DE69531505T2

DE69531505T2 - Verfahren zur zellerkennung

Info

Publication number: DE69531505T2
Application number: DE69531505T
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Miyai; Tsutomu Otawara-shi NAITOH; Toshihiro Otawara-shi YONEKAWA
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 1994-12-29
Filing date: 1995-12-27
Publication date: 2004-06-17
Anticipated expiration: 2015-12-28
Also published as: ATE247176T1; EP0807689A1; DE69531505D1; EP0807689A4; US5922544A; EP0807689B1; WO1996021041A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Detektieren von in biologischen Proben erscheinenden Zellen. In Fällen von Erkrankungen des Verdauungstraktes, wie bspw. bei Geschwüren und Tumoren, wird in den Fäkalien eine Vielzahl von Zellen beobachtet. Bspw. kann bei einer Blutung in die Fäkalien die Beobachtung von Blutzellen in den Fäkalien ein Indikator von Erkrankungen im Verdauungssystem darstellen. Konkret wird eine Blutung in die Fäkalien oft in den Fällen von Geschwüren im Magen und dem Duodenum detektiert, oder bei Krebs im Verdauungstrakt, wie dem Ösophagus, Magen und Kolon. Abgesehen von regelmäßigen Blutungen, werden Blutzellen in den Fäkalien beobachtet, wenn Krankheiten wie die ulzeröse Colitis und tumoröse Nekrose eine Diapedese verursachen.
Wenn auf Kolonkrebs gescreent wird, ist es besonders wichtig, in den Fäkalien okkultes Blut zu detektieren. Bis zu einem bestimmten Grad kann Kolonkrebs in seinen Frühstadien durch Entnahme von Proben nicht invasiv gesammelter Fäkalien detektiert werden. Die diagnostische Technologie, die die Blutung in die Fäkalien als Indikator verwendet, kann außer bei dem Menschen ebenso bei anderen Tierspezies angewendet werden.
Zusätzlich zu Fäkalien wird im Allgemeinen Urin als eine biologische Probe verwendet. Das Detektieren von Zellen in Urin ist ein wichtiger Krankheitsmarker. Bspw. wird eine Infektion des Harntraktes vermutet, wenn weiße Blutzellen im Urin detektiert werden. Somit liefert die Detektion von Zellen in biologischen Proben von einem lebenden Organismus, in denen unter normalen Umständen keine Zellen detektiert werden können, wertvolle Informationen, um viele Arten von Krankheiten zu diagnostizieren.
Derzeit betrifft ein weitverbreitet verwendetes Verfahren zur Detektion von Blutungen in die Fäkalien das Indexieren von aus dem Blut stammendem Hämoglobin. Dem entsprechend ist ein Verfahren einer biochemischen Färbereaktion, bei der die Peroxidase-ähnliche Aktivität des Hämoglobins verwendet wird, und ein Verfahren zur immunologischen Detektion, bei dem ein Antikörper gegen Hämoglobin verwendet wird (Songstar et al., Cancer. 45, Seiten 1099–1102, 1980), bekannt. Obgleich das vorherige biochemische Verfahren Blut vom Verdauungstrakt detektieren kann, besteht stets die Möglichkeit eines falsch positiven Ergebnisses, denn eine ähnliche Reaktion kann mit anderen Substanzen mit Peroxidase-ähnlicher Aktivität oder tierischem Hämoglobin, das von der Nahrung stammt, bewirkt werden. Auf der anderen Seite wird das letztere immunologische Verfahren nicht durch tierisches Hämoglobin oder Substanzen mit Peroxidaseähnlicher Aktivität beeinflusst, die von der Nahrung stammen. Das immunologische Verfahren mit diesen Charakteristiken wird weitverbreitet verwendet, denn das Testen kann zu jeder Zeit durchgeführt werden, ohne die Mahlzeiten einzuschränken.
Obgleich das immunologische Verfahren zum Detektieren von fäkalem okkultem Blut hinsichtlich Spezifität und Sensitivität bislang erfolgreich war, haben sich gerade jetzt verschiedene Probleme um dieses Verfahren ergeben. Das größte Problem ist die Stabilität des Hämoglobins, während es im Verdauungstrakt ist, und dessen Stabilität während der Zeit der Konservierung oder des Transportierens der Fäkalienproben. Fäkalien enthalten verschiedene Faktoren, die signifikant die immunologische Aktivität des Hämoglobins beeinflussen. Im Falle von Blutungen in einem oberen Teil des Verdauungstraktes wird die Sensitivität der Detektion von Hämoglobin stark durch die Verdauung über Verdauungsenzyme, durch die biologische Zersetzung über Mikroorganismen oder durch die chemische Umwandlung unter sauren Bedingungen beeinflusst. Es gibt Fälle, in denen trotz Blutungen kein Hämoglobin detektiert wird, da die immunologische Aktivität des Hämoglobins auf Grund einer nicht spezifischen Adhäsion von verschiedenen Arten von festen Substanzen abgeschwächt oder verloren wurde. Deshalb können Techniken, mit denen Blutungen detektiert werden, und die Hämoglobin als einen Indikator verwenden, Blutungen in einem unteren Teil des Verdauungstraktes detektieren. Es gibt jedoch ein Stabilitätsproblem, wenn dies als Indikator von Blutungen im oberen Teil des Verdauungstraktes verwendet wird. Darüber hinaus besteht ebenfalls die Möglichkeit einer falsch negativen Detektion auf Grund unbekannter Faktoren, die nicht einfach über die obigen Ursachen erklärt werden können. An Lösungen zu diesen Problemen besteht großer Bedarf.
Ein anderes Problem mit dem immunologischen Verfahren besteht darin, Spezifität zu bewahren. Das immunologische Verfahren erreicht eine höhere Spezifität im Vergleich zu dem klassischen Verfahren, bei dem die chemische Aktivität des Hämoglobins als Indikator verwendet wird. Es erfordert ebenso strenge Bedingungen der Qualitätskontrolle für das Reagens, denn seine höhere Spezifität hängt stark von den Eigenschaften der Antikörper ab.
Wie oben erwähnt, gibt es bei dem immunologischen Verfahren noch schwierige ungelöste Probleme. Diese sind: (1) ein Übersehen von Blutungen im oberen Teil des Verdauungstraktes; (2) Stabilitätsprobleme bei der Aufbewahrung, schlechter Behandlung und dem Transportieren der Proben; und (3) Schwierigkeiten bei der Kontrolle der Reagenzien. Deshalb gibt es große Erwartungen bzgl. einer neuen Technologie, die eine höhere Spezifität als das immunologische Verfahren erreichen kann.
Andere Substanzen werden als Indikator getestet, um das Hämoglobinstabilitätsproblem zu lösen. Bspw. wurde der Trypsin-Inhibitor, α1-Anti-Trypsin (α1AT) als Indikator verwendet, um Blutungen in die Fäkalien zu detektieren: Es wurde jedoch darauf hingewiesen, dass α1AT in Fäkalien auf Grund anderer Ursachen als Blutungen detektiert werden kann. Dieser wird nicht in großem Umfang verwendet, denn es hat sich erwiesen, dass dessen Stabilität im Verdauungstrakt oder den Fäkalien geringer ist als die von Hämoglobin. Auf der anderen Seite wurden Gene als Indikator zur Analyse von Organismen verwendet. Bspw. offenbarten Kourilsky und andere ein Verfahren zur Detektion von Nukleinsäure mit einer enzymmarkierten Sonde ( US 4581333 ). Ranki offenbarte ein Sandwich-Hybridisierungsassay-Verfahren (US 4489839). Diese Techniken werden in großem Umfang verwendet, um Nukleinsäure von genetischen Zusammensetzungen zu detektieren, und sie werden auf eine Vielzahl von Proben angewendet. Es werden viele Berichte über die Detektion von sich auf Krebserkrankungen, Viren und Krankheitskeimen beziehende Gene präsentiert. Ein Bericht betrifft ein Experiment, um kanzeröse Gene in Fäkalien über die Anwendung dieser Technologie zu detektieren (Science 256; 102–05, 1992).
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, einen neuen Marker vorzuschlagen, der Zellen in Fäkalien detektieren kann. Der neue Marker als ein Gegenstand dieser Erfindung sollte Stabilität im Verdauungstrakt und Stabilität während des Transportierens aufweisen. Derzeit wird das immunologische Verfahren ausschließlich zum Screenen von Kolonkrebs verwendet, bei dem es sich um Krankheiten im unteren Verdauungstrakt handelt, wobei die Stabilität des Hämoglobins berücksichtigt wird. Diese Erfindung schlägt eine Technologie vor, die hinsichtlich der Spezifität gleich der oder besser als die gegenwärtige immunologische Detektionstechnologie ist, die Hämoglobin als Indikator für Blutung verwendet.
Zusätzlich hierzu liefert diese Erfindung eine neue Idee, von der erwartet wird, dass diese die Sensitivität verbessert, die in dem immunologischen Verfahren begrenzt ist, bei dem Hämoglobin als Indikator für Blutung verwendet wird.
Und zwar stellt diese Erfindung ein Verfahren bereit, um das Vorhandensein oder die Spur eines Vorhandenseins von aus einem Tier stammenden Zellen zu detektieren, die in verschiedenen biologischen Proben des Tieres enthalten sind, nämlich über das Detektieren von Genen, die für diese Tierspezies spezifisch sind.
Die Erfindung schlägt ein Ex-vivo-Verfahren vor, um anormale Zustände eines menschlichen Lebewesens zu diagnostizieren, die ausgewählt sind aus der Gruppe Blutung in eine Ausscheidung und Geschwüre und Krebs in dem Verdauungstrakt, gekennzeichnet durch die Schritte des Detektierens eines Zielpolynukleotids, sofern vorhanden, in einer Probe einer Ausscheidung von einem menschlichen Lebewesen, wobei das Polynukleotid die für menschliche Lebewesen spezifische und in normalen Zellen vorhandene ALU-Sequenz aufweist, mittels der Verwendung einer Gensonde, die spezifisch an das Polynukleotid hybridisieren kann, wobei die Gensonde eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die mehr als 80% Homologie zu einer der Nukleinsäuresequenzen aufweist, die als SEQ ID Nr. 1 bis 10 gelistet sind; und des Korrelierens des Vorhandenseins von detektiertem Polynukleotid mit den anormalen Zuständen.
Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung einer Gensonde in der Herstellung eines diagnostischen Reagens, um anormale Zustände eines menschlichen Lebewesens mittels des Detektierens eines Zielpolynukleotides zu diagnostizieren, das in einer biologischen Probe eines lebenden Organismus enthalten ist; das Zielpolynukleotid ist spezifisch für menschliche Lebewesen und ist in normalen Zellen vorhanden; die Gensonde weist eine Nukleinsäuresequenz auf, die mehr als 80% Homologie zu einer der als SEQ ID Nr. 1 bis 10 gelisteten Nukleinsäuresequenzen aufweist, wobei die Gensonde an das Zielpolynukleotid hybridisiert; das diagnostische Reagens weist die Gensonde, einen festen Träger, um das Zielpolynukleotid daran zu immobilisie ren, und einen Marker auf, um die Gensonde zu detektieren, wenn diese an das Zielpolynukleotid bindet.
Das Zelldetektionsverfahren der vorliegenden Erfindung ist sehr nützlich, insbesondere für dessen Anwendung zur Zelldetektion in Fäkalien. Ferner liefert diese Erfindung bei Verwendung dieses Zelldetektionsverfahrens eine Technologie, um okkultes fäkales Blut zu detektieren, und ein neues Reagens bereit, das für diese Detektionsverfahren verwendbar ist.
In dem Zelldetektionsverfahren dieser Erfindung werden als biologische Proben Fäkalien und Urin analysiert. Unter normalen Bedingungen werden in solchen biologischen Proben tierische Zellen selten beobachtet. Bei vielen Gelegenheiten zeigt das Auftauchen von Zellen des lebenden Organismus in diesen biologischen Proben einen anormalen Indikator an. Als anormaler Indikator können Zellen in den Fäkalien bspw. Blutzellen auf Grund von Blutungen oder einer Diapedese, und Gewebezellen auf Grund einer Schädigung der Gewebe des Verdauungsorgans anzeigen. Weiße Blutzellen im Urin zeigen einen anormalen Indikator an. Diese Zellen zeigen nicht nur einen anormalen Indikator an, wenn diese als in ihrer Zellstruktur erhaltene vollständige Zellen detektiert werden, sondern auch, wenn diese als Spuren von zerstörten Zellen detektiert werden. Zellstrukturen werden bspw. sehr wahrscheinlich durch die Verdauungstätigkeit in dem oberen Verdauungstrakt, wie bspw. dem Magen, zerstört.
Im Rahmen dieser Erfindung handelt es sich bei einem Hybridisierungsassay um eine erwünschte Technik, um Gene zu detektieren. Bei dem Hybridisierungsassay handelt es sich um eine Analysetechnologie, die auf der Affinität zwischen Nukleinsäuren und komplementären Sequenzen basiert. Grundsätzlich werden Nukleinsäuren in den Proben durch Denaturierung über einen Hitzeschritt in einen Einzelstrang formiert, und anschließend reagieren Sonden mit komplementären Sequenzen mit den dafür vorgesehenen Sequenzen. Die Ausbildung eines Doppelstranges belegt das Vorhandensein von Zielnukleinsäure. Durch die vorherige Fixierung von Nukleinsäuren an eine Nitrozellulosemembran (Blotting) und der Zugabe einer markierten Sonde als Reagens, kann die Ausbildung des Doppelstranges auf einfache Art und Weise durch das Überprüfen des Vorhandenseins der Markierung auf der Membran bestätigt werden. Bisher wurden verschiedene auf diesem Reaktionsprinzip basierende Analysesysteme vorgeschlagen. In der vorliegenden Erfindung wird die für die Tierspezies spezifische Gensequenz als zu detektierender Gegenstand ausgewählt, nachdem jedoch diese spezifische Sequenz ausgewählt wurde, kann jede bekannte Analysetechnologie dazu angepasst werden, die Sequenz in einer biologischen Probe zu detektieren. Gene, einschließlich DNA und RNA, sind detektierbar. Für beide Gegenstände sind verschiedene Detektionstechnologien bekannt. Es ist bevorzugt, als zu detektierenden Gegenstand DNA zu verwenden, um eine bessere Stabilität zu erreichen.
Als Ausführungsbeispiel der Analysetechnologie kann der Festphase-Sandwich-Hybridisierungsassay genannt werden. Diese Technologie erfordert zwei komplementäre Sonden für zwei auf den Genen des zu detektierenden Subjektes physisch getrennte Bereiche. Eine Sonde ist auf der festen Phase fixiert und die andere reagiert als markierte Sonde. Wenn eine Sequenz detektiert werden soll, dann hybridisieren sowohl die Festphasensonde als auch die markierte Sonde an das zu detektierende Gen und bilden eine Sandwich-Struktur aus. Da diese überlegene Techno logie kein Blotting der zu detektierenden Gene des Subjektes auf die Membran erfordert, kann eine einfache Analyse erfolgen, sofern nur das Reagens bereitgestellt wird.
Das Polymerasekettenreaktions(PCR)-Verfahren kann als eine weitere geeignete Technologie erwähnt werden, um für diese Erfindung Gene zu analysieren. Das PCR-Verfahren basiert auf dem Reaktionsprinzip, bei dem eine als Primer bezeichnete Sequenz als eine Verlängerungsstelle festgelegt wird, nach dem Synthetisieren einer Doppelstrangverlängerung ausgehend von dem Primer unter Verwendung der Einzelstrangnukleinsäure als Template, wird der Doppelstrang in einen Einzelstrang denaturiert und anschließend die Doppelstrangsynthese wiederholt.
In dieser Analysetechnologie kann die Anzahl von Nukleinsäuren logarithmisch amplifiziert werden, denn eine aus der Reaktion hervorgehende Substanz kann im nächsten Schritt als Template verwendet werden.
Wenn das PCR-Verfahren auf diese Erfindung angewendet wird, werden für die Tierspezies spezifische Gensequenzen als zu detektierendes Subjekt festgelegt, anschließend werden sowohl an dem 3'-Ende der Gensequenz als auch an dem 3'-Ende der hierzu komplementären Sequenz Primer mit komplementären Sequenzen bereitgestellt. Bei dem PCR-Verfahren amplifizieren derart gebildete Primer Gene auf spezifische Art und Weise, sofern in den Proben Zielgene vorhanden sind. Die amplifizierten Gene können nach Auftrennung des Reaktionsgemisches mittels Elektrophorese als einzelne Bande bestätigt werden. Das Vorhandensein von Amplifizierungsprodukten kann mittels des zuvor erwähnten Hybridisierungsassays detektiert werden.
Vor dem Detektieren der Gene ist es ideal, von den biologischen Proben des lebenden Organismus Gene zu extrahieren. Entsprechend des Prinzips dieser Erfindung beeinflussen verschiedenste Substanzen, die in den Fäkalien der biologischen Proben des lebenden Organismus enthalten sind, in keinster Weise die Analyseergebnisse. Fäkalien enthalten jedoch verschiedene Arten von Substanzen wie Bakterien der Darmmikroben und Speisereste. Es ist wünschendwert, die Fäkalien wegen der Unannehmlichkeit bei deren Handhabung unter sanitären Gegebenheiten zu handhaben. Nachdem die Fäkalien in geeigneten Pufferlösungen dispergiert wurden, um diese zu suspendieren, oder nachdem diese mit inaktiven Filtern filtriert wurden, die nicht an genetische Zusammensetzungen adhärieren, oder wenn der Überstand mittels Zentrifugation abgetrennt wird, können sie leicht als Analyseprobe verwendet werden.
Es ist zweckmäßig, einen gegenwärtig vertriebenen Behälter für Fäkalienproben zu verwenden. Eine Reihe von Arbeitsschritten, wie die quantitative Sammlung von Fäkalien, die Suspension in eine Pufferlösung und die Filtrierung, können in dem gleichen Behälter durchgeführt werden. Der Behälter. für die Fäkalienproben wird gegenwärtig zum Transport der Proben zur immunologischen Detektion von Hämoglobin verwendet, da dieser dem Transport standhält ( US 5149506 , US 5246669 und US 5514341 ). Diese Arten von Behältern können im Rahmen dieser Erfindung ohne jegliche Modifizierung verwendet werden. Sofern Bedenken bestehen, dass eine Adhäsion von Genen an die Filter die Sensitivität der Detektion beeinflussen könnte, können die Filter zuvor mit inaktiven Genen behandelt werden. Im Allgemeinen wird für diese Zwecke DNA aus Lachsspermien verwendet.
Der Transport der Fäkalienprobe in flüssiger Form ist nicht immer erforderlich. Bspw. kann ein getrockneter Filterpapier-Fäkalienabstrich unter trockenen Bedingungen transportiert werden. In diesem Fall ist es erforderlich, vor der Analyse Genelemente von den Filtern zu extrahieren und zu dispergieren. Die Extraktion von Genelementen kann unter Verwendung einer Mikrowellenbehandlung und anderer Verfahren akkurat und schnell erfolgen.
Es empfiehlt sich, eine Vielzahl von Konservierungsstoffen zu verwenden, um die Gene in den Fäkalien zu schützen, denn diese können während der Aufbewahrung durch Mikroorganismen und Verdauungsenzyme beschädigt werden. Gute Beispiele für effektive Konservierungsstoffe sind Inhibitoren für nukleinsäureabbauende Enzymaktivität, wie Bspw. Nuclease, denn Gene sind Analysesubstanzen. Als Inhibitoren sind besonders verschiedene Proteasen, proteindenaturierende Mittel und Actin nützlich.
Wirksame Konservierungsstoffe sind chelierende Agenzien, wie bspw. EDTA und EGTA, denn die Nuclease (DNase) benötigt im Aktivierungsprozess bivalente Ionen, wie bspw. Ca²⁺ und Mg²⁺. Die Koexistenz von nicht im Zusammenhang stehenden Nukleinsäuren (bspw. Lachsspermien-DNA) ist sehr wirksam, um Nukleinsäuren zu schützen, denn die nicht im Zusammenhang stehenden Nukleinsäuren verursachen keine unspezifische Reaktion. Neben Konservierungsstoffen ist eine Hitzebehandlung der Proben bei 80 bis 100°C für etwa fünf Minuten ein wirksames Verfahren, um die stabile Aufbewahrung zu erhalten.
Sofern es Bedenken über negative Auswirkungen der Aufbewahrung auf die Gendetektion gibt, sind die Konservierungsstof fe zu extrahieren, abzutrennen oder zu neutralisieren, um deren negative Auswirkungen vor der Durchführung der Detektion zu verhindern. Bspw. wird die Möglichkeit, dass eine Kontamination von zugegebener Protease in das Analysesystem das Nukleinsäureamplifizierungsenzym oder Markierungsenzym beeinflussen könnte, nicht übersehen. In solchen Fällen ist es ratsam, Proteaseinhibitoren hinzuzugeben, oder einen Hitzevorgang zur Inaktivierung durchzuführen.
Gelegentlich ist es erforderlich, eine Zelle zur Detektion von in der Zelle enthaltenen Genen aufzubrechen. Es ist möglich, dass die Gene ohne ein Aufbrechen der Zellen nicht vollständig detektiert werden, wenn die Zellstruktur auf Grund von Blutungen in dem unteren Verdauungstrakt noch erhalten ist. Es gibt verschiedene bekannte Verfahren, um Gene aus Zellen zu extrahieren. Diese bekannten Genextraktionstechniken sind auf diese Erfindung anzuwenden. Bspw. ist eine Kombination von Proteinase K und Natriumdodecylsulfat (SDS) ein übliches Verfahren, um Gene zu extrahieren. Eine Erwärmung bei 100°C für ungefähr fünf Minuten ermöglicht eine Genextraktion ohne enzymatische Behandlung.
Bei dem oben Genannten, wenn Blut vom oberen Verdauungstrakt das alleinige Detektionssubjekt ist, ist ein Verfahren zum Aufbrechen der Blutzellen nicht erforderlich, da die Wahrscheinlichkeit von übrig gebliebenen Zellstrukturen gering ist. Durch Ausnutzung dieses Merkmals entsprechend dem Zelldetektionsverfahren der vorliegenden Erfindung kann die Identifizierung der Blutungsstelle als vorausgesetzt erwartet werden.
Das Gendetektionsverfahren der vorliegenden Erfindung kann durch das folgende Verfahren der Reihe nach detailliert erläutert werden, z. B.:
(1) Probenbehandlung
Dieses Verfahren ist zur Ausbildung von einzelsträngigen Genen durch Extrahieren von Genen mit oder ohne Aufbrechen von menschlichen Zellen, die in biologischen Proben, wie bspw. Fäkalien, enthalten sind, gefolgt von Hitzedenaturierung der Gene.
(2) Hybridisierung
Dieses Verfahren ist für die Hybridisierung der so erhaltenen einzelsträngigen Gene und im voraus hergestellten Gensonden.
(3) Detektion
Die Menge der Zielgene wird entweder durch die Bestimmung der Menge von hybridisierten Gensonden oder von nicht hybridisierten Gensonden abgeschätzt, nachdem diese abgetrennt wurden.
Es sind viele Variationen des Hybridisierungsassays bekannt und können in die vorliegende Erfindung übernommen werden. Für die PCR können die in Schritt (1) erhaltenen einzelsträngigen Gene als Template verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung kann neben dem Menschen auf eine Vielzahl von Tieren angewendet werden, wie bspw. Kühe, Schweine, Ziegen, Hunde, Katzen usw. Durch die Herstellung einer für die zu testende Tierspezies spezifischen Gensequenz, um Blutungen zu untersuchen, dem sich Verschaffen einer auf dieser Sequenz basierenden Sonde und dem Feststellen, ob in einer Probe, wie bspw. in Fäkalien, ein zu der Sonde komplementäres Gen vorhanden ist oder nicht, können die Zielzellen detektiert werden.
In der vorliegenden Erfindung sind mit für die Tierspezies spezifischen Genen solche Gene gemeint, die in der Tierspezies vorhanden sind, von der die zu detektierenden Zellen stammen, und die nicht in normalen Zellen anderer Tierspezies oder in Mikroorganismen, die in den Fäkalien gefunden werden können, oder in als Nahrung verwendetem biologischem Material, oder in DNA-Quellen, die in anderen Substanzen der Probe vorhanden sein können, detektiert werden können. Deshalb können bspw. zu den Genen komplementäre Sequenzen, die in den Genquellen der Tierspezies, die nicht den zu testenden Tierspezies entsprechen, in der vorliegenden Erfindung als Sonden oder Primer verwendet werden, wenn die Gene, die die Sequenzen aufweisen, nicht neben dem Analysesubjekt in der biologischen Probe vorhanden sind. Diese Gene sind bei dieser Erfindung in die für das Tierspeziessubjekt spezifischen Gene mit einbezogen.
In dieser Erfindung wird ein als Alu-Sequenz bezeichnetes Gen zur Detektion von menschlichen Zellen verwendet. Die Alu-Sequenz ist in jeder eukaryotischen Zelle im Blut vorhanden und die individuelle Dichte pro Bluteinheit fluktuiert geringfügig, was eine stabile und genaue Analyse der Blutung ermöglicht. Ihr Vorhandensein im Blut mit einem gewissen Grad einer konstanten Dichte trägt zur verbesserten Sensitivität bei. Die Alu-Sequenzen existieren im Genom als repetitive Sequenz (eine pro 1.000 bis 3.000 Basenpaare) und ungefähr 400.000 oder mehr Alu-Sequenzen sind in einer einzelnen Zelle verteilt. Deshalb ist es möglich, mit hoher Sensitivität eine geringe Menge von Zel len zu detektieren, wenn eine Alu-Sequenz als Indikator verwendet wird.
Eine repetetive Sequenz, die in einem DNA-Chromosom vieler Eukaryoten ungefähr 300 Basenpaare aufweist, wird als Alu-Sequenz bezeichnet. In vielen Eukaryoten wird in Chromosomen eine repetetive Sequenz beobachtet. Im Falle des Menschen beinhaltet sie eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym AluI (AGCT), als einen Teil der DNA-Sequenz. Die Alu-Sequenz weist eine für den Menschen einheitliche Sequenzstruktur auf. Es ist das ideale Gen, um für diese Erfindung verwendet zu werden. Eine Nukleinsäuresequenz für eine typische Alu-Sequenz ist in dem Sequenzprotokoll gezeigt, gelistet als SEQ ID Nrn. 1–10. Die Sequenzen wurden von P. L. Deininger et al. als BLUR (Bam Linked Udiqutous Repeat) 1 (SEQ ID Nr. 2), 2 (SEQ ID Nr. 3), 6 (SEQ ID Nr. 4), 7 (SEQ ID Nr. 5), 8 (SEQ ID Nr. 1), 10 (SEQ ID Nr. 6), 11 (SEQ ID Nr. 7), 13 (SEQ ID Nr. 8), 14 (SEQ ID Nr. 9), 19 (SEQ ID Nr. 10) (J. Mol. Bio. 151, 17–33; 1981) kloniert. Diese Sequenzen sind mit Nummer versehen, bei denen 1 in 1 bis 10 das C in AGCT der AluI-Erkennungsstelle repräsentiert. Die Homologie ist einfach zu vergleichen, indem jede Sequenz überprüft wird und die AluI-Erkennungsstelle als Maßstab verwendet wird (Beurteilung einer Consensus-Sequenz). Für diese Erfindung ist unter zehn Sequenzen in der Sequenztabelle BLUR 8 (SEQ ID Nr. 1) die beste Sequenz. SEQ ID Nr. 1 ist eine der Hauptsequenzen unter den Alu-Sequenzen. Jede der zehn in dem Deininger-Artikel klonierten Sequenzen hat zumindest mehr als 80% Homologie zu SEQ ID Nr. 1. Deshalb sollte in dieser Erfindung die ideale Gegebenheit die Detektierbarkeit einer Sequenz sein, die mehr als 80% Homologie mit der als SEQ ID Nr. 1 bezeichneten Nukleinsäuresequenz von BLUR 8 hat, was zu einer hohen Sensitivität führen wird.
Wenn als Zielgen eine Alu-Sequenz gewählt wird, werden als Sonden ein gesamtes Gen oder eine teilweise kontinuierliche Sequenz mit 10 bis 200 Basen der Gene verwendet. Im Hinblick auf eine Sonde, die aus den angepassten Nukleinsäuresequenzen gebildet ist, wird eine optimale Hybridisierungsumgebung etabliert, wobei die die Spezifität und Sensitivität erhaltende Stringenz berücksichtigt wird. Eine geringere Anzahl von Basen wird zu einer Abnahme der Spezifität führen. Wie zuvor erwähnt, ist eine wirksame Methode, die gesamte spezifisch in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Sequenz als Sonde zu verwenden, um eine Sequenz mit mehr als 80% Homologie zu detektieren. Es ist ebenso möglich, eine Vielzahl von synthetischen Sonden herzustellen, sofern es schwierig ist, mit einer einzelnen Sonde die Vielfalt von Spezies einer Familie zu bewältigen. In jedem Fall sind diese Verfahren in der Lage, eine genaue Analyse einer Sequenz mit mehr als oben erwähnter 80%iger Homologie durchzuführen.
Andererseits weist die Alu-Sequenz zwei verschiedene Domänen auf. Eine Domäne hat unter den Individuen extrem hohe Homologie, und die andere hat unter den Individuen eine extrem hohe Variation. Eine höhere Festsetzung von Stringenz bringt selten Probleme mit sich, sofern als Sonde eine Domäne mit hoher Homologie verwendet wird. Auf der anderen Seite besteht bei der Wahl der anderen Domäne mit hoher Variation als Sonde die Wahrscheinlichkeit einer Nicht-Detektion, sofern nicht eine Stringenz bereitgestellt wird, die die akkurate Hybridisierung einer Sequenz mit einer Homologie von mehr als 90%, idealerweise von mehr als 80% ermöglicht. Die Alu-Sequenz ist grundsätzlich mit als für den Menschen einzigartigen Sequenzen strukturiert, selbst wenn sie eine Domäne mit einer hohen Variation enthält. Selbst wenn die Stringenz etwas reduziert wird, kann eine notwendige Spezifität aufrechterhalten werden.
Auf der anderen Seite sind als Primer, wenn zur Gendetektion das PCR-Verfahren verwendet wird, kontinuierliche Sequenzen zu wählen und diese sollten komplementär zu den Teilen der 3'- und 5'-Enden sein, bei denen es sich um einheitliche Bereiche der Alu-Sequenz handelt. Basierend auf einem ähnlichen Standard ist eine Primersequenz als Sonde herzustellen. Basen im 3'-Ende sollten vollständig komplementär sein, denn sie sind ein Substrat für die Polymerase. Die folgenden Sequenzen können als Primer verwendet werden und sind aus der zuvor gezeigten SEQ ID Nr. 1 ausgewählt;
Das Gen-Detektionsverfahren in dieser Erfindung ist sehr nützlich, um Blutungen vom Verdauungstrakt zu detektieren, wenn Fäkalien als Proben verwendet werden. Blutungen vom Verdauungstrakt liefern wichtige Informationen, um Geschwüre oder Tumore zu diagnostizieren. Speziell wird okkultes Fäkalienblut als ein wichtiger diagnostischer Marker in Erwägung gezogen, um Kolonkrebs zu screenen. Wenn für diese Erfindung Urin als biologische Probe des lebenden Organismus gewählt wird, werden in dem Urin weiße Blutzellen detektiert. Weiße Blutzellen im Urin sind ein Marker einer Infektion der Harnwege.
Diese Erfindung stellt des Weiteren ein Zelldetektionsreagens bereit, das aus einer Gensonde mit für die Tierspezies spezifischen Sequenzen gebildet ist. Dieses Reagens umfasst eine für das oben erwähnte Detektionsverfahren erforderliche Gensonde. Wie zuvor erläutert, wird in dieser Erfindung die Alu-Sequenz als Sonde verwendet, wenn eine menschliche Zelle Detektionsgegenstand ist. Die Nukleinsäuresequenz in den Alu-Sequenzen, einschließlich SEQ ID Nr. 1 (BLUR 8), ist in dieser Erfindung eine typische Sequenz für eine Sonde zur Detektion von menschlichen Zellen. Neben den Alu-Sequenzen ist die Beta-Actin-Gensequenz als für den Menschen einzigartiges Gen bekannt (Patentoffenlegung Hei7-99981 (eingereicht: 12. Mai 1993), die Priorität basierend auf der US-Patentanmeldung Nr. 061692 beansprucht).
Die Sonde kann, sofern dies notwendig ist, mit einer Markersubstanz markiert werden. Als Marker sind Radioisotope, Enzyme, lumineszierende Materialien, fluoreszierende Materialien und Haptene bekannt.
In dieser Erfindung besteht das Reagens zur Detektion von Zellen neben den Gensonden aus einer Vielzahl von ergänzenden Bestandteilen. Es handelt sich um eine Kombination von Bestandteilen zur Abtrennung von Nukleinsäure und um eine verdünnte Lösung von Probenbestandteilen zur Markerdetektion und um Positiv- oder Negativkontrollmaterial, um die Analyseergebnisse zu bestätigen. Für ein PCR-Verfahren werden Enzymreagenzien und Substrate benötigt.
In dieser Erfindung sind für die Tierspezies spezifische Gene ein Indikator von Zellen. Der Indikator kann bei einer hohen Genauigkeitsrate Blutkomponenten auf Grund von Nahrung von Spuren nachzuweisender Zellen unterscheiden. Zusätzlich hierzu wird ferner eine höhere Stabilität der Proben während des Transportes oder für Proben im Inneren des Verdauungstraktes erreicht, wobei es sich um eine für die Aufbewahrung der Proben äußerst schädliche Umgebung handelt. In dieser Erfindung können Gene als Indikator für Zellen in verschiedenen biologischen Proben des lebenden Organismus, wie bspw. in Fäkalien, dienen. Entsprechend der in den später beschriebenen Beispielen dargestellten Hintergründe, tauchen menschliche Zellen in normalen. Fäkalien selten auf. Das Vorhandensein von spezifischen Genen ist ein nützlicher Beleg für das Vorhandensein von Zellen. Genau genommen ist es möglich, dass in den Fäkalien eines gesunden Menschen mucoide Gewebe der Verdauungsorgane gefunden werden, eine begrenzte Menge dieser Gewebe lässt sich jedoch von anormalen Zuständen unterscheiden.
Gene wie die Alu-Sequenzen kommen im Blut bei konstanter Dichte vor. Die Indexierung dieser Alu-Sequenzen für Blutung führt wegen einer geringeren Fluktuation der Dichte im Blut bei verschiedenen Individuen zu einer stabilen Analysegenauigkeit.
Die Wahl von Genen als Indikator für Blutung kann die Spezifität drastisch verbessern und den Detektionsgegenstand amplifizieren. Derartige speziellen Effekte werden von gegenwärtig verwendeten Indikatoren nicht erwartet. Es ist extrem nützlich, Gene als einen Indikator für Blutung zu verwenden.
Gegenwärtig wird Hämoglobin als Indikator für Blutung verwendet. Die Tierspezies kann jedoch nicht genau erkannt werden, obwohl das immunologische Verfahren hinsichtlich der Spezifität als überlegen angesehen wird. Ein hohes Maß an Herstellungstechnologie ist erforderlich, um einen hervorragenden Antikör per zu erhalten, der sowohl mit Spezifität als auch Reaktivität ausgestattet ist. Auf der anderen Seite kann diese Erfindung unter Verwendung von Genen als Indikator leicht eine hervorragende Spezifität erreichen. Eine Analysetechnik basierend auf Gensequenzierung kann ohne Verwendung einer speziellen Technologie eine höhere Spezifität erreichen.
Ferner ist die Verwendung von Genen hinsichtlich der Stabilität vorteilhafter. Die DNA ist hinsichtlich durch Säuren verursachter Degradation im Vergleich zu Protein, wie bspw. Hämoglobin, stabiler. Sie werden ebenfalls selten durch ein Proteindegradationsenzym, ein Verdauungsenzym beeinflusst. Die durch den Verdauungstrakt hindurchgetretenen Blutkomponenten in den Fäkalien sind durch Säuren und Proteindegradationsenzyme beschädigt. Es bleibt die Möglichkeit der Degradation der Proben noch bevor diese analysiert werden, denn sie müssen, nachdem sie gesammelt wurden, in ein Labor transportiert werden. Demnach ist die Stabilität eines Gens ein sehr bedeutsames Merkmal, um die Zuverlässigkeit von Analyseergebnissen zu verbessern.
Zusätzlich zu dessen Stabilität ist die vergleichsweise konstante Dichte eines Gens im Blut eine wichtige Eigenschaft. Für eine Vielzahl von im Blut enthaltenen Komponenten ist es möglich, ein Indikator für Blutung zu werden. Wenn eine Komponente dazu neigt, zwischen Individuen in ihrer Dichte im Blut zu fluktuieren, ist sie wegen fehlender Zuverlässigkeit kein idealer Indikator. Die in dieser Erfindung dargestellten Alu-Sequenzen sind in jeder eukaryotischen Zelle enthalten und ihre Dichte im Blut (ungefähr 20 × 10⁴ Zellen/μl) ist auf einem hohen Niveau stabil, um eine hohe Zuverlässigkeit als Indikator für Blutung aufrechtzuerhalten.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Sequenz, in der das C des AluI-Erkennungsbereichs AGCT von BLUR 8, dargestellt in SEQ ID Nr. 1, mit 1 nummeriert ist. In dieser Figur zeigt „." eine Deletion an.
2 ist eine Sequenz, in der C des AluI-Erkennungsbereichs AGCT von BLUR 1, dargestellt in SEQ ID Nr. 2, mit 1 nummeriert ist. In dieser Figur zeigt „." eine Deletion an.
3 ist eine Sequenz, in der C des AluI-Erkennungsbereichs AGCT von BLUR 2, dargestellt in SEQ ID Nr. 3, mit 1 nummeriert ist. In dieser Figur zeigt „." eine Deletion an.
4 ist eine Sequenz, in der C des AluI-Erkennungsbereichs AGCT von BLUR 6, dargestellt in SEQ ID Nr. 4, mit 1 nummeriert ist. In dieser Figur zeigt „." eine Deletion an.
5 ist eine Sequenz, in der C des AluI-Erkennungsbereichs AGCT von BLUR 7, dargestellt in SEQ ID Nr. 5, mit 1 nummeriert ist. In dieser Figur zeigt „." eine Deletion an.
6 ist eine Sequenz, in der C des AluI-Erkennungsbereichs AGCT von BLUR 10, dargestellt in SEQ ID Nr. 6, mit 1 nummeriert ist. In dieser Figur zeigt „." eine Deletion an.
7 ist eine Sequenz, in der C des AluI-Erkennungsbereichs AGCT von BLUR 11, dargestellt in SEQ ID Nr. 7, mit 1 nummeriert ist. In dieser Figur zeigt „." eine Deletion an.
8 ist eine Sequenz, in der C des AluI-Erkennungsbereichs AGCT von BLUR 13, dargestellt in SEQ ID Nr. 8, mit 1 nummeriert ist. In dieser Figur zeigt „." eine Deletion an.
9 ist eine Sequenz, in der C des AluI-Erkennungsbereichs AGCT von BLUR 14, dargestellt in SEQ ID Nr. 9, mit 1 nummeriert ist. In dieser Figur zeigt „." eine Deletion an.
10 ist eine Sequenz, in der C des AluI-Erkennungsbereichs AGCT von BLUR 19, dargestellt in SEQ ID Nr. 10, mit 1 nummeriert ist. In dieser Figur zeigt „." eine Deletion an.
11 zeigt eine Korrelation zwischen den durch das Blutdetektionsverfahren der vorliegenden Erfindung erhaltenen Ergebnissen und den Ergebnissen, die durch konventionelle Verfahren zur Detektion von okkultem Blut erhalten wurden. In der Figur sind die Ergebnisse des Latexagglutinationsverfahrens, die der vorliegenden Erfindung und die des Orthotolidintests durch die vertikale Achse, die horizontale Achse bzw. den Symbolen in der Figur gekennzeichnet. Jedes Symbol bedeutet Folgendes x;–, Δ;+, O;2+ und •;3+.
Beispiele der Erfindung
BEISPIEL 1: Detektionssensitivität des Detektionssystems für menschliche DNA unter Verwendung der Alu-Sequenz-Sonde
Zur Herstellung einer Probe wird Blut, dem Heparin zugegeben wurde, stufenweise mit 200 μl physiologischer Kochsalzlösung verdünnt. Für eine weitere Probe wurde dieselbe Menge Blut nicht zu physiologischer Kochsalzlösung, sondern zu 200 μl Lösung hinzugegeben, die mit 20 mg Fäkalien eines gesunden Menschen versetzt war.
Sowohl zu der physiologischen Kochsalzlösung, die fortlaufend verdünntes Blut, dem Heparin zugesetzt wurde, enthielt, als auch der mit menschlichen Fäkalien versetzten Lösung wurden 0,5% SDS und 1 mg/ml Proteinase K (hergestellt von Boehringer Mannheim) hinzugegeben (Endkonzentration). Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C wurden beide Lösungen einmal mit Ether extrahiert. Die in einem Ethanolpräzipitationsprozess gesammelte DNA wurde luftgetrocknet und anschließend in 100 μl destilliertem Wasser gelöst.
Diese wurde gemäß der üblichen Vorgehensweise auf eine Nitrozellulosemembran Dot-geblottet, eine mittels Nick-Translationsverfahren mit ³²P markierte Alu-Sequenz-Sonde wurde hybridisiert. Als Sonde wurde DNA mit der als SEQ ID Nr. 1 dargestellten Basissequenz verwendet. Das Ergebnis wurde nach 18-stündiger Autoradiografie ausgewertet. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 gezeigt. Trotz vermuteter geringerer Sensitivität und des Effektes der Fäkalien in der mit den Fäkalien vermischten Probe bestätigt sich, dass das Verfahren dieser Erfindung 0,125 μl Blut pro 20 mg Fäkalien (ungefähr eine Spatelschaufel) detektieren kann.
Tabelle 1 Detektionssensitivität des Detektionssystems für menschliche DNA unter Verwendung der Alu-Sequenz-Sonde
BEISPIEL 2: Untersuchung der Spezifität der Sonden
Es wurde derselben Detektionsablauf wie in Beispiel 1 eingehalten, um die Spezifität dieser Erfindung zu bestätigen, wobei anstelle von menschlichem Blut das Blut von Kühen und Hühnern verwendet wurde. Zum Vergleich wurden das Orthotolidin-Verfahren-Messkit HEMATEST (Markenname, Bayer), das gegenwärtig zur Detektion von okkultem Fäkalienblut vertrieben wird, und das immunologische Latex-Agglutinationsverfahren-Messkit, OC-HEMODIA EIKEN (Eiken Kagaku, Markenname) verwendet. Die Handhabung erfolgte gemäß der beigefügten Anleitungen. Das Orthotolidin-Verfahren verwendet die durch die Peroxidase-ähnliche Aktivität des Hämoglobins verursachte Farbentwicklungsreaktion des Orthotolidins. Auf der anderen Seite wird das menschliche Hämoglobin mit dem immunologischen Latex-Agglutinationsverfahren detektiert, das die Agglutinationsreaktion zwischen menschlichem Hämoglobin und Polysterollatexpartikeln verwendet, die mit einem Anti-menschliches-Hämoglobin-Antikörper beschichtet sind, sofern menschliches Hämoglobin vorhanden ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Diese Erfindung belegt, dass menschliches Blut klar von dem Blut von Hühnern oder Kühen, das sich mit der Nahrung vermischt haben könnte, unterschieden werden kann. Solches Tierblut wird nicht durch das Orthotolidinverfahren unterschieden und zeigt exakt die gleiche Reaktion wie menschliches Blut.
Der Vergleich wurde zwischen den konventionellen Verfahren zum Detektieren von okkultem Fäkalienblut, wie bspw. den Orthotolidin- und Latex-Agglutinationsverfahren, und dem Verfahren dieser Erfindung durchgeführt. Fäkalienproben, die nach Rindfleischkonsum gesammelt wurden, wurden mit Fäkalienproben ver glichen, die nach eingeschränktem Fleischkonsum gesammelt wurden. Es wurde derselben Ablauf wie in Beispiel 1 eingehalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Sowohl das Latex-Agglutinationsverfahren als auch das Verfahren dieser Erfindung erkannten die Tierspezies, bei allen Ergebnissen sind Minuszeichen angegeben. Auf der anderen Seite erkennt das Orthotolidinverfahren nicht die Tierspezies und ergibt ein falsch positives Signal, das durch den Fleischkonsum verursacht sein könnte.
Tabelle 2 Spezifität der Sonden (Spezifität für Tierspezies)
Tabelle 3 Spezifität der Sonden (Vergleich mit konventionellen Verfahren)
BEISPIEL 3: Vergleich mit konventionellen Verfahren zum Detektieren von okkultem Blut
Das Detektionsverfahren dieser Erfindung wurde mit konventionellen Verfahren für okkultes Blut unter Verwendung üblicher Fäkalienproben verglichen, wie bspw. mit dem Orthotolidinverfahren (biochemische Detektion) und dem Latex Agglutinationsverfahren (immunologische Detektion). Es wurden dieselben Abläufe wie in Beispiel 1 (diese Erfindung) oder in Beispiel 2 (konventionelle Verfahren) eingehalten.
Jede Fäkalienprobe wurde unter keinerlei Ernährungseinschränkung gesammelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Die zehn Proben bestanden aus Proben, die im Screeningtest für Kolonkrebs über den Latex-Agglutinationstest positiv waren (Proben 1 bis 7), Proben von Magengeschwürpatienten (Proben 8-9) und aus einer Probe eines Kolonkrebs-Patienten (Probe 10).
Die Ergebnisse für Probe 5 in dem Latex-Agglutinationsverfahren (+ → –; ein zwischen + und – liegendes Ergebnis) könnten durch reduzierte Antigenizität des Hämoglobins verursacht sein.
Tabelle 4 Vergleich mit konventionellen Verfahren zur Detektion von okkultem Blut
BEISPIEL 4: Detektion von Blutungen im oberen Verdauungstrakt
Unter Verwendung von Fäkalienproben, die von einem gesunden Menschen gesammelt wurden, der sein eigenes Blut aufgenommen hatte als Modell für eine Blutung im oberen Verdauungstrakt, wurde diese Erfindung mit den konventionellen Verfahren verglichen. Die zwischen der vorliegenden Erfindung und den konventionellen Verfahren des Orthotolidinverfahrens und des Latex-Agglutinationsverfahrens unter Ernährungseinschränkungen vergleichenden Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Das durch den oberen Verdauungstrakt hindurchgetretene Blut kann mit dem Latex-Agglutinationsverfahren nicht detektiert werden. Dies könnte durch einen Verlust der Antigenizität des Hämoglobins durch Magensäuren oder verschiedene Enzyme verursacht worden sein. Auf der anderen Seite konnte das Verfahren dieser Erfindung, das DNA als Indikator verwendet, Blut durchgehend detektieren.
Tabelle 5 Detektion einer Blutung in dem oberen Verdauungstrakt
BEISPIEL 5: Anwendung auf allgemeine Proben
Unter Verwendung von Fäkalienproben, die für ein Kolonkrebsscreening gesammelt wurden, wurden die gemessenen Ergebnisse sowohl des konventionellen Verfahrens zur Detektion von okkultem fäkalem Blut als auch des Blutdetektionsverfahrens, das diese Erfindung verwendet, verglichen. Diese Fäkalien wurden mit denselben Abläufen wie in Beispiel 1 (diese Erfindung) und Beispiel 2 (konventionelles Verfahren) analysiert, außer für Fäkalien, denen Blut hinzugegeben wurde. Die Ergeb nisse sind in 11 gezeigt. Es wurde bestätigt, dass in Tests, die die wirklichen Fäkalienproben verwenden, diese Erfindung okkultes fäkales Blut detektieren kann, das nicht mit konventionellen Orthotolidin- und Latex-Agglutinationsverfahren detektiert werden kann.
SEQUENZPROOKOLL

Claims

Ex vivo-Verfahren, um anormale Zustände eines menschlichen Lebewesens zu diagnostizieren, die ausgewählt sind aus der Gruppe Blutung in eine Ausscheidung und Geschwüre und Krebs in dem Verdauungstrakt, gekennzeichnet durch die Schritte: Detektieren eines Zielpolynukleotids, sofern vorhanden, in einer Probe einer Ausscheidung von einem menschlichen Lebewesen, wobei das Polynukleotid die für menschliche Lebewesen spezifische und in normalen Zellen vorhandene ALU-Sequenz aufweist, mittels der Verwendung einer Gensonde, die spezifisch an das Polynukleotid hybrisieren kann, wobei die Gensonde eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die mehr als 80% Homologie zu einer der Nukleinsäuresequenzen aufweist, die als SEQ ID Nr. 1-10 gelistet sind, und Korrelieren des Vorhandenseins von detektiertem Polynukleotid mit den anormalen Zuständen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Nukleinsäuresequenzen, die als SEQ ID Nr. 1–10 gelistet sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausscheidung Fäkalien oder Urin sind.
Verwendung einer Gensonde in der Herstellung eines diagnostischen Reagenz, um anormale Zustände eines menschlichen Lebewesens, die ausgewählt sind aus der Gruppe Blutung in eine Ausscheidung und Geschwüre und Krebs in dem Verdauungstrakt, mittels des Detektierens eines Zielpolynukleotides zu diagnostizieren, das in einer biologischen Probe eines lebenden Organismus enthalten ist; wobei das Zielpolynukleotid spezifisch für menschliche Lebewesen und in normalen Zellen vorhanden ist; wobei die Gensonde eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die mehr als 80% Homologie zu einer der als SEQ ID Nr. 1–10 gelisteten Nukleinsäuresequenzen aufweist, wobei die Gensonde an das Zielpolynukleotid hybridisiert, und wobei das diagnostische Reagenz die Gensonde, einen festen Träger, um das Zielpolynukleotid daran zu immobilisieren, und einen Marker, um die Gensonde zu detektieren, wenn diese an das Zielpolynukleotid bindet, aufweist.