WO2016209011A1 - 전도성 고분자를 이용한 세포 유리 dna 검출용 구조체 및 이의 용도 - Google Patents

전도성 고분자를 이용한 세포 유리 dna 검출용 구조체 및 이의 용도 Download PDF

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WO2016209011A1
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conductive polymer
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PCT/KR2016/006728
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조영남
이은숙
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국립암센터
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Definitions

  • the present invention relates to a structure for detecting cell free DNA using a conductive polymer and its use, and more particularly, to isolate and detect cell-free DNA such as circulating tumor DNA. It relates to using a planar structure or a nanostructure consisting of.
  • Circulating cell-free DNA has been studied in various physiological and pathological conditions, such as inflammatory disorders, oxidative stress and malignant tumors.
  • their blood concentration is 0-100 ng / ml, on average 30 ng / ml.
  • this number corresponds to an average genome equivalent of 0-15,000 per ml of blood, with an average genome of 5000 per ml.
  • Most of this DNA is double stranded and apparently in the form of nucleoprotein complexes.
  • Circulating cell-free DNA is a potentially useful biomarker, with DNA levels and fragmentation patterns present interesting possibilities for diagnostic and prognostic prediction purposes.
  • Bartov et al. Disclosed a method for evaluating the reproductive status of a male individual based on cfDNA measured in a bodily fluid sample (WO2008 / 047364). They also proposed a method for treating low fertility in men by administering DNase to subfertile men.
  • cell-free DNA has been proposed as a non-invasive monitoring biomarker for malignant and benign proliferation and inflammatory conditions such as endometriosis.
  • CTC circulating tumor cell
  • ctDNA circulating tumor DNA
  • a method of diagnosing cancer through noninvasive blood samples is a very interesting area that is currently receiving a lot of attention. If the separation / detection of CTC and ctDNA from blood samples is effective, it can be a basis for establishing a diagnosis and treatment strategy. Since the treatment may be periodically selected according to the genetic change of the tumor due to the resistance, the effect of the existing cancer treatment may be maximized.
  • Circulating tumor cells are cells of epithelial organs present in the blood of patients with different solid malignancies, which are derived from clones of primary tumors and are malignant (Fem et al., Clin. Cancer Res. 8: 2073-84, 2002). It is also known that CTC may be considered to be an independent diagnosis of cancer progression of carcinomas.
  • Detection and production of circulating tumor cells is important in the management of patients for a variety of reasons. They can be detected before the primary tumor, thus allowing early stage diagnosis. As they decrease in response to treatment, the ability to yield CTCs allows monitoring the effectiveness of a given treatment regimen. They can be used as a tool for monitoring the recurrence of patients with diseases that cannot be estimated in the adjuvant environment.
  • the CTC and ctDNA are present in the blood in a very small amount, for example about 1 per 10 8-10 9 blood cell components, and thus several CTC separation methods have been proposed.
  • a method using a microfluidic device in which a capture antibody is bound to a resin surface such as a magnetic particle immobilized with an anti-EpCAM (epidermal cell adhesion molecule) antibody or a columnar structure and the size of CTC and blood cells Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology.
  • a common method for extracting ctDNA is to use commercially available kits.
  • the Qiagen Circulating Nucleic Acid Kit uses a positively charged silica membrane to induce DNA attachment and then isolate attached DNA through changes in pH.
  • the Qiagen Circulating Nucleic Acid Kit uses a positively charged silica membrane to induce DNA attachment and then isolate attached DNA through changes in pH.
  • the present inventors found that by fabricating a planar structure or a nanostructure using a conductive polymer and modifying the surface with a positive charge, the adhesion of the ctDNA can be greatly increased, and the ctDNA can be effectively separated by an electrical signal, thereby completing the present invention. It was.
  • Another object of the present invention to provide a method for detecting or separating cfDNA using the conductive polymer.
  • Another object of the present invention to provide a method for providing information for diagnosing the onset and prognosis of cancer through the result of the detection or isolation of cfDNA.
  • Another object of the present invention to provide a diagnostic method for diagnosing the onset and prognosis of cancer through the detection or isolation of cfDNA.
  • the present invention provides a structure for detecting and separating cell-free DNA, preferably circulating tumor DNA (ctDNA), comprising a surface-modified conductive polymer. .
  • ctDNA circulating tumor DNA
  • the surface-modified conductive polymer is preferably positively charged.
  • the nanostructure may be provided in the form of nanorods or nanowires, but is not limited thereto.
  • the conductive polymer may be selected from the group consisting of polyacetylene, polyaniline, polypyrrole, polythiophene and polysulfurtritrid, most preferably polypyrrole.
  • the present invention provides a cell-free DNA detection and separation kit comprising the cell-free DNA detection and separation structure described above.
  • the present invention provides a method for detecting or isolating cell-free DNA, comprising the following steps:
  • the biological sample may be blood, bone marrow, pleural effusion, peritoneal fluid, spinal fluid, urine, or saliva, preferably blood.
  • step (ii) the step of attaching the cfDNA is preferably performed by applying electricity for 20 to 40 seconds to 0.8 ⁇ 1.2V.
  • step (iii) the step of detecting or isolating the cfDNA is preferably performed by applying an electrical signal for 4-6 minutes at -1.3 ⁇ -1.0 V.
  • the magnitude of the electrical signal may be appropriately adjusted by those skilled in the art according to the type of conductive polymer to be used and the type of DNA to be detected.
  • the present invention includes the steps of detecting / separating and analyzing circulating tumor DNA (ctDNA) in a sample using the cell-free DNA detection and isolation construct.
  • ctDNA circulating tumor DNA
  • the detection and separation of circulating tumor DNA (ctDNA) in the sample using the cell-free DNA detection and separation structure, the onset of cancer of the subject and Prognostic methods of prognosis are provided.
  • the cancer may be carcinoma, lymphoma, blastoma, sarcoma, liposarcoma, neuroendocrine tumor, mesothelioma, schwanoma, schwanoma, Meningioma, adenocarcinoma, melanoma, melanoma, leukemia, lymphoidmalignancy, squamous cell cancer, squamous cell cancer, lung cancer (lpithelial squamous cell cancer), lung cancer (lung cancer) cancer, small-cell lung cancer, non-small cell lung cancer, adenocarcinoma of the lung, squamous carcinoma of the lung, peritoneal tumor the peritoneum, hepatocellular cancer, gastric or stomach cancer, gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, brain cancer, glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer (ovarian cancer), liver cancer, bladder cancer der cancer, hepatoma, breast cancer, colon cancer, rectal cancer, color
  • the assay according to the present invention can analyze the amount (concentration), the copy number or the sequence of ctDNA in a sample, and the cancer develops or progresses when the amount (concentration) or the copy number of the ctDNA increases. Information can be provided.
  • the present invention encompasses a variety of uses for the detection and isolation of circulating cell-free DNA (cfDNA) of planar or nanostructured surfaces consisting of surface modified conductive polymers.
  • cfDNA circulating cell-free DNA
  • the cell free DNA detection construct according to the present invention includes an electrochemically surface-modified conductive polymer, thereby converting the conductive polymer into a positive charge or a negative charge through voltage regulation, thereby including circulating tumor DNA (ctDNA). Since the adhesion and separation of cell free DNA is easy and the detection efficiency is remarkably improved, it is expected that the circulating tumor DNA is effectively detected and separated by an electrical signal, and ultimately, it is very useful for the diagnosis and prognosis of cancer onset.
  • ctDNA circulating tumor DNA
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a method for detecting and isolating circulating cell-free DNA (cfDNA) using the nanostructure Ppy / Au NWs of the present invention.
  • FIG. 2 is a top view FE-SEM image of the nanostructures Ppy / Au NWs of the present invention.
  • Figure 3 is a formula showing the DNA capture and release (separation) mechanism according to the oxidation-reduction of the conductive polymer polypyrrole.
  • 4A to 4F are the results of evaluating the adhesion and detachment ability of cfDNA through voltage and time adjustment using the nanowire structure of the present invention.
  • Figure 5a is the result of evaluating the adhesion and detachment ability of the cfDNA of the planar structure and nanostructure of the conductive polymer polypyrrole.
  • Figure 5b is a result of evaluating the adhesion and separation ability by concentration of cfDNA using a nanostructure of 1.0 ⁇ m.
  • 5C and 5D show the results of evaluating the adhesion and detachment ability of cfDNA after spiking DNA of various sizes into blood plasma of normal people.
  • Figure 6a is a result of comparing the concentration after separating the cfDNA present in the blood of normal, breast and lung cancer patients through the nanowire structure of the present invention and a commercial Qiagen kit.
  • Figure 6b is a result of separating the cfDNA present in the blood of breast cancer and lung cancer patients through the nanowire structure and the commercial Qiagen kit of the present invention and confirmed the presence of DNA through electrophoresis. It was confirmed that the cfDNA isolated through the nanowire structure of the present invention existed in the form of small fragments characteristic of cancer-specific ctDNA, and the cfDNA isolated through the commercial Qiagen kit was not observed in all patients because of its low concentration. Did.
  • Figure 8 is a result of comparing the cfDNA present in the blood of breast cancer and lung cancer patients by PCR amplification after detecting using the Qiagen kit and nano-structure Ppy / Au NWs.
  • FIG. 9 shows the results of separation (release) of cfDNA circulating in blood through a polypyrrole planar structure with varying degrees of roughness depending on the applied voltage.
  • Subject or “patient” means any single individual in need of treatment, including humans, cattle, dogs, guinea pigs, rabbits, chickens, insects, and the like. Also included are any subjects who participated in clinical research trials showing no disease clinical findings or subjects who participated in epidemiologic studies or who used as controls. In one embodiment of the present invention, humans were targeted.
  • CTC cancer tumor cell
  • CTCs are epithelial cells that are often isolated from solid tumors that are found at very low levels in the circulating blood of patients with advanced cancer. CTCs can also be cells originating from primary, secondary or tertiary tumors. "Circulating tumor cells” (CTCs) include cancer cells, but the term also encompasses non-tumor cells, such as circulating epithelial or endothelial cells, which are not commonly found in circulating blood. Tumor cells and non-tumor epithelial cells are therefore included within the definition of CTCs of the invention.
  • Cancer may include, but is not limited to, various cancer types known in the art, including dysplasia, hyperplasia, solid tumors, and hematopoietic stem cell cancer. Many types of cancer are known to metastasize and shed or metastatic circulating tumor cells, such as secondary cancers resulting from metastasized primary cancers. Other cancers may include, but are not limited to, cancers of the following organs or organs: brain, heart, lung, stomach, urogenital tract, liver, bone, nervous system, gynecology, blood, skin, breast and adrenal gland. Do not.
  • glioma (Schwannoma, glioblastoma, astrocytoma), neuroblastoma, pheochromocytoma, adrenal ganglion, meningioma, adrenal cortex, medulloblastoma, rhabdomyosarcoma, kidney cancer, various types Vascular cancer, osteoblastic osteocarcinoma, prostate cancer, ovarian cancer, uterine myoma, salivary gland cancer, choroid plexus cancer, breast cancer, pancreatic cancer, colon cancer and megakaryotic leukemia; And sarcomas, such as malignant melanoma, basal cell carcinoma, squamous cell carcinoma, Karposi's sarcoma, moles dysplastic nevi, lipoma, hemangioma, dermal fibroid, keloid, fibrosarcoma or angiosarcoma, and melanoma Includes skin cancer, including.
  • Sample refers to any sample suitable for the method provided by the present invention.
  • Sample sources include whole blood, bone marrow, pleural effusion, peritoneal fluid, central spinal fluid, urine, saliva and bronchial lavage.
  • the sample is a blood sample, including, for example, whole blood or any fraction or component thereof.
  • Blood samples suitable for use in the present invention may be extracted from any known source, including blood cells or components thereof, such as veins, arteries, peripheral blood, tissues, umbilical cord blood, and the like.
  • a “protein” is also to include fragments, analogs and derivatives of a protein that possess essentially the same biological activity or function as the reference protein.
  • nucleotide or “nucleic acid” refers to nucleotide polymers of all lengths, such as ribonucleotides as well as deoxyribonucleotides. This term refers only to the primary structure of a molecule and therefore to double or single chain DNA or RNA.
  • modification for example a label, methylation, "caps” known in the art, one or more naturally occurring nucleotide substitutions, debonding (eg methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoamidate, carbarnate) Including attachments (eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.), proteins (eg nucleases, toxins, antibodies, signal peptides, poly-Llysine, etc.) Examples include those with acridine, Psolalen, etc., those with chelates (e.g. metal elements, radioactive metal elements, boron, metal oxide elements, etc.), those with alkyl compounds, modified bonds (e.g. alpha having an anomeric nucleic acid, etc.), and also means an internucleotide modification including an unmodified polynucleotide.
  • debonding eg methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoamidate, carbarnate
  • attachments e
  • An “primer” is an oligonucleotide sequence that hybridizes to complementary RNA or DNA target polynucleotides and functions as a starting point for the stepwise synthesis of polynucleotides from mononucleotides, for example by the action of nucleotidyltransferases that occur in polymerase chain reactions. Means.
  • the term "functional equivalent” refers to, for example, one or more substitutions, deletions or additions from a reference sequence, the actual effect of not producing various functional dissimilarities between the reference sequence and the subject sequence ( It refers to both the nucleotide and nucleic acid sequence of the changed mutant sequence, such as net effect).
  • Substantial equivalents according to the invention for example mutations, amino acid sequences, preferably have at least 80% sequence identity, more preferably at least 90% sequence identity with the listed amino acid sequences.
  • Substantial equivalents of the nucleotide sequences of the present invention may have a lower percentage of sequence identity, for example when considering redundancy or degeneracy of the genetic code.
  • the nucleotide sequence may have at least about 65% identity, more preferably at least about 75% identity, and most preferably about 95% identity.
  • Anticancer Drugs refers to cancer cells that cause genetic changes in response to anticancer drugs, thereby attenuating the effects of chemotherapy by avoiding the attack of anticancer drugs.
  • resistant may be used in the same sense as the term “resistance”.
  • Treatment is an approach for obtaining beneficial or desired results, including clinical results.
  • Treatment or “mitigation” of a disease, disorder or condition is a progression of progression with less and / or lesser extent of the condition, disorder or disease state and / or undesirable clinical signs compared to not treating the disorder. Means slowing down or getting longer.
  • weight loss for example at least 5% weight loss, is an example of desirable treatment outcomes.
  • beneficial or desirable clinical outcomes may alleviate or ameliorate one or more symptoms, reduce the extent of disease, or stabilize (ie, not worsen) a disease.
  • Treatment can also mean prolonging survival as compared to expected survival if untreated.
  • treatment does not need to occur by administration of a single dose and often occurs upon administration of a series of doses.
  • a therapeutically effective amount, an amount sufficient for alleviation, or an amount sufficient for the treatment of a disease, disorder or condition may be administered in one or more administrations.
  • “About” means 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 for reference quantities, levels, values, numbers, frequencies, percentages, dimensions, sizes, quantities, weights, or lengths. , Amount, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight or length, varying by about 3, 2 or 1%.
  • the present invention relates to a structure for detecting and separating cell free DNA using a conductive polymer and its use.
  • planar structures or nanostructures composed of surface modified conductive polymers and their use, which can effectively detect and isolate cell-free DNA comprising circulating tumor DNA.
  • the cell free DNA detection construct of the present invention is characterized by consisting of a conductive polymer.
  • the conducting polymer is a useful material in a wide range of industrial fields besides chemical or physics because it has the advantages of ductility of polymers and easy manufacturing and at the same time has the electrical, magnetic and optical properties of metals and semiconductors. It is used. In particular, it has been used as a biosensor, tissue engineering, neuroprobe, drug delivery, bio-actuator due to various advantages such as ease of processing, high electrical conductivity, good biocompatibility, environmental stability and reversible volume change.
  • Examples of the conductive polymers that may be used in the present invention include polypyrrole, polyacetylene, polyaniline, polythiophene, poly sulfur nitride, and derivatives thereof.
  • Polypyrrole is used as the most preferable conductive polymer.
  • the polypyrrole has been selected as a material for drug delivery systems of micropumps, including medical actuators for implantation in the body, due to excellent in vivo stability and repeated shrinkage of swelling and reduction by oxidation. In particular, reversible volume expansion and contraction phenomena due to the doping / de-doping mechanism with the anion during the electropolymerization of the conductive polymer has been spotlighted as a drug delivery material.
  • the polypyrrole may be coated on the conductive film by the oxidation-reduction reaction according to the electrical polymerization, and is used for practical purposes, such as the production of chemical / biosensors, supercapacitors.
  • the polypyrrole may be synthesized through the following method, or may be used by purchasing a compatible polymer.
  • the compounds are used in the sense of including the compound itself, pharmaceutically acceptable salts, hydrates, solvates, isomers and prodrugs thereof.
  • the conductive polymer compound may be prepared and used by a method known in the art, a modified method thereof, or the like, and may be purchased and used commercially. That is, it can be suitably modified by various methods based on the technique of the art with reference to a known method. For example, modifications apparent to those skilled in the art can be successfully carried out, for example, by appropriate protection of the interferor, by replacement with other suitable reagents known in the art, or by routine changes in the reaction conditions. .
  • the present invention relates to a structure for cfDNA detection and separation, preferably ctDNA detection and separation, and its use as the conductive polymer.
  • the conductive polymer constituting the structure is characterized by electrochemical surface modification to increase the adhesion and specificity of the circulating cell-free DNA.
  • a method of electrochemically activating a surface to fix a biological material among various immobilization techniques is used. This means a method of charging a positive or negative charge so as to spatially selectively fix a desired material at a required position.
  • the surface of the conductive polymer is modified to have a positive charge by electrical stimulation.
  • Positively charged materials that can be used to change the surface properties of the nanostructures made of the conductive polymer include amino silane, amino (silane), nylon (Nylon), nitrocellulose, and spermidine (APTES).
  • spermidine) and polylysine (Polylysine) is preferably one or more selected from the group consisting of the positively charged material depending on the type and the concentration of the nanostructure surface of the positively charged surface properties, the nano The size of the detectable DNA may be determined according to the type of positively charged material treated on the surface of the structure or the degree of change in the surface property of the nanostructure controlled according to the density of the processed material.
  • the structure for cfDNA detection and separation which is made of the surface-modified conductive polymer, may be manufactured as a planar structure or a nanostructure.
  • the present invention can be used to form a nanostructure in order to transform the conductive polymer into a bio-like environment.
  • biomimetic structures such as nanoporous structures, nanowired structures can be used. These nanostructures exhibit a structure similar to the extracellular matrix in vivo, thereby enhancing cell growth and differentiation and maximizing interaction with living tissue.
  • the nanostructure can be produced using any known method. Examples include: (i) vapor phase particle growth, including laser pyrolysis used for nanoparticle synthesis or atomic layer deposition for thin film deposition, and (ii) colloidal methods and single layer magnetic coupling techniques for nanoparticle formation. Liquid phase growth, (iii) particle preparation in solid phase, such as phase separation to make metal nanoparticles, and (iv) hybrid methods such as nanowire growth in gas-liquid-solid phase (VLS).
  • VLS gas-liquid-solid phase
  • the present invention may utilize nanorods or nanowires made by methods such as fabrication by an electrical method on a mold, growth in solution, or anisotropic growth.
  • nanorods or nanowires made by methods such as fabrication by an electrical method on a mold, growth in solution, or anisotropic growth.
  • the nanostructures can be produced.
  • the nanowire refers to a structure having a diameter of nanometers and having a length of several hundred nanometers to several hundred micrometers.
  • the nanowires have the advantage of being able to precisely control the size interfacial characteristics and the electronic properties during the synthesis process and a large amount of parallel assembly using the synthesized nanowires.
  • an aluminum oxide (AAO) made of anodization may be used as a template having nanopores.
  • the pore AAO is mainly used as a general template for the production of nanowires or nanotubes made of metal or ceramic.
  • the AAO is very thermally stable and has vertically aligned nanochannels at high density (10 9-10 11 / cm 2 ).
  • gold (Au) nanowires having nanopores were prepared from AAO made by anodization.
  • the free-standing nanowire structure of the present invention greatly increases the adhesion of ctDNA through surface modification of each nanowire column, and has a very effective detection effect due to the large surface area by various lengths and diameters.
  • the present invention can be simply manufactured and used in the form of a planar structure with the conductive polymer.
  • the surface of the polypyrrole polymer is electrochemically modified to simplify the planar structure, thereby greatly increasing the adhesion of the ctDNA and increasing the ctDNA detection efficiency by voltage control.
  • the surface of the polypyrrole polymer is electrochemically modified to simplify the planar structure, thereby greatly increasing the adhesion of the ctDNA and increasing the ctDNA detection efficiency by voltage control.
  • the structure made of the conductive polymer of the present invention reacts only by an external electrical stimulus, the attached ctDNA can be separated only by an electrical signal, thereby enabling specific and effective detection of the ctDNA.
  • Constructs of the conductive polymers of the present invention are useful for detecting and isolating circulating cell-free DNA (cfDNA), particularly circulating tumor DNA (ctDNA).
  • cfDNA circulating cell-free DNA
  • ctDNA circulating tumor DNA
  • Circulating cell-free DNA is a generic term for DNA freed from cells present in the blood, and is subject to detection and isolation of the present invention without limitation on the origin and source of DNA.
  • the most preferable example of the present invention may include circulating tumor DNA (ctDNA) released from CTC (circulating tumor cell).
  • the blood of cancer patients includes DNA fragments, or ctDNAs, of tumors released into the bloodstream due to the death of cancer cells due to apotosis and necrosis.
  • ctDNAs DNA fragments, or ctDNAs
  • the contents of normal cells' blood are processed by macrophages in an instant, but the amount of ctDNA from which the cancer cells are destroyed is beyond the amount that can be processed by phagocytes. It is reported that up to 3.3% of cfDNA is released into the bloodstream daily in cancer patients with 10 10 cancer cells.
  • there are large fragments of ctDNA ranging from 70 to 200 base pairs of fragments to 21 kbps.
  • most cancer-derived cfDNAs exist in small fragments of 200 bp or less.
  • ctDNA plays a very important role not only for the detection of early cancer but also for monitoring the treatment process. That is, when detecting the ctDNA present in the blood, it can be an important clue to determine the state of the tumor.
  • the ctDNA has a half-life of less than 2 hours, it can be very advantageous that it can provide up-to-date information on tumors, that is, cancer cell-specific mutations and other genetic changes.
  • sample sources used for the detection and separation of ctDNA of the present invention include whole blood, bone marrow, pleural fluid, peritoneal fluid, central spinal fluid, urine, saliva, and bronchial lavage fluid.
  • the sample is a blood sample comprising whole blood or any fraction or component thereof.
  • Blood samples suitable for use in the present invention may be extracted from any known source, including blood cells or components thereof, such as veins, arteries, peripheral blood, tissues, umbilical cord blood, and the like.
  • samples are known and can be obtained and processed using conventional clinical methods (eg, procedures for collecting and processing whole blood).
  • an exemplary sample can be peripheral blood taken from a subject having cancer.
  • the amount (volume) of the sample can be properly selected and determined by one skilled in the art, but is usually 1 to 20 mL, preferably 3 to 7 mL.
  • the bodily fluid (especially blood) used as a sample is phosphate buffered saline (PBS) (PBS containing 0.251 mM EDTA depending on the purpose), for example, diluted to 2 to 20 times, and then used by filtration.
  • PBS phosphate buffered saline
  • pretreatment may be performed.
  • the present invention relates to a method for detecting or isolating circulating cell-free DNA (cfDNA) using the nanostructures.
  • cfDNA circulating cell-free DNA
  • the method may be carried out in one embodiment, including the following process:
  • the surface of the conductive polymer is modified by an electrochemical method.
  • the electrochemical method that can be used may use any method known in the art.
  • the surface of the conductive polymer may be modified positively or negatively, preferably with positive charges to facilitate the attachment and detachment of negatively charged cfDNAs. Reform.
  • the surface of the structure is roughened to increase the ratio of surface area to volume, thereby allowing a much larger amount of cfDNA to be attached (DNA capture).
  • this structure may have the effect of enhancing the interaction with the cfDNA.
  • the sample is treated with a biological sample, preferably blood, to treat the biological sample to attach cfDNA (cell free DNA) to the conductive polymer.
  • a biological sample preferably blood
  • the adhesion of the cfDNA to the conductive polymer is preferably performed by applying electricity for 20 to 40 seconds at 0.8 ⁇ 1.2V.
  • planar Ppy film was prepared by electropolymerization at a voltage of 1.5 V for 5 minutes, and then added + 1.8V for 2 minutes in 1M Tris-HCl buffer to maximize the positive charge of the surface of Ppy to induce Ppy peroxidation. It was.
  • the super-oxidized planar Ppy film was incubated in the patient's plasma and DNA capture was attempted by adding +1.0 V for 30 seconds. As a result, it was confirmed that the DNA capture efficiency of the planar structure Ppy film is similar to that when using the nanostructure.
  • the captured DNA was effectively released by applying a voltage of 1.3 V for 3 minutes.
  • the cfDNA in order to separate cfDNA (cell free DNA) from the conductive polymer, in the case of the nanostructure, the cfDNA can be separated by applying an electrical signal for about 4 to 6 minutes at about -1.3 to -1.0 V, and 1.3 to 1.8. V, most preferably undergo an oxidation voltage of 1.3V.
  • the cfDNA in the case of the planar structure, can be separated by applying an electrical signal at about -1.3 to -1.0 V for 4 to 6 minutes, and an oxidation voltage of 1.3 to 1.8 V, most preferably 1.5 V.
  • the separated cfDNAs can be identified through labeling.
  • the particular label or detectable group used in the assay can be any substance detectable by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical, electrical, optical or chemical means and having detectable physical or chemical properties.
  • the label is any composition detectable by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical, electrical, optical or chemical means.
  • Useful labels include AlexaFluor fluorescent dyes (Invitrogen), magnetic beads (e.g. Dynabeads TM ), fluorescent dyes (e.g. fluorescein isothiocyanates, Texas red, rhodamine, etc. ), Radiolabels, other imaging agents such as microbubbles (for ultrasound imaging), enzymes (eg, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, etc. commonly used in ELISAs), and colorimetric labels such as colloidal gold or colored Glass or plastic (eg, polystyrene, polypropylene, latex, etc.) beads.
  • AlexaFluor fluorescent dyes Invitrogen
  • magnetic beads e.g. Dynabeads TM
  • fluorescent dyes e.g. fluorescein isothiocyanates, Texas red, rhodamine, etc.
  • Radiolabels e.g. fluorescein isothiocyanates, Texas red, rhod
  • Label detection means are well known to those skilled in the art.
  • the label is a fluorescent label
  • it can be detected by exciting the fluorescent dye at an appropriate wavelength of light and detecting the resulting fluorescence.
  • Fluorescence can be visually detected by a photographic film by use of an electron detector such as a charge coupling element (CCD) or a photomultiplier tube.
  • CCD charge coupling element
  • the method of the present invention has the following advantages, for example.
  • cfDNA is easy to attach and detach: A positive voltage is applied to the conductive polymer for a short time, for example, for 1 minute, and the DNA present in the sample is treated to react at about 1V for about 30 seconds. Even if only the cfDNA, preferably ctDNA can be easily attached. In addition, if about -1.3V is applied for about 5 minutes to recover the attached DNA, more than 90% recovery is possible. Thus, DNA can be attached and separated from a sample without the use of positively charged polymers or other molecules.
  • the invention relates to a device, eg a kit, for detecting or isolating circulating cell-free DNA (cfDNA) comprising the construct.
  • a device eg a kit, for detecting or isolating circulating cell-free DNA (cfDNA) comprising the construct.
  • cfDNA circulating cell-free DNA
  • a solid substrate having a structure having a surface property changed to have a positive charge an electrode for applying a voltage to the structure of the solid substrate, and measuring an electrical signal generated when a sample containing DNA passes through the structure
  • a DNA detection device (kit) including a measuring unit can be provided.
  • the method may further include a sample storage chamber connected with the solid substrate to store the sample introduced into the structure.
  • the DNA detector includes a reagent for measuring cfDNA levels in a biological sample, wherein the cfDNA levels in the biological sample are non-limiting examples, including any nucleic acid dye, such as an intercalator. It can be measured by any known technique.
  • Non-limiting examples of DNA intercalators that can be used to measure cfDNA levels and can be included in the kits according to the invention include berberine, ethidium bromide, proflavin, daunomycin ), Doxorubicin, thalidomide, Sybr®Green, Sybr®Gold and PicoGreen.
  • the present invention relates to a method of providing information for diagnosing the onset and prognosis of cancer in a subject comprising detecting, isolating and analyzing circulating tumor DNA (ctDNA).
  • ctDNA circulating tumor DNA
  • the present invention also relates to a method for diagnosing the onset and prognosis of cancer of a subject, comprising detecting, separating and analyzing circulating tumor DNA (ctDNA).
  • ctDNA circulating tumor DNA
  • cancer refers to or indicates a physiological condition characterized by unregulated cell growth in mammals. Cancers to be diagnosed include carcinoma, lymphoma, blastoma, sarcoma, liposarcoma, neuroendocrine tumor, mesothelioma, schwanoma, Meningioma, adenocarcinoma, melanoma, melanoma, leukemia, lymphoidmalignancy, squamous cell cancer, squamous cell cancer, lung cancer (lpithelial squamous cell cancer), lung cancer (lung cancer) cancer, small-cell lung cancer, non-small cell lung cancer, adenocarcinoma of the lung, squamous carcinoma of the lung, peritoneal tumor the peritoneum, hepatocellular cancer, gastric or stomach cancer, gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, brain cancer, glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer (ovarian cancer), liver cancer,
  • the method of the present invention can be used to assess such cancer patients and persons at risk for cancer.
  • one or more indicators of cancer such as the presence or absence of cancer cells, or any other disease, can be used to provide a diagnosis or prognosis.
  • the amount (concentration), copy number or sequence of ctDNA in the sample can be analyzed and characterized.
  • Analysis and characterization of ctDNA can be done at specific intervals at various intervals to assess subject progression and pathology. For example, it can be performed at regular intervals such as 1 day, 2 days, 3 days, 1 week, 2 weeks, 1 month, 2 months, 3 months, 6 months or 1 year to track as a function of time.
  • ctDNA amount (concentration) or copy number indicates the stabilization of the disease and the patient's response to the treatment and is an indicator that does not alter the treatment.
  • a sudden increase in the detected ctDNA amount (concentration) or copy number allows the patient to provide an early warning that a tumor has developed or has progressed.
  • another analysis can also be performed to provide another clinical evaluation.
  • gene expression analysis and PCR techniques e.g., gene chip analysis to obtain information such as the type of tumor from which ctDNA is derived, the state of metastasis, and the degree of malignancy, are specific for specific cancer markers. Multiplexing with primers can be used.
  • cell size, DNA or RNA analysis, proteome analysis or metabolome analysis can be performed as a means to assess additional information regarding the characterization of a patient's cancer.
  • the assay comprises antibody multiplexed to a primer specific for one or more of the following markers or PCR multiplexing using the primer: EGFR, HER2, ERCC1, CXCR4, EpCAM, E-cadherin, mucin-1 , Cytokeratin, PSA, PSMA, RRM1, androgen receptor, estrogen receptor, progesterone receptor, IGF1, cMET, EML4 or leukocyte associated receptor (LAR).
  • the present invention may provide sufficient data to determine a subject's responsiveness to a particular treatment regimen or to determine the effect of a candidate agent in cancer treatment.
  • a sample taken from a patient prior to drug treatment and one or more cell samples taken from the patient concurrently with or following drug treatment can be treated using the methods of the present invention.
  • the efficacy of the drug treatment or the patient's responsiveness to the drug can be determined. In this way, initial identification of failed compounds can be made or initial validation of promising compounds can be made.
  • the present invention may provide a method of determining candidate subjects for a particular clinical trial.
  • the detected ctDNA of the candidate can be analyzed to determine if a particular marker is present to determine whether a particular treatment regimen of the clinical trial can possibly be successful.
  • analysis of ctDNA during clinical trials may also provide information as to whether the patient responds to or does not respond to the experimental drug, where a substantial change or decrease in the identified ctDNA indicates a response and the confirmed increase in ctDNA is a poor response. Indicates. This information is an initial indicator of drug effect and can be used by the investigator as a secondary endpoint in clinical trials.
  • the present invention encompasses a variety of uses for the detection and isolation of circulating cell-free DNA (cfDNA) of three-dimensional nanostructures consisting of surface modified conductive polymers, whereby cancer development, in particular, by circulating tumor DNA It will be very useful for selective and individual chemotherapy by providing useful information about the diagnosis and prognosis.
  • cfDNA circulating cell-free DNA
  • Au layer approximately 150 nm thick was coated on one side of an AAO template (Whatman; pore diameter, 100 nm).
  • Au nanowires are electrochemically grown in the pores of Au-backed AAO membranes using gold-plated solution (Orotemps 24 RTU Rack) and subjected to cyclic voltammetry to 1.1 at 100 mV / s.
  • Ppy-coated Au NWs were fabricated by depositing Ppy on the surface of Au nanowires using a potential range of ⁇ 0 V.
  • per-oxidized Ppy / Au NWs were immersed in blood samples at room temperature for 30 minutes to facilitate DNA interaction with individual nanowires: the samples were i) spiked in human plasma Artificial samples containing DNA molecules (250 ng / mL), or ii) untreated plasma samples (200 ⁇ L to 1 mL) obtained from three healthy donors and 17 cancer patients.
  • the obtained DNA was measured spectrophotometrically at 260 and 280 nm, and the purity of the DNA captured and released was evaluated using the A 260 / A 280 ratio.
  • the interaction between Ppy / Au NWs and DNA was visualized by examining PicoGreen fluorescence under Zeiss LSM 710 confocal microscope.
  • DNA ladders (low: 10-100 bp; middle: 100 bp-2 kb; high: 3.5-21 kb) were purchased from Bioneer (Korea). All PCR amplifications were performed on GeneAmp PCR system 9600 (Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA), template DNA, 2 oligonucleotide primers (5 pM), 200 mM each dNTP, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.1 The final reaction volume was carried out at 20 ⁇ L, containing% (w / v) gelatin and 1 U Taq DNA polymerase (Perkin Elmer).
  • PCR amplification consisted of 45 cycles of denaturation (94 ° C, 30s), annealing (64 ° C, 30s) and elongation (72 ° C, 30s). PCR products were electrophoresed on a 2% agarose gel and stained with Etbr (ethidium bromide) to visualize their presence under UV transilluminator.
  • CfDNA was extracted from 1 mL plasma using the QIAamp circulating nucleic acid kit. Briefly, plasma samples were dissolved using proteinase K and lysis buffer, and circulating nucleic acids were bound to silica using vacuum pressure. DNA fragments were recovered from the membrane after several washing steps.
  • EGFR mutations in cfDNA were detected for EGFR L858R and exon 19 deletion (p.E746-A750del) on the QX200 ddPCR system (BioRad, CA, USA) using PrimePCR ddPCR mutation assay.
  • Water-oil emulsion droplets were generated from PCR mixtures containing 8 ⁇ L cfDNA, 10 ⁇ L ddPCR supermix, and 2 ⁇ L target primers and probes. After generating the droplets, PCR was performed in a thermal cycler. Positive droplets containing at least one copy of the amplified DNA could be detected by a droplet reader for fluorescence assay.
  • EGFR gene locations in primary tumor tissues were detected using PCR-direct sequencing methods. Genomic DNA was extracted and amplified using specific primers for exons 19 and 21 of the EGFR gene. PCR products were sequenced using the BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit and analyzed using an ABI PRISM 3100 DNA Analyzer (Applied Biosystems, CA, USA).
  • DNA ladder was spiked into blood plasma to concentrate and isolate cfDNA. In addition, it was found that much more cfDNA could be attached / disconnected to nanowire structures than flat surfaces.
  • FIGS. 5A to 5D the present inventors spiked DNA ladders of various sizes into plasma and then confirmed the attachment and detachment ability using Western blotting and PICO green.
  • FIGS. 5A to 5D various molecular weights and various concentrations of DNA were used to determine the cfDNA attachment / dissociation capacity.
  • DNA adhesion and separation ability was not significantly affected by molecular weight or concentration. That is, low molecular weight, medium molecular weight, and high molecular weight DNA were all excellent in adhesion and separation, and it was found that there was no significant difference in DNA adhesion and separation ability when using a DNA of a certain amount or more.
  • the present inventors compared the concentrations of cfDNA isolated using Qiagen kit and conductive nanostructures using blood of breast cancer patients and lung cancer patients.
  • the nanostructure of the present invention succeeded in separating cfDNA much more than commercial Qiagen kit. Through this, it was found that the conductive nanowire of the present invention is an effective technique for detecting small fragment DNA.
  • EGFR and KRAS mutations were identified from patient samples using PCR amplification methods and are shown in FIG. 8. That is, it was confirmed that EGFR and KRAS mutation analysis is possible.
  • the DNA separation result was significantly improved than that of the currently used Qiagen kit, and it was found that the conductive nanowire of the present invention was much more effective in detecting ctDNA than the conventional Qiagen kit.
  • the present inventors further confirmed that cfDNA circulating in the blood can be separated from the surface of the polypyrrole planar structure.
  • fabricating a planar Ppy film at a voltage of 0.6 to 0.8 V does not help greatly in DNA capture and release because the surface is very smooth, but a high voltage of 1.5 V is required when fabricating planar Ppy film through electropolymerization.
  • a high voltage of 1.5 V is required when fabricating planar Ppy film through electropolymerization.
  • the roughness of the surface of the planar Ppy was greatly increased to help DNA recovery. From the above, it can be seen that the roughness of the surface of the nanostructure not only enhances the interaction with the DNA but also improves the surface-to-volume area to provide a place to attach a large amount of DNA.
  • the cell-free DNA detection and isolation construct according to the present invention is easy to attach and separate cell free DNA, including circulating tumor DNA (ctDNA) and the like, and the detection efficiency is significantly improved. By effectively detecting and isolating tumor DNA by electrical signals, it is ultimately expected to be very useful for the diagnosis and prognosis of cancer development.
  • ctDNA circulating tumor DNA

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Abstract

본 발명은 전도성 고분자를 이용한 세포 유리 DNA 검출용 구조체에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 세포-유리(cell-free) DNA를 검출하고 분리하는데 있어서, 표면 개질한 전도성 고분자로 구성된 평면 구조체 또는 나노 구조체를 이용하는 것에 관한 것으로, 순환 종양 DNA(ctDNA) 등을 포함하는 세포 유리 DNA를 효과적으로 검출 및 분리할 수 있다.

Description

전도성 고분자를 이용한 세포 유리 DNA 검출용 구조체 및 이의 용도
본 발명은 전도성 고분자를 이용한 세포 유리 DNA 검출용 구조체 및 이의 이용에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 순환 종양 DNA 등의 세포-유리(cell-free) DNA를 분리하고 검출하는데 있어서, 표면 개질한 전도성 고분자로 구성된 평면 구조체 또는 나노 구조체를 이용하는 것에 관한 것이다.
인간 혈장에서 순환하는 세포-유리형 DNA의 존재는 1948년에 멘델 및 메타이스에 의해 발표되었다. 순환하는 세포-유리형 DNA(cell-free DNA, cfDNA)는 염증성 장애, 산화 스트레스 및 악성 종양 등의 다양한 생리학적 및 병리학적 병태들에서 연구되고 있다. 건강한 개체의 경우 이의 혈중 농도는 0 - 100 ng/ml이고, 평균적으로 30 ng/ml이다. 정상 세포의 DNA 함량을 6.6 pg으로 가정하면, 이 수치는 혈액 1 ml 당 평균 게놈 당량(genomeequivalent) 0-15,000에 해당하며, ml 당 게놈이 평균 5000이다. 이 DNA 대부분이 이중 가닥이고, 외관상 핵단백질 복합체 형태이다.
유리형 DNA의 혈류 방출과 관련된 정확한 기전은 불확실하지만, 아마도 세포자살, 세포괴사 및 세포로부터의 능동적인 방출이 종합적으로 작용하는 것으로 보인다.
순환하는 세포-유리형 DNA는 잠재적으로 유용한 바이오마커로서, DNA 수준과 단편화 패턴은 진단 및 예후 예측 목적으로 흥미로운 가능성을 제시한다. 최근, 바르토브 등은 개체의 체액 샘플에서 측정된 cfDNA를 토대로 남성 개체의 생식성 상태를 평가하는 방법을 개시하였다(WO2008/047364). 이들은, 또한, 생식력 저하(subfertile) 남성에게 DNase를 투여함으로써 남성의 낮은 생식력을 치료하는 방법도 제안하였다. 또한, 세포-유리형 DNA는 악성 및 양성 증식과 염증성 병태, 예컨대 자궁내막증에 대한 비-침습적인 모니터링 바이오마커로서 제안된 바 있다.
특히, 상기 순환하는 세포-유리형 DNA 중에서, CTC(circulating tumor cell) 또는 ctDNA(circulating tumor DNA)를 혈액 속에서 추출 및 분리함으로써, 암 특이 유전자를 검출하는 방법을 통하여 암 진단과 모니터링에 활용하는 비침습적 검사가 암 진단 분야에 기여할 수 있을 것으로 기대되고 있다.
비침습성 혈액 샘플을 통한 암 진단 방법은 현재 많은 관심을 받고 있는 매우 흥미로운 분야로서, 혈액 샘플로부터 CTC 및 ctDNA의 분리/검출이 효과적으로 이루어진다면 진단 및 치료 전략 수립에 대한 근거가 될 수 있으며, 또한 항암제 저항에 따른 종양의 유전적 변화에 맞춘 치료법의 선택 등을 주기적으로 시행할 수 있으므로 기존 암 치료법의 효과를 극대화시킬 수 있을 것이다.
순환 종양 세포(CTC)는 상이한 고형의 악성종양을 갖는 환자의 혈액에 존재하는 상피 기관의 세포로서, 이들은 1차 종양의 클론으로부터 유도되며 악성이다(펨(Fehm) 등의 문헌[Clin. Cancer Res. 8: 2073-84, 2002]). 또한, CTC가 암종의 암 진행에 대한 독립적인 진단인 것으로 고려될 수 있음이 알려져 있다.
순환 종양 세포의 검출 및 산출은 여러 가지 이유로 환자의 관리에 있어 중요하다. 이들은 1차 종양 전에 검출될 수 있고, 따라서 초기 단계 진단을 허용한다. 이들은 치료에 반응하여 감소하므로, CTC를 산출하는 능력은 주어진 치료 섭생의 효과를 모니터링하게 한다. 이들은 보조제 환경에서 추측할 수 없는 질병을 갖는 환자의 재발을 모니터링하기 위한 도구로서 사용될 수 있다.
상기 CTC 및 ctDNA는, 혈중에 극히 적은 양으로 존재하는데, 예를 들어 혈구 성분 108∼109개당 약 1개이며, 이로 인해, 몇 가지의 CTC 분리법이 제안되어 왔다. 예를 들어, 분리법에는, 항 EpCAM(상피 세포 접착 분자) 항체를 고정화한 자성 입자, 또는 기둥 형상 구조 등의 수지 표면에 캡처 항체를 결합시킨 마이크로 유체 디바이스를 이용하는 방법, 또한 CTC와 혈구 세포의 크기 차이를 이용하여 필터를 사용하여 분리하는 방법 등이 알려져 있다(Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Sunitha Nagrath et al. Nature, 2007, 450:1235-1239).
ctDNA를 추출하기 위한 일반적인 방법은 상업화된 키트(kit)를 사용하는 것이다. 퀴아젠 순환 핵산 키트(Qiagen Circulating Nucleic Acid Kit)는 양성적으로 대전된 실리카 멤브레인을 사용하여 DNA의 부착을 유도한 후 pH의 변화를 통해 부착된 DNA를 분리한다. 그러나 여전히 낮은 회수 효율을 가지는 문제점이 있다.
프랑스의 Laurent 그룹은 드롭렛 기반의 디지털 PCR(droplet-based digital PCR)을 사용하여 직장암 환자의 혈장에 존재하는 ctDNA의 발견을 통하여 KRAS 종양형성 유전자를 정량화하는 기술을 소개하였다. 미국 펜실베니아 대학의 다이아몬드(Diamond) 그룹은 양성적으로 대전된 폴리에틸렌이민 나노 입자를 사용하여 음성적으로 대전된 DNA를 부착하는 연구를 진행하였는데, 이는 나노 입자 표면에 광분해성(phtoclevable) 리간드를 연결함으로써, 검출된 DNA에 빛을 쏘여주어 효과적으로 분리하는 기술이다. 중국의 Dezhou 대학의 Wang 그룹에서는 자성 나노 입자에 양성적으로 대전된 폴리머를 연결한 후 pH의 변화를 통하여 게놈 DNA를 효과적으로 부착하고 분리하였다.
그러나 현재 ctDNA의 검출을 위해 사용되고 있는 방법들은 많은 문제점들을 가지고 있다. 우선, 시간이 오래 걸리고, 프로세싱이 복잡하며, 고비용 및 낮은 회수율(recovery efficiency) 등이 앞으로 개선해야할 문제점들이다. 특히, 초기 암보다는 진행된 암환자에게서 ctDNA가 발견되기 때문에 초고감도의 검출/분리 기술의 개발이 시급하다.
이에 본 발명자들은 전도성 고분자를 이용하여 평면 구조체 또는 나노 구조체를 제작하고 표면을 양전하로 개질함으로써, ctDNA의 부착력을 크게 증대시키고 전기적 신호에 의해 효과적으로 ctDNA를 분리시킬 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 주된 목적은 전도성 고분자를 이용한 세포 유리 DNA(cell free DNA, cfDNA) 검출 또는 분리용 구조체 및 이를 포함하는 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 전도성 고분자를 이용하여 cfDNA 검출 또는 분리방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 cfDNA 검출 또는 분리 결과를 통해 암의 발병 및 예후를 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 cfDNA 검출 또는 분리 결과를 통해 암의 발병 및 예후를 진단하는 진단방법을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 표면 개질한 전도성 고분자를 포함하는, 세포-유리(cell-free) DNA, 바람직하게는 순환 종양 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA) 검출 및 분리용 구조체를 제공한다.
이 때, 세포-유리(cell-free) DNA가 음전하를 띠기 때문에, 상기 표면 개질한 전도성 고분자는 양전하를 띠는 것이 바람직하다.
상기 나노 구조체는 나노 막대 또는 나노 와이어의 형태로 제공될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 전도성 고분자는 폴리아세틸렌, 폴리아닐린, 폴리피롤, 폴리티오펜 및 폴리설퍼니트리드로 구성된 군에서 선택될 수 있는데, 가장 바람직하게는 폴리피롤을 사용한다.
또한, 본 발명은 다른 구체예로서, 상기 설명한 세포-유리 DNA 검출 및 분리용 구조체를 포함하는 세포-유리 DNA 검출 및 분리용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 또 다른 구체예로서, 하기의 단계를 포함하는, 세포-유리 DNA를 검출 또는 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 평면 구조체 또는 나노 구조체를 형성하는 전도성 고분자의 표면을 양전하로 개질하는 단계;
(ii) 생물학적 시료를 처리하여 상기 전도성 고분자에 cfDNA(cell free DNA)를 부착시키는 단계; 및
(iii) 전기적 신호를 가하여 상기 전도성 고분자로부터 cfDNA를 검출 및 분리시키는 단계.
이 때, 상기 생물학적 시료는 혈액, 골수, 흉수, 복막액, 척수액, 뇨, 또는 타액을 이용할 수 있고, 바람직하게는 혈액을 이용한다.
(ii) 단계에서, 상기 cfDNA를 부착시키는 단계는 0.8 ~ 1.2V로 20 ~ 40초 동안 전기를 가하여 수행되는 것이 바람직하다.
또한, (iii) 단계에서, 상기 cfDNA를 검출 또는 분리시키는 단계는 -1.3 ~ -1.0 V로 4~6분 동안 전기적 신호를 가하여 수행되는 것이 바람직하다.
사용하는 전도성 고분자의 종류 및 검출하고자 하는 DNA의 종류에 따라 전기적 신호의 크기는 당업자가 적절히 조절할 수 있을 것이다.
또한, 본 발명은 또 다른 구체예로서, 상기 세포-유리 DNA 검출 및 분리용 구조체를 이용하여 샘플 중 순환 종양 DNA(ctDNA)를 검출/분리하여 분석하는 단계를 포함하는, 대상자에서 암의 발병 및 예후를 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 또 다른 구체예로서, 상기 세포-유리 DNA 검출 및 분리용 구조체를 이용하여 샘플 중 순환 종양 DNA(ctDNA)를 검출/분리하여 분석하는 단계를 포함하는, 대상자의 암의 발병 및 예후의 진단방법을 제공한다.
이 때, 상기 암은 암종 (carcinoma), 림프종 (lymphoma), 모세포종 (blastoma), 육종 (sarcoma), 지방육종(liposarcoma), 신경내분비종 (neuroendocrine tumor), 중피종 (mesothelioma), 신경초종 (schwanoma), 수막종(meningioma), 샘암종 (adenocarcinoma), 흑색종 (melanoma), 백혈병 (leukemia), 악성 림프종 (lymphoidmalignancy), 편평세포암종 (squamous cell cancer), 편평상피세포암 (epithelial squamous cell cancer), 폐암 (lung cancer), 소세포폐암 (small-cell lung cancer), 비소세포폐암 (non-small cell lung cancer), 폐샘암종(adenocarcinoma of the lung), 폐편평암종 (squamous carcinoma of the lung), 복막종 (cancer of the peritoneum), 간세포성종 (hepatocellular cancer), 위암종 (gastric or stomach cancer), 위장관종 (gastrointestinal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 뇌암, 아교모세포종 (glioblastoma), 자궁경부암 (cervical cancer), 난소암 (ovarian cancer), 간암(liver cancer), 방광암 (bladder cancer), 간암 (hepatoma), 유방암 (breast cancer), 결장암 (colon cancer), 직장암(rectal cancer), 결장직장암 (colorectal cancer), 자궁내막 또는 자궁암 (endometrial or uterine carcinoma), 침샘암(salivary gland carcinoma), 신장암 (kidney and renal cancer), 전립선암 (prostate cancer), 외음암 (vulval cancer), 갑상선암 (thyroid cancer), 간암종 (hepatic carcinoma), 항문암종 (anal carcinoma), 음경암종 (penile carcinoma), 고환암 (testicular cancer), 식도정맥류암 (esophageal cancer), 담도암 (biliary tract) 및 두경부암 (head and neck cancer)으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 유방암, 폐암, 위암, 간암 또는 췌장암이다.
상기로부터, 본 발명에 따른 분석은 샘플 중 ctDNA의 양(농도), 카피(copy)수 또는 염기서열을 분석할 수 있는데, 상기 ctDNA의 양(농도) 또는 카피수가 증가하는 경우 암이 발생 또는 진행된다는 정보를 제공할 수 있다.
이처럼, 본 발명은 표면 개질된 전도성 고분자로 이루어진 평면 구조체 또는 나노 구조체의 순환성 세포-유리 DNA(cfDNA)의 검출 및 분리를 위한 다양한 용도를 모두 포함한다.
본 발명에 따른 세포 유리 DNA 검출용 구조체는 전기화학적으로 표면 개질된 전도성 고분자를 포함함으로써, 전압 조절을 통해 전도성 고분자의 양전하 또는 음전하로의 전환이 가능하여, 순환 종양 DNA(ctDNA) 등을 포함하는 세포 유리 DNA의 부착 및 분리가 용이하고, 검출 효율이 현저하게 향상되는 바, 순환 종양 DNA를 전기적 신호에 의해서 효과적으로 검출 및 분리함으로써 궁극적으로 암 발병의 진단 및 예후 예측에 매우 유용할 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 나노 구조체 Ppy/Au NWs를 이용하여 순환성 세포-유리 DNA(cfDNA)를 검출 및 분리하는 방법에 대한 개념적 모식도이다.
도 2는 본 발명의 나노 구조체 Ppy/Au NWs의 상면도 FE-SEM 이미지이다.
도 3은 전도성 고분자 폴리피롤의 산화-환원에 따른 DNA 캡쳐 및 방출(분리) 기작을 나타낸 식이다.
도 4a 내지 도4f는 본 발명의 나노 와이어 구조체를 이용하여 전압 및 시간 조절을 통하여 cfDNA의 부착 및 분리 능력을 평가한 결과들이다.
도 5a는 전도성 고분자 폴리피롤의 평면 구조체 및 나노 구조체의 cfDNA의 부착 및 분리 능력을 평가한 결과이다.
도 5b는 1.0 μm의 나노 구조체를 사용하여 cfDNA의 농도별로 부착 및 분리 능력을 평가한 결과이다.
도 5c 및 도 5d는 다양한 크기의 DNA를 정상인의 혈장(blood plasma)에 스파이킹(spiking) 시킨 후 cfDNA의 부착 및 분리 능력을 평가한 결과들이다.
도 6a는 정상인, 유방암 및 폐암 환자의 혈액 내에 존재하는 cfDNA를 본 발명의 나노 와이어 구조체와 상업용 Qiagen kit을 통하여 분리한 후 농도를 비교한 결과이다.
도 6b는 유방암 및 페암 환자의 혈액 내에 존재하는 cfDNA를 본 발명의 나노 와이어 구조체와 상업용 Qiagen kit을 통하여 분리한 후 전기영동을 통해 DNA의 존재 여부를 확인한 결과이다. 본 발명의 나노 와이어 구조체를 통하여 분리된 cfDNA는 암 특이적 ctDNA의 특징인 작은 단편(fragment)의 형태로 존재함을 확인하였으며, 상업용 Qiagen kit을 통하여 분리된 cfDNA는 농도가 낮아 모든 환자에게서 관찰되지 않았다.
도 7은 전도성 고분자 폴리피롤 나노 구조체를 이용하여 전기 자극에 의해 cfDNA를 부착(왼쪽, 가운데) 및 분리한 경우(오른쪽)를 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 8은 유방암 및 폐암 환자의 혈액 내에 존재하는 cfDNA를 Qiagen kit 및 나노 구조체 Ppy/Au NWs를 사용하여 검출한 후 PCR 증폭하여 비교한 결과이다.
도 9는 가해진 전압에 따라 다양한 거침도를 가진 폴리피롤 평면 구조체를 통해 혈액 내 순환하는 cfDNA의 분리(방출) 결과이다.
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다. 본 발명의 일 실시예에서는 인간을 대상으로 하였다.
"순환 종양 세포"(circulating tumor cell, CTC)는 대상자의 샘플에서 발견되는 임의의 암세포를 의미한다. CTC는 흔히, 진행된 암을 갖는 환자의 순환혈액에서 매우 저농도로 발견되는 고형 종양으로부터 떨어져 나온 상피 세포이다. CTC는 또한 원발성, 2차 또는 3차 종양으로부터 비롯되는 세포일 수 있다. "순환 종양 세포"(CTC)는 암세포를 포함하지만, 상기 용어는 또한 순환혈액에서 통상적으로 발견되지 않는 비-종양 세포, 예를 들면, 순환 상피 또는 내피 세포를 포함하는 것이다. 따라서 종양 세포 및 비-종양 상피 세포도 본 발명의 CTC의 정의 내에 포함된다.
"암"은 이형성, 과다형성, 고형 종양 및 조혈모세포 암을 포함하여 당해 분야에 공지되어 있는 다양한 암 유형을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 많은 유형의 암이, 예를 들면, 전이된 원발성 암으로부터 야기된 2차 암과 같이, 순환 종양 세포를 전이시키고 흘리거나 또는 전이성인 것으로 알려져 있다. 또 다른 암으로는 다음의 장기 또는 기관: 뇌, 심장, 폐, 위장, 비뇨생식관, 간, 뼈, 신경계, 부인과, 혈액, 피부, 유방 및 부신의 암을 포함할 수 있으나, 이로 한정되지는 않는다. 또 다른 유형의 암 세포로는 신경교종(신경초종(Schwannoma), 교모소포종, 성상세포종), 신경모세포종, 갈색세포종, 부신경절종, 뇌수막종, 부신피질암, 수모세포종, 횡문근육종, 신장암, 다양한 유형의 혈관암, 골모세포성 골암(osteoblastic osteocarcinoma), 전립선암, 난소암, 자궁 근종, 침샘암, 맥락총암, 유방암, 췌장암, 결장암 및 거대핵세포성 백혈병; 및, 악성 흑색종, 기저세포암, 편평세포암, 카포시 육종(Karposi's sarcoma), 이형성 모반(moles dysplastic nevi), 지방종, 혈관종, 피부섬유종, 켈로이드, 섬유육종 또는 혈관육종과 같은 육종, 및 흑색종을 포함한 피부암이 포함된다.
"샘플"은 본 발명에 의해 제공된 방법에 적합한 임의의 샘플을 말한다. 샘플 공급원으로는 전혈, 골수, 흉수, 복막액, 중추 척수액, 뇨, 타액 및 기관지 세척액이 포함된다. 한 양태에서, 샘플은, 예를 들면, 전혈 또는 그의 임의의 분획 또는 성분을 포함하여 혈액 샘플이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 혈액 샘플은, 혈액 세포 또는 그의 성분, 예를 들면, 정맥, 동맥, 말초혈, 조직, 제대혈 등을 포함하는 알려져 있는 임의의 공급원으로부터 추출될 수 있다.
"단백질"은 또한 기준 단백질과 본질적으로 동일한 생물 활성 또는 기능을 보유하는, 단백질의 단편, 유사체 및 유도체를 포함하는 것이다
"폴리뉴클레오티드(polynucleotide)" 또는 "핵산(nucleic acid)"이라는 용어는 리보뉴클레오티드 뿐만 아니라 디옥시리보뉴클레오티드 등 온갖 길이의 뉴클레오티드 중합체를 의미한다. 이 용어는 분자의 1차적 구조만을 의미하고, 따라서 이중 또는 단일 사슬의 DNA 또는 RNA를 의미한다. 이것은 또한 변형의 알려진 유형, 예를 들어 당해 분야에서 알려진 표지(label), 메틸화, "caps", 유사체의 하나 혹은 그 이상의 자연 발생의 뉴클레오티드 치환, 탈결합(예: methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoamidate, carbarnate, 등)과 결합(예:phosphorothioate, phosphorodithioate, 등), 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드(signal peptide), poly-Llysine,등) 등의 부속물을 포함하는 것, 삽입물(예: 아크리딘, Psolalen, 등)을 가지는 것, 킬레이트(예: 금속원소, 방사성 금속원소, 붕소, 산화 금속원소, 등)을 가지는 것, 알킬화합물을 가지는 것, 변형된 결합(예: alpha anomeric 핵산, 등)을 가지는 것, 또한 폴리뉴클레오티드의 비변형을 포함한 뉴클레오티드간 변형을 의미한다.
"프라이머"는 상보성 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응에서 발생하는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제의 작용에 의해 모노뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드의 단계적 합성을 위한 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다.
"기능적 등가물"이라는 용어는 예를 들어, 기준(reference) 서열로부터 하나 또는 그 이상의 치환, 결실 또는 부가, 기준(reference) 서열과 실험(subject) 서열 사이의 다양한 기능적 비유사성을 낳지 않는 실제 효과(net effect) 등 변화된 돌연변이 서열의 뉴클레오티드와 핵산서열 모두를 의미한다. 본 발명에 따른 실질적 등가물인, 예를 들어 돌연변이, 아미노산 서열은 나열된 아미노산 서열과 바람직하게는 최소한 80%의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 최소한 90%의 서열 동일성을 갖는다. 실질적 등가물인 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, 유전자 암호의 중복(redundancy) 또는 축퇴(degeneracy)를 고려할 때, 더 낮은 백분율의 서열 동일성을 가질 수 있다. 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열은 최소한 약 65%의 동일성, 보다 바람직하게는 최소한 약 75%의 동일성, 가장 바람직하게는 약 95%의 동일성을 가질 수 있다.
항암제 "내성"이란 암세포가 항암제에 대응하여 유전자 변화를 일으킴으로써 항암제의 공격을 피해 항암치료의 효과를 약화시키는 것을 말한다. 상기 "내성"이라는 용어는 "저항성"이라는 용어와 동일한 의미로 사용될 수 있다.
"치료"는 임상 결과를 포함하여 이로운 또는 원하는 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 질환, 장애 또는 병태의 "치료" 또는 "완화"는, 장애를 치료하지 않는 것과 비교하여, 병태, 장애 또는 질환 상태의 정도 및/또는 바람직하지 않은 임상 징후가 적어지고/적어지거나 경시적인 진행 추이가 느려지거나 길어지는 것을 의미한다. 예를 들어, 비만 치료에서, 체중 감소, 예를 들어, 적어도 5％의 체중 감소는 바람직한 치료 결과의 예이다. 본 발명의 목적을 위하여, 이롭거나 바람직한 임상 결과는, 검출가능 또는 검출불능 여부와 상관없이, 1가지 이상의 증상의 경감 또는 개선, 질환 정도의 축소, 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 감속, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 진정(부분적 또는 전체적)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. "치료"는 치료를 받지 않은 경우에 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장시키는 것을 또한 의미할 수 있다. 또한, 치료는 1회 용량의 투여에 의해 발생할 필요가 없고, 일련의 용량의 투여 시에 종종 발생한다. 따라서 치료상 유효량, 완화에 충분한 양, 또는 질환, 장애 또는 병태의 치료에 충분한 양이 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다.
"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 전도성 고분자를 이용한 세포 유리 DNA 검출 및 분리용 구조체 및 이의 이용에 관한 것이다.
특히, 순환 종양 DNA를 포함하는 세포-유리(cell-free) DNA를 효과적으로 검출하고 분리할 수 있는, 표면 개질한 전도성 고분자로 구성된 평면 구조체 또는 나노 구조체 및 이의 이용에 관한 것이다.
<전도성 고분자>
본 발명의 세포 유리 DNA 검출용 구조체는 전도성 고분자로 구성되는 것을 특징으로 한다.
상기 전도성 고분자(conducting polymer)는 고분자의 연성과, 제조가 용이한 장점을 가지는 동시에 금속이나 반도체의 전기적, 자기적 그리고 광학적 성질을 동시에 가지고 있기 때문에 화학이나 물리 분야 외에도 광범위한 산업적 분야에서 유용한 물질로 많이 사용되고 있다. 특히, 가공의 용이성, 높은 전기 전도도, 우수한 생체 친화력, 환경적 안정성 및 가역적 부피 변화 등과 같은 여러 가지 장점들 때문에 바이오센서, 조직공학, 신경탐침, 약물전달, 바이오작동기로 사용되고 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 전도성 고분자들로는 폴리피롤(polypyrrole), 폴리아세틸렌(polyacetylene), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리티오펜(polythiophene), 폴리설퍼니트리드(poly sulfur nitride) 및 그들의 유도체들을 예로 들 수 있다.
가장 바람직한 전도성 고분자로서 폴리피롤(polypyrrole)을 사용한다.
상기 폴리피롤은 우수한 생체 내 안정성 및 산화에 의한 팽창과 환원의 반복적인 수축 현상으로 인하여, 체내 이식용 의료용 작동기를 비롯한 마이크로펌프의 약물전달체계의 재료로 선택되고 있다. 특히, 전도성 고분자의 전기 중합과정에서 음이온과의 도핑(doping)/디도핑(de-doping) 메카니즘으로 인한 가역적인 부피 팽창 및 수축 현상은 약물 전달 소재로써 각광을 받고 있다. 또한, 상기 폴리피롤은 전기 중합에 따른 산화-환원 반응에 의해 전도성 필름에 코팅될 수 있고, 화학/바이오 센서, 슈퍼 커패시터(supercapacitor)의 제작 등 실용적인 목적으로 사용된다.
상기 폴리피롤은, 하기와 같은 방법 등을 통해 합성하거나 상용성 폴리머를 구입하여 사용할 수 있다.
Figure PCTKR2016006728-appb-I000001
특히, 상기 폴리피롤을 이용하는 경우, 전기 자극만으로도 폴리피롤 평면 구조체 또는 나노 구조체의 전하(charge)를 변화시키기 때문에, 종래의 DNA 분리에 따른 전처리 과정이 필요 없으며, 폴리피롤 표면에 부착된 DNA 또한 별도의 과정 없이 전기 자극에 의해서 손쉽게 회수할 수 있는 장점이 있다.
이하에서 별도의 설명이 없는 한, 상기 화합물들은, 화합물 그 자체, 약제학적으로 허용되는 그것의 염, 수화물, 용매화물, 이성질체 및 프로드럭을 모두 포함하는 개념으로 사용된다.
상기 전도성 고분자 화합물은 당업계에 알려진 방법, 이의 변형된 방법 등으로 제조하여 사용할 수 있으며, 상업적으로 판매하는 것을 구입하여 사용할 수도 있다. 즉, 공지의 방법을 참조하여 당해 분야의 기술에 근간한 다양한 방법들에 의해 적절히 변형시켜 사용할 수 있다. 예를 들면, 당 분야의 숙련가에게 명백한 변형에 의해, 예를 들면, 간섭기를 적절히 보호하거나, 당 분야에 공지된 다른 적당한 시약으로 교체하거나, 또는 반응 조건을 통상적으로 변화시킴으로써 성공적으로 수행될 수 있다.
<전도성 고분자로 형성된 구조체>
본 발명은 일 관점에서, 상기 전도성 고분자로서 cfDNA 검출 및 분리, 바람직하게는 ctDNA 검출 및 분리용 구조체 및 이의 용도에 관한 것이다.
특히, 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 구조체를 구성하는 전도성 고분자를 전기화학적으로 표면 개질하여 순환성 세포-유리 DNA의 부착성 및 특이성을 증가시키는 것을 특징으로 한다.
전기화학적 표면 개질
분석물질을 인식하기 위하여 생체물질들을 전기적으로 증착된(electro-deposition) 전도성 고분자에 고정화하는 기술이 필요하다.
본 발명에서는 여러 가지 고정화 기술 중에서 전기화학적으로 표면을 활성화시켜 생체 물질을 고정하는 방법을 이용하며, 이는 원하는 물질을 필요한 위치에 공간 선택적으로 고정시킬 수 있도록 양전하 또는 음전하로 대전시키는 방법을 의미한다.
바람직하게는, 음전하를 띠는 DNA의 분리를 용이하게 하기 위하여, 전기 자극에 의해 상기 전도성 고분자 표면이 개질되어 양전하를 띄도록 한다.
상기 전도성 고분자로 이루어진 나노 구조체의 표면 특성을 변화시키기 위해 사용할 수 있는 양전하를 띤 물질은 APTES(aminopropyltriethoxysilane) 을 포함하는 아미노 실란(amino silane), 나일론(Nylon), 니트로셀룰로오스(Nitrocellulose), 스퍼미딘(spermidine) 및 폴리라이신(Polylysine)으로 구성된 그룹에서 선택되는 하나 이상인 것이 바람직한데, 상기 양전하를 띤 물질의 종류 및 처리되는 농도에 따라 나노 구조체 표면이 양전하를 띠는 표면특성이 달라지게 되므로, 상기 나노 구조체 표면에 처리되는 양전하를 띤 물질의 종류 또는 처리되는 밀도에 따라 조절되는 나노 구조체 표면 특성 변화 정도에 따라 검출할 수 있는 DNA의 크기가 결정될 수 있다.
상기 전도성 고분자의 표면 개질은 상기 구조체를 형성하기 전, 동시 또는 후에 당업자가 적절히 수행할 수 있음은 자명하다.
상기 표면 개질된 전도성 고분자로 이루어진, cfDNA 검출 및 분리용 구조체는 평면 구조체 또는 나노 구조체로 제작될 수 있다.
일 구체예로서, 본 발명은 상기 전도성 고분자를 생체와 유사한 환경으로 변형하고자 나노 구조체를 형성하여 이용할 수 있다.
비제한적으로, 나노 다공성 구조 (nanoporous structure), 나노 와이어 구조체 (nanowired structure)와 같은 3차원의 생체 모방형 구조체를 이용할 수 있다. 이러한 나노 구조체는 생체 내의 세포외 기질(extracellular matrix)와 유사한 구조를 보임으로 세포의 생장과 분화를 증진시키고 생체 조직과의 상호작용을 극대화시킨다.
상기 나노 구조체는 공지의 임의의 방법을 이용하여 제작할 수 있다. 예를 들어, (i) 나노 입자 합성에 이용되는 레이저 열분해나 박막증착에 이용되는 원자 층 증착 증을 포함하는 증기상 입자성장, (ii) 나노 입자 형성을 위한 콜로이드방법과 단층 자기결합기술들이 포함되는 액상 성장, (iii) 금속 나노입자를 만들기 위한 상 분리 방법과 같은 고상에서의 입자제조, (iv) 기-액-고상(VLS)에서의 나노와이어 성장과 같은 하이브리드 방법 등을 이용할 수 있다.
본 발명은 주형 상에 전기적 방법으로 제작, 용액 내에서 성장, 또는 이방성 성장 등의 방법으로 만드는 나노 막대 또는 나노 와이어를 이용할 수 있다. 전도성 고분자로 제작할 수 있는 나노 구조체의 형태에는 제한은 없으나, 가장 바람직하게는 나노 와이어(Nanowire) 구조체로 제작할 수 있다.
상기 나노 와이어란 나노미터 크기의 직경을 가지면서 수백 나노미터에서 수백 마이크로미터의 길이를 가지는 구조를 말한다.
상기 나노 와이어는 합성과정에서 크기 계면특성 및 전자적 특성을 정확하게 조절할 수 있고 이렇게 합성된 나노 와이어들을 이용해서 다량의 병렬조립이 가능하다는 장점이 있는 구조이다.
최근 기능적 나노재료를 만드는데 템플릿(주형) 중합을 많이 사용하고 있다. 템플릿과 증착 조건에 따라서 중합된 나노구조의 길이와 지름 그리고 밀도의 조절이 가능하기 때문이다.
바람직하게는 양극산화로 만들어진 알루미늄 산화물(anodic aluminium oxide, AAO)로 나노기공을 가진 구조를 템플릿으로 사용할 수 있다. 상기 기공이 많은 AAO는 금속이나 세라믹으로 되어 있는 나노 와이어나 나노튜브의 생산을 위한 일반적인 템플릿으로 주로 사용되고 있다. 상기 AAO는 열에 매우 안정적이고 고밀도(109∼1011/cm2)에서 수직이면서 정렬된 나노채널을 가진다. 본 발명의 일 실시예에서도, 양극산화로 만들어진 AAO로 나노기공을 가진 금(Au) 나노와이어를 제작하였다.
본 발명의 프리-스탠딩(free-standing)의 나노 와이어 구조체는 각각의 나노 와이어 기둥의 표면 개질을 통하여 ctDNA의 부착력을 크게 증대시키고, 다양한 길이 및 직경에 의한 넓은 표면적으로 인하여 효율이 매우 향상된 검출 효과를 가진다.
다른 구체예로서, 본 발명은 상기 전도성 고분자로 평면 구조체 형태로 간단하게 제작하여 이용할 수 있다.
상기 설명한 나노 구조체, 구체적으로 나노 와이어뿐만 아니라, 폴리피롤 고분자의 코팅시 표면을 전기화학적으로 개질함으로써 평면 구조체 형태로 간단하게 제작하여 ctDNA의 부착력을 크게 증대시키고 전압조절에 의해 ctDNA 검출 효율을 높일 수 있음을 본 발명의 일 실시예에서 확인하였다.
이처럼, 본 발명의 전도성 고분자로 이루어진 구조체는 외부의 전기 자극에 의해서만 반응이 일어나므로, 부착된 ctDNA를 전기적 신호에 의해서만 분리할 수 있어 ctDNA의 특이적 및 효과적 검출이 가능하다.
<cfDNA>
본 발명의 전도성 고분자로 이루어진 구조체는 순환성 세포-유리 DNA(cfDNA), 특히 순환 종양 DNA(ctDNA)를 검출 및 분리하는데 유용하다.
순환성 세포-유리 DNA는 혈액 중 존재하는 세포로부터 유리된 DNA를 총칭하여 일컫는 것으로서, DNA의 유래 및 소스(source)의 종류에 제한없이 본 발명의 검출 및 분리 대상이 된다. 다만, 본 발명의 가장 바람직한 예로서 CTC(circulating tumor cell)로부터 유리된 순환 종양 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)을 들 수 있다.
암환자의 혈액에는 세포사멸(apotosis) 및 세포괴사(necrosis)로 인한 암세포의 사멸로 인해 혈류 속으로 방출된 종양의 DNA 프래그먼트(fragment), 즉 ctDNA가 포함되어 있다. 일반적으로, 정상적인 세포의 혈액 내 내용물들은 대식세포에 의해 순식간에 처리되지만, 암세포가 파괴되어 나오는 ctDNA의 양은 포식세포(phagocyte)에 의해 처리될 수 있는 양을 넘어서게 되는데, 100 g의 종양, 즉 3 * 1010의 암세포를 가진 암환자에게서 최고 3.3 %의 cfDNA가 매일 혈류속으로 방출되고 있는 것으로 보고되고 있다. 평균적으로, 70에서 200 염기쌍의 작은 프래그먼트에서부터 21kbp에 이르는 큰 프래그먼트의 ctDNA가 존재한다. 하지만, 대부분의 암 유래 cfDNA는 200bp 이하의 작은 프래그먼트로 존재한다.
일반적으로 정상인들은 혈액 내 평균적으로 30 ng/ml 미만의 DNA를 가지고 있는 반면, 암환자의 혈액에는 평균 180 ng/ml의 ctDNA가 존재하고, 원발성 암환자의 경우 종양 부위를 제거하면 혈액 내 존재하는 ctDNA의 양이 정상인 수준으로 내려가는 반면, 전이성 암환자의 경우는 여전히 높은 수치의 ctDNA 값을 보인다.
그러므로, ctDNA는 초기 암의 발견뿐 아니라 치료 과정의 모니터링을 위해서도 매우 중요한 역할을 한다. 즉, 혈액 내에 존재하는 ctDNA를 검출할 경우, 종양의 상태를 파악할 수 있는 중요한 단서가 될 수 있다.
특히, 상기 ctDNA의 경우, 2시간 미만의 반감기(half-life)를 갖기 때문에 종양에 대한 최신 정보, 즉 암세포 특유의 돌연변이 및 기타 유전적 변화를 제공할 수 있다는 점도 매우 유리한 정보가 될 수 있다.
종래의 단백질 마커들은, 혈중 단백질 농도 증가가 암 발생 외에도 정상 세포에서 다른 원인에 의해 상승할 수 있으므로 가-양성(false-positive)으로 나타나는 단점이 존재하고, 또한, 대부분의 단백질 마커들이 수 주에 걸쳐서 혈액 내에 존재하므로 종양의 현재 상태를 정확히 전해주는 데에는 한계가 있었던 반면, 본 발명의 검출 및 분리 대상인 cfDNA, 바람직하게는 ctDNA는 이러한 문제점을 해결하는 장점도 있다.
한편, 본 발명의 ctDNA의 검출 및 분리에 사용하는 샘플 공급원으로는 전혈, 골수, 흉수, 복막액, 중추 척수액, 뇨, 타액 및 기관지 세척액이 포함된다. 바람직한 일 구체예로서, 상기 샘플은, 전혈 또는 그의 임의의 분획 또는 성분을 포함하는 혈액 샘플이다.
본 발명에 사용하기에 적합한 혈액 샘플은, 혈액 세포 또는 그의 성분, 예를 들면, 정맥, 동맥, 말초혈, 조직, 제대혈 등을 포함하는 알려져 있는 임의의 공급원으로부터 추출될 수 있다. 예를 들면, 샘플은 공지되어 있으며 통상적인 임상 방법(예를 들면, 전혈을 채취 및 처리하기 위한 절차)을 이용하여 수득되고 처리될 수 있다. 한 태양에서, 예시적인 샘플은 암을 갖는 대상자로부터 채취된 말초혈일 수 있다.
상기 샘플의 양(체적)은 당업자가 적절히 선택하여 결정할 수 있으나, 통상 1∼20mL, 바람직하게는 3∼7mL이다.
일반적으로, 샘플로 사용되는 체액(특히, 혈액)은 인산 완충 생리 식염수(PBS)(목적에 따라 0.251mM EDTA 함유의 PBS)로, 예를 들어, 2∼20배로 희석한 후에 여과하여 사용한다. 특히 혈액량이나 혈구 수가 많은 경우에는, 전처리를 행해도 된다.
<검출 방법>
그러므로 또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 나노 구조체를 이용하는 순환성 세포-유리 DNA(cfDNA)를 검출 또는 분리하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법에 대한 개념적인 모식도를 도 1에 도시하였다.
상기 방법은 일 구체예로 다음의 공정을 포함하여 수행할 수 있다:
(i) 평면 구조체 또는 나노 구조체를 형성하는 전도성 고분자의 표면을 양전하로 개질하는 단계;
(ii) 생물학적 시료를 처리하여 상기 전도성 고분자에 cfDNA(cell free DNA)를 부착시키는 단계; 및
(iii) 전기적 신호를 가하여 상기 전도성 고분자로부터 cfDNA를 검출 또는 분리시키는 단계.
앞서 설명한 바와 같이, 평면 구조체를 형성하거나, 다양한 직경 및 길이의 전도성 고분자들을 이용하여 나노 구조체, 예를 들어 나노 와이어 구조체를 형성시킨 후, 전기화학적 방법으로 전도성 고분자의 표면을 개질한다.
이 때, 사용될 수 있는 전기화학적 방법은 공지의 임의의 방법을 사용할 수 있다. 검출 또는 분리하고자 하는 DNA의 전하적 특성에 따라 양성(positive) 또는 음성(nevative)로 전도성 고분자의 표면을 개질시킬 수 있는데, 바람직한 예로서는 음전하를 띠는 cfDNA의 부착 및 분리를 용이하게 하기 위해 양전하로 개질한다.
특히, 다양한 직경 및 길이의 전도성 고분자들을 이용하여 나노구조체로 형성하는 경우, 구조체 표면을 거칠게 함으로써 표면 대 부피 영역 비율을 높임으로써, 훨씬 더 많은 양의 cfDNA가 부착될 수 있도록 한다(DNA 포획). 또한, 이러한 구조는 상기 cfDNA와의 상호작용을 증진시키는 효과를 가질 수 있다.
다음으로, 이러한 구조체에 생물학적 시료 샘플, 바람직하게는 혈액을 처리하여 생물학적 시료를 처리하여 상기 전도성 고분자에 cfDNA(cell free DNA)를 부착시킨다.
이 때, 상기 전도성 고분자에 cfDNA의 부착은 0.8 ∼ 1.2V로 20∼40초 동안 전기를 가하여 수행하는 것이 바람직하다.
구체적으로 평면 구조의 Ppy 필름에 표면 거침도를 높이기 위해 전기중합(electropolymerization)을 할 때 다양한 전압, 즉 0.8 V부터 1.8 V를 사용하였다. 전기중합의 전압이 높아질수록, 표면의 거침도 또한 높아져서 표면적이 크게 늘어나며, DNA의 결합부위가 증가하여 DNA 포획(capture)/방출(release) 효율이 증가한다. 실제적으로 분석 결과, 0.1M pyrrole과 0.01M PSS의 용액에서 1.5 V의 전압을 5분 동안 가한 후 제작된 Ppy 평면 구조체 필름이 DNA 포획에 최대의 효율을 보이는 것으로 확인하여 평면 구조체 Ppy 필름을 제작할 때 기본 조건으로 사용하였다. 평면 Ppy 필름을 1.5 V의 전압에서 5분 동안 전기중합을 통하여 제작한 후, Ppy 표면의 양전하를 극대화시키기 위해 1M Tris-HCl buffer에서 +1.8V를 2분 동안 가함으로 Ppy의 과-산화를 유도하였다. 과-산화된 평면 Ppy 필름을 환자의 혈장에 배양한 후 +1.0V를 30초간 가하여 DNA 포획을 시도하였다. 확인 결과, 평면 구조체 Ppy 필름의 DNA 포획 효율이 나노 구조체를 사용하였을 때와 비슷하게 나오는 것을 확인하였다. 포획된 DNA를 1.3 V의 전압을 3분간 가하여 효과적으로 방출할 수 있었다.
다음으로, 전기적 신호를 가하여 상기 포획된 cfDNA를 분리하여 방출시킨다.
이 때, 전도성 고분자로부터 cfDNA(cell free DNA)를 분리시키기 위해, 나노 구조체의 경우는 약 -1.3 ∼ -1.0 V로 4~6분 동안 전기적 신호를 가하여 상기 cfDNA를 분리시킬 수 있고, 1.3 ∼ 1.8V, 가장 바람직하게는 1.3V의 산화 전압(oxidation voltage)을 거친다. 또한, 평면 구조체의 경우는 약 -1.3 ∼ -1.0 V로 4~6분 동안 전기적 신호를 가하여 상기 cfDNA를 분리시킬 수 있고, 1.3 ∼ 1.8V, 가장 바람직하게는 1.5V의 산화 전압(oxidation voltage)을 거친다.
또한, 상기 분리된 cfDNA들은 표지 등을 통해 확인할 수 있다.
검정에 사용되는 특정 표지 또는 검출가능한 기는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능하며, 검출가능한 물리적 또는 화학적 특성을 갖는 임의의 물질일 수 있다. 따라서 표지는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의의 조성물이다.
유용한 표지는 알렉사플루오르(AlexaFluor)　형광 염료(Invitrogen), 자기 비드(예를 들어, 다이나비즈(Dynabeads)TM), 형광 염료(예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 텍사스 레드, 로다민 등), 방사성표지, 기타 영상화제, 예컨대 마이크로버블(초음파영상화용), 효소(예를 들어, ELISA에 통용되는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 등), 및 비색 표지, 예컨대 콜로이드성 금 또는 유색 유리 또는 플라스틱(예를 들어, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드를 포함한다.
표지 검출 수단은 당업자에게 주지이다. 예를 들어 표지가 형광 표지인 경우, 형광색소를 광의 적당한 파장으로 여기시키고 생성되는 형광을 검출함으로써 검출될 수 있다. 형광은 사진용 필름에 의해, 전자검출기, 예컨대 전하 커플링 소자(CCD) 또는 광전증배관 등의 사용에 의해 가시적으로 검출될 수 있다.
본 발명의 상기 방법은 예를 들어, 다음과 같은 장점이 있다.
(i) cfDNA의 부착 및 분리가 용이하다: 전도성 고분자에 정의 전압(positive voltage)을 짧은 시간, 예를 들어, 1분 정도 가하고, 샘플 내 존재하는 DNA를 처리하여 약 1V 에서 약 30초 동안 반응시키기만 하더라고 cfDNA, 바람직하게는 ctDNA를 손쉽게 부착할 수 있다. 또한, 부착된 DNA를 회수하기 위하여 약 -1.3V를 약 5분 동안 가해주면 90% 이상의 회수가 가능하다. 따라서 종래 사용되던 양성으로 대전된 고분자 또는 다른 분자들의 사용 없이 DNA를 샘플으로부터 부착 및 분리 할 수 있다.
(ii) 부착율이 우수하고 검출방법이 효율적이다: 프리-스탠딩 나노 와이어 구조체의 경우는 각각의 나노 와이어 기둥의 표면 개질이 가능하기 때문에 넓은 표면적으로 인하여 ctDNA의 부착력을 크게 증대시킬 수 있다. 또한, 전도성 구조체로서 외부 전기 자극에 의해서만 반응이 일어나므로 부착된 ctDNA를 전기적 신호에 의해서만 분리할 수 있다.
(iii) 혈액 내 존재하는 DNA 뿐만 아니라 타액, 소변, 대변 같은 체액 내의 DNA 또한 분리 가능하다
(iv) 작은 크기의 DNA(small fragment DNA)의 검출이 가능하다.
<검출 키트>
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 구조체를 포함하는 순환성 세포-유리 DNA(cfDNA)를 검출 또는 분리용 장치, 예를 들어 키트에 관한 것이다.
일 구체예로서, 양전하를 띠도록 표면특성이 변화된 구조체를 가진 고체 기판, 상기 고체기판의 구조체에 전압을 인가하는 전극, 및 상기 구조체를 DNA를 함유하는 시료가 통과할 때 발생하는 전기적 신호를 측정하는 측정부를 포함하는 DNA 검출장치(키트)를 제공할 수 있다.
경우에 따라서는 고체기판과 연결되어 상기 구조체로 투입되는 시료가 보관되는 시료 저장 챔버를 더 포함할 수 있다.
상기 DNA 검출장치(키트)는 생물 샘플에서 cfDNA 수준을 측정하기 위한 반응시약을 포함하는데, 생물 샘플내 cfDNA 수준은 비-제한적인 예로, 임의의 핵산 염료, 예컨대 인터칼레이터 등의 당해 기술 분야에 공지된 임의의 기법으로 측정할 수 있다.
cfDNA 수준을 측정하는데 사용될 수 있으며 본 발명에 따른 키트에 포함시킬 수 있는, DNA 인터칼레이터에 대한 비-제한적인 예로는, 베르베린(berberine), 브롬화에티듐, 프로플라빈, 다우노마이신(daunomycin), 독소루비신, 탈리도마이드(thalidomide), Sybr　Green, Sybr　Gold 및 PicoGreen을 포함한다.
<기타 용도>
또 다른 관점에서, 본 발명은 순환 종양 DNA(ctDNA)를 검출 및 분리하여 분석하는 것을 포함하는, 대상자에서 암의 발병 및 예후를 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 순환 종양 DNA(ctDNA)를 검출 및 분리하여 분석하는 것을 포함하는, 대상자의 암의 발병 및 예후의 진단방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "암"은 포유류에서 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장으로 특징 지어진 생리적 상태를 나타내거나 가리킨다. 진단 대상이 되는 암은 암종(carcinoma), 림프종 (lymphoma), 모세포종(blastoma), 육종(sarcoma), 지방육종(liposarcoma), 신경내분비종 (neuroendocrine tumor), 중피종(mesothelioma), 신경초종(schwanoma), 수막종(meningioma), 샘암종(adenocarcinoma), 흑색종(melanoma), 백혈병(leukemia), 악성 림프종 (lymphoidmalignancy), 편평세포암종(squamous cell cancer), 편평상피세포암(epithelial squamous cell cancer), 폐암(lung cancer), 소세포폐암(small-cell lung cancer), 비소세포폐암(non-small cell lung cancer), 폐샘암종(adenocarcinoma of the lung), 폐편평암종 (squamous carcinoma of the lung), 복막종(cancer of the peritoneum), 간세포성종 (hepatocellular cancer), 위암종(gastric or stomach cancer), 위장관종(gastrointestinal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 뇌암, 아교모세포종(glioblastoma), 자궁경부암 (cervical cancer), 난소암(ovarian cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 간암(hepatoma), 유방암(breast cancer), 결장암(colon cancer), 직장암(rectal cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 자궁내막 또는 자궁암(endometrial or uterine carcinoma), 침샘암(salivary gland carcinoma), 신장암(kidney and renal cancer), 전립선암(prostate cancer), 외음암(vulval cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 간암종(hepatic carcinoma), 항문암종(anal carcinoma), 음경암종(penile carcinoma), 고환암(testicular cancer), 식도정맥류암(esophageal cancer), 담도암(biliary tract) 및 두경부암(head and neck cancer)으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 암은 바람직하게는 유방암, 폐암, 위암, 간암 또는 췌장암이다.
본 발명의 방법은, 상기 암 환자 및 암에 대한 위험이 있는 사람을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기술된 진단 또는 예측 방법들 중 임의의 방법에서, 하나 이상의 암의 지표, 예를 들면, 암세포, 또는 임의의 다른 질환의 존재 또는 부재가 진단 또는 예후를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 이를 위해, 샘플 중 ctDNA의 양(농도), 카피수 또는 염기서열을 분석하고 특성화할 수 있다.
ctDNA의 분석 및 특성화는 대상자의 진행 및 병리를 평가하기 위해 다양한 간격으로 특정 시간 동안 이루어질 수 있다. 예를 들면, 시간의 함수로 추적하기 위해 1일, 2일, 3일, 1주, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월 또는 1년과 같이 규칙적 간격으로 수행될 수 있다.
시간 경과에 따른 ctDNA 양(농도) 또는 카피수에 있어 2배, 5배, 10배 이상이 되는 임의의 증가는 환자의 예후를 저하시키며, 환자가 치료를 변경해야 하는 조기 지표이다. 유사하게, 2배, 5배, 10배 이상이 되는 임의의 증가는 환자가 예후 및 치료에 대한 반응을 더 평가하기 위해 영상화와 같은 추가의 검사를 받아야 하는 것을 나타낸다.
시간 경과에 따른 ctDNA 양(농도) 또는 카피수에 있어 임의의 감소는 질환의 안정화 및 치료에 대한 환자의 반응을 나타내며, 치료를 변경하지 않는 지표이다. 암의 위험이 있는 사람들의 경우, 검출된 ctDNA 양(농도) 또는 카피수의 갑작스러운 증가는 환자에 종양이 발생 또는 진행하였다는 조기 경고를 제공하여 조기 진단을 제공할 수 있게 한다.
상기 방법에서, 또 다른 임상 평가를 제공하기 위해 또 다른 분석을 또한 수행할 수 있다. 예를 들면, 영상 분석 이외에, 유전자 발현 분석 및 PCR 기술, 예를 들면, ctDNA가 유래된 종양의 유형, 전이 상태 및 악성 정도와 같은 정보를 수득하기 위한 유전자 칩 분석 및 특정 암 마커에 대해 특이적인 프라이머를 사용한 다중화(multiplexing)를 이용할 수 있다. 또한, 환자의 암의 특성화에 관한 추가의 정보를 평가하기 위한 수단으로서 세포 크기, DNA 또는 RNA 분석, 프로테옴(proteome) 분석 또는 대사체(metabolome) 분석을 수행할 수 있다. 다양한 양태에서, 분석은 다음 마커들 중 하나 이상에 특이적인 프라이머에 대해 유도된 항체 또는 상기 프라이머를 사용한 PCR 다중화를 포함한다: EGFR, HER2, ERCC1, CXCR4, EpCAM, E-카데린,뮤신-1, 사이토케라틴, PSA, PSMA, RRM1, 안드로겐 수용체, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, IGF1,cMET, EML4 또는 백혈구 연관 수용체(LAR).
또한, 본 발명은 특정 치료 요법에 대한 대상자의 반응성을 결정하거나 또는 암 치료에서 후보 약제의 효과를 결정하기에 충분한 데이터를 제공할 수 있다.
예를 들면, 일단 약물 치료가 환자에게 시행되면, 본 발명의 방법을 이용하여 약물 치료의 효능을 측정하는 것이 가능하다. 예를 들면, 약물 치료 전에 환자로부터 취한 샘플, 및 약물 치료와 동시에 또는 약물 치료에 이어서 환자로부터 취한 하나 이상의 세포 샘플을 본 발명의 방법을 이용하여 처리할 수 있다. 각각의 처리된 샘플의 분석 결과를 비교함으로써, 약물 치료의 효능 또는 약제에 대한 환자의 반응성을 결정할 수 있다. 이러한 방식으로, 실패한 화합물에 대한 초기 확인이 이루어질 수 있거나 또는 유망한 화합물에 대한 초기 검증이 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명은 특정 임상 시험에 대한 후보 대상자를 결정하는 방법을 제공할 수 있다. 예를 들면, 후보의 검출된 ctDNA를 분석하여 임상 시험의 특정 치료 요법이 가능하게 성공적일 수 있는지를 결정하기 위해 특정 마커가 존재하는지를 결정할 수 있다.
또한, 임상 시험 동안 ctDNA의 분석은 환자가 실험 약물에 반응하는지 또는 반응하지 않는지에 관한 정보도 제공할 수 있을 것이며, 이때 확인된 ctDNA의 실질적인 무변화 또는 감소는 반응을 나타내고 확인된 ctDNA 증가는 불량한 반응을 나타낸다. 상기 정보는 약물 효과에 대한 초기 지표이며, 임상 시험에서 2차 종료점으로서 연구자에 의해 이용될 수 있다.
이처럼, 본 발명은 표면 개질된 전도성 고분자로 이루어진 3차원 나노 구조체의 순환성 세포-유리 DNA(cfDNA)의 검출 및 분리를 위한 다양한 용도를 모두 포함하고, 이에 의해 특히, 순환 종양 DNA에 의한 암 발병의 진단 및 예후에 관한 유용한 정보를 제공함으로써 선택적, 개별적 항암 치료에 매우 유용할 것이다.
<실시예>
재료 및 방법
1. Ppy-코팅된 Au NWs(Ppy/Au NWs)의 제작
종래 열 증착(thermal evaporation) 기술을 이용하여, 대략 150nm 두께의 Au 레이어를 AAO 주형(Whatman; 포어 직경, 100nm)의 한 면에 코팅하였다. 금-플레이팅 용액(Orotemps 24 RTU Rack)을 이용하여 Au 나노 와이어를 전기화학적으로 Au-backed AAO 멤브레인의 포어 내에 성장시키고, 순환 전압전류법(cyclic voltammetry)을 적용하여 100 mV/s 속도로 1.1 ~ 0 V의 전위 범위를 사용하여 Ppy를 Au 나노 와이어의 표면에 증착하도록 하여 Ppy-코팅된 Au NWs를 제작하였다.
모든 전기화학적 실험은 Ag/AgCl, 플라티늄 와이어 및 고안된 플랫폼이 참고, 카운터, 작업용 전극으로 각각 사용된 3-전극 세포에서 potentinstat/galvanostat(BioLogic SP-150)을 이용하여 수행되었다. 전도성 탄소 페이스트를 이용하여 인듐 주석 산화물(indium tin oxide, ITO) 상에 고정한 후, 상기 생성된 멤브레인을 수용성 NaOH용액(2M)에 4시간 동안 용해시켜 AAO 주형을 제거하였고, 궁극적으로 뚜렷한 길이의 Au NWs의 수직으로 배열된 어레이를 생성하였다.
Ppy-코팅된 Au NWs를 제조하기 위해, 0.01M 피롤 및 0.01M 폴리(소듐 4-스티렌설포네이트)(PPS)의 수용성 혼합물에서, 0.8V(versus Ag/AgCl)에서 20초 동안 크로노암페로메트리(chronoamperometry)(CA)를 이용하여 프리-스탠딩 Au NWs 상 Ppy의 전기화학적 증착을 수행하였다. 결과로 수득한 Ppy/Au NWs를 물로 여러번 헹구고, +1.8 V(vs Ag/AgCl)에서 2분 동안 적용함으로써 은 층의 Ppy의 전기화학적 과-산화(over-oxidation)를 위해 Tris-HCl(pH 7.5)에서 인큐베이팅하였다.
이와 같이, 전도성 고분자인 Polypyrrole(Ppy)을 다양한 길이 및 직경을 가진 나노 와이어로 제작한 후, 도 1에 나타낸 바와 같이, 전도성 나노 와이어 구조체의 전기적인 방법에 의한 표면 개질을 통하여 양성(positive) 또는 음성(negative)로의 전환을 가능하게 함으로써, 혈액 내 존재하는 음전하를 띠는 cfDNA의 부착 및 분리를 용이하게 하였다.
2. 샘플 수집 및 제작
NCC 임상시험심사위원회에 의해 승인받은 절차를 이용하여 항응고제 EDTA를 함유하는 진공채혈기 튜브에 전혈을 수집하였다. 냉장 원심분리기(3000 x g, 10min)를 이용하여 혈장을 분리하였다. Ppy/Au NWs 플랫폼의 포획 및 방출 효율을 평가하기 위하여, 건강한 공여자로부터 200㎕ 혈장 내로 DNA 래더(ladder)의 ex vivo 스파이킹(spiking)에 의해 제작된 인공 혈액 샘플을 이용하여 이들을 테스트하였다. 임상적용을 위해, 3명의 건강한 자원자 및 유방암과 폐암 환자 17명으로 혈액 샘플을 수집하였다.
3. DNA 포획(Capture) 및 방출(Release)
DNA 포획효율을 평가하기 전에, 개별적인 나노 와이어와 DNA의 상호작용을 촉진하기 위하여, 과-산화된 Ppy/Au NWs를 혈액 샘플에 30분 동안 상온에서 침지하였다: 상기 샘플들은 i) 인간 혈장에 스파이크 된 DNA 분자(250ng/mL)를 함유하는 인공 샘플들, 또는 ii) 3명의 건강한 공여자 및 17명 암환자로부터 수득한 미처리된 혈장샘플(200μL ~ 1 mL)이다.
다음으로, +1.0 V(vs Ag/AgCl)에서 30초 동안 즉각적인 DNA 포획을 수행하였다. 포획된 DNA를 방출하기 위해, Ppy/Au NWs를 -1.3V(vs Ag/AgCl)로 5분 동안 자극하였다. 상기 포획 및 방출된 DNA를 PicoGreen 분석법을 이용하여 정량화하였다.
상기 수득된 DNA를 260 및 280nm에서 분광 광도법으로 측정하고, A260/A280 비율을 이용하여 포획되고 방출된 DNA의 순도를 평가하였다. Ppy/Au NWs 및 DNA 사이의 상호작용을 Zeiss LSM 710 공초점 현미경 하 PicoGreen 형광을 검사함으로써 가시화하였다.
4. PCR 및 겔 전기영동
모든 프라이머들을 합성하여 사용하였다(마크로젠, 한국)
Figure PCTKR2016006728-appb-T000001
DNA 래더들(low: 10~100bp; middle: 100bp ~ 2kb; high: 3.5 ~21 kb)을 바이오니아(한국)로부터 구입하였다. 모든 PCR 증폭은 GeneAmp PCR system 9600(Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA)에서, 주형 DNA, 2 올리고뉴클레오타이드 프라이머(5 pM), 200mM의 각 dNTP, 10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.1%(w/v) 젤라틴 및 1U Taq DNA 폴리머라아제(Perkin Elmer)를 함유하는, 최종 반응 부피 20μL에서 수행하였다.
PCR 증폭은 45 사이클의 변성(94℃, 30s), 어닐링(64℃, 30s) 및 신장(72℃, 30s)으로 구성하였다. PCR 산물을 2% 아가로오스 겔 상에서 전기영동하고 Etbr(브롬화에티듐, ethidium bromide)으로 염색하여 UV 트랜스일루미네이터 하 그 존재를 가시화하였다.
5. QIAamp 순환 핵산 키트(circulating nucleic acid kit)
QIAamp 순환 핵산 키트를 이용하여 1mL 혈장으로부터 cfDNA를 추출하였다. 간략하게 말하면, 혈장 샘플을 프로테이나아제 K 및 용해 버퍼를 이용하여 용해하고, 순환하는 핵산들을 진공 압력을 이용하여 실리카에 결합시켰다. DNA 프래그먼트들을 여러 번의 세척 단계 후 멤브레인으로부터 회수하였다.
6. 디지털 PCR
cfDNA에서 EGFR 돌연변이를, PrimePCR ddPCR 돌연변이 분석법을 이용하여 QX200 ddPCR system(BioRad, CA, USA) 상에서 EGFR L858R 및 엑손 19 결실(p.E746-A750del)에 대해 검출하였다. 수(water)-유(oil) 에멀젼 드롭렛(droplet)들을 8μL cfDNA, 10 μL ddPCR 수퍼믹스, 및 2μL 타겟 프라이머 및 프로브를 함유하는 PCR 혼합물로부터 생성하였다. 상기 드롭렛을 생성한 후, PCR을 열 순환기(thermal cycler)에서 수행하였다. 증폭된 DNA의 적어도 하나의 카피(copy)를 함유하는 양성(positive) 드롭렛을 형광 분석법에 대한 드롭렛 리더기에 의해 검출할 수 있었다.
7. EGFR 유전자에 대한 돌연변이 테스트
일차 종양 조직에서 EGFR 유전자 위치를 PCR-direct 시퀀싱 방법을 이용하여 검출하였다. 게놈 DNA를 추출하고, EGFR 유전자의 엑손 19 및 21에 대한 특이적 프라이머를 이용하여 증폭하였다. PCR 산물들을 BigDye 터미네이터 사이클 시퀀싱 키트를 이용하여 시퀀싱하고 ABI PRISM 3100 DNA 분석기(Applied Biosystems, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.
실시예 1 : 나노 와이어 구조체를 이용하여 cfDNA의 부착/분리 능력 평가
전기 자극을 통한 효과적인 폴리피롤의 표면 개질 성질을 이용하여 DNA 래더를 혈장(blood plasma)에 스파이킹(spiking)시켜서 cfDNA의 농축 및 분리를 시도하였다. 또한, 편평한 표면보다 나노 와이어 구조체에 훨씬 더 많은 cfDNA가 부착/분리될 수 있음을 확인하였다.
구체적으로, DNA의 농축 및 분리를 위해 3단계의 과정이 필요하다. 첫 번째, 폴리피롤 나노 와이어 구조체에 높은 전압을 가하여 과-산화시켜서 양전하를 표면에 유도하였다. 그 후, 1.0 V에서 DNA 포획을 시도한 후, 3번의 세척(washing) 과정 후에 1.3V를 가하여 농축된 DNA를 나노와이어 구조체 표면으로부터 분리하여 획득하였다. 그 결과, 과-산화 전압이 높아질수록 DNA 포획 효율이 증가하는 것을 확인하였으며(도 4a 참조), 1.8V를 2분 동안 가하였을 때 가장 높은 DNA 포획 효율을 확인하였다(도 4b 참조). 또한, 효율적인 DNA 포획을 위한 전압 및 시간은 1.0V와 30 초가 가장 적합한 것으로 확인되었으며(도 4c 및 도 4d 참조), 포획된 DNA를 나노와이어 구조체 표면으로부터 분리하기 위한 가장 효율적인 전압 및 시간은 1.3V와 5분으로 평가되었다(도 4e 및 도 4f 참조).
이에 더하여, 본 발명자들은 다양한 크기의 DNA 래더(ladder)를 혈장에 스파이킹(spiking) 시킨 후 웨스턴 블럿팅 및 PICO green을 사용하여 부착 및 분리 능력을 확인한 결과를 도 5a 내지 도 5d에 도시하였다. 또한, 다양한 분자량 및 다양한 농도의 DNA를 사용하여 cfDNA 부착/분리 능력을 측정하였다.
그 결과, 분자량이나 농도에 큰 영향을 받지 않고 DNA 부착 및 분리 능력이 있음이 확인되었다. 즉, 저분자량, 중간분자량, 및 고분자량의 DNA 모두 부착 및 분리가 우수하였고, 일정량 이상 농도의 DNA를 사용하는 경우라면 DNA 부착 및 분리 능력에도 큰 차이가 나타나지 않음을 알 수 있었다.
실시예 2 :유방암 및 폐암 환자의 혈액 내에 존재하는 cfDNA 평가
유방암 환자의 혈액을 이용하여 전도성 나노 구조체 표면에 부착된 cfDNA를 형광 염료인 SYBR Green / PICO Green을 통해 공초점 현미경으로 관찰하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, 1.0 μm 길이의 나노 와이어를 사용하였을 때, 와이어 표면에 cfDNA가 완벽하게 부착된 모습을 확인할 수 있었고, 전기 자극 후에는 부착된 cfDNA가 분리되어 형광이 나타나지 않는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 유방암 환자 및 폐암 환자의 혈액을 이용하여 Qiagen kit 및 전도성 나노 구조체를 이용하여 분리된 cfDNA의 농도를 비교하였다.
그 결과, 도 6a 및 도 6b에 나타난 바와 같이, 정상인의 혈액에서 검출된 cfDNA의 양과 비교하여 암환자의 혈액에서 최고 10배 이상의 cfDNA가 검출되었다. 또한, 본 발명의 나노 구조체의 경우가 상용 Qiagen kit 보다 월등히 많은 양의 cfDNA의 분리에 성공하였다. 이를 통해 본 발명의 전도성 나노 와이어가 작은 프래그먼트 DNA를 검출하는데 효과적인 기술임을 알 수 있었다.
또한, 유방암 환자의 혈액에서 Qiagen kit 또는 나노 구조체 Ppy/Au NWs를 사용하여 cfDNA를 검출 한 후, PCR 증폭방법을 사용하여 환자 샘플로부터 EGFR 및 KRAS 돌연변이를 확인하여 도 8에 도시하였다. 즉, EGFR 및 KRAS 돌연변이 분석이 가능함을 확인할 수 있었다.
또한, 폐암 환자의 혈액에서 Qiagen kit 또는 Ppy/Au NWs를 사용하여 cfDNA를 검출 한 후, 디지털 PCR을 시행하여 환자 샘플로부터 EGFR 돌연변이의 검출 빈도를 비교하여 하기 표 2에 나타내었다.
Figure PCTKR2016006728-appb-T000002
그 결과, 현재 상업적으로 사용되고 있는 Qiagen kit보다 월등히 향상된 DNA 분리 결과를 보였고, 이를 통해, 본 발명의 전도성 나노 와이어가 종래 Qiagen kit와 비교하여 ctDNA를 검출하는데 훨씬 효과적임을 알 수 있었다.
특히, 기존의 상업제품인 Qiagen kit을 사용할 때 검출되지 않았던 작은 프래그먼트 DNA(small fragment DNA)가 본 발명의 폴리피롤 나노 와이어 구조체에서는 검출되었다는 것은 암 진단용 kit로서 사용 가능성을 시사한다.
실시예 3 : 폴리피롤 평면 구조체를 이용한 cfDNA의 부착/분리 능력 평가
폴리피롤 나노 와이어 구조체 뿐만 아니라, 본 발명자들은 추가로 폴리피롤 평면 구조체의 표면에서도 혈액 내 순환하는 cfDNA의 분리가 가능함을 확인하였다.
이와 관련하여, 도 9에 나타낸 바와 같이, 전압이 높아질수록 혈액 내 존재하는 cfDNA의 검출량이 증가하였으며, 특히 1.5V의 폴리피롤 표면의 산화(oxidation) 과정을 거치면 DNA 검출 효율이 94%로 증가하였다. 이를 통해, 폴리피롤 평면 구조체에 가해진 전압이 높아질수록 cfDNA의 분리 효율이 증가하는 것을 확인하였다.
이에 더하여, 평면 Ppy 필름을 0.6 ~ 0.8 V의 전압에서 제작하면 표면이 굉장히 매끈하기 때문에 DNA 포획 및 방출에 크게 도움이 되지 않지만, 전기중합 과정을 통하여 평면 Ppy 필름을 제작할 때 1.5 V의 높은 전압을 적용한다면 평면 Ppy 표면의 거침도가 크게 상승하여 DNA 회수에 도움이 되는 것을 확인하였다. 상기로부터, 나노 구조체의 표면의 거침도는 DNA와의 상호작용을 증진시킬 뿐만 아니라 표면 대 부피 영역도 향상시켜 많은 양의 DNA를 부착시킬 수 있는 장소를 제공함을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 분리용 구조체는 순환 종양 DNA(ctDNA) 등을 포함하는 세포 유리 DNA의 부착 및 분리가 용이하고, 검출 효율이 현저하게 향상되는 바, 순환 종양 DNA를 전기적 신호에 의해서 효과적으로 검출 및 분리함으로써 궁극적으로 암 발병의 진단 및 예후 예측에 매우 유용할 것으로 기대된다.

Claims (20)

  1. 표면 개질한 전도성 고분자를 포함하는, 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 분리용 구조체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 표면 개질한 전도성 고분자는 양전하를 띠는 것을 특징으로 하는, 세포-유리 DNA 검출 및 분리용 구조체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 구조체는 평면 구조체 또는 나노 구조체인 것을 특징으로 하는, 세포-유리 DNA 검출 및 분리용 구조체.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 나노 구조체는 나노 막대 또는 나노 와이어인 것을 특징으로 하는, 세포-유리 DNA 검출 및 분리용 구조체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 전도성 고분자는 폴리피롤, 폴리아세틸렌, 폴리아닐린, 폴리티오펜 및 폴리설퍼니트리드로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 세포-유리 DNA 검출 및 분리용 구조체.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 전도성 고분자는 폴리피롤인 것을 특징으로 하는, 세포-유리 DNA 검출 및 분리용 구조체.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 세포-유리 DNA는 순환 종양 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)인 것을 특징으로 하는, 세포-유리 DNA 검출 및 분리용 구조체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 세포-유리 DNA 검출 및 분리용 구조체를 포함하는, 세포-유리 DNA 검출 및 분리용 키트.
  9. (i) 평면 구조체 또는 나노 구조체를 형성하는 전도성 고분자의 표면을 양전하로 개질하는 단계;
    (ii) 생물학적 시료를 처리하여 상기 전도성 고분자에 cfDNA(cell free DNA)를 부착시키는 단계; 및
    (iii) 전기적 신호를 가하여 상기 전도성 고분자로부터 cfDNA를 검출 또는 분리시키는 단계를 포함하는 세포-유리 DNA를 검출 또는 분리하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 혈액, 골수, 흉수, 복막액, 척수액, 뇨, 및 타액으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포-유리 DNA를 검출 또는 분리하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 혈액인 것을 특징으로 하는 세포-유리 DNA를 검출 또는 분리하는 방법.
  12. 제9항에 있어서,
    (ii) 단계에서, 상기 cfDNA를 부착시키는 단계는 0.8 ∼ 1.2V로 20 ∼ 40초 동안 전기를 가하여 수행되는 것을 특징으로 하는 세포-유리 DNA를 검출 또는 분리하는 방법.
  13. 제9항에 있어서,
    (iii) 단계에서, 상기 cfDNA를 검출 또는 분리시키는 단계는 -1.3 ∼ -1.0 V로 4 ∼ 6분 동안 전기적 신호를 가하여 수행되는 것을 특징으로 하는 세포-유리 DNA를 검출 또는 분리하는 방법.
  14. 제9항에 있어서,
    상기 세포-유리 DNA는 순환 종양 DNA인 것을 특징으로 하는 세포-유리 DNA를 검출 또는 분리하는 방법.
  15. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 세포-유리 DNA 검출 및 분리용 구조체를 이용하여 샘플 중 순환 종양 DNA(ctDNA)를 검출 또는 분리하여 분석하는 것을 포함하는, 대상자에서 암의 발병 및 예후를 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 암은 암종(carcinoma), 림프종(lymphoma), 모세포종(blastoma), 육종(sarcoma), 지방육종(liposarcoma), 신경내분비종(neuroendocrine tumor), 중피종(mesothelioma), 신경초종(schwanoma), 수막종(meningioma), 샘암종(adenocarcinoma), 흑색종(melanoma), 백혈병(leukemia), 악성 림프종(lymphoidmalignancy), 편평세포암종(squamous cell cancer), 편평상피세포암(epithelial squamous cell cancer), 폐암(lung cancer), 소세포폐암(small-cell lung cancer), 비소세포폐암(non-small cell lung cancer), 폐샘암종(adenocarcinoma of the lung), 폐편평암종(squamous carcinoma of the lung), 복막종(cancer of the peritoneum), 간세포성종(hepatocellular cancer), 위암종(gastric or stomach cancer), 위장관종(gastrointestinal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 뇌암, 아교모세포종(glioblastoma), 자궁경부암(cervical cancer), 난소암(ovarian cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 간암(hepatoma), 유방암(breast cancer), 결장암(colon cancer), 직장암(rectal cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 자궁내막 또는 자궁암(endometrial or uterine carcinoma), 침샘암(salivary gland carcinoma), 신장암(kidney and renal cancer), 전립선암(prostate cancer), 외음암(vulval cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 간암종(hepatic carcinoma), 항문암종(anal carcinoma), 음경암종(penile carcinoma), 고환암(testicular cancer), 식도정맥류암(esophageal cancer), 담도암(biliary tract) 및 두경부암(head and neck cancer)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 폐암, 위암, 간암 또는 췌장암인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 분석은 샘플 중 ctDNA의 양(농도), 카피수 또는 염기서열을 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    ctDNA의 양(농도) 또는 카피수가 증가하는 경우 암이 발생 또는 진행된다는 정보를 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 세포-유리 DNA 검출 및 분리용 구조체를 이용하여 샘플 중 순환 종양 DNA(ctDNA)를 검출 또는 분리하여 분석하는 것을 포함하는, 대상자의 암의 발병 및 예후 진단방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019106990A (ja) * 2017-12-19 2019-07-04 国立大学法人山口大学 前癌病変又は癌の有無の予測を補助する方法

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108330171A (zh) * 2017-09-27 2018-07-27 天津诺禾医学检验所有限公司 检测egfr基因第19号外显子缺失突变的试剂盒、方法及其应用
KR102249506B1 (ko) 2017-10-30 2021-05-11 주식회사 인퓨전텍 동형2기능성 이미도에스터를 이용한 액체생검 유래 생체물질의 추출 방법
US20210010064A1 (en) * 2018-03-14 2021-01-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Enrichment of nucleic acids
US20210215681A1 (en) * 2018-06-01 2021-07-15 Genopsy Co., Ltd. Method for detection of unstable cell-free dna and device using same
KR20200117917A (ko) * 2019-04-05 2020-10-14 주식회사 제놉시 Cfdna를 이용한 암 진단방법
WO2021231862A1 (en) * 2020-05-14 2021-11-18 Georgia Tech Research Corporation Methods of detecting the efficacy of anticancer agents
KR102552632B1 (ko) * 2020-11-06 2023-07-06 사회복지법인 삼성생명공익재단 중추신경계 림프종을 진단하기 위한 마커, 이를 포함하는 중추신경계 림프종 진단 키트 및 중추신경계 림프종을 진단하는 방법
EP4281556A1 (en) * 2021-01-25 2023-11-29 The Broad Institute Inc. Methods and compositions for increasing the concentration of cell free dna
CN115253682B (zh) * 2022-07-29 2024-02-02 烟台至公生物医药科技有限公司 一种膀胱癌细胞捕获装置及捕获方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070041952A (ko) * 2005-10-17 2007-04-20 삼성전자주식회사 표면처리된 나노포어를 이용한 ｄｎａ 검출방법 및검출장치
US20100330706A1 (en) * 2009-06-25 2010-12-30 The Regents Of The University Of California Probe immobilization and signal amplification for polymer-based biosensor
KR20140088646A (ko) * 2013-01-02 2014-07-11 연세대학교 산학협력단 암 진단 및 치료용 유-무기 나노복합체
KR20150059992A (ko) * 2013-11-25 2015-06-03 국립암센터 전도성 고분자를 포함하는 세포의 검출 및 회수용 조성물

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5776672A (en) * 1990-09-28 1998-07-07 Kabushiki Kaisha Toshiba Gene detection method
US5440025A (en) * 1992-03-12 1995-08-08 University Of Massachusetts At Lowell Process for separating nucleic acid polymers
KR100399475B1 (ko) 1998-02-12 2003-09-29 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 순환 중인 암세포의 신속하고 효과적인 분리 방법 및 이를위한 제제
US6855426B2 (en) 2001-08-08 2005-02-15 Nanoproducts Corporation Methods for producing composite nanoparticles
JP4593557B2 (ja) 2003-02-27 2010-12-08 ベリデックス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 循環腫瘍細胞（ｃｔｃ）：転移癌患者における増悪までの時間、生存および療法に対する応答の早期評価
DE10311315A1 (de) * 2003-03-14 2004-09-30 Apibio Sas Verfahren und Vorrichtung zur Detektion von Biomolekülen
US7910064B2 (en) 2003-06-03 2011-03-22 Nanosys, Inc. Nanowire-based sensor configurations
US20090294303A1 (en) 2004-10-12 2009-12-03 The Regents Of The University Of California method for identifying compounds that affect a transport of a protein through menbrane trafficking pathway
US8034222B2 (en) * 2004-10-26 2011-10-11 The Regents Of The University Of California Conducting polymer nanowire sensors
CN101243316A (zh) * 2005-06-30 2008-08-13 阿普尔拉股份有限公司 含有导电聚合物的多孔复合电极
KR100700090B1 (ko) * 2005-09-23 2007-03-28 삼성전자주식회사 이온투과성 폴리머로 코팅된 전극을 이용한 핵산 정제 방법및 그 장치
BRPI0712225A8 (pt) 2006-06-02 2019-01-22 Pfizer Producs Inc métodos para prever e monitorar a eficácia da terapia antagonista de igf-1r
CN101563134A (zh) 2006-10-18 2009-10-21 派利尼斯有限公司 用于诊断和治疗男性低生育力的方法和药物组合物
KR100940598B1 (ko) * 2007-10-12 2010-02-04 부산대학교 산학협력단 Ｄｎａ검출용 마이크로칩 및 이를 이용한 검출방법
US8070928B2 (en) * 2007-12-31 2011-12-06 Intel Corporation Nanofabricated structures for electric field-assisted nucleic acid extraction
US20100041048A1 (en) * 2008-07-31 2010-02-18 The Johns Hopkins University Circulating Mutant DNA to Assess Tumor Dynamics
JP5080434B2 (ja) 2008-12-05 2012-11-21 ベリデックス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 生物学的試料から標的生体部分を単離する方法およびそのためのキット
JP5704590B2 (ja) 2010-02-05 2015-04-22 国立大学法人東京農工大学 サイズ選択マイクロキャビティアレイを用いた循環腫瘍細胞の検出
CN101812176B (zh) * 2010-04-13 2012-01-25 无锡中美亿芯生物科技有限公司 一种具有生物活性的导电聚苯胺及其制备方法和应用
EP2715351B1 (en) * 2011-05-24 2016-10-19 The Regents of The University of California Method for exosomal biomarker detection by electric field-induced release and measurement
JP5854456B2 (ja) 2011-08-23 2016-02-09 日立化成株式会社 癌細胞濃縮フィルター
US9999856B2 (en) * 2013-07-26 2018-06-19 General Electric Company Methods for electroelution of biomolecules
JP2017512483A (ja) * 2014-04-08 2017-05-25 バイオロジカル ダイナミクス，インク． 生体物質の単離のための改良された装置

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070041952A (ko) * 2005-10-17 2007-04-20 삼성전자주식회사 표면처리된 나노포어를 이용한 ｄｎａ 검출방법 및검출장치
US20100330706A1 (en) * 2009-06-25 2010-12-30 The Regents Of The University Of California Probe immobilization and signal amplification for polymer-based biosensor
KR20140088646A (ko) * 2013-01-02 2014-07-11 연세대학교 산학협력단 암 진단 및 치료용 유-무기 나노복합체
KR20150059992A (ko) * 2013-11-25 2015-06-03 국립암센터 전도성 고분자를 포함하는 세포의 검출 및 회수용 조성물

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JEON, SEUNGHYUN ET AL.: "High-purity Isolation and Recovery of Circulating Tumor Cel Using Conducting Polymer-deposited Microfluidic Device", THERANOSTICS, vol. 4, no. 11, 2014, pages 1123 - 1132, XP055340332 *
See also references of EP3315607A4 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019106990A (ja) * 2017-12-19 2019-07-04 国立大学法人山口大学 前癌病変又は癌の有無の予測を補助する方法
JP7239973B2 (ja) 2017-12-19 2023-03-15 国立大学法人山口大学 前癌病変又は癌の有無の予測を補助する方法

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