培养物的培养基样品调节至多个不同的pH值，由此使该样品达到与气体体积的pH-CO2平衡，

-测定与样品中的培养基处于pH-CO2平衡下的各自气体体积中的CO2气体分数，

-对照样品的各自平衡pH值对测定的CO2气体分数作图，

-在作图值中拟合曲线和

-由拟合曲线推导培养基特异性关系的参数。

因此，可以例如在用参考细胞培养物接种参考生物反应器之前凭经验确定培养基特异性关系。根据实施方案，也可以在参考生物反应器中培养和生长细胞培养物后凭经验确定培养基特异性关系。但是，在这种情况下，必须监测和储存pH值、总气体流入速率和参考生物反应器的排气中的CO2分数以一凭经验确定培养基特异性关系就能够计算所述参考生物反应器的PACO参考状态图。

根据一些实施方案，通过用培养基填充生物反应器，例如参考生物反应器(据此该培养基不含细胞培养物细胞)并将参考生物反应器的温度和压力设定至预定值，例如20℃和标准大气压而获得培养基特异性关系。然后，可以将该培养基设定为不同pH值，例如通过经由改变的CO2气体流入速率提高或降低培养基上方的气体体积中的CO2浓度并在一段时间(通常数分钟或数小时)后在培养基已平衡(达到在给定pH和预定温度和压力下的pH-CO2平衡状态)时，测量所述培养基上方的气体体积中的CO2浓度(其与在所述平衡状态下的CO2分压相关联)。例如通过分析培养基上方的气体体积中的CO2浓度或经由排气中的CO2体积分数进行所述测量。将获取的在样品(生物反应器或等分试样)中测得的平衡pH值和CO2浓度(或CO2排气值)的对作图，即呈现在坐标系中。可以通过计算机系统自动进行该作图，其可另外以纸基打印输出和/或显示在计算机屏幕上的曲线图的形式输出该曲线图。也可以手动进行该作图。将曲线自动或手动拟合至所述曲线图并计算描述所述拟合曲线的参数。这些参数确定当所述培养基在特定pH值下处于pH-CO2平衡时pH值和所述培养基上方的气体体积的CO2浓度的培养基特异性关系。在已计算这些参数后，可以将参考生物反应器中的培养基设定至所需pH值，可以用细胞培养基接种并可监测(关于培养基中的当前pH值、当前CO2排气速率和当前总气体流入速率)以获得PACO参考状态图。这一方法的优点在于有可能不用额外设备凭经验确定培养基特异性关系并且该培养基可用于获得所述关系和用于培养细胞。

根据另一些实施方案，通过制造所述培养基的等分试样形式的多个样品，各样品具有不同pH值，获得培养基特异性关系。使样品在预定温度和压力下保持一段时间(例如数分钟或数小时)以实现各样品中的气体和液体培养基之间的pH-CO2平衡。

可以例如通过改变单个样品的pH值和随后进行测量而随后获得样品，或可以通过平行制造所述培养基的多个样品(通过改变培养基上方的气体体积的CO2浓度而将各等分试样设定为不同pH值)而获得样品。可以将样品填充到能够设定和测量当前pH值和能够改变CO2浓度和测量在平衡状态下的CO2浓度或CO2排气速率的任何容器中。

根据一些实施方案，方程FCO2_M1(pH)＝REL-M1(pH)是根据FCO2_M1(pH)[％]＝a1xpH+a2的线性方程。在这种情况下，参数a1和a2是由该拟合曲线推导出的参数。单位[％]涉及在pH-CO2平衡状态下样品中的培养基上方的气体体积的CO2气体分数。

根据另一些实施方案，方程FCO2_M1(pH)＝REL-M1(pH)是根据FCO2_M1(pH)[％]＝b1xpH²+b2x pH+b3的多项式方程。在这种情况下，参数b1、b2和b3是由该拟合曲线推导出的参数。

凭经验确定培养基特异性关系和相应的培养基特异性参数可具有这样的有益作用，即甚至在培养基的确切组成未知的情况下(这通常是市场中的许多培养基的情况)，可以实验确定特定pH值对与所述培养基处于pH-CO2平衡下的空气体积中的平衡CO2浓度。因此，在使用组成未知的培养基时也可以计算PACO值。

根据优选实施方案，生物反应器的细胞培养物包含与在参考生物反应器中培养的细胞培养物相同或非常类似类型的细胞。不同细胞类型，例如细菌和酵母的代谢和生长状态图通常不可比较。例如，该细胞可以是真核细胞(eukaryotic cell)，例如酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞，特别是人类细胞。根据另一些实施方案，该细胞可以是细菌或古细菌细胞(archaea cell)。

根据实施方案，在计算出的PACO值和PACO-参考状态图中的各自参考PACO值之间的计算差值超过阈值的情况下，该计算差值的输出包含自动输出警报信号。该警报信号可以是例如声和/或光信号、传输至用户设备(例如计算机或手机)或自动化生物反应器控制单元的信息。该信息可经网络，例如互联网或局域网传输。

所述特征允许用户手动采取行动以修改生物反应器或其中包含的培养基的参数以使与参考PACO值的差值最小化和/或允许自动化控制单元自动执行预计降低比较的PACO值的差值的动作。

根据实施方案，参考生物反应器中和监测和/或控制的生物反应器中所用的培养基是碳酸盐缓冲培养基。

最广义地说，任何能够溶解至少少量CO2的溶液是碳酸盐缓冲培养基，因为溶解的CO2会根据下列pH-CO2平衡方程：CO₂+H₂O→HCO₃ ^-+H⁺离解成HCO3-和H+离子。

根据实施方案，“碳酸盐缓冲培养基”是每升培养基包含至少10mMol碳酸盐的培养基，据此该培养基是无细胞培养基(细胞代谢可能改变pH值和因此培养基中的碳酸盐量)。该碳酸盐可以是例如碳酸氢钠或碳酸钙。

使用缓冲培养基具有降低pH波动的优点，特别是在6-8的生物pH范围内。

碳酸盐缓冲液的缺点在于在pH-CO2平衡下的pH值依赖于空气中的二氧化碳分压和在培养基中稍后由细胞生成的CO量，并且CO2具有有限溶解度。因此，根据现有技术状况的方法在生物反应器中使用碳酸盐缓冲液通常妨碍在包含碳酸盐缓冲培养基的生物反应器中在不同温度和/或压力条件下培养的细胞培养物的状态的精确比较。与生物反应器的PACO基状态比较结合使用碳酸盐缓冲培养基具有有益作用，即可以使用其缓冲液不像例如磷酸盐缓冲液那样强地干扰细胞代谢但仍能够比较在不同温度和/或压力下运行的生物反应器的培养基。甚至在该缓冲液的碳酸盐干扰细胞代谢的情况下，该PACO值也整合了所述效应并仍能够精确比较和/或同步生物反应器状态。

根据实施方案，参考生物反应器与生物反应器的区别在于一个或多个下列特征：

a)生物反应器中的气体体积，

b)生物反应器中的培养基体积，

c)生物反应器的雷诺数，

d)生物反应器的牛顿数(Newton number)，

e)生物反应器的尺寸(例如高度与直径之比)，

f)生物反应器和/或生物反应器挡板的几何特征(例如生物反应器的圆柱形或多边形、挡板和生物反应器内的其它组件如传感器、泵、搅拌器等的尺寸、形状、取向和位置)，

g)搅拌器配置(例如生物反应器中的搅拌器的尺寸、取向和形状、搅拌间隔、搅拌间隔的持续时间、搅拌单元的数量和相对取向)，

h)搅拌速率，

i)生物反应器的氧气体积传质系数(kLa)，

j)总气体流入速率和/或O2流入速率和/或N2流入速率和/或CO2流入速率，

k)功率输入，

l)生物反应器中的压力，

m)培养基中的气泡保持时间，

n)培养基中的气泡尺寸和分布，

o)表面速度(可以米/秒[m/s]表示并可代表轴和生物反应器中的培养基的支座(bearing)之间的相对速度)，

p)作为一个或多个参数a)-o)的导数计算的参数。

本文所用的“功率输入”参数规定生物反应器的搅拌器的功率输入量。不同的搅拌器配置可在相同搅动或相同梢速下具有不同功率输入。在相同搅拌器速度下的功率输入可能依赖于培养基的粘度。

因此，本发明的实施方案甚至在两个比较的生物反应器在许多不同的工程参数方面不同的情况下也能够比较生物反应器的状态与另一(“参考”)生物反应器的状态。这非常有利，因为已经观察到，使所有所述参数保持相同以比较和/或控制生物反应器状态通常在实践中不可行。通过使用PACO值，甚至在这两个生物反应器具有不同雷诺数和/或牛顿数、具有搅拌器的不同速度或配置等的情况下也可容易地比较两个生物反应器的状态(相同PACO值意味着关于相关参数的相同状态)。

根据实施方案，通过使用曝气速率作为用于对抗生物反应器的当前PACO值与参考PACO值的偏差的控制参数运行该监测和/或控制的生物反应器。

令人惊讶地观察到，在使用曝气速率作为控制参数以对抗PACO值与所需参考PACO值的任何偏差的情况下，PACO值在两个生物反应器之间存在压力差(在运行生物反应器时常遇到的范围内，例如由气候诱发的大气压变化造成的压力变化)的情况下也能够比较生物反应器的状态。一般而言，压力影响培养基的pH-CO2平衡。在pH值保持恒定的同时，升高的压力导致CO2排气速率降低。实际上，在压力升高的情况下，PACO值降低。为补偿压力上升的效应，根据实施方案使用控制器单元，其自动降低曝气速率(例如以vvm＝气体体积流量/单位液体培养基体积/分钟测得)直至PACO差值等于所需参考PACO值或已达到0或已达到预定最小曝气速率(确保用足量氧气补充细胞)。通过降低曝气速率，也降低CO2排气速率且PACO提高。因此，通过使用曝气速率作为控制参数，容易补偿压力偏差并可使用PACO作为生物反应器及其细胞培养物的可靠状态指标。

根据一些实施方案，参考生物反应器和生物反应器位于不同地理区，例如不同建筑物、城市或国家。在一个有益方面中，PACO值的比较能够精确比较在一个或多个上述参数彼此不同的生物反应器中(相继或平行)培养的细胞培养物的状态。因此，本发明的实施方案能够使具有与参考生物反应器完全不同的尺寸并在许多方面偏离参考生物反应器的生物反应器中的细胞培养物获得出色表现(grooving)。

优选地，监测和/或控制的生物反应器和参考生物反应器在状态图中的各自时间ti的CO2气体流入速率相同以允许在这两个生物反应器中建立可比较的动态pH-CO2平衡。

在另一有益方面中，降低成本并提高灵活性：之前，为了在特定生物反应器中在与参考反应器中观察到的类似或相同的条件下培养细胞，通常必须确保生物反应器的尺寸、形状、搅拌机制和多个其它特征与参考生物反应器相同以确保特定生物反应器的各个参数尽可能类似于参考生物反应器。这提高成本，因为如果它们的尺寸、生物反应器类型和/或所述生物反应器或其一些部件的版本不同于参考参数的各自特征，可得的生物反应器不能使用。通常，在不同国家存在阀和其它生物反应器元件的不同标准和规范。因此，在若干情况下实际上不可能运行其尺寸和/或组件与参考生物反应器相同的生物反应器，以致不同国家的生物反应器的比较困难或不可能。通过使用如上所述的PACO参考值，观察到在尺寸或形状或影响培养基的pH-CO2平衡并因此影响所述培养基中的细胞生长的任何其它特征方面的差异达到平衡并且甚至在两个比较的生物反应器或它们的组件显著不同的情况下也有可能精确比较细胞培养物状态。

根据实施方案，监测和/或控制的生物反应器在当前时间的PACO值的计算包括对于监测和/或控制的生物反应器的各接收的当前CO2排气速率和pH值，计算：

-根据：FCO2_B1-EXP-ti＝REL-M1(pH_B1-ti)的生物反应器(104)的当前排气体积的预期CO2排气分数FCO2_B1-EXP-ti，其中FCO2_B1-EXP-ti是在当前时间(ti)以％计的生物反应器(104)的总排气体积(TGO_B1)的预测CO2排气分数，使用接收的当前pH值(pH_B1-ti)作为用于REL-M1(pH_B1-ti)的输入值计算该预测，其中REL-M1是培养基(M1)的培养基特异性关系(136)，其中pH_B1-ti是在时间ti在生物反应器(104、106)的培养基中接收的当前pH值；因此，在生物反应器的培养基不含细胞培养物、具有用作培养基特异性关系的输入值的pH值并与生物反应器中在所述培养基上方的气相处于pH-CO2平衡状态并因此也与所述生物反应器的总排气体积平衡的假设下计算生物反应器中的预期CO2排气分数；

-根据：

的预期CO2排气速率ACO_B1-EXP-ti[mol/min]值，其中ACO_B1-EXP-ti值是当生物反应器的培养基具有当前测得的pH值并与所述培养基上方的气相处于pH-CO2平衡时生物反应器(104)的预期CO2排气速率，其中TGI_B1是生物反应器(104)在当前时间(ti)的气体流入总量；生物反应器的气体流入总量与气体流出总量大致相等；

-根据：PACO_B1-ti＝ACO_B1-EXP-ti-ACO_B1-M-ti的PACO_B1-ti值，其中ACO_B1-M-ti是在生物反应器中在时间ti测得的CO2排气速率。

根据实施方案，参考生物反应器中的培养基具有第一体积和第一总质量。监测和/或控制的生物反应器中的培养基具有第二体积和第二总质量。第一体积和第二体积彼此不同。相应地，第一质量和第二质量彼此不同。每一计算出的PACO值及其在PACO-参考状态图中的各自参考PACO值之间的差值的计算包括：

-通过处理器将计算出的PACO值除以第二体积；和通过处理器将PACO-参考状态图中的各自参考PACO值除以第一体积；或

-通过处理器将计算出的PACO值除以第二质量；和通过处理器将PACO-参考状态图中的各自参考PACO值除以第一质量。

所述特征可以是有利的，因为它们能够比较在各自包含不同体积培养基的生物反应器中培养的细胞培养物的状态。例如，参考生物反应器可以是包含100升培养基的试验生物反应器。参考生物反应器可用于确定适用于有效培养细胞培养物，例如用于提纯特定肽的参数(温度、压力、进料速率、O2流入速率、pH、搅拌速率等)。因此，参考反应器可在不同条件下多次使用以找出用于在参考生物反应器中培养细胞的最佳参数。在已确定参考生物反应器的“最佳”或“合适”参数组后，在参考反应器中在所述“最佳”参数组下培养至少一种细胞培养物。在所述“最佳”或“合适”条件下培养细胞培养物的同时从参考反应器获得参考PACO状态图。

在“生产模式”(其通常在试验模式之后)中，在更大的生物反应器或甚至在平行运行的多个更大的生物反应器中大规模培养细胞培养物(“生产模式”)。由于生物反应器的尺寸和任选其它参数，如搅拌配置(steering configuration)、O2流入速率和/或更大生物反应器的其它参数可能不同于参考生物反应器，使用以上述体积依赖性方式计算出的PACO参考状态图甚至在尺寸明显不同的生物反应器中培养细胞培养物的情况下也能够精确比较细胞培养物状态。例如，一些参数，如搅拌速率、搅拌配置等可能是参考生物反应器特有的并且在应该以更大规模生长细胞培养物的另一生物反应器中不可再现。根据另一实例，用于生产用途的生物反应器中的培养基体积可以比参考生物反应器中的培养基体积大10倍、100倍或甚至大于1000倍。因此，本发明的实施方案能够在大规模差异上精确扩大细胞培养物的培养规模。类似地，通过用不同培养基体积或培养基质量标准化PACO值和参考PACO值，本发明的实施方案能够在大规模差异上缩小细胞培养物的培养规模。

根据实施方案，该PACO参考状态图覆盖运行参考生物反应器的多个阶段。这些阶段包含：

-无进料阶段，在此期间在参考生物反应器中在不进料的情况下培养细胞培养物；

-进料阶段，在此期间在参考生物反应器中在给定进料速率存在下培养细胞培养物，所述细胞培养物不分泌影响培养基的pH值的代谢物；影响pH值的代谢物可以是例如乳酸盐和/或H+离子。

-进料阶段，在此期间在参考生物反应器中在给定进料速率存在下培养细胞培养物，所述细胞培养物分泌影响培养基的pH值的代谢物。

根据实施方案，该系统包含配置成自动改变生物反应器的一个或多个控制参数以使计算出的PACO值和PACO-参考状态图中的各自参考PACO值之间的差值最小化的控制单元。

因此，本发明的实施方案不仅可以监测和比较在具有明显不同的性质和参数的生物反应器中培养的细胞培养物的状态，还能够以使生物反应器中与细胞生长相关的条件非常类似于在获得参考PACO状态图的同时参考生物反应器中的条件的方式使用这一信息控制生物反应器。

该控制单元可以是例如可有效耦合到控制的生物反应器上的控制计算机。或者，该控制单元可以是用户，例如生物反应器操作员的数据处理装置，所述数据处理装置已安装以使动态获得的生物反应器的PACO值和参考PACO状态图中的参考PACO值之间的差值最小化的方式自动或半自动监测和/或控制生物反应器的生物反应器管理软件应用。例如，该数据处理系统可以是台式计算机、智能电话、平板计算机(tabloid computer)等。比较单元可以是例如硬件、软件和/或固件逻辑形式的一条可自动执行的程序逻辑。比较单元可有效耦合至控制单元，例如可以是控制单元的组成部分或可以是配置成与控制单元交互操作的应用程序。

根据实施方案，该控制单元可如下控制生物反应器：

在监测和/或控制的生物反应器中获得的PACO值高于PACO参考状态图中的各自参考PACO值的情况下，该控制单元通过执行一种或多种下列操作自动改变生物反应器的一个或多个控制参数：

-降低进入生物反应器的总空气流入速率和/或降低O2气体流入速率和/或降低CO2气体流入速率和/或降低碱流入速率和/或改变生物反应器的压力或温度。

在PACO值低于PACO参考状态图中的各自参考PACO值的情况下，该控制单元通过执行一种或多种下列操作自动改变生物反应器的一个或多个控制参数：

-提高总空气流入速率和/或提高O2气体流入速率和/或

-提高进入生物反应器的CO2气体流入速率和/或提高碱流入速率和/或改变生物反应器的压力或温度。

代替逐一使参数差异最小化(例如通过使与参考生物反应器中的参考pH的pH差异最小化)，使用PACO偏差作为控制参数以例如加入酸或碱性物质以改变培养基的pH值可具有改进控制质量的优点：PACO值依赖于pH值，但与pH值不相同。因此根据实施方案通过PACO差值控制参数间接控制pH值。这在控制回路中引入一定的鲁棒性，其防止或至少减轻由于控制器延迟受控参数在设定点值上振荡的公知问题。

根据实施方案，该系统进一步包含控制和/或监测的生物反应器。该系统可任选进一步包含附加生物反应器和参考生物反应器，和/或用于在屏幕上显示PACO状态图差异的显示器。

在另一方面中，本发明涉及一种监测生物反应器，在本文中也称作“监测和/或控制的生物反应器”中的细胞培养物状态与参考生物反应器中的细胞培养物的参考状态的偏差的方法。所述生物反应器包含与参考生物反应器相同的培养基。所述方法包含：

-通过生物反应器状态监测系统的比较单元接收PACO-参考状态图，所述PACO-参考状态图代表参考PACO值相对于时间的变化，所述PACO-参考状态图指示在参考生物反应器中测得的CO2排气速率与参考生物反应器的预测CO2排气速率的偏差，所述预测CO2排气速率是在不存在细胞培养物的情况下和在平衡状态下的培养基的pH值等于在测量参考生物反应器中的CO2排气速率时测得的参考生物反应器的pH值的条件下参考生物反应器中的所述培养基在pH-CO2平衡状态下的预测排气速率，所述PACO参考状态图依赖于在培养细胞培养物时由参考生物反应器中的细胞培养物的细胞产生的CO2排气的量；

-通过比较单元接收包含培养基特异性关系的数据对象，所述培养基特异性关系是所述培养基特有的并指示当所述培养基与所述气体体积处于pH-CO2平衡状态并且不含细胞培养物时所述培养基的pH值和气体体积中的各自CO2气体分数之间的关系；

-在当前时间下反复接收在生物反应器中的细胞培养物的培养过程中测得的生物反应器的当前CO2排气速率和生物反应器的培养基的当前pH值；

-通过比较单元计算在各接收的当前CO2排气速率下：

■PACO值，所述PACO值指示在生物反应器中测得的CO2排气速率与预测CO2排气速率的偏差，所述预测CO2排气速率是在不存在细胞培养物的情况下和在平衡状态下的培养基的pH值等于在测量生物反应器中的CO2排气速率时测得的生物反应器(104、106)的pH值的条件下生物反应器中的所述培养基在pH-CO2平衡状态下的预测排气速率，所述PACO值依赖于在培养细胞培养物时由生物反应器中的细胞培养物的细胞产生的CO2排气的量，PACO值的计算使用下列作为输入：

о接收的当前CO2排气速率；

о接收的当前pH值；

о培养基特异性关系；

■计算出的PACO值和PACO-参考状态图中的各自参考PACO值之间的差值；

-通过比较单元输出计算差值，所述计算差值指示生物反应器中的细胞培养物的状态与参考状态的偏差。

根据实施方案，该PACO参考状态图包含多个参考PACO值。该方法进一步包含如下计算参考PACO值：

-接收包含培养基特异性关系的数据对象；

-在当前时间下反复接收以

计的参考生物反应器的当前CO2排气速率和在参考生物反应器中培养细胞培养物的过程中在所述当前时间下测得的参考生物反应器的培养基的当前pH值；

-对于接收的各对当前CO2-排气速率和当前pH值，计算参考PACO值之一、参考PACO值的计算使用下列作为输入：

о接收的参考生物反应器的当前CO2排气速率；

о接收的参考生物反应器的当前pH值；

о在接收当前CO2排气速率时参考生物反应器的总气体流入速率；和

о培养基特异性关系。

例如，可以通过比较参考PACO状态图与监测和/或控制的生物反应器的当前计算的PACO值的比较单元计算参考PACO值。或者，可以通过不同的数据处理单元，例如参考生物反应器的控制计算机计算参考PACO状态图的参考PACO值。

根据实施方案，该方法进一步包括如下建立参考生物反应器的PACO-参考状态图：

-绘制CO2排气速率中的参考PACO值相对于时间的曲线图；

-在绘制的参考PACO值中拟合曲线，所述曲线构成参考PACO状态图。

根据实施方案，作图和拟合可以通过计算机或其它数据处理装置完全自动进行、半自动或手动进行。所得参考PACO状态图可以例如以电子数据结构的形式储存在非暂时性存储介质上。监测和/或控制的生物反应器的监测单元可以经由网络或通过从存储中读取所述数据结构自动接收所述数据结构。

根据实施方案，在各自当前时间ti的各参考PACO值PACO_R-ti的计算包括对于参考生物反应器的各接收的当前CO2排气速率ACO_R-M-ti和pH值计算：

-根据：FCO2_R-EXP-ti[％]＝REL-M1的参考生物反应器的当前排气体积的预期CO2排气分数FCO2_R-EXP-ti，其中FCO2_R-EXP-ti[％]是在当前时间以％计的参考生物反应器的总排气体积的预测CO2排气分数，使用接收的当前pH值作为用于REL-M1(pH_R-ti)的输入值计算该预测，其中REL-M1是培养基(M1)的培养基特异性关系，其中pH_R-ti是在时间ti在参考生物反应器的培养基中接收的当前pH值，因此，在参考生物反应器的培养基不含细胞培养物、具有用作培养基特异性关系的输入值的pH值并与生物反应器中在所述培养基上方的气相处于pH-CO2平衡状态并因此也与所述生物反应器的总排气体积平衡的假设下计算参考生物反应器中的预期CO2排气分数；

-根据：

的预期CO2排气速率ACO_R-EXP-ti[mol/min]值，其中ACO_R-EXP-ti[mol/min]值是以

计的参考生物反应器(102)的预期CO2排气速率，其中TGI_R是参考生物反应器(102)在当前时间ti的气体流入总量，

-根据：PACO_R-ti＝ACO_R-EXP-ti[mol/min]-ACO_R-M-ti[mol/min]的

值，其中ACO_R-M-ti[mol/min]是在参考生物反应器中在时间ti测得的以

计的CO2排气速率。

一般而言，特定生物反应器(例如参考生物反应器或监测的生物反应器B1或B2)在特定时间t_i的PACO值如下计算：

PACO_ti＝ACO_EXP-ti-ACO_MEASURED-ti，其中ACO_EXP-ti是在不存在细胞培养物的情况下和在平衡状态下的培养基的pH值等于在测量生物反应器中的CO2排气速率时测得的生物反应器的当前pH值的条件下在时间ti所述生物反应器中的所述培养基在pH-CO2平衡状态下的“预测”(或“预期”)CO2排气速率。

例如，可通过将在时间ti接收的生物反应器的当前pH值输入培养基特异性关系而获得预测CO2排气速率。测得的CO2排气速率可获自CO2测量装置。预测CO2排气速率和测得的CO2排气速率可具有单位[mol CO2/min]。

参考生物反应器的预期/预测CO2排气速率因此代表在作为输入提供的pH值下对培养基预测的某种“无细胞CO2排气速率”，该培养基不含细胞培养物细胞和可能改变培养基的pH-CO2平衡状态的任何其它组分。

本文所用的“pH测量装置”是用于测量培养基中的当前pH值的装置和/或物质。pH测量装置可以是例如pH指示剂(如酚酞)-溶液或pH试纸形式或电位装置。根据优选实施方案，该pH测量装置是pH计。该pH计可以是例如连续pH计，即能够连续和反复测量生物反应器的培养基的pH而不必提取样品并且不必为每次测量将所述pH计插入培养基中的pH计。例如，pH测量装置可以是连接到培养基和连接到参考电极上并以不显示测得电位而是已显示pH值的方式标度的精确电压计。优选将pH测量装置浸在培养基中并用于在生物反应器中培养细胞时的整个过程中反复测量培养基中的当前pH值。例如，pH测量装置可以每分钟或每30分钟或每小时测量当前pH值。在用作pH测量装置的典型现今pH计中，将参考电极嵌入pH电极中，这使该装置紧凑。

本文所用的“在线测量”是获得描述生物反应器或其中所含的细胞培养物的状态特征的测量值的方法，由此进行该测量所需的持续时间比所述特征显著变化的持续时间短。显著变化可以是大于预定阈值的变化。例如，大于5％的变化可被视为显著变化。不同特征的阈值可不同。在线测量能够实时控制生物反应器。

“离线测量”是获得描述生物反应器或其中所含的细胞培养物的状态特征的测量值的方法，由此进行该测量所需的持续时间比所述特征显著变化的持续时间长。显著变化可以是大于预定阈值的变化。例如，大于5％的变化可被视为显著变化。离线测量的典型实例是例如为测量当前pH值，培养基的探针的自动化、半自动化或手动取样。离线测量基于不连续取样过程。由于生物反应器特征可能自取样以来同时改变，由于测量时刻和进行各控制操作的时刻之间的显著延迟时间，基于离线测量数据控制生物反应器往往是低质量的。

根据实施方案，通过连续pH测量装置，例如浸在所述生物反应器的培养基中的pH计测量监测和/或控制的生物反应器的当前pH值。附加地或替代性地，通过连续pH测量装置，例如浸在所述参考生物反应器的培养基中的pH计测量参考生物反应器的当前pH值。

“CO2测量装置”，也称作“CO2计”或“CO2分析仪”是用于测量气体体积，例如生物反应器的培养基上方的气体体积或生物反应器的排气中的当前CO2浓度的装置。根据实施方案，通过连续CO2排气计，即能够反复测量生物反应器的排气中的当前CO2浓度而不必为每次CO2浓度测量将硬件模块插入或替换到生物反应器或其相连的排气管道中的装置测量监测和/或控制的生物反应器的当前CO2排气速率。与总气体流入速率或总排气速率结合，可以通过CO2排气计或连向所述CO2排气计的数据处理装置自动测定CO2排气速率。附加地或替代性地，通过连续CO2排气计测量参考生物反应器的当前CO2排气速率。可以由生物反应器的排气中的当前CO2浓度和生物反应器的当前总排气体积数学推导测得的当前排气速率。但是，这样推导出的CO2排气速率在本文中被称作“测得的CO2排气速率”，因为其可容易地由测得的CO2浓度和总气体流入速率(或总排气速率)计算。根据一些实施方案，所述计算另外使用各自的生物反应器的体积或质量作为用于将计算的CO2排气速率标准化以消除培养基体积的影响的输入值。

使用连续pH测量装置和/或连续CO2排气计可以是有利的，因为可由容易并且反复测量的参数推导出各PACO值或参考PACO值。许多现有生物反应器已包含一个或多个浸入的pH计和/或包含与能够测量CO2排气速率和/或总气体流入速率的测量装置耦合。根据实施方案，该生物反应器(或参考生物反应器)包含单个气体流入管线或管道或多个气体流入管线或管道。例如，单个气体流入管线或管道可用于将环境空气或(已膨胀的)压缩空气从特殊供应源传送到生物反应器(参考生物反应器)中。所述环境空气或压缩空气可由地球大气典型的气体混合物，特别是N2、O2和CO2构成。附加地或替代性地，单个气体流入管线或管道或任何其它气体流入管线或管道可用于将独立的气体，如N2、O2和CO2传送至生物反应器，以例如控制细胞生长。在任何情况下，测定总气体流入速率，例如经由生物反应器的任何气体流入管线或管道每单位时间传送至生物反应器的所有气体的总量。

根据实施方案，生物反应器(监测和/或控制的生物反应器和/或参考生物反应器)包含一个或多个用于由流入的气体生成极细分散的气泡的微喷雾器以加速建立生物反应器中的培养基和气体体积之间的pH-CO2平衡。例如，微喷雾器可用于例如气体混合物或单独用于各个流入气体组分。附加地或替代性地，配置并运行两个生物反应器之一或每一个以使二氧化碳和一种或多种其它气体(例如氮气、氧气和/或空气)作为气体混合物一起同时添加到生物反应器中。例如，所有流入气体可作为气体混合物，例如经由浸没管开口或微喷雾器输入生物反应器。

优选地，在生物反应器的体积低于例如400升或例如200升的阈值体积的情况下，经由微喷雾器和/或以气体混合物的形式将所有工艺气体输入生物反应器。

根据实施方案，选择生物反应器的培养基中的曝气速率和流入气体的气泡尺寸以使所有气泡在离开生物反应器之前与培养基达到pH-CO2平衡或完全溶解在培养基中。

所述特征可能有利，因为它们确保在其气体内容物离开生物反应器之前气泡达到平衡状态：微喷雾器生成流入气体的极细分散气泡，由此加速生物反应器中的培养基和气体体积之间的pH-CO2平衡。作为气体混合物输入CO2气体避免从纯CO2气泡到培养基中的CO2迁移速率大于从培养基到例如空气或N2气泡的CO2迁移速率(该迁移速率可能依赖于培养基和不同类型的气泡之间的CO2浓度差的量)。因此，所述措施确保在宽范围的生物反应器体积之间(包括低于例如400升的体积)生物反应器状态的可比较性。

根据实施方案，参考PACO状态图包含至少一个在用细胞培养物接种参考生物反应器之前在参考生物反应器中的培养基在特定温度和压力下达到pH-CO2平衡时的时间t_R-0对参考生物反应器获得(通过测量当前pH值和当前CO2排气速率)的参考PACO值。在时间t_R-0参考生物反应器中的预定温度和压力必须等于用于凭经验确定培养基特异性关系的培养基样品的温度和压力，例如20℃和标准大气压。所述参考PACO值被称作“初始化参考PACO值”。

当启动监测和/或控制的生物反应器时，在所述生物反应器中的培养基在与参考生物反应器在t_R-0时相同的温度和压力下达到pH-CO2平衡时的时间t_B1-0由所述生物反应器获得当前PACO值(通过测量当前pH值和当前CO2排气速率)。所述当前PACO值被称作监测和/或控制的生物反应器的“初始化PACO值”。

监测和/或控制的生物反应器的初始化包含将初始化参考PACO值与监测和/或控制的生物反应器的初始化PACO值比较。在该比较反馈所述两个比较的PACO值之间的差值超过预定阈值，例如两个比较的初始化PACO值的较小值的5％的情况下，判定监测的生物反应器的pH测量装置错误校准或有缺陷。另外，在这两个生物反应器在相同温度和压力下处于pH-CO2平衡状态并已设定至相同pH值(例如通过相应地选择CO2流入速率)但在排气中具有不同CO2浓度的情况下，判定这两个生物反应器的pH测量装置已不同地校准。据此推测这两个生物反应器包含相同的无细胞培养基并且CO2分析仪正确校准。例如，可以手动执行比较和判定。更优选地，通过数据处理系统，例如计算机自动执行所述比较和判定。该计算机可生成和输出指示监测和/或控制的生物反应器的校准误差的警告信息和/或可自动启动监测和/或控制的生物反应器的pH测量装置的校准。

这可具有可从一开始就阻止包含错误校准的pH测量装置的生物反应器的初始化的有利作用。错误校准的pH测量装置会造成细胞培养物的表现不佳，甚至造成应在生物反应器中发生的生物或生物化学过程的完全失败，因为错误的pH值会造成错误的PACO值并可能造成依赖于当前获得的PACO值与参考PACO值的计算差值的错误控制信号。培养基和细胞培养物细胞是昂贵的，因此在pH测量装置校准误差的情况下防止生物反应器的接种可能节省与在错误控制参数下操作生物反应器中的细胞培养物相关的时间和成本和/或可采取适当的纠正措施，例如更换错误校准或有缺陷的pH测量装置。

在另一方面中，本发明涉及测试pH计的校准的方法。该方法包含：-在用细胞培养物接种生物反应器的培养基之前的时间ti，从pH测量装置接收培养基的当前测得pH值和接收生物反应器的当前测得CO2排气速率，所述生物反应器具有预定压力和温度；

-接收培养基特异性关系，所述培养基特异性关系是该类型的培养基特有的并指示当所述培养基与所述气体体积处于pH-CO2平衡状态并且不含细胞培养物时所述培养基的pH值和气体体积中的各自CO2气体分数之间的关系；

-使用当前测得的pH值作为用于预测在测得的当前pH值下对不存在细胞培养物的处于pH-CO2平衡状态下的生物反应器中的培养基预期的生物反应器的当前CO2排气速率的关系的输入值；

-测定当前PACO值，所述当前PACO值指示生物反应器的当前测得的CO2排气速率和生物反应器的预测CO2排气速率之间的差值；

-测定参考PACO值和生物反应器的测定的当前PACO值之间的差值，所述参考PACO值指示在参考生物反应器中测得的CO2排气速率与参考生物反应器的预测CO2排气速率的偏差、所述预测CO2排气速率是在不存在细胞培养物的情况下和在平衡状态下的培养基的pH值等于在测量参考生物反应器中的CO2排气速率时测得的参考生物反应器的pH值的条件下参考生物反应器中的所述类型的培养基在pH-CO2平衡状态下的预测排气速率，

-如果测定的差值超过阈值，判定该pH测量装置错误校准。

或者，代替比较PACO值，比较这两个生物反应器的排气的CO2浓度和这两个生物反应器中的培养基的pH值以确定这两个比较的生物反应器的pH测量装置是否相同地校准。当启动这两个生物反应器并在相同压力和温度下填充相同的无细胞培养基并在这两个生物反应器达到pH-CO2平衡时测量和比较这两个生物反应器中的培养基的当前pH值和当前CO2浓度。如果这两个生物反应器的排气中的CO浓度相等而pH值不相等，或如果这两个生物反应器的pH值相等并且排气中的CO2浓度不相等，比较单元自动判定这两个生物反应器不同地校准并启动适当的操作，例如输出警告信息或启动pH测量装置的更换或再校准。

这可具有有可能在用细胞培养物接种生物反应器之前确定pH测量装置的校准误差的优点，由此防止与在具有未达最佳的pH依赖性控制参数的生物反应器中培养细胞多日相关的时间和努力的浪费。

根据实施方案，pH校准试验方法用于测试在用细胞培养物接种生物反应器之前是否正确校准监测和/或控制的生物反应器的pH测量装置。该方法包括确定差值是否超过阈值，以判定生物反应器的pH测量装置正确校准，并在判定pH测量装置正确校准的情况下用细胞培养物选择性接种生物反应器。在监测和/或控制的生物反应器中接种细胞培养物之后，通过将动态计算的所述生物反应器的PACO值和参考PACO状态图中规定的参考PACO值的差值最小化监测和/或控制所述生物反应器。

在时间ti生物反应器中的预定温度和压力等于之前已用于凭经验确定培养基特异性关系的一个或多个培养基样品的温度和压力。

根据一些实施方案，在接种细胞培养物后的一定时间比较参考生物反应器102和监测和/或控制的生物反应器下列数值对：

-分别计算的PACO值或分别测得的这两个生物反应器的排气中的CO2浓度；

-这两个生物反应器中的培养基的pH值；

-各自生物反应器中的细胞培养物的氧摄取速率(OUR)。

OUR被视为细胞培养物的代谢状态的指示。这两个生物反应器在相同压力和温度下运行。CO2排气浓度和/或PACO值可受细胞培养物的代谢影响。当这两个生物反应器达到pH-CO2平衡时测量和比较当前CO2排气浓度或PACO值和当前pH值和OUR速率。如果这两个生物反应器的排气中的CO2浓度(或PACO值)相等、两个OUR速率相等而pH不相等，或如果这两个生物反应器的pH值相等、OUR速率相等且排气中的CO2浓度(或PACO值)不相等，比较单元自动判定这两个生物反应器不同地校准并启动适当的操作，例如输出警告信息或启动pH测量装置的更换或再校准。

所述特征可能有利，因为它们甚至在两个生物反应器都已启动并且在细胞的代谢可能改变当前pH值的情况下也能够确定两个比较的生物反应器的pH测量装置之间的任何校准差异。在两个生物反应器中的OUR相等的情况下，PACO或CO2排气浓度的任何偏差被认为由于校准差异而非由于细胞代谢。

本文所用的“状态图”是参数值变化相对于时间的图示。

本文所用的“参考状态图”是获自参考生物反应器的状态图。可在运行要将其细胞培养物状态与参考生物反应器的细胞培养物状态相比较的生物反应器之前获得参考状态图。例如，可能在监测的生物反应器中培养细胞培养物之前几个月或甚至几年培养参考生物反应器中的细胞培养物。或者，参考生物反应器中的细胞培养物和“监测的”生物反应器中的细胞培养物可以平行培养，因此能够“实时”比较这两个比较的生物反应器中的细胞培养物的状态。在一些实施方案中，参考生物反应器中的细胞培养物和“监测的”生物反应器中的细胞培养物可以平行培养但存在一定时间差，其中晚于参考生物反应器用细胞培养物接种监测的生物反应器。该延迟可以是例如数小时或甚至数天。优选地，在将监测和/或控制的生物反应器中的细胞培养物状态与参考生物反应器中的细胞培养物状态比较时，将监测的生物反应器的当前PACO值与参考PACO状态图中的参考PACO值比较。据此，将当前PACO值与在与监测的生物反应器的当前PACO值相同的时间间隔后(从在各自的生物反应器中接种细胞培养物时开始)获得的状态图中的参考PACO值比较。

“pH-CO2平衡”指示包含水溶液(例如细胞培养基)和在所述溶液上方的空气体积(例如生物反应器中的气体体积)的系统的状态，它们的pH值和CO2分压根据Henderson-Hasselbalch方程处于化学平衡。CO2分压对应于培养基上方的总气体体积中的CO2气体的分数。Henderson-Hasselbalch方程描述在生物和化学系统中作为酸度的量度的pH与酸离解常数(pKa)的关系。如果包含CO₂的气体与水性液体如培养基接触，至少小部分CO2溶解在所述液体中。在室温下，例如，二氧化碳的溶解度为大约90cm³CO₂/100ml水(c_l/c_g＝0.8)。随着温度降低，任何水溶性气体变得更可溶。小部分(大约0.2-1％)溶解的CO₂转化成H₂CO₃。大多数CO₂仍为溶解的分子CO₂。这一过程可通过下式描述：

碳酸(H2CO3)平衡:

[CO2]x[H2O]←→[H2CO3]←→[H+]x[HCO3-]

[H+]x[HCO3-]＝K x[CO2]x[H2O]，

其中K＝平衡常数

pH＝pK+log([HCO3-]/[CO2])

“培养基”或“细胞培养基”是旨在支持微生物或细胞或小植物如小立碗藓(mossPhyscomitrella)的培养和通常生长的液体或凝胶。存在用于生长不同类型的细胞的不同培养基。市场上存在许多不同培养基，例如用于衍生自植物或动物的特定细胞类型的细胞培养，和用于生长微生物，如细菌或酵母的微生物培养。培养基可以是例如营养培养基，例如LB培养基(Lysogeny Broth)，基本培养基、选择性培养基、鉴别培养基或加富培养基。一些培养基可能需要例如5-10％CO2的CO2环境以维持生理pH。

根据一些实施方案，短语“两种培养基相同”意味着两种培养基(例如一方面参考生物反应器中的培养基和另一方面监测和/或控制的生物反应器中的培养基)包含-在特定压力、温度和所述培养基上方的气体体积中的CO2浓度下-相同组成和有机和无机化合物和溶剂的浓度并已使用相同制造程序和条件在测量精度内制造。

根据一些实施方案，所述短语意味着这两种培养基仅在所述差异(在给定温度、压力和所述培养基上方的气体体积中的CO2浓度下)不影响或大致不影响所述培养基在多个不同pH值下的pH-CO2平衡的程度内和在分别由所述两种培养基凭经验推导出的培养基特异性关系相等的程度内才可在任一所述标准(组成、浓度、制造程序)方面不同。

本文所用的“排气速率”是在单位时间内离开一定实体，例如生物反应器的气体量。相应地，“CO2排气速率”是在单位时间内离开所述实体的CO2气体量。其可以例如作为[molCO2/min]规定。

本文所用的“总气体流入速率”是在单位时间内进入一定实体，例如生物反应器的气体总量。该气体可以是气体混合物。例如，该气体可以是由大约78Vol.％N2气体、21Vol.％O2气体和大约1Vol.％其它气体，包括大约0.04Vol.％CO2气体构成的环境空气。其可以例如作为[升/min]规定。

本文所用的“CO2体积分数”是总气体体积中的CO2气体分数。单位可以是例如Vol.％。其也被称作气体体积的“CO2浓度”，该浓度以Vol.％规定。

本文所用的“培养细胞培养物”通常是指生长细胞培养物，即细胞培养物的细胞数增加。但是，在一些情况下，细胞数也可能停滞或甚至下降。

附图简述

下面更详细解释本发明的实施方案，仅作为实例，参考附图，其中：

图1显示用于监测和/或控制一个或多个生物反应器的系统的方框图；

图2显示用于监测和/或控制生物反应器的方法的流程图；

图3显示生物反应器的组件；

图4显示培养和生长细胞培养物的各种阶段；

图5显示图解生物反应器的排气中的CO2浓度对其它参数的依赖性的图；

图6显示用于获得培养基特异性pH-CO2浓度关系的曲线图；

图7a显示在四个不同生物反应器中生长细胞培养物的同时四个不同生物反应器的pH值；

图7b显示使用pH值和培养基特异性关系作为输入对这四个生物反应器的每一个预测的排气中的CO2分数；

图7c显示在这四个生物反应器的每一个中实际测得的CO2排气分数；

图7d显示由预测和实际测得的CO2排气分数的差值产生的PACO状态图；

图8a是显示两个生物反应器和参考生物反应器的PACO状态图的图，据此一个生物反应器的PACO状态图在接种前已不同于参考生物反应器的PACO状态图；

图8b是显示图8a的两个生物反应器与所述参考生物反应器的PACO状态图差异的图。

详述

图1显示根据本发明的一个实施方案用于监测和/或控制一个或多个生物反应器的系统100的方框图。下面参考如图2a和2b的流程图中所示的监测和/或控制生物反应器的相应方法描述所述实施方案。

图1显示甚至在两个比较的生物反应器的尺寸、形状、温度或其它工程或环境参数彼此不同的情况下也能够实时和精确比较不同生物反应器的所述培养物状态的系统100。该比较基于作为所述生物反应器的当前pH值和当前CO2排气速率和所述生物反应器中所用的细胞培养基的特异性关系136、138的导数对特定生物反应器计算的所谓“PACO”参数。

系统100包含处理器110、主存储器112和非暂时性存储介质114。该存储介质包含计算机可读指令，其在通过处理器110执行时使该处理器执行如对本发明的实施方案描述的执行自动监测和/或控制一个或多个生物反应器104、106的方法。

存储介质114包含特定培养基M1和用于经预定时间间隔和以预定目标在所述培养基M1中培养特定细胞培养物的特定项目特有的至少一个参考PACO状态图。例如，该项目可以是在最佳或接近最佳细胞生长条件下在细胞培养基M1中经14天生长CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)直至达到大约100x 10⁵个细胞/毫升的细胞密度。此外，存储介质114包含指示所述细胞培养基M1特有的pH-CO2浓度关系的数据结构136，例如文件或数据库记录。

此外，该存储介质可包含其它细胞培养基的培养基特异性关系138和/或可包含使用不同细胞类型和/或使用不同培养基M2的其它细胞培养项目的参考PACO状态图118。可经数据通信接口120，例如网络接口、USB端口、CDROM驱动器等接收参考PACO状态图和培养基特异性关系。根据一些实施方案，可以动态接收参考PACO状态图以能够实时比较两个监测的生物反应器的细胞培养物状态。

系统100可进一步包含用于从一个或多个监测和/或控制的生物反应器104、106动态接收当前测量值的接口126。该测量值特别是当前pH值和当前CO2排气速率。PACO比较单元130使用接收的测量值和监测的生物反应器104、106中的培养基M1的培养基特异性关系136反复计算当前PACO值并将所述当前PACO值与参考生物反应器102中的细胞培养项目(其应在监测的生物反应器104中重复)的PACO参考状态图116比较。可经由显示器134，例如计算机监视器或智能电话监视器向用户显示当前PACO值与各自的参考PACO值的任何差异。

任选地，系统100进一步包含控制单元132，其控制生物反应器104、106的一个或多个参数以使当前获得的PACO值与各自的参考PACO值的差异最小化。该控制单元可以是例如可有效耦合至用于接收PACO值比较结果的比较单元130的软件和/或硬件模块。该控制单元能够控制一个或多个工程过程和参数的配置和操作。例如，控制单元132可切实提高或降低对pH值具有影响的液体的流入量，例如可提高或降低柠檬酸或1M NaOH溶液的流入量。

培养基M1可以是例如Ham's F-12培养基的Kaighn变型(Kaighn's Modificationof Ham's F-12Medium)，其包含例如腐胺、胸腺嘧啶、次黄嘌呤、锌和更高含量的所有氨基酸和丙酮酸钠。这些添加剂能为培养基补充极低量的用于一些细胞类型的血清或指定组分。Ham's F-12K(Kaighn's)培养基不含蛋白质或生长因子，因此通常补充可为特定细胞系优化的生长因子和胎牛血清(FBS)。Ham's F-12K(Kaighn's)培养基使用碳酸氢钠缓冲体系(2.5g/L)。

培养基M2可以是LB培养基，并且可能存在例如用于为各种目的和相应“项目”培养细菌或植物的多种其它培养基M3、M4的参考状态图。

该系统可有效耦合至一个或多个要监测和/或控制的生物反应器104、106。监测或控制的生物反应器的尺寸和其它工程参数(搅拌速率和配置、气泡尺寸、尺寸等)可能彼此不同和/或可能不同于参考生物反应器的各自参数。有效耦合可包括将监测数据(当前pH和CO2排气速率)传送至比较单元130和任选也将来自控制单元132的控制数据传送至各自的生物反应器104、106。参考生物反应器可以但不必耦合至系统100。比较单元130可获得从参考生物反应器收集的PACO参考状态图就足够了。

在下列段落中，给出系统100和根据本发明的实施方案的相应方法如何控制包含培养基M1的生物反应器104、106的运行以甚至在所述两个生物反应器的尺寸和其它工程参数不同的情况下也能在相同培养基中在与参考生物反应器中培养的参考细胞培养物几乎相同的生理条件下培养所述生物反应器中的细胞培养物的综述。

在第二步骤202中，凭经验确定当培养基在预定条件(例如20℃和标准大气压)下处于pH-CO2平衡状态时无细胞培养基的pH值和所述培养基上方的空气体积中的相应CO2分压之间的培养基特异性关系136。这一步骤更详细描述在图5D)和6中。由于目标是在Ham'sF-12培养基的Kaighn变型中生长CHO细胞14天，专门确定所述培养基的关系。

在步骤204中，从参考生物反应器102获得参考PACO状态图。首先，向参考生物反应器填充无细胞培养基M1并通过开始连续加入气体，例如通过将环境空气和/或其独立组分(N2、O2和/或CO2)传送至生物反应器和任选也通过开始连续加入液体(无细胞培养基、任选附加液体，如进料、碱等)而启动。此外，可以启动搅拌器。参考生物反应器可以在与用于获得培养基特异性关系的温度和压力不同的温度和压力下运行。在一定时间(通常数分钟或数小时)后，参考生物反应器中的培养基和在参考生物反应器中在该培养基上方的空气体积已达到pH-CO2平衡状态并由培养基特异性关系136和参考生物反应器的当前pH-和CO2值对参考生物反应器计算一个或多个PACO值。

根据实施方案，在参考PACO状态图的生成过程中，除无细胞培养基外还向参考生物反应器供入一种或多种液体，如进料溶液或碱。在这种情况下，在一些实施方案中生成附加参考状态图。所述附加状态图分别指示在状态图的给定时刻添加到参考生物反应器中的进料溶液或碱的量。当启动和运行监测和/或控制的生物反应器时，将如各自的状态图中规定的相同量的每单位体积培养基和每单位时间的进料溶液或碱添加到所述生物反应器。因此确保甚至在生物反应器中的培养基的组成改变的情况下，生物反应器中的培养基也与在给定时刻ti参考生物反应器中的“相同”或“大致相同”。由于进料溶液和/或碱通常不会显著改变培养基的组成，该培养基特异性关系甚至在凭经验确定不含所述进料溶液的培养基的培养基特异性关系的情况下也可用于计算当前PACO值。但是，如果在参考培养基中培养细胞的同时参考生物反应器中的培养基的组成显著改变(例如由于从第一培养基切换成组成完全不同的另一第二培养基)，实际上需要测定两个相继的PACO参考状态图和两个不同的培养基特异性关系并传送至监测和/或控制的生物反应器的控制单元。

优选地，监测和/或控制的生物反应器104、106至少在初始化时间点在与参考生物反应器相同的温度和压力下运行。但是，在运行生物反应器104、106的同时，有可能改变温度和/或压力以使PACO差异最小化。

然后在步骤206中，使用PACO参考状态图和培养基特异性关系136监测和/或控制不同生物反应器104、106中的细胞培养物状态，例如通过将所得参考PACO状态图和关系136经互联网或经便携式存储介质传送至系统100并将该状态图和该关系存储在存储介质114中。从图1中可以推断，所述一个或多个监测的生物反应器104、106可能在许多参数，例如生物反应器的尺寸和形状、搅拌参数、总气体流入速率、温度、压力、表面速度、气泡尺寸和分布和其它参数方面不同于参考生物反应器102。PACO参考状态图在本发明的实施方案中的使用206可包含图2b中所示的步骤208-220。

系统100能够监测生物反应器104、106中的细胞培养物的状态和将在接种后的相应时间所述生物反应器的细胞培养物状态与参考生物反应器中的细胞培养物状态比较。参考生物反应器和各监测的生物反应器104、106包含相同培养基M1并用相同类型的细胞培养物接种。可以在监测的生物反应器启动和接种细胞培养物之前从参考生物反应器收集参考PACO状态图，但参考生物反应器和所述一个或多个监测的生物反应器也可以平行或以例如一天或多天的延迟运行。在这种情况下，在监测的生物反应器中培养细胞培养物的同时动态接收参考PACO状态图。

在第一步骤208中，生物反应器状态监测系统100的比较单元130接收PACO-参考状态图116，例如通过从存储介质114读取包含状态图的文件或经由接口120从系统外部数据源，例如互联网接收所述状态图。该PACO-参考状态图代表PACO参考值PACO_R-ti相对于时间ti的变化，i代表一系列时间之一，例如t0、t1、t2、…、tmax。时间t0优选是位于用细胞培养物接种参考生物反应器的时间点之前的预定时间间隔的时间点。例如，t0可代表接种参考生物反应器前1小时，t1可代表接种前45分钟，t2可代表接种前30分钟，t3可代表接种前15分钟，t4可代表接种时，t6可代表接种后15分钟，诸如此类，直至在细胞培养项目持续期结束时达到tmax。

此外，PACO-参考状态图指示在参考生物反应器中测得的CO2排气速率与所述参考生物反应器的预测CO2排气速率的偏差。测得的CO2排气速率可通过在给定时间测量参考生物反应器的CO2浓度和参考生物反应器的总气体流入速率TGI_R-ti获得。通过将参考生物反应器中的培养基的当前测得的pH值pH_R-M-ti输入培养基特异性关系推导出预测CO2排气速率，据此假设所述培养基无细胞并在生成培养基特异性关系时使用的预定温度和压力(例如20℃和标准大气压)下处于pH-CO2平衡状态。因此，PACO参考状态图指示预期与测得的CO2排气速率的偏差并依赖于在培养细胞培养物的同时由参考生物反应器中的细胞培养物的细胞产生的CO2排气量和依赖于对pH-CO2平衡具有影响的其它因素，如温度、pH、压力等。

在步骤210中，比较单元130接收包含要监测的生物反应器104、106中的培养基M1的培养基特异性关系136的数据对象。该培养基特异性关系指示不含细胞培养物的培养基M1的多个不同pH值和在预定压力和温度下与所述培养基处于pH-CO2平衡状态的气体体积中的各自CO2分数之间的关系。

在步骤212中，比较单元130经接口128反复在当前时间ti接收监测的生物反应器104的当前CO2排气速率ACO_B1-M-ti和生物反应器104的培养基M1的当前pH值pH_B1-ti。至少在生物反应器104中的细胞培养物的培养过程中接收测得的CO2排气速率和pH值，并可任选在接种前接收以比较在无细胞状态下的生物反应器的状态。

对于生物反应器104中接收的每对CO2排气速率和pH值，比较单元130在步骤214中比较PACO值PACO_B1-ti。该PACO值指示在生物反应器104中测得的CO2排气速率与预测CO2排气速率的偏差。由在不存在细胞培养物的情况下、在预定温度和压力下和在平衡状态下的培养基的pH值等于监测的生物反应器104在时间ti的pH值的条件下对与所述体积处于pH-CO2平衡状态的所述培养基M1的样品上方的气体体积预测的CO2分数推导出所述预测CO2排气速率。计算的PACO值指示在培养细胞培养物的同时在特定时间ti由生物反应器中的细胞培养物的细胞产生的预测CO2排气速率与在该时间实际测得的CO2排气速率的偏差。PACO值的计算使用下列作为输入：

-在时间ti接收的监测的生物反应器104的当前CO2排气速率；

-在时间ti接收的监测的生物反应器104的当前pH值；

-在时间ti生物反应器104的总气体流入速率TGI_B1；和

-培养基M1的培养基特异性关系136；

在步骤216中，比较单元130计算监测的生物反应器104的计算PACO值PACO_B1-ti和PACO-参考状态图116中的各自参考PACO值PACO_R-ti之间的差值。例如，将监测的生物反应器104的PACO_B1-t100与PACO-参考状态图116中的各自PACO_R-t100比较，据此t100相当于接种后第24小时的开始。

在步骤220中，比较单元130例如在显示器134上输出计算差值。该计算差值指示生物反应器104中的细胞培养物的状态与根据状态图116参考生物反应器102中的细胞培养物的参考状态的偏差。

根据实施方案，比较单元130或耦合至该比较单元的控制单元可另外监测一个或多个如上所述的附加生物反应器106的状态。

图3显示生物反应器102、104、106的一个实施方案。该生物反应器耦合至用于将液体，如酸、碱、新鲜培养基等传送到生物反应器中的第一管道和耦合至流出物。该生物反应器另外耦合至一个或多个用于将气体，例如环境空气和/或N2气体和/或O2气体和/或CO2气体传送到生物反应器中的第二管道和耦合至第三排气管道。第二管道可包含用于测定当前总气体流入速率的传感器144。第三管道可包含传感器122，例如CO2排气分析仪，以选择性测量每单位时间经第三管道传送的CO2气体量。根据另一些实施方案，可能没有液体流入和流出管道并可借助进料溶液的逐步滴注(bolus)添加将营养素供入生物反应器。

图4显示根据特定细胞培养项目(例如经18天生长CHO细胞)和由所述项目推导的PACO参考状态图402在参考生物反应器102中培养和生长细胞培养物的各种阶段。在该项目的过程中，加入不同进料(进料1、进料2、进料3)和/或碱性液体并显示参考PACO状态图中的PACO值的影响。为了在另一生物反应器104、106中再现该项目，必须在各自的时间间隔将相同进料和/或碱性物质添加到培养基中，并通过改变监测和控制的生物反应器104、106的工程参数和配置测定和最小化任选监测的生物反应器104中的PACO值与状态图402中的各自参考PACO值的任何偏差。

图4中所示的PACO状态图402清楚显示在该项目期间在参考生物反应器102中生长设定培养物时可观察到的不同工艺阶段。因此，该状态图显示，单一参数——由可容易和动态推导的测量值计算的PACO参数——可识别与细胞培养物细胞的不同状态相关的不同工艺阶段。但是，该PACO值没有量化对参考生物反应器102中的培养基M1的pH-CO2平衡具有影响的独立参数(碱性进料、碱添加、乳酸盐产量等)的单一效应。

在图4中可以看出，在接种后所述培养物细胞的生长导致预测CO2排气速率的测得版本(“ACO”(CO2排气速率)，例如以[mol CO2/min]测得)的差异提高。在生长细胞的同时，培养基的pH通常降低且CO2排气速率可能依赖于pH值和其它参数的降低而降低。状态图402涵盖四个不同阶段：在接种后的第一阶段，不添加进料并且PACO值提高。该提高可能由细胞代谢造成。在第二阶段，将第一进料添加到培养基中并且PACO值降低。然后，在第三阶段，加入第二碱性进料，其提高PACO值。但是，稍后在所述“第三进料”阶段中，细胞代谢导致PACO值降低且细胞培养物可能进入第四阶段。在第四阶段，仍将第二碱性进料添加到培养基M1中。此外，细胞培养物细胞开始产生乳酸盐和/或其它物质，它们降低培养基的pH值。因此，参考生物反应器的PACO值在第四阶段中提高。

“下DB”指示培养基的最低容许pH值。在培养基的pH值降到“下DB”阈值以下的情况下，控制器单元可以自动降低CO2流入速率以提高pH值。“上DB”是指培养基的最高容许pH值。在培养基的pH值超过“上DB”阈值的情况下，控制器单元可以自动提高CO2流入速率以提高pH值。在所述阈值之间，可以仅基于PACO值控制CO2流入速率的控制。

图4显示在生长细胞培养物时，实际CO2浓度会明显不同于对无细胞培养基预期的CO2浓度，因为培养基中的碱添加、进料添加、乳酸盐生成、不同的CO2积聚和脱除速率等会影响培养基的pH-CO2平衡和生物反应器中所述培养基上方的气体体积中的CO2浓度。

图5显示图A、B、C和D，其图解四个不同生物反应器的排气中的CO2浓度(和因此意味着，排气速率)对pH值的依赖性和所述CO2浓度对各自生物反应器的工程参数和尺寸参数的独立性。

四个不同生物反应器具有下列工程性质：

向各所述生物反应器I-IV填充不含任何细胞的特定细胞培养基M1。所述培养基的原始pH值为6.85(见图B)。然后，在各生物反应器中通过降低各自生物反应器中的所述培养基上方的气体体积中的CO2浓度提高pH值。在该试验开始时和对于各组预定pH值，使各生物反应器中的培养基达到在预定温度和压力，例如20℃和标准大气压下与培养基上方的气体体积的pH-CO2平衡。在达到该平衡后，测定所述四个生物反应器的每一个的总排气的以Vol.％计的CO2浓度(“CO2气体分数”-“FCO2[％]”、“CO2浓度”)(见图A，其与图B一起显示pH值对测得的排气中的CO2浓度的影响)。图C)以条形图形式显示pH值对这四个生物反应器的每一个的测得CO2浓度的影响。对这四个生物反应器的每一个获得的FCO2的最大偏差[％]小于生物反应器的总排气速率的0.4％。

图D)是包含在这四个生物反应器I-IV的每一个中在各设定pH值(6.85、6.95、7.05、7.15、7.25、7.35)下在所述生物反应器的培养基M1达到pH-CO2平衡状态时测得的CO2[％]值的曲线图。

应该指出，可通过进入和/或离开生物反应器的CO2气体速率挑战生物反应器中的pH-CO2平衡，因此该pH-CO2平衡可实际上是动态平衡。但是，可以以在特定pH值下建立动态pH-CO2平衡的方式控制生物反应器，例如通过改变生物反应器中的总CO2流入速率而降低或提高生物反应器中的培养基上方的气体体积中的CO2浓度。

可以通过添加酸性或碱性物质或液体改变pH值。但是，由于所述物质可能改变培养基的组成，优选在生物反应器在特定pH值下仅通过以达到所述pH值的方式控制CO2流入速率而建立动态pH-CO2平衡状态。使用CO2流入速率而非碱性或酸性物质建立pH-CO2平衡的优点在于不改变培养基的组成(除溶解的CO2及其离解产物的浓度外)并因此由在不同pH值下的相同培养基凭经验推导出培养基特异性关系。

然后，将曲线502拟合到该曲线图中以凭经验确定用于这四个生物反应器中所含的培养基M1特有的关系316的参数。这种方法能够凭经验确定，对于特定细胞培养基，用作用于预测当所述培养基具有特定pH值、压力和温度(例如20℃和标准大气压)、不含任何细胞并处于pH-CO2平衡时所述培养基上方的气相中的预期CO2体积分数的输入值的培养基特异性关系。所得关系不依赖于生物反应器规模、曝气速率和使用CO2气体作为用于pH控制的酸性组分的工艺中的其它工程参数。对于特定培养基M1仅确定培养基特异性关系一次。该确定可以在单个生物反应器中，例如在接种参考生物反应器之前的参考生物反应器中进行。为了提高精确度，也可以在多个生物反应器或允许测量pH值和CO2气体分数(CO2浓度)的其它容器中进行该确定，然后使用在多个生物反应器或容器中获得的信息获得更精确的拟合曲线502。在图5中所示的实例中，使用四个不同生物反应器凭经验确定拟合曲线502和在平衡pH值和平衡CO2浓度之间的相应培养基特异性关系。

图6更详细显示图5D)中的图。培养基M1的培养基特异性关系136是通过数学拟合pH值和所述培养基上方的气相中的各自CO2浓度的多个凭经验确定的对获得的方程FCO2_M1(pH)＝REL-M1(pH)，该气相中的CO2浓度根据上文提到的Henderson-Hasselbalch方程与所述培养基处于pH-CO2平衡。

“FCO2M1(pH)[％]”参数是在与具有给定pH值的所述培养基处于pH-CO2平衡状态的气体体积中在预定温度和预定压力下的预测CO2浓度，该预测是专门针对培养基M1(凭经验获得其关系)的。

“pH”参数是指用作所述方程的输入值的pH值，该输入的pH值被视为在培养基(基于其进行CO2浓度的预测)的pH-CO2平衡状态下的培养基的pH值。

“REL-M1”是通过运算符连接的一个或多个参数a1、a2、b1、b2、b3的集合。这些参数如下获得：通过将不含细胞培养物的培养基M1的样品调节至如上所述的多个不同的pH值，由此使该样品达到在预定压力和温度下的pH-CO2平衡、通过测定与样品中的培养基接触的各自气体体积中的平衡CO2浓度、通过对照样品的各自平衡pH值绘制测得的平衡CO2浓度(见图5D和6)的图、在绘制值中拟合曲线502和由拟合曲线推导参数a1、a2或b1、b2、b3。

根据一些实施方案，方程FCO2_M1(pH)＝REL-M1(pH)是根据FCO2_M1(pH)[％]＝a1xpH+a2的线性方程。在这种情况下，参数a1和a2是由该拟合曲线推导出的参数。在所示实例中，线性拟合产生下列方程：FCO2_M1(pH)＝-19.177x pH+143.61。在这一实例中，a1＝-19.177且a2＝143.61。

根据另一些实施方案，方程FCO2_M1(pH)＝REL-M1(pH)是根据FCO2_M1(pH)[％]＝b1xpH²+b2x pH+b3的多项式方程。在这种情况下，参数b1、b2和b3是由该拟合曲线推导出的参数。在所示实例中，多项式拟合产生下列方程：

FCO2_M1(pH)＝19.969x pH²-302.25x pH+1146.2。在这一实例中，b1＝19.969且b2＝-302.25且b3＝1146.2。使用多项式拟合的优点在于其比线性拟合更精确，尽管线性拟合对PACO基细胞培养物比较和监测而言已足够精确。

图7a-d图解如何由培养基特异性关系136和一些可容易和动态获得的测量值计算生物反应器104、106的PACO值。

图7a显示在四个不同生物反应器I-IV中在特定培养基M1中生长细胞培养物多日的同时测得的pH值变化。优选地，各pH值使用浸在生物反应器的培养基M1中的pH测量装置，例如电位pH计在所述培养基的pH-CO2平衡下测量。

图7b显示使用图7a的测得实际pH值和培养基特异性关系作为输入对这四个生物反应器的每一个预测的生物反应器的总排气的以[％]计的CO2浓度。例如，培养基M1的培养基特异性关系遵循根据FCO2_M1(pH)[％]＝b1x pH²+b2x pH+b3的多项式方程。参数b1、b2和b3是由图5D和6中描绘的拟合曲线推导出的参数。

例如，在t0(该项目的起点)后4天，在所有生物反应器中测得的pH值为大约6.95。相应地，使用pH值6.95作为输入计算第四天的预期CO2浓度：

FCO2_M1 (pH)[％]＝b1x 6-95²+b2x 6.95+b3

B1、b2和b3是培养基M1的凭经验确定的参数。单位[％]是指：在特定时间生物反应器的总排气体积(对应于总气体流入

)的CO2排气体积分数。

图7c显示在这四个生物反应器的每一个中测得的实际(“测得”)CO2排气分数。从预测CO2排气分数[％]和各生物反应器的实际(测得)CO2排气分数的比较可以推断，存在可能源于细胞培养物中的细胞的代谢和对培养基的pH-CO2平衡具有影响的其它因素的影响的显著差异。

例如，如图3中所示的CO2分析装置122，也称作“二氧化碳传感器”可用于反复测量每单位时间排气中的CO2浓度。CO2传感器的常见实例是红外气体传感器(NDIR)和化学气体传感器。NDIR传感器是通过其特征吸收检测气体环境中的CO2的光谱传感器。或者，CO2传感器可以是微机电传感器。

图7d显示作为图7b的预测CO2排气浓度和图7c的所述一个生物反应器的测得CO2排气浓度的差异生成的生物反应器之一的PACO状态图。

为了计算状态图402的PACO值，将预测和测得的CO2排气浓度(“CO2”或“FCO2”[％])根据本发明的实施方案转化成CO2排气速率[mol/min]。

例如，可以如下对图7a)的各测得pH值进行计算：

预期CO2排气速率:

测得(“实际”)CO2排气速率：

据此，

是用于计算当前PACO值的生物反应器的总排气体积，据此可以使用该生物反应器中的气体流入总量

作为总排气体积。在生物反应器的总排气体积不恒定的情况下，需要在每次测量用作用于计算CO2排气速率的输入值的pH值时测定

例如，在生物反应器具有用于CO2的第一气体流入管道、用于O2的第二气体流入管道、用于N2的第三气体流入管道和用于环境空气的第四气体流入管道的情况下(这四个管道各自中的气流可独立地改变)，可作为

计算

值

是理想气体的Mol体积。

然后，作为无细胞培养基M1中在所述pH值下预期的绝对CO2排气速率和实际测得的生物反应器的CO2排气速率

之间的差值计算在各测得pH值(对应于时间ti)下的PACO值

根据上述公式的PACO值计算的优点在于该公式可有效用于比较具有不同规模、类型或设备的两个或更多个生物反应器的状态。由不涉及离线测量的输入数据计算PACO值。例如用于根据之前的测定生物反应器状态的方法测定样品的pH值或生物质含量的偏差测量(offset measurements)可能增加测量值的偏差。所述偏差通常依赖于在各自的装置和生产现场中使用的设备，因此可能是可靠比较位于不同生产现场的生物反应器的状态的障碍。上述公式因此可能提供生物反应器状态的抗误差(error-robust)全面比较。

但是，上述公式可以许多方式调节：

-可以修改该公式以包括对气体体积的校正因子：上述公式假设具有在273.15K和1.01325*105Pa压力下22.414升的摩尔体积的理想气体。实际上，温度、压力和因此体积可能不同。因此可以使用校正因子或测量数据调节公式和输出值的精确度。

-可以修改该公式以包括对测得的CO2排气浓度的校正因子以补偿压力效应：据此，可以补偿环境压力变化对CO2排气浓度的影响；

-可以修改该公式以包括对排气湿度的校正因子以补偿湿度在排气CO2浓度测量中的影响；

-可以修改该公式以包括对温度的校正因子以补偿温度对所用pH测量装置的影响；可以同时接收由两个或更多个在线pH计测得的pH值并用于计算平均测得pH值以提高pH测量的精确度；

-可以修改该公式以考虑或补偿探针校准的效应，该补偿可以例如以补偿曲线的形式进行，该补偿曲线如果叠加在pH计的测得电压下，使每单位的改变pH的测得电压(例如mV/pH)位移；该曲线可具有适用于补偿获自中性pH探针的pH测量的电流偏差(currentoffset)的斜率和振幅。作为一个实例，如果开启和关闭，pH计的温度补偿设施可导致不同pH读数。或者，pH计可能支持由测得的电压差计算pH的不同算法。可通过在该公式中引入一个或多个补偿因子补偿所有所述效应。

优选地，参考PACO值的计算以与PACO值的计算相同的方式进行，据此在参考生物反应器中测量当前pH值和CO2排气速率。

根据实施方案，控制器单元控制监测的生物反应器104以使当前对控制的生物反应器104计算的PACO值(由在接种后的时间ti测得的pH值和CO2浓度[％])和参考状态图402中的相应参考PACO值之间的差值最小化。

标准化PACO值

根据一些实施方案，计算标准化PACO值，其虑及用于计算PACO值的生物反应器中的培养基M1的体积。

这能够平衡不同的生物反应器体积并因此能够扩大或缩小生物反应器工艺的规模和/或比较具有不同尺寸的生物反应器的细胞培养物。

首先，标准化CO2排气速率“NACO_M1”如下计算：

在对参考生物反应器102计算PACO的情况下，生物反应器中的培养基M1的体积是“参考生物反应器中的培养基的体积”。在对监测和/或控制的生物反应器104计算PACO的情况下，监测和/或控制的生物反应器中的培养基M1的体积是“生物反应器中的培养基的体积”。所述体积不包含培养基上方的气相。

然后，在测量用于预测CO2排气值的pH值时的特定时间ti计算体积标准化PACO值：

根据实施方案，也可以使用生物反应器中的培养基M1的总质量代替生物反应器中的培养基的体积计算标准化CO2排气速率和PACO值。据此，1升培养基通常对应于1千克的质量。

图7d显示由预测和实际测得的CO2排气速率的差值获得的PACO状态图。

图8a是显示参考生物反应器102的参考PACO状态图402、第一监测和/或控制的生物反应器104的PACO状态图802和第二监测和/或控制的生物反应器106的另一PACO状态图804的图。该图表明在时间t0(在图8中描绘的实例中，时间t0是用细胞培养物接种生物反应器时)，生物反应器104的PACO值(“B1”)已明显不同于参考生物反应器在t0的PACO值。根据实施方案，这可用作比较其状态图的生物反应器的pH计已不同校准的指示。假设参考生物反应器的pH测量装置正确校准，在t0(即在培养基包含可调节PACO的任何细胞培养物细胞时或之前)的PACO偏差可用作监测的生物反应器106(“B2”)、104(“B1”)的pH测量装置错误校准并应在开始生长细胞培养物之前正确校准的指示。

在所描绘的实例中，监测的生物反应器106(“B2”)的状态图804在时间t0的PACO值等于参考PACO状态图402在时间t0的参考PACO值。监测的生物反应器104(“B4”)的状态图802在时间t0的PACO值明显不同于参考PACO状态图402在时间t0的参考PACO值。

或者，代替PACO值，可以比较这两个生物反应器的排气的CO2浓度以确定这两个比较的生物反应器的pH测量装置是否相同地校准。启动这两个生物反应器并在相同压力和温度下填充相同无细胞培养基并在这两个生物反应器达到pH-CO2平衡时测量和比较这两个生物反应器中的培养基的当前pH值和当前CO2浓度。如果这两个生物反应器的排气中的CO浓度相等而pH值不相等，或如果这两个生物反应器的pH值相等并且排气中的CO2浓度不相等，比较单元判定这两个生物反应器不同地校准。

错误校准的pH计可能导致基于PACO值比较两种细胞培养物的细胞培养物状态时的不精确结果。这是因为PACO值由pH值导出。因此，为使PACO差值最小化而由控制器采取的任何措施可能无法使PACO差值最小化(这一效应没有显示在图8a和8b中，因为在生物反应器B2中生长细胞培养物的过程中，通过添加碱和提高总气体流入速率改变pH-CO2平衡；因此，尽管参考生物反应器和生物反应器B2的pH计以相同方式校准，B2的PACO状态图明显不同于参考PACO状态图)。

图8b是显示两个生物反应器104、106的PACO状态图802、804与参考生物反应器102的参考PACO状态图402的PACO状态图差异的图。曲线810代表生物反应器104和参考生物反应器的PACO状态图差异，且曲线808代表生物反应器106和参考生物反应器的PACO状态图差异。生物反应器106与PACO参考状态图402的PACO状态图差异明显大于生物反应器104的PACO差异，因为在B2中生长细胞培养物的同时，改变pH-CO2平衡。

附图标记清单

100 用于监测和/或控制生物反应器中的细胞培养物状态的系统

102 参考生物反应器

104 监测和/或控制的生物反应器B1

106 监测和/或控制的生物反应器B2

108 pH测量装置

110 处理器

112 存储器

114 存储介质

116 参考PACO状态图

118 参考PACO状态图

120 用于接收一个或多个参考PACO状态图和培养基特异性关系的接口

122 CO2排气分析仪

124 CO2排气分析仪

126 CO2排气分析仪

128 用于接收在一个或多个生物反应器中测得的参数的接口

130 PACO比较单元

132 控制单元

134 显示器

136 培养基M1的培养基特异性关系

138 培养基M2的培养基特异性关系

140 总气体流入量的传感器

142 pH测量装置

144 总气体流入量的传感器

146 pH测量装置

202-220 步骤

402 PACO参考状态图

502 对四个生物反应器绘制的培养基特异性关系的图

802 监测的生物反应器的PACO状态图

804 监测的生物反应器的PACO状态图

808 与参考PACO状态图的状态图差异

810 与参考PACO状态图的状态图差异

M1 细胞培养基

TGI_B1 生物反应器B1的总气体流入量

TGI_B2 生物反应器B2的总气体流入量

TGI_R 参考生物反应器的总气体流入量

TGO_B1 生物反应器B1的总排气

TGO_B2 生物反应器B2的总排气

TGO_R 参考生物反应器的总排气

TLI_B1 生物反应器B1的总液体流入量

TLI_B2 生物反应器B2的总液体流入量

TLI_R 参考生物反应器的总液体流入量

TLO_B1 生物反应器B1的总(液体)流出量

TLO_B2 生物反应器B2的总(液体)流出量

TLO_R 参考生物反应器的总(液体)流出量

Claims

1.一种用于监测生物反应器(104、106)中的细胞培养物状态与参考生物反应器(102)中的细胞培养物的参考状态的偏差的系统(100)，所述生物反应器包含与参考生物反应器相同的培养基(M1)，所述系统包含：

-存储介质(114)，其包含：

■PACO-参考状态图(116)，所述PACO-参考状态图代表参考PACO值PACO_R-ti相对于时间ti的变化，所述PACO-参考状态图指示在参考生物反应器中测得的CO2排气速率ACO_R-M-ti与参考生物反应器的预测CO2排气速率ACO_R-EXP-ti的差异，所述预测CO2排气速率是在不存在细胞培养物的情况下和在平衡状态下的培养基的pH值等于在测量参考生物反应器中的CO2排气速率ACO_R-M-ti时测得的参考生物反应器的pH值pH_R-ti的条件下参考生物反应器中的所述培养基在pH-CO2平衡状态下的预测排气速率，所述PACO参考状态图依赖于在培养细胞培养物时由参考生物反应器中的细胞培养物的细胞产生的CO2排气的量；

■包含培养基特异性关系(136)的数据对象，所述培养基特异性关系是培养基(M1)特有的并指示当所述培养基与气体体积处于pH-CO2平衡状态并且不含细胞培养物时培养基(M1)的pH值和气体体积中的各自CO2气体分数之间的关系；

-用于在当前时间ti下反复接收(212)在生物反应器中的细胞培养物的培养过程中测得的生物反应器(104、106)的当前CO2排气速率ACO_B1-M-ti、ACO_B2-M-ti和生物反应器(104、106)的培养基的当前pH值pH_B1-ti、pH_B2-ti的接口(128)；

-比较单元(130)，其配置成对于各接收的当前CO2排气速率，计算(214、216)：

■PACO值PACO_B1-ti、PACO_B2-ti，所述PACO值指示在生物反应器(104、106)中测得的CO2排气速率ACO_B1-M-ti、ACO_B2-M-ti与预测CO2排气速率ACO_B1-EXP-ti、ACO_B2-EXP-ti的差异，所述预测CO2排气速率是在不存在细胞培养物的情况下和在平衡状态下的培养基的pH值等于在测量生物反应器(104、106)中的CO2排气速率时测得的生物反应器(104、106)的当前pH值pH_B1-ti、pH_B2-ti的条件下所述生物反应器(104、106)中的所述培养基在pH-CO2平衡状态下的预测排气速率，所述PACO值依赖于在培养细胞培养物时由生物反应器中的细胞培养物的细胞产生的CO2排气的量，使用下列这些作为输入计算PACO值PACO_B1-ti、PACO_B2-ti：

○接收的当前CO2排气速率ACO_B1-M-ti、ACO_B2-M-ti；

○接收的当前pH值pH_B1-ti、pH_B2-ti；

○在接收当前CO2排气速率时ti生物反应器的总气体流入速率TGI_B1、TGI_B2；和

○培养基特异性关系(136)；

■计算出的PACO值PACO_B1-ti、PACO_B2-ti和PACO-参考状态图(116)中的各自参考PACO值PACO_R-ti之间的差值；

■比较单元(130)配置成输出(218)计算差值，所述计算差值指示生物反应器(104、106)中的细胞培养物的状态与参考状态的偏差。

2.权利要求1的系统(100)，所述培养基特异性关系是通过数学拟合培养基(M1)的pH值和在气体体积中各自测得的CO2气体分数的多个凭经验确定的对获得的方程FCO2_M1(pH)＝REL-M1(pH)，其中：

-FCO2_M1(pH)是在所述培养基具有给定pH值并与所述气体体积处于pH-CO2平衡状态并且不含细胞培养物时培养基(M1)的样品上方的气体体积中的预测CO2气体分数；

-所述pH值是输入参数值并代表在不存在细胞培养物的情况下在pH-CO2平衡状态下的培养基(M1)的pH值；

-其中REL-M1是通过运算符连接的一个或多个参数的集合，这些参数如下获得：

■将不含细胞培养物的培养基(M1)的样品调节至多个不同的pH值，由此使所述样品达到与气体体积的pH-CO2平衡，

■测定与样品中的培养基处于pH-CO2平衡下的各自气体体积中的CO2气体分数，

■对照样品的各自平衡pH值对测定的CO2气体分数作图，

■在作图值中拟合曲线(502)和由所述拟合曲线推导培养基特异性关系的参数。

3.前述权利要求任一项的系统(100)，接收的当前CO2排气速率、接收的当前pH值、生物反应器在特定时间ti的总气体流入速率和培养基特异性关系是用于计算监测的生物反应器的PACO值PACO_B1-ti、PACO_B2-ti的仅有输入参数。

4.前述权利要求任一项的系统(100)，所述系统配置成计算PACO值PACO_B1-ti、PACO_B2-ti，PACO值的计算包括：

-将接收的当前pH值输入培养基特异性关系以计算在测量当前CO2排气速率和当前pH值时与培养基处于平衡状态的生物反应器(104、106)的气体体积中的预测CO2浓度FCO2_EXP；

-将预测CO2浓度FCO2_EXP乘以生物反应器的总气体流入速率以获得生物反应器的预测CO2排气速率ACO_EXP；预测CO2排气速率是在不存在细胞培养物的情况下和在平衡状态下的培养基的pH值等于输入所述培养基特异性关系的接收的当前pH值的条件下所述培养基在pH-CO2平衡状态下的预测排气速率；和

-从生物反应器的预测CO2排气速率ACO_B1-EXP-ti、ACO_B2-EXP-ti中减去生物反应器的测得CO2排气速率ACO_B1-M-ti、ACO_B2-M-ti以获得PACO值。

5.权利要求4的系统(100)，所述生物反应器在当前时间ti的预测CO2排气速率ACO_B1-EXP-ti、ACO_B1-EXP-ti的计算如下进行：ACO_EXP-ti

其中TGI_B1是生物反应器(104、106)在当前时间ti的气体流入总量，且其中FCO2_EXP是在测量当前CO2排气速率和当前pH值时与培养基处于平衡状态的生物反应器(104、106)的气体体积中的预测CO2浓度。

6.前述权利要求任一项的系统(100)，所述计算差值的输出包括：-在计算出的PACO值PACO_B1-ti、PACO_B2-ti和PACO-参考状态图(116)中的各自参考PACO值PACO_R-ti之间的计算差值(808、810)超过阈值的情况下，自动输出警报信号。

7.前述权利要求任一项的系统(100)，所述培养基是碳酸盐缓冲培养基。

8.前述权利要求任一项的系统(100)，所述参考生物反应器与生物反应器(104、106)的区别在于一个或多个下列特征：

a)生物反应器中的气体体积，

b)生物反应器中的培养基体积，

c)生物反应器的雷诺数，

d)生物反应器的牛顿数，

e)生物反应器的尺寸，

f)生物反应器和/或生物反应器挡板的几何特征，

g)搅拌器配置，

h)搅拌速率，

i)生物反应器的氧气体积传质系数kLa，

k)功率输入，

l)生物反应器中的压力，

m)培养基中的气泡保持时间，

n)培养基中的气泡尺寸和分布，

o)表面速度，

p)作为一个或多个参数a)-o)的导数计算的参数。

9.前述权利要求任一项的系统(100)，在当前时间ti的PACO值PACO_B1-ti的计算包括对于生物反应器(104)的各接收的当前CO2排气速率ACO_B1-M-ti和pH值pH_B1-ti，计算：

-根据：FCO2_B1-EXP-ti[％]＝REL-M1 pH_B1-ti的生物反应器(104)的当前排气体积的预期CO2排气分数FCO2_B1-EXP-ti[％]，其中FCO2_B1-EXP-ti[％]是在当前时间ti以％计的生物反应器(104)的总排气体积TGO_B1的预测CO2排气分数，使用接收的当前pH值pH_B1-ti作为用于REL-M1pH_B1-ti的输入值计算所述预测，其中REL-M1是培养基(M1)的培养基特异性关系(136)，其中pH_B1-ti是在当前时间ti在生物反应器(104、106)的培养基中接收的当前pH值；

-根据：

的预期CO2排气速率ACO_B1-EXP-ti[mol/min]值，其中ACO_B1-EXP-ti[mol/min]值是当生物反应器的培养基具有当前测得的pH值并与所述培养基上方的气相处于pH-CO2平衡时生物反应器(104)的预期CO2排气速率

其中TGI_B1是生物反应器(104)在当前时间ti的气体流入总量；

-根据：PACO_B1-ti＝ACO_B1-EXP-ti[mol/min]-ACO_B1-M-ti[mol/min]的PACO_B1-ti[mol/min]值，其中ACO_B1-M-ti[mol/min]是在生物反应器(104)中在时间ti测得的CO2排气速率

10.前述权利要求任一项的系统(100)，参考生物反应器中的培养基具有第一体积VRM和第一总质量，生物反应器(104、106)中的培养基具有第二体积V1M和第二总质量，第一体积和第二体积彼此不同，每一计算出的PACO值PACO_B1-ti及其在PACO-参考状态图(116、402)中的各自参考PACO值PACO_R-ti之间的差值的计算包括：

-通过处理器将计算出的PACO值PACO_B1-ti除以第二体积V1M；和通过处理器将PACO-参考状态图(116)中的各自参考PACO值PACO_R-ti除以第一体积VRM；或

-通过处理器将计算出的PACO值PACO_B1-ti除以第二质量；和通过处理器将PACO-参考状态图(116)中的各自参考PACO值PACO_R-ti除以第一质量。

11.前述权利要求任一项的系统(100)，所述PACO参考状态图(116、402)覆盖运行参考生物反应器的多个阶段，所述阶段包含：

-进料阶段，在此期间在参考生物反应器中在给定进料速率存在下培养细胞培养物，所述细胞培养物不分泌影响培养基的pH值的代谢物；

12.前述权利要求任一项的系统(100)，所述系统包含配置成自动改变生物反应器(104、106)的一个或多个控制参数以使计算出的PACO值PACO_B1-ti和PACO-参考状态图(116)中的各自参考PACO值PACO_R-ti之间的差值最小化的控制单元(132)。

13.权利要求12的系统(100)，

-其中在PACO值PACO_B1-ti高于PACO参考状态图中的各自参考PACO值PACO_R-ti的情况下，所述控制单元通过执行一种或多种下列操作自动改变生物反应器(104、106)的一个或多个控制参数：降低进入生物反应器(104、106)的总空气流入速率和/或降低O2气体流入速率和/或降低CO2气体流入速率和/或降低碱流入速率和/或改变生物反应器的压力或温度；

-其中在PACO值PACO_B1-ti低于PACO参考状态图中的各自参考PACO值PACO_R-ti的情况下，所述控制单元通过执行一种或多种下列操作自动改变生物反应器(104、106)的一个或多个控制参数：提高总空气流入速率和/或提高O2气体流入速率和/或提高进入生物反应器(104、106)的CO2气体流入速率和/或提高碱流入速率和/或改变生物反应器的压力或温度。

14.前述权利要求任一项的系统(100)，其进一步包含生物反应器(104、106)。

15.一种监测生物反应器(104、106)中的细胞培养物状态与参考生物反应器(102)中的细胞培养物的参考状态的偏差的方法，所述生物反应器包含与参考生物反应器相同的培养基(M1)，所述方法包含：

-通过生物反应器状态监测系统(100)的比较单元(130)接收PACO-参考状态图(116)，所述PACO-参考状态图代表参考PACO值PACO_R-ti相对于时间ti的变化，所述PACO-参考状态图指示在参考生物反应器中测得的CO2排气速率ACO_R-M-ti与参考生物反应器的预测CO2排气速率ACO_R-EXP-ti的差异，所述预测CO2排气速率是在不存在细胞培养物的情况下和在平衡状态下的培养基的pH值pH_R-M-ti等于在测量参考生物反应器中的CO2排气速率ACO_R-M-ti时测得的参考生物反应器的pH值的条件下参考生物反应器中的所述培养基在pH-CO2平衡状态下的预测排气速率，所述PACO参考状态图依赖于在培养细胞培养物时由参考生物反应器中的细胞培养物的细胞产生的CO2排气的量；

-通过比较单元接收包含培养基特异性关系(136)的数据对象，所述培养基特异性关系是培养基(M1)特有的并指示当所述培养基与气体体积处于pH-CO2平衡状态并且不含细胞培养物时培养基(M1)的pH值和气体体积中的各自CO2气体分数之间的关系；

-在当前时间ti下反复接收(212)在生物反应器中的细胞培养物的培养过程中测得的生物反应器(104、106)的当前CO2排气速率ACO_B1-M-ti、ACO_B2-M-ti和生物反应器(104、106)的培养基的当前pH值pH_B1-ti、pH_B2-ti；

-通过比较单元计算在各接收的当前CO2排气速率下：

■PACO值PACO_B1-ti、PACO_B2-ti，所述PACO值指示在生物反应器中测得的CO2排气速率ACO_B1-M-ti、ACO_B2-M-ti与预测CO2排气速率ACO_B1-EXP-ti、ACO_B2-EXP-ti的差异，所述预测CO2排气速率是在不存在细胞培养物的情况下和在平衡状态下的培养基的pH值等于在测量生物反应器(104、106)中的CO2排气速率时测得的生物反应器(104、106)的pH值pH_B1-ti、pH_B2-ti的条件下生物反应器中的所述培养基在pH-CO2平衡状态下的预测排气速率，所述PACO值依赖于在培养细胞培养物时由生物反应器中的细胞培养物的细胞产生的CO2排气的量，PACO值的计算PACO_B1-ti、PACO_B2-ti使用下列作为输入：

○接收的当前CO2排气速率ACO_B1-M-ti、ACO_B2-M-ti；

○接收的当前pH值pH_B1-ti、pH_B2-ti；

○培养基特异性关系(136)；

-通过比较单元(130)输出计算差值，所述计算差值指示生物反应器(104、106)中的细胞培养物的状态与参考状态的偏差；

其中所述生物反应器状态监测系统(100)是权利要求1-14任一项的系统(100)。

16.权利要求15的方法，所述PACO参考状态图包含多个参考PACO值，所述方法进一步包含如下计算参考PACO值：

-接收包含培养基特异性关系的数据对象；

-在当前时间ti下反复接收以

计的参考生物反应器(102)的当前CO2排气速率ACO_R-M-ti和在参考生物反应器中培养细胞培养物的同时在所述当前时间ti下测得的参考生物反应器(102)的培养基的当前pH值pH_R-ti；

-对于接收的各对当前CO2排气速率ACO_R-M-ti和当前pH值pH_R-ti，计算参考PACO值PACO_R-ti之一、参考PACO值的计算使用下列作为输入：

○接收的参考生物反应器的当前CO2排气速率ACO_R-M-ti；

○接收的参考生物反应器的当前pH值pH_R-ti；

○在接收当前CO2排气速率时ti参考生物反应器的总气体流入速率；和

○培养基特异性关系(136)。

17.权利要求16的方法，其进一步包括如下建立参考生物反应器(102)的PACO-参考状态图：

-绘制CO2排气速率中的参考PACO值PACO_R-ti相对于时间的曲线图；

18.权利要求16或17的方法，在各自当前时间ti的各参考PACO值PACO_R-ti的计算包括对于参考生物反应器(102)的各接收的当前CO2排气速率ACO_R-M-ti和pH值，计算：

-根据：FCO2_R-EXP-ti[％]＝REL-M1 pH_R-ti的参考生物反应器(102)的当前排气体积的预期CO2排气分数FCO2_R-EXP-ti[％]，其中FCO2_R-EXP-ti[％]是在当前时间ti以％计的参考生物反应器(102)的总排气体积TGO_R的预测CO2排气分数，使用接收的当前pH值pH_R-ti作为用于REL-M1 pH_R-ti的输入值计算所述预测，其中REL-M1是培养基(M1)的培养基特异性关系(136)，其中pH_R-ti是在时间ti在参考生物反应器(102)的培养基中的当前pH值，

-根据：

-根据：PACO_R-ti＝ACO_R-EXP-ti[mol/min]-ACO_R-M-ti[mol/min]的PACO_R-ti[mol/min]值，其中ACO_R-M-ti[mol/min]是在参考生物反应器(102)中在时间ti测得的以

计的CO2排气速率；

-根据：PACO_R-ti＝ACO_R-EXP-ti[mol/min]-ACO_R-M-ti[mol/min]的PACO_R-ti[mol/min]值。