MX2011003601A - Determinacion de acido nucleico que codifica inmunoglobulina. - Google Patents

Abstract

Se reporta en la presente un método para la determinación de la cantidad de ARNm que codifica la inmunoglobulina que comprende: a) proporcionar una muestra, b) realizar una reacción en cadena de polimerasa para amplificar la cadena ligera con los cebadores de la SEQ ID NO: 23 y 24 y la sonda de la SEQ ID NO: 33, y/o c) realizar una reacción en cadena de polimerasa para amplificar la cadena pesada con los cebadores de la SEQ ID NO: 19 y 21 y la sonda de la SEQ ID NO: 40, y d) cuantificar con una eficiencia de 2.0. Los cebadores con las SEQ ID NOs 23 y 24 se enlazan en las posiciones CL 247-266 y CL166-185, respectivamente, y la sonda con la SEQ ID NO: 33 se enlaza en 189-212 en cadena kappa IgG humana. El cebador con la SEQ ID NO: 19 se enlaza en la posición 2 de la región CH 220-237 y el cebador con la SEQ ID NO: 21 se enlaza en la posición 3 de la región CM 114-133. Finalmente la sonda con la SEQ ID NO: 40 se enlaza de la posición 315 en CH2 a la posición 7 en CH3.

Description

DETERMINACION DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICA INMUNOGLOBULINA Campo de la Invención La invención actual se dirige a un método para la determinación de ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina, es decir ARN y ADN, y cebadores para determinación por PCR de ácido nucleico que codifica inmunoglobulina .

Antecedentes de la nvención En los procesos biotecnológicos actuales se emplean microorganismos producidos genéticamente por ingeniería con objeto de proporcionar polipéptidos terapéuticos en alto rendimiento. La línea de célula de ovarios de hámster chino (CHO) se usa ampliamente para la producción de polipéptidos recombinante's , especialmente inmunoglobulinas terapéuticas. Esta línea celular' es capaz de promover las modificaciones secundarias y de forma más importante la línea de célula CHO es capaz de secretar el polipéptido producido recombinantemente a las operaciones de proceso cadena abajo que facilitan el medio de crecimiento (Jiang, Z., et al., Biotechnol. Prog. 22 (2006) 313-138; Yee, J.C., et al., Biotechnol. Bioeng. 102 (2009) 246-263) . Con objeto de incrementar la productividad de los parámetros de líneas de célula recombinante tipo la línea de célula precursora, se han optimizado el medio de cultivo, o las condiciones de Ref.: 217770 cultivo (Yee, J.C., et al., Biotechnol. Bioeng. 102 (2009) 246-263) .

Con base en los análisis de la posición, la estructura y número de copia de ácidos nucleicos heterólogos integrados en el genoma de los indicadores de líneas de células recombinante para la decisión acerca de las propiedades de líneas de célula recombinante debieran establecerse ( urm, F.M., Ann. N. Y. Acad. Sci. 782 (1996) 70-78). El ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo se integra en el genoma de la línea de célula recombinante como ácido desoxiribonucleótido (ADN) , que se transcribe en ácido ribonucleico (ARN) durante el proceso de transcripción. El ARN de nuevo es la plantilla para la biosíntesis de proteína en el proceso de traducción. Debido a la importancia del ARN para expresión de genes, el análisis de este ácido nucleico gana importancia (Seth, G. , et al., Biotechnol Bioeng. 97 (2007) 933-951) .

En la publicación WO 2008/094871 se reporta un método para la selección de líneas de célula de alta producción. Se reporta un estudio de líneas de célula CHO que produce anticuerpo monoclonal por Chusainow, J. , et al. (Biotechnol. Bioeng. 102 (2009) 1182-1196). Barnes, L.M., et al. (Biotechnol. Bioeng. 85 (2004) 115-121) que reporta la definición molecular de indicadores predictivos de expresión de proteína estable en células de mxeloma NSO recombinante.

Breve Descripción de la Invención Un aspecto de la invención actual es un método para la determinación de la cantidad de AR m que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina y/o una cadena pesada de inmunoglobulina de la subclase IgGl o IgG4 con una reacción en cadena de polimerasa y cuantificación absoluta, por a) realizar una reacción en cadena de polimerasa para la cadena ligera de inmunoglobulina con los cebadores de SEQ ID NO: 23 y 24 y la sonda de SEQ ID NO: 33 con el colorante FAM en un formato de sonda de hidrólisis TaqMan, y/o b) realizar una reacción en cadena de polimerasa para la cadena pesada de inmunoglobulina con los cebadores de SEQ ID NO: 19 y 21 y la sonda de SEQ ID NO: 40 con el colorante Cy5 en un formato de sonda de hidrólisis TaqMan, y c) realizar cuantificación absoluta con una eficiencia de 2.0.

Aspectos adicionales de la invención actual son un primer kit que comprende los ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 33 y un segundo kit que comprende los ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 40. Otro aspecto es el uso de los ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 23, 24, y 33 o de SEQ ID NO: 19, 21, y 40 en una reacción en cadena de pol imeras .

Otro aspecto de la invención actual es un método para determinar la productividad de una célula que expresa un polipéptido heterólogo que comprende las siguientes etapas en el siguiente orden: determinar la cantidad de ARNm que codifica el polipéptido heterólogo en una célula de productividad conocida, determinar la cantidad de ARNm que codifica el polipéptido heterólogo en una célula de productividad desconocida, - calcular la relación de la cantidad determinada de ARNm que codifica el polipéptido heterólogo en la célula de productividad desconocida a la célula de productividad conocida, multiplicar la productividad de la célula de productividad conocida con:, la relación calculada y por ello determinar la productividad de una célula que expresa un polipéptido heterólogo.

En una modalidad el polipéptido heterólogo es una inmunoglobulina, o fragmento de inmunoglobulina, o conjugado de inmunoglobulina. Todavía en una modalidad adicional la determinación de la cantidad de ARNm es por medio de una reacción en cadena de polimerasa (PCR) . En una modalidad la determinación de la cantidad de ARNm es por una reacción en cadena de polimerasa con los cebadores de SEQ ID NO: 23 y 24 y la sonda de SEQ ID NO: 33 con el colorante FAM en un formato de sonda de hidrólisis TaqMan y/o por una reacción en cadena de polimerasa con los cebadores de SEQ ID NO: 19 y 21 y la sonda de SEQ ID NO: 40 con el colorante Cy5 en un formato de sonda de hidrólisis TaqMan. En una modalidad adicional la cantidad de ARNm que codifica la inmunoglobulina heteróloga es el promedio de la cantidad de ARNm que codifica la cadena ligera de la inmunoglobulina heteróloga y la cantidad de ARNm que codifica la cadena pesada de la inmunoglobulina heteróloga. En otra modalidad la productividad es la velocidad de producción específica en pg/célula/día . En otra modalidad la reacción en cadena de polimerasa es una reacción en cadena de polimerasa de pliegues múltiples.

Descripción Detallada de la Invención En la invención actual se ha encontrado que el número de copias de un ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina (ADN) y la cantidad de transcrito generado desde éste (ARN) pueden usarse para determinar la productividad de una línea de célula CHO recombinante que expresa una inmunoglobulina heteróloga. También se ha encontrado que la cantidad de ARNm que codifica un polipéptido heterólogo es una medida para la productividad específica de tal célula.

La invención comprende un método para determinar la productividad de una célula que expresa una inmunoglobulina que comprende a) realizar una reacción en cadena de polimerasa con los cebadores de SEQ ID NO: 23 y 24 y la sonda de SEQ ID NO: 33, y/o realizar una reacción en cadena de polimerasa con los cebadores de SEQ ID NO: 19 y 21 y la sonda de SEQ ID NO: 40 y por ello determinar la cantidad de ARNm que codifica la inmunoglobulina en una célula de productividad conocida, b) realizar una reacción en cadena de polimerasa con los cebadores de SEQ ID NO: 23 y 24 y la sonda de SEQ ID NO: 33, y/o realizar una reacción en cadena de polimerasa con los cebadores de SEQ ID NO: 19 y 21 y la sonda de SEQ ID NO: 40 y por ello determinar la cantidad de ARNm que codifica la inmunoglobulina en una célula de productividad desconocida, c) calcular la relación de la cantidad determinada de ARNm que codifica la inmunoglobulina de la célula de productividad desconocida a la célula de productividad conocida, d) multiplicar la productividad de la célula de productividad conocida con la relación calculada y por ello determinar la productividad de una célula que expresa una inmunoglobulina .

Los métodos y técnicas conocidas para una persona experta en la técnica, que son útiles para llevar a cabo la invención actual, se describen por ejemplo en Ausubel, F. M . , ed. , Current Protocols in Molecular Biology, Volúmenes I hasta III (1997), Wiley and Sons ; Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) .

El término "aminoácido" como se usa dentro de esta solicitud significa el grupo de carboxi -aminoácidos, que directamente o en forma de un precursor pueden codificarse por un ácido nucleico. Los aminoácidos individuales se codifican por ácidos nucleicos que consisten de tres nucleótidos, llamados codones o tripletes base. Cada aminoácido se codifica por al menos un codón. La codificación del mismo aminoácido por codones diferentes se conoce como "degeneración del código genético" . El término "aminoácido" como se usa dentro de esta solicitud significa los carboxi OÍ-aminoácidos que se presentan naturalmente y que comprenden alanina (código de tres letras: ala, código de una letra: A), arginina (arg, R) , asparagina (asn, N) , ácido aspártico (asp, D) , cisteína (cys, C) , glutamina (gln, Q) , ácido glutámico (glu, E) , glicina (gly, G) , histidina (his, H) , isoleucina (ile, I) , leucina (leu, L) , lisina (lys, ) , metionina (met, M) , fenilalanina (phe, F) , prolina (pro, P) , serina (ser, S) , treonina (thr, T) , triptofan (trp, W) , tirosina (tyr. Y) , y valina (val, V) .

Un "ácido nucleico" o una "secuencia de ácido nucleico", cuyos términos se usan intercambiablemente dentro de esta solicitud, se refieren a una molécula polimérica que consiste de nucleótidos individuales (también llamados bases) A, C, G y T (o U en AR ) , por ejemplo para ADN, AR , o modificaciones de los mismos. Esta molécula de polinucleótido puede ser una molécula de polinucleótido que se presenta naturalmente o una molécula de polinucleótido sintético o una combinación de una o más moléculas de polinucleótido que se presentan naturalmente con una o más moléculas de polinucleótido sintético. También se abarcan por esta definición las moléculas de polinucleótido que se presentan naturalmente en las cuales uno o más nucleótidos se cambian (por ejemplo por mutagénesis) , eliminan, o agregan. Un ácido nucleico puede ya sea aislarse, o integrarse en otro ácido nucleico, por ejemplo en un cásete de expresión, un plásmido, o el cromosoma de una célula.

A una persona experta en la técnica le son bien conocidos los procedimientos y métodos para convertir una secuencia de aminoácido, por ejemplo de un polipéptido, en una secuencia de ácido nucleico correspondiente que codifica esta secuencia de aminoácido. Por lo tanto, un ácido nucleico se caracteriza por su secuencia de ácido nucleico que consiste de nucleótidos individuales e igualmente por la secuencia de aminoácido de un polipéptido codificado por ello.

Un "polipéptido" es un polímero que consiste de aminoácidos unidos por enlaces de péptido, ya sea que se producen naturalmente o sintéticamente. Los polipéptidos de menos de alrededor de 20 residuos de aminoácido pueden referirse como "péptidos" , mientras que las moléculas que consisten de dos o más polipéptidos o que comprenden un polipéptido de más de 100 residuos de aminoácido pueden referirse como "proteínas" . Un polipéptido también puede comprender componentes no de aminoácido, tales como grupos carbohidrato, iones de metal, o ésteres de ácido carboxílico. Los componentes no de aminoácido pueden agregarse por la célula, en la cual el polipéptido se expresa, y puede variar con el tipo de célula. Los polipéptidos se definen en la presente en términos de su estructura de columna de aminoácido o el ácido nucleico que codifica el mismo. Generalmente no se especifican adiciones tales como grupos carbohidrato, pero no obstante pueden presentarse.

El término "inmunoglobulina" abarca las diversas formas de estructuras de inmunoglobulina que incluyen inmunoglobulinas completas y conjugados de inmunoglobulinas. La inmunoglobulina empleada en la invención actual es en una modalidad un anticuerpo humano, o un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo quimérico, o un anticuerpo desprovisto de antígeno de célula T (ver por ejemplo WO 98/33523, O 98/52976, y WO 00/34317) . Las inmunoglobulinas producidas por ingeniería genética, por ejemplo, se describen en Morrison, S.L., et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5,202,238 y US 5,204,244; Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270; Lonberg, N. , Nat . Biotechnol. 23 (2005) 1117-1125. Las inmunoglobulinas pueden existir en una variedad de formatos, incluyendo, por ejemplo, Fv, Fab, y F(ab)2 así como cadenas sencillas (scFv) o diacuerpos (por ejemplo Huston, J.S., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883; Bird, R.E., et al., Science 242 (1988) 423-426; en general, Hood et al., Immunology, Benjamín N.Y., 2a edición (1984); y Hunkapiller, T. and Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16) .

El término "inmunoglobulina completa" significa una inmunoglobulina que comprende dos de las llamadas cadenas ligeras y dos de las llamadas cadenas pesadas . Cada una de las cadenas pesadas y ligeras de una inmunoglobulina completa contiene un dominio variable (región variable) (generalmente la porción de terminal amino de la cadena de polipéptido) que comprende regiones enlazadas que son capaces de interactuar con un antígeno. Cada una de las cadenas pesadas y ligeras de una inmunoglobulina completa comprende una región constante (generalmente la porción de terminal carboxilo) . La región constante de la cadena pesada media el enlace del anticuerpo i) a las células que transportan un receptor gamma Fe (FcyR) , tal como células fagocíticas, o ii) a las células que transportan el receptor Fe neonatal (FcRn) también conocido como receptor Brambell. Este también media el enlace a algunos factores que incluyen factores del sistema de complemento clásico tal como componente (Clq) . El dominio variable de una cadena ligera y pesada de la inmunoglobulina de nuevo comprende diferentes segmentos, es decir cuatro regiones de estructura (FR) y tres regiones hipervariables (CDR) .

El término "conjugado de inmunoglobulina" significa un polipéptido que comprende al menos un dominio de una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina conjugada por medio de un enlace péptido a un polipéptido adicional. El polipéptido adicional es un péptido no de inmunoglobulina, tal como una hormona, o receptor de crecimiento, o péptido antifusogénico, o factor de complemento, o similares. Los conjugados de inmunoglobulina ejemplares se reportan en WO 2007/045463.

El término "inmunoglobulina heteróloga" significa una inmunoglobulina que no se produce naturalmente por una célula de mamífero o la célula hospedera. La inmunoglobulina producida de acuerdo con un método de la invención se produce por medios recombinantes . Tales métodos son ampliamente conocidos en el estado del arte y comprenden expresión de proteínas en células eucarióticas con recuperación subsecuente y aislado de la inmunoglobulina heteróloga, y usualmente purificación hasta una pureza farmacéuticamente aceptable. Para la producción, es decir expresión, de una inmunoglobulina a ácido nucleico que codifica la cadena ligera y un ácido nucleico que codifica la cadena pesada se insertan cada uno en un cásete de expresión por métodos estándar. Los ácidos nucleicos que codifican cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina se aislan y procesan en secuencia rápidamente usando procedimientos convencionales. Las células de hibridoma pueden servir como una fuente de tales ácido nucleicos . Los casetes de expresión pueden insertarse en plásmidos de expresión, que luego se transfectan en células hospederas, que no producen de otra manera inmunoglobulinas . La expresión se realiza en células hospederas procarióticas o eucarióticas apropiadas y la inmunoglobulina se recupera de las células después de la lisis o del sobrenadante de cultivo.

Un "polipéptido aislado" es un polipéptido que está esencialmente libre de componentes celulares contaminantes, tales como carbohidrato, lípido, u otras impurezas proteínicas asociadas con el polipéptido en naturaleza. Típicamente, una preparación de polipéptido aislado contiene el polipéptido en una forma altamente purificada, es decir al menos alrededor de 80 % puro, al menos alrededor de 90 % puro, al menos alrededor de 95% puro, más de 95% puro, o más de 99% puro. Una forma para mostrar que una preparación de proteína particular que contiene un polipéptido aislado es por la aparición de una banda sencilla después de electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio (SDS) -poliacrilamida de la preparación de proteína y Teñido del gel con Azul Brillante Coomassie. Sin embargo, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, tal como dímeros o formas alternativamente glicosiladas o derivadas.

"ADN heterólogo" o "polipéptido heterólogo" se refiere a una molécula de ADN o un polipéptido, o una población de moléculas de ADN o una población de polipéptidos , que no existen naturalmente dentro de una célula hospedera dada. Las moléculas de ADN heterólogo a una célula hospedera particular puede contener ADN derivado de las especies de célula hospedera (es decir ADN endógeno) en la medida en que el ADN hospedero se combine con el ADN no hospedero (es decir ADN exógeno) . Por ejemplo, una molécula de ADN que contiene el segmento de ADN no hospedero que codifica un polipéptido ligado operablemente al segmento de ADN hospedero que comprende un promotor se considera que es una molécula de ADN heterólogo. A la inversa, una molécula de ADN heterólogo puede comprender un gen estructural endógeno ligado operablemente con un promotor exógeno. Un péptido o polipéptido codificado por una molécula no hospedera de ADN es un péptido o polipéptido "heterólogo" .

El término "célula" o "célula hospedera" se refiere a una célula en la cual un ácido nucleico, por ejemplo que codifica un polipéptido heterólogo, puede o se transfecta. El término "célula" incluye tanto células procarióticas, que se usan para propagación de plásmidos, y células eucarióticas , que se usan para la expresión de un ácido nucleico y producción del polipéptido codificado. En una modalidad, las células eucarióticas son células de mamífero. En otra modalidad la célula de mamífero es una célula CHO, preferiblemente una célula CHO Kl (ATCC CCL-61 o DSM ACC 110), o una célula CHO DG44 (también conocida como CHO-DHFR [-], DSM ACC 126), o una célula CHO XL99, una célula CHO-T (ver por ejemplo Morgan, D., et al., Biochemistry 26 (1987) 2959-2963), o una célula CHO-S, o una célula Super-CHO (Pak, S.C.O., et al., Cytotechnology . 22 (1996) 139-146). Si estas células no se adaptan para crecer en un medio libre de suero o en suspensión, se realiza una adaptación antes del uso en el método actual. Como se usa en la presente, la expresión "célula" incluye la célula objeto y su progenie. De esta manera, las palabras "transformante" y "célula transformada" incluyen la célula objeto primaria y los cultivos derivados de esta sin tener en cuenta el número de transferencias o subcultívos. También se entiende que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie variante que tiene la misma función o actividad biológica como la seleccionada para la célula originalmente transformada .

El término "expresión" como se usa en la presente se refiere a procesos de transcripción y traducción que se presentan dentro de la célula. El nivel de transcripción de una secuencia de ácido nucleico de interés en una célula puede determinarse con base en la cantidad de AR m correspondiente que está presente en la célula. Por ejemplo, el ARNm transcrito desde una secuencia de interés puede cuantificarse por RT-PCR o por hibridación Northern (ver Sambrook, et al., 1989, supra) . Los polipéptidos codificados por un ácido nucleico de interés pueden cuantificarse por varios métodos, por ejemplo por ELISA, por ensayo para la actividad biológica del polipéptido, o al emplear ensayos que son independientes de tal actividad, tal como manchado Western o radioinmunoensayo, usando inmunoglobulinas que se reconocen y enlazan al polipéptido (ver Sambrook, et al., 1989, supra) .

La expresión de un gen se realiza ya sea como expresión transitoria o permanente. El polipéptido de interés es en general un polipéptido secretado y por lo tanto contiene una extensión de terminal N (también conocida como la secuencia de señal) que es necesario para el transporte/secreción del polipéptido a través de la pared celular en el medio extracelular . En general, la secuencia de señal puede derivarse de cualquier gen que codifica un polipéptido secretado. Si se usa una secuencia de señal heteróloga, preferiblemente es una que se reconoce y procesa (es decir desdobla por una peptidasa de señal) por la célula hospedera. Para secreción en levadura por ejemplo la secuencia de señal nativa de un gen heterólogo a expresarse puede sustituirse por una secuencia de señal de levadura homologa derivada de un gen secretado, tal como la secuencia de señal de invertasa de levadura, líder de factor alfa (incluyendo líderes de factor a de Saccharomyces, Kluyveromyces , Pichia, y Hansenula, el segundo descrito en US 5,010,182), secuencia de señal de fosfatasa ácida, o la secuencia de señal de glucoamilasa de C. albicans (ver EP 0 362 179) . En la expresión de célula de mamífero la secuencia de señal nativa de la proteína de interés es satisfactoria, aunque otras secuencias de señal de mamífero pueden ser apropiadas, tal como secuencias de señal de polipéptidos secretados de la misma especie o relacionados, por ejemplo con inmunoglobulinas de origen humano o murino, así como secuencias de señal secretoras víricas, por ejemplo, la señal de secuencia de glicoproteína D de herpes simplex. El fragmento de ADN que codifica tal pre-segmento se liga en estructura, es decir ligado operablemente, al fragmento de ADN que codifica un polipéptido de interés.

La transfeccion de por ejemplo una célula CHO de acuerdo con el método de acuerdo con la invención se realiza como etapas secuenciales de transfección y selección. Las células CHO apropiadas en el método de acuerdo con la invención son por ejemplo una célula CHO Kl, o una célula CHO DG44, o una célula CHO XL99, o una célula CHO DXB11, o una célula CHO DP 12, o una célula super-CHO. Dentro del alcance de la presente invención, las células transfectadas pueden obtenerse con sustancialmente cualquier tipo de método de transfección conocido en la técnica. Por ejemplo, el ácido nucleico puede introducirse en las células por medio de electroporación o microinyección. Alternativamente, los reactivos de lipofección tal como FuGENE 6 (Roche Diagnostics GmbH, Alemania) , X-tremeGENE (Roche Diagnostics GmbH, Alemania) , LipofectAmine (Invitrogen Corp., USA), y la nucleotransfección (AMAXA Corp.) se pueden usar. Todavía alternativamente, el ácido nucleico puede introducirse en la célula por sistemas de vector viral apropiados basados en retrovirus, lenti virus, adenovirus, o virus asociados a adeno (Singer, O. , Proc. Nati. Acad. Sci . USA 101 (2004) 5313-5314) .

Usualmente, la formación del perfil de expresión de gen en el nivel de ADN o ARN se monitorea en base de rutina por un procedimiento de multi-etapa. Primero, la respectiva muestra celular se remueve del recipiente de cultivo. En el caso de células adherentes que se cosechan se puede soportar por la tripsinización (tratamiento con una solución de Tripsina-EDTA) con objeto de separar las células adherentes del soporte sólido. En segundo lugar, las células recolectadas se sedimentan y someten a lisis celular. Como una tercera etapa se requiere usualmente para al menos parcialmente purificar el ARN, ARNm o ADN total que se presenta en la muestra (por ejemplo ver EP 0 389 063) . Después, si es necesario, una primera hebra de etapa de síntesis de ADNc se realiza con una polimerasa de ADN dependiente de ARN tal como AMV o MoMULV Reverse Transcriptase (Roche Applied Science, Alemania) .

Posteriormente, la cantidad de ADN o de ADNc generado se cuantifica ya sea por medio de PCR cuantitativo (Sanger, G. and Goldstein, C, Biochemica 3 (2001) 15-17) o alternativamente por medio de amplificación y la hibridización posterior sobre un microensayo de ADN (Kawasaki, E.S., Ann. N.Y.. Acad. Sci. 1020 (2004) 92-100). En el caso de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) , una etapa RT-PCR se puede realizar, caracterizada en que la primera hebra de síntesis de ADNc y la amplificación posterior se catalizan por la misma Polimerasa tal como Polimerasa T.th (Roche Applied Science Cat. No. 11 480 014, Alemania) .

En una modalidad el análisis de expresión de gen se basa en PCR en tiempo real. Tal vigilancia en tiempo real se caracteriza en que el progreso de amplificación del ácido nucleico en la reacción PCR se monitorea y cuantifica en tiempo real. Los diferentes formatos de detección se conocen en la técnica. Los formatos de detección mencionados abajo se han demostrado ser útiles para PCR y así proporcionar un posibilidad fácil y sencilla para análisis de expresión de gen: a) Formato de sonda de Hidrólisis TaqMan: Una sonda de hibridizacion de hebra sencilla se etiqueta con dos componentes. Cuando el primer componente se excita con luz de una longitud de onda adecuada, la energía absorbida se transfiere al segundo componente, el llamado inhibidor, de acuerdo con el principio de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia. Durante la etapa de combinación de pares de bases complementarios de la reacción PCR, la sonda de hibridizacion se enlaza al ADN objetivo y se degrada por la 5 '-3' actividad exonucleasa de la Polimerasa Taq durante la fase de elongación posterior. Como un resultado el componente fluorescente excitado y el inhibidor se separan espacialmente uno del otro y por lo tanto una emisión de fluorescencia del primer componente se puede medir. Los ensayos de sonda TaqMan se reportan en detalle en US 5,210,015, US 5,538,848, y US 5,487,972. Las sondas de hibridizacion TaqMan y mezclas de reactivos se reportan en US 5, 804,375. b) Balizas Moleculares: Estas sondas de hibridizacion se etiquetan con un componente fluorescente y un inhibidor, las etiquetas preferiblemente que se ubican en ambos extremos de la sonda. Como un resultado de la estructura secundaria de la sonda, ambos componentes están en vecindad espacial en solución. Después de la hibridizacion a los ácidos nucleicos objetivo ambos componentes se separan uno del otro de tal manera que después de la excitación con luz de una longitud de onda adecuada la emisión de fluorescencia del primer componente se puede medir (US 5, 118, 801) . c) Sondas de hibridizacion FRET: El formato de prueba de sonda de hibridizacion FRET es especialmente útil para todas las clases de ensayos de hibridizacion homogénea (Matthews, J.A. and Kricka, L.J., Anal. Biochem. 169 (1988) 1-25). Esto se caracteriza por dos sondas de hibridizacion de hebra sencilla que se usan simultáneamente y que son complementarias a sitios adyacentes de la misma hebra del ácido nucleico objetivo amplificado. Ambas sondas se etiquetan con diferentes componentes fluorescentes. Cuando se excita con luz de una longitud de onda adecuada, un primer componente transfiere la energía absorbida al segundo componente de acuerdo con el principio de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) tal que una emisión de fluorescencia del segundo componente se puede medir cuando ambas sondas de hibridización enlazan a posiciones adyacentes de la molécula objetivo a detectarse. Alternativamente para la vigilancia del incremento en fluorescencia del FRET componente aceptador, también es posible monitorear disminución de fluorescencia del componente donador FRET como una medida cuantitativa de un evento de hibridización.

En particular, el formato de sonda de hibridización FRET se puede usar en PCR en tiempo real, con objeto de detectar el ADN objetivo amplificado. Entre todos los formatos de detección conocido en la técnica de PCR en tiempo real, el formato de Sonda de Hibridización FRET se ha demostrado que es altamente sensible, exacto y confiable (ver O 97/46707; WO 97/46712; WO 97/46714). Como un alternativa a dos sondas de hibridización FRET, también es posible usar un cebador etiquetado fluorescente y solamente una sonda de oligonucleótido etiquetada (Bernard, P.S., et al., Anal. Biochem. 255 (1998) 101-107) . En este sentido, se puede elegir arbitrariamente, si el cebador se etiqueta con el donador FRET o el compuesto aceptador FRET. d) Formato Verde SYBR® : También está dentro del alcance de la invención que si la PCR en tiempo real se realiza en la presencia de un aditivo que en caso de que el producto de amplificación se detecta usando un ácido nucleico de hebra doble enlaza la porción. Por ejemplo, el respectivo producto de amplificación también se puede detectar de acuerdo con la invención por un colorante que enlaza ADN fluorescente, que emite una correspondiente señal de fluorescencia sobre la interacción con el ácido nucleico de hebra doble después de la excitación con luz de una longitud de onda adecuada. Los colorantes SYBR® Verde I y Oro SYBR® (Molecular Probes, USA) han demostrado ser particularmente adecuados para esta aplicación. Los colorantes de intercalación se pueden usar alternativamente. Sin embargo, para este formato, con objeto de discriminar los diferentes productos de amplificación, es necesario realizar un respectivo análisis de curva de fusión (US 6 , 17 , 670) . e) Formato de pliegues múltiples: La determinación simultánea de diferentes ácidos nucleicos en un recipiente de reacción se denomina PCR en tiempo real de pliegues múltiples. Generalmente para la determinación de cada ácido nucleico se requiere un colorante fluorescente que no interfiere o no tiene solamente un traslape pequeño con los otros colorantes empleados.

Los cebadores PCR usados en la invención actual y que también son aspectos de la invención se designaron con el software eprimer3 de acuerdo con los siguientes parámetros : - enlace específico a la secuencia a amplificarse, ninguna o poco probable formación de dímeros de cebador, - longitud entre 18 y 25 nucleótidos, - contenido G/C de aproximadamente 50%, - temperatura de fusión de aproximadamente 60 °C, - amplicón de 500 pares base o menos, en una modalidad entre 100 y 250 pares base, - preferiblemente los cebadores deben enlazar a exones vecinos y el producto PCR debe abarcar al menos un intrón para permitir la discriminación entre la amplificación de ADNc y ADN genómico .

Los ácidos nucleicos complementarios a los cebadores designados se ubican dentro de las regiones constantes de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas idénticas en inmunoglobulinas tipo IgGl e IgG4.

Las sondas usadas en el método también son un aspecto de la invención actual y se designaron con el software eprimer3 de acuerdo con los siguientes parámetros: - temperatura de fusión de aproximadamente 70 °C, - ningún G en el extremo 5', ninguna o poco probable formación de dímero con cebadores u otras sondas, - preferiblemente la sondas destinadas a usarse para RT PCR deben enlazar a dos diferentes exones adyacentes para permitir la discriminación entre amplificación de ADNc y ADN genómico. En una modalidad los ácidos nucleicos complementarios a las sondas designadas se ubican dentro de las regiones constantes de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas idénticas en inmunoglobulinas tipo IgGl e IgG4. La sondas se etiquetaron con objeto de permitir una reacción RT-PCR de pliegues múltiples como sigue: - cadena ligera: colorante fluorescente FAM, excitación a 465 nm, detección en 510 nm, gen de referencia: colorante Yakima Amarillo, excitación a 533 nm, detección en 580 nm, - cadena pesada: colorante fluorescente IRD 700 o Cy5, excitación a 618 nm, detección en 660 nm.

Los cebadores y sondas enlistadas en la Tabla 1 se designaron y cada una son individualmente y como combinación un aspecto de la invención actual.

Tabla 1 : Cebadores y sondas .

La ubicación de los cebadores y sondas en la región constante de inmunoglobulina se muestra en las Figuras 1 hasta .

En lo siguiente la invención actual se ejemplifica basado en tres líneas celulares que producen una inmunoglobulina específicamente que enlaza al péptido ß-?4 amiloide (anticuerpo anti-?ß) , por lo cual la primera línea celular se transfecta una vez, la segunda línea celular se transfecta dos veces, y la tercera línea celular se transfecta tres veces con un plásmido que contiene un ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina.

La expresión de gen de la cadena de inmunoglobulina pesada y ligera se determinó con RT-PCR por cuantificación de los ARNm de la cadena pesada y ligera en la región constante que codifica parte usando el colorante SYBR® Verde I y sondas TaqMan. La determinación es en una modalidad realizada con AR de célula total.

La determinación de la cantidad de ARNm de la cadena de anticuerpo ligero de las tres líneas celulares se realizó independientemente cinco veces cada una con tres diferentes cantidades de ARNm de 250 ng, 50 ng, y 10 ng y - el colorante SYBR® Verde I. El resultado de un experimento representativo obtenido con la combinación de cebador #131 y #132 se enlista basado en la cantidad de ARN de la línea celular transfectada sencilla 8C8, que se estableció a 100% cantidad relativa en la Tabla 2. Se puede observar, que la línea celular dos veces transfectada 4F5 tiene aproximadamente 40% más de ARNm que codifica cadena ligera de inmunoglobulina que la línea celular transfectada sencilla, y que la linea celular transfectada tres veces 20F2 tiene aproximadamente 70% más ARNm que codifica la cadena ligera de inmunoglobulina.

Tabla 2: Resultados ejemplares con combinación de cebador #131 y #132.

El anterior método de determinación realizado es específico ya que solamente un producto sencillo se obtiene como se confirma por electrof oresis de gel de agarosa y se muestra en la Figura 5.

Para la determinación de la cantidad de ARN de la cadena de anticuerpo ligero de las tres líneas celulares con sondas de hidrólisis TaqMan, al principio hubo que determinar la combinación de cebadores y sonda útiles en este aspecto de la invención. Las combinaciones enlistadas en la Tabla 3 se probaron.

Tabla 3: Ácido nucleico de formato de TaqMan probado.

Los productos PCR obtenidos con las diferentes combinaciones cebador- sonda como se enlistan arriba muestran (por ejemplo Figura 6) que los cebadores de combinaciones #133 y #132 con sonda #166 así como los cebadores de combinación #133 y #38 con sonda #166 resultaron en productos PCR con un alto rendimiento de producto específico y baja formación de sub-producto. De esta manera, las combinaciones cebador-sonda #133, #132, y #166 así como la combinación cebador- sonda #133, #38, #166 por sí mismos son aspectos específicos de la invención actual así como el uso de estas combinaciones cebador- sonda . En una modalidad es la combinación cebador-sonda #133, #132, y #166. Esta combinación se prefiere como que muestra una mejor eficiencia de PCR, es decir un incremento más pronunciado de la curva de amplificación como se denota en la Figura 7.

La determinación de la cantidad de ARN de la cadena de anticuerpo ligero de las tres líneas celulares se realizó independientemente cuatro veces cada una con tres diferentes cantidades de ARNm de 250 ng, 50 ng, y 10 ng . El resultado de un experimento representativo obtenido con la combinación de cebador #133/#132 y la sonda #166 se enlista basada en la cantidad de ARN de la línea celular transfectada sencilla, que .se estableció a 100% cantidad relativa en la Tabla 4. Se puede observar, que la línea de célula 4F5 tiene aproximadamente 77% más ARNm que codifica cadena ligera de inmunoglobulina que la línea celular transfectada sencilla, y que la línea celular 20F2 tiene aproximadamente 114% más ARNm que codifica la cadena ligera de inmunoglobulina.

Tabla 4: Resultados ejemplares con combinación cebador-sonda #133/#132/#166. cantidad de línea celular 4F5 línea celular 20F2 mARN en la % relativo a línea ,% relativo a línea muestra [ng] celular 8C8 ± s celular 8C8 ± s 250 171.51 ±16.83 211.4 ± 15.40 50 183.08 ±9.22 213.61 ±5.32 10 177.15 ±7.14 219.62 ±8.85 valor de promedio relativo 177.25 ±5.78 214.88 ±4.25 El anterior método de determinación · realizado es específico ya que solamente un producto sencillo se obtiene como se confirma por electroforesis de gel de agarosa.

Para la determinación de la cantidad de ARN de la cadena de anticuerpo pesada los cebadores #62 y #65 y el colorante SYBR® Verde I se usaron. Estos cebadores enlazan a dos diferentes exones (región CH1- y CH2, respectivamente) , que se separan por un intrón, el exón de articulación y un segundo intrón.

La determinación de la cantidad de ARN de la cadena de anticuérpo pesada de las tres líneas celulares se realizó independientemente tres veces cada una con tres diferentes cantidades de ARNm de 250 ng, 50 ng, y 10 ng. El anterior método de determinación realizado es específico como solamente un producto sencillo se obtiene como se confirmó por la electroforesis de gel de agarosa y se muestra en la Figura 8.

El resultado de un experimento representativo obtenido con la combinación de cebador #62/#65 se enlista basado en la cantidad de ARN de la línea celular transfectada sencilla, que se estableció a 100% cantidad relativa en la Tabla 5. Se puede observar, que la línea celular 4F5 tiene aproximadamente 60% más ARNm que codifica cadena ligera de inmunoglobulina que la línea celular transfectada sencilla, y que la línea celular 20F2 tiene aproximadamente 140% más ARNm que codifica la cadena ligera de inmunoglobulina.

Tabla 5: Resultados ejemplares con combinación de cebador #62/#65.

Para la determinación de la cantidad de ARN de la cadena de anticuerpo pesada de las tres líneas celulares con sondas de hidrólisis TaqMan al principio la combinación de cebadores y sonda útil en este aspecto de la invención tuvo que determinarse. Las combinaciones de cebadores #62, #65, #66, #68, #67, #62, #63 y las sondas TaqMan #167 y #168 se probaron. La sondas contenidas en el extremo 5' el colorante IRD700. Los productos PCR obtenidos con las diferentes combinaciones cebador- sonda como se enlistan arriba (por ejemplo Figura 9) que los cebadores de combinaciones #66 y #68 con sonda #168 así como los cebadores de combinación #67 y #68 con sonda #168 resultados en los productos PCR con un alto rendimiento de producto específico y baja formación de sub-producto . Para el incremento en la intensidad de fluorescencia el colorante fluorescente de la sonda #168 se cambió a Cy5. Esta nueva sonda se denotó como sonda #173. De esta manera, las combinaciones cebador-sonda #66, #68, y #168 o #173 así como la combinación cebador- sonda #67, #68, y #168 o #173 por sí mismos son aspectos específicos de la invención actual así como el uso de estas combinaciones cebador- sonda en el método de acuerdo con la invención. En una modalidad es la combinación cebador- sonda #66, #68, y #173. Esta combinación se prefiere como que muestra una mejor eficiencia de PCR, es decir un incremento más pronunciado de la curva de amplificación.

La determinación de la cantidad de ARN de la cadena de anticuerpo pesada de las tres líneas celulares se realizó independientemente cuatro veces cada una con tres diferentes cantidades de ARNm de 250 ng, 50 ng, y 10 ng . El resultado de un experimento representativo obtenido con la combinación de cebador #66/#68 y la sonda #173 se enlista con base en la cantidad de ARN de la línea celular transfectada sencilla, que se estableció a 100% de la cantidad relativa en la Tabla 6. Se puede observar, que la línea celular 4F5 tiene aproximadamente 88% más ARNm que codifica cadena pesada de inmunoglobulina que la línea celular transfectada sencilla, y que la línea celular 20F2 tiene aproximadamente 126% más ARNm que codifica la cadena ligera de inmunoglobulina.

Tabla 6: Resultados ejemplares con combinación cebador-sonda #66/#68/#173.

El anterior método de determinación realizado es específico como solamente un producto sencillo se obtiene como se confirma por la electroforesis de gel de agarosa.

Con objeto de normalizar los resultados obtenidos con objeto de eliminar las variaciones entre días y entre laboratorios, puede usarse una correlación a un gen constitutivo. Se ha encontrado que el gen que codifica la enzima deshidrogenasa gliceraldehxdo- 3 - fosfato (GAPDH) puede usarse para este propósito. De esta manera, un aspecto de la invención actual es la combinación cebador-sonda #169/#170 y #171 y el uso de la combinación en un formato PCR de sonda TaqMan para la determinación de GAPDH ARNm.

En una reacción PCR de pliegues múltiples una detección y amplificación simultánea de un ARNm que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina, un ARNm que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina, y un ARNm que codifica GAPDH se realizó. Para la determinación sencilla las combinaciones cebador-sonda #132/#133/#166 (cadena ligera, colorante FAM) , #66/#68/#173 (cadena pesada, colorante Cy5) , y #169/#170/#171 (GAPDH, colorante Yakima Amarillo) se usaron. La combinación para el gen GAPDH no fue útil en una reacción PCR de pliegues múltiples. Pero se ha encontrado que la combinación cebador-sonda #148/#149/#174 es útil en una determinación PCR de pliegues múltiples de GAPDH ARNm. De esta manera, un aspecto de la invención actual es la combinación cebador-sonda #148/#149 y #174 y el uso del mismo en una reacción PCR de pliegues múltiples.

Después de que el PCR de pliegues múltiples que emplea las combinaciones cebador-sonda #132/#133/#166 (para detección y amplificación de cadena ligera, colorante FAM) , #66/#68/#173 (para amplificación y detección de cadena pesada, colorante Cy5) , y #148/#149/#174 (para amplificación y detección GAPDH, colorante Yakima Amarillo) los productos PCR se separaron en un gel de agarosa al 2%. La bandas detectadas se correlacionaron con los fragmentos esperados de 101 bp (cadena ligera) , 197 bp (GAPDH) , 244 bp (cadena pesada) (ver Figura 10) .

La eficiencia de las reacciones PCR en tiempo real se determinó con base en una serie de dilución (200 ng, 100 ng, 50 ng, 25 ng, 12.5 ng, 6.25 ng, 3.125 ng) determinada como cuadru licados y se da en la Tabla 7.

Tabla 7: Eficiencia.

De esta manera, una eficiencia de 2 para el cálculo puede usarse .

En el PCR de pliegues múltiples las siguientes cantidades para el ARNm que codifica la cadena ligera de inmunoglobulina y la cadena pesada de inmunoglobulina en las líneas celulares 4F5 y 20F2 comparado con la línea celular 8C8, que se establece a 100%, se encontraron.

Tabla 8: Resultados de PCR de pliegues múltiples.

Ahora se ha encontrado que la velocidad de producción específica (SPR) de una célula se correlaciona bien con la cantidad de ARNm que codifica el polipéptido heterologo producido.

Esto se encontró para reacciones PCR simples (Tabla 9) así como para reacciones PCR de pliegues múltiples (tabla 10) .

Tabla 9 : Resultados de reacción PCR simple ejemplares.

Tabla 10 : Resultados de reacción PCR de pliegues múltiples ej emplares .

Ahora se ha encontrado que un factor se puede calcular con base en la cantidad de ARNm determinada por medio de PCR de una célula con SPR desconocido y una célula con SPR conocido de un polipéptido heterólogo que permite el cálculo del SPR desconocido.

Tabla 11: Determinación de Factor.

De esta manera, un aspecto de la invención actual es un método para determinar la productividad de una célula que expresa un polipéptido heterólogo que comprende las etapas de - determinar la cantidad de ARNm que codifica el polipéptido heterologo en una célula de productividad conocida, determinar la cantidad de ARNm que codifica el polipéptido heterologo en una célula de productividad desconocida, - calcular la relación de la cantidad determinada de ARNm que codifica el polipéptido heterologo de la célula de productividad desconocida a la célula de productividad conocida, - multiplicar la productividad de la célula de productividad conocida con la relación calculada y por ello determinar la productividad de una célula que expresa un polipéptido heterologo.

En una modalidad el polipéptido heterologo es una inmunoglobulina o un fragmento de inmunoglobulina o un conjugado de inmunoglobulina. En una modalidad la inmunoglobulina heteróloga es una inmunoglobul na heteróloga multimérica. En otra modalidad la cantidad de ARNm que codifica el polipéptido heterologo es la suma de las cantidades de ARNm que codifica todas las subunidades del polipéptido heterologo dividido por el número de subunidades. En una modalidad la productividad es la velocidad de producción específica en pg/célula/día . En una modalidad la cantidad de ARNm que codifica la inmunoglobulina heteróloga es el promedio de la cantidad de ARNm que codifica la cadena ligera de la inmunoglobulina heteróloga y la cantidad de ARNm que codifica la cadena pesada de la inmunoglobulina heteróloga. En una modalidad la determinación de la cantidad de ARNm es por medio de una reacción en cadena de polimerasa (PCR) . En una modalidad el PCR es un PCR de pliegues múltiples . En otra modalidad el PCR es un PCR de transcripción inversa (RT-PCR) . En una modalidad la relación calculada se multiplica por un factor de 0.925.

Por ejemplo, la velocidad de producción específica de una célula precursora es 100 pg/célula/dia. Por medio de PCR de pliegues múltiples del ARNm de una célula de productividad desconocida la cantidad de ARNm que codifica la cadena ligera de inmunoglobulina se determinó para ser 169% y la cantidad de ARNm que codifica la cadena pesada de inmunoglobulina se determinó para ser 161% de la cantidad de ARNm de la célula precursora. El promedio de las cantidades de ARNm es 165% o 1.65 veces la cantidad de ARNm de la célula precursora. De esta manera, el SPR de la célula precursora de 100 pg/célula/día se multiplica por 1.65, obteniendo así un SPR de 165 pg/célula/día. El SPR de la célula desconocida se determinó para ser 165 pg/célula/día.

El término "alrededor de" como se usa dentro de esta solicitud significa una desviación de +/- 10% del valor indicado. De esta manera, el término "alrededor de 1.65" significa el intervalo desde 1.49 hasta 1.82.

Dependiendo de la secuencia de aminoácido de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos se dividen en las clases: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y diversos de éstos se pueden además dividir en subclases, tal como IgGl, IgG2, IgG3 , y IgG4, IgAl y IgA2. Las regiones constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se llaman oc, d, e, ?, y µ, respectivamente. Las regiones constantes de cadena ligera que se pueden encontrar en todas las cinco clases de anticuerpo se llaman K (kappa) y ? (lambda) .

Debido a los diferentes números de copia de gen que codifican la inmunoglobulina heteróloga integrada en el genoma la cantidad de ARNm transcrita de estos genes también es diferente. De esta manera, un aspecto adicional de la invención actual es un método para la determinación de la cantidad de ARNm o ADN con cuantificación relativa para ARNm o cuantificación absoluta para ADN que comprende a) proporcionar una muestra, b) realizar una reacción en cadena de polimerasa con los cebadores de la SEQ ID NO: 23 y 24 y la sonda de SEQ ID NO: 33, y/o c) realizar una reacción en cadena de polimerasa con los cebadores de SEQ ID NO: 19 y 21 y la sonda de SEQ ID NO: 40, y d) cuantificar con una eficiencia de 2.0.

Además se ha encontrado que la productividad específica de las diferentes lineas celulares está bien correlacionada con la cantidad de ARN. También se ha encontrado que el ARNm que codifica la cadena pesada de la inmunoglobulina explica para 30% de la inmunoglobulina que codifica ARNm y que el ARNm que codifica la cadena ligera de la inmunoglobulina explica para 70% de la inmunoglobulina que codifica ARNm.

Un aspecto adicional de la invención es un método para la selección de una célula productora de inmunoglobulina que comprende a) proporcionar una célula, b) aislar el ARN de la célula, c) realizar con el ARN aislado una reacción en cadena de polimerasa con los cebadores de la SEQ ID NO: 23 y 24 y la sonda de la SEQ ID NO: 33, d) realizar con el ARN aislado una reacción en cadena de polimerasa con los cebadores de la SEQ ID NO: 19 y 21 y la sonda de la SEQ ID NO: 40, e) seleccionar una célula como una célula productora de inmunoglobulina si en la etapa c) y d) un producto de reacción en cadena de polimerasa se obtiene.

En una modalidad la célula proporcionada se ha transfectado con un ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina, en otra modalidad la célula proporcionada es una célula que no produce endógenamente una inmunoglobulina. En una modalidad la célula es una pluralidad de células.

Otro aspecto de la invención es un método para la producción de una inmunoglobulina que comprende a) proporcionar una pluralidad de células, b) aislar el ARN de cada una de las células, c) realizar con el ARN aislado una reacción en cadena de polimerasa con los cebadores de la SEQ ID NO: 23 y 24 y la sonda de la SEQ ID NO: 33, d) realizar con el ARN aislado una reacción en cadena de polimerasa con los cebadores de la SEQ ID NO: 19 y 21 y la sonda de la SEQ ID NO: 40, e) seleccionar una célula basada en la cantidad de producto de reacción en cadena de polimerasa formado en la etapa c) y d) , f) cultivar la célula seleccionada, g) recuperar la inmunoglobulina de la célula o el medio de cultivo y por ello producir una inmunoglobulina.

En una modalidad la célula se selecciona que tenga la mayor cantidad de producto de reacción en cadena de polimerasa en la etapa d) .

Un aspecto adicional de la invención actual es un método para la determinación simultánea de cadenas pesadas y ligeras IgGl e IgG4 en una forma de alto rendimiento .

En una modalidad de la invención actual es el polipéptido heterologo un anticuerpo anti-Abeta.

En una modalidad de los métodos antes presentados de acuerdo con la invención la reacción en cadena de polimerasa es un formato de sonda de hidrólisis TaqMan. En otra modalidad los cebadores de cadena ligera se etiquetan con el colorante FAM y los cebadores de cadena pesada se etiquetan con el colorante Cy5. En una modalidad los cebadores de la SEQ ID NO: 23 y 24 son para la cadena ligera de inmunoglobulina y los cebadores de la SEQ ID NO: 19 y 20 son para la cadena pesada de inmunoglobulina. En una modalidad las etapas c) y d) además comprenden medir la amplificación del ácido nucleico en tiempo real para determinar la cantidad amplificada del ácido nucleico.

Los siguientes ejemplos, listado de secuencias y figuras se proporcionan para ayudar al entendimiento de la presente invención, el alcance verdadero del cual se establece en las reivindicaciones añadidas. Se entiende que las modificaciones se pueden hacer en los procedimientos establecidos sin apartarse del espíritu de la invención.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1. Muestra la ubicación y dirección de cebadores y sondas en la región constante de cadena ligera (cadena IgG kappa humana; SEQ ID NO: 44) .

Figura 2. Muestra la ubicación y dirección de cebadores y sondas en la región constante de cadena pesada 1 (cadena pesada IgG humana CH1; SEQ ID NO: 45) .

Figura 3. Muestra la ubicación y dirección de cebadores y sondas en la región constante de cadena pesada 2 (cadena pesada IgG humana CH2 ; SEQ ID NO: 46) .

Figura 4. Muestra la ubicación y dirección de cebadores y sondas en la región constante de cadena pesada 3 (cadena pesada IgG humana CH3 ; SEQ ID NO: 47) .

Figura 5. Muestra la separación de gel de agarosa de reacción en cadena ligera PCR con la combinación de cebador #131 y #132 y SYBR® GREEN I.

Figura 6. Muestra la separación de gel de agarosa de una muestra de 8 µ? de una reacción PCR de 45 ciclos; muestras: PM: marcador de par base; 1: 139 / 134 - 165; 2: 139 / 134 -166; 3: 139 / 132 - 165; 4: 139 / 132 - 166; 5: 139 / 146 -165; 6: 139 / 146 - 166; 7: 139 / 38 - 147; 8: 139 / 38 -165; 9: 139 / 38 - 166; 10: 139 / 146 - 147; 11: 131 / 38 -166; 12: 131 / 38 - 147; 13: 37 / 134 - 166; 14: 37 / 132 -166; 15: 37 / 146 - 166; 16: 37 / 146 - 147; 17: 145 / 146 -147; 18: 145 / 38 - 147; 19: 131 / 134 - 165; 20: 131 / 134 -166; 21: 131 / 132 - 165; 22: 131 / 132 - 166; 23: 131 / 146 - 166; 24: 131 / 146 - 165; 25: 131 / 146 - 147; 26: 131 / 38 - 165; 27: 37 / 38 - 166; 28: 133 / 134 - 166; 29: 133 / 132 - 166; 30: 133 / 146 - 166; 31: 133 / 146 - 147; 32: 133 / 38 - 166.

Figura 7. Muestra las curvas de amplificación de reacciones PCR con la combinación cebador- sondas #133, #132, y #166, o #133/#38, y #160, respectivamente.

Figura 8. Muestra la separación de gel de agarosa de reacción PCR de cadena pesada con los cebadores #62 y #65 y el colorante SYBR® Verde I; bpm = marcador estándar de par base; 1: referencia vacía; 2: 8C8; 3: 4F5; 4: 20F2.

Figura 9. Muestra la separación de gel de agarosa de una muestra de 8 µ? de una reacción PCR de 45 ciclos; muestras: PM: marcador de par base; 1: referencia vacía; 2: 62/65 -167; 3: 66/68 - 168; 4: 67/68 - 168.

Figura 10. Muestra el gel de agarosa de los productos PCR de un PCR de pliegues múltiples que emplea las combinaciones cebador-sonda #132/#133/#166 (para detección y amplificación de cadena ligera, colorante FAM) , #66/#68/#l 73 .(para amplificación y detección de cadena pesada, colorante Cy5) , y #148/#149/#174 (para amplificación y detección GAPDH, colorante Yakima Amarillo) . Las bandas detectadas se correlacionan a los fragmentos esperados de 101 bp (cadena ligera) , 197 bp (GAPDH) , y 244 bp (cadena pesada) .

Ejemplos Materiales y Métodos La información general con respecto a las secuencias de nucleótido de cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas humanas se da en: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta ed. , Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) . Los aminoácidos de cadenas de anticuerpo se numeran de acuerdo con la numeración EU (Edelman, G.M., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta ed. , Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)) .

Técnicas ADN recombinantes : Los métodos estándares se usaron para manipular ADN como se describe en Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Los reactivos biológicos moleculares se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante .

Síntesis de Genes: Los segmentos de gen deseados se prepararon de oligonucleótidos hechos por síntesis química. Los segmentos de gen de 100 - 600 pb de largo, que se acompañan por sitios de desdoblamiento de endonucleasa de restricción singular, se ensamblaron al combinar los pares de bases y ligar., los oligonucleótidos que incluyen amplificación PCR y posteriormente clonaron en el vector de clonación pCR2.1-TOPO-TA (Invitrogen Corp., USA) por medio de vector de clonación pPCR-Script Amp SK(+) o colgaduras A (Stratagene Corp., USA) . La secuencia de ADN de los fragmentos de gen subclonados se confirmaron por secuenciación de ADN.

Síntesis de oligonucleótido de ADN: Los cebadores y sondas no etiquetadas, que se etiquetaron con inhibidores y colorantes fluorescentes, se generaron por síntesis química.

Determinación de proteínas: La concentración de proteínas se determinó al determinar la densidad óptica (OD) en 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado en la base de la secuencia de aminoácido .

Determinación de ADN y ARN: La concentración de ADN y ARN se determinó al medir la densidad óptica en 260 nm asumiendo que una densidad óptica de 1 corresponde a ADN de hebra doble 50 yg/ml o ARN 40 Determinación de número de célula: El número de célula se determinó en un modelo CASY® TT. Antes de la determinación de número de célula las células se individualizaron al tratar con tripsina a 37°C por 10 minutos. La tripsinación se terminó por la adición de suero de bovino fetal (FCS) .

Determinación de concentración de inmunoglobulina: Las concentraciones de inmunoglobulina se determinaron ya sea por ELISA Fe anti-humano o por cromatografía de Proteina A usando el anticuerpo purificado autologo como una referencia.

SDS-PAGE Solución amortiguadora de muestra LDS, concentrado cuatro veces (4x) : glicerol 4 g, 0.682 g TRIS-Base, clorohidrato TRIS 0.666 g, LDS 0.8 g (dodecil sulfato de litio), EDTA 0.006 g (tetra ácido de etilen diamina), 0.75 mi de una solución 1% en peso (p/p) de Azul Serva G250 en agua, 0.75 mi de una solución 1% en peso (p/p) de fenol rojo, agregar agua para hacer un volumen total de 10 mi.

El caldo de cultivo que contiene la inmunoglobulina secretada se centrifugó para remover células y restos celulares. Una alícuota del sobrenadante clarificado se mezcló con 1/4 volúmenes (v/v) de solución amortiguadora de muestra 4xLDS y volumen 1/10 (v/v) de 0.5 M 1, 4 -ditiotreitol (DTT) . Luego las muestras se incubaron por 10 min. a 70 °C y la proteína se separa por SDS-PAGE. El sistema de gel NuPAGE® Pre-Cast (Invitrogen Corp., USA) se usó de acuerdo con la instrucción del fabricante. En particular, geles NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast al 10% (pH 6.4) y un NuPAGE® OPS que ejecuta solución amortiguadora se usó.

Técnica Western blot Solución amortiguadora de transferencia: glicina 39 mM, clorohidrato TRIS 48 mM, 0.04% (p/p) SDS, y metanol al 20% (v/v) .

Después de SDS-PAGE las cadenas de inmunoglobulina separadas se transfirieron electroforáticamente a una membrana de filtro de nitrocelulosa (tamaño de poro: 0.45 µp) de acuerdo con "Semidry-Blotting-Method" de Burnette (Buraette, W.N., Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203).

Aislamiento de ARN ARN se ha aislado con el mini-Kit RNeasy® de Qiagen (Hilden, Alemania) de acuerdo con el manual del fabricante. La contaminación de ADN se eliminó por la adición de ADNse . El ARN se aisló de lxlO7 células probadas en el tercer día de cultivo .

Aislamiento de ADN El ADN genómico se aisló con el Kit de ADN para cultivo de células y sangre Midi de Qiagen (Hilden, Alemania) de acuerdo con el manual del fabricante a partir de lxlO7 células en el cuarto día de cultivo.

PCR de Tiempo Real o RT-PCR de Tiempo Real Para la PCR de tiempo real o RT-PCR de tiempo real los colorantes SYBR® Verde I y sondas TaqMan se han usado. Las mezclas de reacción fueron después de la preparación y antes de la amplificación colocadas sobre hielo en la oscuridad. La determinación y análisis se realizó con el Sistema 2.0 LightCycler® y software 4.1 LightCycler® o con el Sistema 480 LightCycler® II y software 1.5 LightCycler® (todos de Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) .

Ejemplo 1 Vector de Expresión para expresar un anticuerpo anti-?ß Un anticuerpo de ejemplo con el cual los métodos de acuerdo con la invención se pueden ejemplificar es un anticuerpo contra el péptido ß-?4 amiloide (anticuerpo anti-?ß) . Tal anticuerpo y las secuencias de ácido nucleico correspondientes son, por ejemplo, reportados en WO 2003/070760 O US 2005/0169925 O en la SEQ ID NO: 1 hasta 12.

Tres anticuerpos anti-?ß que expresan líneas celulares de ovario de hámster Chino (CHO) se generaron por tres transíecciones completas sucesivas y campañas de selección como se reporta en WO 2009/046978.

Un segmento de gen de región constante de cadena ligera humano genómico (C-kappa, CL) se agregó a la región variable de: cadena ligera del anticuerpo anti-?ß, mientras que un segmento de gen de región constante de cadena pesada ?? humano (CHi-Bisagra-CH2-CH3) se agregó a la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-?ß. Los genes de anticuerpo de cadena pesada ?? y ligera ? completos se unieron luego con un promotor de citomegalovirus humano (HCMV) en el extremo 5' y una secuencia de señal de poliadenilación de inmunoglobulina humana en el extremo 31.

Para la expresión y producción del anticuerpo anti-?ß los casetes de expresión de cadena ligera y cadena pesada se colocaron sobre un vector de expresión sencillo (cadena pesada 5' de cadena ligera en la orientación de las manecillas del reloj ) . Tres vectores de expresión idénticos se generaron que son diferentes solamente en el gen marcador seleccionable incluido, en particular, en el gen que confiere resistencia al agente de selección de neomicina, higromicina, o puromicina.

Las células hospederas precursoras pre-adaptadas se propagaron en suspensión en medio completo ProCH04 libre de componente animal, sintético bajo condiciones de humidificado estándares (C02 al 95%, 37°C, y 5%) . Sobre intervalos regulares dependiendo de la densidad celular las. células se separaron en medio fresco. Las células se cosecharon por centrifugación en la fase de crecimiento exponencial, se lavaron una vez en solución salina amortiguada con fosfato estéril (PBS) y re-suspendieron en PBS estéril.

Antes de la transfección los plásmidos que expresan anticuerpo anti-?ß se linealizaron dentro del gen de lactamasa ß (gen marcador resistente a la ampicilina E. coli) usando la enzima de endonucleasa de restricción Pvul o Avill. El ADN desdoblado se precipitó con etanol, se secó bajo vacío, y disolvió en PBS estéril.

En general, para la transfección, las células CHO se electroporaron con 20-50 yg de ADN de plásmido linealizado por aproximadamente 107 células en PBS a temperatura ambiente. Las electroporaciones se realizaron con un dispositivo de electroporación Gene Pulser XCell (Bio-Rad Laboratories) en una cubeta de 2 mm de espacio, usando un protocolo de onda cuadrática con un impulso de 180 V sencillo. Después de la transfección, las células se colocaron en placas en medio completo ProCH04 en placas de cultivo de 96 pozos. Después de 24 h de crecimiento una solución que contiene uno o más agentes de selección se agregaron (medio de selección completo ProCH04 ; G418: 400 g/ml; higromicina : 600 g/ml; puromicina: 8 yg/ml). Una vez por semana el medio de selección completo ProCH04 se reemplazó. La concentración de anticuerpo del anticuerpo anti-?ß se analizó con un ensayo ELISA específico para IgGl humano en los sobrenadantes de cultivo.

Para la selección de anticuerpo anti-?ß que produce líneas celulares la productividad se probó en medio de selección completo ProCH04 después de la propagación en placas de cultivo de 6 pozos, matraces T y/o matraces de agitación Erlenmeyer usando un ELISA de IgGl anti-humana y/o HPLC de Proteína A analítica.

Para la primera etapa de transfección y selección se ha usado un plásmido que contiene un gen que confiere resistencia al agente de selección neomicina. El plásmido se ha transfectado con electroporacion en línea de célula precursora adaptado para crecer en medio completo ProCH04. Las células transfectadas se cultivaron en medio completo ProCH04 complementado con hasta 700 g/ml de G418 en placas de 96 pozos. La concentración de anticuerpo en los sobrenadantes de cultivo se evaluó por un ELISA de IgGl anti -humana. Aproximadamente 1000 clones se han probado y los seleccionados de ellos se cultivaron además en placas de 24 pozos, placas de 6 pozos y posteriormente en matraces de agitación. El crecimiento y la productividad de aproximadamente 20 clones se evaluaron en cultivos estáticos y en suspensión por ELISA IgGl anti-humano y/o HPLC de Proteína A analítica. El mejor clon (mejor clon no denota el clon más productivo esto significa el clon con las mejores propiedades para las etapas adicionales) se sub-clonó por dilución limitada en medio acondicionado ProCH04 complementado con 700 µ?/??? de G418. El clon seleccionado se nombró 8C8.

Para la segunda etapa de transfección y selección se ha usado un plásmido que contiene un gen que confiere resistencia al agente de selección de higromicina. El plásmido se ha transfectado con electroporacion en línea celular cultivada en medio completo ProCH04 complementado con 700 pg/ml de G418. Las células transfectadas se ampliaron por alrededor de dos hasta tres semanas en medio acondicionado ProCH04 complementado con 200 µ?/??? de G418 y 300 ug/ml de higromicina (medio de selección doble ProCH04) . Las células secretoras de anticuerpo sencillas se identificaron y depositaron en la base de su intensidad de fluorescencia después de la tinción con un conjugado de Fluor Alexa de Proteína A por análisis FACS . Las células depositadas se cultivaron en medio de selección doble ProCH04 en placas de 96 pozos. La concentración de anticuerpo en los sobrenadantes de cultivo se evaluó por un ELISA de IgGl anti-humana. Aproximadamente 500 clones se han probado y los seleccionados de ellos se cultivaron además en placas de 24 pozos, placas de 6 pozos y posteriormente en matraces de agitación. El crecimiento y productividad de aproximadamente 14 clones se evaluó en cultivos estáticos y en suspensión por ELISA IgGl antihumano y/o HPLC de Proteína A analítica. El clon seleccionado se nombró 4F5.

Para la tercera etapa de transfección y selección se ha usado un plásmido que contiene un gen que confiere resistencia al agente de selección puromicina. El plásmido se ha transfectado con electroporación en línea celular cultivada en medio de selección doble ProCH04. Las células transfectadas se expandieron por alrededor de dos hasta tres semanas en medio de selección triple ProCH04 (medio acondicionado ProCH04 complementado con 200 \iq/ml G418 y 300 g/ml higromicina y 4 pg/ml puromicina) . Las células secretoras de anticuerpo sencillas se identificaron y depositaron en la base de su intensidad de fluorescencia después de la tinción con un conjugado de Fluor Alexa de Proteína A por análisis FACS . Las células depositadas se cultivaron en medio de selección triple ProCHO.4 en placas de 96 pozos. La concentración de anticuerpo en los sobrenadantes de cultivo se evaluó por un ELISA IgGl anti-humano. Aproximadamente 500 clones se han probado y los seleccionados de ellos se cultivaron además en placas de 24 pozos, placas de 6 pozos y posteriormente en matraces de agitación. El crecimiento y produc ividad de aproximadamente 10 clones se evaluaron en cultivos estáticos y en suspensión por ELISA IgGl anti-humano y/o HPLC de proteína A analítica. El clon seleccionado se nombró 20F2.

Caracterís icas de Clon: Como se puede ver de la siguiente tabla el tiempo de duplicación y densidad celular después de tres días de cultivo fueron comparables cuando la línea celular básica CHO-K1 (tipo natural) y los clones seleccionados se comparan.

Tabla 12: Características de clones.

Ejemplo 2 RT-PCR de Tiempo Real con SYBR® Verde I Para el RT-PCR con SYBR® Verde I el sistema LightCycler® 2.0 se empleó (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) . Del ARN de líneas celulares 8C8, 4F5 y 20F2 cada una de una serie de dilución con la disminución de concentración de ARN se preparó y analizó. La cantidad de ARN en todas las muestras se complementó con ARN de tipo natural en una forma que la cantidad de ARN total, es decir la suma de ARN de tipo natural y ARN muestra, fue el mismo en todas las muestras .

Después de la preparación de muestra, 5 µ? de la muestra se mezclaron con 15 pi de una solución RT-PCR-SG. La solución RT-PCR-SG comprende: 5 µ? de agua grado PCR 1.3 µ? 50 nM n(0Ac)2 7.5 µ? SYBR® Verde I Pre-Mezcla 0.6 µ? cebador delantero (10 pmol/µ?) 0.6 µ? cebador inverso (10 pmol/µ?) .

De cada muestra tres diferentes cantidades de AR se analizaron (250 ng, 50 ng, y 10 ng) . Las condiciones PCR fueron como se muestra en la Tabla 13.

Tabla 13: Condiciones de PCR.

La fluorescencia se determinó en 530 nm.

Análogamente el sistema LightCycler® II 480 se empleó en el RT-PCR. Las condiciones PCR fueron como se muestra en la Tabla 14.

Tabla 14: Condiciones PCR.

Ejemplo 3 RT-PCR de Tiempo Real con sondas de hidrólisis TaqMan Para el RT-PCR con sondas de hidrólisis TaqMan el sistema LightCycler® II 480 se empleó (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) . Las muestras PCR se prepararon al usar el Kit de Sondas de Hidrólisis Maestro de ARN LightCycler® 480 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) .

Después de la preparación de muestra, 5 µ? de la muestra se mezclaron con 15 µ? de una solución RT-PCR-HS. La solución RT-PCR-HS comprende: 3. 8 µ? agua grado PCR 1. 3 µ? 3.25 ?? Mn(0Ac)2 7. 4 µ? Pre-Mezcla LightCycler® 1. 0 µ? cebador delantero (10 pmol/µ?) 1. 0 µ? cebador inverso (10 pmol/µ?) 0. 5 µ? sonda de hidrólisis TaqMan (10 pmol/µ?) .

Las condiciones PCR fueron como se muestra en la Tabla 15 Tabla 15: Condiciones PCR.

Programa Fase Número T T Tasa de Determinación de [°C] [min: s incremen ciclos ] to [°C/s] Trans1 61 20:00 4.4 cripción inversa Desnatu^ 1 95 02 : 00 4.4 ralización PCR de Desnatu45 95 00 : 10 4.4 Tiempo ralización Real Combinación vari 00:20 2.2 de pares de bases able Extensión 72 00:01 4.4 sencilla Enfria1 37 00 : 01 2.2 miento Ejemplo 4 RT-PCR de Pliegues múltiples de Tiempo Real con sondas de hidrólisis TaqMan Para el RT-PCR de pliegues múltiples dos o tres, respectivamente, las sondas de hidrólisis TaqMan se han combinado. Después de la preparación muestra 5 µ? de la muestra se mezcló con 15 µ? de una solución RT-PCR-M_HS.

Tabla 16: Componentes de la solución RT-PCR-M_HS. componente volumen para dos sondas [µ?] tres sondas [µ?] agua de grado PCR 1.3 1.3 Mn(OAc)2, 3.25 mM 1.3 1.3 Pre-Mezcla LightCycler® Cebador delantero 1, 10 1 0.75 pmol/µ? Cebador inverso 1, 10 1 0.75 pmol/µ? Sonda TaqMan 1, 10 pmol/µ? 0.5 0.5 Cebador delantero 2, 10 1 0.75 pmol/µ? Cebador inverso 2 , 10 1 0.75 pmol/µ? Sonda TaqMan 2, 10 pmol/µ? 0.5 0.5 Cebador delantero 3, 10 - 0.75 pmol/µ? Cebador inverso 3, 10 - 0.75 pmol/µ? Sonda TaqMan 3, 10 pmol/µ? - 0.5 Total 15 15 Los resultados del RT-PCR de pliegues múltiples se han correlacionado con un programa de compensación de color generado para las sondas TaqMan empleadas .

Ejemplo 5 PCR de Tiempo Real Para el PCR de Tiempo Real se han usado el sistema LightCycler® II 480 que emplea SYBR® Verde I y las sondas TaqMan. Cada muestra se determinó en las diluciones de ADN muestra 50 ng, 25 ng, 10 ng, 5 ng, y 2.5 ng como cuadruplicado. Para el PCR de tiempo real 15 µ? de la solución de PCR correspondiente se colocó en el pozo de una placa de microtítulo de 96 pozos seguido por 5 µ? del ADN muestra. La placa se selló con una hoja de sellado LightCycler® 480 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) y centrifugó en 1,500 x g por 2 minutos. Después la placa se montó en el sistema LightCycler® 480. La determinación y análisis de los datos se hizo con el software LightCycler® 480 versión 1.5.

El número de copia se determinó por cuantificación absoluta con el primer plásmido de transfeccion del Ejemplo 1 como estándar externo en forma lineal.

SYBR® Verde I Para el PCR de tiempo real el Kit LightCycler® FastStart Master PLUS SYBR Verde I (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) se empleó. La mezcla de reacción fue compuesta de: 9 µ? agua grado PCR 4 µ? Pre-Mezcla SYBR® Verde I 1 µ? cebador delantero (10 pmol/µ?) 1 µ? cebador inverso (10 pmol/µ?) .

Las condiciones PCR empleadas fueron como se muestra en la Tabla 17.

Tabla 17: Condiciones PCR.

Sonda de hidrólisis TaqMan Para el RT-PCR el Kit Maestro de Sondas LightCycler® 480 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) se usó. La mezcla de reacción fue compuesta de: 2.5 µ? agua grado PCR 10 µ? Pre-Mezcla LightCycler® 1 µ? cebador delantero (10 pmol/µ?) 1 µ? cebador inverso (10 pmol/µ?) 0.5 µ? sonda de hidrólisis TaqMan (10 pmol/µ?) .

Las condiciones PCR empleadas fueron como se muestra en la Tabla 18.

Tabla 18: Condiciones PCR.

Cuantificación absoluta En la cuantificación absoluta la cantidad de una secuencia de ácido nucleico se determina en términos de número de copias de la secuencia. La función estándar o de referencia se determinó por análisis de cinco soluciones con concentraciones conocidas del primer plásmido usado en. el ejemplo 1. La función de referencia se proporciona por una relación lineal entre el valor Cp y el número de copia de un ácido nucleico y se permite para la determinación de un número de copia desconocido en una muestra.

Las diluciones de las muestras estándar contienen 2.5 x 107 hasta 2.5 x 102 copias del plásmido. El cálculo del número de copia (Nk) del plásmido linealizado de la función estándar se hizo de acuerdo con las siguientes ecuaciones (1) hasta (4) (ver por ejemplo Jiang, Z., et al . , Biotechnol . Prog. 22 (2006) 313-318): (1) Mpiásmido = pbpiásmido x Mpb = 14,033 pb · 660 g mol"1 9,261,780 g mol"1 (2) Cpiásmido = 92.92 ng µ?"1 (después de linealización) (3) NA = 6.022 X 1023 mol"1 (numero de Avogardo) (4) NK = Cpiásmido · NA / MPiásmido = 6.0416 x 109 copias µ?"1 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (16)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para la determinación de la cantidad de ARNm caracterizado porque comprende a) proporcionar una muestra, b) realizar una reacción en cadena de polimerasa con los cebadores de la SEQ ID NO: 23 y 24 y la sonda de la SEQ ID NO: 33, y/o c) realizar una reacción en cadena de polimerasa con los cebadores de la SEQ ID NO: 19 y 21 y la sonda de la SEQ ID NO: 40, y d) cuantificar con una eficiencia de 2.0.

2. Un método para determinar la productividad de una célula que expresa una inmunoglobulina caracterizado porque comprende a) proporcionar una célula con productividad desconocida y una célula con productividad conocida, b) realizar una reacción en cadena de polimerasa con los cebadores de la SEQ ID NO: 23 y 24 y la sonda de la SEQ ID NO: 33, y/o realizar una reacción en cadena de polimerasa con los cebadores de la SEQ ID NO: 19 y 21 y la sonda de la SEQ ID NO: 40 con el ARN de la célula de productividad conocida y por ello determinar la cantidad de ARNm que codifica la inmunoglobulina en una célula de productividad conocida, c) realizar una reacción en cadena de polimerasa con los cebadores de la SEQ ID NO: 23 y 24 y la sonda de la SEQ ID NO: 33, y/o realizar una reacción en cadena de polimerasa con los cebadores de la SEQ ID NO: 19 y 21 y la sonda de la SEQ ID NO: 40 con el ARN de la célula de productividad desconocida y por ello determinar la cantidad de A Nm que codifica la inmunoglobulina en una célula de productividad desconocida, d) calcular la relación de la cantidad determinada de ARNm que codifica la inmunoglobulina de la célula de productividad desconocida a la célula de productividad conocida, e) multiplicar la productividad de la célula de productividad conocida con la relación calculada y por ello determinar la productividad de una célula que expresa una inmunoglobulina .

3. Un método para la selección de una célula productora de inmunoglobulina caracterizado porque comprende a) proporcionar una célula, b) aislar el ARN de la célula, c) realizar con el ARN aislado una reacción en cadena de polimerasa con los cebadores de la SEQ ID NO: 23 y 24 y la sonda de la SEQ ID NO: 33, d) realizar con el ARN aislado una reacción en cadena de polimerasa con los cebadores de la SEQ ID NO: 19 y 21 y la sonda de la SEQ ID NO: 40, e) seleccionar una célula como una célula productora de inmunoglobulina si en la etapa c) y d) un producto de reacción en cadena de polimerasa se obtiene.

4. Un método para la selección de una célula productora de inmunoglobulina caracterizado porque comprende a) proporcionar una pluralidad de células, b) aislar de cada una de las células el ARN, c) realizar con cada uno del ARN aislado individualmente una reacción en cadena de polimerasa con los cebadores de la SEQ ID NO: 23 y 24 y la sonda de la SEQ ID NO: 33, d) realizar con cada uno del ARN aislado individualmente una reacción en cadena de polimerasa con los cebadores de la SEQ ID NO: 19 y 21 y la sonda de la SEQ ID NO: 40, e) seleccionar una célula como célula productora de inmunoglobulina basada en la cantidad de producto de reacción en cadena de polimerasa formada en la etapa c) y d) .

5. Un método para la producción de una inmunoglobulina caracterizado porque comprende a) proporcionar una pluralidad de células, b) aislar el ARN de cada una de las células, c) realizar con cada uno del ARN aislado individualmente una reacción en cadena de polimerasa con los cebadores de la SEQ ID NO: 23 y 24 y la sonda de la SEQ ID NO: 33, d) realizar con cada uno del ARN aislado individualmente una reacción en cadena de polimerasa con los cebadores de la SEQ ID NO: 19 y 21 y la sonda de la SEQ ID NO: 40, e) seleccionar una célula basada en la cantidad de producto de reacción en cadena de polimerasa formado en la etapa c) y/o d) , f) cultivar la célula seleccionada, g) recuperar la inmunoglobulina de la célula o el medio de cultivo y por ello producir una inmunoglobulina.

6. Un método de conformidad con la reivindicación 4 o 5, caracterizado porque la célula se selecciona que tiene la mayor cantidad de producto de reacción en cadena de polimerasa en la etapa d) .

7. Un método de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 3 hasta 6, caracterizado porque la célula proporcionada se ha, o las células proporcionadas se han transfectado con un ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina .

8. Un método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la relación se multiplica con un factor de 0.925.

9. Un método de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la reacción en cadena de polimerasa es un formato de sonda de hidrólisis TaqMan.

10. Un método de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los cebadores de la SEQ ID NO: 23 y 24 son para la cadena ligera de inmunoglobulina y los cebadores de la SEQ ID NO: 19 y 20 son para la cadena pesada de inmunoglobulina.

11. Un método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque los cebadores de cadena ligera se etiquetan con el colorante FA y los cebadores de cadena pesada se etiquetan con el colorante Cy5.

12. Un método de acuerdo con una de cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las etapas de realizar una reacción en cadena de polimerasa además comprende medir la amplificación del ácido nucleico en tiempo real para determinar la cantidad amplificada del ácido nucleico.

13. El método de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la reacción en cadena de polimerasa es una reacción en cadena de polimerasa de transcriptasa inversa.

14. Un kit caracterizado porque comprende a) un ácido nucleico de la SEQ ID NO: 23, b) un ácido nucleico de la SEQ ID NO: 24, y c) un ácido nucleico de la SEQ ID NO: 33.

15. Un kit caracterizado porque comprende a) un ácido nucleico de la SEQ ID NO: 19, b) un ácido nucleico de la SEQ ID NO: 21, y c) un ácido nucleico de la SEQ ID NO: 40.

16. El uso de los ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 23, 24 y 33 o de la SEQ ID NO: 19, 21, y 40 en una reacción en cadena de poliraerasa.