CN104862373B - 一种高通量筛选光动力抗菌光敏剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明为一种高通量筛选光动力抗菌光敏剂的方法。这种方法是通过水溶性阳离子共轭聚合物(简称CP)来检测光敏剂的光动力抗菌能力，CP结构式如式(I)如下，其中，R为三甲胺基、三乙胺基或三丙胺基；m取值为1–12；X为Cl、Br、I或F；n为聚合度，n＝8–20。利用CP的荧光淬灭程度对细菌的数量进行定量检测，从而对抗菌光敏剂的功效进行筛选。本发明与传统的筛选方法相比，具有精确、快速、简便、经济、直接等特点。通过水溶性共轭聚合物分子的荧光淬灭效率可以定量的测定细菌的数量，并利用其可以对光动力抗菌光敏剂的抗菌功效进行高通量筛选。

Description

一种高通量筛选光动力抗菌光敏剂的方法

技术领域

本发明属于化学传感及检测领域，涉及一种基于共轭聚合物高通量筛选光动力抗菌光敏剂的方法。

背景技术

由于长期使用抗生素，导致许多病原微生物产生了耐药性，严重威胁公共安全卫生，成为亟待解决的重要问题。近些年，除了新型抗生素的研发外，光动力抗菌化学疗法(PACT)在对病原菌杀伤方面得到了越来越多的关注。PACT是指利用光敏剂在光照条件下产生活性氧物种对病原菌进行杀伤，这种方法不会使病原菌产生耐药性，是一种高效优良的抗菌方法。目前已经被文献报道的抗菌型光敏剂主要包括卟啉类衍生物、共轭聚合物、BODIPY化合物和钌多吡啶配合物。抗菌型光敏剂的抗菌活性主要取决于经过光照后产生活性氧的产率。目前，对抗菌型光敏剂的筛选工作耗时长、费用高、劳动强度大，而且实验结果受操作条件的影响很大。因此开发一种简单、经济、快速的筛选光动力抗菌光敏剂的方法显得非常重要。

共轭聚合物是一类具有强的光捕获能力和光信号放大效应的高分子聚合物，目前已成功应用于信号传感，疾病诊断、生物检测、生物医学成像等方面。共轭聚合物作为荧光传感器，它可以实现对被检测物快速、准确、实时的在线检测，其灵敏度高、选择性强、操作简便。水溶性共轭聚噻吩衍生物在温度、相反电荷底物及pH值等外界环境影响下，光学性质可发生明显变化。聚噻吩可以通过静电及疏水相互作用与带负电的大肠杆菌结合，从而使其聚集状态发生改变，发生荧光淬灭。因此，可以利用聚噻吩类共聚物荧光淬灭效率检测用抗菌光敏剂抗菌后的细菌数量，从而检测抗菌型光敏剂的抗菌功效。

发明内容

本发明的目的为针对当前市场上光敏剂种类繁多，筛选具有抗菌能力光敏剂或检测其其抗菌能力强弱的工作量大且繁复的缺点，提供一种利用共轭聚合物高通量筛选光动力抗菌光敏剂的方法。发明人通过研究发现，CP是一种可以发荧光的聚合物，细菌与其结合能够引起其发生聚集，使得它的荧光发生淬灭，细菌越多荧光淬灭越严重，因此，本发明通过共轭聚合物CP来检测光敏剂的光动力抗菌能力，利用CP的荧光淬灭程度对细菌的数量进行定量检测，从而对抗菌光敏剂的功效进行筛选。

本发明的技术方案为：

一种高通量筛选光动力抗菌光敏剂的方法，包括以下步骤：

(a)将带负电的细菌溶于第一缓冲液中得到溶液a，其浓度为0.5–5.0OD；

(b)将光敏剂溶液，加入溶液a中，使光敏剂的浓度为0.1–100.0μM，室温下，光照孵育1–20分钟，光强度为50–150mW/cm²，得到溶液b；

(c)将培养基加入所获溶液b中，37℃下孵育1-5小时，得到溶液c；其中，体积比为溶液b：培养基＝1：1～3；

(d)取上步得到的溶液c，向其中加入共轭聚合物和检测缓冲溶液，室温下孵育1–10min，得到溶液d；其配比为每20μL步骤(c)得到的溶液中加入100～200μL检测缓冲溶液；加入共轭聚合物溶液使得溶液d中共轭聚合物的浓度为0.1–100.0μM；

(e)用紫外灯下照射溶液d，与相同条件下参比溶液中的聚合物荧光颜色相比较，可以判定光敏剂是否具有抗菌性(即，当荧光颜色为与参比溶液中未加光敏剂的空白试验时同为暗绿色，说明所含的光敏剂不具有抗菌性；而当荧光颜色为比参比溶液中未加光敏剂的空白试验中的颜色更为明亮时，说明所含的光敏剂具有抗菌性)；或者，根据激发光波长400–450nm下溶液d的荧光强度值，与相同条件下标准曲线的荧光值的比值，可以判断得到光敏剂作用后的细菌数量，进而判断光敏剂抗菌性的功效，进行筛选；

所述的水溶性阳离子共轭聚合物(简称CP)结构式如式(I)所示：

其中，R为三甲胺基、三乙胺基或三丙胺基；m取值为1–12；X为Cl、Br、I或F；n为聚合度，n＝8–20。

所述的培养基的制备具体为称取2g胰蛋白胨、1g酵母提取物、2g NaCl加入锥形瓶中，加入200mL超纯水，高温灭菌后，冷却到室温，3～6摄氏度冷藏待用。

所述的光敏剂优选为为卟啉类衍生物、BODIPY化合物和钌多吡啶配合物、共轭聚电解质。

所述的光敏剂最优选为吡啶基卟啉(TMPyP)、苯基卟啉(TMP)、亚甲蓝(MB)、甲苯胺蓝(TBO)、血卟啉(HP)或二氢卟吩(PC)、阳离子聚对苯撑乙炔(CPe-1)、钌-头孢菌素(BLRu)。

所述的表面带负电的细菌，具体为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、硝化细菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、白色念珠菌、根瘤菌或金黄色葡萄球菌。

所述的步骤a)中的第一缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、PB缓冲液、HEPES缓冲液。优选为PBS缓冲液。

所述的步骤d)中的检测缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、PB缓冲液、HEPES缓冲液或40％醇水。

所述紫外灯为365nm的紫外灯,照射时样品与紫外灯的距离为1–5cm。

所述的参比溶液中的聚合物荧光颜色的获得方法，包括以下步骤：

(a)将带负电的细菌溶于第一缓冲液中得到溶液a，其浓度为0.5–5.0OD；

(b)取溶液a在室温下，光照孵育2–20分钟，光强度为50–150mW/cm²，得到溶液b；

(c)将培养基加入所获溶液b中，37℃下孵育1-5小时，得到溶液c；其中，体积比为溶液b：培养基＝1：1～3；

(d)取上步得到的溶液c，向其中加入共轭聚合物和检测缓冲溶液，室温下孵育1–10min，得到溶液d；其中，每步骤(c)得到的溶液20μL加入100μL检测缓冲溶液，溶液d中共轭聚合物浓度为0.1–100.0μM；

(e)用紫外灯下照射溶液d，通过肉眼可观测到参比溶液中的聚合物荧光颜色。(为暗绿色，)

所述的标准曲线的荧光值获得方法，包括以下步骤：

将浓度相同的共轭聚合物溶液与不同数量的细菌在96孔板中混合，得到一系列细菌浓度为0–5×10⁷CFU mL^-1孔板溶液，其中，溶液中共轭聚合物的浓度为0.1–100.0μM数量，然后孵育1min，用多功能酶标仪读取制备完成样品的荧光光谱，激发光为400–450nm，得到发射光谱为400–800nm的荧光强度值。

本发明的实质性特点为：基于共轭聚合物的高通量筛选抗菌光敏剂的方法，其特征在于，基于阳离子共轭聚合物(CP)与带负电的细菌相互作用，通过细菌对CP的荧光淬灭效率定量检测经过光敏剂抗菌后的细菌数量，进而诊断光动力抗菌光敏剂的功效。

本发明的有益效果为：基于共轭聚合物所建立的高通量筛选光动力抗菌光敏剂的方法，与传统的筛选方法相比，具有精确、快速、简便、经济、直接等特点。通过水溶性共轭聚合物分子的荧光淬灭效率可以定量的测定细菌的数量，并利用其可以对光动力抗菌光敏剂的抗菌功效进行高通量筛选。与其他方法相比，本发明不需要昂贵的材料和设备，样品处理简便，成本低(通量检测一系列不同浓度的六种抗菌型光敏剂的抗菌能力花费大约1元人民币)。此外，该检测方法用时短，大约只需要4.5小时就可以完成孵育、辐照、细胞培养和检测等在内的完整筛选过程。检测结果肉眼可见，无需繁杂的仪器设备。该方法对于发现新的光动力抗菌光敏剂和抗菌策略具有重要的价值和应用前景。

附图说明

图1为本发明利用共轭聚合物检测大肠杆菌的荧光光谱图。

其中，图1a为共轭聚合物与不同数量的大肠杆菌在40％乙醇水溶液中的荧光光谱；图1b为共轭聚合物的荧光淬灭效率与大肠杆菌数量的关系曲线。

图2为经6种不同抗菌光敏剂在相同浓度及光照条件下的抗菌后，在紫外灯下PMNT的荧光变化图。

图3为随着抗菌型光敏剂(TMPyP)浓度增加大肠杆菌数量的变化图。

具体实施方式

参考下面的实施例将更详细地描述本发明。下面的实施例是用于解释的目的，并不是意图限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法如无特殊说明均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明均为自常规生化试剂商店购买得到。

本发明设计的水溶性阳离子共轭聚合物(简称CP)为公知材料，其中，PMNT的制备方法可参见文献Colorimetric and fluorometric detection of nucleic acids usingcationic polythiophene derivatives,ANGEWANDTE CHEMIE-INTERNATIONAL EDITION第41卷第9期1548-1551页；PMMT的制备方法将上述方法中的3-乙氧基溴-4-甲基噻吩换为3-甲氧基溴-4-甲基噻吩即可得到。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、预准备：六种商业光敏剂、共轭聚合物溶液及培养基的配制方法。

(a)吡啶基卟啉TMPyP溶液的配制：取0.0136g吡啶基卟啉TMPyP加入10mL超纯水中，得到1mM贮存液。

(b)苯基卟啉TMP溶液的配制：取0.0153g苯基卟啉TMP加入到10mL超纯水中，得到1mM贮存液。

(c)亚甲蓝MB溶液的配制：取0.0032g亚甲蓝MB加入1mL DMSO中，再加入9mL超纯水溶解得1mM贮存液。

(d)甲苯胺蓝TBO溶液的配制：取0.003g甲苯胺蓝TBO加入1mL DMSO中，再加入9mL超纯水溶解得1mM贮存液。

(e)血卟啉HP溶液的配制：取0.0067g血卟啉HP加入1mL DMSO中，再加入9mL超纯水溶解得1mM贮存液。

(f)二氢卟吩PC溶液的配制：取0.006g二氢卟吩PC加入1mL DMSO中，再加入9mL超纯水溶解得1mM贮存液。

(g)共轭聚合物：聚[3-(2’-N，N，N-三乙氨基-1’-乙氧基)-4-甲基噻吩盐酸盐](PMNT)(即式I中X为Cl，R为三乙胺基，m＝2，n＝6–8溶液的配制。取0.0028g PMNT加入10mL超纯水中，得到1mM贮存液。

(h)培养基的配制(配制量200mL)。称取2g胰蛋白胨、1g酵母提取物、2g NaCl加入锥形瓶中，加入200mL超纯水。高温灭菌后，冷却到室温，3～6摄氏度冷藏待用。

实施例2、检测大肠杆菌数量——标准曲线的获取(见图1)。

(a)将大肠杆菌溶于500μL PBS缓冲溶液(PBS具体组成：氯化钠4g、氯化钾0.1g、磷酸氢二钠0.71g、磷酸二氢钾0.135g，溶于500mL超纯水中，离子强度137mM PH＝7.4)中，使溶液中细菌的浓度分别从0到5×10⁷CFU mL^-1(分别为0、100CFU mL^-1、10⁴CFU mL^-1、10⁶CFUmL^-1、2×10⁶CFU mL^-1、6×10⁶CFU mL^-1、10⁷CFU mL^-1、5×10⁷CFU mL^-1)的，得到一系列细菌浓度的溶液a。

(b)将共轭聚合物PMNT溶液分别加入到上面得到的不同细菌浓度的溶液a中，使溶液中PMNT的浓度为100μM，该混合物在室温下摇匀孵育2分钟；

(c)用多功能酶标仪读取上述制备完成的样品(b)的荧光光谱，激发光为428nm，得到其发射光谱为400–800nm。

(d)将大肠杆菌数量为0，CP浓度为100μM的样品526nm处的荧光强度记为I₀；将其他样品在526nm处的荧光强度记为I。

(e)计算不同大肠杆菌数量对CP荧光的淬灭效率，即1-I/I₀。。

(f)如图1a所示，随着大肠杆菌数量逐渐增多(从0到3.5×10⁷CFU mL^-1)，通过步骤(c)测得样品(b)的荧光强度逐渐减小(从4700到550)。(标准表)

大肠杆菌数量(CFU mL-1)	3×105	9.5×105	1.92×106	5.64×106	3.44×107
						荧光强度(a.u.)	4396	4219	3788	1918	562.8

(g)通过步骤(d)(e)的计算，得到得到大肠杆菌数量与荧光淬灭效率的关系，如图1b所示。随着大肠杆菌数量增多，荧光淬灭效率越高；不同的大肠杆菌数量对应不同的荧光淬灭效率。可以利用这幅图，通过荧光淬灭效率，从图中可以查得对应的大肠杆菌数量。

实施例3、高通量的筛选抗菌型光敏剂。

(a)配置7个500μL的大肠杆菌PBS悬浮液样品，浓度均为3.5×10⁷CFU mL^-1，

(b)将6种不同的光敏剂(吡啶基卟啉TMPyP、苯基卟啉TMP、亚甲蓝MB、甲苯胺蓝TBO、血卟啉HP、二氢卟吩PC)分别加入到(a)中所述样品中，另外一个空白样品作为对照，最终得到的悬浮液中光敏剂的浓度为5.0μM，悬浮液的体积为100μL(空白溶液中光敏剂浓度为0)。将这7个样品悬浮液在100mW/cm²的白光下照射5分钟。

(c)分别将实施例1中的培养基100μL加入到步骤(b)得到的悬浮液中，在37℃下培养4小时。

(d)取(c)中所得7个样品各20μL，分别加入乙醇质量百分比为40％的乙醇水溶液170μL，再分别加入PMNT，得到PMNT浓度为100μM，室温下孵育5分钟。

(e)在波长为365nm的紫外灯(距离3cm)下用肉眼直接观察7个样品的颜色。

与空白对照样品相比，加入TMPyP、TBO、MB光敏剂后，样品具有亮绿色荧光，共轭聚合物CP没有发生荧光淬灭，这说明样品中所含大肠杆菌数量变少。即TMPyP、TBO、MB这三种光敏剂在5.0μM浓度下，可以对大肠杆菌起到抗菌作用，是三种抗大肠杆菌型光敏剂。加入HP、PC、TMP这三种光敏剂，在5.0μM浓度下，三种样品的颜色与空白对照组颜色一致为暗绿色，样品发生了荧光淬灭，说明这三组样品中大肠杆菌的数量较多，和对照组数量相近，即这三种抗菌剂在浓度为5.0μM时不具有抗菌作用。

实施例4、抗菌型光敏剂的作用浓度判断。

(a)配置7个500μL体积浓度均为3.5×10⁷CFU mL^-1的大肠杆菌PBS悬浮液样品(PBS的配方同实施例2)，作为溶液a。

(b)分别将TMPyP溶液加入到溶液a中，使TMPyP的浓度为0–50μM(浓度分别0、0.3μM、0.6μM、1μM、3μM、5μM、10μM、25μM、50μM)。取各样品100μL，在100mW/cm²的白光下照射5分钟。

(c)–(d)步骤同实施例3步骤(c)–(d)。

(e)用多功能酶标仪读取完成(f)样品的荧光光谱，激发光为428nm，发射光谱为400–800nm。

(f)计算不同光敏剂浓度对PMNT荧光的淬灭效率。从而得到不同浓度TMPyP抗菌后，大肠杆菌数量，如图3。当光敏剂TMPyP的浓度小于1.0μM时，大肠杆菌的数量为7.0×10⁶CFU mL^-1；当光敏剂TMPyP的浓度等于1.0μM时，大肠杆菌的数量为2.4×10⁶CFU mL^-1；当光敏剂TMPyP的浓度大于3.0μM时，大肠杆菌的数量为0。这说明，当光敏剂TMPyP的浓度小于1.0μM时，经过光照，细菌的数量依旧很多，该浓度下光敏剂TMPyP不具有抗菌能力；当光敏剂TMPyP的浓度大于1.0μM时；细菌的数量开始减少，说明其具有抗菌能力；最终得到TMPyP光敏剂最低的抗菌浓度为1.0μM。

实施例5、检测抗菌型光敏剂TMPyP对不同细菌的抗菌能力

(a)配置大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的PBS悬浮液样品各500μL，每个样品中细菌数量相同，均为3.5×10⁷CFU mL^-1。(PBS的配方同实施例2)

(b)取(a)中各菌样品90μL，再分别加入TMPyP溶液，总体积为100μL，得到TMPyP的浓度为5μM，得到溶液b；

(c)取100μL溶液b在室温下，光照孵育5分钟，光强度为90mW/cm²，得到溶液c；

(d)分别将实施例1中的培养基100μL加入到c样品中，在37℃下培养4小时。

(e)取(c)中所得3个样品各20μL，每个样品分别加入170μL的40％的乙醇水溶液和PMNT溶液，使PMNT浓度为100μM，室温下孵育5分钟。

(f)在波长为365nm的紫外灯下用肉眼直接观察3个样品的颜色。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌两个样品为亮荧光绿色，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌数量变少；枯草芽孢杆菌样品荧光为暗绿色，发生荧光淬灭，枯草芽孢杆菌的数量多。说明抗菌型光敏剂TMPyP(5μM)对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抗菌作用，对枯草芽孢杆菌的抗菌效果较差。

实施例6-9，其他共轭聚合物的实验验证：

将聚[3-(2’-N，N，N-三乙氨基-1’-甲氧基)-4-甲基噻吩盐酸盐](PMMT)(即式I中X为Cl，R为三乙胺基，m＝1，n＝6–8)替代PMNT来进行先前用于抗菌型光敏剂的高通量筛选：

共轭聚合物PMMT溶液的配制。取0.0027g PMMT加入10mL超纯水中，得到1mM贮存液。

不同之处为将PMMT替换PMNT用于检测大肠杆菌数量，其他步骤同实施例2-5。

实施例6通过PMMT的淬灭程度同样可以得到大肠杆菌数量与荧光淬灭效率的关系。随着大肠杆菌数量增多，荧光淬灭效率越高；不同的大肠杆菌数量对应不同的荧光淬灭效率。实施例7在高通量的筛选抗菌型光敏剂过程中，加入TMPyP、TBO、MB光敏剂后，与PMNT同样可以观察到样品具有亮绿色荧光，共轭聚合物CP没有发生荧光淬灭，这说明样品中所含大肠杆菌数量变少。加入HP、PC、TMP这三种光敏剂，三种样品的颜色与空白对照组颜色一致为暗绿色，样品发生了荧光淬灭，说明这三组样品中大肠杆菌的数量较多，即这三种抗菌剂在浓度为5.0μM时不具有抗菌作用。实施例8计算不同光敏剂浓度对PMNT荧光的淬灭效率，从而得到不同浓度TMPyP抗菌后，与PMNT同样最终可以得到TMPyP光敏剂最低的抗菌浓度为1.0μM。实施例9加入PMMT后，在紫外灯下观察，与PMNT作用效果同样可以观察到大肠杆菌和金黄色葡萄球菌两个样品为亮荧光绿色，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌数量变少；枯草芽孢杆菌样品荧光为暗绿色，发生荧光淬灭，枯草芽孢杆菌的数量多。说明抗菌型光敏剂TMPyP(5μM)对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抗菌作用，对枯草芽孢杆菌的抗菌效果较差。

由上面的实施例可以看出，本检测方法可在下述4个方面应用：

1)高通量筛选抗菌型光敏剂。通过观察加入不同光敏剂之后溶液的荧光颜色，可以直观、快速、简便的筛选抗菌型光敏剂。

2)检测抗菌型光敏剂的抗菌能力强弱。通过观察不同抗菌型光敏剂在相同浓度下对同种细菌抗菌后溶液的荧光强度，可以判断其抗菌能力的强弱。

3)检测抗菌型光敏剂的作用浓度。通过观察不同浓度下某一光敏剂对同种细菌抗菌后的荧光强度，可以找到该光敏剂在抗特定菌种时的最小抗菌浓度。

4)检测特定抗菌型光敏剂对不同细菌的杀菌能力。通过观察某种抗菌型光敏剂对不同细菌抗菌后溶液的荧光颜色，可以判断该光敏剂的抗菌的类型。

本发明未尽事宜为公知技术。

Claims (2)

1.一种高通量筛选光动力抗菌光敏剂的方法，其特征为包括以下步骤：

（a）将带负电的细菌溶于第一缓冲液中得到溶液a，其浓度为0.5–5.0 OD；

（b）将光敏剂溶液，加入溶液a中，使光敏剂的浓度为0.1–100.0 μM，室温下，光照孵育1–20分钟，光强度为50–150 mW/cm²，得到溶液b；

（c）将培养基加入所获溶液b中，37°C下孵育1-5小时，得到溶液c；其中，体积比为溶液b：培养基＝1：1~3；

（d）取上步得到的溶液c，向其中加入共轭聚合物和检测缓冲溶液，室温下孵育1–10min，得到溶液d；其配比为每20 μL步骤（c）得到的溶液中加入100~200 μL检测缓冲溶液；加入共轭聚合物溶液使得溶液d中共轭聚合物的浓度为0.1–100.0 μM；

（e）用紫外灯下照射溶液d，与相同条件下参比溶液中的聚合物荧光颜色相比较，可以判定光敏剂是否具有抗菌性；或者，根据激发光波长400–450 nm下溶液d的荧光强度值，与相同条件下标准曲线的荧光值的比值，可以判断得到光敏剂作用后的细菌数量，进而判断光敏剂抗菌性的功效，进行筛选；

所述的共轭聚合物结构式如式（I）所示：

式（I）

其中，R为三甲胺基、三乙胺基或三丙胺基；m取值为1–12；X为Cl、Br、I或F；n为聚合度，n= 8–20；

所述的培养基的制备具体为称取2 g 胰蛋白胨、1 g 酵母提取物、2 g NaCl 加入锥形瓶中，加入200 mL 超纯水，高温灭菌后，冷却到室温，3~6摄氏度冷藏待用；

所述的光敏剂为卟啉类衍生物、BODIPY化合物、钌多吡啶配合物或共轭聚电解质；

所述的带负电的细菌，具体为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、硝化细菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、白色念珠菌、根瘤菌或金黄色葡萄球菌；

所述的步骤a）中的第一缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、PB缓冲液、HEPES缓冲液；

所述的步骤d）中的检测缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、PB缓冲液、HEPES缓冲液或40%醇水；

所述紫外灯为365 nm的紫外灯,照射时样品与紫外灯的距离为1–5cm；

所述的参比溶液中的聚合物荧光颜色的获得方法，包括以下步骤：

（a）将带负电的细菌溶于第一缓冲液中得到溶液a，其浓度为0.5–5.0 OD；

（b）取溶液a在室温下，光照孵育2–20分钟，光强度为50–150 mW/cm²，得到溶液b；

（c）将培养基加入所获溶液b中，37°C下孵育1-5小时，得到溶液c；其中，体积比为溶液b：培养基＝1：1~3；

（d）取上步得到的溶液c，向其中加入共轭聚合物和检测缓冲溶液，室温下孵育1–10min，得到溶液d；其中，每步骤（c）得到的溶液20μL加入100 μL检测缓冲溶液，溶液d中共轭聚合物浓度为0.1–100.0μM；

（e）用紫外灯下照射溶液d，通过肉眼可观测到参比溶液中的聚合物荧光颜色；

所述的标准曲线的荧光值获得方法，包括以下步骤：

将浓度相同的共轭聚合物溶液与不同数量的细菌在96孔板中混合，得到一系列细菌浓度为0–5×10⁷ CFU mL^-1孔板溶液，其中，溶液中共轭聚合物的浓度为0.1–100.0 μM数量，然后孵育1min，用多功能酶标仪读取制备完成样品的荧光光谱，激发光为400–450 nm，得到发射光谱为400–800 nm的荧光强度值。

2.如权利要求1所述的高通量筛选光动力抗菌光敏剂的方法，其特征为所述的光敏剂为吡啶基卟啉（TMPyP）、苯基卟啉（TMP）、亚甲蓝（MB）、甲苯胺蓝（TBO）、血卟啉（HP）或二氢卟吩（PC）、阳离子聚对苯撑乙炔（CPe-1）或钌-头孢菌素（BLRu）。