JPH04166765A - 糞便中のヒトヘモグロビン測定のための装置及び該測定に使用する試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は糞便中のヒトヘモグロビンを測定するための装
置及び測定のために使用されるキットに関する。さらに
詳しくは　、本発明は大腸癌の予備的スクリーニング法
として有用な糞便中ヒトヘモグロビン測定のための免疫
学的固相分析装置及び測定のために使用されるキットに
関する。

［従来の技術］ 糞便中のヘモグロビンの検出は、消化管出血の証明とな
り、消化管疾思のスクリーニング法、特に大腸癌の予備
的スクリーニング法として広く用いられている。

糞便中のヘモグロビンの検出には従来から化学的糞便潜
血反応法や免疫学的糞便潜血反応法が用いられている。

一般に化学的反応法は敏感であり、比較的操作も簡便で
しかも低コストである点から広〈実施されている。しか
し、化学的反応法は血液中のヘモグロビンのヘム部分に
由来する偽ペルオキシダーゼ活性を測定するものである
ため、ヒトヘモグロビンに対する種差特異性がなく、野
菜や肉などの食餌に由来するペルオキシダーゼ活性或い
は偽ペルオキシダーゼ活性の影響を受けてしまう。その
ため検査前に食餌を制限する必要がある。したがって、
被検者の食餌如何によっては、全くその結果が信頼でき
ないという問題もある。このように実質上糞便中のヒト
ヘモグロビンの測定を非常に困難なものにしている。

これに対し免疫学的反応法は、ヒトのヘモグロビンに対
する特異抗体を使用できるため、ヒトのヘモグロビンに
対する特異性が極めて高く、かつヒトヘモグロビンを高
感度に測定することが可能である。そのため、本法は一
般に広く使用されるようになりつつある。このようなも
のとして、抗ヒトヘモグロビン抗体をラテックス粒子或
いは赤血球に結合させた抗体感作粒子と糞便中のヒトヘ
モグロビンとを反応させる、いわゆる凝集反応法や、酵
素標識抗ヒトヘモグロビン抗体を用いるエンザイムイム
ノアッセイ（ＥＩＡ）がある。

［発明が解決しようとする課題］ 上記のように利点が期待される免疫学的反応法であるが
、前記した凝集反応法やＥＩＡは、検体試料の取り扱い
方法、その検体試料の希釈方法及び操作、さらにはその
測定手技等が非常に煩雑である。また凝集反応法はかな
りの熟練が必要とされ、その測定結果を安定に保存する
ことも困難である。ＥＩＡはその結果を得るのに時間を
要するという問題がある。

さらに凝集反応法においては、検体溶液及び試薬を反応
板上に滴下した後、撹拌棒でその反応混合物を撹拌しな
ければならない。一般には検体溶液及び試薬は、比較的
少量が使用されることから、均一な撹拌を行うことには
かなりの困難が伴い、結果の再現性にも問題を生じる。

次にこうして撹拌された反応混合物は、さらに３分間程
度その反応板を揺動することにより処理される。このよ
うな操作は時間がかかる、また手数のかかる操作である
。さらにこの凝集反応法においては、糞便中から抽出さ
れたヒトヘモグロビン濃度が測定範囲を越える場合には
、館性と判断される（プロゾーン現象）ことから、この
ような場合さらに検体を希釈して再試験する必要がある
。また−船釣には未知量である検体中のヒトヘモグロビ
ン濃度をある程度ｙｊ製しなければならないという大き
な問題点がある。この凝集反応法ではその測定結果は、
その凝集像により得られるのであるが、その凝集像は原
理的に不安定なものであることから、その測定結果を安
定に保存することができないことから、大量の検体数の
ものを一度に扱うことが困難であるという問題がある。

一方ＥＩＡによる測定においては、現在一般に行われて
いる手法としては固相化抗体に検体中のヒトヘモグロビ
ンを反応させた後、洗浄処理し、次にその洗浄後に酵素
標識抗体を反応させ、さらに酵素に対する基質を反応さ
せて、一定時間の反応処理を行った後、反応停止剤を橋
板し、その反応を停止させた後にその発色を測定、結果
を判定するというように、最終的な結果を得るまでに多
くの処理ステップを経なければならず、その操作が煩雑
である。さらにその各反応処理には３０分間から数時間
程度の時間がかかり、即時に結果を得ることが困難であ
る。

また、従来より用いられている糞便中ヘモグロビンの抽
出液には、非特異的反応を防止する目的でカゼインやゼ
ラチンが添加されているが、これらは糞便中に存在する
ヒト及び微生物由来のタンパク賃分解酵素の影響を受け
、安定性が悪く十分に非特異的反応を防止できないとい
う欠点を有している。

［本発明の目的］ 本発明は糞便中のヒトヘモグロビンを特異的かつ高感度
に測定することができ、測定操作が簡便で、更なる特別
な装置を必要としない且つ目視検出が可能であり、かつ
迅速に測定することができ、マススクリーニング等の大
量検体への応用も可能なヒトヘモグロビン測定装置、及
び優れた安定性を有するヘモグロビン抽出液であって、
該測定装置で使用するに特に適したものを提供すること
を目的とするものである。

［課題を解決するための手段］ 本発明は、多孔性支持体、スペーサー層及び吸収層より
なり、ヒトヘモグロビンを簡便かつ迅速に検出するため
の免疫学的固相分析装置及びヒトヘモグロビンを安定に
測定することができる糞便中ヘモグロビンの抽出試薬を
提供するものである。

多孔性支持体は、上面と下面とを有し、該上面にはヒト
ヘモグロビンに対する特異抗体が同相化されている試験
区域を有している。該下面部分はスペーサー層と接して
いる。

スペーサー層は、後述する吸収層へ移行した標識物質と
試験区域に特異的に結合した標識物質とを区別するため
、すなわち吸収層へ移行した標識物質の色が多孔性支持
体を通して見えないようにするものであり、装置の各層
を流れる試薬等の流速を調節する流れｒ１４節層として
の機能を有するものではない。

吸収層は、スペーサー層の下部に位置し、試験区域に特
異的に結合しなかった試料或い・は試薬を吸収し、多孔
性支持体への試料或いは試薬の逆流を防止する働きをす
るものである。

本発明の装置は、セレン、テルル或いは硫黄などの目視
可能な非金属物質のコロイド粒子、特にはセレンコロイ
ドを標識物質としたトレーサーを用いて、糞便中のヒト
ヘモグロビンを測定するために使用される。

本発明の好ましい態様において、多孔性支持体は、セル
ロース、ニトロセルロース、アセチルセルロース、テフ
ロン等の孔径が比較的小さく、滑らかで均一な表面を持
つフィルター素材であり、当業者によく知られているも
のから任意に選択されるが、好ましくは１〜７μｍの孔
径を有するニトロセルロース膜である。該膜の上面には
抗ヒトヘモグロビン抗体、特に好ましくは抗ヒトヘモグ
ロビン・モノクローナル抗体が０．１〜０．５μｇ　／
　ｍ　ｍ　”の密度で固相化されている試験区域を有す
る。試験区域に固相化される抗ヒトヘモグロビン抗体は
、測定結果を容易に目視判定できるように、−本ないし
は複数本の棒状、円形状或いは＋表示などの形状にプリ
ントされることが望ましい。

本装置のスペーサー層としては、吸収層へ移行したコロ
イド粒子標識試薬の色が、多孔性支持体を通して見えて
しまうことを防ぐために、コロイド粒子標識試薬と非特
異的に結合しないような物質、例えばセルロース、ガラ
ス繊維、無機ｍ維など吸収性に優れ、弾力の有る当業者
によく知られている素材から任意に選択されるが、特に
好ましくはライドール　（ｇｌａｓｓ　ｆｉｂｅｒ　ｗ
ｉｔｈ　ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ−ａｌｃｏｈｏｌ　ｂｉｎ
ｄｅｒ　：　Ｌｙｄａｌｌ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｐａ
ｐｅｒ　［１ｆｖｆｓｉｏｎ　Ｉｎｃ、）を使用するこ
とができる。

吸収層は任意の吸収材料がら構成することもできるが、
当業者によく知られているセルロース、パルプ、無機繊
維等の吸収性の高い円筒状に成形可能な素材、好ましく
はグラスファイバー、特に縦方向のみの繊維からなるグ
ラスファイバーを用いることが好ましい。

本装置は適当な容器中に納められる。容器中に保持され
た本装置の具体化の一つの態様を第１図に示す。本装置
を納める容器１ｏは、免疫学的反応の液体残漬、すなわ
ち多孔性支持体上の試験区域に結合しなかった試料及び
試薬を吸収するための吸収層２０を保持する。吸収層２
ｏは、その上面をスペーサー層３０に接しており、さら
にスペーサー層３０の上面に多孔性支持体４ｏを有する
。

吸収層２０、スペーサー層３０及び多孔性支持体４０は
、容器１０及び漏斗状の形態を有するファンネル部５０
により、押えられている。

容器１０は、複数の長い突出部１１が内側に放射状に伸
びており、該突出部１１の最も内側の縁が吸収層２０の
外周に接触することにより吸収層２０を容器１０の内部
表面から離して保持する役目をしている。これによって
吸収層２０の回りに通気孔１２を提供する。通気孔１２
は容器１０或いはファンネル部５０のいずれかに設けら
れた刻みによる通気孔に通じており、これにより実質的
に通気空間を確保することができる。

容器１０及びファンネル部５０は、ポリスチレン、ポリ
プロピレン、ポリカーボネイト、アクリルスチレン等の
溶出物のないプラスチック樹脂を用いることができる。

上記本発明の装置を用いて検体中のヘモグロビンを測定
するに当たっては、先ず適切な抽出液に糞便からのヘモ
グロビンを溶解せしめたｆ麦、任意に濾過されたサンプ
ル溶液を本発明装置の試験区域に滴下される。この滴下
される量は１滴から数滴までの任意の量とすることがで
きる。こうしてサンプル溶液が滴下された後、本発明の
装置は、数秒から数分間の任意の時間静置されるが、好
ましくは２〜３分間、より好ましくは３分間反応のため
＃Ｐ置される。こうして適当に反応させた後、標識抗ヒ
トヘモグロビン抗体試薬、より好適にはセレンコロイド
標識化抗ヒトヘモグロビン抗体を滴下せしめる。錘板す
る試薬の量は任意に選択することができる。次にこのよ
うにして試薬が滴下された本発明の装置は、数秒から数
分間、好ましくは２〜５分間、より好ましくは３分間反
応せしめられる。この反応後、適当な洗浄液で１回程度
洗浄後、本装置の試験区域の結果を目視判定することに
より測定がなされる。

このように本発明の装置を使用すれば、簡単な操作で、
短時間のうちに結果を得ることができ、さらにその処理
操作も極めて簡単な手法で行うことができる。

上記第１図に示された本発明の具体化された装置は、最
適な例の一つを示すものであるが、同様な作用効果及び
機能を果たすものであれば本発明に基づいて種々の改変
をなすことができる。そのように改変された例のものと
しては、特許請求の範囲に示された各要素を備えたもの
が挙げられ、円筒型、円柱型、コンパクト型などの様々
な外形が考えられる。

本発明のキットは、使い捨て容器に収納された試験装置
、コロイド粒子標識物質及びヘモグロビン抽出液とから
なる。

コロイド粒子はコロイド状金属粒子を使用することも可
能であるが、好ましくはセレン、テルル或いは硫黄など
の目視可能な非金属コロイド、特に好ましくはセレンコ
ロイドが使用される。コロイド粒子標識ｍＭは、コロイ
ド粒子に抗ヒトヘモグロビン抗体が結合したコロイド粒
子標識抗体、或いはコロイド粒子にヒトヘモグロビン又
はヒトヘモグロビンと免疫学的に同等の誘導体が結合し
たコロイド粒子標識抗原である。コロイド粒子標識物質
は、試験区域において特異的に結合し、目視可能な信号
を与える。

試験区域における該信号の目視による判定を容易なもの
にするためには、非特異的な結合によるバックグラウン
ドを回避するために、抗体が結合している膜をブロッキ
ング剤により前処理する必要がある。しかし、膜の前処
理によるブロッキングは、製造工程が複雑になると共に
、抗体が結合した躾を安定に保存するために厳密にその
保存条件を決める必要があり、製造上大きな制約が課さ
れる。

一方、尿や血清を検体とする免疫学的試験法においては
、通常、緩衝液中にカゼインやゼラチンなどを添加し、
非特異的結合による偽陽性の問題を解決している。しか
し、糞便検体においては糞便中に含有されるヒト及び微
生物由来のタンパク質分解酵素によりカゼインやゼラチ
ンが分解されるため安定性が悪く、これらの物質を添加
することによっては非特異的結合による偽陽性を回避す
ることができない。本発明キット中の糞便中ヘモグロビ
ンの抽出液は、ブロッキング剤としてポリオキシエチレ
ン系非イオン性界面活性剤、特に好ましくはポリオキシ
エチレンモノラウリン酸ソルビタン（ＴＷＥＥＮ　　２
０）を使用しており、糞便中に存在する酵素による影響
を受けない、安定性に優れた抽出液である。本発明にお
いては、このような目的を達成し、同等の効果を有する
ものであれば、適当な実験を行うことにより本発明に従
って見出し、それが同様に用いられることが理解されよ
う。さらに、試験区域である膜の前処理を必要としない
ため、製造上の利点をも有している。本発明の糞便中ヒ
トヘモグロビン測定用キットは糞便中のタンパク質分解
酵素によるバックグラウンド等の悪影響を生じさせない
安定性に憬れた抽出液を提供するものである。

以下に非限定的実施例によりさらに本発明の詳細な説明
する。

［実施例］ 実施例１　試薬の調製方法 （１）多孔性支持体への抗ヒトヘモグロビン抗体の同相
化 ５μｍの孔径を有する多孔性ニトロセルロース膜に、０
．１〜０．５μｇ　／　ｍ　ｍ　２の抗ヒトヘモグロビ
ン・モノクローナル抗体を固相化し試験区域とするため
に、１％ショ糖含有１０ｍＭｈリス塩Ｍ緩衝液（ｐＨ７
，２）にヒトヘモグロビンに対するモノクローナル抗体
を溶解した抗体溶液（１，５ｍｇ／ｒｎｌ）をプリント
し、抗体を固相化した。

（２）セレンコロイド標識抗ヒトヘモグロビン抗体の作
製 セレンコロイド粒子溶液（ＯＤ５３Ｑ、、−＝　１５　
）のｐＨを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，２）を
用いて７゜２に調製する。次いで抗ヒトヘモグロビン・
モノクローナル抗体を最駐濃度が３０μｇ　／　ｍ　１
となるようにコロイド粒子溶液に加え室温で６０分間溶
液を混合する。混合徨、該溶液の０．５％量のポリエチ
レングリコール２０．０００（シグマ社；平均分子量約
２０，０００　）を添加し、室温で４時間溶液を混合す
る。該溶液を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してコ
ロイド粒子を集める。集めたコロイド粒子を再度ポリエ
チレングリコール２０，０００に懸濁させ、さらに５０
００ｒｐｍで１０分間遠心分離した壕、得られたコロイ
ド粒子を１％アルカリ処理カゼイン、０．２５％カゼイ
ン、０．５％ＢＳＡ含有５５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）中に懸濁させ、セレンコロイド標識抗ヒトヘ
モグロビン抗体溶液とした。

実施例２　糞便中のヒトヘモグロビンの測定的１０ｍｇ
の糞便を０．１％のＴＷＥＥＮ　　２０．０．５％のウ
シ血清アルブミン及び０．１％のＮ　ａ　Ｎ　３を含有
する０、１Ｍｈリス塩Ｍ緩衝液（ｐＨ７，６）４ｍｌに
溶解させた後、濾過したものをサンプル溶液とする。該
サンプル溶液１００μｌを本装置の試験区域に滴下し、
３分間反応させる。反応後、セレンコロイド標識抗ヒト
ヘモグロビン抗体溶液１００μｍを滴下し、３分間反応
させる。１０ｍＭトリス塩＃ｌ緩衝液（ｐＨ７゜２）５
００μｍで洗浄後、試験区域における色を目視判定する
。

［発明の効果］ 本発明は糞便中のヒトヘモグロビンを測定する方法とし
て、操作が簡単で特別な装置を必要としない目視判定が
可能な、大腸癌の予備的なスクリーニング方法として広
く応用可能な免疫学的測定方法である。

測定は数分以内に終了することが可能であり、測定結果
の安定性にも優れている。また、いわゆる「プロゾーン
現象」による偽陰性がないため、試験検体を希釈するこ
となく広範囲の検体を測定することが可能である。

さらに、糞便中のタンパク質分解酵素に安定な糞便中ヘ
モグロビンの抽出液を使用することにより、結果判定に
悪影響を与えるバックグラウンドの問題をも解決した優
れた糞便中ヒトヘモグロビンの測定用キットを提供する
ものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は容器に組み込まれた本発明装置の断面図である
。 第２図は組み立てられる装置の種々の構成部材間の関係
を示す本発明の装置の正面図である。 図中、１０・・・容器 １１・・・突出部 １２・・・通気孔 ２０・・・吸収層 ３０・・・スペーサー層 ４０・・・多孔性支持体 ５０・・・ファンネル部 第１図 第２図

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）目視可能なコロイド粒子標識物質を用いる糞便中
   のヒトヘモグロビンの存在を検出するための装置であつ
   て、 上面及び下面を有し、該上面にはヒトヘモグロビンに対
   する特異抗体が固相化されている試験区域を有する多孔
   性支持体； 多孔性支持体の下方に位置し、試験区域に特異的に結合
   しない試料或いは試薬を受入れ、多孔性支持体への試料
   或いは試薬の逆流が起こらないように働く吸収層；及び 多孔性支持体の下面と吸収層の間に位置し、吸収層に吸
   収されたコロイド粒子標識物質の色が多孔性支持体を通
   して見えないように働くスペーサー層； とからなることを特徴とする糞便中のヒトヘモグロビン
   の検出装置。
2. （２）ヒトヘモグロビンに対する特異抗体が、抗ヒトヘ
   モグロビン・ポリクローナル抗体である特許請求の範囲
   第１項に記載の検出装置。
3. （３）ヒトヘモグロビンに対する特異抗体が、抗ヒトヘ
   モグロビン・モノクローナル抗体である特許請求の範囲
   第１項に記載の検出装置。
4. （４）目視可能なコロイド粒子がセレン、テルル或いは
   硫黄などの非金属物質のコロイドである特許請求の範囲
   第１項に記載の検出装置。
5. （５）目視可能なコロイド粒子が、セレンのコロイドで
   ある特許請求の範囲第１項に記載の検出装置。
6. （６）コロイド粒子標識物質がコロイド粒子で標識され
   た抗ヒトヘモグロビン・ポリクローナル抗体である特許
   請求の範囲第１項に記載の検出装置。
7. （７）コロイド粒子標識物質がコロイド粒子で標識され
   た抗ヒトヘモグロビン・モノクローナル抗体である特許
   請求の範囲第１項に記載の検出装置。
8. （８）コロイド粒子標識物質がコロイド粒子で標識され
   たヒトヘモグロビン或いはヒトヘモグロビンと免疫学的
   に同等の物質である特許請求の範囲第１項に記載の検出
   装置。
9. （９）コロイド粒子標識物質及びポリオキシエチレン系
   非イオン性界面活性剤を含有する糞便中のヘモグロビン
   の抽出液、及び特許請求の範囲第１項に記載の装置とか
   らなるヒトヘモグロビンの測定用キット。
10. （１０）ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が
    ポリオキシエチレンモノラウリン酸ソルビタンである特
    許請求の範囲第９項に記載のヒトヘモグロビンの測定用
    キット。