KR20150059992A

KR20150059992A - 전도성 고분자를 포함하는 세포의 검출 및 회수용 조성물

Info

Publication number: KR20150059992A
Application number: KR1020130143833A
Authority: KR
Inventors: 조영남
Original assignee: 국립암센터
Priority date: 2013-11-25
Filing date: 2013-11-25
Publication date: 2015-06-03
Also published as: US20150147747A1; KR101545160B1; US10634670B2

Abstract

본 발명은 전도성 고분자에 도펀트를 도핑시킨 조성물 및 진단용 장치에 관한 것으로서 질병 등의 진단 및 바이오물질의 검출에 이용되며, 포집한 바이오물질을 효과적이며 비파괴적으로 회수하여 정량 및 진단에 사용할 수 있는 조성물에 관한 것이다. 또한 나노구조의 스캐폴드 표면에 필름형태로 부착하여 포집효율을 극대화할 수 있고, 다양한 연결체를 활용할 수 있는 초고감도 센서로서 활용된다.

Description

전도성 고분자를 포함하는 세포의 검출 및 회수용 조성물{Composition comprising of a conductive polymer for detecting, capturing, releasing, and collecting cell}

본 발명은 생물학적 시료에서 세포 등을 포집하고 회수할 수 있는 장치 및 그 분리 회수 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 전도성 고분자에 biomolecules, 항원, 항체, 세포 등을 효과적으로 포집하고 비파괴적으로 포집한 세포를 분리하여 질병의 진단 등에 사용하기 위한 장치 및 진단 방법에 관한 것이다.

전도성 고분자(conducting polymer)란 일반적으로 전도율 10^-7 Scm^-1(반도체 이상의 값) 이상의 값을 표시하는 고분자로서 대부분의 경우는 전자 수용체 또는 전자 공여체를 고분자에 도프(Dope)함으로써 높은 전도율이 얻어진다. 도핑된(Doping) 폴리에틸렌, 폴리피롤, 폴리티오펜 등이 대표적인 전도성 고분자이다.

전도성 고분자인 폴리아닐린(polyaniline), 폴리피롤(polypyrrole)과 폴리티오펜(polythiopene) 등은 중합이 용이하고, 전기전도성이 비교적 높으며, 산화안정성 등의 물성이 우수하여 많은 주목을 받아 왔다. 이들 고분자 화합물들은 전기 전도성 이외에도 방식성과 전기 변색특성을 갖는다. 또한 고분자 본래의 특성인 가볍고 가공이 쉽다는 장점으로 인해 반도체 등 전자기기에 많이 사용되고 있다.

최초로 발견된 전도성 고분자는 폴리아세틸렌으로 그 자체로는 반도체에 불과하지만 이를 요오드로 처리하면 금속에 버금가는 전기 전도성을 갖는다. 전도성 고분자가 본격적으로 연구된 계기는 폴리아세틸렌, (CH)x 필름에 할로겐 원소들을 도핑(doping)하여 전기 전도도가 급격히 증가하는 부도체-금속 상전이 현상이 발견된 이후부터이다. 폴리아세틸렌과 같은 고분자에는 탄소 원자들의 단일 결합과 이중 결합이 번갈아 반복되는 사슬구조를 하고 있어서 π-전자가 어느 정도 자유롭게 움직일 수 있기 때문에 'π-공액 고분자(π-conjugated polymer)'라고 부른다. 또한 이런 고분자에 화학적 또는 전기화학적 방법으로 도핑하면 전기전도도를 부도체에서 금속에 이르는 영역에까지 조절할 수 있기 때문에 '전도성 고분자(conducting polymers)' 또는 '합성 금속(synthetic metals)'이라고 부르기도 한다. 이후 플라스틱처럼 휠 수도 있고 가벼운 특성 때문에 전도성 고분자는 화학이나 물리학 분야뿐 아니라 광범위한 산업적 응용성을 갖게 됐다.

혈중 종양 세포 또는 순환 종양 세포(CTC, Circulating Tumor Cell)는 혈액 중에 존재하여 체내를 순환하는 희소의 종양세포를 일컫는 것으로 종양의 전이에 중요한 역할을 담당하므로 혈중 종양세포들을 검출하는 것은 암 진단과 치료에 오랫동안 중요한 숙제로 남아있다. 현재의 항암 치료는 이러한 CTC 나 DTC(disseminated tumor cell)의 존재 유무의 확인 없이 거의 대부분의 환자들에게 일률적으로 항암제가 투여되고 있어 CTC의 발견(detection) 및 분석(analysis) 연구를 통해 CTC의 존재 유무에 따른 선별적인 항암제의 투여, 또는 CTC의 분자적 특성에 따른 맞춤형 약물 투여를 통해 약물 효능(efficacy)의 증진이 필요하다.

혈중 종양 세포는 암의 전이 및 재발에 관여하는 인자로 알려져 있으며, 특히 최근 암 연구의 큰 화두중 하나인 암 줄기 세포(cancer stem cell)를 포함하고 있을 가능성이 제시되면서 혈중 종양 세포에 대한 분석을 통해 기존의 조직 검사로 얻을 수 없는 새로운 암 예후 예측의 가능성 및 이를 바탕으로 한 환자 맞춤형 치료법의 개발이 가능할 것으로 기대된다.

하지만, 이러한 혈중 종양 세포는 혈액 내에서 그 양이 매우 적고 세포 자체가 연약하여 이를 감지하고 그 수를 파악하기가 매우 어렵다. 따라서, 환자의 체내에 존재하는 혈중 종양 세포, 암 세포 또는 암 줄기 세포를 검출할 수 있는 높은 민감성을 나타내는 진단 방법이 여전히 필요하며, 생물학적 시료 중에 포함된 혈중 종양 세포를 효율적으로 분리하는 방법 및 이와 관련된 장치가 여전히 요구되고 있다.

최근 수십 년 동안 복잡한 세포 혼합물에서 원하는 순수한 세포를 대량으로 획득, 분류 및 특성화할 수 있는 새로운 전략을 개발하는 방향으로 많은 노력이 수행되어 왔다. 세포 분리 및 정제된 세포의 상세한 분석은 기초 생물학 같은 다양한 연구분야 및 새로운 임상진단, 치료분야의 발전을 위해 필수적이기 때문이다.

희귀한 유형의 암세포는 암의 무제한적인 발생과 진행에 관련된 메카니즘을 풀어가는 과정에 매우 중요하기 때문에 다양한 근원으로부터 암줄기세포 또는 혈중종양세포(CTC: circulating tumor cells) 와 같은 희귀한 유형의 세포분리는 매우 중요하다. 특히 혈중종양세포는 암의 전이성 확산에 중요한 역할을 하기 때문에 혈중종양세포의 검출은 전이에 관한 이론을 수립하며, 결과적으로 현장진단(point-of-care : POC)을 도입할 수 있는 가능성을 제시한다.

대상세포의 막에서 발현되는 바이오마커를 인식함으로써 이루어지는 높은 친화성과 특이성의 항원-항체 친화력에 주로 의존하는 접근 방법이 개발되었으며, 이는 면역 자석 구슬, 마이크로구조 및 나노구조의 표면을 포함한다. 또한 flow cytometers, 세포검색시스템, 크기에 의한 상피종양세포(epithelial tumor cells)의 분리와 같은 기존의 벤치 탑 방법에 비하여, 현재의 플랫폼 기반 기술은 혈액 샘플에서 표적세포의 회수와 함께 순도 및 수율의 증가시킬 수 있음을 증명하고 있다.

그러나 최근의 연구 결과는 일반적으로 포집수율을 강화하는 것과 감도에 초점을 맞추고 있으나, 포집된 세포를 비파괴적으로 방출할 수 있는 기술의 가능성과 회수한 세포의 특성에 관한 기술은 활발하게 개발되고 있지 않았다.

한국공개특허 10-2013-0081952호

이에 본 발명에서는 전도성 고분자를 이용하여 바이오물질을 분리 회수하기 위한 조성물을 제공하기 위해 도펀트(dopant)가 전도성 고분자(Conducting polymer)의 내부에 도핑(Doping)된 병원성물질 검출용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 병원성물질 검출용 조성물을 포함하는 질병의 진단장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 검출용 조성물을 이용한 병원성물질 수득방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 도펀트(dopant)가 전도성 고분자(Conducting polymer)의 내부에 도핑(Doping)된 병원성물질 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 도펀트는 바이오틴(biotin), 스트렙타비딘(streptavidin) 및 항체(antibody)로 이루어진 군에서 선택되어지는 어느 하나 이상의 도펀트 일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항체는 항-EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule), 항-PSA (전립선-특이적 항원 (Prostate-Specific Antigen) : KLK3 (칼리크레인), 항-PSMA (전립선-특이적 막 항원(Prostate-Specific Membrane Antigen)), 항-PSCA (전립선 줄기 세포 항원(Prostate Stem Cell Antigen)), 항-STEAP (전립선의 6개 막통과 상피조직 항원(Six Transmembrane Epithelial Antigen of the Prostate)), 항-hTERT(human TElomerase Reverse Transcriptase), 항-WT1(Wilms tumor 1), 항-MAGE(Melanoma Antigen Family A)-A2, 항-5T4(oncofetal antigen 5T4), 항-MAGE-A3, 항-MUC1(Mucin 1, cell surface associated), 항-Her-2/neu(human epidermal growth factor receptor 2), 항-CEA(Carcinoembryonic antigen), 항-서비빈(Survivin), 항-MAGE-C1 또는 항-MAGE-C2인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 검출용 조성물은 전도성 고분자에 항체가 결합되어 있거나, 바이오틴 및 스트라비딘이 순차적으로 반복되어 연결된 연결체에 항체가 결합되어 있는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 순차적으로 반복되어 연결된 연결체는 바이오틴 및 스트라비딘의 단일 연결체가 1~50개로 반복 연결되어 있는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 병원성 물질은 항원(antigen), 항체(antibody), 혈구(blood corpuscle), DNA, RNA, 단백질(protein), 효소(enzyme), 박테리아(bacteria), 바이러스(virus) 또는 세포일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포는 암세포인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암세포는 간암, 대장암, 직장암, 자궁내막암, 난소암, 신우암, 췌장암, 소장암, 간췌담도암, 위암, 뇌종양, 유방암, MCF7 세포, HeLa 세포 또는 CTC(Circulating Tumor Cell)인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 전도성고분자는 폴리아세틸렌(Poly-acetylene), 폴리피롤(Poly-pyrrole), 폴리티오펜(Poly-thiophene), 폴리피닷(Poly-PEDOT: poly(3,4-ethylenedioxythiophene), 폴리아닐린(Poly-aniline) 또는 이들의 유도체인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 나노와이어(nanowire) 구조, 나노헤어(nanohair) 또는 나노필러(nanopillar)구조인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 금(Au), 백금(Pt), 은(Ag), 구리(Cu), 철(Fe) 또는 ITO(Indium Tin Oxide) 표면에 부착된 것일 수 있다.

또한 본 발명은 병원성물질 검출용 조성물을 포함하는 질병의 진단장치를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 진단장치는 바이오센서인 것일 수 있다.

또한 본 발명은 검출용 조성물을 이용한 병원성물질 수득방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 수득방법은 전압변화, 전류변화 또는 화합물의 첨가인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 글루타치온(glutathione)인 것일 수 있다.

본 발명에 따른 전도성 고분자를 포함하는 세포 회수용 장치는 생물학적 시료 중에 소수만 존재하는 경우라도 검출이 가능하며, 혈중암세포를 포함한 다양한 바이오물질을 효율적으로 포집할 수 있으며, 또한 바이오물질에 손상이 없이 회수할 수 있어 정량에 유용하여 암 또는 감염성 질병 등의 진단 및 연구에 사용될 수 있다.

또한 나노구조를 형성하는 바이오센서로 사용하는 경우 포집 및 회수효율이 매우 높으며, 다양한 검진, 검출, 회수용 장치 등으로 활용하는 경우 실시간 검진 등이 가능하다.

도 1 (A)는 항-EpCAM이 결합된 바이오틴 도핑 폴리피롤 플랫폼에 상피세포(EpCAM) 분자가 특이적으로 포집된 것을 도시한 것이다. (B)는 전기 자극으로 인해 포집된 세포가 손상 없이 분리되어 다시 배양되는 것을 도시한 것이다.
도 2는 전도성 폴리머에 효과적으로 EpCAM 발현한 세포가 검출된 후, negative 직류전기를 가하였을 때 폴리피롤(polypyrrole) 폴리머가 팽창됨에 따라 도핑된 비오틴(biotin) 분자가 자연스럽게 폴리머로부터 떨어져 나오면서 포집된 세포가 분리되는 것을 도시한 것이다.
도 3 (A)는 항-EpCAM이 결합된 바이오틴 도핑 폴리피롤 플랫폼의 세포 포집 수율을 평가한 것으로서 EpCAM 음성세포(HeLa 등)와 EpCAM 양성세포(MCF7)를 대상으로 항-EpCAM 유무에 따라 비교한 것이다. (B)는 바이오틴 농도에 따라 항-EpCAM이 결합된 폴리피롤 플랫폼에 포집된 HELA, MCF7 및 PC3 세포의 형광 이미지이다. (C)는 다양한 표면밀도의 바이오틴이 도핑된 폴리피롤 플랫폼에 고정된 항-EpCAM과 결합된 다양한 세포를 정량분석한 것이다.
도 4 (A)는 항-EpCAM이 고정된 폴리피롤 플랫폼에 포집된 MCF7의 방출 프로파일이며, +0.8 V, +0.4 V, 0 V, 0.5 V, 0.8 V의 전기장에서 15초 동안 노출시켰다. (B)는 15초동안 전기장을 가한 후 30분이 경과한 시점에 폴리피롤 플랫폼 표면에 남아 있는 MCF7세포를 정량하여 %로 표시한 것이다. (C)는 다양한 전위에 15초 동안 노출된 후 폴리피롤 플랫폼에서 회수한 MCF7 세포의 활성(Viability )을 나타낸 것이다. D)는 15 초 동안 0.8 V에서 전기 자극 이후에 방출 된 세포의 시간에 따른 확산과 분포를 보여주는 광학 현미경 이미지이다.
도 5 (A)는 순환전압전류법(Cyclic Voltammogram : CV) 곡선을 작성하여 그 효과를 나타낸 것이다. (B) 다양한 표면에 페리시안화 CV에서 평균 전류 밀도를 나타낸 것이다.
도 6 (A)의 상단은 EpCAM 단백질의 발현에 대해 웨스턴블롯 분석을 수행한 결과를 도시한 것이다. (A)의 하단은 0.8 V에서 15초 동안 전기자극을 수행한 웨스턴 블롯결과를 그래프로 나타낸 것이다.
(B)는 15 초 동안 0.8 V에서 전기장의 존재 여부에 따른 MCF7 세포에서 EpCAM 발현을 검출한 것을 도시한 것이다.
도 7은 항-EpCAM 고정, 비오틴 도핑된 폴리피롤을 이용하여 세포 혼합군으로부터 EpCAM 양성 MCF7세포만을 특이적 포집한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 실제로 혈액에서 순환종양세포를 검출할 수 있는지 확인하기 위해 인공적으로 MCF7 세포들을 전혈 (whole blood)에 추가하여 실험하였다. (b)는 100 ~ 1000개의 MCF7 세포들을 혈액에 섞어서 EpCAM 항체가 고정된 polypyrrole 필름에 떨어뜨렸을 때 대부분의 MCF7 세포들은 표면에 부착된 것을 나타낸 그래프이다. (c)는 2초 동안의 전기 자극을 통하여 90%의 MCF7 세포들을 손상 없이 회수할 수 있었던 것을 나타낸 것이다. 이에 반해, 대부분의 혈구세포들은 polypyrrole 표면에 부착되지도 않을뿐더러 부착되었더라도 전기자극을 가할 때 release 되지 않고 polypyrrole 표면에 그대로 남아있는 것을 확인하였다. (d)는 polypyrrole 표면에 capture되고 release된 MCF7 세포와 백혈구를 immunofluorescence로 확인한 결과 백혈구에서 특이적으로 발현되는 CD45 와 MCF7에서 발현되는 CK의 존재를 각각 확인한 영상이다.
도 9 (A)는 PSA항원(Anti-prostate specific antigen)이 도핑된 폴리피롤을 전기 중합방법으로 금나노와이어(Au NW)의 표면에 코팅한 후 BSA로 봉쇄한 후에 PSA 항원의 농도에 따른 전류의 변화를 도시한 것이다. (B)는 금나노와이어(Au NW)(a), 금나노와이어에 PSA 항체가 doping 된 폴리피롤 필름이 부착된 것 (b와 c)를 촬영한 전자현미경사진이다.
도 10은 금나노와이어(Au NW)에 PSA 항체(Anti PSA)를 첨가 후 BSA로 봉쇄한 후에 1 ng PSA 항원을 첨가 후 DPV측정법으로 전류의 변화를 도시한 것이다.
도 11은 금나노와이어 표면에 항원-항체 결합으로 인하여 전자를 흐름을 방해하는지 여부를 도시한 것이다. 항원의 양이 늘어남에 따라 전자의 흐름이 방해되는 정도를 그래프화 하였다.
도 12는 금나노와이어(Au NW)에 PSA 항체(Anti PSA)를 첨가 후 BSA로 봉쇄한 필름이 PSA에게만 반응하는지 나타낸 것이다.
도 13 금나노와이어에 PSA가 첨가됨에 따라 impedance 값이 변화하는 것을 나타낸 것이다.
도 14 Human serum을 사용하여 실험함. PSA 항원을 Human serum에 첨가함에 따른 영향을 나타낸 것으로서 BSA에는 반응이 일어나지 않고 오직 PSA가 있을 때만 항원-항체 반응으로 전자의 흐름 방해하여 전류값의 변화가 나타나는 것을 도시한 것이다.
도 15 Human serum을 사용하여 실험함. 항-PSA 항체가 도핑된 폴리피롤 필름을 Human serum에서 PSA 첨가량 변화에 따른 전류의 영향을 나타낸 것이다.

본 발명은 전도성 폴리머에 항체 또는 연결체를 도핑시켜 시료에 존재하는 목적물인 생물학적 물질 등을 포집하고 다시 목적물을 손상시키지 않고 회수할 수 있다는 사실을 최초로 규명하였으며, 따라서 본 발명은 전도성 폴리머를 이용하여 목적물인 생물학적 물질 등을 포집, 검출 또는 회수를 위한 조성물을 제공하며, 상기 조성물을 포함하는 장치 및 회수방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.

본 발명자들은 질병 등의 진단을 위해 생물학적 물질을 포집 또는 측정하는 바이오센서에 관심을 가지며 경구를 진행하던 중 바이오센서에 포집된 세포를 임상 등의 방법을 통해서 확인하기 위해서는 세포의 손상 없이 안정적으로 분리하는 것이 매우 힘들며, 검사 결과에도 영향을 준다는 점에 착안을 하여 본 발명을 완성하였다.

전도성 폴리머 또는 전도성 고분자(conducting polymer)는 외부 전기 자극의 변화에 따라 팽창과 수축 작용을 반복함에 따라 요구되는 시기에 탑재된 molecules을 개시하고 중단하는 것에 사용될 수 있다. 금속류가 우수한 열 전도성 및 전기 전도성을 기반으로 대표적인 전기 자극 반응형 물질로써 오랫동안 사용되어 졌지만 생체 내에 이식하였을 때 기계적인 강도의 현격한 차이 및 표면 개질의 어려움으로 인한 제한된 반응의 결과로서 생체 조직 자극 및 염증과 같은 부작용을 일으키는 문제점을 보이고 있다. 한편, 전도성 폴리머는 가공의 용이성, 높은 전기 전도도, 우수한 생체 친화력, 환경적 안정성 및 가역적 부피 변화 등과 같은 여러 가지 장점들 때문에 다양한 연구들에 사용되어지고 있다.

그 중에서도 폴리피룰 필름의 우수한 생체 내 안정성 및 전기 중합에 의한 제조의 용이성으로 인하여 화학/바이오 센서, 슈퍼 커패시터 (supercapacitor) 등 다양한 학문적 또는 실용적인 목적으로 응용되어 지고 있다.

그러나 전기 중합과정에서 전도성 폴리머 내부의 음이온과의 도핑(doping)/디도핑 (de-doping) 메카니즘으로 인해 생기는 폴리피롤의 현격한 부피 차이 (~ 35 vol%)가 발생하며 이러한 원리를 이용하여 지능형 platform을 제조 박테리아, 바이러스, 유전자, 단백질, 세포 등의 생물학적 목적물을 검출 및 분리할 수 있다는 사실을 최초로 규명하였다는 점에 의의가 있다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 물질을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 물질이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

전도성고분자(Conducting Polymer)란 전기전도성을 갖는 고분자를 의미하며, 전도성고분자는 단량체를 전기중합하여 얻을 수 있다.

본 발명에 있어서 도핑(doping)이란 의미는 고분자화학에서 사용되는 용어로서 고분자막(film)의 내부에 첨가제인 도펀트(dopant)를 혼입(또는 도입)시키는 방법 또는 상태를 나타낸 것을 의미한다. 또한 디도핑(de-doping)이란 고분자

본 발명에 있어서 포집이란 여러 가지 방법으로 일정한 물질 속에 있는 미량 성분을 분리하여 잡아 모으는 것으로서 특정 물질과 특히 반응성이 높은 피검체가 결합하는 것을 의미하며, 피검체는 세포, 항원, 항체, 미생물 등 다양한 바이오물질일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

본 발명은 항-EpCAM(anti-EpCAM : epithelial-cell adhesion molecule antibody) 양성 세포를 포집하고 농축하는 데 적합한 바이오틴이 도핑된 전도성 폴리머 플랫폼을 이용하며, 이러한 플랫폼은 낮은 전위를 이용하여 비파괴적으로 세포를 분리할 수 있는 최초의 시도로서, 폴리피롤(Ppy : polypyrrole)과 같은 전도성 폴리머는 간단한 전기고분자반응(또는 전기중합 :　electropolymerization)을 통해 다양한 음이온과 양이온 및 성장 인자, 항 염증성 약물, ATP, 글루타민산을 결합할 수 있기 때문에 새로운 고분자 임플란트나 약물전달제로 널리 사용된다. 폴리피롤(Ppy : polypyrrole) 전극막에 포집된 도펀트(dopant)는 전기장에 의해 촉발되어 특이적으로 방출된다.

본 발명에서는 EpCAM 양성 암 세포를 효율적으로 포집하고 방출하기 위해 이러한 기술을 채택했으며, 폴리피롤(Ppy : polypyrrole)을 위한 상대음이온(counteranion)으로서 비오틴은 비오틴 - 스트렙타비딘 커플링(biotin-streptavidin coupling)을 통해 목표물과 매우 강한 상호작용을 할 수 있다. 또한 비오틴화된 항-에피캠(biotinylated anti-EpCAM)을 연속흡착할 수 있는 항복치는 도 2 (C)에 나타내었다.

대부분의 표면이 다양한 생체 분자에 적합한 기능을 유도하는 것을 제한하는 점을 감안할 때, 비오틴 잔기가 폴리피롤(Ppy : polypyrrole)로 도핑되는 것은 순차적인 결합을 위한 강한 결합부위 또는 데더링부위(tethering site)를 제공하며, 이러한 비오틴 도핑된 폴리피롤은 다양한 콘쥬게이션(conjugation) 전략과 호환되는 표면을 제공할 뿐만 아니라, 폴리피롤의 반복적인 산화 환원과정을 통해 외부 전기 자극에 대해 폴리피롤 플랫폼의 구조 및 기능적 안정성을 제공한다. 또한 궁극적으로 "스마트" 약물 전달 시스템에 대한 깊은 통찰력을 제공한다.

본 발명자는 포집한 세포의 비파괴적인 분리를 위한 효율적인 대안을 설정하였으며, 도 1B에 포집한 세포의 전기장의 크기와 관련된 온디멘드(On-demand) 방출에 관하여 나타내었다.

< 시료 및 기구 >

1. 비오틴이 도핑된 폴리피롤( Biotin - Doped Polypyrrole : PPy )

인간 EpCAM/TROP-1 biotinylated antibody (Anti-EpCAM)는 R&D Systems으로부터 구입하였다. 피롤(Pyrrole), 비오틴(biotin), 소듐 도데실벤젠 설폰산염(sodium dodecylbenzene sulfonate : NaDBS), 페리시안화 칼륨 (potassium ferricyanide), 에틸 디메필아미노프로필 카르보디이민(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide : EDC), 수산화석신이미드(N-hydroxysuccinimide : NHS) 및 스트렙타비딘(streptavidin) 는 Aldrich로부터 구입하였다. 소혈청알부민(Bovine serum albumin : BSA)은 Bovogen으로부터 구입하였다. 수용액은 모두 Milli Q water (Millipore, USA)를 이용하여 준비하였다.

2. 항체가 도핑된 폴리피롤

나노구멍(nanoporous)이 형성된 알루미늄양극 산화물(Anodic Aluminum Oxide　: AAO)은 Whatman에서 구입하였으며, 금(AU) 도금액(Orotemp24 RTU Rack)은 Technic™에서 구입하였다. 또한 수산화 나트륨, 피롤, 폴리스티렌 설포네이트 나트륨(Poly sodium 4-styrenesulfonate), 페리시안화 칼륨(Potassium ferricyanide III), 칼륨 염화물, Tween-20, 아스코르빈산, L-글루타티온 , 면역글로불린G와 인간 AB혈청은 시그마알드리히(Sigma-Aldrich)에서 구입하였다. 항인간-PSA(Anti-Human Prostate Specific Antigen)항원, 단일항체 와 인간 PSA 키트는 Anogen에서 구입하였으며, 소혈청알부민은 Bovogen에서 구입하였으며, Milli Q (Millipore, USA)를 이용하여 증류수를 제조하였다.

3. 측정기구

전기화학적 측정은 백금와이어 상대전극과 Ag/AgCl 비교전극을 구비한potentiostat/galvanostate (BioLogic SP-150)를 사용하였으며, 전기화학적 임피던스 분광(Electrochemical impedance spectra)은 200 mV 및 5 mA의 형식전위(formal potential)에서 200 kHz와 10 mHz 사이의 주파수 대역에서 측정하였다.

전도성 폴리피롤 나노 와이어의 형상은 전계방출 주사전자현미경(field emission scanning electron microscope : FESEM, JEOL JSM-6701F)으로 조사되었다

< 실시예 1>

비오틴이 도핑된 폴리피롤( Biotin - Doped Polypyrrole : PPy )

폴리피롤 필름의 제조는 3전극 시스템을 이용하여 제조하였으며, 제조기구로는 potentiostat/galvanostat(PGSTAT: BioLogic SP-150)를 이용하였다. 상온에서 작동시켰으며, 상대전극(counter electrode)은 백금 와이어(platinum wire) 기준전극(또는 비교전극, reference electrode)은 Ag/AgCl을 사용하였다. 작업전극(working electrode)으로는 순수 ITO(Indium Tin Oxide)를 이용하여 폴리피롤의 전기고분자화반응(또는 전기중합반응)을 진행하였다.

고분자화는 0.1 M 피롤(pyrrole)과 0.01 M 소듐 도데실벤젠 설폰산염(sodium dodecylbenzene sulfonate : NaDBS) 수용액을 사용하였으며, 수용액에는 각각 1 mM, 0.1 mM 및 0.01 mM의 다양한 농도의 비오틴을 크로노암페로메트리(chronoamperometry : CA)를 0.8 V ~ 1.1 V (versus Ag/AgCl)에 2초 ~ 2분 동안 가한 후에 비오틴 도핑된 폴리피롤 필름이 ITO표면에 증착되었고 초순수 증류수(ultrapure water)로 3회 세척한 후 건조되었다.

< 실시예 2>

항체가 도핑된 폴리피롤

본 발명의 일 실시형태로서 별도의 연결자나 표지자 없이 목적 단백질 또는 항원을 직접 포집 또는 분석할 수 있는 비표지 바이오센서로 사용될 수 있다.

본 발명자들은 전도성 고분자에 항체를 직접 도핑시킨 형태로 바이오 물질의 검출에 사용될 수 있도록 항-PSA항체(Anti-PSA : anti prostate specific antigen)를 피롤용액(pyrrole)에 혼합하여 필름을 제조하였으며, 금나노와이어(Au NW) 표면에 폴리피롤(polypyrrole)을 전기고분자화 반응을 실시하였다(도 9 (A) 참조).

BSA로 폴리피롤 표면을 차단한 후에 비표지(label-free) 전기화학면역감지기(electrochemical immunosensor)로 사용하였다.

150 nm의 얇은 은(Au) 필름을 가열증발(thermal evaporation)시켜 작업전극으로 작용하는 AAO(anodic aluminum oxide) 템플릿의 한쪽 면에 증착시켰다. 전기화학적 증착을 위해서 은이 부착된 AAO 막은 1.5 X 2cm²의 전도성 ITO(인듐 주석 산화물) 표면에 배치하였다. 다음으로 노출된 개기공(open pore)을 구비한 상업용 테플론 전기도금 셀에 삽입하였다.

막 내에서의 은(Au) 나노와이어를 만들기 위해, 상업용 금 도금 솔루션을 테플론 셀에 부었으며, 전착(electrodeposition)은 100 mV/s의 스캔 속도로 순환 전압 전류 법에 의해 -1.1 ~ 0 V의 전위로 100회 스캔하며 상온에서 실시되었다.

AAO 템플릿의 은(Au)면에 탄소 페이스트를 부착하였으며, 60 ℃에서 하룻밤 동안 건조시켰다. 이러한 구조는 독립된 은(Au) 나노와이어로 남아있는 경우 강한 지지구조를 유지한다.

AAO 템플릿은 4 시간 동안 2 M NaOH 수용액에 용해되었으며, 고정된 기판은 증류수로 여러번 세척하였으며, PSA 항체를 폴리피롤필름에 도핑시키기 위해서, 항체 10 μL(1 ㎎/mL)를 0.01 M 피롤 및 PSS 수용액을 혼합하였으며, 총 부피가 400 uL가 되었다.

폴리피롤은 독립된 은(Au) 나노와이어에 전기 화학적으로 증착하였으며, 이때 +0.8V (Ag/ AgCl)를 20 초 동안 인가하였고, PSA항체가 도핑된 전도성 폴리피롤 나노와이어를 1 wt%의 Tween-20 (1X PBS)용액으로 여러번 세척한 후에 비특이적으로 부착된 항원을 차단하기위해 1 wt% BSA (1x PBS)를 처리하였다. 1 시간 후, 최종 폴리피롤 나노와이어는 1 wt% tween-20으로 수차례 세척하였다.

< 실시예 3>

나노와이어 형태의 전도성 고분자 막

본 발명의 전도성 고분자막은 입체적 형태의 검출 또는 회수장치에 사용될 수 있다.

ITO 또는 금을 나노와이어(nanowire) 또는 나노필러(nanopillar)형태로 제조한 스캐폴드(Scaffold)를 제조한 후 이러한 스캐폴드를 작업전극으로 사용하여 도 8에 나타난 형태로 제조할 수 있으며, 이러한 형태로 검출에 사용하는 경우 부피당 표면적이 극대화 되어 더 많은 피검출물을 포집할 수 있으며, 부피가 큰 피검출물의 경우 미세흡착효과로 인해 더욱 견고한 결합을 이룰 수 있다. 또한 연결체를 30회 이상 반복하여 결합시켜 나노와이어 형태를 제조할 수 있으며, 스캐폴드 구조와 함께 사용하는 경우 표면적을 극대화 시킬 수 있다.

본 발명자들은 AAO(Anodic alumina oxide) template에 금을 코팅한 후 0.1M 폴리피롤과 0.01 M PSS, 1 mM NHS-SS-biotin solution을 혼합하여 전기 중합 (electropolymerization) 방식으로 0.7 ~ 1.1 V에서 코팅을 시도한 후에 AAO template를 3 M NaOH에 녹여 폴리피롤나노와이어(Ppy nanowire)만 남아 있게 되며, 전기중합 시간에 따라 다양한 길이 (100 nm ~ 40 um) 의 나노 와이어를 획득하였다.

이때 가해진 전압에 따라 나노와이어 구조체의 표면 거침도에 영향을 받으며, 사용된 AAO template의 pore diameter에 따라 전도성 폴리피롤 나노와이어 구조체의 직경도 달라지는 것을 확인하였다.

< 실시예 4>

전기자극으로 인한 세포회수

본 발명의 또 다른 활용분야는 플랫폼에 결합된 세포 등 바이오 물질을 비파괴적으로 획득하여 진단 및 분석에 사용하는 것으로서, 전도성 고분자의 자발적인 산화 환원 동작을 작용원리로 하는 것이며, 약한 전위를 이용하여 포집된 세포와 폴리피롤에 도핑된 비오틴의 상호작용을 조절할 수 있어 효율적으로 결합을 제어할 수 있다(도 2 참조).

본 발명자들은 폴리피롤 필름에 포집된 바이오물질을 분리하기 위해서potentiostat/galvanostat (BioLogic SP-150)의 3원전극을 사용하여 포집한 바이오 물질(피검체)을 회수하였으며, 바이오물질의 효율적이며 비파괴적인 회수 여부, 회수 수율 및 회수 후 생존성 등을 확인하기 위해 아래와 같은 실험을 실시하였다.

1. 전처리

폴리피롤에 도핑된 비오틴에 고정된 항-EpCAM에 포집된 세포를 비파괴적으로 방출할 수 있는 방법에 해당하는지 확인하기 위해 실험 전에 1 mM의 비오틴이 도핑된 폴리피롤 표면에 MCF7 세포 2 X 10⁵/mL을 포집하였으며, 반복 세척을 통해 결합되지 않거나 비특이적으로 결합된 세포를 제거하였다.

2. 전위에 따른 회수효과

본 발명자들은 세포에 대한 전기장의 효과를 측정하기 위해서 폴리피롤 표면의 MCF7에 다양한 전위를 적용해 보았다.

각각 +0.8 V, +0.4 V, 0 V, -0.5 V 및 -1.0 V의 전압에서 2초 ~ 15초 동안 처리한 후 고정된 세포는 37°C, 5% CO₂에서 30분간 정치하였고, 약하게 교반하는 PBS(phosphate-buffered saline)에 넣고 포집된 세포의 방출을 조절하였으며, 그 후 고정된 세포를 세척한 후 세포마커로 염색 하였다.

비오틴이 도핑된 폴리피롤 필름에서 금 나노입자(gold nanoparticles)의 방출조절을 하는 결과와 같이 선택적인 세포 분리와 방출은 필름표면에 음전위를 가한 경우에만 나타났다. 결과적으로 폴리피롤 표면에 양성 자극(양전위)을 실시한 경우의 방출패턴은 아무런 감도도 나타나지 않았으며, 자극 없는 경우와 유사하게 되었다.

도 4(B)에 나타낸 것과 같이 - 0.5 V에 노출된 후 표면에 오직 15 %의 세포만 남아 있었으며, 0.8 V의 자극을 준 후에는 대부분의 세포가 폴리피롤 표면에서 분리되었다. 전기 중합과정에서 전도성 폴리머 내부의 음이온과의 도핑(doping)/디도핑 (de-doping) 메카니즘으로 인해 생기는 폴리피롤의 현격한 부피 차이 (~ 35 vol%)가 발생하며 이러한 원리로 폴리피롤에 도핑된 도펀트가 분리되어 포집된 세포 등을 분리할 수 있다.

세부적으로는 포집된 세포의 방출에 영향을 미치는 주요 요인은 가역적인 부피 변화와 연관되어 있으며, 세부에서 캡처 세포의 릴리스에 영향을 미치는 주요 요소는 환원 산화 사이클 동안 고분자 사슬을 실시에서 전기 화학 반응의 결과로 발생하는 가역적 부피 변화와 연관 되며 이는 산화환원주기 동안 전도성 고분자 사슬에서 전기 화학 반응의 결과로 발생한다.

실험결과에 따르면, 반복적인 산화환원된 상태는 사용된 전압에 따라 최대 35 %까지 큰 부피변화를 초래하며, 이러한 프로세스는 폴리피롤과 비오틴 상호 작용의 화학적 강도를 변경시켜 음전위에서 많은 수의 포집된 세포를 방출되는 이유를 확인하였다.

3. 화합물 첨가에 따른 회수효과

본 발명의 일 실시예로서 글루타치온(glutathione) 등 환원제를 첨가하는 경우 비오틴 도핑된 폴리피롤과 스트렙타비딘이 부착된 세포 복합체 사이의 결합력의 변화를 줄 수 있으며 설계된 표면의 산화 환원 상태와 전하의 변화로부터 발생할 수 있다.

본 발명자들은 AAO(Anodic alumina oxide) template에 금(Au)을 코팅한 후 0.1M 폴리피롤과 0.01 M PSS, 1 mM NHS-SS-biotin 용액을 혼합하여 전기 중합 (electropolymerization) 하여 Ppy 나노와이어(nanowire)를 제조한 후 NaOH 로 AAO template을 녹여 NHS-SS-biotin doped된 Ppy nanowire를 제조하였다.

이때 글루타치온은(Glutathion) 환원제로서 이황화결합(disulfide bond), 즉 NHS-SS-biotin에서 SS(이황화결합)부위를 자르기 때문에 biotin에 연결된 암세포들을 손상시키지 않고 분리할 수 있다.

실험예 1

1. 세포배양( Cell Culture )

MCF7 세포(유방암세포, EpCAM-positive), PC3 세포(전립선암세포, EpCAM-positive) 및 HeLa 세포(cervical cancer, EpCAM-negative)는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 분양받아 사용하였으며, 5% 소태아혈청(fetal bovine serum : FBS, GenDepot)이 공급되는 RPMI-1640배지(Roswell Park Memorial Institute)와 DMEM(Dulbeccos modified Eagle)배지를 이용하여 배양하였다.

2. 세포가 포집된 비오틴 도핑 폴리피롤 필름

ITO 표면에 비오틴이 도핑된 필름은 EDC (0.095 g) / NHS (0.061 g)이 포함된 용액에 45분 동안 정치하였으며, 다음으로 초순수 증류수로 3회 세척하였다.

비오틴 도핑된 폴리피롤 필름을 고정하기 위해서 스트렙타비딘 50 mL를 (20 ㎎ / mL 수용액)을 필름 위에서 1시간 동안 정치시킨 후 증류수로 3회 세척하였다.

다음으로 스트렙타비딘에 항체를 결합시키기 위해서, 4 ℃에서 하룻밤 동안 항 EpCAM (10 mg/mL in 1 X PBS용액) 30 mL로 필름을 노출시키고, PBS로 세척 한 후, 항원의 비특이적인 결합을 방지하기 위해 1 중량% BSA 100 mL(in 1 X PBS)을 필름표면에 가하였다.

세포부착을 위해 1시간 후 필름표면을 PBS로 수차례 세척 한 후 12-well 배양접시에 폴리피롤 필름/스트라비틴/항EpCAM이 결합된 ITO를 얻을 수 있었으며, 필름 표면의 접착 특성을 확인하기위해서 EpCAM양성 세포(MCF7, PC3)과 EpCAM 음성 세포(HeLa)를 2 X 10⁵ 밀도로 20분 동안 처리하였으며, 필름은 PBS로 3회 세척하였다.

3. 웨스턴 블롯( western blot )

HeLa, MCF7 및 PC3 세포는 방사선 면역침전분석 완충용액에서 포획되고 용해되었으며, 단백질 샘플(20 mg)은 10% SDS 폴리아크릴아마이드 겔(-polyacrylamide gel)로 분리되었으며 니트로셀룰로오스 필터(nitrocellulose)로 옮겨졌다.

필터는 5% 무지방 건조분유로 봉쇄하였으며, 글리셀알데히드 인산디히드로게나아제 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase : GAPDH, Santa Cruz Biotechnology)에 대한 항체는 내부 조절제로 사용하였다. 또한 양성반응은 화학 발광 검출시스템(chemiluminescence detection system, Amersham Pharmacia)을 사용하여 시각화 하였다.

4. 회수한 세포의 생존 및 활성 측정

본 발명은 또한 위의 방법으로 제조한 폴리피롤 필름을 이용하여 검출 또는 포집된 물질을 손상 없이 회수 할 수 있는 장치에 사용될 수 있으며, 본 발명자들은 비오틴 도핑된 폴리피롤 필름에 포집된 세포를 회수하기 위해 potentiostat/galvanostat (BioLogic SP-150)의 3원전극 시스템을 사용하여 0.8 V, 0.4 V, +0.4 V 및 +0.8 V의 전압을 세포가 부착된 필름 표면에 2초 ~ 15초 동안 인가하여 포집된 세포를 회수하였다.

세포의 생존을 측정하기 위해서 다음과 같은 실험을 실시하였다. MCF7, PC3 및 HeLa 세포는 20분 동안 폴리피롤 필름 / 스트랩타비딘 / 항 EpCAM에 2 × 10⁵cells의 밀도로 분주 하였으며, 최종필름은 PBS로 3회 세척되었으며, 염색을 위해서 calcein AM (녹색, 생존세포)와 ethidium homodimer-1 (적색, 사멸세포)을 세포필름 표면에 20분 동안 가하였다. 또한 표시된 세포는 형광현미경(Zeiss LSM 710 ConfoCor 3)으로 검사되었다.

본 발명자들은 세포의 활성을 측정하기 위해 다음과 같은 실험을 실시하였다. 세포활성은 (methylthiazole tetrazolium : MTT) cell count kit-8 (Dojindo Molecular Technologies)을 사용하여 생세포 표면을 검사하여 결정하였으며, 전기자극 후 MCF7 세포는 96 웰 플레이트에서 3 X 10⁴농도로 배양되었다.

실험 결과는 24시간 후 분광광도계(Molecular Devices, Emax)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

5. 면역형광

세포는 커버슬립플레이트에 옮긴 후 고정되었으며, 위에서 설명한 대로 투과한 후 EpCAM에 대한 항체를 커버슬립 플레이트에 처리하였으며, 2시간 정치하였다.

다음으로 Alexa Fluor 488(Invitrogen; EpCAM에 대해서 녹색발광)이 결합된 2차 항체를 첨가하였으며, 커버슬립을 30분간 정치하였다.

DNA(청색)는 1 mg/mL Hoechst 33258 (Invitrogen)로 염색되었으며, 표시된 세포는 Zeiss LSM 710 형광현미경으로 검사되었다.

< 실험예 2>

본 발명자들은 위의 방법으로 제조한 본 발명의 전도성고분자 플랫폼의 항-EpCAM의 선택적 결합을 확인하기 위해 아래와 같은 실험을 실시하였다.

MCF7 유방암세포, PC3 전립선 암세포와 같은 EpCAM 양성 세포와 헬라(HeLa) 자궁경부 암세포와 같은 EpCAM 음성세포를 2 X 10⁵ cells/ ㎖ 처리하였으며, 면역형광 기법을 통해서 흡착여부 및 흡착밀도를 확인하였다.

도 3 (A) 에 나타난 것처럼 폴리피롤기질에 결합된 항-EpCAM과 HeLa 세포간에는 아무런 관련성도 나타나지 않았으며, 반대로 MCF7 세포는 항-EpCAM의 존재와 강력한 상관관계가 있는 것으로 나타났다.

폴리피롤 내부에 도핑된 비오틴 농도에 대한 세포밀도의 효과를 명확히 하기위해 도 3 (B) 및 (C)에 나타난 실험을 하였으며, 폴리피롤의 비오틴 농도는 사용된 비오틴 농도와 포집효율간에 큰 차이 없이 상관관계를 보였으며, 획득된 MCF7 및 PC3 세포 밀도는 폴리피롤에 결합된 비오틴 양에 직선적으로 비례했다.

고밀도의 비오틴 수용체는 EpCAM 양성 세포의 결합부위를 증가시켜 항-EpCAM의 흡착을 증가시킨다. 도 3 (C)에 도시한 것처럼 폴리피롤 내부에 고정된 비오틴의 양에 따라 결합된 세포의 수를 나타낸 것으로서 비오틴 농도가 증가할수록 EpCAM 양성 암세포가 증가하는 것을 확인하였다.

< 실험예 　3>

본 발명자들은 본 발명에 따른 회수방법이 효율적인지 또한 비파괴적인지 확인하기위해 다음과 같은 실험을 실시하였다.

1. 회수한 세포의 생존성 확인

순환전압전류법(Cyclic voltammetry)은 전압-전류법(voltammetry)의 대표적인 예로서 산화 환원종의 전기화학적인 거동을 살펴보고, 이로부터 산화-환원반응의 메카니즘을 규명하는데 기본적으로 가장 많이 사용되는 전기화학적인 분석방법으로서, 작업전극의 전위를 일정속도로 순환시켜 전류를 측정하는 방법으로 순환전압전류곡선을 얻을 수 있다.

방출된 세포의 생존성을 테스트하기 위해 세포를 수집한 후 다시 배양하였으며, 실험결과 도 4 (C)에 나타난 것처럼 (-)0.8 부터 0.8V 사이의 약한 전기장을 가한 경우 모든 실험에서 세포 생존성이 90% 이상을 유지하여 세포의 생존성에 아무런 영향을 미치지 않았으며, 회수된 세포는 5계대(계대당 3 일) 이상으로 성공적으로 배양되었으며 이러한 사실로부터 비오틴 도핑된 폴리피롤 플랫폼은 세포의 활성을 유지하며 포집 및 방출할 수 있는 가장 유망한 플랫폼이 될 수 있다는 것을 확인하였다.

2. 회수한 세포의 방출 프로파일

도 4(D)에 나타난 것처럼 광학 현미경 이미지는 방출된 세포의 형태변화에 대해 더 자세한 정보를 제공하며 페트리접시에 도말한 후 시간의 함수로 나타내었으며, 전기자극 후 더 둥글거나 평평하게 모양을 나타내지만 분리 후 24시간이 지나면서 전체적으로 본래의 형태를 회복하였으며, 48시간 경과 후에는 대부분의 세포가 완전한 형태를 갖추게 되었다. 형태적으로 세포들은 시간이 갈수록 점진적으로 퍼진 모양으로 본래의 형태로 회복되었으며, 완전한 생물학적 기능을 회복하였다.

3. 폴리피롤 필름의 전기 화학적 특성

본 발명자들은 비오틴 도핑된 폴리피롤 필름의 전기 화학적 특성을 해석하기 위해서는 폴리피롤 표면을 통해 전기활성화 페리시안화 종의 전자전송능력을 평가하는 것이 필수적이므로 다음과 같은 실험을 실시하였다.

지시약으로 5 mM 페리시안화(ferricyanide)용액을 탐지용액(probe solution)으로 사용하여 전기자극을 가한 후 순환전압전류법(Cyclic Voltammogram : CV) 곡선을 작성하여 그 효과를 측정하였다.

실험결과 도 5(A)에 나타낸 것처럼, 비오틴 도핑된 폴리피롤 표면은 산화환원 전류에서 명백한 피크전위(peak potential)를 나타낸 반면 비오틴이 도핑된 폴리피롤 표면은 산화환원 피크에서 상당한 변화를 보였다.

이러한 거동은 폴리피롤 표면에 고정된 항-EpCAM 및 MCF7세포에 의한 것으로 보이며, 전류밀도와 피크위치를 다양화시킴으로써 전해질의 자유전이(Free Transfer)를 쉽게 막을 수 있다.

또한 도 5(B)는 다양한 표면에 페리시안화 CV에서 평균 전류 밀도를 얻었으며, 각 포인트는 별개의 3개의 실험의 평균±표준편차이다. 5 mM Fe(CN)₆ ^3-/4-를 사용하여 측정하였고, 파란색은 바이오틴 도핑된 폴리피롤이며, 바이오틴 도핑된 폴리피롤 표면에 항 EpCAM을 고정시킨 것이다. 검정색은 바이오틴 도핑된 폴리피롤 표면에 고정된 항 EpCAM이 MCF7을 포집한 것이다. 녹색은 0.8 V에서 15초 동안 자극을 가한 후 100 mV/sec의 스캔속도로 폴리피롤 표면을 측정한 것으로서, 생체분자와 MCF7 세포의 전계 중재방법(electric-field-mediated)으로 인한 탈착은 산화환원 전류의 크기를 극적으로 증가시켰다.

15초 동안 0.8 V의 전기 자극의 응용 프로그램에 의해 폴리피롤 표면의 생체분자 어셈블리를 제거하여 피크 강도를 복원하는 데 충분했으며, 도 5 (B)는 민감한 산화환원 지시약으로 페리시안화 용액을 사용하여 순환전압전류법을 통해 얻은 최대순간전류(peak current)를 나타내고 있으며, 이러한 결과는 전기화학 반응은 폴리피롤 표면에서 항-EpCAM/MCF7 세포의 흡착과 탈착의 직접적인 증거가 된다.

4. 방출세포의 발현 프로파일

본 발명자들은 방출된 세포의 분자 발현 프로파일을 얻기 위해서 전계 중재방법(electric-field-mediated approache)을 사용하였으며, Fujifilm Multigauge 3.0을 사용하여 면역형광법(immunofluorescence)과 정량을 실시하여 EpCAM 항원의 발현 정도를 평가하였다. 이때 세포 등의 분리에 있어서 인가 전기장은 세포의 구조와 생물학적 기능이 손상하지 않으며 비오틴-폴리피롤 결합을 해체하는 범위에서 선택되어야 한다.

전위에 따른 HeLa 세포 와 MCF7 세포에서 EpCAM 손실수준에 대한 효과를 측정하기 위해서 웨스턴블롯 분석을 수행하였으며, -0.8 V에서 15초 동안 인가하였으며, MCF7 세포에서 EpCAM 발현을 검출하였다. 세포는 항마우스 면역 글로불린 G 이차 항체(녹색)를 사용하여 염색하였고, 비교염색으로 Hoechst 33342 (청색)과 글리세르 알데히드-3-인산 탈수소 효소(GAPDH)을 이용하였다. 또한 전기자극을 수행한 웨스턴 블롯결과를 그래프로 나타낸 것으로서 Fujifilm Multigauge 3.0을 이용하여 단백질 발현양을 계산하였다.

실험결과 도 6(A) 및 6(B)에 나타난 것처럼 0.8 V의 음전위를 사용한 경우 MCF7 세포의 EpCAM 단백질 밴드에 대한 효과는 무시할 수 있을 정도였으며, 컨트롤 세포(0 V)의 결과와 유사하게, EpCAM 단백질이 녹색에서 많이 발현되었으며, 주로 방출된 세포의 세포질과 막에 주로 나타났다.

5. 항 EpCAM 특이적 포집

본 발명자들은 비오틴 도핑 폴리피롤 플랫폼에 의한 EpCAM-양성 세포 특이적 인식을 하는지 확인하기 위해 MCF7 cells (2 X 10⁵cells/mL)과 HeLa cells(2 X 10⁵cells/mL)을 1:1로 혼합한 샘플과 MCF7 cells (2 X 10⁵cells/mL)만 혼합한 샘플을 비교하여 실험하였다.

실험결과 도 7에 나타난 것처럼 항-EpCAM 항체가 고정된 비오틴 도핑 폴리피롤을 이용하여 실험한 결과 세포 혼합군으로부터 EpCAM 양성 MCF7세포을 특이적 포집한 결과로서, 비오틴 도핑 폴리피롤 표면은 적색 헬라 세포를 제외하고, 95%의 형광 녹색(MCF7 세포)이 나타나는 것으로 보아 특이적으로 포집된 것을 알 수 있었으며, 이러한 결과로부터 본 발명은 93%효율로 세포를 포집하였으며, 95%의 순도를 나타내는 것을 알 수 있었다. 또한 이러한 결과로부터 본 발명이 세포 포집 및 높은 효율과 순도, 비파괴적인 세포 회수에 대한 중요한 도구가 될 것으로 생각된다.

< 실험예 4>

본 발명자들은 금나노와이어(Au NW)에 항 PSA항체(Anti PSA)를 첨가한 폴리피롤 필름을 제조한 후 BSA로 봉쇄한 다음 1 ng PSA 항원을 떨어뜨린 후 시차펄스전압전류법(Differential Pulse Voltammetric Determination : DPV)으로 전류(CURRENT)의 변화를 관찰하였다.

또한 BSA의 양의 변화에 따른 전류의 변화를 측정하기 위해 금나노와이어(Au NW)에 PSA 항체 (Anti PSA)를 첨가 후 BSA로 차단한 후에 100 fg 부터 10 ng까지 PSA양을 변화시켜 전류의 양을 측정하였다.

도 9에 나타낸 것처럼 0.1에서 0.3 전압 사이에서 피크치를 형성하였으며, anti-PSA 항체를 보유하면서 PSA로 필름 표면을 차단한 경우가 25μA로 가장 낮은 전류를 기록하였으며, 단순히 금나노와이어만 사용한 경우는 62μA로 가장 높은 전류치를 기록하였다.

이러한 결과로부터 골드 나노와이어 표면에 포집되는 물질이 많을수록 전자의 통과가 어렵기 때문에 전류가 줄어드는 것을 알 수 있었다.

또한 도 10에 나타난 것처럼 PSA양을 변화에 따른 전류의 변화는 PSA가 0 일때 가장 높은 전류치를 갖으며, PSA 10ng 일때 27.5μA로 전류가 가장 낮은 값을 나타내었다. 따라서 예상대로 PSA의 양이 증가할 수록 큰 폭으로 전류가 줄어드는 것을 알 수 있었으며, 금나노와이어 표면에 항원-항체 결합으로 인하여 전자를 흐름을 방해한다는 것을 알 수 있었다.

< 실험예 5>

본 발명자들은 항-PSA 항체가 도핑된 폴리피롤 필름이 시료 중에서 PSA가 있는 경우에만 특이적으로 반응하는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 실시하였다.

금나노와이어(Au NW)에 PSA 항체(Anti PSA)를 첨가 후 BSA로 봉쇄한 후에 10 ng PSA 외에 각각의 10 ng ascorbid acid (AA), 10 ng IgG, 10 ng BSA를 첨가한 후 전류의 변화를 측정하였다.

실험결과 도 12에 나타난 것처럼 PSA를 첨가한 경우 전류가 20 μA로 나타났으며, AA, IgG 및 BSA를 첨가한 경우에는 4 μA 이하의 낮은 전류값을 나타내었다. 이러한 결과로부터 본 발명에 따른 항-PSA 항체가 도핑된 폴리피롤 필름은 PSA항원에만 특이적으로 반응하는 것을 알 수 있었다.

< 실험예 6>

본 발명자들은 항-PSA 항체가 도핑된 폴리피롤 필름에 PSA의 양에 따른 전류의 변화를 측정하기 위해 임피던스(Impedence) 실험을 수행하였다.

a는 금나노와이어만을 대상으로 하는 콘트롤이며, b는 금나노와이어와 항-PSA가 도핑된 폴리피롤 샘플이며, c는 금나노와이어에 항-PSA이 도핑된 폴리피롤 필름을 BSA로 봉쇄한 샘플이며, d는 금나노와이어에 항-PSA이 도핑된 폴리피롤 필름을 BSA로 봉쇄한 후 1 ng의 PSA를 첨가한 샘플이다.

실험 결과 도 13에 나타난 것처럼 금나노와이어에 PSA가 첨가됨에 따라 임피던스(impedance) 값이 크게 증가하는 것을 알 수 있었으며 샘플 D는 3000 Im(Z)/Ohm을 초과하여 값을 나타내었다.

< 실험예 7>

본 발명자들은 항-PSA 항체가 도핑된 폴리피롤 필름에 PSA 첨가량 변화에 따른 전류의 영향을 확인하기 위해 인간혈청(Human serum)에 PSA 항원의 농도를 달리 첨가하여 실험을 수행하였다.

첫번째로 인간혈청(HUMAN SERUM)에 10 ng PSA 및 BSA를 각각 떨어뜨린 후 전류의 변화를 측정하였으며, 도 14에 나타난 것처럼 BSA를 첨가한 경우에는 컨트롤 샘플과 마찬가지로 반응이 일어나지 않았으며, PSA를 첨가한 경우에만 항원-항체 반응으로 전자의 흐름을 막으므로 전류의 흐름이 감소되는 것을 알 수 있었다.

두번째로 첨가된 PSA 양에 따른 전류의 변화를 측정하기 위하여 각각 혈청만 첨가, 10 pg/ml의 PSA 첨가, 1 ng/ml의 PSA 첨가 및 10 ng/ml의 PSA 첨가하였다. 도 15에 나타난 것처럼 PSA의 양이 증가할수록 흐르는 전류가 감소되는 것을 알 수 있었다.

이러한 실험으로부터 항-PSA 항체가 도핑된 폴리피롤 필름에 PSA 첨가에 따라 전류값이 낮아지며, PSA의 양이 증가할수록 전류가 일정하게 감소되므로 본 발명을 바이오센서로 제작하는 경우 피검체의 정량을 안정적으로 수행할 수 있다는 것을 확인하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

도펀트(dopant)가 전도성 고분자(Conducting polymer)의 내부에 도핑(Doping)된 병원성물질 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 도펀트는 바이오틴(biotin), 스트렙타비딘(streptavidin) 및 항체(antibody)로 이루어진 군에서 선택되어지는 어느 하나 이상의 도펀트인 것을 특징으로 하는 병원성물질 검출용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 항체는 항-EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule), 항-PSA (전립선-특이적 항원 (Prostate-Specific Antigen) : KLK3 (칼리크레인), 항-PSMA (전립선-특이적 막 항원(Prostate-Specific Membrane Antigen)), 항-PSCA (전립선 줄기 세포 항원(Prostate Stem Cell Antigen)), 항-STEAP (전립선의 6개 막통과 상피조직 항원(Six Transmembrane Epithelial Antigen of the Prostate)), 항-hTERT(human TElomerase Reverse Transcriptase), 항-WT1(Wilms tumor 1), 항-MAGE(Melanoma Antigen Family A)-A2, 항-5T4(oncofetal antigen 5T4), 항-MAGE-A3, 항-MUC1(Mucin 1, cell surface associated), 항-Her-2/neu(human epidermal growth factor receptor 2), 항-CEA(Carcinoembryonic antigen), 항-서비빈(Survivin), 항-MAGE-C1 또는 항-MAGE-C2인 것을 특징으로 하는 병원성물질 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 검출용 조성물은 전도성 고분자에 항체가 결합되어 있거나, 바이오틴 및 스트라비딘이 순차적으로 반복되어 연결된 연결체에 항체가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 병원성물질 검출용 조성물.
제4항에 있어서,
상기 순차적으로 반복되어 연결된 연결체는 바이오틴 및 스트라비딘의 단일 연결체가 1~50개로 반복 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 병원성물질 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 병원성 물질은 항원(antigen), 항체(antibody), 혈구(blood corpuscle), DNA, RNA, 단백질(protein), 효소(enzyme), 박테리아(bacteria), 바이러스(virus) 또는 세포인 것을 특징으로 하는 병원성물질 검출용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 세포는 암세포인 것을 특징으로 하는 병원성물질 검출용 조성물.
제7항에 있어서,
상기 암세포는 간암, 대장암, 직장암, 자궁내막암, 난소암, 신우암, 췌장암, 소장암, 간췌담도암, 위암, 뇌종양, 유방암, MCF7 세포, HeLa 세포 또는 CTC(Circulating Tumor Cell), CTSC(Circulating Tumor Stem Cell)인 것을 특징으로 하는 병원성물질 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 전도성고분자는 폴리아세틸렌(Poly-acetylene), 폴리피롤(Poly-pyrrole), 폴리티오펜(Poly-thiophene), 폴리피닷(Poly-PEDOT: poly(3,4-ethylenedioxythiophene) 폴리아닐린(Poly-aniline) 또는 이들의 유도체인 것을 특징으로 하는 병원성 물질 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 나노와이어(nanowire) 구조, 나노헤어(nanohair) 또는 나노필러(nanopillar)구조인 것을 특징으로 하는 병원성물질 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 금(Au), 백금(Pt), 은(Ag), 구리(Cu), 철(Fe) 또는 ITO(Indium Tin Oxide) 표면에 부착된 것을 특징으로 하는 병원성물질 검출용 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 병원성물질 검출용 조성물을 포함하는 질병의 진단장치.
제12항에 있어서,
상기 진단장치는 바이오센서(Biosensor)인 것을 특징으로 하는 질병의 진단장치.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 검출용 조성물을 이용한 병원성물질 수득방법.
제14항에 있어서,
상기 수득방법은 전압변화, 전류변화 또는 화합물의 첨가인 것을 특징으로 하는 병원성