DE10118043B4

DE10118043B4 - Hochspezifisches Detektionssystem

Info

Publication number: DE10118043B4
Application number: DE10118043A
Authority: DE
Inventors: Astrid Dr. Statmann; Ingrid Horschke; Ana Fulgencio
Original assignee: HOLBURN PATHOLOGY PRODUCTS Ltd; HOLBURN PATHOLOGY PRODUCTS Ltd BOWMANVILLE
Current assignee: HOLBURN PATHOLOGY PRODUCTS LTD., BOWMANVILLE, ONTA
Priority date: 2001-04-11
Filing date: 2001-04-11
Publication date: 2005-10-27
Anticipated expiration: 2021-04-12
Also published as: DE10118043A1; WO2002083941A2; WO2002083941A3

Abstract

Formamid-freie Pufferlösung für eine In-situ-Hybridisierung bestehend aus in Wasser gelösten 10% (Gew.-%) Dextransulfat, 0,2% (Gew.-%) Lauroylsarkosin, 0,1 bis 0,8 M NaCl und 0,01 bis 0,08 M Na₃-Citrat.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein hochspezifisches In-situ-Hybridisierungsverfahren von markierten Oligonucleotiden mit in einem Zielobjekt nachzuweisenden Nucleotidsequenzen sowie dabei eingesetzte Hybridisierungspuffer.
Sowohl die molekularbiologische Grundlagenforschung als auch die angewandte Forschung, insbesondere die molekulare Beschreibung physiologischer oder krankhafter Vorgänge, bedient sich in zunehmendem Maße einer Nucleotidanalyse auf Zell- und Gewebeebene. Zur exakten Lokalisation und quantitativen Abschätzung der Expression von zum Beispiel DNA oder RNA in Zellen oder Geweben wird die molekulare In-situ-Hybridisierung eingesetzt. Grundlage dieses molekularbiologischen Nucleinsäurenachweises ist das Prinzip der spezifischen Basenpaarung zweier komplementärer Nucleinsäuremoleküle. Eine in einem Zielobjekt vorhandene Nucleotidsequenz wird durch Basenpaarung mit einer markierten komplementären Nucleotidsequenz, der Sonde, nachgewiesen. Derartige Verfahren sind aus Wernert und Behrens (mta 13 (1998) 12, 880-886) bekannt.
Den In-situ-Hybridisierungsverfahren ist gemeinsam, dass nach radioaktiver oder nicht-radioaktiver Markierung der Nucleinsäure-Sonden und gegebenenfalls erfolgender In-situ-Amplifikation der zu untersuchenden Nucleotidsequenzen eine Hybridisierung in situ stattfindet. Im Vorfeld der In-situ-Hybridisierung wird üblicherweise zunächst das Gewebe fixiert, eingebettet, ein Schnitt hergestellt, die Zielnucleinsäure demaskiert, gegebenenfalls ein DNAse oder RNAse-Verdau durchgeführt und gegebenenfalls die Zielnucleinsäure und die Probe denaturiert. Anschließend kann dann die eigentliche Hybridisierung mit der markierten Sonde stattfinden.
Ein besonders bedeutsamer Anwendungsbereich der In-situ-Hybridisierung ist die Untersuchung von mit dem menschlichen oder tierischen Immunsystem zusammenhängenden Vorgängen. Für die Durchführung der ISH ist die Kenntnis der Sequenz der nachzuweisenden DNA oder RNA notwendig. Die Nucleotidsequenzen der Ig-λ-leichte Ketten-Gene sind aus Hieter et al. (Nature 294 (1981), 536-540) und die der κ-leichte Ketten-Gene aus Hieter et al. (Cell 22 (1980), 197-207) bekannt. Sowohl diagnostische als auch therapeutische Verfahren, im Rahmen derer Qualität und Quantität einer Ig-basierten Immunantwort analysiert werden müssen, sind bekannt.
So ist beispielsweise aus Takahashi et al. (J. Oral. Pathol. Med. 1996 (25) 331-335) bekannt, die Immunglobulin (Ig) λ und κ leichten Ketten mRNA mittels In-situ-Hybridisierung (ISH) als Hinweis auf eine Immunreaktion im Rahmen einer Zahnerkrankung nachzuweisen. Unter Einsatz Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC)-markierter λ- und κ-leichte Ketten-Oligonucleotidgemische sowie Anti-FITC- Antikörper, die mit alkalischer Phosphatase konjugiert worden waren, wurden λ- und κ-leichte Ketten-mRNA in verschiedenen Schnitten nachgewiesen. Auch Pringle et al. (J. of Pathology 162 (1990), 197-207) beschreibt eine ISH von Ig leichte Ketten mRNA unter Verwendung von Gemischen von markierten Oligonucleotiden. Die beschriebenen Verfahren erweisen sich jedoch insofern als nachteilig, als dass einerseits die Hybridisierungszeit vergleichsweise lang, andererseits auch die erhaltene Sensitivität verbesserungsfähig sind.
Aus der DE 42 16 949 C2 und der WO 93/24652 sind Verfahren zur Hybridisierung von spezifischen Proben in situ bekannt, wobei Hybridisierungspuffer eingesetzt werden, die keine oder wenig denaturierende Agentien enthalten. Formamid-haltige Hybridisierungspuffer sind für den Einsatz in ISH zum Beispiel aus Rüger et al. (Biochemica 3 (1995), 27-29) bekannt. Diesen Puffern haftet jedoch der Nachteil an, gesundheits- und umweltgefährdend zu sein. Überdies sind sie aus einer Vielzahl von verschiedenen Komponenten aufgebaut und vergleichsweise teuer. Die vorgenannten Druckschriften betreffen auch nicht die In-situ-Hybridisierung von Ig-λ- und κ-leichte Ketten-Nucleotidsequenzen.
Die US 6 194 146 B1 und WO 9919511 A1 offenbaren Hybridisierungspuffer auf Carbinol-Basis mit oder ohne Dextran, die Formamid-frei sind. Es werden auch In-situ-Fluoreszenz-Hybridisierungsverfahren unter Verwendung dieser Puffer beschrieben. Auch die DE 691 24 522 T2 beschreibt ein In-situ-Fluoreszenz-Hybridisierungsverfahren, das gegebenenfalls ohne Denaturierungsmittel (speziell Formamid) durchgeführt werden kann.
Chemical Abstracts Vol 119 (1993) 87478 und Chemical Abstracts Vol 115 (1990) 43413 beschreiben In-situ-Hybridisierungsverfahren zum Nachweis der mRNA der konstanten Region der Ig leichten Kette bzw. der Ig kappa oder lambda leichten Kette. Formamid-freie Puffer sind nicht erwähnt.
Die DE 43 22 884 A1 offenbart unter anderem eine 3'Endmarkierung von Oligonukleotiden mit markierten dNTPS unter Verwendung von terminaler Transferase. Die DGENE-Datenbank-Auszüge AN AAX06954, AAV69020, AAV24257, AAQ48064, AAQ45511 und AAQ48064 offenbaren Sequenzen, die als einen Teil derselben die hierin beschriebenen SEQ ID Nr. 1, 2, 5, 6, 8 und 9 umfassen.
Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem bestand also darin, eine In-situ-Hybridisierungstechnik zu entwickeln, die in automatisierbarer, schneller und hochsensitiver Weise den Nachweis von Immunglobulin λ- und κ-leichte Ketten-Nucleotidsequenzen ermöglicht, wobei gleichzeitig unter Einsatz preisgünstiger, umwelt- und gesundheitsverträglicher Mittel eine Reduzierung der Hintergrundaktivität soweit wie möglich erreicht werden soll.
Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrunde liegende technische Problem durch die Bereitstellung eines Verfahrens gemäß Anspruch 4 für die Durchführung von In-situ-Hybridisierungen von mindestens einem markierten Oligonucleotid mit nachzuweisenden Nucleotidsequenzen in Zielobjekten, wobei das mindestens eine markierte Oligonucleotid in situ unter Zusatz eines formamidfreien Hybridisierungspuffers mit den Nucleotidsequenzen in Kontakt gebracht und hybridisierende Nucleotidsequenzen im Zielobjekt nachgewiesen werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter Zielobjekten jedwede Art von Objekten verstanden, die Nucleotidsequenzen enthalten oder aus diesen bestehen. Dies sind insbesondere biologische Materialien wie Zellen, Gewebe, Gewebeschnitte, Zellorganelle, Nucleotidsequenz-haltige Partikel wie Viren oder Liposomen, menschliche, tierische oder pflanzliche Chromosomen, menschliche, tierische oder pflanzliche extrachromosomale Strukturen, ebenso wie chromosomale oder extrachromosomale Strukturen in Procaryoten oder ähnliches. Die Zielobjekte können lebend oder tot, vorbehandelt oder unbehandelt sein. Die in ihnen enthaltenden nachzuweisenden Nucleotidsequenzen können im Zielobjekt oder an andere Strukturen gebunden vorliegen. Sie können auch in amplifizierter Form vorliegen. Überdies können die Nucleotidsequenzen einzel- oder doppelsträngig sowie gegebenenfalls mehrfachsträngig im Zielobjekt vorliegen.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter nachzuweisenden Nucleotidsequenzen pro- oder eucaryotische Nucleotidsequenzen von einige wenige bis viele hundert oder tausend Nucleotide enthaltende Nucleotidsequenzen verstanden, beispielsweise Genabschnitte, Gene, Plasmide, Nucleotidsequenzen in Chromosomen oder Chromosomenfragmente etc. Die Nucleotidsequenz kann als RNA- oder DNA-Sequenz vorliegen. Sie kann einzel-, doppel- oder mehrfachsträngig sein. Erfindungsgemäß ist es daher nicht zwingend notwendig, doppelsträngig in situ vorhandene nachzuweisende Nucleotidsequenzen vor der ISH in die einzelsträngige Form zu überführen. Erfindungsgemäß kann vielmehr die Bildung von Tripel-Formationen, das heißt aus drei Nucleinsäuresträngen gebildete Formationen vorgesehen sein. Die Erfindung erfasst natürlich auch die Hybridisierung mit einzelsträngigen Abschnitten, die in nativer DNA bereichsweise vorliegen kann.
Ebenfalls beschrieben werden speziell entwickelte markierte und z.B. für den Einsatz im vorgenannten ISH-Verfahren besonders geeignete Oligonucleotide oder Gemische davon sowohl für die Hybridisierung mit Immunglobulin-λ als auch mit Immunglobulin-κ-leichte Ketten-Nucleotidsequenzen. Selbstverständlich sind diese Oligonucleotide auch für andere Zwecke, z.B. andere ISH-Verfahren oder In-situ-Amplifikationen geeignet.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Immunglobulin-λ-leichte Ketten-Oligonucleotid ausgewählt aus der Gruppe der Sequenzen bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis 6. Auch beschrieben wird ein Gemisch aus verschiedenen, zum Beispiel zwei, drei, vier, fünf oder sechs der genannten Oligonuc leotide, und für den Einsatz im vorgenannten ISH-Verfahren besonders geeignet, insbesondere ein Gemisch aus SEQ ID Nr. 2, 3 und 6.
Bevorzugt ist die Nucleotidsequenz des κ-leichte Ketten Oligonucleotids ausgewählt aus der Gruppe der Sequenzen, bestehend aus SEQ ID Nr. 7 bis 10. Ebenfalls beschrieben wird ein Gemisch aus verschiedenen, zum Beispiel zwei, drei oder vier der genannten Oligonucleotide, insbesondere aller vier Oligonucleotide (SEQ ID Nr. 7, 8, 9 und 10).
Diese λ- und κ-Oligonucleotide sind hochsensitiv, hochspezifisch und entsprechen jeweils der konstanten Region der menschlichen λ- und κ-Gene. Die Oligonucleotide können als einzelne Oligonucleotide zum Beispiel in dem erfindungsgemäßen Verfahren oder als Gemisch aus zum Beispiel drei, insbesondere SEQ Nr. 2, 3, 6 für die λ-beziehungsweise vier, insbesondere SEQ Nr. 7, 8, 9 und 10 für die κ Ig-leichte Ketten-Nucleotidsequenz-Detektion eingesetzt werden. Die Oligonucleotide beziehungsweise deren Gemische zeichnen sich auch dadurch aus, dass die bei einer herkömmlichen ISH auftretende Hintergrundfärbung weitgehend bis ganz vermieden werden kann. Die Einzeloligonucleotide weisen eine über fünfzig- bis hundertfach höhere Sensitivität auf, als Sonden des Standes der Technik. Die Oligonucleotide können als Sinn- oder Antisinn-Oligonucleotide ausgeführt sein.
Die Verwendung der vorgenannten, insbesondere als Antisinn-Oligonucleotide ausgeführten, Oligonucleotidsonden in Form eines Gemisches führt bei glei cher Endkonzentration wie für ein einzelnes Oligonucleotid zu einer zusätzlichen Erhöhung der Sensitivität um den Faktor 2 bis 5.
Ebenfalls beschrieben werden die vorgenannten Oligonucleotide und deren Verwendung in dem vorgenannten In-situ-Hybridisierungsverfahren, wobei die Oligonucleotide markiert sind, beispielsweise mit einer radioaktiven oder chemilumineszenten Markierung. So kann beispielsweise vorgesehen sein, die Oligonucleotide mit Isotopen zu markieren, insbesondere Radioisotopen. Es wird jedoch die Markierung mit Enzymen, Antikörpern, Fluorochromen, Fluorogenen, Photoaffinitäts- oder Spinlabeln bevorzugt. Insbesondere werden die Oligonucleotide mit Biotin, FITC oder DIG (Digoxigenin) markiert. Es ist dabei in einer besonders bevorzugten Ausführungsform vorgesehen, die Oligonucleotide an ihrem 3'- oder 5'-Ende zu markieren. Bevorzugt wird eine 3'-Endmarkierung, wobei in einer bevorzugten Ausführungsform das molare Verhältnis von markiertem Nucleotid dNTP zu unmarkiertem dNTP 1:1 beträgt.
Die Erfindung betrifft auch einen Hybridisierungspuffer sowie dessen Verwendung in einem Hybridisierungsverfahren, z.B. dem vorgenannten In-situ-Hybridisierungsverfahren, wobei dieser Hybridisierungspuffer aus 10 Gew.-% Dextransulfat, 0,2 Gew.-% Lauroylsarcosin, 0,1 bis 0,8 M NaCl und 0,01 bis 0,8 M Na₃-Citrat in Wasser besteht. Der erfindungsgemäße Puffer weist in Wasser also nur 4 Komponenten auf und enthält keine denaturierenden Agentien wie Formamid, aber auch keine RNA, DNA oder sonstige Zusätze.
In besonders bevorzugter Ausführungsform beträgt der NaCl-Gehalt 0,3 bis 0,6 M, insbesondere 0,6 M.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt der Na₃-Citrat-Gehalt 0,03 bis 0,06 M, insbesondere 0,06 M.
Der erfindungsgemäße Hybridisierungspuffer ist also Formamid-frei und weist keine anderen als die vorgenannten Komponenten auf. Er ist daher in besonders vorteilhafter Weise einfach und kostengünstig herzustellen, da er aus insgesamt lediglich fünf Komponenten aufgebaut ist. Der Hybridisierungspuffer ist insbesondere auch aufgrund des Fehlens von Formamid giftfrei, nicht fruchtschädigend und daher ohne besondere Vorsichtsmaßnahmen einsetzbar. Der Hybridisierungspuffer ermöglicht in besonders vorteilhafter Weise eine hochspezifische, Hintergrundfreie Hybridisierung.
Weiter beschrieben wird ein Verfahren zum Markieren von Oligonucleotiden, insbesondere an deren 3'-Ende, wobei mindestens ein zu markierendes Oligonucleotid in einem Reaktionspuffer und H₂O nach Zugabe eines molaren 1:1-Verhältnisses von markiertem dNTP zu unmarkiertem dNTP mit einer terminalen Transferase inkubiert wird und eine Anheftung einer endständigen markierten Nucleotidsequenz erzielt wird. Insbesondere ist dabei vorgesehen, dass das markierte und unmarkierte dNTP dATP, dCTP, dGTP, dUTP oder dTTP ist.
Bevorzugt wird ein molares 1:1-Verhältnis von markiertem dUTP zu unmarkiertem dATP eingesetzt. Weiter bevorzugt wird ein molares 1:1-Verhältnis von markiertem dATP zu unmarkiertem dATP eingesetzt. Die Markierung kann, wie vorstehend ausgeführt, eine üblicherweise verwendete Markierung sein, insbesondere eine Biotin-, FITC- oder DIG-Markierung. Das molare Verhältnis von 1:1 bei der terminalen Markierungsreaktion weicht um eine 10er Potenz von dem üblicherweise eingesetzten Markierungsverhältnis ab (üblicherweise wird ein Verhältnis 1:10 von markiertem zu unmarkiertem dNTP eingesetzt, vgl. z.B. Boehringer Mannheim Markierungskit; Best.-Nr. 1417231). Das bei der Markierungsreaktion vorgesehene molare 1:1-Verhältnis führt, insbesondere bei Einsatz des erfindungsgemäßen Hybridisierungspuffers, insbesondere in dem erfindungsgemäßen In-situ-Hybridisierungsverfahren, zu einer besonders hohen Sensitivität und niedrigen Hintergrundfärbung beim Nachweis der zu testenden Nucleotidsequenzen. Es konnte eine drastische Erhöhung der Sondensensitivität und eine besonders signifikante Reduzierung der bei üblichen Markierungsreaktionen auftretenden Hintergrundfärbungen bewirkt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung wird das Verfahren zur 3'-Markierung von Oligonucleotiden bei einer Temperatur von 30 bis 40°C, insbesondere 37°C, besonders bevorzugt für eine Zeitdauer von 10 bis 60 Minuten, insbesondere 30 Minuten, durchgeführt.
Es ist vorgesehen, dem Reaktionspuffer Co²⁺, beispielsweise in Form von CoCl₂ zuzuführen. besonders bevorzugt werden dem Reaktionspuffer 0,5 bis 5, insbesondere 1 mM CoCl₂ zugesetzt.
Die mittels der vorgenannten Mittel und Verfahrensweisen ermöglichte erfindungsgemäße In-situ-Hybridisierung zeichnet sich durch eine besonders rasche Verfahrensdurchführung von zum Beispiel nur 3,5 Stunden für den gesamten Prozess, eine besonders schonende Behandlung der Zielobjekte beziehungsweise nachzuweisenden Nucleotidsequenzen aufgrund des Fehlens denaturierender chemischer Agenzien, eine aufgrund der Abwesenheit toxischer Bestandteile gute Handhabbarkeit und vor allen Dingen extrem hohe Sensitivität bei geringer oder gar nicht vorhandener Hintergrundfärbung aus. Die erfindungsgemäße Vorgehensweise ermöglicht insbesondere die Detektierung nachzuweisender Nucleinsäuren mittels automatisierter Systeme sowie auch eine Auswertung mittels automatisierter Bildanalysesysteme und gewährt in einfacher, kostengünstiger und schneller Weise die Analyse auch größerer Mengen an Material. Die erfindungsgemäße Verfahrensweise ist daher insbesondere für High-Throughput-Verfahren geeignet.
Die Erfindung sieht selbstverständlich auch vor, dass die Zielobjekte vor der Hybridisierung einer Vorbehandlung unterzogen werden.
Eine derartige Vorbehandlung kann beispielsweise eine Fixierung, Einbettung, Schnittherstellung, De maskierung der Zielnucleinsäure, DNAse-Verdau, RNAse-Verdau und/oder Denaturierung sein.
So kann erfindungsgemäß beispielsweise eine Aldehydfixierung oder eine Alkohol-Säure-Fixierung vorgesehen sein. Die Fixierung kann insbesondere in Formalin stattfinden. Erfindungsgemäß kann weiterhin vorgesehen sein, die fixierten Zielobjekte in zum Beispiel Paraffin einzubetten.
Die gegebenenfalls fixierten und eingebetteten Zielobjekte können dann auf gegebenenfalls ebenfalls vorbehandelte Objektträger, beispielsweise erhitzte, gewaschene und getrocknete Objektträger aufgezogen und dann deparaffinisiert werden. Die Objektträger können gegebenenfalls mit zum Beispiel Aminopropyltriethoxisilan-TESPA vorbehandelt sein.
Die erfindungsgemäß gegebenenfalls vorgesehene Fixierung kann zu einer Vernetzung zwischen Proteinen und zwischen Nucleinsäuren und Proteinen führen. Um die nachzuweisende Nucleinsäure den Oligonucleotidsonden zugänglich zu machen, ist es daher vorteilhaft, eine limitierte Proteolyse zum Beispiel mit Pepsin, Proteinase K oder Pronase durchzuführen.
Erfindungsgemäß kann gegebenenfalls zur Erhöhung der Spezifität eines DNA- oder RNA-Nachweises insbesondere in komplexeren Systemen ein DNAse- oder RNAse-Verdau vorgesehen sein.
Obgleich erfindungsgemäß eine Denaturierung von nachzuweisenden Nucleotidsequenzen und erfindungsgemäßen, vorzugsweise einzelsträngig vorliegenden, Oligonucleotidsonden nicht notwendig ist, kann die se jedoch gegebenenfalls durchgeführt werden, wobei die nachzuweisende Nucleotidsequenz und/oder Oligonucleotidsonde, zum Beispiel durch Erhitzen auf 75°C bis 95°C, denaturiert werden.
Erfindungsgemäß kann auch vorgesehen sein, die nachzuweisenden Nucleotidsequenzen und/oder die erfindungsgemäßen Oligonucleotide vor der In-situ-Hybridisierung zu amplifizieren, zum Beispiel mittels PCR.
Die erfindungsgemäße Hybridisierung kann über einen Zeitraum von 0,5 bis 2 Stunden stattfinden. Bevorzugt wird ein Zeitraum von einer Stunde. Die Hybridisierung findet in einer bevorzugten Ausführungsform bei 45°C bis 60°C, insbesondere 55°C statt. Selbstverständlich ist es möglich, dass nach der Hybridisierung mindestens ein Waschschritt durchgeführt wird. In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung wird nach dem gegebenenfalls erfolgten Waschschritt oder direkt nach der Hybridisierung ein Nachweisschritt bei 30 bis 37°C durchgeführt.
Das erfindungsgemäße In-situ-Hybridisierungsverfahren kann beispielsweise bei der Diagnose von Erkrankungen des menschlichen oder tierischen Körpers eingesetzt werden, beispielsweise bei allergischen Erkrankungen, Autoimmunkrankheiten sowie onkogenen Erkrankungen. Selbstverständlich kann die erfindungsgemäße Verfahrensweise auch im Rahmen der Grundlagen- oder angewandten Forschung eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Testkit zur Durchführung des vorgenannten In-situ-Hybridisierungsverfahrens gemäß Anspruch 17, umfassend mindestens ein Gefäß, das mindestens eins der vorgenannten Oligonucleotide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis 10, vorzugsweise markiert, gegebenenfalls auch amplifiziert enthält und/oder mindestens ein Gefäß enthaltend einen erfindungsgemäßen Hybridisierungspuffer, und/oder gegebenenfalls mindestens ein Gefäß enthaltend Waschlösungen. Es ist vorteilhafterweise vorgesehen, in dem Kit markierte Oligonucleotide einzusetzen. Es ist bevorzugt, in dem Kit weitere Komponenten, z.B. Antikörper vorzusehen.
Ebenfalls bereitgestellt wird ein Kit zur Markierung von Oligonucleotiden umfassend mindestens ein Gefäß enthaltend eine terminale Transferase und/oder ein Gefäß enthaltend einen Reaktionspuffer und gegebenenfalls CoCl₂-Lösung, gegebenenfalls ein Gefäß enthaltend Kontrolloligonucleotid (unmarkiert), ein Gefäß enthaltend gegebenenfalls ein weiteres Kontrolloligonucleodit mit Markierung gegebenenfalls ein Gefäß enthaltend eine Kontroll-Nucleotidsequenz sowie entweder getrennt in einzelnen Gefäßen oder bereits gemischt in einem Gefäß ein markiertes dNTP und ein unmarkiertes dNTP im molaren 1:1 Verhältnis, z.B. unmarkiertes dATP und markiertes dUTP.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Die Erfindung wird anhand der Beispiele, der dazugehörigen Zeichnungen und Sequenzprotokolle näher erläutert.
Das Sequenzprotokoll erfasst die in SEQ ID Nr. 1 bis 10 dargestellten Nucleotidsequenzen, wobei SEQ ID Nr. 1 bis 6 Antisenseoligonucleotide darstellen, die dem Nachweis der mRNA der Ig-λ-leichten Kette und die SEQ ID Nr. 7 bis 10 dem Nachweis der mRNA der Ig-κ-leichten Kette dienen.
Die Figuren zeigen in photografischer (1 bis 7) und grafischer (8 und 9) Darstellung:
1 eine ISH (In-situ-Hybridisierung) eines Gemisches sechs verschiedener Oligonucleotide mit SEQ ID Nr. 1 bis 6 in erfindungsgemäßem Hybridisierungspuffer auf humaner Tonsille, wobei die Oligonucleotide mittels des hierin beschriebenen Verfahrens markiert (Biotin-markiert) wurden,
2 die Darstellung einer ISH mit den Oligonucleotiden und dem Hybridisierungspuffer gemäß 1 auf humaner Tonsille, wobei zur Markierung der Oligonucleotide eine übliche Markierungsreaktion (FITC-markiert) eingesetzt wurde,
3 eine ISH auf humaner Tonsille unter Verwendung eines Gemisches von sechs Oligonucleotiden mit den SEQ ID Nr. 1 bis 6 in erfindungsgemäßem Hybridisierungspuffer und unter Verwendung der hierin beschrie benen Markierungsreaktion FITC-markiert (vergleiche 1),
4 eine ISH auf humaner Tonsille unter Verwendung eines λ-Oligonucleotid-Gemisches (FITC-markiert) des Standes der Technik,
5 eine ISH auf humaner Tonsille unter Verwendung eines λ-Oligonucleotid-Gemisches (DIG-markiert) gemäß eines anderen Standes der Technik,
6 eine ISH auf humaner Tonsille unter Verwendung eines Gemisches von sechs Oligonucleotiden mit den Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 1 bis 6, wobei die Oligonucleotide wie hierin beschrieben markiert (Biotin-markiert) und ein Hybridisierungspuffer gemäß des Standes der Technik (50 % Formamid enthaltend) eingesetzt wurde,
7 eine ISH gemäß den Bedingungen der 6 (Biotin-markiert), wobei jedoch anstelle des Hybridisierungspuffers des Standes der Technik ein erfindungsgemäßer Hybridisierungspuffer verwendet wurde,
8 eine grafische Darstellung der Hybridisierungssignalintensität und der im Gewebe auftretenden Hintergrundfärbung einer im Verhältnis 1:10 markierten κ9-Sonde (SEQ ID Nr. 10) gemäß des Standes der Technik und
9 eine grafische Darstellung der Hybridisierungssignalintensität und der im Gewebe auftretenden Hintergrundfärbung einer wie hierin beschrieben markierten κ9- Sonde (SEQ ID Nr. 10).
Beispiel
Nachweis der mRNA der λ-leichten-Kette in humanen Tonsillen-Gewebe mittels ISH
I. Markierung der Oligonucleotide
Materialien
5-facher Reaktionspuffer für die terminale Desoxynucleotidyltransferase (MBI Fermentas): 1M Cacodylat, pH 7,2, 0,5 mM DTT, 0,05 % Triton-X-100
Terminale Transferase (MBI Fermentas): 25 U/μl
Verfahren:
A) Markierung
Es wird ein 20 μl Reaktionsgemisch hergestellt aus:
4 μl Reaktionspuffer (5×)
1 μl Oligonucleotid (Antisinn) (1 μg/μl) (beziehungsweise Gemisch der Oligonucleotide)
1 μl dATP (1mM)
1 μl dUTP (FITC/BIOTIN/DIGOXIGENIN) (1 mM)
1 μl Terminale Transferase (25 U/μl)
1 μl CoCl₂ (20mM)
11 μl aqua dest.
Die Komponenten werden gemischt und bei 37°C (Wasserbad) für 30 Minuten inkubiert.
B) Präzipitation
Dem Reaktionsgemisch wird in Eppendorf-Röhrchen auf Eis 2 μl Glycogen/EDTA (200 μl EDTA 0,2 M, pH 8 + 1 μl Glycogen 20 μg/μl) zugegeben, 2,5 μl LiCl (4M) und 75 μl Ethanol (100 %, auf Eis) hinzugegeben und gemischt sowie anschließend über Nacht bei –20°C ausgefällt.
C) Rekonstitution
Es wird bei 13000 rpm für 30 Minuten zentrifugiert, der Überstand abgenommen, das Pellet 1 × mit Ethanol (70 %, 4°C) gewaschen, 30 bis 45 Minuten bei Raumtemperatur (RT) luftgetrocknet und in 20 μl aqua dest. aufgenommen. Die markierten Oligonucleotide werden bei –20°C gelagert.
II. Herstellung des Hybridisierungspuffers
Der erfindungsgemäße Hybridisierungspuffer besteht aus:
4 × SSC (0,6 M Natriumclorid und 0,06 M Trinatrium-Citrat), 10 Gew.-% Dextransulfat und 0,2 Gew.-% Lauroylsarkosin in aqua dest. Der Puffer enthält keine weiteren Komponenten und ist daher Formamid-frei.
Als Vergleichspuffer wurde ein Standardhybridisierungspuffer hergestellt, der wie folgt zusammengesetzt war:
45 Gew.-% Formamid, 3,6 × SSC, 7,5 Gew.-% Dextransulfat, 4,5 × Denhardt's Lösung, 1,8 Gew.-% SDS und 0,4 mg/ml Hefe-t-RNA
(20 × SSC: 3 M NaCl, 0,3 M Trinatriumcitrat) (50 × Denhardt's Lösung: 1 Gew.-% Rinderserumalbumin, 1 Gew.-% Polyvinyl-Pyrrolidon, 1 Gew.-% Ficoll-400)
Weitere nicht unmittelbar bei der Hybridisierung aber im Rahmen des vorliegenden Beispiels verwendete Puffer wiesen folgende Zusammensetzung auf:
TBST: 0,1 M Tris/HCl, 0,1 M NaCL, 0,05 % Tween-20, pH 7,5
Blockierungs-Puffer: 1 % Blockierungsreagenz (Roche) in 0,1 M Maleinsäure, 0,15 M NaCl, pH 7,5
AP-Puffer: 0,1 M NaCl, 0,1 M Tris/HCl, pH 9,5
NBT (Roche): 100 mg/ml in 70 % Dimethylformamid
BCIP (Roche): 50 mg/ml in Dimethylformamid
III. Fixierung, Einbettung und Schnittherstellung
Menschliches Tonsillen-Gewebe wurde in NBF (neutralem gepufferten Formalin) fixiert und in Paraffin eingebettet. Nach der Paraffineinbettung wurden 2 μm dicke Gewebe-Schnitte zur Gewährleistung besserer Haftung auf TESPA- (Aminopropyltriethoxisilan-TESPA) beschichtete Objektträger aufgezogen. Zur Entparaffinierung wurden die mit dem Gewebe versehenen Objektträger auf 70°C für 15 Minuten erwärmt und zweimal jeweils 10 Minuten in Xylol und anschließend einmal für 5 Minuten in Ethanol gewaschen sowie anschließend luftgetrocknet.
IV. Demaskierung der Ziel-Nucleinsäure
Um die nachzuweisende Nucleinsäure den Oligonucleotiden zugänglich zu machen, wurde anschließend eine limitierte Proteolyse durchgeführt, indem die Objektträger in 0,1 %igem Pepsin in 0,1 M HCl bei 37°C für 2 bis 20 Minuten inkubiert wurden. Anschließend wurden die Objektträger zehn Sekunden in Ethanol gewaschen und luftgetrocknet. Es wurde weder ein DNAse- oder RNAse-Verdau noch eine Denaturierung von Zielnucleinsäuren und/oder Proben durchgeführt.
V. Hybridisierung
Ein gemäß I. hergestelltes Sondengemisch aus Biotin-markierten λ-leichte Ketten-Oligonucleotiden der Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 1 bis 6, das heißt ein sechs verschiedene Oligonucleotide enthaltendes Oligonucleotidgemisch, wurde in einer Menge von 15 μl pro Sektion (0,1 ng/μl Gesamtsondenkonzentrati on) in Standardhybridisierungspuffer (vergleiche 6) oder erfindungsgemäßem Hybridisierungspuffer (auch als LSD-Puffer bezeichnet) (vergleiche 1, 3 und 7) und auf die Gewebebeschnitte aufgebracht. Anschließend wurde ein Deckgläschen aufgelegt und mit Klebematerial abgedichtet. Die Hybridisierung wurde anschließend eine Stunde bei 37°C (Standardhybridisierungspuffer) oder 55°C (erfindungsgemäßer LSD-Puffer) durchgeführt. Anschließend wurde mit TBST zweimal jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur (bei Standardhybridisierungspuffer) oder einmal fünf Minuten bei 55°C und zweimal jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur (bei erfindungsgemäßem LSD-Puffer) gewaschen.
VI. Nachweis
Auf jeden Gewebeschnitt wurden 200 μl Anti-Bio(Biotin)-AP (alkalische Phosphatase konjugiert zu einem Anti-Biotin-Antikörper, DAKO) aufgebracht (verdünnt in 1:30 Blockierungspuffer). Anschließend wurde bei 34°C 30 Minuten inkubiert.
Im Anschluss an die Inkubation wurde zweimal jeweils zwei Minuten mit TBST und einmal zwei Minuten mit aqua dest. gewaschen.
Anschließend wurde auf jeden Gewebeschnitt 200 μl AP-Puffer gegeben, der NBT-BCIP-Farbsubstrate (2 μl NBT + 10 μl BCIP in 1000 μl AP-Puffer) enthielt. Anschließend wurde bei 34°C 30 Minuten inkubiert und sodann dreimal für jeweils zwei Minuten mit aqua dest. gewaschen. Die so gefärbten Schnitte wurden in Glycerol eingebettet, mit einem Deckgläschen versehen und mit Nagellack versiegelt.
VII. Ergebnisse
Die 1, 3 und 7 zeigen gemäß des vorbeschriebenen Verfahrens durchgeführte ISHs, wobei ein Oligonucleotidgemisch der Sequenzen SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5 und 6, jeweils in äquimolaren Verhältnissen zueinander, in erfindungsgemäßem LSD-Hybridisierungspuffer eingesetzt wurde, wobei die eingesetzten Oligonucleotide 3'-endmarkiert waren, wie hierin beschrieben. Es ist erkennbar, dass vorteilhafterweise keine Hintergrundfärbung und eine sehr hohe Signalstärke erreicht wird.
Im Vergleich dazu wurde wie vorstehend beschrieben vorgegangen, wobei anstelle des erfindungsgemäßen LSD-Hybridisierungspuffer ein Standard-Hybridisierungspuffer mit ca. 50 % Formamid eingesetzt wurde. Die dazugehörige 6 zeigt eine vergleichsweise schwache Signalstärke.
Ebenfalls im direkten Vergleich zu den in den 1, 3 und 7 dokumentierten Ergebnissen ist das in 2 dokumentierte Ergebnis zu sehen. Gemäß der Verfahrensweise, die zum Ergebnis nach 2 führte, wurde wie im Vorstehenden beschrieben vorgegangen, wobei jedoch anstelle der hierin beschriebenen Markierung im 1:1 molaren Verhältnis von markiertem dNTP zu unmarkiertem dNTP eine Standardmarkierung durchgeführt wurde. Diese wurde wie im Stand der Technik beschrieben (DIG Oligonucleotide-Tailing Kit, Bestell-Nr. 1417231, Boeh ringer Mannheim) durchgeführt, wobei ein 1:10 molares Verhältnis von markiertem dUTP zu unmarkiertem dATP eingesetzt wurde. Es zeigt sich eine vergleichsweise starke Hintergrundfärbung und überdies, dass die Signalstärke nicht so stark ist wie bei der Verwendung einer hierin beschriebenen Markierungsreaktion (vergleiche zum Beispiel 3).
Gemäß der in den 4 und 5 dokumentierten Ergebnisse wurde mittels bekannter λ-leichte Ketten-Oligonucleotid-Gemische (4: Firma Biogenex, USA, San Ramon, Kat.-Nr. HK856-2K, 5: Firma Kreatech, NL, Amsterdam, Kat.-Nr. PLD 182) jeweils eine ISH durchgeführt. Gemäß der Resultate von 4 wurde eine FITC-markierte Sonde und gemäß der Experimente der 5 eine DIG-markierte Sonde eingesetzt. 4 zeigt eine deutlich stärkere Hintergrundfärbung und verringerte Signalstärke als bei der erfindungsgemäßen Vorgehensweise (vergleiche zum Beispiel 3). 5 zeigt eine sehr schwache Signalstärke im Vergleich zu erfindungsgemäßen Vorgehensweise (vergleiche zum Beispiel 3). Die eingesetzten Oligonucleotide sind gemäß Herstellerangaben markiert gewesen. Die eingesetzten Hybridisierungspuffer sind üblicherweise eingesetzte Hybridisierungspuffer.
Die 8 und 9 stellen die Intensität des Hybridisierungssignals sowie der im Gewebe auftretenden Hintergrundfärbung in Abhängigkeit von der Verdünnung einer κ9-Sonde (SEQ ID Nr. 10) dar.
Die 8 zeigt, dass mittels einer Standardmarkierung unter Verwendung eines 1:10 molaren Verhältnisses von Bio-, DIG- oder FITC-markiertem dNTP (hier: dATP beziehungsweise dUTP) zu dATP eine geringere Sensitivität, das heißt Signalstärke, und eine stärkere Hintergrundfärbung erhalten wird. Dies steht im Gegensatz zu der erfindungsgemäßen Verfahrensweise, die gemäß der in 9 dargestellten Grafik bei Verwendung eines 1:1 molaren Verhältnisses von Bio-, DIG- oder FITC-markierten dNTP (hier: dATP beziehungsweise dUTP) zu dATP eine gesteigerte Sensitivität, das heißt stärkere Hybridisierungssignalintensität, und eine geringere beziehungsweise gar keine Hintergrundfärbung mit sich bringt.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Formamid-freie Pufferlösung für eine In-situ-Hybridisierung bestehend aus in Wasser gelösten 10% (Gew.-%) Dextransulfat, 0,2% (Gew.-%) Lauroylsarkosin, 0,1 bis 0,8 M NaCl und 0,01 bis 0,08 M Na₃-Citrat.
Pufferlösung nach Anspruch 1, wobei der NaCl-Gehalt 0,3 bis 0,6 M beträgt.
Pufferlösung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Na₃-Citrat-Gehalt 0,03 bis 0,06 M beträgt.
Verfahren für die Durchführung einer In-situ-Hybridisierung mindestens eines markierten Oligonucleotides mit nachzuweisenden, die leichten Ketten eines Immunglobulins codierenden Nucleotidsequenzen in Zielobjekten, wobei das mindestens eine markierte Oligonucleotid in situ unter Zusatz eines Formamid-freien Hybridisierungspuffers, der aus Wasser enthaltend 10 Gew.-% Dextransulfat, 0,2 Gew.-% Lauroylsarkosin, 0,1 bis 0,8 M NaCl und 0,01 bis 0,08 M Na₃-Citrat besteht, mit den nachzuweisenden Nucleotidsequenzen in Kontakt gebracht wird und hybridisierende Nucleotidsequenzen nachgewiesen werden.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die nachzuweisenden Nucleotidsequenzen λ- oder κ-leichte Ketten der Immunglobuline codieren.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei das mindestens eine markierte Oligonucleotid eins oder mehr als eins der Oligonucleotide mit den Sequenzen der SEQ ID Nr. 1 bis 6 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei das mindestens eine markierte Oligonucleotid eins oder mehr als eins der Oligonucleotide mit den Sequenzen der SEQ ID Nr. 7 bis 10 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei das mindestens eine markierte Oligonucleotid 3'-endmarkiert ist und wobei für die 3'-Endmarkierung ein 1:1 molares Verhältnis von markiertem dNTP zu unmarkiertem dNTP eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 8, wobei die Hybridisierung über einen Zeitraum von 0,5 bis 2 Stunden stattfindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 9, wobei die Hybridisierung über einen Zeitraum von 1 Stunde stattfindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 10, wobei die Hybridisierung bei 45°C bis 60°C stattfindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 11, wobei die Hybridisierung bei 55°C stattfindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 12, wobei nach der Hybridisierung mindestens ein Waschschritt durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 13, wobei nach dem gegebenenfalls erfolgenden Waschschritt oder direkt nach der Hybridisierung ein Nachweisschritt bei 30 bis 37°C stattfindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 14, wobei die Zielobjekte vor der Hybridisierung fixiert und eingebettet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 15, wobei die Zielobjekte vor der Hybridisierung proteolytisch behandelt werden.
Kit für die Durchführung eines In-situ-Hybridisierungsverfahren, umfassend einen Hybridisierungspuffer gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 sowie mindestens ein markiertes Oligonucleotid der SEQ ID Nr. 1 bis 10.