JP2002082117A - 検査キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 イムノクロマトグラフ法に基づいて被検出物
質を測定するにあたり、目視判定性に優れ、高い検出感
度を得ることができる検査キットを提供する。 【解決手段】 検体添加部位と微粒子捕捉部位とが設け
られたメンブランと、酵素と、前記酵素に対する基質と
を備える検査キットであって、検体添加部位には、被検
出物質と特異的に結合する物質とビオチン又はアビジン
とが固定化された微粒子が保持されており、前記微粒子
捕捉部位には、被検出物質と特異的に結合する物質が固
定化されており、前記酵素にアビジン又はビオチンが固
定化されており、微粒子が合成高分子からなるラテック
ス粒子であり、その表面負電荷が０．０１ｍｅｑ／ｇ〜
０．５ｍｅｑ／ｇであり、粒子径が０．０１μｍ〜５．
０μｍの範囲とされている検査キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、酵素反応及び免疫
反応を利用した検査キットに関し、より詳細には、被検
出物質の有無及び量を特異的な結合反応を利用して簡便
にかつ迅速に測定することが可能とされている検査キッ
トに関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、抗原−抗体による特異的反応を利
用して、特定の抗原または抗体よりなる被検出物質を検
出する免疫測定法が広く用いられている。この種の免疫
測定法では、免疫反応により試料中の被検出物質を、微
粒子に感作させた抗体または抗原と結合し、結合によっ
て生じる微粒子の凝集状態を測定する凝集法が簡便であ
り、目視判定が可能であるため一般的に用いられてい
る。

【０００３】また、試料中の被検出物質に、放射性同位
元素、酵素または蛍光物質からなる標識物質により標識
した抗体または抗原を免疫反応により結合し、結合した
標識物質を測定する放射免疫測定法、酵素免疫測定法ま
たは蛍光免疫測定法も使用されている。

【０００４】これらの免疫測定法の機構としては、競合
型反応及びサンドイッチ型反応が広く用いられている。
サンドイッチ型反応の測定法としてイムノクロマトグラ
フ法が知られており、試料中の抗原または抗体よりなる
被検出物質を検出するために、各種操作方法が提案され
ている。

【０００５】例えば、米国特許第４，１６８，１４６号
には、抗体が固定化された多孔質試験小片を用いる方法
が開示されている。また、米国特許第４，０９４，６４
７号、第４，２３５，６０１号及び４，３６１，５３７
号には、免疫学的及び他のタイプの特異的結合アッセイ
において、試薬をクロマトグラフ溶媒移動させて毛管現
象により展開・移動させる方法が開示されている。

【０００６】この方法では、ニトロセルロースやナイロ
ン等からなる多孔性膜により構成されているクロマトグ
ラフ媒体上に設けられた検体添加部位に検体が加えら
れ、溶液が展開され、多孔性膜上に設けられた検出部位
にて呈示される標識物の着色度合いにより検体中の被検
出物質の有無が判定される。

【０００７】標識物質としては、着色ラテックス粒子、
金属コロイド、非金属コロイド、色素、または酵素等が
用いられている。着色ラテックス粒子を用いた方法で
は、例えば、あらかじめ、多孔性膜上に抗原もしくは抗
体を固相化しておき、膜の一端に抗体もしくは抗原を結
合させた着色ラテックス粒子を載置する。尿や血清等の
検体が添加されると、検体中の抗原もしくは抗体と着色
ラテックス粒子とが、多孔性膜の有する毛細管現象の作
用により順次拡散・移動し、展開する。この場合、免疫
反応により生じた抗原もしくは抗体−着色ラテックス粒
子複合体が、固相化されていた抗原もしくは抗体に到達
し、その部位で抗原抗体反応が起こり、着色ラテックス
粒子が捕捉された度合いを色の濃度により目視により観
察することができる。

【０００８】すなわち、クロマトグラフ媒体に形成され
た反応部位に、固定化された抗体が固定化試薬となり、
該固定化試薬に被検出物質である抗原を介して感作標識
微粒子が特異的に結合し、その結果、感作標識微粒子が
反応部位に捕捉されることにより生じる信号の有無また
は強度を目視により判定することにより、試料中の検出
物質の存在の有無または量が測定される。

【０００９】上記イムノクロマトグラフ法において、標
識微粒子を調製するための微粒子としては従来、金、白
金、銅、酸化鉄等のコロイド状金属粒子またはコロイド
状酸化物粒子、硫黄等のコロイド状非金属粒子及び染料
粒子等が用いられている。このような微粒子としては、
一般に、０．００５μｍ〜１０．０μｍの粒子径を有す
るものが市販されている。

【００１０】他方、イムノクロマトグラフ法に用いられ
るクロマトグラフ媒体としての多孔性膜または繊維状膜
は、一般には、ガラス繊維状シート、濾紙、ナイロンシ
ート、ニトロセルロースシート、ポリエチレンシート等
からなり、これらは、その種類によって、０．０１μｍ
〜５０μｍの範囲の孔径を有する多孔性膜や繊維状膜で
あることが多い。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、標識微
粒子として、コロイド状金属粒子、コロイド状金属酸化
物粒子またはコロイド状非金属粒子を用いる場合、その
調製条件または粒径によって色調が決定される。従っ
て、所望とする鮮明な濃い色調を呈する標識微粒子を得
ることができないことがあった。

【００１２】他方、染料粒子では、その色調及び色の濃
さを任意に選択することができ、鮮明な濃い色調を呈す
る標識微粒子を得ることができる。しかしながら、染料
粒子を用いた場合においても、クロマトグラフ媒体上で
捕捉された標識微粒子の積み重ねにより形成される捕捉
ラインの色調は弱く、検出物が微量の場合には検出が非
常に困難であった。また、イムノクロマトグラフ法の反
応部位におけるシグナル強度を所望の強度レベルとする
ことが困難であり、かつ正確な目視判定が困難であり、
検出感度を高めることができないという問題があった。

【００１３】本発明の目的は、上述した従来技術の欠点
を解消し、被検出物質の目視による判定を容易にかつ確
実に行なうことができ、従って、高い検出感度を実現し
得るイムノクロマトグラフ法用の検査キットを提供する
ことにある。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明は、検体添加部位
と被検出物質捕捉部位とが設けられたメンブランと、酵
素と、酵素に対する基質とを備える検査キットであっ
て、前記メンブランには、試料中の検出すべき被検出物
質と特異的に結合する物質とビオチン又はアビジンとが
固定化された微粒子が保持されており、被検出物質捕捉
部位には、被検出物質と特異的に結合する物質が固定化
されており、上記酵素にはアビジン又はビオチンが固定
化されており、上記微粒子が合成高分子からなるラテッ
クス粒子であり、粒子径が０．０１μｍ〜５．０μｍの
範囲であることを特徴とする。

【００１５】上記微粒子には、好ましくは、アビジンが
固定化され、上記酵素にはビオチンが固定化されてい
る。また、本発明に係る検査キットでは、好ましくは、
単糖類または二糖類が含有されている。

【００１６】本発明に係る検査キットの特定の局面で
は、上記メンブレンとして、多孔性膜または繊維状膜が
用いられる。以下、本発明の詳細を説明する。

【００１７】なお、本明細書において、「アビジン」と
は、ビオチンに特異的に強く結合し得るタンパク質の総
称を意味するものとし、アビジンとしては、より具体的
には、卵白アビジン、ストレプトアビジン、遺伝子組み
替えアビジン等を挙げることができる。

【００１８】アビジンは、同一のサブユニット４個から
形成されるタンパク質であり、各サブユニットにはビオ
チン結合部位が一箇所づつ存在する。従って、１分子の
アビジンには、４分子のビオチンが結合され得る。ま
た、各サブユニットは共有結合により結合していないた
め、高い熱が加えられた場合には各サブユニットに開裂
することが知られている。そこで、アビジンの各サブユ
ニット間が架橋、すなわち分子内架橋されているものも
用いることができる。また、これらのアビジンやビオチ
ンが様々に化学修飾されていてもよく、遺伝子組み替え
等によりアミノ酸等が置換されていてもよい。

【００１９】本発明においては、被検出物質と特異的に
接合する物質とアビジン又はビオチンとが固定化された
標識微粒子と、被検出物質とがクロマトグラフ上で反応
され、あるいはあらかじめ反応されたものをクロマトグ
ラフ上に添加し、クロマトグラフ上の捕捉部位において
被検出物質と標識微粒子との複合体を捕捉する。しかる
後、ビオチンまたはアビジンで標識された酵素をクロマ
トグラフ上に展開し、捕捉された微粒子上のアビジンま
たはビオチンとの反応により、酵素を捕捉部位に留置さ
せる。同時に、あるいはしかる後、酵素に対する基質が
クロマト上に展開され、捕捉部位にて酵素と基質とが反
応するので、捕捉ライン上にて発色させることができ
る。

【００２０】上記酵素としては、特に限定されるわけで
はないが、アルカリフォスターゼ、ペルオキシダーゼ、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルコール脱水素酵素、グ
ルコース−６−リン酸脱水素酵素、キサンチンオキシダ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ、インベルターゼ、アセ
テートキナーゼ、グルコース脱水素酵素、ピルビン酸キ
ナーゼ、ウレアーゼ等が挙げられる。好ましくは、アル
カリフォスターゼ、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラク
トシダーゼが用いられる。

【００２１】本発明において、上記微粒子を構成するた
めのラテックス粒子としては、ポリスチレン、スチレン
−スルホン酸（塩）共重合体、スチレン−メタクリル酸
共重合体、アクリルニトリル−ブタジエン−スルホン酸
共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、
酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等からなる合
成高分子粒子を挙げることができる。

【００２２】また、基質としては、上述した酵素の基質
となるものを任意に用いることができる。例えば、アル
カリフォスターゼに対しては、ｐ−ニトロフェニルリン
酸、ペルオキシダーゼには５−アミノサリチル酸やｏ−
フェニレンジアミン、３，３’５，５’−ｔｅｔｒａｍ
ｅｔｈｙｌｂｅｎｎｉｚｉｎｅ、２，２’−Ａｚｉｎｏ
ｄｉ−３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｉｌｉｎｅ−
６’−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ等を用いることがで
きる。

【００２３】ラテックス粒子には様々な官能基を付与さ
せることができるので、非検出物質と特異的に接合する
物質として、被検出物質に対する抗原または抗体、ある
いはリガンド等を容易に結合し、固定化することができ
る。また、ラテックス粒子にはアビジンまたはビオチン
を共有結合等の化学結合等により容易に結合し、固定化
することができる。

【００２４】また、ラテックス粒子は、その表面電荷
が、負電荷で０．０１〜０．５ｍｅｑ／ｇであることが
好ましい。さらに、表面にスルホン酸基やカルボキシル
基等が導入されたラテックス粒子も適宜使用することが
できる。

【００２５】本発明における上記ラテックス粒子は、そ
の粒子径が、０．０１μｍ〜５．０μｍの範囲にあるこ
とが好ましく、より好ましくは０．０２μｍ〜３．０μ
ｍである。

【００２６】上記ラテックス粒子は、白色あるいは透明
であることが好ましく、また若干着色されている場合に
おいても、酵素の発色による色調を妨害しなければ使用
することができる。

【００２７】ラテックス粒子が液状あるいは乾燥状態で
検査キットに設置される場合、検査キットが糖を含有す
ることが好ましい。糖としては、エリスリトール、キシ
ロース、グルコース、フルクトース、ソルビトール、マ
ンニトール、スクロース、トレハロース、マンノース、
ラクトース、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、ポ
リデキストロース等及びこれらの修飾体等を挙げること
ができるが、特に限定されるものではないが、単糖類ま
たは二糖類あるいはこれらの修飾体が好適に用いられ
る。

【００２８】クロマトグラフ媒体である試験片について
は、一般に毛細管現象を発現する公知の適宜の材料を用
いることができる。例えば、セルロース、ニトロセルロ
ースのようなセルロース修飾体；ナイロン、ポリエチレ
ン、濾紙、ガラス繊維等を挙げることができるが、多孔
性膜や繊維状膜からなるクロマトグラフ媒体が好ましく
用いられる。特に、好ましくは、ニトロセルロース膜、
ナイロン膜、ポリエチレン膜、ガラス繊維膜または濾紙
等の多孔性膜もしくは繊維状膜が用いられる。

【００２９】これらの試験片には、検出ゾーンとして、
試料中の検出すべき被検出物質と結合可能な固定化試薬
を含む少なくとも１つの反応部位が設けられている。固
定化試薬としては、例えば、被検出物質が抗原の場合、
これに対して特異的なポリクローナル抗体、モノクロー
ナル抗体、リガンド、または被検出物質が抗体等の場合
には、対応する抗原や抗原性を有するペプチド等を含有
する試薬が挙げられる。これらの試薬は、上記クロマト
グラフ媒体上に滴下され、あるいは塗布され、乾燥され
ることにより、固定化することができる。

【００３０】試験片の大きさについては特に限定されな
いが、例えば、幅３〜１０ｍｍ×長さ２０〜１５０ｍｍ
程度のストリップ状のものが、取り扱い容易であるため
好ましい。試験片の厚みは、１０μｍ〜１ｍｍ程度のも
のがが取り扱い容易であり好ましい。また、吸水力のあ
る濾紙等のパッドを試験片の上部に貼付してもよい。

【００３１】試験片の一部または全部にウシ血清アルブ
ミン、カゼイン、糖類または界面活性剤等を含有せても
よい。ラテックス粒子が乾燥され保持されている同時
に、ラテックス粒子が保持されている部位に糖を含有さ
せることが好ましい。糖としては、特に限定されない
が、前述した各種糖及びその修飾体が用いられ、単糖類
または二糖類あるいはこれらの修飾体が好ましく用いら
れる。

【００３２】本発明に係る検査キットで用いられる試料
については、特に限定されないが、例えば、血液、血
清、血漿、唾液、汗、尿、乳汁、胸水、粘膜液、髄液、
腹腔液、羊水、糞便等のような生理学的な流体、発酵ブ
ロス、細胞培養または化学反応混合物などから得たもの
等、任意である。生物学的流体または生理学的流体の他
に、他の液体サンプル、例えば、水や食品の製造検定サ
ンプル、水質・土壌検査サンプル等であってもよい。ま
た、これらの試料は、適宜、緩衝液等で希釈して用いら
れてもよく、濃縮、濾過、熱処理、凍結融解、抽出操
作、妨害成分の不活化あるいは試薬の添加等の前処理を
施されたものであってもよい。

【００３３】また、試薬には、ブロッキング剤、緩衝
液、血液凝固抑制剤、または界面活性剤等をあらかじめ
ラテックス粒子とともに乾燥して保持させて含有させて
おいてもよい。

【００３４】

【発明の実施の形態】以下、本発明の具体的な実施例及
び比較例を挙げることにより、本発明をより詳細に説明
する。なお、本発明は以下の実施例に限定されるもので
はない。

【００３５】（実施例１） （１）ＨＢｓ抗原固定化多孔性膜の作製 ニトロセルロースメンブレン（日本ミリポア社製、品
番：ＳＲＨＦ、厚み１００μｍ，バッキングコートあ
り）を幅２０ｃｍ×長さ５ｃｍの矩形形状に切断し、得
られた矩形のニトロセルロースメンブレンの上端から３
０ｍｍの位置に、ＨＢｓ抗原を２．０ｍｇ／ｍｇ濃度で
含有する１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を１
μＬ／ｃｍとなるようにライン状に塗布した。３７℃で
２時間乾燥した後、１％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン
（ＤＩＦＣＯ社製）の１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．５）溶液に１０分間浸漬し、ブロッキング処理を行
なった。しかる後、０．１％（ｗ／Ｖ）のラウリル硫酸
ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
にて洗浄後、室温にて乾燥した。このようにして、ＨＢ
ｓ抗原固定化多孔製膜を得た。

【００３６】（２）ＨＢｓ抗原及びアビジン結合ラテッ
クス粒子の作製 カルボキシル基含有ラテックス粒子（積水化学工業社
製、白色カルボラテックス、粒子径０．３μｍ）の１％
（ｗ／ｖ）の分散液１．０ｍＬに、２０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ５．５）９ｍＬを加え、１５０００ｒｐｍにて
２０分間遠心分離した。得られた沈渣を２％（ｗ／ｖ）
の１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカ
ルボジイミドヒドロクロライドを含有する２０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ５．５）に懸濁し、３７℃で１時間混和
した。しかる後等、混和液を１５０００ｒｐｍで遠心分
離し、沈渣を０．２Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ８．５）４ｍ
Ｌに懸濁させた。得られた懸濁液にＨＢｓ抗原の０．５
ｍｇ／ｍL −０．２Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍ
Ｌを加え、十分混和し、３７℃で１時間攪拌した。

【００３７】未反応のＨＢｓ抗原を除去するために、１
５００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈渣を０．２Ｍほ
う酸緩衝液（ｐＨ８．５）４ｍＬに懸濁させ、これにア
ビジンの１ｍｇ／ｍＬ−０．２Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ
８．５）１ｍＬを加え、十分混和し、３７℃で１時間攪
拌した。再度、１５０００ｒｐｍ及び２０分の条件で遠
心分離し、沈渣を０．１Ｍのエタノールアミンヒドロク
ロライド−０．２Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ８．５）溶液に
て懸濁し、３７℃で１時間攪拌した。攪拌後、１５００
０ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈渣を１％（ｗ／ｖ）
ウシ血清アルブミン−１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．５）溶液５ｍＬに懸濁させ、室温で１時間攪拌し、
ブロッキング処理を行なった。

【００３８】しかる後、ブロッキング処理された液体を
１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈渣を１％
（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン−０．１％（ｗ／ｖ）ア
ジ化ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）２ｍＬに懸濁させ、冷蔵保存した。このようにし
て、ＨＢｓ抗原及びアビジン結合ラテックス粒子懸濁液
を得た。

【００３９】（３）試験片の作製 上記ＨＢｓ抗原固定化多孔性膜を幅５ｍｍ×長さ２５ｍ
ｍに裁断し、幅５ｍｍ×長さ６０ｍｍの粘着性基材に貼
り合わせ、該多孔性膜の上端に幅５ｍｍ×長さ２ｃｍの
吸水用濾紙（日本ミリポア社製）を上端が一致するよう
に重ね、透明な粘着テープで固定した。吸水用濾紙の下
端にはグラスファイバー片（ワットマンジャパン社製）
に上記ラテックス粒子懸濁液を２μＬ含有させ乾燥した
ものを貼付した。該グラスファイバー片上に、さらにフ
ィルタ濾紙（ワットマンジャパン社製）を重ね透明な粘
着テープで固定した。このようにして試験片を得、該試
験片をウェル内に入れ、立設した。

【００４０】（４）抗ＨＢｓ抗体の測定 抗ＨＢｓ抗体の測定陽性サンプルとして、ＨＢｓ抗原の
濃度が０ｍＩＵ／ｍＬ、５ｍＩＵ／ｍＬ、１０ｍＩＵ／
ｍＬ、２０ｍＩＵ／ｍＬ、４０ｍＩＵ／ｍＬ、及び８０
ｍＩＵ／ｍＬの濃度の各サンプル５０μＬをウェルに添
加し、試験片に吸収させ、反応させた。５分後に１０ｍ
Ｍアルカリフォスファータゼ標識ビオチン含有リン酸緩
衝液（ｐＨ７．５）５０μＬを添加し、さらに５分後
に、基質として１０ｍｇ／ｍＬの５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリル−リン酸二ナトリウム塩含有溶液５
０μＬを添加した。この添加の１０分後に、青色のライ
ンが検出されるかどうかを目視により判定した。ライン
の強度は３名の評価者により評価し、その平均値を求め
た。結果を下記の表１に示す。

【００４１】（実施例２）ＨＢｓ抗原及びアビジン結合
ラテックス粒子懸濁液に、さらにトレハロース（林原生
物化学研究所製）を１０％（ｗ／ｖ）となるように加え
たこと以外は、実施例１と同様にして試験片を作製し、
かつ抗ＨＢｓ抗体の測定を行なった。結果を下記の表１
に示す。

【００４２】（実施例３）ＨＢｓ抗原結合アビジン結合
ラテックス粒子懸濁液に、さらにトレハロース（林原生
物化学研究所製）を２０％（ｗ／ｖ）となるように加え
たこと以外は、実施例１と同様にして試験片を作製し、
かつ抗ＨＢｓ抗体の測定を行なった。結果を下記の表１
に示す。

【００４３】（実施例４）ＨＢｓ抗原結合アビジン結合
ラテックス粒子懸濁液に、さらにトレハロース（林原生
物化学研究所製）を３０％（ｗ／ｖ）となるように加え
たこと以外は、実施例１と同様にして試験片を作製し、
かつ抗ＨＢｓ抗体の測定を行なった。結果を下記の表１
に示す。

【００４４】（比較例１）実施例１において、ＨＢｓ抗
原及びアビジン結合ラテックス粒子の作製を、下記のＨ
Ｂｓ抗原結合青色着色ラテックス粒子の作製に変更した
こと、サンプル滴下後に、１０ｍＭアルカリフォスター
ゼ標識ビオチン含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）５０μ
Ｌを添加しなかったこと、並びに、１０ｍｇ／ｍＬの５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−リン酸二ナト
リウム塩含有溶液５０μＬの添加をしなかったことを除
いては、全て実施例１と同様にして行なった。

【００４５】ＨＢｓ抗原結合青色着色ラテックス粒子の
作製 カルボキシル基含有青色着色ラテックス粒子（積水化学
工業社製、青色カルボラテックス、粒子径０．３μｍ）
の１０％ｗ／ｖ濃度の分散液１．０ｍＬに２０ｍＭにリ
ン酸緩衝液（ｐＨ５．５）９ｍＬを加え、１５０００ｒ
ｐｍで２０分間遠心分離した。得られた沈渣を、２％
（ｗ／ｖ）の１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３
−エチルカルボジイミドヒドロクロライドを含有する２
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に懸濁し、１時間、
３７℃で混和した。混和された混濁液を、１５０００ｒ
ｐｍにて２０分間遠心分離し、０．２Ｍホウ酸緩衝液
（ｐＨ８．５）４ｍＬに懸濁した。この懸濁液に、ＨＢ
ｓ抗原の０．５ｍｇ／ｍＬ−０．２Ｍほう酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．５）を１ｍＬ加え十分混和し、３７℃で１時間攪
拌した。しかる後、未反応のＨＢｓ抗原を除去するため
に、１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。沈渣を
０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）４ｍＬに懸濁させ
た。

【００４６】上記のようにして得た懸濁液を再度、１５
０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。沈渣を０．１Ｍ
のエタノールアミンヒキドロクロライド−０．２Ｍホウ
酸緩衝液（ｐＨ８．５）にて懸濁し、３７℃で１時間攪
拌した。しかる後、攪拌された懸濁液を１５０００ｒｐ
ｍで２０分間遠心分離した。遠心分離後に、１％（ｗ／
ｖ）ウシ血清アルブミン−１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）５ｍＬに懸濁し、室温で１時間攪拌し、ブロ
ッキング処理した。

【００４７】上記ブロッキング処理後、懸濁液を１５０
００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。沈渣を１％（ｗ／
ｖ）ウシ血清アルブミン−０．０１％（ｗ／ｖ）アジ化
ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２ｍＬに懸濁させ、冷蔵保存した。このようにして、Ｈ
Ｂｓ抗原結合青色着色ラテックス粒子含有懸濁液を得
た。

【００４８】

【表１】

【００４９】なお、表１においては、ラインの強度は
−、＋、＋＋、＋＋＋の４段階で評価した。表１から明
らかなように、比較例１では、２０ｍＩＵ／ｍＬまでの
濃度のサンプルしか検出できなかったのに対し、実施例
１では、５ｍＩＵ／ｍＬの濃度のサンプルまで検出する
ことができ、感度の高められることがわかる。また、反
応容器内に糖を含有させた実施例２〜４においても、同
様に、５ｍＩＵ／ｍＬの濃度の場合でも、検出ラインを
確認することができ、感度の高められていることがわか
る。

【００５０】

【発明の効果】本発明に係る検査キットでは、被検出物
質と特異的に結合する物質と、ビオチンまたはアビジン
とが固定化された微粒子が、合成高分子からなるラテッ
クス粒子であって、粒子径が０．０１〜５．０μｍの範
囲にあるので、該微粒子が、被検出物質捕捉部位に捕捉
された場合、捕捉後粒子の量が、背景色に妨害されず、
また粒子自身の持つ色に妨害されずに測定され得る。従
って、合成高分子ラテックス粒子を用いたイムノクロマ
トグラフ法により、高感度に被検出物質を測定すること
ができる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 検体添加部位と被検出物質捕捉部位とが
   設けられたメンブランと、酵素と、前記酵素に対する基
   質とを備える検査キットであって、 前記メンブランには、試料中の被検出物質と特異的に結
   合する物質とビオチン又はアビジンとが固定化された微
   粒子が保持されており、 前記被検出物質捕捉部位には、被検出物質と特異的に結
   合する物質が固定化されており、 前記酵素にアビジン又はビオチンが固定化されており、 前記微粒子が合成高分子からなるラテックス粒子であ
   り、粒子径が０．０１μｍ〜５．０μｍの範囲であるこ
   とを特徴とする検査キット。
2. 【請求項２】 前記微粒子にアビジンが固定化され、前
   記酵素にビオチンが固定化されている、請求項１に記載
   の検査キット。
3. 【請求項３】 単糖類または二糖類を含有することを特
   徴とする請求項１または２に記載の検査キット。
4. 【請求項４】 前記メンブレンが、多孔性膜または繊維
   状膜からなる、請求項１〜３のいずれかに記載の検査キ
   ット。