CN101443462A - 利用胃粘膜洗涤液的疾病相关标记物检测法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有从经过了胃粘液除去处理的对象采集的胃粘膜洗涤液的检体、以及利用该检体的疾病相关标记物检测法。通过使用本发明的检体，能简便且低侵袭性地以高灵敏度及高精确度检测疾病相关标记物。

Description

利用胃粘膜洗涤液的疾病相关标记物检测法
技术领域
本发明涉及用于检测疾病相关标记物的方法，更具体而言涉及利用胃粘膜洗涤液的上述方法、含有胃粘膜洗涤液的检体、该方法中使用的前处理剂以及该方法使用的器具。
背景技术
癌症一直是近二十年来日本死因的第一位。分别按部位来看成为死因的癌症时，胃癌一直名列前茅，患胃癌病例的情况多变，且以前一直是晚期胃癌所代表的StageIII、IV占据主要的患者层，而现在50％以上被StageI所占据。Stage I包括Stage Ia、Ib，但均具有癌停留于粘膜下层这样的特点，归类于所谓的早期癌症。
作为所述癌症的治疗方针，与对身体影响大、广泛的局部淋巴结清扫术相比，一般为侵袭性较低的治疗方法例如内窥镜的局部切除、开腹部分胃切除、腹腔镜下部分胃切除等。但是，与早期胃癌呈上升趋势以前的主要治疗方法即胃切除术不同，采用上述治疗方法时由于有一部分胃残留，因此必须注意癌症在残留胃复发。另外，在上述早期癌症中，现在利用肉眼诊断的术前评价由于不具有100％的诊断能力而使完全切除率未达到100％，在此情况下，对癌残留的判定和评价变得非常重要，而如今仅仅依靠采用定期内窥镜检查的肉眼诊断和点活检。
通常，在胃内窥镜检查中，一边对胃内进行洗涤一边肉眼进行粘膜异常的拾取。根据情况的不同，有时也通过利用染色(磺化靛蓝液)的对比法，来查找表面的异常。当发现有可疑部位时，将其一部分进行点活组织采集，并用福尔马林固定后在显微镜下对组织图像进行评价。
但是，在现有的胃内窥镜检查中，不仅理所当然无法拾取肉眼觉察不到的微小癌症，而且点活检也只不过能在“点”上对组织进行评价，将其扩大到“面”则存在物理限制。而且，用内窥镜治疗、腹腔镜下治疗等治疗后影响到的部位在纤维化、热凝固变性等的修饰下，几乎难以肉眼评价。因此，当确定有残留时，不少情况下已变成晚期癌症。
由于今后期望增加如上述那样的低侵袭治疗，因此构筑与所述治疗法相对应的术后的确切的诊断方法成为当务之急。
另一方面，在消化道疾病的诊断中，作为补充或代替活检和其后的组织学评价的方法，近年来尝试检测对象疾病特有的核酸或蛋白质等疾病标记物。例如在非专利文献1和2中记载了用粪便DNA诊断大肠癌的方法显示了一定的成果。另外，在非专利文献3～5中记载了腹水DNA和血清DNA能用于胃癌的诊断，在非专利文献6中记载了胃粘液DNA能用于幽门螺旋杆菌感染症的诊断，而且，在非专利文献7中记载了内窥镜得到的胃洗涤液中含有的DNA能用于淋巴瘤的治疗后评价。但是，例如在非专利文献7所述的方法中，对于约半数的试样而言，无法提取足够量的DNA来进行诊断所需的Southern印迹法等，上述方法均在诊断可能性和诊断精确度上存在问题，还停留在离实际应用相当远的水平。
非专利文献1：Ahlquist DA et al.，Gastroenterology.2000Nov；119(5)：1219-27
非专利文献2：Osborn NK et al.，Gastroenterology.2005Jan；128(1)：192-206
非专利文献3：To EM et al.，Diagn Mol Pathol.2003 Jun；12(2)：88-95
非专利文献4：Leung WK et al.，Br J Cancer.2005 Jun 20；92(12)：2190-4
非专利文献5：Marutsuka T et al.，Clin Cancer Res.2003 Feb；9(2)：678-85
非专利文献6：Furuta T et al.，J Clin Microbiol.1996 Oct；34(10)：2421-5
非专利文献7：Chen B et al.，Hum Pathol.2004 May；35(5)：582-6
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种没有上述缺点的新型的疾病标记物的检测方法。
本发明人等为了解决上述技术问题进行了潜心研究，结果发现：从对象的胃采集检体前，通过进行除去胃粘液的处理，不仅能可靠地采集迄今为止难以采集的粘液层以内的粘膜表层细胞，还能构筑将核酸的损伤降到最小限的pH环境，并且，将通过在胃粘液的吸引除去后直接洗涤胃粘膜表面而得到的胃粘膜洗涤液作为核酸检测用试样具有极好的特性，而且，通过对从该洗涤液提取的核酸进行分析，能以高频率检测疾病相关基因，从而完成了本发明。
即，本发明涉及一种疾病相关标记物检测用的检体，其含有从经过了胃粘液除去处理的对象采集的胃粘膜洗涤液。
本发明还涉及含有5μg以上的核酸的上述检体。
另外，本发明涉及进一步含有螯合剂和/或pH调节剂的上述检体。
进而，本发明涉及pH为3～11的上述检体。
本发明进而涉及一种胃粘膜洗涤液采集的前处理剂，其含有胃粘液除去剂。
本发明进而还涉及一种检测疾病相关标记物的方法，其包括从上述检体提取核酸的工序。
另外，本发明涉及进一步包括将检体的pH调节到3～11的工序的上述方法。
本发明还涉及一种评价药剂和/或治疗方法的治疗效果的方法，其包括用上述检测方法来检测疾病相关标记物的工序。
进而，本发明涉及一种胃粘膜洗涤液采集用的检体采集容器，其含有螯合剂和/或pH调节剂、且能够与内窥镜装置的吸引管道连接。
另外，本发明还涉及一种内窥镜装置，其连接有上述检体采集容器。
本发明的检体或方法采用通过先除去附着于对象胃粘膜的粘液后对胃粘膜面进行洗涤而得到的胃粘膜洗涤液，与非专利文献7等中记载的使用含有大量胃液的、伴随单纯的内窥镜检查得到的胃洗涤液的方法完全不同。当用单纯的胃洗涤液作为检体时，如非专利文献7所示，在约2成的案例中得不到用于PCR的足够量的DNA，至于Southern印迹法，则在约4成的案例中无法实施，而且实施内窥镜对对象造成一定程度的肉体上、经济上的负担，因此检体重新采集频率极高的使用胃洗涤液的现有方法，无论如何也无法应用于临床。但是，若采用使用胃粘膜洗涤液的本发明的方法，则容易得到含有优质标记物的检体，因此可将来自内窥镜检查的废液作为检体材料利用，从而具有以下各种有益效果。
即，本发明的检体或方法由于使用以往废弃的洗涤液作为材料，因此不会新发生因利用了内窥镜的其他检查方法而产生的各种危险(出血的危险性(活检法)、过敏、肾功能障碍的发生(染色法)、检查时间的延长(放大内窥镜)、高昂设备(放大内窥镜、NBI))，且检体的采集简便，因此几乎不会对内窥镜实施医生、护士带来负担。此外，在本发明的方法中，由于将检体采集管安装在内窥镜装置的封闭回路中，因而能避免检体的污染，且由于能直接利用市售的内窥镜装置，因此无需新的设备投资。
此外，利用本发明的方法，只需对可疑粘膜面整体进行洗涤即可实现在“面”上的评价，而且不像活检那样对组织造成损伤，因此即使对止血功能或创伤愈合能力等衰退的对象，且即使在内服了抗血小板药、抗凝固药等对止血或创伤愈合有影响的药剂的情况下，也能进行检查。由于需要内窥镜检查的对象中高龄者较多，因此经常服用所述药剂的患者的比例也较多，因此上述优点的意义极大。此外，还能进行基因或表基因性异常DNA的检索、及可成为胃癌危险的H.Pylori和EB病毒等的同时评价。特别是关于H.Pylori的认定，不是从萎缩粘膜、癌部等的菌相对丰度低的部位进行诊断，而是能够对胃整体进行评价，并且在现有单纯的胃粘液的回收中，检测出来自H.Pylori死菌的标记物的可能性高，假阳性率也高，完全不适合作为除菌疗法的判断方法，但在本发明的方法中，由于胃粘液被除去，因此在提高拾取陷入粘膜表面的细胞中的活菌的能力方面优异。
进而，使用通过本发明方法采集的检体，能够对包括抗癌剂在内的各种药剂敏感性进行研究。
另外，利用本发明的检体或方法能够根据检体中的核酸量来判断疾病的有无，例如是否存在胃内肿瘤，因此能更简便且廉价地筛选患病对象。
附图说明
图1是表示检体采集容器的结构的图。
图2是表示各种试样中的DNA状态的电泳图。
图3是用分光光度法评价各种试样中的DNA量的图。横轴表示试样的种类，纵轴表示DNA量(μg)。横轴的符号意思如下所述。T：癌对象的肿瘤部活检试样，N：癌对象的正常部位活检试样，W：癌对象的胃粘膜洗涤液，EN：内窥镜诊断下正常对象的活检试样，EW：内窥镜诊断下正常对象的胃粘膜洗涤液。另外，*表示2组间显著性差异的Student的t检验的P<0.0001，**表示P<0.001。另外，图中的水平线表示平均值。
图4是评价各种试样中的甲基化DNA的图(扩增图)。
图5是评价各种试样中的甲基化DNA的图(多组合图)。
图6是表示胃粘膜洗涤液试样和活检试样中的hpu基因是否存在的电泳图。图上部的符号中，T表示肿瘤部活检，W表示胃粘膜洗涤液，符号后的编号表示实施例5所述的对象编号。
图7是表示在不同的pH条件下孵育3小时后试样中的DNA量的图。
图8是表示在不同的pH条件下孵育24小时后试样中的DNA量的图。
图9是表示在不同的pH条件下孵育3或24小时后试样中的DNA状态的电泳图。
图10是评价在不同的pH条件下孵育3或24小时后试样中的甲基化DNA的图(多组合图)。
符号说明
1 检体采集容器
2 检体采集容器上部
3 检体采集容器下部
4 观测器侧连接部
5 吸引器侧连接部
具体实施方式
以下对本发明优选的方式进行详细说明。
本发明涉及一种疾病相关标记物检查用的检体，其含有从经胃粘液除去处理的对象中采集的胃粘膜洗涤液。
在本发明中，“对象”是指有胃的任何生物个体，优选动物，更优选哺乳动物，例如人、非人灵长类、狗、猫等伴侣动物、牛、马、山羊、绵羊、猪等产业动物等，特别优选人。在本发明中，对象可以是健康的，也可以患有某些疾病，还可以是正处于疾病治疗中或治疗后的。
在本发明中，“胃粘液除去处理”包括有意识地除去通常附着在胃粘膜上的胃粘液的所有处理，典型地包括给予对象胃粘液除去剂，但也包括介由内窥镜装置等向对象胃内导入单纯的水或生理盐水、从而吸引物理性剥离的粘液等的纯粹的物理方法。胃粘液除去处理优选能使胃粘液覆盖部分最小的处理，例如，并非限定，可列举出给予对象粘液溶解除去剂，通过变换对象的体位等以遍及胃整体的处理，或作为更简便的方法，给予对象溶解于较多溶剂(例如相对于Pronase(注册商标)MS 2万单位、小苏打1g以及Gascon(注册商标)滴剂4ml(含有80mg二甲硅油)，水剂为100ml以上)的粘液溶解除去剂，在规定期间例如10～15分钟在座位上保持安静的处理等。
用于胃粘液除去处理的胃粘液除去剂只要具有使胃粘液的洗涤除去变容易的性质即可，例如，可列举出能分解胃粘液中的蛋白质、糖类、糖蛋白等产生胃粘液粘性的物质的物质等。在本发明中，从胃粘液除去效率高、及对对象的安全性等观点出发，优选蛋白质分解酶制剂Pronase(注册商标)。将Pronase(注册商标)用于成人时，典型地为将2万单位在约50～80ml的水中溶解后口服给药。为了提高酶活性，优选与碳酸氢钠(小苏打)一起给药。碳酸氢钠的用量典型地为成人每人1g。另外，为了高效地进行胃粘膜洗涤液的吸引，优选与二甲硅油(二甲基聚硅氧烷)等消泡剂一起给药。作为消泡剂的二甲硅油的用量典型地为成人每人40～80mg。
胃粘液除去处理可在胃粘膜洗涤液采集前的任意时刻进行，但由于胃粘液不断地产生，因此优选在即将采集前进行。但是，当使用胃粘液除去剂时，必须确保该除去剂与胃粘液的作用时间，因此优选在采集前1小时内、更优选在30分钟以内、更优选在20分钟以内进行。胃粘液除去剂可以通过能发挥胃粘液除去作用等的期望效果的任意途径给药，作为所述途径，例如包括经口给药、介由内窥镜装置的给水功能或胃管(包括经口、经鼻)或胃瘘等给药等。
在本发明中，可以进一步对对象实施胃酸分泌抑制处理。这里，胃酸分泌抑制处理包括从胃粘膜洗涤液采集前例如采集前约1周开始给予对象PPI(质子泵抑制剂)、H2受体拮抗剂等胃酸分泌抑制剂。在本发明中，优选在胃内pH上升效果的维持(pH保持)方面优异的PPI。作为PPI的例子，可列举出奥美拉唑、兰索拉唑、雷贝拉唑等，而且，作为H2受体拮抗剂的例子，可列举出西咪替丁、法莫替丁、雷尼替丁、罗沙替丁等，但不限于这些。胃酸分泌抑制剂以通常的治疗用量给药。以奥美拉唑为例，成人为20mg/天。胃酸分泌抑制剂的给药途径没有特殊限制，可适当选择内服制剂的经口给药、注射制剂等的非经口给药等。
在本发明中，“胃粘膜洗涤液(gastric mucosal washing liquid)”是指通过用洗涤液的水流洗涤经胃粘液除去处理后暴露的胃粘膜而得到的液体。因此，与不进行胃粘液除去处理而单纯地将附着有胃粘液的胃粘膜直接洗涤而得到的所谓的“胃洗涤液(gastric washing)”不同。
在本发明中，胃粘膜洗涤液优选含有进行分析所需的足够量的核酸。这里，进行分析所需的足够量是指，例如液体中的核酸量优选为5μg以上，更优选为10μg以上，更优选为50μg以上，最优选为100μg以上。关于胃粘膜洗涤液中的核酸量的测定，例如可采用分光光度法等公知的方法来进行。另外，为了确保检查用的优质核酸，上述液体优选实质上不含胃粘液。这里，实质上不含胃粘液是指，例如胃粘膜洗涤液是在下述情况下采集的：对象胃粘膜上的胃粘液的附着在内窥镜肉眼观察时为1处/1视野以下、优选为1处/2视野以下、更优选为1处/3视野以下、最优选为整个视野没有胃粘液附着。
胃粘膜洗涤液可通过利用内窥镜装置的洗涤/吸引功能或胃管等的公知的任意方法来采集。优选利用内窥镜装置来采集，因其能够一边通过图像监测胃内状态一边进行吸引操作。这里，“内窥镜装置”指市售的任意内窥镜装置，但优选至少具备观测器、对其进行操作/驱动的处理器以及吸引器，所述观测器具有至少1条送水通道和吸引通道。作为所述内窥镜装置的例子，例如可列举出奥林巴斯株式会社制EVIS200系列、EVIS240系列、LUCERA系列、FTS(Fujinon Toshiba ES System株式会社)制FTS200系统、FTS400系统、PENTAX公司制内窥镜系统等。
采集胃粘膜洗涤液时，优选废弃含有较多胃液和从胃粘膜除去的胃粘液的初期吸引液，采集这些成分的含量非常少的吸引液作为胃粘膜洗涤液。这里，“含量非常少的吸引液”是指，洗涤胃内部直至下述情况后的吸引液：对象胃粘膜上的胃粘液的附着在内窥镜肉眼观察时为1处/1视野以下、优选为1处/2视野以下、更优选为1处/3视野以下、最优选为整个视野没有胃粘液的附着。
为了使核酸稳定，本发明的检体可进一步含有螯合剂和/或pH调节剂。螯合剂和/或pH调节剂可以在采集胃粘膜洗涤液前、例如在胃粘液除去处理时给予对象，也可以在将该洗涤液采集到容器后添加，此外，还可以事先添加到采集容器中。当事先添加到采集容器中时，螯合剂和/或pH调节剂例如可以以固体(粉末、颗粒、片剂、胶囊等)或液体(溶液、悬浮液、乳液等)形态存在于容器中，或附着于容器的壁面。或者，还可以使螯合剂和/或pH调节剂事先附着于在采集操作中不与吸引液接触的容器内部的部分、例如容器顶部的内表面，在采集后通过翻转混合等操作使其与吸引液接触。另外，当与内窥镜装置连接的检体采集容器上部与接收胃粘膜洗涤液的容器下部可分离时，可以另行准备能安装于容器下部且在内侧面具有螯合剂和/或pH调节剂的盖子，在检体采集后仅将容器下部从内窥镜装置拆装，通过安装上述盖子并进行翻转混合等，将其所具有的螯合剂和/或pH调节剂导入胃粘膜洗涤液中。
添加时的温度只要在检体中的疾病标记物不变性的范围内即可，没有特殊限制，但从标记物保护的观点出发，优选冷藏(4℃左右)。
螯合剂可使用公知的任意螯合剂，例如EDTA(乙二胺四乙酸)类(例如EDTA4H、EDTA2Na·2H2O、EDTA3Na·2H2O、EDTA3Na·3H2O、EDTA4Na·4H2O、EDTA4Na·液体等)、HEDTA(羟乙基乙二胺三乙酸)类(例如HEDTA3Na·3H2O、HEDTA3Na·液体等)、DHEDDA(二羟乙基乙二胺)类(例如DHEDDA2Na等)、1，3PDTA(1，3—丙二胺四乙酸)类(例如1，3PDTA4H等)、DTPA(二乙三胺五乙酸)类(例如DTPA5H、DTPA5Na、DTPA·FeAM等)、TTHA(三乙四胺六乙酸)类(例如TTHA6Na等)、NTA(硝基三乙酸)类(例如NTA3Na·H2O等)、葡萄糖酸类(例如葡萄糖酸钠等)、HIMDA(羟乙基亚胺基二乙酸)类(例如HIMDA2Na等)、ASDA(L—天冬氨酸—N，N—二乙酸)类(例如ASDA4Na等)、NTMP(氨基三亚甲基膦酸)类(例如NTMP等)、HEDP(羟基乙烷膦酸)类(例如HEDP等)各种螯合剂，EDTA混合物，EDTA衍生物，EDTA金属盐，非水类螯合剂等，但从作为螯合试剂需要的使pH为从中性到弱碱性、且除去使DNA分解酶活化的二价金属离子的观点出发，优选EDTA(乙二胺四乙酸)类螯合剂。螯合剂的添加量没有特殊限制，如果是0.5M EDTA pH为8，则在每50ml采集液中优选为0.1～5.0ml、更优选为0.2～2.0ml、特别优选为0.2～1.0ml。
pH调节剂也可以使用公知的pH调节剂，但优选在与pH为7相比为酸性的环境下或极端碱性环境下能避免DNA损伤的pH调节剂，可列举出例如碳酸氢钠(小苏打)、NaOH、HCl等。pH调节剂的添加量为可以使检体的pH优选为3～11、更优选为5～11、特别优选为7～11、最优选为9～11的量，以碳酸氢钠(小苏打)为例，优选每50ml检体中为0.5～2.0g、更优选为0.7～1.5g、特别优选为1.0g。另外，当在采集前给予对象时，以成人为例，优选为0.5～2.0g、更优选为0.7～1.5g、特别优选为1.0g。
胃粘膜洗涤液的回收方法没有特殊限制，在利用内窥镜装置的情况下，例如可列举出在吸引管道中的操作部、接续部、吸引罐、吸引器或它们之间的部分等处连接至少1个能密封的检体采集容器的方法。若考虑洗涤、灭菌的简便性、污染的风险等，优选在接续部与吸引罐之间安装检体采集容器。另外，从操作性或洗涤的简便性等观点出发，优选可拆卸地安装检体采集容器。典型地，例如从吸引罐侧卸下连接接续部与吸引罐的吸引管，将其连接到设于检体采集容器的流入侧连接部，将设于检体采集容器的流出侧连接部与吸引罐连接。内窥镜装置优选具有保持检体采集容器的部件。可以仅连接1个上述检体采集容器，也可以串联或并联多个。
本发明的疾病相关标记物包括本技术领域中已知的任意标记物，例如可列举出其存在与否或存在量与特定的疾病相关的核酸。所述标记物优选为能在胃粘膜洗涤液中存在的标记物，例如APC、K—RAS、H—RAS、N—RAS、p53、P16、CHFR、RASSF家族、SFRP家族、MINT家族、MGMT、RUNX家族、SMAD家族、PRDM家族等癌相关基因或、H.Pylori及其相关基因(CagA、hpu、cagPAI、BabA、AlpA/B、HopZ、iceA、VacA等)、EBV及其相关基因、CMV及其相关基因等，但不限于这些，也包括虽然现在还未知但将来会发现的各种标记物。
另外，作为本发明的疾病相关标记物，可使用核酸量本身。即，在本发明的方法中，可将检体中的DNA量和/或RNA量用作判断是否存在疾病例如在胃中是否存在肿瘤特别是胃癌的指标。具体而言，在利用检体中的DNA量来判断胃中是否存在肿瘤的情况下，例如当本发明检体中的DNA量在规定量以上、或与非癌对象检体中的DNA量相比在规定比例以上时，可判断胃中肿瘤存在的可能性高。所述规定量或规定比例的具体数值(临界值)可通过根据规定的检体制备、检测方案进行患者对照研究等来进行适当设定。
本发明还涉及含有胃粘液除去剂的胃粘膜洗涤液采集的前处理剂。作为前处理剂中含有的胃粘液除去剂，可采用上述任意的胃粘液除去剂。本前处理剂还可以含有选自pH调节剂、消泡剂以及螯合剂中的1种或2种以上的成分。这些成分的具体例子和剂量如上所述。本前处理剂可以为适合经口给药的任意剂型，例如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、液剂、悬浮剂、乳剂、凝胶剂、糖浆剂等形态，在此情况下，可进一步含有适合各剂型的各种添加剂，例如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、包衣剂、溶剂等(例如参照標準薬剤学、渡辺喜照ら、南江堂、2003年等)。本前处理剂可在单一的制剂中含有上述各成分，也可以在2个以上的分开的制剂中含有。在后种情况下，可以将各制剂分别给药，也可以在给药前混合后给药。为了有利于迅速扩散到胃整体，优选给药时为液状的剂型、例如液剂、悬浮剂、乳剂、糖浆剂等。另外，即使是散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂等固体剂型，由于可通过在给药前溶解或悬浮于水等液体中而达到与液体剂型同样的效果，因此也优选这些剂型。
本发明的前处理剂优选含有1次给药即可达到胃粘液除去和核酸稳定化等规定效果的用量的各成分。典型地，以成人为例，Pronase(注册商标)为2万单位、碳酸氢钠为1g、且二甲硅油为40～80mg。另外，各成分的量可考虑各对象的情况、例如对象的一般健康状态、年龄、体重、胃粘膜的状态、胃粘液的量、给药时机、并用药物、治疗经历等进行适当调节。
本前处理剂可采用能发挥胃粘液除去作用、pH调节作用、螯合作用等所期望效果的任意途径来给药，作为所述途径，例如包括经口给药、介由内窥镜装置的给水功能或胃管(包括经口、经鼻)或胃瘘等来给药等。
本发明还涉及一种检测疾病相关标记物的方法，其包括从本发明的检体中提取核酸的工序。
在本发明的方法中，可用公知的任意方法从检体中提取疾病相关标记物。典型地，离心分离检体，将得到的粒状沉淀再悬浮于合适的介质、例如PBS或生理盐水等，然后用蛋白酶K等蛋白质溶解剂等进行酶解，用苯酚、氯仿等有机溶剂除去蛋白，用乙醇等将核酸沉淀，从而提取核酸。关于具体的方案，在基因工程学相关的各种文献(例如Chomczynski，P.，Sacchi，N.：Anal.Biochem.，162：156-159，1987、村松正實、山本
Figure A200780017634D0013101451QIETU
、新遺伝子工学ハンドブツク、改訂第4版、羊土社、2003年10月、20～29頁等)中已有记载，在此不详细说明。
检体优选在采集后立即进行提取处理，也可以在提取处理前保存一定时间例如12小时左右、进而24小时左右。关于优选的保存温度，从保护疾病相关标记物的观点出发，优选为-80℃～20℃，更优选为-80℃～10℃，特别优选为-80℃～4℃。在保存检体的情况下，优选在离心分离后、再悬浮于上述合适的介质中的状态下保存。
其后，提取得到的核酸可用与目标疾病标记物对应的各种检测方法来进行检测，例如PCR法、NASBA(核酸序列依赖性扩增法)法、TMA(转录介导的扩增法)法、LCR(连接酶链反应)法、SDA(链置换扩增)法、LAMP(环介导等温扩增)法、ICAN(等温的和嵌合引物起始的核酸扩增)法、分支DNA法等各种核酸扩增法、Southern印迹法、Northern印迹法、RNA酶保护实验、微阵列法、点印迹法或狭线印迹法等。
特别是当标记物为表观的甲基化DNA时，可采用例如亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性PCR(MS—PCR)、亚硫酸氢盐组合限制化验(COBRA)、MS—SNuPE、亚硫酸氢盐—SSCP、DMH(差异甲基化杂交)法、MethyLight法、Pyrosequencing法等方法来检测。
另外，核酸的定量可利用任意已知的方法，包括测定在260nm左右的最大吸收波长下的吸光度的分光光度法，使用将核酸染色的各种试剂、例如溴化乙锭、DAPI(4，6-二脒-2-苯基吲哚)、吖啶橙、Mupid(注册商标)-STAIN eye(株式会社ADVANCE)、二苯胺试剂、Hoechst 33258(H33258)、Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent(Invitrogen)、Quant-iT RiboGreen(注册商标)RNA Reagent(Invitrogen)、Gel Indicator RNA Staining Solution(Funakoshi株式会社)、SYBR(注册商标)Green I或II、SYBR(注册商标)Gold、GelRed等的方法。
将被检检体的检测结果与规定的对照检体的检测结果，例如，在明确未患有目标疾病的时期、或在曾患有目标疾病但与现在相比未发展的时期、按同样的方法采集的检体的结果，或从明确未患有目标疾病的另一对象用同样的方法得到的检体的结果等进行比较，当目标疾病标记物的水平随目标疾病的存在或发展而上升时，若被检检体的标记物水平高于对照检体，则表示目标疾病存在或发展，反之若低于对照检体，则表示目标疾病不存在或消退。同样地，当目标疾病标记物的水平随目标疾病的存在或发展降低时，若被检检体的标记物水平低于对照检体，则表示目标疾病存在或发展，反之若高于对照检体，则表示目标疾病不存在或消退。因此，本发明的方法可用于疾病的诊断，相关诊断方法也属于本发明。
另外，利用本发明方法还能评价特定药剂或治疗方法的治疗效果。例如，通过将治疗前的标记物水平与治疗后的标记物水平进行比较，或将治疗中某个时间点的标记物水平与该时间点之后的治疗中的另一时间点的标记物水平进行比较，若目标疾病的发展减速或停止或目标疾病消退，则可评价为有治疗效果，或者，若对目标疾病的发展没有影响，则可评价为无治疗效果。特别是当疾病为癌症且治疗方法是摘除术时，能够容易地确认有无癌残留，因此该方式非常有用。
本发明的方法还可用于监测治疗结束后疾病有无复发。此时，在治疗结束后，定期从对象采集检体，基于标记物水平，用与上述同样的方法检查疾病是否存在。
本发明还涉及胃粘膜洗涤液的采集中使用的检体采集容器，其含有螯合剂和/或pH调节剂、且能够与内窥镜装置的吸引管道连接。
本发明容器的结构只要是能从内窥镜装置的吸引管道接收洗涤液的即可，没有特殊限制，但从采集作业的效率性和污染的风险等观点出发，优选与该吸引管道形成封闭回路的结构。作为所述检体采集容器的例子，例如可列举出检体采集容器的上部具有气密性地连接于观测器侧的吸引管或吸引通道的至少1个连接部，以及与此不同的、气密性地连接于吸引器侧的吸引管或吸引通道的至少1个连接部，但不限于此。另外，在上述方式中，容器上部优选具有盖结构、且能与容器下部拆装。而且，容器上部和下部优选例如通过螺合或通过紧固件等气密性接合。此外，检体采集容器优选至少容器下部能直接设置在离心分离器上。
连接部只要是空心的部件即可，没有特殊限制，优选能与内窥镜装置附带的管连接并对胃肠液等具有耐受性。该部件可以是硬性部件，也可以是挠性部件，可以与容器上部连接，也可以与容器上部一体成型。连接部的长度没有特殊限制，当该部件具有挠性管的形态时，优选具有能到达内窥镜装置侧的连接部的长度。作为这样的检体采集容器的例子，可列举出Argyle Speciment Collection Container(Type O、收集容量为50ml、TycoHealthcare Group LP、医疗用具许可编号16200BZZ00045、Cat No.2583-50)等。
上述连接部可具有旋塞(cock)、阀瓣(valve)、阀、三路活栓等开闭机构，和/或将检体采集容器分流并将吸引管道的观测器侧和吸引器侧连接的分流机构。所述机构可以与上述连接部或容器上部一体成型，也可以作为能拆装的另一部件来设置。另外，所述机构可以组装在内窥镜装置上，也可以作为可拆装的另一部件来设置。
本发明的容器在检体采集前事先含有螯合剂和/或pH调节剂。因此，无需在检体采集后向检体添加这些试剂。本发明容器中含有的螯合剂和/或pH调节剂的例子和存在形态如上所述，但优选根据检体采集容器中的洗涤液的水位释放规定量的试剂的方式。具体而言，可列举出上述试剂附着于容器内壁的方式，将上述试剂按照具有与容器的高度相当的长度的柱状成型、或将上述试剂浸渍或包衣到如此成型成柱状的媒介物上，然后配置到内部的方式等。或者也可以是如下结构：在采集操作中不与吸引液接触的容器内部的部分例如容器顶部的内表面、设置上述试剂或含有该试剂的贮存器例如水溶性包装件或胶囊等，通过在检体采集后将容器翻转等操作使其与液体接触，从而向液体中导入上述试剂。或者还可以是如下结构：当与内窥镜装置连接的检体采集容器上部与接收胃粘膜洗涤液的容器下部可分离时，另行准备可从容器下部拆装的、且在内侧面具有螯合剂和/或pH调节剂本身或含有所述试剂的贮存器的盖子，通过在检体采集后仅取下容器下部，安装上述盖子并进行翻转混合等操作，从而将上述试剂导入胃粘膜洗涤液中。在本发明中，从操作性、制造容易性等观点出发，优选上述试剂附着于容器内壁，或设置于盖子内侧面的方式。在前者的情况下，可用喷雾涂布法等公知的任意方法使上述试剂附着。
检体采集容器的容量没有特殊限制，从作业性和设置空间等观点出发，优选为10～100ml、更优选为30～50ml、特别优选为50ml。
本发明容器的材质没有特殊限制，可用已知的任意材料来制造，从强度、或经济性等观点出发，优选聚丙烯制。
本发明还涉及一种内窥镜装置，其具有上述检体采集容器。能使用的内窥镜装置的例子，以及检体采集容器在该装置上的设置方法等如上所述。
实施例
以下，结合实施例更详细地说明本发明。但本发明不限于以下的实施例。
实施例1：检体采集容器
图1表示本发明的检体采集容器的一个例子。该检体采集容器1包括盖状的检体采集容器上部2和具有50ml容量的检体采集容器下部3，两者通过螺合气密性地接合。在检体采集容器上部2设有2个连接部、即观测器侧连接部4和吸引器侧连接部5，并能与内窥镜装置的吸引管道气密性地连接。此外，在检体采集容器1中还封入0.5ml 0.5M的EDTA(和光纯药工业K.K.特级品)。
实施例2：检体的制备
从内窥镜装置(EVIS LUCERA、奥林巴斯株式会社)的吸引瓶取下与接续部连接的吸引管，将其与上述检体采集容器的观测器侧连接部连接，同时将检体采集容器的吸引器侧连接部与吸引瓶的观测器侧连接部连接，形成封闭回路。
将二甲硅油(Gascon(注册商标)滴剂、Kissei药品工业株式会社)4ml(含有80mg二甲基聚硅氧烷)用50～100ml的普通水稀释，将在该稀释液中溶解2万单位Pronase(注册商标)(Pronase(注册商标)MS、科研制药株式会社)和1g小苏打得到的前处理剂给予患有各种胃病的人对象，10～15分钟后，使对象在卧位状态下以体轴为中心旋转2～3次，然后进行普通内窥镜检查，此时，将最初吸引的液体废弃，直至在内窥镜肉眼观察时胃粘液的附着为1处/1视野以下，然后在检体采集容器中回收约50ml的胃粘膜洗涤液。回收后，取下检体采集容器，到用于分析前在4℃下保存。检体的pH均在7.5～10.0的范围。
另外，为了比较，从上述对象采集病变部位和非病变部位的活检检体和血清检体，分别同样地保存在4℃下。
为了提取DNA，将各检体在2700rpm、4℃下离心分离15分钟，除去上清后，将粒状沉淀在4.5ml的SEDTA中再悬浮。向其中分别添加0.5ml10％的SDS以及50ml 20mg/ml的蛋白酶K(TAKARA BIO株式会社、CodeNo.9033)，在55℃下孵育1小时。加入5ml苯酚(UltraPure Buffer-SaturatedPhenol、Invitrogen life technologies)，翻转混合后，在2700rpm、4℃下离心分离15分钟，将上清转移到新管中。再重复1～2次此操作，将溶剂改为等量的氯仿(和光纯药工业株式会社)后再重复1～2次。加入5ml糖原(Ambion、Cat#9510)和9ml 100％乙醇，翻转混合后，在4℃下孵育12小时。然后，将检体在2700rpm、4℃下离心分离15分钟，舍弃上请，将粒状沉淀悬浮于10ml 70％乙醇中，然后在2700rpm、4℃下离心分离15分钟，舍弃上清、溶于200ml纯水中，得到DNA分析用试样。
实施例3：DNA的品质和量的评价
i)DNA品质的评价
用电泳法对来自患有胃癌的人对象的上述试样中含有的DNA的品质进行评价。电泳法中，将1～2μg DNA检体在10μl的H2O中稀释，在1％琼脂糖凝胶中，在100V下进行30分钟电泳。电泳法的评价结果如图2所示。该图中，左泳道是阳性对照(1Kb DNA Extension Ladder、Cat.No.10511-012、Invitrogen)、中央泳道是血清试样、右泳道是胃粘膜洗涤液。任一结果均显示胃粘膜洗涤液试样含有质量比血清试样好并与活检检体匹敌的DNA。
ii)DNA量的评价
用分光光度法对来自患有胃癌的人对象的试样中含有的DNA的回收量进行评价。作为试样，使用采用实施例2中记载的方法从胃癌对象采集的胃粘膜洗涤液试样(W：约50～约100ml、n＝20)、病变部位活检试样(T：n＝20)以及非病变部位活检试样(N：n＝17)(分别、2个6×6mm大小)，或用同样的方法从内窥镜未发现癌病变的胃炎对象(内窥镜诊断下正常患者)采集的胃粘膜洗涤液试样(EW：约50～约100ml、n＝48)以及胃粘膜活检试样(EN：胃体中部、2个6×6mm大小、n＝48)。分光光度法使用NanoDrop ND-1000分光光度计(Asahi Techno Glass株式会社)，按照制造者的操作手册来进行。即，在测定基座配置试样1μl，进行测定。分光光度法的评价结果如图3所示。另外，组间统计学的显著性差异评价采用非配对Student t检验(利用GraphPad PRISM)。
从图3可知，在胃癌对象中，胃粘膜洗涤液试样中含有的DNA量显著多于病变部位和非病变部位活检试样(P<0.0001)。在非癌对象中，胃粘膜洗涤液试样含有显著多于活检试样的量的DNA(P<0.0001)。而且，上述胃粘膜洗涤液试样均可用PCR法得到规定的条带，能用Pyrosequencing法进行DNA的甲基化分析。如上所述，确认本发明的检体无论在量上还是在质上均适合于核酸的检测。
此外，还证实来自胃癌对象的胃粘膜洗涤液试样中含有的DNA量显著多于非癌对象(P<0.001)。这意味着胃粘膜洗涤液中的DNA量本身能作为用来判断胃中是否存在肿瘤的指标。与此相对，在活检检体中，在胃癌对象与非癌对象之间未发现统计学上的显著性差异。另外，由于能如此大量回收来自胃癌对象的DNA，因此能以更高灵敏度和高精确度进行特异性DNA标记物的检测。
实施例4：甲基化DNA的检测
采用应用了实时PCR的MethyLight法对来自患有胃癌的人对象的试样中特定的甲基化DNA进行评价。作为测定对象的疾病相关标记物，采用PRDM5。已知该基因在癌细胞中以高频率被甲基化(参照Deng.Q.，Haung.S.Oncogene；23，4903-4910，2004)。首先，将实施例2中提取的DNA试样(活检检体使用2处活检)进行亚硫酸氢钠处理。即，将2μg的DNA与50μl的H2O混合，在其中添加5.5ml的2M NaOH并在37℃下孵育10分钟。然后，加入30μl的氢醌和520μl的亚硫酸氢钠，然后向上清中添加矿物油，在50℃下孵育16小时。然后，将反应液转移到新的微管中，加入1000μl的Wizard(注册商标)Resin(Promega)，通过过滤器排出后，用2ml的80％异丙醇再排出。在其中加入5.5μl的3M NaOH、1μl的糖原(20mg/ml)、66μl的5M乙酸铵以及310μl的100％乙醇，在-80℃下孵育1小时，然后离心分离30分钟，在得到的粒状沉淀中加入70％乙醇，再离心分离5分钟。将得到的粒状沉淀在20μl的H2O中溶解，将得到的溶液供于PCR。
如下操作进行PCR。首先，针对各检体制作亚硫酸氢钠处理后的DNA检体1μl、TaqMan(注册商标)mix25μl、引物(上游/下游)1μl、TaqMan(注册商标)探针2μl以及H2O 21μl形成的反应混合液(计50μl)。引物和探针使用以下的物质：
上游引物：TAGCGTTTAGGTTCGCGTTTTTCGC(序列号1)
下游引物：TACCGATTCCAAAATCCCCCGCGA(序列号2)
探针：TCGGGTCGAGTTCGATTCGGG-MGB(序列号3)
用Applied Biosystems 7900Fast实时PCR系统，将上述反应混合液在下表的条件下进行PCR扩增，检测荧光。
表1
Figure A200780017634D00191
结果如图4和5所示。由这些图可知，在血清试样中，无法检测出甲基化DNA，但在胃粘膜洗涤液试样中能以与活检检体相匹敌的灵敏度检测出甲基化DNA。
实施例5：hpu(H.pylori脲酶)基因的检测
用PCR法对来自患有各种胃病的5名人对象的胃粘膜洗涤液和活检检体中hpu基因的存在进行评价。上述5名患者的情况如下表所述。另外，快速脲酶试验(RUT)采用ヘリコチエツク(注册商标)(大塚制药株式会社)，并按照制造者的说明书进行。具体而言，将20mg尿素和4μg酚红溶于2.5ml的溶解液中，制备基质试剂液，将其5滴(约0.2ml)与适量的活检试样在反应杯中混合，在室温下静置2小时后，用肉眼观察试剂液色调的变化。
表2
 
对象编号 疾病种类 RUT结果
300 胃癌(4型) -
301 胃癌(3型) +
304 胃癌(4型) +
400 胃溃疡(A2-stage) +
hpu基因是与胃癌、胃溃疡等胃病密切相关的病原性H.pylori的标记物之一(例如参照Clayton CL et al.J Clin Microbiol.1992 Jan；30(1)：192-200)。PCR法如下进行。即，针对上述各检体，制作由DNA试样1μl、10×缓冲液5μl、dNTP 0.85μl、引物1μl、HS-Taq 0.2μl以及H2O 42μl形成的反应混合液，在下述条件下进行PCR，将扩增产物供于2.5％的琼脂糖凝胶电泳。另外，引物采用以下的物质。
上游引物(HPU-1)：5′-GCCAATGGTAAATTAGTT-3′(序列号4)
下游引物(HPU-2)：5′-CTCCTTAATTGTTTTTAC-3′(序列号5)
表3
结果如图6所示。由该图可知，在胃粘膜洗涤液试样中，能检测出未能在活检检体中检测到的hpu基因。另外，现有方法的利用活检试样的RUT将本应全为阳性的5个检体中的2个判断为阴性，而利用胃粘膜洗涤液试样进行的检查中未发生上述错误。这表明胃粘膜洗涤液试样具有高灵敏度和特异性，在诊断能力方面优异。
实施例6：检体pH对DNA回收量的影响
用大肠癌细胞株HCT116，以DNA回收可能量为指标探讨检体pH的不同对DNA损伤的程度。具体而言，将培养中的HCT116细胞回收，使其在经NaOH和HCl将pH分别调至1、3、5、7、9、11和13的SEDTA中暴露3小时或24小时。另外，3小时的暴露假定是从检体刚采集后到提取DNA的最长胃液暴露时间，24小时的暴露假定是从检体采集后将检体以未处理的状态直接送到检查场所到提取DNA时的最长胃液暴露时间。
在各pH、设定时间下孵育后，用NaOH和HCl将检体的pH调回7，用苯酚/氯仿法提取DNA(参照实施例2)，通过NanoDrop ND-1000分光光度计测定采集的DNA量(参照实施例3)。结果如图7和8所示。在3小时的暴露中，当检体的pH在5～11的范围内时，在24小时的曝光中，当检体的pH在7～11的范围内时能提取到相当量的DNA。特别是当检体的pH在9～11的范围内时，能稳定地提取到大量的DNA
实施例7：检体pH对DNA品质的影响
为了分析检体的pH对回收的DNA的品质所带来的影响，对DNA片段化和DNA修饰的耐久性进行研究。
(1)DNA的片段化
将实施例6中提取的各DNA试样供于1％琼脂糖凝胶电泳(图9)。无论暴露时间如何，均在暴露于pH为3～11的条件下的试样中检测出条带。另外，还可知在越碱性的条件下片段化越少。
(2)DNA修饰的耐久性
对回收的DNA是否具有能经受甲基化DNA检测中使用的亚硫酸氢盐(bisulfite)处理的品质进行研究。具体而言，将实施例6中提取的各DNA检体与实施例4同样地供于亚硫酸氢钠处理和利用MethyLight法进行的甲基化DNA的检测，荧光强度曲线立起则判断为甲基化阳性(图10)。与上述(1)的结果同样，无论暴露时间如何，均可在暴露于pH为3～11的条件下的试样中检测出甲基化DNA。而且，可在暴露于pH为7～9的条件下的试样中更稳定地检测出甲基化DNA。
序列表
<110>北海道公立大学法人札幌医科大学；
     圣玛丽安娜医科大学；
<120>利用胃粘膜洗涤液的疾病相关标记物检测法
<130>2260SI
<160>5
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>PRMD5sense primer
<400>1
Figure A200780017634D00221
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>PRDM5 antisense primer
<400>2
Figure A200780017634D00222
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>PRDM5 probe
<400>3
Figure A200780017634D00223
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>hpu sense primer
<400>4
Figure A200780017634D00231
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>hpu antisense primer
<400>5
Figure A200780017634D00232

Claims (10)

1、一种疾病相关标记物检测用的检体，其含有从经过了胃粘液除去处理的对象采集的胃粘膜洗涤液。
2、如权利要求1所述的检体，其含有5μg以上的核酸。
3、如权利要求1或2所述的检体，其进一步含有螯合剂和/或pH调节剂。
4、如权利要求1～3任一项所述的检体，其pH为3～11。
5、一种胃粘膜洗涤液采集的前处理剂，其含有胃粘液除去剂。
6、一种检测疾病相关标记物的方法，其包括从权利要求1～4任一项所述的检体中提取核酸的工序。
7、如权利要求6所述的方法，其进一步包括将检体的pH调节到3～11的工序。
8、一种评价药剂和/或治疗方法的治疗效果的方法，其包括用权利要求6或7所述的方法检测疾病相关标记物的工序。
9、一种胃粘膜洗涤液采集用的检体采集容器，其含有螯合剂和/或pH调节剂，且能够与内窥镜装置的吸引管道连接。
10、一种内窥镜装置，其连接有权利要求9所述的检体采集容器。
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