WO1996021041A1 - Procede de detection cellulaire - Google Patents

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WO1996021041A1
WO1996021041A1 PCT/JP1995/002734 JP9502734W WO9621041A1 WO 1996021041 A1 WO1996021041 A1 WO 1996021041A1 JP 9502734 W JP9502734 W JP 9502734W WO 9621041 A1 WO9621041 A1 WO 9621041A1
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WO
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sequence
gene
detecting
cells
feces
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PCT/JP1995/002734
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Inventor
Kiyoshi Miyai
Tsutomu Naitoh
Toshihiro Yonekawa
Original Assignee
Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting cells appearing in a biological sample.
  • diseases such as gastrointestinal ulcers and tumors
  • various cells may be observed in the feces.
  • blood cells are observed in the stool and are indicative of digestive disorders.
  • stool bleeding is often detected in stomach and duodenal ulcers and cancers of the digestive organs from the esophagus to the stomach and colon.
  • ulcerative colitis and necrosis of the tumor blood cells due to leaky bleeding (diapedesis) due to the disease are observed in the stool.
  • detection of fecal occult blood is important in screening for colorectal cancer.
  • colorectal cancer can be detected early with a certain detection rate.
  • a diagnostic technique using bleeding in the feces as an index is a technique that can be applied to animals other than humans.
  • cell detection is an important marker of disease in urine, which is a common biomaterial along with feces. For example, when leukocytes are detected in urine, a urinary tract infection is suspected. As described above, detecting cells in a biological sample in which cells are not normally detected provides important information for diagnosing various diseases. Background art
  • the currently widely used technique for detecting fecal bleeding uses hemoglobin derived from blood as an indicator. That is, a method of inducing a biochemical color reaction using the beloxidase-like activity of hemoglobin, or a method of immunological detection using an antibody against hemoglobin (Songster et al, Cancer. 45 , ppl099-l 102, 1980).
  • the former biochemical method can detect gastrointestinal bleeding, it is always a false positive because the same reaction occurs with dietary animal hemoglobin and other substances having peroxidase-like activity.
  • the latter immunological method is not affected by substances derived from dietary beloxidase-like activity or animal hemoglobin.
  • immunological techniques are widely used because they can be tested at any time without dietary restrictions. It is a method of detecting fecal occult blood by immunological techniques that has been successful in terms of specificity and sensitivity, but still has some problems. The biggest problem is the stability during storage and transport of the digestive organs and fecal samples of the hemog mouth bottle. There are many factors in feces that have a significant effect on the immunological activity of hemoglobin. Especially in the case of upper gastrointestinal bleeding, degradation by digestive enzymes, biological degradation by microorganisms, or chemical denaturation by acidic conditions affect the detection sensitivity of hemoglobin.
  • hemoglobin may be attenuated or lost due to non-specific adsorption by various solid components, etc., and it may not be possible to detect the hemoglobin despite bleeding. ing.
  • hemorrhage detection technology using hemoglobin as an index can detect bleeding in the lower gastrointestinal tract, it is said that there is a problem in stability as an index for bleeding in the upper gastrointestinal tract.
  • unknown factors that cannot be explained by these factors alone may cause detection omission, and solutions are strongly desired.
  • immunological techniques Another problem with immunological techniques is the maintenance of specificity.
  • the immunological method achieved much higher specificity than the classical method using the chemical activity of hemoglobin as an index.
  • the high specificity of immunological techniques depends heavily on the properties of the antibody, and strict conditions are required for quality control of reagents.
  • immunological methods also have issues such as (1) oversight of upper gastrointestinal bleeding, (2) problems in stability of specimen storage, storage and transportation, and (3) difficulty in reagent management. Therefore, new technologies that can more easily achieve specificity superior to immunological techniques are desired.
  • An object of the present invention is to propose a new marker capable of detecting cells in feces.
  • a new marker to be addressed by the present invention must be able to expect stability in the digestive tract or stability during transport.
  • current immunological methods are currently being used for screening for colorectal cancer, which is a lower gastrointestinal tract disease.
  • the present invention proposes a technique that is comparable in specificity to the currently known immunological detection technique for hemoglobin, which is an indicator of blood bleeding.
  • the present invention provides a new idea that can be expected to further improve the detection sensitivity, which is limited by the immunological method using hemoglobin as an index.
  • the present invention relates to a method for detecting the presence or a trace of the presence of cells derived from a living body in a biological sample, the method comprising detecting using a gene specific to the animal species as an index.
  • the cell detection method of the present invention is particularly advantageously applied to the detection of cells in feces.
  • the present invention provides a technique for detecting fecal occult blood based on this cell detection method, and a novel reagent useful for these detection methods.
  • Biological samples to be analyzed by the cell detection method of the present invention include feces and urine.
  • cells of the living body are rarely observed in normal times. Therefore, cells derived from the living body appearing in these biological samples often serve as indicators of some abnormality.
  • Cells that are indicators of abnormalities include, for example, the loss of blood cells and digestive organ tissue due to bleeding or leaky bleeding in feces. Tissue cells can be indicated.
  • leukocytes are an indicator of abnormalities.
  • the presence of complete cells that maintain their cell structure is not only an indicator of abnormality. For example, in the upper digestive tract such as the stomach, cell structures are more likely to be destroyed by digestive functions. However, even if the cells are destroyed, it can be an indicator of abnormality if the traces of the presence of the cells can be detected.
  • the detection of the gene in the present invention can be carried out by hybridization assay.
  • Hybridization assay is an analysis technique based on the affinity between nucleic acids having sequences complementary to each other. Basically, a nucleic acid in a sample is converted into a single strand by a denaturing operation such as heating, and a probe having a sequence complementary to the target sequence is reacted with the single strand. Can prove the presence of the nucleic acid. If the nucleic acid in the sample is fixed (plotted) in advance on a ditrocellulose membrane or the like, and the probe added as a reagent is labeled, the formation of double strands can be easily determined by the presence or absence of the label remaining on the membrane.
  • One of the specific analytical techniques is a solid-phase sandwich hybridization assay.
  • This technology involves preparing probes that are complementary to two physically separated regions on the gene to be detected, immobilizing one on a solid phase, and reacting the other as a labeled probe. When the sequence to be detected is present, the probe on the solid phase is hybridized with the labeled probe via the gene to be detected to complete the sandwich structure, which is why the sequence is called. Since this technique does not require the operation of plotting the gene to be detected on the membrane, it is an excellent technique that can be easily analyzed as long as reagents are provided. As a gene analysis technique applicable to the present invention, a polymerase chain reaction (hereinafter, abbreviated as PCR method) can be shown.
  • PCR method polymerase chain reaction
  • a single-stranded nucleic acid is synthesized into a double-stranded nucleic acid using a sequence called a primer as an origin of replication, and then the resulting double-stranded nucleic acid is denatured into a single-stranded nucleic acid for further double-stranded synthesis. It is based on the reaction principle of repeating. This is an analysis technique that can exponentially amplify nucleic acids because the reaction product functions as type II in the next step.
  • a gene sequence specific to the animal species cell to be detected is set, and a sequence complementary to the 3 'end of this sequence and the 3' end of its complementary strand is set.
  • feces which are biological samples
  • fecal matter contains various substances such as intestinal bacterial cells and food residues, and it is uncomfortable to operate. Therefore, it is desirable to work in a clean state.
  • the feces can be dispersed in an appropriate buffer to form a suspension, which can be easily used as an analytical sample by filtering through an inert filter material that does not adsorb gene components, or by collecting the supernatant by centrifugation. .
  • Transport of fecal samples does not have to be carried out in liquid form.
  • a piece of filter paper with feces attached may be transported in a dry state.
  • Extraction of gene components from filter paper pieces can be performed more quickly and reliably by using ultrasonic treatment or the like.
  • Genes in feces are exposed to attack by microorganisms and degrading enzymes during storage, so they should be protected using various preservatives. Since the gene is the object of analysis, effective preservatives include nuclease activity inhibitors such as nucleases. Specific examples include various proteinase-denaturing agents and actin as inhibitors.
  • the nuclease Ichize (DN ase) is effective because it requires a divalent ion such as active onset currently C a 2+ and M g 2+, EDTA, as chelating agent a preservative such as EGTA. From the viewpoint of protecting nucleic acids, it is also effective to coexist unrelated nucleic acids (eg, salmon sperm DNA) that do not cause nonspecific reactions. In addition to the preservative, a method in which the sample is heated at 80 to 100 U C for about 5 minutes is also effective for stable storage of the gene.
  • these protective agents may have a disturbing effect on gene detection, the effect can be prevented by adsorption separation, neutralization, etc. of the protective agent prior to detection.
  • the contamination of the analysis system with proteases may affect nucleic acid amplification enzymes and labeling enzymes. In such a case, it is advisable to perform an operation of adding a fluorothease inhibitor or inactivating it by heating prior to analysis.
  • a gene derived from a cell requires destruction of the cell.
  • the bleeding site is the lower digestive tract, the cell structure is maintained, and it may be impossible to completely detect the gene without destroying the cells.
  • Various methods are known for extracting genes from cells. In the present invention, these known gene extraction techniques can be applied.
  • a method for extracting a gene for example, a combination of Flotinase K and sodium dodecyl sulfate (hereinafter abbreviated as SDS) is generally used. Heating at 100 ° C for about 5 minutes enables gene extraction without enzymatic treatment.
  • the hybridization assay can be applied to the present invention. If the PCR method is employed, the single-stranded gene obtained in the step (1) can be used for type I.
  • the present invention can be applied to a wide range of animals such as humans, pigs, pigs, goats, dogs, and cats, in addition to humans.
  • Set a gene sequence specific to the animal species whose bleeding is to be confirmed obtain a probe based on this sequence, and confirm whether there is a gene complementary to the probe in a sample such as feces.
  • Cells can be identified.
  • the gene specific to the animal species in the present invention is present in the animal species from which the cell to be detected is derived, and may appear in normal cells of other animals, biological material serving as food, or feces. A gene that cannot be detected by microorganisms or other DNA sources that may appear in a sample.
  • a sequence has homology to a gene that may be present in a gene source other than the animal species to be detected, there is no possibility that the gene will coexist in the biological sample to be analyzed. thing If so, it can be used in the present invention as a probe or primer.
  • Such genes are included in the gene specific to the animal species in the present invention.
  • an Alu sequence When human cells are detected according to the present invention, a gene called an Alu sequence can be used. Since the Alu sequence is a gene that is present in all nucleated cells in the blood, the concentration per unit blood does not vary between individuals and bleeding can be analyzed with stable accuracy. Also, since it is always present at a certain concentration in blood, it contributes to improvement of sensitivity. Since the Alu sequence is present as a repeated sequence on the genome (one per 100,000 to 300,000 base pairs), about 400,000 or more are dispersed in one cell Will be. Therefore, by using the Alu sequence as an index, it is possible to detect a small number of cells and detect cells with high sensitivity.
  • the Alu sequence is the name for a repeat sequence of about 300 base pairs that is present on the chromosomal DNA of many eukaryotes. Chromosome repeats are observed in many eukaryotic cells, but in humans, a part of these repeats has an A1uI recognition site (AGCT), which is a restriction enzyme. Has been called.
  • A1uI recognition site A1uI recognition site
  • the Alu sequence is composed of a sequence unique to humans, and is a suitable gene for applications such as the present invention.
  • the base sequence of a typical Alu sequence is shown in the sequence listing as Sequences 1 to 10.
  • sequence 1 is one of the main Alu sequences.
  • sequences of 10 clones in this report all have at least 80% homology to sequence 1. Therefore, in the present invention, it is preferable to use conditions that allow detection of a sequence having a homology of 80% or more with respect to the base sequence of BLUR 8 shown as sequence 1 because it leads to high sensitivity and sensitivity. .
  • the entire sequence of this gene or a continuous sequence of about 100 to 200 bases from the sequence of this gene is adopted as the probe. It is advisable to set optimal hybridization conditions in consideration of the stringency that can maintain specificity and sensitivity according to the probe composed of the base sequence used. In addition, it is not preferable that the number of bases is too small, because it causes a decrease in specificity.
  • the advantageous methods to use all of the sequences specifically shown in Sequence 1 as probes.
  • multiple synthetic probes can be prepared. In any case, these methods enable high-precision analysis of sequences having a homology of 80% or more as described above.
  • the Alu sequence has a very high homology between individuals and a region with high variability between individuals.
  • a portion with high homology as a probe, no problem occurs even if the stringency is set high.
  • a region with high variability is selected as a probe, detection errors may occur unless a stringency that can reliably hybridize to a sequence having a homology of 90% or more, preferably 80% or more is ensured. Nature occurs.
  • the Alu sequence is basically composed of a sequence unique to humans, so that the required specificity can be maintained even if the stringency is slightly reduced.
  • a continuous sequence corresponding to the 3′-side and 5′-side end portions of the region specific to this Alu sequence is selected as a primer.
  • the sequence of the primer is also set based on almost the same criteria as the probe. However, the base at the 3 'end must be completely complementary because it serves as a substrate for volumease.
  • the sequences that can be used as primers are shown below. The following sequence was selected from Sequence 1 shown above.
  • the method for detecting cells according to the present invention is useful for detecting bleeding from digestive organs when feces are used as a sample. Gastrointestinal bleeding can provide valuable information for diagnosing ulcers and tumors. You. In particular, in screening for colorectal cancer, detection of occult blood in feces is an important diagnostic item.
  • detection of occult blood in feces is an important diagnostic item.
  • leukocytes in urine can be detected. Leukocytes in urine are one marker of urinary tract infection.
  • the present invention also provides a cell detection reagent comprising a gene probe having a sequence specific to an animal species. This reagent contains a gene probe necessary for performing the detection method described above.
  • the Alu sequence can be used as the probe of the present invention when a human cell is to be detected.
  • the base sequence of the Alu sequence including Sequence 1 (BLUR8) is a typical sequence in the probe of the present invention for detecting human cells.
  • BLUR8 Sequence 1
  • a beta-actin gene sequence is known as a human-specific gene (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-99981 / 1993. Claimed application).
  • the probe may be labeled with a known labeling component, if necessary.
  • labeling component e.g., radioisotopes, luminescent substances, fluorescent substances, enzymes, haptens and the like are known.
  • the cell detection reagent of the present invention can be composed of various additional components in addition to the gene probe. That is, a sample diluent, a component for separating nucleic acids, a component for detecting a label, and a negative or positive control sample for confirming an analysis result can be combined. If the PCR method is used, it is necessary to prepare enzyme reagents and components to be substrates.
  • Genes specific to the animal species of the present invention are cellular indicators. It is an index for distinguishing blood components derived from meals from the traces of cells to be detected with extremely high accuracy. In addition, it exhibits a high degree of stability in the digestive tract, which is in a harsh environment for storage, or in the environment where samples are transported.
  • the gene in the present invention is a substance that can be used as a cell index with high reliability in various biological samples such as feces. Even if the background is taken into account as shown in the Examples, human cells rarely appear in large amounts in normal feces, so the presence of the gene is useful as cell proof.
  • genes such as the Alu sequence are substances that exist at a constant concentration in the bleeding blood and provide stable analysis accuracy when used as an indicator of bleeding because the blood concentration varies little between individuals. .
  • genes as indices, specificity can be dramatically improved, and special effects that can be expected from previous indices, such as amplifying the detection target, can be obtained. In particular, it is highly useful as an indicator of bleeding.
  • Hemoglobin a traditional indicator of hemorrhage, is difficult to completely discriminate from animal species, even with the most specific immunological techniques at present. To obtain an excellent antibody having both specificity and reactivity, advanced production technology is required. In contrast, in the present invention using a gene as an index, excellent specificity can be easily realized. Analysis techniques based on gene sequences can achieve high specificity without using special techniques.
  • Genes are also advantageous in terms of stability.
  • the gene which is DNA, is stable to hemoglobin, which is a protein, and is resistant to denaturation by acids and the like. Moreover, it is less susceptible to proteolytic enzymes, which are digestive enzymes. Blood components placed in feces that pass through the digestive tract are attacked by acids and proteolytic enzymes. Since samples for analysis need to be transported to the laboratory even after collection, there is always the effect of denaturation until immediately before analysis. Therefore, the stability of the gene is a very useful feature in improving the reliability of the analysis results.
  • the gene maintains relatively stable blood levels. Any of the various components in the blood may be indicators of bleeding. However, a component in which the blood concentration is likely to fluctuate between individuals is not preferable because it is a reliable indicator.
  • the Alu sequence exemplified in the present invention is a gene possessed by all nucleated cells in blood, and its blood concentration (about 20 ⁇ 10 4 cells / l) is stable at a high level and is an indicator of hemorrhage. It can be said that the reliability is high.
  • FIG. 1 shows a sequence in which C is designated as 1 in the Alul recognition site AGCT of BLUR 8 shown in SEQ ID NO: 1. In the figure, the deletion is indicated by “.”
  • FIG. 2 shows a sequence in which C is designated as 1 in the Alul recognition site AGCT of BL UR1 shown in SEQ ID NO: 2. In the figure, “deletion” is indicated by "”.
  • FIG. 3 shows a sequence in which C in the Alul recognition site AGCT of B LUR2 shown in SEQ ID NO: 3 is represented as 1. In the figure, the deletion is indicated by ".”
  • FIG. 4 is a sequence in which C in the Alul recognition site AGCT of B LUR6 shown in SEQ ID NO: 4 is represented as 1. In the figure, “deletion” is indicated by “”.
  • FIG. 5 shows a sequence in which C in the Alul recognition site AGCT of BLU 7 shown in SEQ ID NO: 5 is represented as 1.
  • FIG. 6 is a sequence in which C in the Alul recognition site AGCT of BLUR10 shown in SEQ ID NO: 6 is represented as 1. In the figure, the deletion is indicated by ".”
  • FIG. 7 is a sequence in which C in the Alul recognition site AGCT of BLU 11 shown in SEQ ID NO: 7 is represented as 1.
  • FIG. 8 shows a sequence in which C in the Alul recognition site AGCT of BLU R13 shown in SEQ ID NO: 8 is represented as 1. In the figure, the deletion is indicated by ".”
  • FIG. 9 is a sequence in which C in the Alul recognition site AGCT of BLUR14 shown in SEQ ID NO: 9 is represented as 1.
  • FIG. 10 shows a sequence in which C in the Alul recognition site AGC T of BLU R19 shown in SEQ ID NO: 10 is represented as 1. In the figure, “deletion” is indicated by “”.
  • FIG. 11 shows the correlation between the result obtained by the conventional method for detecting fecal occult blood and the measurement result obtained by the bleeding detection method to which the present invention is applied.
  • the vertical axis shows the measurement result by the latex agglutination method
  • the horizontal axis shows the measurement result by the present invention
  • the symbol in the figure shows the result of the ortho-ligin method.
  • the symbols correspond to X: —, ⁇ : +, ⁇ : 2+, and reference: 3+, respectively.
  • Example 1 Measurement sensitivity of human DNA detection system using Alu sequence probe
  • Heparin-collected blood was serially diluted and added to physiological saline 200 to prepare a sample.
  • a suspension of 2 Omg of healthy human feces per 200 ⁇ l was prepared in place of physiological saline, and the same amount of blood was added to the suspension to determine the measurement sensitivity in feces.
  • 0.5% SDS and lmg / ml proteinase K (manufactured by Behringer's Mannheim) were added to physiological saline or stool suspension obtained by serially diluting heparinized blood. Both are final concentrations). After incubating at 37 ° C for 30 minutes, the mixture was extracted once with ether. The DNA recovered by ethanol precipitation was air-dried and dissolved in 100 ⁇ l of purified water.
  • Example 2 Examination of peculiarity of mouthpiece The specificity of the present invention was confirmed by performing the same detection operation as in 1, except that human blood was used instead of human blood.
  • Controls include Hematest (available from Bayer, trade name), a commercially available kit for the detection of fecal occult blood, which is currently used for the detection of occult blood, and OC Modia Eiken, a kit for immunological latex agglutination. (Manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.). The operation was in accordance with the attached instructions.
  • the ortho-tolysin method utilizes a reaction in which ortho-tolysine develops color due to the peroxidase-like activity of hemoglobin.
  • hemoglobin is detected using the phenomenon that polystyrene latex particles sensitized with an antibody against human hemoglobin are aggregated by an immunological reaction in the presence of hemoglobin. ing.
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name human Other information: ALU array BLUR8
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name human
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name human
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name human
  • CGGTGGCTCA CACCTGTAAT CCCAGCACTT TGGGAGGCCA AGGTGGGCAG 50 ATCACCTGAG CTCAGGAGTT TGAGACCAGC CTTGCCAACA TGGCAAAACC 100 CCGTCTCTAT TAAAAATACA AAAATTAGCC GGGCAAGGAG GTGGGTGCCT 150 GTAATCCCAG CTACTTGGGA GGCTGAGGCA GGAGAAACAC TTGAACCTGG 200 GAGAGCCGAG ATAGTGCCAC TGTACTCCAG CCTGGGCAAC AGAGTGAGAC 250 TCTGTCA SEQ ID NO: 5
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name human
  • Sequence type nucleic acid
  • AAAAAAAAAA TTAGCCGGCG TGGTGACGGG CGCCTGTAGT CTCAGCTACT 50 CAGGAGGCTG AGGCAGGAGA ATGGCGTGAA CCTGGGAGGT GGAGCTTGCA 100 GTGAGCCGAG ATCGGGCCAT TACACTCCGG CCTGGGCGAC AGAGCGAGAC 150 TCCGTCTCAA AAAAAAAAAA AAAAAAA sequence number
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name human
  • TGTAATCCCA GCACTTTTGG GAGGCTGAGG AGGGATGGAT CACCTGAGGT 50 CAGGAGTTCA AGACCAGCCT GGCCAACATG GTGAAACCCC GTTTCTACTA 100 AAAATACAAA AATTAGCTGG GCATGGTGGT GGGCACCTGT AATCCCAGCT 150 ACTCGGGAGG CTGAGGCAGG AGAATTGCTT GAAACCAGGA GGCAGAGGTT 200 GCAGTGAGCT GAGATTGCGC CACTGTACTT CAGGCTGTGT GACAGAGTGA 250 GACTCCATCT CAAAAAAAAAAAAA SEQ ID NO: 8
  • Organism name human
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name human
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name human

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Description

明細書
細胞検出方法
技術分野
本発明は生体試料中に出現する細胞の検出方法に関するものである。 消化管の 潰瘍や腫瘍のような疾患では、 糞便中にいろいろな細胞が観察されることがある。 たとえば糞便への出血があるときには血液細胞が糞便中に観察され、 消化系疾患 の指標となる。 具体的には、 胃や十二指腸の潰瘍、 食道から胃 ·大腸にいたる消 化器官の癌では、 糞便への出血が検出されることが多い。 一般的な出血の他、 た とえば潰瘍性大腸炎や腫瘍の壊死でも疾患に起因する漏出性出血（diapedesis)に よる血液細胞が便中に観察される。
特に大腸癌のスクリーニングにおける糞便中の潜血の検出は重要である。 糞便 という非侵襲的に採取できる生体試料を使って、 ある程度の検出率で大腸癌を早 期に捉えることができる。 更に糞便中への出血を指標とする診断技術は、 ヒ 卜以 外の動物においても応用可能な技術である。
この他に、 糞便と並んで一般的な生体材料である尿においても、 細胞の検出は 疾病の重要なマーカーである。 たとえば白血球が尿中に検出されるときには、 尿 路感染症が疑われる。 このように、 正常時には細胞が検出されない生体試料にお いて細胞を検出することは、 各種の疾病を診断するための重要な情報を与える。 背景技術
現在広く採用されている糞便中への出血検出技術は、 血液に由来するへモグロ ビンを指標にしている。 すなわち、 ヘモグロビンのベルォキシダ一ゼ様活性を利 用して生化学的な発色反応を起こさせる方法、 あるいはへモグロビンに対する抗 体を利用して免疫学的に検出する方法（Songster et al , Cancer. 45, ppl099-l 102, 1980)が知られている。 前者の生化学的方法では消化管からの出血を検出すること は可能なものの、 食事に由来する動物性のヘモグロビンや、 その他のペルォキシ ダーゼ様活性を持つ物質によっても同じ反応が起きるため常に偽陽性の可能性が ともなう。 一方後者の免疫学的な手法は、 食事に由来するべルォキシダーゼ様活 性を持つ物質や動物性のヘモグロビンの影響を受けない。 この特徴によって、 免 疫学的な手法は、 食事制限無しでいつでも検査が可能なため広く普及している。 特異性や感度の点で成功をおさめた免疫学的な手法による便潜血の検出方法で あるが、 いまなおいくつかの問題点が指摘されている。 最大の問題点が、 へモグ 口ビンの消化器官內ゃ糞便検体の保存輸送時における安定性である。 糞便中には へモグロビンの免疫学的な活性に重大な影響を与える多くの要因が存在している。 特に上部消化管出血の場合には、 消化酵素による分解、 微生物による生物学的な 分解、 あるいは酸性条件による化学的な変性等がへモグロビンの検出感度に影響 を与える。 また種々の固形成分による非特異的な吸着等によってへモグロビンの 免疫学的な活性が減衰、 もしくは消失して、 出血しているのにもかかわらず検出 することができない場合の有ることも指摘されている。 このようにへモグロビン を指標とする出血の検出技術では、 下部消化管の出血を捉えることはできるが、 上部消化管の出血の指標としては安定性に問題が有るとされている。 更にこれら の要因だけでは説明のできない未知の要因によって検出漏れが生じる可能性も有 り、 解決が強く望まれている。
免疫学的な手法のもうひとつの問題点は、 特異性の維持である。 免疫学的な手 法は、 ヘモグロビンの化学的な活性を指標とした古典的な方法に比べてはるかに 高い特異性を実現した。 しかし免疫学的手法における高い特異性は、 抗体の特性 に強く依存しているため、 試薬の品質管理には厳しい条件を要求される。
以上述べてきたとおり、 免疫学的な手法においても （1 ) 上部消化管出血の見 落とし、 （2 ) 検体の保存 ·放置 ·輸送における安定性の問題、 （3 ) 試薬管理 のむずかしさといった課題を残しているため、 免疫学的な手法に勝る特異性をよ り容易に実現できる新しい技術が望まれている。
へモグロビンにおける安定性の問題を解消するために、 他の物質を指標とする 試みも有る。 たとえばトリプシンインヒビタ一である α 1—アンチトリプシン ( α 1 A T ) 等を指標に糞便中への出血を検出することが試みられた （特開平 3 — 1 3 8 6 3 ) 。 しカゝし α 1 A Tは出血以外の要因でも糞便中に検出される場合 の有ることが指摘ざれた。 また消化管内や糞便中での安定性もへモグロビンを越 える利点は確認されなかったことから、 普及にはいたっていない。
他方、 遺伝子を生物の分析のための標的とする試みは古くから行われている。 たとえば、 Kouri lskyらは酵素標識プ口一ブによる核酸の検出方法を開示している (US4581333) 。 Rankiらはサンドイッチハイブリダィゼーシヨンアツセィ法を報 告した （US4486539) 。 これらの技術は、 遺伝子を構成している核酸の検出技術と して広く普及し、 さまざまな試料に対して応用されている。 そして病原性の細菌 やウィルス、 あるいは癌に関連する遺伝子の検出に関する多くの報告が有る。 こ の技術を応用した糞便中の癌遺伝子の検出の試みも報告されている。 （Science 256 ; 102- 05, 1992)
発明の要約
本発明の課題は、 糞便中の細胞の検出を可能とする新しいマーカーの提案であ る。 本発明が課題とする新しいマーカ一は、 消化器官内における安定性、 あるい は輸送中の安定性を期待できるものでなければならない。 事実、 ヘモグロビンの 安定性を考慮して現在の免疫学的手法はもつはら下部消化管疾患である大腸癌の スクリーニングに用いられているのが現状である。 本発明は現在知られている出 血の指標であるへモグロビンの免疫学的な検出技術に比べて特異性においても遜 色の無い技術を提案するものである。
加えて本発明は、 ヘモグロビンを指標とする免疫学的な手法では限界のある検 出感度の向上についても、 更に感度の向上が期待できる新しいアイディアを提供 する。
すなわち本発明は、 生体試料中におけるその生体に由来する細胞の存在または 存在の痕跡を検出する方法であって、 当該動物種に特異的な遺伝子を指標として 検出することを特徴とする細胞検出方法を提供する。 本発明の細胞検出方法は、 特に糞便中の細胞検出に応用すると有利である。 更に本発明は、 この細胞検出方 法に基づく糞便潜血の検出技術、 そしてこれらの検出方法に有用な新規な試薬を 提供する。
好適な実施態様の説明
本発明の細胞検出方法の分析対象である生体試料には、 糞便や尿が含まれる。 これらの生体試料には、 一般的に正常時にはその生体の細胞が観察されることは 少ない。 したがってこれらの生体試料に出現する当該生体由来の細胞は、 多くの 場合なんらかの異常の指標となる。 異常の指標となる細胞とは、 たとえば糞便中 においては出血や漏出性出血に起因する血液細胞、 消化器官の組織の破壊にとも なう組織細胞を示すことができる。 また尿中においては、 白血球が異常の指標と なる。 これらの細胞は、 細胞構造を維持した完全な細胞の存在そのものが異常の 指標となるばかりではない。 たとえば胃のような上部消化器官内においては、 細 胞構造が消化機能などによって破壊される可能性が高い。 しかしたとえ細胞が破 壊されてしまっても細胞が存在した痕跡を検出することができれば異常の指標と なり うる。
好ましい態様によれば、 本発明における遺伝子の検出はハイブリダゼ一シヨン アツセィにより行うことができる。 ハイブリダィゼ一シヨンアツセィは、 互いに 相補的な配列を備えた核酸同士の親和性に基づく分析技術である。 基本的には、 試料中の核酸を加熱等の変性操作によって 1本鎖とし、 これに目的とする配列に 相補的な配列を備えたフローブを反応させ、 もしも 2本鎖が形成されれば目的の 核酸の存在を証明できる。 試料中の核酸をあらかじめ二トロセルロース膜等に固 定 （プロッティング） しておき、 一方試薬として加えるブローブを標識しておけ ば、 2本鎖の形成を膜上に残る標識の有無によって簡単に確認することが可能で ある。 このような反応原理に基づいて、 現在までにさまざまな分析系が提案され ている。 本発明では検出対象として生体試料が由来する動物種の特定の遺伝子配 列を選ぶが、 その他の点についてはこれまでに知られている各種分析技術を応用 することが可能である。 検出対象とできる遺伝子には D N Aと R N Aがあり、 い ずれの場合もその検出技術にはさまざまな方法が知られている。 しかし D N Aを 検出対象とする方がより高い安定性を期待できるため好ましい。
具体的な分析技術のひとつに固相サンドィツチハイブリダゼ一シヨンアツセィ を示すことができる。 この技術は、 検出対象である遺伝子上の物理的に離れた 2 つの領域に相補的なプローブを用意し、 一方を固相に固定し、 もう一方を標識フ ローブとして反応させる技術である。 検出対象となる配列が存在した場合には、 固相上のプローブに検出対象である遺伝子を介して標識ブローブがハイブリダィ ズしサンドィツチ構造が完成するためこのように呼ばれている。 この技術は検出 対象となる遺伝子を膜にプロッティングする操作が不要なため、 試薬さえ提供さ れれば簡単に分析を行える優れた技術である。 本発明に応用可能な遺伝子の分析技術として、 この他にボリメラーゼ ·チェ一 ン · リアクション法 （Polymerase Chain Reaction, 以下 P C R法と省略する） を 示すことができる。 P C R法は、 プライマーと呼ばれる配列を複製起点として 1 本鎖の核酸を铸型に 2本鎖核酸を合成後、 得られた 2本鎖を変性により 1本鎖と して更に 2本鎖合成を繰り返すという反応原理に基づいている。 反応生成物が更 に次のステップで铸型として機能するので、 核酸を指数的に増幅することができ る分析技術である。
本発明に P C R法を応用する場合には、 検出対象となる動物種細胞に固有の遺 伝子配列を設定し、 この配列の 3 ' 末端と、 その相補鎖の 3 ' 末端に相補的な配 列を持つプライマ一を用意しておく。 このようにして設定したブライマ一により P C R法を行えば、 試料中に目的とする遺伝子が存在しているときには特定の遺 伝子が特異的に増幅される。 増幅された遺伝子は、 反応液を電気泳動により分離 すれば 1本のバンドとして確認できる。 また増幅産物について先に述べたハイブ リダイゼ一シヨンアツセィを行ってその有無を検出しても良い。
このような遺伝子の検出に先だって、 生体試料から遺伝子を抽出する操作を行 うと良い。 本発明の原理上、 たとえば生体試料である糞便中に存在する可能性の 有る多くの成分は基本的にはなんら分析結果に影響を与えない。 しかし糞便には 腸内細菌の菌体、 食物残さ等、 多種多様な物質が存在しているし、 操作上 不快 感をともなうので、 あるていど清浄な状態で作業を進めることが望まれる。 糞便 を適当な緩衝液に分散させて懸濁液とし、 遺伝子成分を吸着しない不活性なろ過 材料でろ過したり、 あるいは遠心分離により上清を分取すれば簡単に分析試料と することができる。
ろ過操作には市販の採便容器を用いると便利である。 糞便の定量的採取 '緩衝 液への分散 ·ろ過という一連の操作を 1つの容器で行うことができるうえ、 輸送 にも耐える採便容器がへモグロビンの免疫学的な検出用試料の輸送に実用化され ている（US5149506, US5246669, USPTO serial number 08/290892； 1994)。 この種の 容器はそのまま本発明に用いることができる。 もしもろ過材への遺伝子の非特異 的な吸着により検出感度が影響を受ける心配があれば、 ろ過材をあらかじめ不活 性な遣伝子で処理しておくこともできる。 このような用途にはサケ精子 D N A等 が一般に用いられている。
糞便試料の輸送は、 必ずしも液体の状態で行わなくても良い。 たとえば糞便を 付着させたろ紙片を乾燥状態で輸送しても良い。 この場合には、 分析に先立って ろ紙片から遣伝子成分を抽出分散する操作が必要となる。 ろ紙片からの遺伝子成 分の抽出は、 超音波処理等を利用すればより迅速に確実な抽出が可能である。 糞便中の遺伝子は、 保存中に微生物や分解酵素による攻擎にさらされることに なるので各種保存剤を利用して保護しておくと良い。 遺伝子を分析対象としてい るので有効な保存剤にはヌクレア一ゼのような核酸分解酵素の活性阻害剤を例示 できる。 具体的には、 各種プロテア一ゼゃ蛋白質変性剤、 あるいはインヒ ビター としてのァクチンなどを挙げられる。 またヌクレア一ゼ （D N a s e ) は活性発 現に C a 2+や M g 2+等の 2価のイオンを要求するので、 E D T A、 E G T A等のキ レート剤も保存剤として有効である。 核酸を保護するという観点から、 非特異的 な反応の原因とならない無関係な核酸 （たとえばサケ精子 D N A) を共存させる ことも効果的である。 保存剤の他、 試料を 8 0〜 1 0 0 UCで 5分間程度加熱処理 してしまう方法も遺伝子の安定保存に有効である。
これら保護剤が遺伝子の検出にあたって妨害的な作用を与える心配が有れば、 検出にさきだって保護剤を吸着分離、 中和などによりその影響を防止することも できる。 たとえばプロテア一ゼが分析系に混入すると核酸増幅酵素や標識酵素に 影響する可能性を否定できない。 このような場合には分析に先立ってフロテア一 ゼインヒビタ一を加えたり、 加熱により不活性化する操作を行うと良い。
細胞に由来する遺伝子の検出のためには、 細胞の破壊が必要な場合が有る。 特 に出血部位が下部消化器官であれば細胞構造が維持されており、 細胞の破壊無し では遺伝子を完全に検出できない可能性が出てくる。 細胞からの遺伝子抽出には さまざまな方法が公知である。 本発明においてこれら公知の遺伝子抽出技術を応 用することができる。 遺伝子の抽出法としては、 たとえばフロティナーゼ Kと ド デシル硫酸ナトリウム （以下 S D Sと省略する） の組み合わせ等が一般的である。 また 1 0 0 °Cで 5分間程度加熱すれば、 酵素的な処理によらず遺伝子の抽出が可 能である。 一方、 上部消化器官からの出血のみを検出対象とするときには、 細胞構造が維 持されている可能性が低いため破壊操作は必要無い。 このような特徴を利用すれ ば、 本発明の細胞検出方法に基づいて出血部位の推定も期待できる。
本発明における遣伝子の検出操作を更に具体的に示せば、 例えば次のような操 作手順を挙げることができる。
( 1 ) 試料の調製
糞便等の生体試料中に含まれるヒ 卜細胞の遺伝子をそのまま、 あるいは細胞の 破壊等によって抽出し、 更に変性処理して 1本鎖とする工程
( 2 ) ハイブリダイズ
得られた 1本鎖遺伝子とあらかじめ用意した遺伝子フローブとをハイプリダイ ズする工程
( 3 ) 検出
ハイブリダィズした遺伝子プローブとしなかった遺伝子プローブとを分離し、 いずれかの量を決定することにより検出対象となる遣伝子の量を求める
もちろんハイブリダイゼ一ションアツセィについては多くのバリエ一ションが 知られており、 本発明にも応用できることは言うまでもない。 また P C R法を採 用するのであれば、 前記工程 （1 ) で得た 1本鎖遺伝子を铸型に利用することが できる。
本発明は、 ヒ 卜の他、 ゥシ、 ブタ、 ャギ、 ィヌ、 ネコなど、 幅広い動物に応用 することができる。 出血を確認したい動物種に特異的な遺伝子配列を設定し、 こ の配列に基づいてプローブを得、 そして糞便等の試料中にそのブローブに対して 相補的な遺伝子が存在するかどうかを確認すれば細胞を確認することができる。 本発明における動物種に特異的な遺伝子とは、 検出すべき細胞が由来する動物 種には存在し、 他の動物の正常な細胞、 食物となる生物材料や糞便中に出現する 可能性が有る微生物、 あるいはその他試料中に出現する可能性を持つ D N Aソ一 ス等では検出できない遣伝子をいう。 したがって、 たとえば検出すべき動物種以 外の遺伝子ソースにも存在する可能性が有る遺伝子と相同性を持つ配列であって も、 その遺伝子が分析対象とする生体試料中において共存する可能性の無いもの であれば、 プローブやプライマーとして本発明に利用することができる。 このよ うな遺伝子は、 本発明における動物種に特異的な遺伝子に含まれる。
本発明によってヒ トの細胞を検出する場合には、 Alu配列と呼ばれる遺伝子が利 用できる。 Alu配列は血液中のすべての有核細胞に存在する遺伝子なので、 個体間 で単位血液当りの濃度に変動が少なく安定した精度で出血の分析が可能である。 また血液中に常にある程度の濃度で存在しているので感度の向上にも貢献する。 Alu配列はゲノム上でく り返し配列として存在している （1 0 0 0〜3 0 0 0塩基 対に 1個） ため、 1つの細胞中には約 4 0万個以上が分散していることになる。 したがって、 Alu配列を指標とすることによって少なレ、細胞を高レ、感度で検出する ことが可能である。
Alu配列は、 多くの真核生物の染色体 D N A上に存在する約 3 0 0塩基対からな る反復配列の名称である。 染色体上の反復配列は真核細胞の多くで観察されるが、 ヒ 卜の場合にはこの反復配列の一部に制限酵素である A 1 u I認識部位 (AGCT)を持つ ているためこのように呼ばれている。 Alu配列はヒ 卜に固有な配列で構成されてお り、 本発明のような用途には好適な遺伝子である。 代表的な Alu配列の塩基配列を 配列 1〜 1 0として配列表に示した。 これらの配列は P. L. Deininger et al .に よって B L U R (Bam Linked Ubiquitous Repeat) 1 (配列 2 ) 、 2 (配列 3 ) 、 6 (配列 4 ) 、 7 (配列 5 ) 、 8 (配列 1 ) 、 1 0 (配列 6 ) 、 1 1 (配列 7 ) 、 1 3 (配列 8 ) 、 1 4 (配列 9 ) 、 および 1 9 (配列 1 0 ) としてクローニング (J. Mol. Biol. 151， 17- 33 : 1981)された配列である。 また図 1—図 1 0には、 これら の配列を、 Alul認識部位である A G C Tの Cを 1として与えた番号とともに記黻 した。 Alul認識部位を基準として各配列を照合することで、 相同性の比較 （すな わちコンセンサス配列の決定） を容易に行うことができる。 配列表に示した 1 0 の配列のうち特に B L U R 8 (配列 1 ) は、 本発明における特に好ましい配列で ある。 配列 1は Alu配列の中でも主要な配列の一つである。 またこの報告における 1 0種のクローンの配列'が、 いずれも配列 1に対して少なくとも 8 0 %以上のホモ ロジ一を備えている。 したがって本発明においては、 配列 1 として示した B L U R 8の塩基配列に対して 8 0 %以上のホモロジ一を持つ配列を検出可能な条件とす ることが高レ、感度につながるので好ましレ、。 本発明における標的遺伝子として Alu配列を選択した場合は、 この遺伝子の全 部、 あるいはこの遺伝子の配列から 1 0〜2 0 0塩基程度の連続した配列をブ ローブとして採用する。 採用した塩基配列で構成されるプローブに合せて、 特異 性と感度を維持できるストリンジエンシーを考慮し至適ハイプリダイズ条件を設 定すると良い。 なお塩基数が少なすぎると特異性の低下の原因となるので好まし くない。 先に述べたように 8 0 %以上のホモロジ一を持つ配列をもれなく検出する ためには、 配列 1に具体的に示した配列の全てをプローブとして用いるのも有利 な方法の 1つである。 あるいは単一のプローブでフアミリー内の多様性に対応す るのが困難であれば、 複数の合成プローブを用意することも可能である。 いずれ にせよ、 これらの方法によって先に述べた 8 0 %以上のホモロジ一を持つ配列の高 精度な分析が可能である。
—方、 Alu配列の配列の中には個体間で非常に相同性の高い部分と、 逆に個体間 で変異性の高い領域が存在する。 相同性の高い部分をプローブとして利用すると きには、 ス トリンジエンシーを高く設定しても問題を生じにくい。 一方変異性の 大きい領域をプローブとして選択したときには、 9 0 %以上、 好ましくは 8 0 %以 上の相同性を持つ配列とも確実にハイブリダィズできるストリンジエンシーを与 えるようにしないと検出漏れの可能性が生じる。 ただ変異性の高い領域を含むと はいえ、 Alu配列は基本的にヒ トに固有の配列で構成されているので、 たとえス 卜 リンジエンシーを多少下げても必要な特異性は維持できる。
—方 P C R法に基づいて遺伝子を検出するときには、 この Alu配列に特異的な領 域の 3 ' 側と 5 ' 側の末端部分に相当する連続した配列をブライマーとして選択 する。 プライマ一の配列もプローブとほぼ同様の基準に基づいて設定する。 ただ しボリメラ一ゼによる基質となるので 3 ' 側末端の塩基は完全に相補的でなけれ ばならない。 プライマ一として利用することができる配列を次に示す。 以下の配 列は先に示した配列 1から選択したものである。
5' -GTAATCCGAG CACTTTGGGA GGC-3'
5' - ATTCTTCTGT CTCAGCCTCC-3'
本発明による細胞の検出方法は、 糞便を試料としたときには消化器官からの出 血検出に有用である。 消化器官の出血は、 潰瘍や腫瘍の診断に有力な情報を与え る。 特に大腸癌のスクリーニングにあたっては、 龚便中の潜血の検出が大切な診 断項目とされている。 この他本発明の生体試料として尿を選んだときには尿中の 白血球を検出することができる。 尿中の白血球は尿路感染症のマーカ一である。 本発明は、 動物種に特異的な配列を持つ遺伝子ブローブからなる、 細胞検出用 試薬を合わせて提供する。 この試薬は、 先に述べた検出方法を行うときに必要な 遺伝子フローブを含んでなるものである。 本発明のプローブには先に説明したと おりヒ ト細胞を検出対象とする時には Alu配列の配列を利用することができる。 配 列 1 (BLUR8)をはじめとする Alu配列の塩基配列は、 ヒ ト細胞検出用の本発明ブ ローブにおいて代表的な配列である。 Alu配列の他にもヒ ト特異的な遺伝子として ベータァクチン遣伝子配列が公知 （特開平 7— 9 9 9 8 1 /1993. 5. 12出願のァメ リ力特許出願番号 061692に基づく優先権主張出願） である。
なおブローブは、 必要に応じて公知の標識成分で標識されていても良い。 標識 としては、 放射性同位元素、 発光物質、 蛍光物質、 酵素、 およびハプテン等が知 られている。
本発明の細胞検出用試薬は、 遺伝子フローブの他に各種の付加的な成分で構成 することができる。 すなわち、 試料希釈液、 核酸を分離するための成分、 標識の 検出のための成分、 および分析の結果を確認するための陰性あるいは陽性の対照 試料などを組み合わせることができる。 また P C R法を行うのであれば、 酵素試 薬や基質となる成分を用意する必要が有る。
本発明の動物種に特異的な遺伝子は、 細胞の指標である。 食事などに由来する 血液成分と、 検出すべき細胞の痕跡をきわめて高い精度で識別するための指標で ある。 加えて保存上は厳しい環境にある消化器官内で、 あるいは検体の輪送環境 のもとで、 高度の安定性を発揮する。 本発明における遺伝子は、 糞便中のような 各種生体試料中において高い信頼性で細胞の指標となり うる物質である。 実施例 に示すようにバックグランドを考慮したとしても、 正常な糞便にはヒ 卜細胞が多 量に出現することは希であるから、 遺伝子の存在は細胞の証明として有用である。 厳密に言えば健常人であっても消化管粘膜組織等が常に糞便中に存在している可 能性が有るが、 そのレベルは狭い範囲に限られているので感度の調整によって容 易に病的な状態と識別することができる。 更に Alu配列のような遣伝子は出血した血液中において一定の濃度で存在し、 個 体間で血中濃度に変動が小さいため出血の指標としたときに安定した分析精度を 与える物質である。
遺伝子を指標に選ぶことで、 特異性は飛躍的に向上し、 また検出対象を増幅す るというこれまでの指標には期待できない特殊な効果を得ることができる。 特に 出血の指標としては有用性が高い。
従来の出血の指標であるへモグロビンは、 現在のところもっとも特異性に優れ るとされている免疫学的な手法によっても完全に動物種を識別することはむずか しい。 特異性と反応性を兼ね備えた優れた抗体を得るには、 高度の製造技術が要 求される。 これに対して遺伝子を指標とする本発明では、 容易に優れた特異性を 実現することができる。 遺伝子配列に基づく分析技術では、 特別な技術を用いる こと無く、 高い特異性の実現が可能である。
更に安定性の点でも遺伝子は有利である。 蛋白質であるへモグロビンに対して、 D N Aである遺伝子は酸などによる変性に対して安定である。 しかも消化酵素で ある蛋白分解酵素の影響を受けにくい。 消化器官を通過する糞便中に置かれた血 液成分は、 酸や蛋白分解酵素の攻擊を受ける。 分析用試料は採取後も検査施設ま で輸送する必要が有るので、 分析直前までは常に変性の影響が有る。 したがって 遺伝子の持つ安定性は分析結果の信頼性を向上させる上で非常に有用な特徴とな る。
安定性に加えて遺伝子が比較的安定した血中濃度を維持している点も重要な点 である。 血液に含まれるさまざま成分は、 いずれも出血の指標とできる可能性が 有る。 しかし個体間で血中濃度に変動が生じ易い成分は指標としては信頼性にか けるため好ましくない。 本発明で例示した Alu配列は、 血液中のすべての有核細胞 が持つ遺伝子で、 その血中濃度 （約 2 0 X 1 04cel l/ 1) は高い水準で安定して おり出血の指標としては信頼性が高いということができる。
図面の簡単な説明
図 1は、 配列番号 1に示した B L U R 8の Alul認識部位 A G C T中 Cを 1 とし て表記した配列である。 図中、 欠失（deletion)を". 〃で示した。 図 2は、 配列番号 2に示した B L UR 1の Alul認識部位 AG C T中 Cを 1とし て表記した配列である。 図中、 欠失（deletion)を "で示した。
図 3は、 配列番号 3に示した B LUR 2の Alul認識部位 AG C T中 Cを 1 とし て表記した配列である。 図中、 欠失（deletion)を". 〃で示した。
図 4は、 配列番号 4に示した B LUR 6の Alul認識部位 AG C T中 Cを 1 とし て表記した配列である。 図中、 欠失（deletion)を "で示した。
図 5は、 配列番号 5に示した B L UR 7の Alul認識部位 AG C T中 Cを 1 とし て表記した配列である。
図 6は、 配列番号 6に示した B L U R 1 0の Alul認識部位 AG C T中 Cを 1 と して表記した配列である。 図中、 欠失（deletion)を". 〃で示した。
図 7は、 配列番号 7に示した B L U R 1 1の Alul認識部位 AG C T中 Cを 1 と して表記した配列である。
図 8は、 配列番号 8に示した B LU R 1 3の Alul認識部位 AG C T中 Cを 1 と して表記した配列である。 図中、 欠失（deletion)を". 〃で示した。
図 9は、 配列番号 9に示した B L U R 1 4の Alul認識部位 AG C T中 Cを 1 と して表記した配列である。
図 1 0は、 配列番号 1 0に示した B L U R 1 9の Alul認識部位 A G C T中 Cを 1 として表記した配列である。 図中、 欠失（deletion)を "で示した。
図 1 1は、 従来の糞便潜血の検出方法による結果と、 本発明を応用した出血検 出方法による測定結果の相関を示す。 図中、 縦軸はラテックス凝集法による測定 結果を、 横軸は本発明による測定結果を、 そして図中の記号によりオル卜 ト リ ジン法の結果を示した。 各記号は、 X ： —、 △ : +、 〇： 2 +、 および参： 3 + にそれぞれ対応する。
以下に本発明の実施例を記載する。
実施例 1 . Alu配列プローブを用いたヒ ト DN A検出系の測定感度
生理食塩水 2 0 0 にへパリン採血した血液を段階希釈したものを加えて試料 とした。 一方生理食塩水の代わりに 2 0 0 μ 1あたり健常人糞便 2 Omgを懸濁した ものを準備し、 これに同量の血液を加えたものを試料として糞便中での測定感度 を求めた。 へバリン加血液を段階希釈して加えた生理食塩水、 もしくは糞便懸濁液に 0. 5%の SDS、 lmg/mlのプロティナーゼ K (ベ一リンガー 'マンハイム製） をそ れぞれ加えた （いずれも最終濃度） 。 3 7°C、 3 0分間インキュベートした後、 エーテルで各 1回ずつ抽出した。 ェタノール沈殿で DN Aを回収したものを風乾 し精製水 1 00 μ 1に溶解した。
これを常法にしたがって二トロセルロースメンブレンにドッ トブロッティング し、 でニック トランスレーション法にて標識した Alu配列プローブをハイブリ ダイズさせた。 プローブには、 配列 1に示した塩基配列を持つ DNAを用いた。 1 8時間オートラジオグラフを行い、 結果を判定した。 結果は表 1に示した。 糞便と合わせた試料では感度がやや低下し糞便の影響が推測されたが、 本発明 により便 20tng (およそスハ一テルひとかき分） あたり 0. 1 2 5 i】の血液量を 検出できることが確認された。
【表 1】 Alu配列プローブを用いたヒ卜 DN A検出系の測定感度
試料 判 定 生理食塩水 200 μ \ +血液 500 μ \ 4 +
+ 1 25 4 +
+ 3 1. 8 4 +
+ 7. 8 3 +
+ 1. 9 3 +
+ 0. 5 2 +
+ 0. 1 25 2 +
+ 0. 031 1 +
+ 0. 008
+ 0
箕便 2 Omg/20 μ 1+血液 500 μ 1 4 +
+ 125 4 +
+ 3 1. 8 3 +
+ 7. 8 3 +
+ 1. 9 2 +
+ 0. 5 2 +
+ 0. 1 25 +
+ 0. 031
+ 0. 008
+ 0
実施例 2. ブ口ーブの特異性の検討 血液として、 ヒ ト血液に代えてゥシとニヮトリの血液を用い、 1と同じ検出操 作を行って本発明の特異性を確認した。 対照には現在便潜血の検出に利用されて いる市販のオルトトリジン法による測定キット" へマテス ト" （バイエル製、 商 品名） 、 および免疫学的ラテックス凝集法による測定キッ ト" O C モディア 栄研" （栄研化学製、 商品名） を用いた。 操作は添付されている指示書にした がった。 オルト トリジン法は、 へモグロビンのペルォキシダ一ゼ様活性によって オルト トリジンが発色する反応を利用している。 他方、 免疫学的ラテックス凝集 反応法では、 ヒ トのヘモグロビンに対する抗体を感作したボリスチレンラテック ス粒子がへモグロビンの存在下で免疫学的な反応によって凝集する現象を利用し てヘモグロビンを検出している。
結果は表 2に示した。 本発明により、 食物に由来して混入する可能性の高いゥ シゃニヮ トリの血液からヒ トの血液を明確に区別できることが確認できた。 これ ら動物血液は、 オル卜 卜リジン法ではまったく区別することができず全てヒ 卜と 同等の反応性を示す。
更に牛肉を摂取した後の糞便を試料として用い、 食肉を制限した後の糞便 （準 潜血食） を対照として従来の便潜血検出方法であるオル卜 卜リジン法、 およびラ テックス凝集法と、 本発明による検出方法との比較を行った。 本発明による方法 は 1 と同じ操作で行った。 結果は表 3に示した。 本発明の方法と、 ラテックス凝 集反応においては動物種を識別しているため全てマイナスとなっている。 これに 対してオルト トリジン法では動物種を識別できないため、 牛肉の摂取に起因する と思われる偽陽性が観察された。
【表 2】 プローブの特異性 (動物種に対する特異性）
健常人便 （2 O O mg/200 1 ) +ヒト血液 1 μ 1 2 +
+ ゥシ血液 1 μ 1
+ニヮトリ血液 1 1
+ 血液無添加 【表 3】 プローブの特異性 （従来の方法との比較）
本発明法 オルトトリジン法 ラテックス凝集法 準 潜 血 食
牛肉摂取後 2曰 2 +
5曰
実施例 3 . 従来の潜血検出方法との比較
実際の糞便試料について、 従来の便潜血検出方法であるオルト 卜リジン法 （生 化学的検査） 、 ラテックス凝集法 （免疫学的検査） と本発明による検出方法との 比較を行った。 操作は実施例 1 (本発明） 、 あるいは 2 (従来法） にしたがった。 試料とした各糞便試料は、 食事制限をしていないものである。 結果は表 4に示 した。 試料として用いたのは、 ラテックス凝集法による大腸癌スク リーニング陽 性検体 （試料 1 — 7 ) 、 胃潰瘍患者検体 （試料 8— 9 ) 、 および大腸癌患者検体 (試料 1 0 ) の 1 0検体である。
試料 5でラテックス凝集法の結果が （+—— ： +と一の中間の結果） となって いるのは、 へモグロビンの抗原性が低下しているためと考えられる。
【表 4】 従来の潜血検出方法との比較
試 料 本発明法 オルトトリジン法 ラテックス凝集法
1 4 + + +
2 4 + + +
3 3 + + +
4 + 2 + +
5 + + + — —
6 + + +
7 3 + ± +
8 2 + 3 + +
9
1 0 3 + 2 + +
実施例 4 . 上部消化管出血の検出
自己の血液 （1 5 ml) を経口的に与えた健康なヒ トの糞便を試料として用い、 上部消化管出血モデルとして本発明と従来法の比較を試みた。 食事制限を行った 上で、 従来の方法であるオル卜 トリジン法およびラテックス凝集法の成績を比較 した。 結果を表 5に示す。 上部消化管を経由した血液は、 ラテックス凝集法では検出することができな かった。 ヘモグロビンが、 胃酸や各種酵素の影響によって抗原性を失っているも のと考えられる。 他方 D N Aを指標とする本発明法では、 安定して血液を検出で きている。
【表 5】 上部消化管出血の検出
本発明法 オルトトリジン法 ラテックス凝集法 準 潜 血 食
血液経口投与後 1 曰 + 3 +
2曰 + 3 +
3曰 + 2 +
4曰 + 2 +
7曰 2 +
実施例 5 . —般検体への応用
大腸癌スクリーニングのために集められた糞便検体 4 4例を試料として、 従来 の糞便潜血の検出方法による結果と、 本発明を応用した出血検出方法による測定 結果を比較した。 これらの糞便は、 血液を添加する他は実施例 1 (本発明） 、 あ るいは 2 (従来法） と同じ操作により分析した。 結果は図 1 1に示した。 実際の 糞便検体においても、 従来のオルト トリジン法やラテックス凝集法では検出でき ない糞便潜血が本発明では検出できることが確認された。 配列表
配列番号： 1
配列の長さ ： 2 6 5
配列の型：核酸
鎖の数： 2本鎖
トホロジ一：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列の特徴 '
起源
生物名 ： ヒ ト 他の情報： Alu配列の BLUR8
配列
TGTAATCCGA GCACTTTGGG AGGCCAAGGA GGGCAGATCA CCTGAAGTCA 50
GGAGTTTGAG ACCAGCCTGG CCAACATGGT GAAACTCCAT CTCTACTGAA 100 AATACAAAAA TTAGCCAGGC ATGGTGATGC GTGCCTGGAA TCCCAGCTAC 150
TTAGGAGGCT GAGACAGAAG AATCCCTTAA ACCAAGAGGT GGAGGTTGCA 200
GTGAGCCGAG ATCGCACGGC TGCACTCCAG CCTGGTGACA GAGCGAGACT 250
CCATCTCAAA AAAAA 配列番号： 2
配列の長さ ： 1 5 3
配列の型：核酸
鎖の数： 2本鎖
トホロジ一：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列の特徴
起源
生物名 ： ヒ ト
他の情報： Alu配列の BLUR 1
配列
CACAAAGGGC CATAAAAATG TTCATAATCT GGTGGGTGTG GTGGCTCATG 50 CCTGTAATCC CAGCACTTTG GGAGGCCAAG GTGGGAGGAT GCCTTGAGTC 100 TAGGAGTTTG AGAGATGCCT GGATAACACA GAGAGACCCT CATCTCTACA 150 AAA 配列番号： 3
配列の長さ ： 3 0 2
配列の型：核酸
鎖の数： 2本鎖 トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列の特徴
起源
生物名 ： ヒ ト
他の情報： Alu配列の BLUR2
配列
GCGGGGCGTG GTAGCTCACA CCTGTAATCC CAATACTTTC GGAGGCTGAG 50 GTGGGTGGAT AACTTGACGT CAGGAGTTCA AGACCAGCTT GACCAACATG 100 GTGAAACCCC ATCTCTACTA AAAATACAAA AATTAGGCAG GGCTGGTGGC 150 ACGCACCTGT AACCCCAGCT ACTCAGGAGG CTGAGGCAGG AGAATCACTT 200 GAACCCTAGA GGCAGAGGTT GCAGTGAGCC GAGATCATGC TACTGTACCC 250 AGCCTGGGCA ACAGAGTGAG ATTCCATCTC AAAAAAAAAA AAAAAGAAAA 300 AA 配列番号： 4
配列の長さ ： 2 5 7
配列の型：核酸
鎖の数： 2本鎖
卜ホロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列の特徴
起源
生物名 ： ヒ 卜
他の情報： Alu配列の BLUR6
配列
CGGTGGCTCA CACCTGTAAT CCCAGCACTT TGGGAGGCCA AGGTGGGCAG 50 ATCACCTGAG CTCAGGAGTT TGAGACCAGC CTTGCCAACA TGGCAAAACC 100 CCGTCTCTAT TAAAAATACA AAAATTAGCC GGGCAAGGAG GTGGGTGCCT 150 GTAATCCCAG CTACTTGGGA GGCTGAGGCA GGAGAAACAC TTGAACCTGG 200 GAGAGCCGAG ATAGTGCCAC TGTACTCCAG CCTGGGCAAC AGAGTGAGAC 250 TCTGTCA 配列番号： 5
配列の長さ ： 2 0 1
配列の型：核酸
鎖の数： 2本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列の特徴
起源
生物名 ： ヒ ト
他の情報： Alu配列の BLUR7
配列
CTAACACAGT GAAACCCTGT CTCTACTAAA AATTCAAAAA TTAGCCAGGC 50 GTGGTGGCAT GCGCCTGTAG TCCCAGCTAC TTGGGAGGCT GAGGCAGGA 100 AATCGCTTGA ACCCAGGAGA TGGAGGCTGC AGTGAGACGA GATCCTGCCA 150 CCACACTCCA GCCTGGGCAA CAGAGCAAGA CTCCATCTCA AAAAACAAAA 200 A 配列番号： 6
配列の長さ ： 1 7 7
配列の型：核酸
鎖の数： 2本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列の特徴
起源 生物名 ： ヒ ト
他の情報： A lu配列の BLUR 10
配列
AAAAAAAAAA TTAGCCGGCG TGGTGACGGG CGCCTGTAGT CTCAGCTACT 50 CAGGAGGCTG AGGCAGGAGA ATGGCGTGAA CCTGGGAGGT GGAGCTTGCA 100 GTGAGCCGAG ATCGGGCCAT TACACTCCGG CCTGGGCGAC AGAGCGAGAC 150 TCCGTCTCAA AAAAAAAAAA AAAAAAA 配列番号： Ί
配列の長さ ： 2 8 0
配列の型：核酸
鎖の数： 2本鎖
トポロジー '·直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列の特徴
起源
生物名 ： ヒ ト
他の情報： A lu配列の BLUR 1 1
配列
TGTAATCCCA GCACTTTTGG GAGGCTGAGG AGGGATGGAT CACCTGAGGT 50 CAGGAGTTCA AGACCAGCCT GGCCAACATG GTGAAACCCC GTTTCTACTA 100 AAAATACAAA AATTAGCTGG GCATGGTGGT GGGCACCTGT AATCCCAGCT 150 ACTCGGGAGG CTGAGGCAGG AGAATTGCTT GAAACCAGGA GGCAGAGGTT 200 GCAGTGAGCT GAGATTGCGC CACTGTACTT CAGGCTGTGT GACAGAGTGA 250 GACTCCATCT CAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 配列番号： 8
配列の長さ ： 2 9 5
配列の型：核酸 鎖の数： 2本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列の特徴
起源
生物名 ： ヒ ト
他の情報： A lu配列の BLUR 13
配列
TCCAGGGGAG GGCTGGGCAT GGTGGCTCAC GTCCGTAATC CCAGCAGTTT 50 GGAAGGCTGA GGCAAGTGGA TCACTTTAAG TCAGGAGTTC AAGACCAGCC 100 TGGCCAACAT GGCAAAACCC CAACTCTACT AAAAACACAA AATTAGCCGG 150 GCGTGGTGGC GCATGCCTGT AGCCCCAGCT ACTCCTGAGG CTGAGGCAGG 200 AGAATCGCTT GAACCCGGGA GGCAGATGTT GCAGTGAGCC GAGATCACAC 250 CATTGCACTC CAGCCTGGGC AACAAGAGCG AAACTCCGTC TCAAA 配列番号： 9
配列の長さ ： 2 3 5
配列の型：核酸
鎖の数： 2本鎖
トホロジ一：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列の特徴
起源
生物名 ： ヒ ト
他の情報： A lu配列の BLUR 14
配列
CAAGAGGTCA GGAGTTCAAA ACCAAGCTGG CTAACTTGGT GAAACCCTGT 50 CTCTACTAAA AATACAAAAA TTAGCTGGGC ATGGTGGTGC ATGCCTGTAA 100 TCCCAGCTAC TCGGGAGGCT GAGGCGAGAG AATTGCTTGA ACCCAGGAGG 150 TGGAGGTTGC GATGAGCCGA GATCGCGCCA CTGCACTCCA GCCTGGGTGA 200 CAGTGCAAAA CTCTGTCTAA AAAAAAAAAA AGAAA 配列番号： 1 0
配列の長さ ： 2 4 1
配列の型：核酸
鎖の数： 2本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列の特徴
起源
生物名 ： ヒ ト
他の情報： Alu配列の BLUR19
配列
CCCAACACTT TGGGAGGCCG AGGTAGATGG ATCACCTAAG GTCAGGACTT 50 CAAAACCCAA CATGGCAAAA CACCATCACT GCTTAAAAAA AGTAATAAAA 100 AATTAGCCCA GTGTAATGAC ACACACCTGT AGTCTCAGCT CTCCTGGAAG 150 CTGAGGCAGG AGAATCGCTT GAACCCAGGA GGTGGAGGTT ACAGTGAGCC 200 (； AGATAGCGC CACTGCACTC CAGCCTGAGC AACAGAGGAA (；

Claims

請求の範囲
1 . 生体試料中におけるその生体に由来する細胞の存在または存在の痕跡を検出 する方法であって、 当該動物種に特異的な遺伝子を指標として検出することを特 徴とする細胞検出方法
2 . 生体試料が、 正常な状態ではその生体に由来する細胞を検出可能なレベルで 含まず、 この細胞の存在または存在の痕跡を検出することが生体の異常の指標と なるものである請求項 1の細胞検出方法
3 . 生体試料が糞便、 および尿からなる群から選択される請求項 2の細胞検出方 法
4 . 生体試料が糞便であり、 細胞が消化管組織に由来するものである請求項 3の 細胞検出方法
5 . 細胞が血液に由来するものである請求項 3の細胞検出方法
6 . 遺伝子をハイブリダィゼーションアツセィにより検出する請求項 1の細胞検 出方法
7 . 指標となる遺伝子が、 正常な細胞に存在するものである請求項 1の細胞検出 方法
8 . 動物がヒ トであり、 かつ動物種に特異的な遺伝子が Alu配列である請求項 7の 細胞検出方法
9 . 配列 1に示す塩基配列に対して 8 0 %以上のホモロジ一を持つ配列に対してハ イブリダイズする条件下でプローブをハイブリダイズさせることを特徴とする請 求項 8の細胞検出方法
1 0 . 生体試料中におけるその生体に由来する細胞の存在または存在の痕跡を検 出するための試薬であって、 当該動物種に特異的な塩基配列を持つ遺伝子フロー ブからなる細胞検出用試薬
1 1 . 動物がヒ トであり、 かつ遺伝子ブローブの塩基配列が Alu配列、 またはその 部分配列である請求項 1 0の細胞検出用試薬
1 2 . 遺伝子ブローブが配列 1〜 1 0に示す塩基配列から選択された塩基配列、 またはその部分配列を持つ、 請求項 1 1の細胞検出用試薬
1 3 . 塩基配列が配列 1から選択される請求項 1 2の細胞検出用試薬
1 4 . 糞便中に出現するその糞便が由来する動物種に特異的な遺伝子を指標とし て血液由来の細胞を検出することを特徴とする糞便潜血検出方法
1 5 . 生体試料が由来する動物種に特異的な塩基配列を持つ遺伝子フローブから なる糞便潜血検出用試薬
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