JP2014527824A - Co2プロファイル培養法 - Google Patents
Co2プロファイル培養法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2014527824A JP2014527824A JP2014531191A JP2014531191A JP2014527824A JP 2014527824 A JP2014527824 A JP 2014527824A JP 2014531191 A JP2014531191 A JP 2014531191A JP 2014531191 A JP2014531191 A JP 2014531191A JP 2014527824 A JP2014527824 A JP 2014527824A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cell
- cells
- carbonic anhydrase
- culture
- value
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000012136 culture method Methods 0.000 title 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 285
- 102100024633 Carbonic anhydrase 2 Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 101710167917 Carbonic anhydrase 2 Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 101000760643 Homo sapiens Carbonic anhydrase 2 Proteins 0.000 claims description 65
- 102000057327 human CA2 Human genes 0.000 claims description 60
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 47
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 46
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 46
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 44
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 40
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 37
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 claims description 35
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 claims description 35
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 24
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 15
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 13
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 10
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 7
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 7
- 108010026463 Carbonic Anhydrase V Proteins 0.000 claims description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 4
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 21
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 21
- 238000011068 loading method Methods 0.000 abstract description 15
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 abstract description 11
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 abstract description 6
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 abstract description 6
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 abstract description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 abstract 2
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 49
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 34
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 28
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 24
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 23
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 19
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 19
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 16
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- OUZWUKMCLIBBOG-UHFFFAOYSA-N ethoxzolamide Chemical compound CCOC1=CC=C2N=C(S(N)(=O)=O)SC2=C1 OUZWUKMCLIBBOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229950005098 ethoxzolamide Drugs 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 11
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 11
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 10
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 10
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 10
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 9
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 9
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 8
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 7
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 7
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 6
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 6
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 6
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 6
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 5
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 5
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 5
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- -1 proton Chemical compound 0.000 description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 5
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012482 calibration solution Substances 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000306 component Substances 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 2
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 2
- 102100029193 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Human genes 0.000 description 2
- 101710099301 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 2
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 238000000575 proteomic method Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 2
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- VADKRMSMGWJZCF-UHFFFAOYSA-N 2-bromophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1Br VADKRMSMGWJZCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VOZDNCFKGOLECZ-BTVCFUMJSA-N 2-hydroxypropanoic acid;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound CC(O)C(O)=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O VOZDNCFKGOLECZ-BTVCFUMJSA-N 0.000 description 1
- 241001244729 Apalis Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010051152 Carboxylesterase Proteins 0.000 description 1
- 102000013392 Carboxylesterase Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- LLQPHQFNMLZJMP-UHFFFAOYSA-N Fentrazamide Chemical compound N1=NN(C=2C(=CC=CC=2)Cl)C(=O)N1C(=O)N(CC)C1CCCCC1 LLQPHQFNMLZJMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229920002274 Nalgene Polymers 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 239000011542 SDS running buffer Substances 0.000 description 1
- 229940122055 Serine protease inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710102218 Serine protease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 230000003416 augmentation Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001733 carboxylic acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000036978 cell physiology Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000013373 clone screening Methods 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000007872 degassing Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000003269 fluorescent indicator Substances 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000004868 gas analysis Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002706 hydrostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000012105 intracellular pH reduction Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 238000000865 membrane-inlet mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- VUZPPFZMUPKLLV-UHFFFAOYSA-N methane;hydrate Chemical compound C.O VUZPPFZMUPKLLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 108010068617 neonatal Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001139 pH measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007793 ph indicator Substances 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010066533 ribonuclease S Proteins 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- DYPYMMHZGRPOCK-UHFFFAOYSA-N seminaphtharhodafluor Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C(C=CC=1C3=CC=C(O)C=1)=C3OC1=CC(N)=CC=C21 DYPYMMHZGRPOCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- ALZJERAWTOKHNO-UHFFFAOYSA-M sodium;dodecyl sulfate;3-morpholin-4-ylpropane-1-sulfonic acid Chemical compound [Na+].OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1.CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O ALZJERAWTOKHNO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O thiamine pyrophosphate Chemical compound CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 229940071127 thioglycolate Drugs 0.000 description 1
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M thioglycolate(1-) Chemical compound [O-]C(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003211 trypan blue cell staining Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
- C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
- C12Y402/01001—Carbonate dehydratase (4.2.1.1), i.e. carbonic anhydrase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
ポリペプチドの組換え産生において、細胞密度、生産性、および産物の品質などのプロセス全体の設計によって影響を受ける関心対象ポリペプチドの高い発現収率が望ましいのみならず、産生費用および下流のプロセシングも同様に考慮しなければならない。
(a)培養用培地において、炭酸脱水酵素をコードする第一の核酸と、ポリペプチドをコードする第二の核酸とを含む哺乳動物細胞を培養する段階;および
(b)ポリペプチドを細胞または培養用培地から回収して、それによってポリペプチドを産生する段階。
(a)ポリペプチドをコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養用培地において培養する段階;および
(b)ポリペプチドを細胞または培養用培地から回収して、それによってポリペプチドを産生する段階。
本明細書において、ヒト炭酸脱水酵素II(hCAII)をコードする構造遺伝子を安定にトランスフェクトした細胞株の生成を報告する。
hCAIIコード核酸配列を、データバンクNCBI登録NM000067(SEQ ID NO:01)から得た。
トランスフェクトされていない親細胞株を参照株として、さらなる増殖を観察することができなくなるまで選択培養用培地中で培養した。この時点で、選択工程は完了していた。クローンのスクリーニング中、クローンおよび対照HyQ細胞株をHyQ培地中で約1.5ヶ月間維持した。メトトレキサートはこの培地に含めなかった。選択されたトランスフェクトした細胞は常に、メトトレキサートを含む培地中で培養した。
全ての値を標準化して、それによって培養5日目でのトランスフェクトされていない親細胞株(=対照)の値は100%を示す。異なる細胞クローンおよび対照の増殖特徴を図2に示す。対照HyQという用語は、トランスフェクトされていない親対照細胞株がHyQ培地中で増殖したことを示す。
-シェーカーフラスコ培養において、得られた最高細胞密度と、親細胞の平均比増殖速度の70%以上の平均比増殖速度とを有する細胞を選択する段階;および/または
-選択圧を適用せずに、培養3もしくは4日目においてよりも培養5もしくは6日目において高い特異的産物産生速度を有する細胞を選択する段階;および/または
-18O-CO2-H2O交換決定法において最高の炭酸脱水酵素活性を有する細胞を選択する段階。
hCAII発現細胞クローンE11を異なるCO2プロファイルで培養した。培養用培地はガラクトースを含み、このように産生されたラクテートは再代謝された。
hCAII発現細胞株の作製
-簡単なスクリーニング法;得られたクローンは、親細胞株と比較してバッチ培養における細胞の増殖、代謝、またはグリコシル化に対する効果を示さない。
-CHO細胞株においてhCAII遺伝子の線状DNAトランスフェクションによる活性なhCAII酵素の産生。
-hCAII発現細胞株に関してCO2酸負荷後のより高い回復初速度に関連する細胞質のより急速な再アルカリ化。
-hCAIIの存在は、特に大きい培養容量での工業的哺乳動物細胞培養条件下での短期間のpH回復において影響を有しうる。
-細胞の細胞質の効率的な再アルカリ化に関してhCAII酵素の正の作用を示す、CO2プロファイル培養下でのhCAII発現細胞に関するよりアルカリ性のpHi。
-CO2プロファイルの存在下でhCAII発現細胞株の細胞増殖の変化。
-hCAII発現細胞株に関してCO2プロファイルの存在下で最小のpHi変動およびよりアルカリ性のpHi値。
-CO2プロファイルによるクローン細胞株および対照細胞株のより高い特異的生産性に関連する細胞周期のG0G1期に入ること。
-hCAII発現細胞はより早期にG0G1期に入り、非hCAII発現細胞と比較するとこの期の細胞画分の増加はより早期であった。
生産性を増加させるために、長期間のアルカリpHiおよび細胞周期のG0G1期に細胞が入ることを利用するために、たとえば誘導型プロモーターを用いることによって、異なる培養相中にhCAII発現を調節することができる「オンオフ」機構を設計すべきである。
SEQ ID NO:01 ヒト炭酸脱水酵素IIをコードする核酸
SEQ ID NO:02 ヒト炭酸脱水酵素IIのアミノ酸配列
SEQ ID NO:03 ヒト炭酸脱水酵素II S2A変種のアミノ酸配列
SEQ ID NO:04 プライマー
SEQ ID NO:05 プライマー
CHO細胞のクローンを調製するために、三段階アプローチを行う。第一に、関心対象遺伝子(GOI)を適切な哺乳動物発現ベクターにおいてクローニングする。第二に、得られたプラスミドを大腸菌において調製して、最後に構築物を有するプラスミドをCHO細胞に導入し、そこで所望のDNAをゲノムに組み入れる。
hCAII遺伝子(NCBI参照番号:NM000067)の哺乳動物発現ベクターは大きさ4807bpを有し、これは大腸菌においてアンピシリン抵抗性(Ampr)を付与する。pJRC36ベクターの構築は、STERLING, D. AND CASEY, J.R., Biochem. J. 344 (1999) 221-229によって記述される。
ヌクレオフェクションのために線状DNAを調製するために、DNA 20μgを、制限酵素ApaLI 100単位を含む全量200μlの反応混合物においてインキュベートした。37℃で4時間のインキュベーションにより制限消化が起こった。その後、試料100ngをゲル電気泳動によって分析した。DNA線状化の確認後、DNAから酵素および塩を除去するために、フェノール-クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によるさらなる精製段階を行った。
長さ20〜22ヌクレオチドおよび約50%のGC含有量を有する、シークエンシング目的のためのプライマーを選択した。プライマーの融解温度は、二本鎖DNA(dsDNA)の50%が変性する温度として定義される。アニーリング温度(TA)は、プライマーが一本鎖DNA鋳型にアニールする温度であり、TMより5℃低いと考えられる。融解温度は、60℃から80℃の間であり、プライマー対の間で5℃を超えて異なることがなかった。プライマーは、3塩基対を超えてのプライマー間相同性を有しないように設計した。同様に、正確な結合を確実にするために、プライマーの3'末端に複数のGまたはC残基を含めることが考慮された。
hCAIIのシークエンシングは、Center for Biotechnology(CeBiTec, Bielefeld, Germany)で行った。
ヌクレオフェクションは線状DNAについて行った。CHO細胞のヌクレオフェクションを、製造元(Amaxa Biosystems, Cologne, Germany)によって提供されるプロトコールに従ってNucleofector(商標)IIによって行った。簡単に説明すると、細胞5×106個を採取して、Cell Line Nucleofector(商標)溶液V 100μlおよび線状DNA 4μgと軽く混合して、0.1 cmギャップキュベットに移した。直後に、細胞をNucleofector(商標)II(Amaxa Biosystems)のプログラムU-024によってパルスした後、予め加温したHyQ培地10mlを含む15ml falconチューブにピペットで移して、200×gでRTにおいて10分間遠心沈降させた。沈降物を予め加温したHyQ培地5mlに浮遊させて、T-25フラスコに移した。37℃および5%CO2で24時間インキュベートした後、細胞を生存率および発現(トランスフェクション効率)の両方に関してアッセイした。48時間後、クローン混合物を単クローン単離のために限界希釈に供した。
抗体を産生するチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株を用いた。ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)陰性の親CHO細胞株に、DHFRおよび抗体の両方の遺伝子を含む組換え型ベクターをトランスフェクトすることによって、細胞株を作製した。トランスフェクトした遺伝子を、DHFR阻害剤およびメトトレキサート(MTX)によって増幅した。高い産生細胞を選択してクローニングした。最終細胞株はまた、ヒグロマイシンに対する抵抗性も含む。
メトトレキサートを含む前培養用培地を接種物調製のために用いて、産生培地において主培養を行った。異なる成分をMilliQ-H2Oに溶解した。培地のpH値を、25%(v/v)HClによってpH 7.2に調節した。濾過滅菌(0.2μm)して補助物質を添加後、培地を4℃で保存した。滅菌試験を37℃で48時間行って、培地を産生後多くて4週間用いた。市販のHyQ(登録商標)SFM4CHO(商標)ユーティリティ培地(HyClone)をヌクレオフェクション後の増殖培地として用いた。
以下は、比速度を算出するための式である。このタイプの培養戦略に関してバイオリアクターからの流入または流出はないことから、体積は一定であると見なされる(等式10.2)。増殖しつつある培養の細胞濃度(X)は、等式10.2に従って時間(t)と共に変化して、積分して対数をとった後、比増殖速度(μ)を算出するための等式を作成する。培地培養の基質は、細胞増殖の結果として消費される。それらは、代謝プロセスを維持するためにおよび産物を形成するために細胞によって用いられる。特異的基質消費(qS)および産物形成速度(qP)をそれぞれ、等式10.4および10.5によって算出し、平均細胞濃度(Xm)を等式10.6に従って算出した。
全ての実験に関して十分な細胞起源を確保するために、当初の細胞株(対照)のワーキングセルバンク(WCB)を設定した。それゆえ、指数増殖培養に関して、細胞密度および生存率を測定した。その後、細胞を収集して、細胞沈降物を5%DMSO(ジメチルスルホキシド)を含む既定量の冷却した前培養用培地に、最終細胞濃度が1×107個/mlとなるように浮遊させた。この細胞浮遊液4mlを名目体積4.5mlのクライオバイアル(Nunc(登録商標))中でアリコートにして、細胞浮遊液を、IceCube 1800(SY-LAB GmbH)によって製造元の説明書(Instructions Manual for Ice Cube 1800, V4.01 from 08.01.2001, SY-LAB)に従って凍結した。クライオバイアルを長期間保存のために液体窒素のガス相に移した。
バックアップまたは接種培養および平行試験バッチを、バイオリアクターチューブおよび振とうフラスコなどの使い捨ての培養システムにおいて行った。50mlポリプロピレンバイオリアクター円錐チューブ(TPP)および異なる名目容量(125ml、250mlおよび500ml)のポリカーボネートアーレンマイヤーフラスコ(Corning)を用いた。いずれも、無菌性を維持してガス交換を容易にするために、0.22μm疎水性メンブレンを組み入れたポリエチレンプラグシールキャップを備えた。バイオリアクターチューブに関して、作業容量は10mlから20mlの範囲であり、振とうフラスコの場合、作業容量は名目容量の40%から60%の範囲であった。培養は、インキュベータ(Mytron)において37℃で5%CO2において80%湿度で行った。125rpmでの軌道振とう(Innova 2300, New Brunswick Scientific)またはバイオリアクターチューブに関しては185rpm(ES-X, Kuhner)および0度の傾斜角によって、撹拌を行った。
対照細胞株の1つのWCBクライオバイアルを、37℃の水浴中で急速に融解して、細胞浮遊液を前培養用培地(RT)10mlと混合した。DMSOを除去するために遠心沈降(200×g、10分間)させた後、沈降物を、室温で前培養用培地10mlに浮遊させた。細胞密度および生存率の測定後、125ml振とうフラスコに細胞5×105個/mlを接種した。
細胞を6×105個/mlで播種して、作業容量90mlの250ml振とうフラスコにおいて185rpmで前培養用培地において培養した。2日間の適応相の後、主培養を産生培地に接種した。試料2mlを細胞密度分析のために毎日採取して、1mlをRTで10 分間遠心分離(200×g)した。無細胞試料中のアンモニウム濃度を測定して、残っている上清をアリコートにして、グルコース、ラクテート、および産物分析のために-20℃で保存した。生存率が40%未満に低下した場合には培養を中止した。細胞を回収して無細胞上清40mlを-20℃で保存した。
クローン細胞株の生成に関して、選択培養条件下(選択圧)での96ウェルプレートでの培養によって単細胞が得られるように、クローンプールを希釈した。ヌクレオフェクションの48時間後、細胞密度および生存率をチェックした。クローンプールを遠心沈降させて、沈降物を選択培地(5%FBSおよび400μg/ml G418を添加したHyQ培地)中で生存細胞2×103個/mlの濃度に浮遊させた。96ウェルプレート(平底、Nunclon(商標)、Nunc)の各ウェルにおいて選択培地150μl中で生存細胞100、20、10、および5個を接種するために、さらに希釈を行った。コロニーを形成させるために、プレートを37℃および5%CO2でインキュベートした。7日後、選択培地50μlをウェルに加えた。選択培地において8日から12日の間に、プレートを定期的にチェックして、1つのコロニーを含むウェルに印をつけた。選択法の開始後17日目に、最初に培地を吸引して、PBSによる洗浄段階の後、細胞を1×トリプシン(Invitrogen)50μlと共に37℃で5分間インキュベートすることによって1つのコロニーをトリプシン処理した。次に、トリプシン処理した細胞を24ウェルプレートに移して、選択圧をかけずにさらに培養した。コロニーの大きさが許す限り、コロニーを35mm皿においてさらに培養した。90%を超えるコンフルエンシーに達すると、細胞の一部を採取して、hCAII発現分析のために調製して、他の部分をt-25フラスコ、t-75フラスコ、バイオリアクターチューブ、および最後に125mlアーレンマイヤーフラスコにおいてさらに増殖させた。指数増殖期の中心で細胞を分割して、その半分を、5%DMSOを含むHyQ培地中で凍結保存した。他の半分を遠心分離して、前培養用培地に浮遊させて、さらに指数増殖期の中心まで培養した。5%DMSOを有する前培養用培地において凍結保存を行った。HyQ培地におけるスクリーニング工程全体において、対照細胞株を培養して、それに従って凍結保存した。
バッチ培養を、作業容量1.5LのマルチバイオリアクターシステムBiostat(登録商標)B-DCU(Sartorius AG)において行った。工程パラメータのオンラインモニタリングを、pH電極、pO2電極、pCO2電極および温度電極などの定位置のセンサーによって行った。工程パラメータは、DCUローカルコントローラー(Sartorius AG)を通して制御した。pH値は、1M NaOHまたは1M HClを添加することによって自動的に7.20±0.01に制御した。バイオリアクターの通気は、インペラー下で培養液中に浸したリングスパージャーによって滅菌ガス混合物(0.2μ入口滅菌フィルター)によって行った。排気ガスは、排気ガス冷却器によって冷却され、出口滅菌フィルターの中を通ってバイオリアクターから出た。バイオリアクターは、2つの4枚刃Rushton型インペラーを備えた。pO2制御に関して、ガス流速(GAFR)および撹拌(STIR)のカスケードを、全流速60mlによって比率モードで用いた。空気と窒素とを含む混合ガスを用いて、溶存酸素濃度を30.0±0.1%空気飽和で維持した。空気流速が最高値に達すると、撹拌(第二のカスケードパラメータ)を細胞酸素要求量に応じて制御した。初期撹拌値は80rpmであった。CO2とN2のさらなる混合物を用いてpCO2を所望の濃度(一定の5%CO2、または5%から25%CO2への持続的CO2プロファイル)で制御した。バイオリアクター温度は37℃に維持され、ジャケット水温を通して制御された。CO2制御培養計数間の浸透圧の差を除外するために、較正された蠕動ポンプを通して1M NaCl(1843 ミリオスモル/kgと同等)を添加してこのパラメータを手動で補正した。泡立ちを避けるために、必要であれば1%消泡液を添加した。プローブが定位置にあり1.5l PBSを充填したリアクターを圧力試験に供した。その後、121℃で50分間の蒸気滅菌を行った。
培養物の細胞密度および生存率を、自動細胞計数システムCedex(Cell Density Examination System, Roche Innovatis GmbH)によって測定した。測定法は、生存細胞および死細胞を決定するための十分に確立されたトリパンブルー色素排除法に基づく。試料の取り扱い、染色、細胞計数、画像獲得、および分析は、Cedexによって自動的に行った。よりよい精度のために、各試料に関して各1mlの2回の測定を行った(画像30個)。使い捨てのバイオリアクター実験由来の試料を、測定前にPBSによって1:2に希釈した。
自動グルコース-ラクテートアナライザYSI 2700D Selectを、上清中のこれらのパラメータを測定するために用いた。機器は、既定の濃度のグルコースおよびラクテート溶液によって自動的に較正する。それぞれに関して試料150μlが必要である繰り返し測定を行った。試料は全て、測定濃度が標準液の濃度未満となるようにPBS緩衝液中で希釈した。
アンモニウムの特異的でありかつ感度のよい測定は、アルカリ環境でアンモニウムを蛍光誘導体へと誘導体化することによって行われる。測定するために、RT試薬(メタノール1ml中にOPA25mg、チオグリコレート25mg、0.4Mホウ酸ナトリウム緩衝液10mlによってpHを10.4にする)1.3mlを1.5ml蛍光キュベット(Plastibrand(登録商標)、Brand)にピペットで移し、ベースライン/値をゼロに調節した。次に、無細胞試料20μlを試薬と混合して、反応工程を追跡した。評価された最高発光強度を記録した。試料中のアンモニウム濃度を決定するため、参照値(標準液5.56mMアンモニウム)をそれに応じて測定した。試料中のアンモニウム濃度は以下の関係によって決定した。
上清の浸透圧を、凝固点降下浸透圧計(Osmomat Auto, Gonotech GmbH)を用いて測定した。試料の測定は、無細胞上清150μlによって行った。浸透圧の値は、ミリオスモル Kgとして表記した。MilliQ-H2O(0 ミリオスモルl/kg)および既定の浸透圧の標準液(280 ミリオスモル/kgまたは320 ミリオスモル/kg;Gonotech GmbH)によって2点較正を行った。
組換え型タンパク質の濃度は、AG Cell Culture Technologyの技術者によるサイズ排除高速液体クロマトグラフィー(SEC-HPLC)によって行った。
pH値およびCO2濃度の定量的測定を、自動血中ガスアナライザAVL COMPACT 3(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)によって行った。測定には試料100μlの量が必要である。CO2(%)を等式10.10によって算出した。
フローサイトメトリー分析は、励起波長488nmのアルゴンレーザーを用いてFACSCalibur(商標)(Becton Dickinson)によって行った。データ獲得および分析は、CellQuest(商標)Proソフトウェアを備えたG4 Apple Macintoshコンピューターを用いて行った。前方光散乱(FSC)および側方散乱(SSC)を用いて細胞の大きさおよび粒度を調べた。
pHi測定を、市販のpHi蛍光指示薬であるCarboxy SNARF-1 AM(Molecular Probes Inc.)によってフローサイトメトリーによって行った。この色素は、細胞内に容易に入り、非特異的なエステラーゼによって加水分解されて遊離の蛍光色素を生じるアセトキシメチル(AM)エステルである。SNARF-1 AMは、生理的範囲内のpHi変化に対して非常に感度が高い。これは488nmから530nmの間で励起され、蛍光発光は2波長で、典型的に約580nm(FL2-H)および640nm(FL3-H)でモニターされる。これは、pHiをより正確に決定するために蛍光発光の波長比を算出できることから特に興味深い。この比測定技術を用いることにより、光退色、細胞の厚さ、ならびに指示薬(SNARF(登録商標)pH指示薬、製品情報、2003、Molecular Probes Inc.)の漏出および不均一な負荷などの多数の蛍光測定のアーチファクトが除去される。本明細書において。擬似ヌル較正法を用いた。方法は、(i)弱酸または塩基の非電離型のみが細胞膜を通過することができる、(ii)解離定数、pKaおよびpKbが細胞の内外で同じであり、および(iii)pHiを調節する機構が、観察されるpHi(または蛍光)の重要な変化に影響を及ぼさないという仮定に基づいている。較正溶液を、弱塩基の濃度と弱酸の濃度がpHiにおいて等しいが反対の変化を生じる(すなわち、pHa=pHb)ように調製すると、単純化を検討することができる。pHi決定に関して得られた関係を等式10.11において表す。
pHiの調節を、重炭酸イオンによる細胞内酸性化中にフローサイトメトリー分析によって調べた。輸送体の動態を調べた。この試験は、生理的条件下で行われた。それゆえ、他の培地成分の影響を説明するために緩衝液の代わりに培地を用いた。他の細胞pHi調節システムの活性を消去するために、細胞を、HEPESによって緩衝化した重炭酸イオンを含まない培地中でプレインキュベートした。pHe変化を引き起こしうるCO2の脱気を防止するために、閉鎖系を構築して、それによってpHi変化が起こった。このシステムは、短いチューブと2つのルアーチューブコネクター(Rotilabo(登録商標))によって接続された2つの使い捨ての5mlルアーロックシリンジ(B.Braun AG, Melsungen, Germany)からなる。これらのルアーコネクターにより、2つのシリンジの急速で容易な接続/切断が可能となった。
本明細書において、デオキシリボ核酸(DNA)含有量は、細胞周期分析のために測定されている。生存率が60%未満に減少するまで、試料を24時間ごとに採取した。細胞およそ1×106個を収集して、遠心沈降(200×g、10分間、RT)させることによって冷PBSによって2回洗浄した。次に、細胞を、固定して、氷冷70%エタノール1mlによって透過性にして、染色するまで-20℃で保った。染色前、細胞を、遠心沈降させた後PBS/0.1%サポニンによって洗浄した。細胞を、室温の暗所で45分間インキュベートすることによって、染色溶液(PBS/0.1%サポニン、40μg/ml RNアーゼS、20μg/ml PI)1mlによって染色した。フローサイトメトリー分析を行うまで、氷上で染色細胞をインキュベートすることによってRNA分解反応を停止させた。流速<200個/秒での「ローラン(LOW RUN)」様式で、データを獲得した。G0G1細胞画分をFL3-H(640nm)ヒストグラムのチャンネル200において獲得した。細胞の積分蛍光をコンピューターソフトウェアModFit(商標)LT(Becton Dickinson)によって分析して、G0G1期、S期、およびG2M期の細胞の百分率を得た。
ウェスタンブロットに関して
細胞約1×107個を収集して、冷PBSによって2回洗浄した。細胞沈降物を溶解緩衝液(RIPA緩衝液、以下の表を参照されたい)600μl中に浮遊させて、氷上で5分間インキュベートした。溶解は、5分間の超音波処理段階、その後の氷上での30分間のインキュベーションとともに進行した。次に、溶解物を16,200×gで4℃において30分間遠心分離して、細胞の破片を除去した。タンパク質溶液を-20℃で保存した。
タンパク質抽出をRIPA緩衝液(前の表を参照されたい)によって行った。細胞約1×107個を収集して、冷PBSによって2回洗浄した。得られた沈降物をRIPA緩衝液2mlに浮遊させて、溶液を-80℃で2時間凍結した。氷上で融解させた後、細胞浮遊液をUltrasonic finger(Sonifier 250, Branson)によって15秒間処置した。細胞の破片を遠心沈降させて(17,000×g、1時間、4℃)、炭酸脱水酵素活性を測定するまで、サイトゾルタンパク質を-20℃で保存した。
細胞1×108個を、両方の細胞株(クローンE11およびHyQ培地中での対照細胞株)に関して、培養2日目(CO2プロファイルの前)および4日目(CO2プロファイルを開始した2日後)にバイオリアクターから収集した。細胞を冷PBS(200×g、10分)によって洗浄して、沈降物を細胞溶解まで-80℃で保存した。凍結した細胞沈降物をTE緩衝液(上記の表を参照されたい)1mlに浮遊させた。次に、セリンプロテアーゼ阻害剤保存液であるフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)20μlおよびDNアーゼ/RNアーゼ混合保存液100μlを添加した(上記の表を参照されたい)。ガラスビーズ(約0.15mm;BioSpec Products Inc.)1 gを含む2ml容器に溶液中の細胞を移した後、ボルテックスミキサーにおいて各30秒間行った4回のホモジナイゼーションサイクルによって機械的細胞破壊を行った。各サイクルの間、細胞を氷上で保存した。その後、溶液中のタンパク質を細胞破片およびガラスビーズから遠心分離段階(16,200×g、20分間、4℃)によって分離した。溶液および細胞区画中のタンパク質を分離するため、106,000×gで4℃において1時間の超遠心分離(Optima(商標)L-90K, Beckman Coulter Inc., USA)を行った。上清のタンパク質含有量を決定するために、タンパク質抽出物の一部を、BCAアッセイ法を行うために採取した。タンパク質溶液の残りを-20℃で保存した。
タンパク質濃度の測定は、タンパク質定量キット(Uptima/Interchim)を用いてビシンコニン酸(BCA)法によって行った。これは、タンパク質のペプチド結合によるCu(II)のCu(I)への還元を伴う。ビシンコニン酸は、Cu(I)イオンと非常に高い特異性で錯体を形成して、水溶性の紫色の錯体を形成する。反応を、最終Cu(I)錯体の高い吸光度に一致する562nmで測定する。タンパク質濃度は吸光度に比例する。これは、製造元によって記述されたプロトコールに従い、検量線の範囲は20μg/mlから2,000μg/mlの間のウシ血清アルブミン(BSA)であった。試料および標準物質を対応する溶解緩衝液中で希釈した。吸光度は、Photospectrometer PowerWave(商標)HT(BioTek Instruments)によって測定した。定量はソフトウェアKC4(BioTek Instruments)によって行った。
10μgまたは40μgおよび150μgまたは450μgのアリコートをウェスタンブロッティングのために調製した。それゆえ、試料1容量を9倍量の氷冷アセトンと混合した。次に、試料を-20℃で終夜インキュベートした。遠心分離(16,200×g、30分間、4℃)して沈殿したタンパク質を沈降させた後、上清を除去して、望ましくないアセトンをRTで蒸発させた。乾燥させたタンパク質沈降物を-20℃で保存した。
ゲル電気泳動モジュールおよびゲルカセットの調製は、製造元の説明書(Invitrogen)に従って行った。分析されるタンパク質試料沈降物および陽性対照(ヒト赤血球の炭酸脱水酵素アイソザイムII、1mg/ml、Sigma Aldrich)20μgを試料緩衝液(4×、NuPAGE(登録商標))、還元剤(10×、Invitrogen)、およびMilliQ-H2Oと共に最終容量20μlとなるように混合した。タンパク質の二次および三次構造の変性ならびに還元(システイン残基の間のジスルフィド結合の切断)は、サーモブロック中で試料を70℃で10分間インキュベートすることによって行った。最後に、試料および分子量マーカー(SeeBlue(登録商標)Plus2予染色標準物質、4kDa〜250kDa;Invitrogen)5μlを10%NuPAGE(登録商標)Novexビストリスゲル(Invitrogen)スロットにロードした。ゲルをNuPAGE(登録商標)MOPS SDS泳動緩衝液によって泳動させて、さらに、電気泳動カメラの中央部で泳動緩衝液中の0.25%(v/v)抗酸化剤試薬によって還元条件を得た。ブロモフェノールがゲルの端部に達するまで、200VでXCell(商標)Sure Lockシステム(Invitrogen)においてゲルを泳動させた。
この実験のために必要な溶液を以下の表に記述する。
溶解物中の炭酸脱水酵素活性を、SILVERMAN(SILVERMAN, D.N., Methods Enzymol. 87 (1982) 732-752)によって開発された18O交換法を用いて測定した。18O交換法は、化学平衡でのCO2と水の18Oの交換のメンブレンインレット質量分析による評価に基づく(等式10.12および10.13)。
Claims (14)
- 以下の段階を含む、ポリペプチドを産生するための方法:
(a)炭酸脱水酵素をコードする第一の核酸と該ポリペプチドをコードする第二の核酸とを含む哺乳動物細胞を培養する段階;および
(b)該ポリペプチドを該細胞または培養用培地から回収して、それによって該ポリペプチドを産生する段階。 - 前記培養する段階が、第一の一定pCO2値を用いる第一の期間、およびその後の、該第一の一定pCO2値から第二のpCO2値まで増加するpCO2値を用いる第二の期間にわたることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 前記培養する段階がさらに、前記第二の期間の後の、前記第二のpCO2値を用いる第三の期間にわたることを特徴とする、請求項2記載の方法。
- 前記第一の一定pCO2値が約4%〜約9%であることを特徴とする、請求項2または3記載の方法。
- 前記第一の一定pCO2値が約5%であることを特徴とする、請求項4記載の方法。
- 前記第二のpCO2値が約15%〜約30%であることを特徴とする、請求項2〜5のいずれか1項記載の方法。
- 前記第二のpCO2値が約25%であることを特徴とする、請求項6記載の方法。
- 前記炭酸脱水酵素が、炭酸脱水酵素IIまたは炭酸脱水酵素Vであることを特徴とする、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
- 前記炭酸脱水酵素がヒト炭酸脱水酵素IIまたはヒト炭酸脱水酵素Vであることを特徴とする、請求項8記載の方法。
- 前記炭酸脱水酵素がSEQ ID NO:03のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項9記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、抗体、または抗体コンジュゲート、または抗体断片、またはFc領域融合ポリペプチドであることを特徴とする、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞がCHO細胞であることを特徴とする、前記請求項のいずれか1項記載の方法。
- 前記CHO細胞がCHO K1細胞であることを特徴とする、請求項12記載の方法。
- ヒト炭酸脱水酵素IIまたはその変種をコードする第一の核酸と、抗体、または抗体コンジュゲート、または抗体断片、またはFc領域融合ポリペプチドをコードする第二の核酸とを含む、CHO細胞。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP11182107 | 2011-09-21 | ||
EP11182107.0 | 2011-09-21 | ||
PCT/EP2012/068248 WO2013041487A1 (en) | 2011-09-21 | 2012-09-17 | Co2 profile cultivation |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2014527824A true JP2014527824A (ja) | 2014-10-23 |
JP6113170B2 JP6113170B2 (ja) | 2017-04-12 |
JP6113170B6 JP6113170B6 (ja) | 2017-07-19 |
Family
ID=
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2018533936A (ja) * | 2015-10-30 | 2018-11-22 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | バイオリアクターにおける状態逸脱のモニタリング |
US11866686B2 (en) | 2015-10-30 | 2024-01-09 | Hoffmann-La Roche, Inc. | Identification of calibration deviations of pH-measuring devices |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007508003A (ja) * | 2003-10-10 | 2007-04-05 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト | 真核生物細胞におけるポリペプチドの大規模生産方法及びそれに適した培養容器 |
JP2011160802A (ja) * | 2010-02-09 | 2011-08-25 | Praxair Technology Inc | 細胞生存度及び生物生産物収率を高めるために、哺乳類細胞培養プロセスにおけるpH、モル浸透圧濃度及び溶存二酸化炭素レベルを制御するための方法 |
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007508003A (ja) * | 2003-10-10 | 2007-04-05 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト | 真核生物細胞におけるポリペプチドの大規模生産方法及びそれに適した培養容器 |
JP2011160802A (ja) * | 2010-02-09 | 2011-08-25 | Praxair Technology Inc | 細胞生存度及び生物生産物収率を高めるために、哺乳類細胞培養プロセスにおけるpH、モル浸透圧濃度及び溶存二酸化炭素レベルを制御するための方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
BIOTECHNOL. PROG., vol. 21, JPN6016025407, 2005, pages 70 - 77, ISSN: 0003500615 * |
J. BIOL. CHEM., vol. 277, no. 39, JPN6016025406, 2002, pages 36085 - 36091, ISSN: 0003354934 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2018533936A (ja) * | 2015-10-30 | 2018-11-22 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | バイオリアクターにおける状態逸脱のモニタリング |
JP2022064917A (ja) * | 2015-10-30 | 2022-04-26 | エフ.ホフマン-ラ ロシュ アーゲー | バイオリアクターにおける状態逸脱のモニタリング |
US11473042B2 (en) | 2015-10-30 | 2022-10-18 | Hoffmann-La Roche, Inc. | Monitoring state deviations in bioreactors |
US11866686B2 (en) | 2015-10-30 | 2024-01-09 | Hoffmann-La Roche, Inc. | Identification of calibration deviations of pH-measuring devices |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2013041487A1 (en) | 2013-03-28 |
EP2758424B1 (en) | 2019-03-06 |
SG2014008809A (en) | 2014-04-28 |
US10513697B2 (en) | 2019-12-24 |
EP2758424A1 (en) | 2014-07-30 |
US20150299688A1 (en) | 2015-10-22 |
JP6113170B2 (ja) | 2017-04-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7514900B2 (ja) | タンパク質ジスルフィド結合の還元の防止 | |
US10513697B2 (en) | CO2 profile cultivation | |
KR20160036612A (ko) | 폴리펩티드의 α-아미드화 및/또는 C-말단 아미노산 분열의 제어를 위한 세포 배양 매질 및 방법 | |
SG192541A1 (en) | Novel regulatory elements | |
Wei et al. | In vivo and in vitro characterization of TEV protease mutants | |
US9175284B2 (en) | Puro-DHFR quadrifunctional marker and its use in protein production | |
KR101916491B1 (ko) | 생체 시료 중의 l-트립토판 분석 방법 및 그것에 이용하는 키트 | |
US20080032300A1 (en) | Lupac Bifunctional Marker and Its Use in Protein Production | |
JP6113170B6 (ja) | Co2プロファイル培養法 | |
US20180282405A1 (en) | Cytoplasmic expression system | |
JP7094655B2 (ja) | アニオン性界面活性剤耐性が向上したアマドリアーゼ | |
Da Silva et al. | CO 2 profile cultivation | |
JP2011505813A (ja) | ρ0細胞を生成させる方法 | |
US20230296616A1 (en) | Arginine fluorescent probe, preparation method therefor and application thereof | |
US20230212237A1 (en) | Methods for producing proteins | |
US20230193341A1 (en) | Expression systems, recombinant cells and uses thereof | |
Nickels | Regulation of the molecular chaperone BiP by its co-chaperones | |
JP2019187453A (ja) | 合成遺伝子の設計方法 | |
AU2014200178A1 (en) | The Puro-DHFR quadrifunctional marker and its use in protein production | |
JP2014532401A (ja) | ヒトh因子の製造方法 | |
MX2011003601A (es) | Determinacion de acido nucleico que codifica inmunoglobulina. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20150427 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20150728 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160707 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20161007 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20161227 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170220 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170314 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6113170 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |