JP7239973B2 - 前癌病変又は癌の有無の予測を補助する方法 - Google Patents

Description

本発明、被検対象における前癌病変又は癌の有無の予測を補助する方法に関する。

厚生労働省が毎年行っている「人口動態統計」によれば、癌（悪性新生物）は、日本人の死因の１位を占めており、２位が心疾患、３位が肺炎である。平成２５年度統計結果では、癌による死亡者数は年間３６万人を超え、ほぼ３人に１人が癌で死亡していることになる。また、臓器別に見ると、男女で多少差があるものの、近年は大腸癌（結腸癌と直腸癌の合計）、肺癌、肝臓癌、胃癌で癌死亡率（人口１０万人に対して）が高い傾向にある。

癌は早期の発見がその治療にとっては何より重要であり、これまでに多くの検査手法が開発されてきた。主な検査手法としては、たとえば大腸癌の場合には便潜血検査、血液検査、直腸指診、大腸内視鏡を用いた診断などがある。しかしながら、大腸癌で広く用いられる便潜血検査は早期の癌の検出感度が低いという問題があった。また、大腸癌及び胃癌で広く用いられる内視鏡検査では、内視鏡検査に対する被検者の抵抗感が高いという問題があった。

こうしたなか本発明者らは、大腸癌の検査についてこれまで研究を進めてきた。まず、便潜血検査によらずに大腸癌の予後予測をする方法として、Ｔｗｉｓｔ ｈｏｍｏｌｏｇ １（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）遺伝子及び／又はＥｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ ｚｅｓｔｅ ｈｏｍｏｌｏｇ２（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）遺伝子の発現上昇を検出する、大腸癌の予後予測方法（特許文献１参照）を開示した。しかしながら、上記方法は患者の組織を切除する必要があり、侵襲性が高いという問題があった。

一方、癌に至らなくても、腺腫を有している状態が把握できれば、その後の経過を注意深く観察することで、たとえその後、癌になった場合でも初期段階での治療が可能となり、予後が良好となる可能性が高まる。また、腺腫の段階で内視鏡切除することで、癌の発生が減ると共に癌死亡率も減ることが報告されている。

そこで、本発明者らは、Ｔｗｉｓｔ ｈｏｍｏｌｏｇ １の所定領域内の１又は２以上のＣｐＧ配列のメチル化の頻度を測定することで大腸腫瘍の有無を予測する方法（特許文献２参照）を開示した。

また、本発明者らは、便中あるいは血清中のＴＷＩＳＴ１、ＮＤＲＧ４、ＢＭＰ３、又はＳＥＰＴ９遺伝子のメチル化の検出による大腸腫瘍の有無を予測する方法を開示した（特許文献３参照）。しかしながら、上記方法ではメチル化解析のためにＤＮＡの制限酵素処理が必要であった。

ところで、近年、血漿中や血清中のＤＮＡと癌との関係についても研究が進められている。たとえば、非特許文献１には、（１）血清中のＤＮＡ量が腫瘍マーカーＣＥＡと正の相関があること、（２）手術切除後に血清中ＤＮＡ量が低下し、癌が再発した時には血清中ＤＮＡ量が増加することが開示されている。また、非特許文献２には、（１）血漿中のＤＮＡ量が大腸癌患者で増加していること、（２）血漿中の長鎖ＤＮＡ断片／短鎖ＤＮＡ断片比が大腸癌患者で増加していることが開示されている。しかしながら、いずれの文献も腺腫と血清中ＤＮＡ量や血漿中ＤＮＡ量との関係は検討されていない。また、いずれの文献も進行が進んだ大腸癌患者の結果に過ぎず、癌初期段階での結果は示されていない。

特開２０１１－０６７１３０号公報 国際公開第２０１０／１１３５２９号パンフレット 国際公開第２０１７／０４３４９７号パンフレット

Quantitative and qualitative characterization of plasma DNAidentifies primary and recurrent colorectal cancer. Cancer Letters 263 170-181,2008 Increased integrity of free circulating DNA in sera ofpatients with colorectal or periampullary cancer: direct quantitative PCR forALU repeats. Clinical Chemistry 52:6 1062-1069, 2006

本発明の課題は、被検対象の生体試料から得られたＤＮＡを解析することで、被検対象における前癌病変又は癌の有無の予測を補助する方法を提供することにある。

腫瘍の予後予測マーカーがいくつかこれまで開発されてきているが、腫瘍の予後予測マーカーはあくまで進行癌の有無の予測で用いられること、及び前癌病変は通常完治できることから予後予測の必要性が乏しかったことから、腫瘍の予後予測マーカーを前癌病変の有無の予測に使えるとは通常考えにくい。そのため前癌病変の有無を予測するには、腫瘍の予後予測マーカーとは全く別に前癌病変の有無を予測する方法を検討する必要があった。そこで本発明者らは、まず血清中のｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数に着目し、かかるｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数に基づいて大腸癌だけでなく前癌病変である大腸腺腫であっても予測可能であることを見出した。また、血清中のｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数が血清中の二本鎖ＤＮＡの濃度と正の相関を示すことを明らかにし、血清中の二本鎖ＤＮＡの濃度に基づいて大腸腺腫の有無も予測可能であることを見出した。さらに、大腸癌以外にも検討を進めた結果、胃癌や肝臓癌においても血清中のｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数や二本鎖ＤＮＡの濃度に基づいて前癌病変又は癌も予測可能であることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）以下の工程（ａ）及び（ｂ）を備えたことを特徴とする、被検対象における前癌病変又は癌の有無の予測を補助する方法。
（ａ）被検対象から採取された生体試料中の二本鎖ＤＮＡの濃度又は量を測定する工程；
（ｂ）工程（ａ）で測定した二本鎖ＤＮＡの濃度又は量が所定のカットオフ値以上の場合に、被検対象において前癌病変又は癌を有するとの予測を補助する工程；
（２）前癌病変又は癌の有無の予測における癌が胃癌又は肝臓癌であることを特徴とする上記（１）記載の被検対象における前癌病変又は癌の有無の予測を補助する方法。
（３）所定のカットオフ値が、健常者から採取された生体試料中の二本鎖ＤＮＡの濃度又は量の中央値、平均値、又は、所定のパーセンタイル値であることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の被検対象における前癌病変又は癌の有無の予測を補助する方法。
（４）生体試料が血清又は血漿であることを特徴とする上記（１）～（３）のいずれか記載の被検対象における前癌病変又は癌の有無の予測を補助する方法。
（５）以下の工程（ｃ）及び（ｄ）を備えたことを特徴とする、被検対象における前癌病変又は癌の有無の予測を補助する方法。
（ｃ）被検対象から採取された生体試料中のヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子のコピー数を測定する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で測定したｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数が所定のカットオフ値以上の場合に、被検対象において前癌病変又は癌を有するとの予測を補助する工程；
（６）前癌病変又は癌の有無の予測における癌が胃癌又は肝臓癌であることを特徴とする上記（５）記載の被検対象における前癌病変又は癌の有無の予測を補助する方法。
（７）所定のカットオフ値が、健常者から採取された生体試料中のｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数の中央値、平均値、又は、所定のパーセンタイル値であることを特徴とする上記（５）又は（６）記載の被検対象における前癌病変又は癌の有無の予測を補助する方法。
（８）生体試料が血清又は血漿であることを特徴とする上記（５）～（７）のいずれか記載の被検対象における前癌病変又は癌の有無の予測を補助する方法。

本発明により、被検対象における前癌病変又は癌の有無の予測を非侵襲的、低コスト、簡易に補助することが可能となる。特に、本発明によれば、前癌病変や癌の初期段階でも、前癌病変又は癌であることを予測することが可能となる。

実施例１において、正常（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、非進行腺腫（Ｎｏｎ－ａｄｖａｎｃｅｄ ａｄｅｎｏｍａ）、進行腺腫（Ａｄｖａｎｃｅｄ ａｄｅｎｏｍａ）、又は、大腸癌（Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ（ＣＲＣ））と判断された患者それぞれにおける血清中のｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数の結果を示す図である。 実施例１において、（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に対する進行腺腫（Ａｄｖａｎｃｅｄ ａｄｅｎｏｍａ）とのＲＯＣ曲線の結果を示す図である。 実施例３において、血清中の二本鎖ＤＮＡ濃度（ｎｇ／μＬ：ＤＮＡサンプル溶液１μＬ（血清８μＬに相当）あたりの二本鎖ＤＮＡ含量）と血清中のｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数との関係を求めた図である。 実施例４において、正常（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、非進行腺腫（Ｎｏｎ－ａｄｖａｎｃｅｄ ａｄｅｎｏｍａ）、進行腺腫（Ａｄｖａｎｃｅｄ ａｄｅｎｏｍａ）、又は、大腸癌（Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ（ＣＲＣ））と判断された患者それぞれにおける血清から抽出した二本鎖ＤＮＡ濃度（ｎｇ／μＬ：ＤＮＡサンプル溶液１μＬ（血清８μＬに相当）あたりの二本鎖ＤＮＡ含量）の結果を示す図である。 実施例４において、正常（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に対する進行腺腫（Ａｄｖａｎｃｅｄ ａｄｅｎｏｍａ）とのＲＯＣ曲線の結果を示す図である。 実施例５において、血清サンプルからＤＮＡ抽出を行わずに、ダイレクトにデジタルＰＣＲを行った場合のデジタルＰＣＲの生データを示す図である。１つのドットが１つのドロップレットの蛍光量を示す。 実施例５において、血清サンプルからＤＮＡ抽出を行わずに、ダイレクトにデジタルＰＣＲを行った場合の各サンプルのｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数を示す図である。 実施例６において、正常（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、胃の過形成ポリープ（Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｔｉｃ ｐｏｌｙｐ）、胃腺腫（ａｄｅｎｏｍａ）、又は、胃癌（Ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）と判断された患者それぞれにおけるｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数の結果を示す図である。 実施例６において、正常（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に対する胃癌（Ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）とのＲＯＣ曲線の結果を示す図である。 実施例７において、血清中の二本鎖ＤＮＡ濃度（ｎｇ／μＬ：ＤＮＡサンプル溶液１μＬ（血清８μＬに相当）あたりの二本鎖ＤＮＡ含量）と血清中のｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数との関係を求めた図である。 実施例８において、正常（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、胃の過形成ポリープ（Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｔｉｃ ｐｏｌｙｐ）、胃腺腫（ａｄｅｎｏｍａ）、又は、胃癌（Ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）と判断された患者それぞれにおける血清から抽出した二本鎖ＤＮＡ濃度（ｎｇ／μＬ：ＤＮＡサンプル溶液１μＬ（血清８μＬに相当）あたりの二本鎖ＤＮＡ含量）の結果を示す図である。 実施例８において、正常（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に対する胃癌（Ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）とのＲＯＣ曲線の結果を示す図である。 実施例９において、正常（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、慢性肝障害、又は、肝臓癌と判断された患者それぞれにおける血清中の二本鎖ＤＮＡ濃度（ｎｇ／μＬ：ＤＮＡサンプル溶液１μＬ（血清８μＬに相当）あたりの二本鎖ＤＮＡ含量）をまとめた結果を示す図である。 実施例９において、正常（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に対する慢性肝障害とのＲＯＣ曲線の結果を示す図である。 実施例９において、正常（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に対する肝臓癌とのＲＯＣ曲線の結果を示す図である。 実施例９において、慢性肝障害に対する肝臓癌とのＲＯＣ曲線の結果を示す図である。

本発明は、（ａ）被検対象から採取された生体試料中の二本鎖ＤＮＡの濃度又は量を測定する工程；（ｂ）工程（ａ）で測定した二本鎖ＤＮＡの濃度又は量が所定のカットオフ値以上の場合に、被検対象において前癌病変又は癌を有するとの予測を補助する工程；の工程（ａ）及び（ｂ）を備えたことを特徴とする、被検対象における前癌病変又は癌の有無の予測を補助する方法や、（ｃ）被検対象から採取された生体試料中のｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数を測定する工程；（ｄ）工程（ｃ）で測定したｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数が所定のカットオフ値以上の場合に、被検対象において前癌病変又は癌を有するとの予測を補助する工程；以下の工程（ｃ）及び（ｄ）を備えたことを特徴とする、被検対象における前癌病変又は癌の有無の予測を補助する方法であり、かかる方法により被検対象における前癌病変又は癌の有無の予測を非侵襲的、低コスト、簡易に補助することが可能となる。

本発明において、「癌」とは、大腸癌（結腸癌又は直腸癌）、胃癌、肝臓癌、脳腫瘍、肺癌（腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌）、食道癌、十二指腸癌、小腸癌、皮膚癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、膣癌、子宮頸部癌、子宮体癌、腎臓癌、膵臓癌、脾臓癌、気管癌、気管支癌、頭頚部癌、胆嚢癌、胆管癌、精巣癌、卵巣癌などの癌、骨組織・軟骨組織・脂肪組織・筋組織・神経組織・血管組織及び造血組織の癌（軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、骨肉腫、軟部組織肉腫などの肉腫や、肝芽腫、髄芽腫、腎芽腫、神経芽腫、膵芽腫、胸膜肺芽腫、網膜芽腫などの芽腫や、胚細胞腫瘍や、リンパ腫や、白血病）を挙げることができ、大腸癌、胃癌、肝臓癌を好適に挙げることができ、大腸癌をより好適に挙げることができる。

本発明において、「前癌病変」とは、正常組織よりも癌を発生しやすい状態へと形態学的に変化した組織を意味する。なお、上記「前癌病変」における癌は、上記「癌」として挙げたそれぞれの癌を挙げることができる。具体的には、大腸癌の前癌病変としては、大腸の進行腺腫（Ａｄｖａｎｃｅｄ ａｄｅｎｏｍａ）、胃癌の前癌病変としては、癌化との関連性が認められる１ｍｍ以上の過形成ポリープ（Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｔｉｃ ｐｏｌｙｐ）や５ｍｍ以上の胃腺腫（ａｄｅｎｏｍａ）、肝臓であれば慢性肝障害、乳腺であれば慢性乳腺症、子宮頚部であれば子宮頚部の異形成を挙げることができる。

なお、上記大腸における前癌病変又は癌の発生する組織としては、盲腸、結腸、直腸、肛門等を挙げることができる。

「前癌病変又は癌」とは、「前癌病変」と「癌」のいずれかであることを意味し、癌にはステージIIIやIVの段階だけでなく、ステージ０やIやIIの段階の癌も含まれる。換言すれば、癌が進行してステージIIIやIVの段階にならなくても、早期発見による治療によって死亡率が低下する前癌病変やステージ０やIやIIの段階でその病態を把握し、その後の癌の予後や治療が可能となる。

生体試料としては、血清、血漿、血液、唾液、尿などを挙げることができ、血清又は血漿を好適に挙げることができる。

生体試料中の二本鎖ＤＮＡを抽出する方法としては、フェノール抽出法、フェノール・クロロホルム抽出法、アルカリ溶解法等や、市販のＤＮＡ抽出試薬を用いる方法を挙げることができる。

生体試料中の二本鎖ＤＮＡの濃度又は量を測定する場合や、ｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数を測定するにあたって、生体試料中のＤＮＡを抽出し、かかるＤＮＡから二本鎖ＤＮＡの濃度又は量の測定や、ｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数の測定を行ってもよく、生体試料中のＤＮＡの抽出を行わず、生体試料中から直接二本鎖ＤＮＡの濃度又は量の測定や、ｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数の測定を行ってもよい。

生体試料中の二本鎖ＤＮＡの濃度又は量を測定する方法は特に限定されず、市販のＤＮＡの濃度又は量の測定キットを用いる方法や、電気泳動法を挙げることができる。

ターゲットを二本鎖ＤＮＡとするのは、血液（血漿又は血清）中のセルフリーＤＮＡは二本鎖であり、高度に断片化しており、約１５０ｂｐの長さであることから、測定値の正確性や再現性の観点から好ましいためである。

ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）は、ヒトの染色体末端（テロメア）の特異的反復配列を伸長させる酵素である。かかるｈＴＥＲＴは、発現することにより、発現した細胞において複製老化を回避するのに十分なテロメア長を維持することが知られている。

生体試料中のｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数を測定する方法は特に限定されず、市販の遺伝子コピー数測定キットを用いる方法や、後述する実施例に示すように、デジタルＰＣＲ等のＰＣＲによる方法や、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法や、リアルタイム定量ＰＣＲ法を挙げることができる。ＰＣＲにより増幅する場合の増幅する配列の長さとしては、２０～３００塩基、好ましくは３０～２００塩基、より好ましくは５０～１５０塩基を挙げることができる。

上記「デジタルＰＣＲ」は、サンプルＤＮＡ量を絶対定量する方法である。この方法では、サンプルＤＮＡを約２万個の小水滴（ドロップレット）に分画し、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲを行う。ターゲットＤＮＡが入っている小水滴は光り、入っていない小水滴は変化しない。光っている小水滴と光っていない小水滴の数をカウントすることでサンプル中の測定対象遺伝子の濃度を絶対的な数値として出すことができるという原理である。データは、小水滴（ドロップレット）のターゲットＤＮＡのアリ／ナシで判断することから、それがデジタル信号の１／０と同じなので「デジタルＰＣＲ」という。「コピー数カウント」は、ドロップレットリーダーによって、上記２万個の小水滴（ドロップレット）を一つずつ蛍光量測定し、蛍光を発するドロップレットの数をカウントすることで、遺伝子のコピー数の絶対値を計測する工程を意味する。

本発明の工程（ｂ）において、被検対象において前癌病変又は癌を有するとの予測を補助する際の所定のカットオフ値としては特に制限されないが、例えば、健常者から採取された生体試料中の二本鎖ＤＮＡの濃度又は量を測定し、その二本鎖ＤＮＡの濃度又は量の中央値、平均値、又は、所定のパーセンタイル値を挙げることができる。所定のパーセンタイル値としては、５０パーセンタイル、好ましくは６０パーセンタイル、より好ましくは７５パーセンタイル、さらに好ましくは８０パーセンタイル、最も好ましくは９０パーセンタイルを挙げることができる。

また、生体試料中の二本鎖ＤＮＡの濃度又は量を基に、所望の感度、特異度となるように作成した受信者操作特性曲線（ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ：ＲＯＣ）に基づきカットオフ値を求めてもよい。また、カットオフ値を求める具体的方法としては、感度＝１００％（Ｙ座標）、１００％－特異度＝０％（Ｘ座標）の点からなるべく近いＲＯＣ曲線上の点で、かつ、高い特異度が得られるよう設定してカットオフ値を求める方法を挙げることができる。このカットオフ値は目的に応じて設定でき、たとえば、偽陽性を避けて高い特異度を求める場合には、Ｙｏｕｄｅｎ ｉｎｄｅｘ「感度（％）＋特異度（％）－１００％」により求めた値が最も高値になるカットオフ値とすることができる。なお、カットオフ値、感度、特異度は相関し、カットオフ値を決めると感度と特異度も一組決まるので、カットオフ値を低いほうから高いほうへ順に変えていくと、そのカットオフ値の数だけ感度と特異度が求められる。

本発明の工程（ｄ）において、被検対象において前癌病変又は癌を有するとの予測を補助する際の所定のカットオフ値としては特に制限されないが、例えば、健常者から採取された生体試料中のｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数を測定し、そのｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数の中央値、平均値、又は、所定のパーセンタイル値を挙げることができる。所定のパーセンタイル値としては、５０パーセンタイル、好ましくは６０パーセンタイル、より好ましくは７５パーセンタイル、さらに好ましくは８０パーセンタイル、最も好ましくは９０パーセンタイルを挙げることができる。また、生体試料中のｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数を基に、上述と同様に所望の感度、特異度となるように作成したＲＯＣに基づきカットオフ値を求めてもよい。

上記工程（ｂ）において、被検対象から採取された生体試料中の二本鎖ＤＮＡの濃度又は量が上記所定のカットオフ値以上であれば、被検対象において前癌病変又は癌を有する可能性が高いとの予測を補助することができる。同様に上記工程（ｄ）において、被検対象から採取された生体試料中のｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数が所定のカットオフ値以上であれば、被検対象において前癌病変又は癌を有する可能性が高いとの予測を補助することができる。また、例えば癌が大腸癌の場合においては、下部消化管内視鏡検査によって容易に判別が可能であるため、前癌病変又は癌を有する可能性が高いと予測された患者については、さらに癌か否かを内視鏡検査等で調べることで、大腸腫瘍が大腸癌か大腸腺腫（非進行腺腫又は進行腺腫）かを判別し、その後の治療や検診の方針の参考とすることが可能となる。

なお、上記工程（ｂ）において、被検対象から採取された生体試料中の二本鎖ＤＮＡの「濃度」を用いる場合には、カットオフ値を求める際には健常者から採取された生体試料中の二本鎖ＤＮＡの「濃度」を用いることとなり、ここでの濃度は、同量の生体試料あたりの二本鎖ＤＮＡ量で揃えるようにする。同様に、上記工程（ｂ）において、被検対象から採取された生体試料中の二本鎖ＤＮＡの「量」を用いる場合には、カットオフ値を求める際には健常者から採取された生体試料中の二本鎖ＤＮＡの「量」を用いることとなり、ここでの量は、同量の生体試料あたりの二本鎖ＤＮＡ量で揃えるようにする。

また、上記工程（ｄ）において、被検対象から採取された生体試料中のｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数を用いる場合には、カットオフ値を求める際には健常者から採取された生体試料中のｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数を用いることとなり、ここでのコピー数は、同量の生体試料あたりのｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数で揃えるようにする。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの
例示に限定されるものではない。

［実施例１］血清中のｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数による前癌病変又は大腸癌の有無の予測
１．血清からのＤＮＡ抽出
血清は精密検査で、正常（Ｃｏｎｔｒｏｌ：ｎ＝２５）、非進行腺腫（Ｎｏｎ―ａｄｖａｎｃｅｄ ａｄｅｎｏｍａ：ｎ＝２５）、進行腺腫（Ａｄｖａｎｃｅｄ ａｄｅｎｏｍａ：ｎ＝７０）、又は、大腸癌（Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ（ＣＲＣ）：ｎ＝１８;ステージI＝１４症例、ステージII＝１症例、ステージIII＝３症例）と判断された患者の血清を用いた。なお、上記「進行腺腫」は、径１ｃｍ以上の腺腫、ｖｉｌｌｏｕｓ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ（絨毛状成分）、(tｕｂｕｌｏｖｉｌｌｏｕｓ（管状絨毛状）若しくはｖｉｌｌｏｕｓ（絨毛状）)を合併する腺腫、又はｈｉｇｈ－ｇｒａｄｅ ｏｒ ｓｅｖｅｒｅ ｄｙｓｐｌａｓｉａ（高度異型性）を合併する腺腫とした。また、「非進行腺腫」は、良性腫瘍のうち上記進行腺腫に該当せず、転移性のない腺腫とした。

血清からのＤＮＡ抽出方法は以下の方法で行った。
ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅコンパクト核酸アイソレーションキットＩ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を使用し、４００μＬの血清から、自動サンプル抽出機ＭａｇＮａ Ｐｕｒｅ Ｃｏｍｐａｃｔシステムの「ＤＮＡ＿Ｂｌｏｏｄ＿１００＿４００」プロトコルによりＤＮＡを自動抽出し、最終的に５０μＬのバッファーに溶出してサンプルＤＮＡ液を得て、その後の測定に用いた。

２．デジタルＰＣＲ
上記で得たサンプルＤＮＡ液を用いてデジタルＰＣＲを以下の方法で行い、ｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数をカウントした。
（１）ＰＣＲ反応液の作製
サンプルＤＮＡ液 ５．０μＬ
水 ５．０μＬ
ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ ｐｒｏｂｅｓ
（＃１８６－３０１０， ＢｉｏＲａｄ社製） １０．０μＬ
１０μＭ ｈＴＥＲＴフォワードプライマー（配列番号１） ０．５μＬ
１０μＭ ｈＴＥＲＴリバースプライマー（配列番号２） ０．５μＬ
５μＭ ｈＴＥＲＴ ＴａｑＭａｎプローブ（配列番号３の５’末端に蛍光物質ＶＩＣ、３’末端にＭｉｎｏｒ Ｇｒｏｏｖｅ Ｂｉｎｄｅｒ（ＭＧＢ）を修飾）
１．０μＬ
（２）ドロップレット作製
ＰＣＲ反応液をＡｕｔｏＤＧシステム（ＢｉｏＲａｄ社製）にセットし、ドロップレットを作製した。
（３）ＰＣＲ反応
以下の条件でＰＣＲを行った。
９５度１０分
４０サイクル（９４度３０秒、５６度１分、ランプ速度２度／秒）
９８度１０分
（４）コピー数カウント
ＱＸ１００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲシステムのＤｒｏｐｌｅｔ Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社製）にＰＣＲ反応済み検体をセットし、各液滴内のＴａｑＭａｎプローブ由来の蛍光色素を検出することで、ｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数（血清４０μＬあたりのｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数）をカウントした。

３．結果
正常（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、非進行腺腫（Ｎｏｎ―ａｄｖａｎｃｅｄ ａｄｅｎｏｍａ）、進行腺腫（Ａｄｖａｎｃｅｄ ａｄｅｎｏｍａ）、又は、大腸癌（Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ（ＣＲＣ））と判断された患者それぞれにおけるｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数（血清４０μＬあたりのｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数）の結果を図１に、また、正常（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に対する進行腺腫（Ａｄｖａｎｃｅｄ ａｄｅｎｏｍａ）とのＲＯＣ曲線の結果を図２示す。

図１に示すように、ｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数は大腸癌患者だけでなく前癌病変である大腸進行腺腫の患者においても増加していることが明らかとなった。さらに、図２に示すように、カットオフ値を１２１１コピーとすれば、感度５３％、特異度７２％で大腸進行腺腫を有すると予測可能であることが明らかとなった。大腸癌は、進行しても自覚症状がないことが多いが、早期であればほぼ完全に治癒するため、自覚症状のない前癌病変も含めた状況を早期に把握することが重要となる。本発明により、前癌病変の状態であってもその状態を把握することが可能であることが明らかとなった。なお、上記カットオフ値１２１１コピーは、感度＝１００％（Ｙ座標）、１００％－特異度＝０％（Ｘ座標）の点からなるべく近いＲＯＣ曲線上の点で、かつ、高い特異度が得られるように設定して求めた。このカットオフ値は目的に応じて設定でき、例えば、図２中、（ｘ）、（ｙ）の位置のコピー数としてもよく、（ｘ）の位置のコピー数をカットオフ値とした場合の感度、特異度はそれぞれ１９％、９１％であり、（ｙ）の位置のコピー数をカットオフ値とした場合の感度、特異度はそれぞれ７１％、５２％である。また、偽陽性を避けて高い特異度を求める場合には、Ｙｏｕｄｅｎ ｉｎｄｅｘ「感度（％）＋特異度（％）－１００％」により求めた値が最も高値になる位置のコピー数としてもよい。

［実施例２］血清中の二本鎖ＤＮＡ濃度
Ｑｕｂｉｔ（登録商標）蛍光定量による二本鎖ＤＮＡ濃度を、Ｑｕｂｉｔ ａｓｓａｙｓ Ｑｕｉｃｋ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/qubit_assays_qrc.pdf）を参考にして以下の方法で行った。
（１）キット及びチューブの用意
Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｑ３２８５１又はＱ３２８５４）及び０．５ｍＬ透明チューブ（Ｑｕｂｉｔ ａｓｓａｙ ｔｕｂｅ，Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｑ３２８５６)を用意した。
（２）Ｑｕｂｉｔ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎの作製
Ｑｕｂｉｔ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを以下により作製した。
Ｉ． Ｑｕｂｉｔ ｒｅａｇｅｎｔを１μＬ×サンプル数分用意した。
II． Ｑｕｂｉｔ ｂｕｆｆｅｒを１９９μＬ×サンプル数分用意した。
III. 上記I.IIを混合した。
（３）スタンダードの調製
Ｉ．Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ ＨＳ ｓｔａｎｄａｒｄ ＃１ １０μＬとＱｕｂｉｔ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ １９０μＬをボルテックスで２－３秒間混合し、その後２分間静置した。
II．Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ ＨＳ ｓｔａｎｄａｒｄ ＃２ １０μＬとＱｕｂｉｔ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ １９０μＬをボルテックスで２－３秒間混合し、その後２分間静置した。
（４）測定サンプルの調整
Ｉ．上記実施例１と同様の方法で、血清４００μＬからサンプルＤＮＡ液を得た。
II．測定対象となるサンプルＤＮＡ液 １－２０μＬにＱｕｂｉｔ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えて最終的に２００μＬとし、ボルテックスで２－３秒間混合し、その後２分間静置した。
（５）Ｑｕｂｉｔ ２．０ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒによる測定
Ｉ．希釈したｓｔａｎｄａｒｄ＃１をＱｕｂｉｔ ２．０にセットし、キャリブレーションを行った。
II．希釈したｓｔａｎｄａｒｄ＃２をＱｕｂｉｔ ２．０にセットし、キャリブレーションを行った。
III．測定対象サンプルをｓｔａｎｄａｒｄ＃２をＱｕｂｉｔ ２．０にセットし、Ｑｕｂｉｔ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ溶液中の二本鎖ＤＮＡ濃度を求めた。続いて、Ｑｕｂｉｔ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎによるＤＮＡ希釈倍率で補正し、最終的に、ＤＮＡサンプル液中の二本鎖ＤＮＡ濃度（ｎｇ／μＬ）を算出した。なお、ここでのＤＮＡサンプル液中の二本鎖ＤＮＡ濃度（ｎｇ／μＬ）はＤＮＡサンプル液１μＬ中の二本鎖ＤＮＡ量（ｎｇ）である。これは、血清８μＬあたりの二本鎖ＤＮＡ量（ｎｇ）に相当する。

［実施例３］血清中の二本鎖ＤＮＡ濃度と血清中のｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数との関係
実施例２で求めた血清中の二本鎖ＤＮＡ濃度をＸ軸とし、実施例１で求めた血清中のｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数をＹ軸としてそれぞれの関係を求めたグラフを図３に示す。図３に示すように、血清中の血清中の二本鎖ＤＮＡ濃度と血清中のｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数とは正の相関があることが明らかとなった。

［実施例４］検体の血清中の二本鎖ＤＮＡ濃度による大腸進行腺腫の有無の予測
上述のように、実施例１において血清中のｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数により大腸進行腺腫の有無の予測ができ、実施例３において血清中のｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数と血清中の二本鎖ＤＮＡとは正の相関があったため、血清中の二本鎖ＤＮＡ濃度によって大腸進行腺腫や大腸癌の有無の予測ができるのではないかと考えた。そこで、正常（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、非進行腺腫（Ｎｏｎ－ａｄｖａｎｃｅｄ ａｄｅｎｏｍａ）、進行腺腫（Ａｄｖａｎｃｅｄ ａｄｅｎｏｍａ）、又は、大腸癌（Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ（ＣＲＣ））と判断された患者それぞれにおける血清中の二本鎖ＤＮＡ濃度をまとめた結果を図４に、また、正常（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に対する進行腺腫（Ａｄｖａｎｃｅｄ ａｄｅｎｏｍａ）とのＲＯＣ曲線の結果を図５示す。

図４に示すように、血清から抽出した二本鎖ＤＮＡ濃度は大腸癌患者だけでなく大腸進行腺腫患者においても増加していることが明らかとなった。さらに、図５示すように、カットオフ値を０．２７４ｎｇ／μＬとすれば、感度４４％、特異度７２％で大腸進行腺腫を有すると予測可能であることが明らかとなった。なお、上記カットオフ値０．２７４ｎｇ／μＬは、感度＝１００％（Ｙ座標）、１００％－特異度＝０％（Ｘ座標）の点からなるべく近いＲＯＣ曲線上の点で、かつ、高い特異度が得られるよう設定して求めた。このカットオフ値は実施例１に記載したとおり、目的に応じて適宜設定できる。

従来、癌患者において血清中の二本鎖ＤＮＡ濃度が増加していることは知られていた。この原因の一つとしては、癌患者の場合には癌細胞が壊れて二本鎖ＤＮＡ断片が多量に生成し、癌細胞の血管への浸潤や炎症等により透過性が著しく亢進した周辺の血管中にその二本鎖ＤＮＡ断片が入ることによるものと考えられる。しかしながら、まだ組織としては正常であり低透過性を維持した血管を有する前癌病変の患者においても血清中の二本鎖ＤＮＡ濃度が増加することは驚くべきことであった。

［実施例５］血清中のｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数の測定
実施例１では血清からＤＮＡを抽出したうえでｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数を測定したが、以下の方法により、血清からＤＮＡを抽出せずにｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数を測定することが可能となる。

血清２μＬに水を４８μＬ加えて血清希釈液とした。次に、実施例１のＰＣＲ反応液の作製において、サンプルＤＮＡ液５μＬの代わりに上記血清希釈液を５μＬ用いた以外は、実施例１と同様にデジタルＰＣＲを行った。

デジタルＰＣＲの生データを図６に、各サンプルのｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数の結果を図７に示す。図６、７に示すように、４症例から得た血清検体サンプルＡ～ＤのｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数はそれぞれ３、６、４、４であり、血清サンプルからＤＮＡ抽出を行わずに、ダイレクトにデジタルＰＣＲが可能であることが明らかとなった。

［実施例６］血清中のｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数による胃の前癌病変又は胃癌の有無の予測
実施例１において、血清中のｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数により前癌病変又は大腸癌の有無の予測が可能であることが明らかとなった。そこで、さらに他の癌でも上記予測について応用可能かどうかを確認するために、胃病変患者の血清によって同様の解析を行った。

１．血清からのＤＮＡ抽出及びデジタルＰＣＲ
実施例１と同様の方法で、血清からのＤＮＡ抽出及びデジタルＰＣＲを行い、血清４０μＬあたりの胃病変患者のｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数をカウントした。血清は精密検査で、正常（Ｃｏｎｔｒｏｌ：ｎ＝２７：慢性胃炎患者８名含む）、前癌病変である胃の１０ｍｍ大の過形成ポリープ（Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｔｉｃ ｐｏｌｙｐ：ｎ＝１）、前癌病変である胃の５、７、１７、２０、２２ｍｍ大の腺腫（ａｄｅｎｏｍａ：ｎ＝５）、又は、胃癌（Ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ：ｎ＝２０；ステージI＝１８症例、ステージII＝２症例）と判断された患者の血清を用いた。

２．結果
正常（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、胃の過形成ポリープ（Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｔｉｃ ｐｏｌｙｐ）、胃腺腫（ａｄｅｎｏｍａ）、又は、胃癌（Ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）と判断された患者それぞれにおけるｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数の結果を図８に、また、正常（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に対する胃癌（Ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）とのＲＯＣ曲線の結果を図９示す。

図８に示すように、ｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数は胃癌患者だけでなく胃の１０ｍｍ大の過形成ポリープや胃の５、７、１７、２０、２２ｍｍ大の腺腫を有する患者においても健常者と比較して明らかに増加していることが明らかとなった。さらに、図９に示すように、カットオフ値を７５５コピーとすれば、感度６５％、特異度９６％で胃癌を有すると予測可能であることが明らかとなった。また、コントロールに慢性胃炎患者も含んでいることから、炎症によるＴＥＲＴコピー数への影響は少ないことが確認された。なお、上記カットオフ値７５５コピーは、感度＝１００％（Ｙ座標）、１００％－特異度＝０％（Ｘ座標）の点からなるべく近いＲＯＣ曲線上の点で、かつ、高い特異度が得られるよう設定して求めた。このカットオフ値は実施例１に記載したとおり、目的に応じて適宜設定できる。

［実施例７］血清中のｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数と血清中の二本鎖ＤＮＡ濃度との関係
実施例２と同様に、正常（Ｃｏｎｔｒｏｌ：ｎ＝２７：慢性胃炎患者８名含む）、胃の１０ｍｍ大の過形成ポリープ（Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｔｉｃ ｐｏｌｙｐ：ｎ＝１）、胃の５、７、１７、２０、２２ｍｍ大の腺腫（ａｄｅｎｏｍａ：ｎ＝５）、又は、胃癌（Ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ：ｎ＝２０）と判断された患者（一部の患者からは複数検体）における血清中の二本鎖ＤＮＡ濃度を測定した。次に、求めた血清中の二本鎖ＤＮＡ濃度をＸ軸とし、実施例６で求めた血清中のｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数をＹ軸としてそれぞれの関係を求めたグラフを図１０に示す。図１０に示すように、血清中のｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数と血清中の二本鎖ＤＮＡ濃度とは胃病変患者においても正の相関があることが明らかとなった。

［実施例８］検体の血清中の二本鎖ＤＮＡ濃度による胃の前癌病変又は胃癌の有無の予測
上述のように、実施例６において血清中のｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数により胃の前癌病変又は胃癌の有無の予測ができ、実施例７において血清中のｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数と血清中の二本鎖ＤＮＡとは正の相関があったため、血清中の二本鎖ＤＮＡによって胃の前癌病変又は胃癌の有無の予測ができるのではないかと考えた。そこで、正常（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、胃の過形成ポリープ（Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｔｉｃ ｐｏｌｙｐ）、胃腺腫（ａｄｅｎｏｍａ）、又は、胃癌（Ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）と判断された患者それぞれにおける血清中の二本鎖ＤＮＡ濃度（ｎｇ／μＬ）をまとめた結果を図１１に、また、正常（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に対する胃癌（Ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）とのＲＯＣ曲線の結果を図１２に示す。

図１１に示すように、血清から抽出した二本鎖ＤＮＡ濃度は胃癌だけでなく胃の前癌病変である胃の過形成ポリープや胃腺腫においても増加していることが明らかとなった。さらに、図１２示すように、カットオフ値を０．１４３５ｎｇ／μＬとすれば、感度６５％、特異度９６％で胃癌を有すると予測可能であることが明らかとなった。なお、上記カットオフ値０．１４３５ｎｇ／μＬは、感度＝１００％（Ｙ座標）、１００％－特異度＝０％（Ｘ座標）の点からなるべく近いＲＯＣ曲線上の点で、かつ、高い特異度が得られるよう設定して求めた。このカットオフ値は実施例１に記載したとおり、目的に応じて適宜設定できる。

［実施例９］検体の血清中の二本鎖ＤＮＡ濃度による肝臓の前癌病変又は肝臓癌の有無の予測
大腸癌、胃癌と同様に患者数が多い肝臓癌患者についても、血清から抽出した二本鎖ＤＮＡ濃度との関係を調べた。

実施例１、２と同様の方法で、血清４０μＬからのＤＮＡ抽出及び血清中の二本鎖ＤＮＡ濃度の測定を行った。血清は精密検査で、正常（Ｃｏｎｔｒｏｌ：ｎ＝２７）、肝臓の前癌病変である慢性肝障害（ｎ＝２３）、又は、肝臓癌（ｎ＝３９）と判断された患者の血清を用いた。

正常（Ｃｏｎｔｒｏｌ：ｎ＝２７）、慢性肝障害（ｎ＝２３）、又は、肝臓癌（ｎ＝３９）と判断された患者それぞれにおける血清中の二本鎖ＤＮＡ濃度をまとめた結果を図１３に、また、正常（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に対する慢性肝障害とのＲＯＣ曲線の結果を図１４に、正常（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に対する肝臓癌とのＲＯＣ曲線の結果を図１５に、慢性肝障害に対する肝臓癌とのＲＯＣ曲線の結果を図１６に示す。

図１３に示すように、血清から抽出した二本鎖ＤＮＡ濃度は肝臓癌だけでなく肝臓の前癌病変である慢性肝障害においても増加していることが明らかとなった。さらに、図１４～１６に示すように、ＲＯＣ曲線に基づいて慢性肝障害又は肝臓癌を有すると予測可能であることが明らかとなった。

Claims (5)

1. 以下の工程（ａ）及び（ｂ）を備えたことを特徴とする、被検対象における前癌病変の有無の予測を補助する方法であって、前記前癌病変が、大腸の進行腺腫、胃の過形成ポリーブ若しくは胃腺腫である、前記方法。
   （ａ）被検対象から採取された血清又は血漿中の二本鎖ＤＮＡの濃度又は量を測定する工程；
   （ｂ）工程（ａ）で測定した二本鎖ＤＮＡの濃度又は量が所定のカットオフ値以上の場合に、被検対象において前癌病変を有するとの予測を補助する工程；
2. 所定のカットオフ値が、健常者から採取された血清又は血漿中の二本鎖ＤＮＡの濃度又は量の中央値、平均値、又は、所定のパーセンタイル値であることを特徴とする請求項１記載の被検対象における前癌病変の有無の予測を補助する方法。
3. 以下の工程（ｃ）及び（ｄ）を備えたことを特徴とする、被検対象における前癌病変の有無の予測を補助する方法であって、前記前癌病変が、大腸の進行腺腫、胃の過形成ポリーブ若しくは胃腺腫である、前記方法。
   （ｃ）被検対象から採取された血清又は血漿中のヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子のコピー数を測定する工程；
   （ｄ）工程（ｃ）で測定したｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数が所定のカットオフ値以上の場合に、被検対象において前癌病変を有するとの予測を補助する工程；
4. 所定のカットオフ値が、健常者から採取された血清又は血漿中のｈＴＥＲＴ遺伝子のコピー数の中央値、平均値、又は、所定のパーセンタイル値であることを特徴とする請求項３記載の被検対象における前癌病変の有無の予測を補助する方法。
5. 工程（ｃ）が、被検対象から採取された血清又は血漿中のヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子のコピー数を、ＤＮＡを抽出せずに測定する工程であることを特徴とする請求項３又は４記載の被検対象における前癌病変の有無の予測を補助する方法。

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