CN103733050A - 代谢活性的快速检测 - Google Patents

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Abstract

本发明一些方面通过获得样品、在多个时间点照射样品、在多个时间点测量来自样品中的代谢活性标记物的透射光、以及由多个时间点处的透射光变化检测代谢活性的存在或缺失从而提供了检测样品中的代谢活性的方法。本发明另一些方面通过提供其中具有反映样品中的代谢活性的可检测的标记物的样品、由标记物产生放大信号、在多个时间点测量放大信号、以及由信号变化检测代谢活性从而提供了检测样品中的代谢活性的方法。其他方面提供了检测样品中的代谢活性的系统。

Description

代谢活性的快速检测
关于联邦政府资助的R&D的声明
本发明的一部分在美国政府的支持下完成。由此，美国政府可以享有本发明的某些权利。
背景
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年8月22日提交的美国临时申请第61/526,160号的优先权权益，该临时申请通过引用以其整体特别并入本文。
发明领域
用于检测样品中的代谢活性，尤其是通过检测代谢活性而检测和/或表征样品中的病原体和毒素的方法和系统。
相关技术的描述
表现出感染(细菌的、病毒的或真菌的)症状的患者通常被给予抗微生物药物。最近增长的耐药的细菌性病原体(一些是目前无法医治的)的发展使其更加重要，正确鉴定病原体并开出准确针对于该病原体的药方是至关重要的。然而，利用目前的技术，鉴定引起传染性疾病的病原体耗费较长的时间，通常为48-72小时。这种延迟通常需要凭经验给予广谱的抗菌药物疗法，这必然不是由实验室关于病原体鉴定或其对具体疗法敏感性的具体信息指导的。这种盲目的经验疗法可能会导致重要的继发性并发症，例如药物反应、发展耐药性以及进行不必要的诊断测试。正是出于这些考虑，已驱使大量的努力来开发更快速诊断和表征此类感染的工具。
在已建立的快速诊断方法中，基于聚合酶链式反应(“PCR”)的方法(其检测核酸材料)作为潜在的快速诊断工具是开发最多的。然而，该方法是病原体特异性的，并且需要首先鉴定和开发病原体的分子靶。此外，这些基于PCR的方法并没有提供关于病原体的抗菌药物敏感性的任何信息，除非该信息在以前就已经被开发。有几种其它记录的方法用于开发关于病原体对特定药物敏感性(或抗性)的信息。然而，这些方法需要预先增加之前获得的临床样品，因此并未及时提供信息。
例如，U.S.3,772,154描述了用于细菌样品的自动化抗生素敏感性分析的方法和装置，其中将临床样品分成几个等分试样，并将其注入一个或多个含有不同抗生素的容器中，并且其中将所述等分试样孵育几个小时，然后将其杀死，通过不同方法来测定细菌计数。由于该方法依赖于计数细菌细胞，在可得到准确的敏感性信息之前，必须存在大量的细胞。这一要求使得该方法对于临床样品而言不现实，尤其是遇到低水平的病原体负荷时。
U.S.3,983,006描述了测定抗生素的最小抑菌浓度(“MIC”)的方法，其通过连续测量响应于抗生素不存在和存在时细菌悬液的细菌生长速率的光学性质变化来测定。U.S.4,132,599描述了无需分离细菌而测定受感染的尿液样品中的细菌的抗菌药物敏感性的方法。这些方法基于细菌ATP分析，并且需要消除非细菌ATP。
U.S.4,146,433描述了通过琼脂稀释法可获得抑菌活性的方法。准备含有稀释抗生素的琼脂板，将测试细菌接种到琼脂板并获得MIC值。随后，将灭活抗生素的酶液散布到平板喷布上，以使抗生素失活。进一步孵育之后，测定平板上没有可见的生长出现的最小浓度，将其定义为最小杀菌浓度(“MBC”)。该方法是现今得到MIC和MBC值的标准。然而，为提供相关信息，该方法通常耗费超过24小时。
U.S.4,209,586描述了以下方法：监测生长期期间具有和不具有所测试的生长抑制剂时微生物培养物的氧化还原电势变化，其中氧化还原电势通常是正的且电势变化的速率近似于线性。有效的生长抑制剂在不超过1小时之内产生可测量的氧化还原电势变化降低至更小的负值。指示所测试试剂的生长抑制作用的敏感信号可由比较器获得，具体通过存储第一时间指示氧化还原电势的放大信号，并将所存储的信号连同在此后不超过1小时获得的其它放大信号一起输入比较器。
U.S.4,236,211描述了以下方法：开发了表格或方程式形式的在预先确定的抗生素几种(如一种或两种)浓度存在下不同微生物的生长与至少抑制这种样品活性所必需的该抗生素的最小浓度之间的固定函数关系。对抗生素和常规类别的微生物的每一种预期组合建立这种关系，在预定时间或生长水平时测定生长程度，优选在“生长”或“不生长”极端条件处出现饱和之前。通过标准公认的定量技术来测定得到这些固定关系所使用的最小浓度。之后，可通过以下方法快速且准确地测定至少抑制任何指定致病性微生物的活性所必需的预先确定的抗生素的最小浓度，其中致病性微生物来自同一预先确定的常规类别的生物体：(1)在相同的预定时间之后，相同的少量(如，一种或两种)预定浓度的抗生素存在下，测定所取样的致病性生物体的生长；以及(2)利用所得到的测量结果和之前建立的固定函数关系来鉴定微生物和抗生素的特定组合所需的最小浓度。还公开了半自动和自动实施该方法的装置。
U.S.4,252,897描述了用于细菌测试的方法和装置，其中多针接种头获得区室化样品盘中的细菌样品，并将其转移至区室化培养板中孵育。培养板包含推测的测试培养基和一些细菌对其敏感的抗生素。还包括指示剂材料，其随着由细菌生长引起的pH变化而变色。该结果是彩色的几何图案，其被输入计算机存储器。还以同样的方式接种另外的培养板，每个培养板含有不同的测试培养基和指示剂。将所有培养板孵育之后，将数据输入存储器，计算机设备将未知细菌的敏感性图案与已知细菌已知的敏感性图案进行比较，以确定对每一种未知细菌样品最有可能的鉴定。
U.S.4,132,599描述了测定细菌敏感性的方法，其中将培养基中细菌悬液的等分试样，抗微生物药物和氚化胸腺嘧啶存放在聚乙烯管中，该管具有由细过滤器隔开的两个区室。将沉淀剂(如三氯乙酸)放入聚乙烯管中以沉淀细菌。这之后，使用真空系统通过过滤器抽出液体，然后计数所过滤的细菌。与U.S.3,772,154一样，该方法依赖于细菌细胞计数，其需要存在大量的细胞。
U.S.4,448,534描述了用于抗生素敏感性测试的装置，其中通过光密度法测定了多等分盘中的细菌计数。该方法也需要存在大量的细菌细胞。U.S.4,604351描述了类似的装置，但是其中将摄取标记的核苷酸用于测定不同化学药剂存在下的细菌生长。该方法局限于摄取标记核苷酸的细菌细胞。
U.S.6,750,038描述了测定细菌对已知抑制细菌内特定酶途径的抗菌药物敏感性的设备。在这种情况下，抗性通过对应于抗性机制的特定酶的抑制或表达来表征。这种方法局限于仅具有特定抗性机制的细菌。U.S.6,861,230描述了用于细菌细胞生长的外部条件的腺苷酸激酶体外测试的试验。
U.S.7,081,353描述了用于药物敏感性测试的设备，所述药物敏感性测试基于样品中伴随不同细菌和抗菌药物浓度的氧气消耗速率。通过用氧电极检测溶氧浓度来测量药物敏感性是众所周知的，但是一般耗费较长的时间(几天)。Machida等描述了改进方法，可将时间周期缩短至几小时。但是即便如此，由于临床样品中存在的宿主细胞代谢的耗氧量损害了氧气测量结果。因而，这些方法没有一种能应用于直接从临床样品及时得到敏感性信息。
直接在临床样品中开发病原体鉴定和敏感性信息的困难可用拉曼散射法来说明。当从临床样品开始时，常规拉曼法为鉴定病原体需要较多的样品制备时间(大约24小时)，以及额外的几小时用于敏感性测试。拉曼法涉及照射感兴趣的样品(在这种情况下，含有临床样品和疑似病原体的样品瓶)。一些入射光以不同于入射光波长的波长非相干散射，散射光强度对波长的光谱成为病原体的信号。
然而，问题出现于可能是临床相关的低浓度的病原体。例如，每毫升血液的单个集落形成单位(CFU/mL)将与人体中的“细菌血症/真菌血症”病症一致。更常见的数目是10-100CFU/mL，在罕见情况下，数目可高达100,000-1,000,000CFU/mL。甚至在1,000,000CFU/mL时，临床样品主要是其他成分。例如，全血中，红血细胞和白血细胞都会超出细菌细胞数目。即使从血液中去除红血细胞和白血细胞(例如通过离心)，病原体还是以固有血清蛋白质为主，其拉曼光谱与病原体的拉曼光谱类似。
具体地，大约10,000,000CFU/mL时，血清样品将具有与固有血清成分含量相当的病原体含量。100CFU/mL时，血清样品具有的病原体含量小于固有血清成分100,000倍。
因而，临床样品的拉曼光谱以临床样品的固有成分为主。这是以前的方法为何要求在从病原体获得有用的拉曼光谱之前，必须分离和培养病原体的根本原因。这种实施拉曼法的难度同样适用于其他方法。
尽管有这些限制，仍然提出了用于病原体鉴定和敏感性测定的几种基于拉曼的方法。在所有这些方法中，利用不同的机制来克服病原体临床浓度低。
例如，U.S.5,866,430描述了检测和鉴定化学和微生物分析物的方法。该方法包括四个基本步骤，其中第一步是试图浓缩微生物细胞的生物浓缩器。U.S.5,573,927描述了以下方法：将原始培养的细菌大肠杆菌的第一组靶细胞的拉曼光谱与抗生素存在下培养的相同细胞的拉曼光谱进行比较，利用比较结果得到关于细菌对抗生素抗性的信息。在这种情况下，样品由分离和培养的大肠杆菌细胞组成，因而该方法不能应用于临床样品，但是将差异光谱法用于开发其他敏感性。U.S.6,040,906描述了将共振拉曼光谱法用于鉴定生物物质(biomatter)的多种有机和无机成分的方法。之前，U.S.4,847,198已表明细菌纯培养物的共振拉曼光谱显示分类标示符。通过收集共振拉曼光谱作为激光激发频率函数，这些发明人要求保护利用所讨论物种的拉曼光谱的激发行为来分类鉴定的方法。U.S.6,379,920描述的方法将来自未受感染患者的临床样品的拉曼光谱用作参比，从未知临床样品的拉曼光谱中减去该参比。利用该方法，发明人声称特定细菌能够快速鉴定而无需培养。然而，该方法不需要显著的细菌细胞计数，这样具有病原体的样品的拉曼光谱不同于没有病原体的样品的拉曼光谱。
U.S.7,256,875和U.S.7,262,840描述了通过拉曼成像检测和鉴定致病性微生物的方法。虽然可将这些方法用于检测正常透明样品中的病原体(如市政供水中的隐孢子虫，如U.S.7,428,045所述)，但是这些方法不能应用于其中预期存在具有类似拉曼信号的大量细胞的临床样品。
考虑到现有技术中的这些局限性，开发能快速鉴定和表征临床样品中存在的未知病原体对抗菌剂的敏感性而无需任何分离步骤的方法和系统是理想的。我们现在发现了检测样品中的代谢活性的方法和系统，特别是通过检测代谢活性来检测和/或表征样品中的病原体和相关物质。
发明概述
一些实施方案是检测样品中的代谢活性的方法，其包括：获得样品；用基本上单色的光在多个时间点照射样品；在多个时间点测量来自样品中的代谢活性的化学标记物的拉曼散射光；以及由多个时间点处的拉曼散射光的变化检测代谢活性。另一些实施方案是检测样品中的代谢活性的方法，其包括：提供其中具有可检测的标记物的样品，所述可检测的标记物反映样品中的代谢活性；由标记物产生放大信号；在多个时间点测量放大信号；以及由多个时间点处放大信号的变化检测代谢活性。一些实施方案是检测样品中的代谢活性的系统，其包括：光源；控制器，用于用光源定期照射样品，其中所述样品含有响应于样品中的代谢活性的化学标记物；检测器，其被配置用于测定来自标记物的光信号；以及计算机，其被配置用于接收来自检测器的光测量结果并确定标记物随时间的变化，所述标记物随时间的变化指示样品中的代谢活性。
在一些实施方案中，拉曼散射光是共振增强的。在一些实施方案中，拉曼散射光的变化是累积的。在其他实施方案中，标记物是抗氧化剂、自由基清除剂、类胡萝卜素和/或番茄红素。在一些实施方案中，标记物是螯合元素的蛋白复合物和/或螯合铁的蛋白复合物。在一些实施方案中，标记物由于代谢活性而增加。在其他实施方案中，标记物由于代谢活性而减少。
在一些实施方案中，代谢活性是产生自由基、产生类胡萝卜素和/或螯合铁。在一些实施方案中，代谢活性的存在指示存在诸如细菌、真菌、寄生虫或病毒的病原体。在另一些实施方案中，代谢活性指示样品中存在由病原体释放的毒素或其他疾病调节物质。
在一些实施方案中，样品含有抗病原性物质。抗病原性物质任选配置用于允许从所检测的代谢活性进行病原体鉴定和/或分类。在一些实施方案中，样品含有配置用于允许从代谢活性的存在进行病原体鉴定和/或分类的培养液。任选地，抗病原性物质选自抗生素的、抗真菌的和抗病毒的物质。所测量的代谢活性指示抗病原性物质有效或无效。
在一些实施方案中，样品包括体液，如血液、脑脊液和/或尿液。任选地，样品被培养并能够包括所培养的细胞系。在一些实施方案中，标记物天然存在于样品中。在另一些实施方案中，标记物在照射之前被添加到样品中。在一些实施方案中，样品在样品中或样品容器上包括校准的拉曼标记物。任选地，样品或样品容器被询问校准的拉曼标记物的存在或强度。
在一些实施方案中，完成检测不超过约6小时。在另一些实施方案中，完成检测不超过约30分钟。
在一些实施方案中，来自标记物的光信号来自斯托克斯-拉曼散射。在另一些实施方案中，来自标记物的光信号来自反斯托克斯-拉曼散射。
在一些实施方案中，样品中的标记物的量随时间累积指示样品中的代谢活性。在另一些实施方案中，样品中的标记物随时间减少指示样品中的代谢活性。在一些实施方案中，由标记物透射的光是共振增强的。
附图说明
图1描述检测样品中的代谢活性的一种方法的流程图。
图2描述检测样品中的代谢活性的另一种方法的流程图。
图3描述检测样品中的代谢活性的一种实施方案的系统。
图4描述利用螯合铁作为代谢活性指示剂的检测样品中的代谢活性的方法的一种实施方案的简图。
图5检测样品中的代谢活性的方法的一种实施方案获得的代表性光谱。
图6说明检测样品中的代谢活性的一种方法的归一化峰强度对时间的图。
图7说明通过病原体蛋白质螯合铁的简图。
图8描述利用番茄红素的变化作为代谢活性指示剂检测样品中的代谢活性的方法的又一实施方案的简图。
图9说明不同检测方法信噪比的表。
图10说明铁-转铁蛋白激发曲线的图。
图11显示细菌分类的拉曼光谱。
图12说明细菌分类实验中恒峰强度的数据图。
图13说明细菌分类实验中峰强度变化的数据图。
图14含有MRSA的血液样品的拉曼光谱覆盖图。
图15说明不同病原体浓度的峰强度变化的图。
图16说明作为病原体浓度函数的生物标记物斜率的图。
图17说明利用一实施方案来检测抗生素的MIC的图。该图说明进行测量来估算MIC。
图18说明利用一实施方案来检测抗生素的MIC的图。该图显示通过一种特定方法可估算MIC。
图19描述利用标记物来区分含有多种病原体的样品的图。
图20说明利用一实施方案来检测具有多种病原体的样品的MIC的图。
图21表明由牛分枝杆菌(M.bovis)产生番茄红素的图。
图22显示由牛分枝杆菌产生番茄红素的另一图。
图23表明由偶发分枝杆菌(M.fortuitum)产生番茄红素的图。
图24显示检测样品中的毒素的图。
图25显示由于样品中存在的毒素而随时间可检测的变化的另一图。
发明的详细描述
如本文所使用，缩写词定义如下：
ATP      三磷酸腺苷
CBC      全血球计数
CFU      集落形成单位
cm-1      厘米倒数或波数
EDTA     乙二胺四乙酸
Fe-Tr    铁-转铁蛋白
MBC      最小杀菌浓度
MIC      最小抑菌浓度
MDR      多药物抗性
nm        纳米
PCR      聚合酶链式反应
apo-Tr   缺乏结合铁的转铁蛋白
ROS      活性氧类
RNS      活性氮类
UV       紫外光
前言
本领域的需要通过监测样品中响应于入侵病原体的代谢活性的变化的设备来解决。现有技术中的难点可归结于试图测定临床样品中病原体的浓度或生物负荷的一般方法。由于与临床样品中的固有成分相比，病原体的浓度低，很难测定。相比之下，所公开的某些实施方案测量响应于入侵病原体的化合物的变化，包括随时间的累积的变化和包括名义上更小的基线水平的变化。因而，这些实施方案能够表征临床样品中存在的低水平的病原体。
本发明的另一实施方案测量了临床样品中易于检测的化合物的形成。在所有情况下(标记物的产生、消耗或修饰)，测量的灵敏度可通过合理使用固有放大标记物产生的信号的测量技术来提高。
一些实施方案开发利用铁螯合过程。每种入侵病原体都需要铁来生长，而脊椎动物宿主在专门的含铁蛋白如血液中存在的铁-转铁蛋白复合物中螯合铁。因此，病原体必须从宿主蛋白质中提取铁。不同的病原体采用不同的机制从宿主蛋白质中螯合铁。如果血液(对于病原体而言，除了缺乏游离铁之外，其恰巧是在各方面通常有利的生长介质)中存在活的病原体，转铁蛋白中的铁含量被快速耗减。相比之下，当血液样品中不存在活的病原体时，转铁蛋白中的铁含量保持不变。
铁-转铁蛋白(Fe-Tr)复合物中存在的铁产生强的拉曼谱带。这些拉曼谱带可作为转铁蛋白中铁含量的标记物，用可商购的拉曼光谱仪来监测。例如，Fe-Tr谱带在1510，1280，1160和1605cm-1处具有强的拉曼峰。铁-转铁蛋白(Fe-Tr)复合物中存在的铁还在以大约470nm为中心处产生光吸收峰。该光吸收峰可作为转铁蛋白中铁含量的标记物，用可商购的颜色传感器来监测。
因此，一种实施方案是可商购的拉曼光谱仪监测临床样品中1510cm-1处的拉曼峰作为时间的函数。除了最低可利用的游离铁之外，临床样品需要进行一些处理以将其转化成各方面合适的生长介质，并且唯一可利用的铁来源是铁-蛋白复合物。对于血液样品，这通过离心步骤或利用未凝结血液的重力分离含有病原体和铁-转铁蛋白复合物的血清或血浆来完成。对于尿液样品，这可通过将少量尿液样品添加至更大量的贮存血清中来完成。如果存在活的病原体，Fe-Tr的铁含量将被快速耗减。在另一些实施方案中，抗菌药物敏感性通过添加抗菌药物重复测量来表征。
在另一实施方案中，监测番茄红素产生的共振拉曼峰。当使用532nm波长的激光时，番茄红素在1510至1520cm-1(即1516cm-1)，1150至1160cm-1(即1156cm-1)以及1005cm-1处具有共振增强的拉曼峰。此外，番茄红素是有效的自由基清除剂，并且自由基通常由细菌和真菌细胞在正常代谢过程中产生以及由人细胞产生。这样的自由基产生是在细胞呼吸过程中的化学渗透和形成ATP的结果。因此，血清样品中存在活的积极复制的细菌和真菌细胞，将导致自由基产生(这与来自晚期分化的人细胞的自由基相比被放大更多)，其反过来将由血清番茄红素清除。由番茄红素清除这些自由基将改变番茄红素分子的光学性质，包括其共振拉曼光学性质。可监测这些光学性质上的变化，如番茄红素峰强度的降低，以检测病原体活力。
在另一实施方案中，将选择性培养基添加到临床样品中时，监测病原体活力(通过以上所列的任一方法)。添加利于病原体生长的选择性培养基将导致活力信号增强，这可用于病原体分类。添加阻止某些病原体生长的选择性培养基将导致活力信号降低，这也可用于鉴定病原体。
在又一实施方案中，在外来物质的疑似存在下，监测人细胞产生的自由基(通过标记物，如以上所述的番茄红素标记物)。如果存在某些外来物质如病原体，人细胞将产生自由基，其可由拉曼仪检测。
定义
出于本论述的目的，拉曼散射是将样品上固定波长的入射光通过由于吸收入射光子的非相干处理而以其它波长散射的任何方法，具体通过将结构由初始较低(基态)激发至较高振动水平，随后松弛下来至另一不同的基态水平。
出于本论述的目的，拉曼谱带是对应于来自分子内特定化学键的拉曼散射的光谱分布(强度对频率)。可理解的是，每一种化学键以不同频率显示拉曼谱带，并且在某些情况下，这些拉曼谱带可重叠，使它们很难区分。另外，可理解的是，化学键的拉曼截面是定义相应拉曼峰强度的常数。此外，可理解的是，该截面可随波长和/或随共振变化。在共振拉曼增强期间发生这样的共振变化。
出于本论述的目的，可理解的是，样品的拉曼光谱是所有拉曼谱带的总和，拉曼光谱中单独的拉曼谱带的相对高度与相应化学键的相对丰度乘以其拉曼截面成比例。
出于本论述的目的，吸收是其中入射光被感兴趣的样品吸收，并且入射光子可通过任意数量的机制与结构相互作用的任何方法，所述机制包括激发外层电子(相当于吸收UV或可见辐射)，或激发分子成更高振动/转动能态。
共振拉曼散射法应当被理解为特殊类型的拉曼散射过程，其包括将分子从初始基态激发成对应于真正振动态的真正激发态。因而，出于本论述的目的，共振拉曼增强(或共振拉曼)是通过强的光吸收增强特定谱带的拉曼截面的任何方法。
出于本论述的目的，铁载体(siderophore)是由病原体释放的蛋白质，其从宿主铁-蛋白质复合物中夺取铁并将铁转运至病原体。
出于本论述的目的，铁螯合是入侵病原体从宿主的铁-蛋白质复合物中获取铁的过程。反过来，铁获取涉及宿主通过形成蛋白质-铁复合物而减少自由铁的量的过程。
出于本论述的目的，可理解的是，铁载体介导的铁螯合是可被病原体利用从宿主铁-蛋白质复合物中螯合铁的几种可能的机制中的一种。此外，可理解的是，无论哪种机制，最终结果是从宿主中的铁-蛋白质复合物中夺取铁。
出于本论述的目的，可理解的是，可螯合宿主中的铁的不同宿主-蛋白质复合物包括转铁蛋白、乳铁蛋白、亚铁血红素和铁蛋白。
出于本论述的目的，可理解的是，铁-蛋白质复合物能够以包括铁的形式或不包括铁的形式存在。将这两种形式描述为含铁和缺乏结合铁(apo)-状态。以转铁蛋白为例，可将这两种形式描述为Fe-Tr和apo-Tr。
出于本论述的目的，可理解的是，类胡萝卜素是清除自由基的化合物，番茄红素是非常有效的自由基清除剂。
出于本论述的目的，外分枝菌素(exomycobactin)是由致病性分枝杆菌利用的细胞外铁载体(有时被称为羧基分枝菌素)，和细胞内的分枝菌素铁载体一起来获取铁。
出于本论述的目的，最小抑菌浓度(MIC)定义为抗菌药物抑制病原体生长的最小浓度，其中病原体具有标准浓度(通常限定为100,000CFU/mL)。
出于本论述的目的，可理解的是，任何测量系统中的噪音与所测量的量的平方根成比例。
检测方法图解
图1和图2示出说明检测样品中的代谢活性的方法的流程图实例。参见图1，方法由方框1获得样品开始。本领域已知获得样品的多种方法。在一些实施方案中，样品以准备好分析的方式提供。在另一些实施方案中，样品在分析之前需要额外准备。在方框1提供样品之后，方法继续至方框2，其中在多个时间点照射样品。然后方法继续至方框3，其中在多个时间点测量来自样品中的标记物的拉曼散射光。然后方法继续至方框4，其中由多个时间点处的透射光变化来检测代谢活性。
参见图2，方法由方框5获得具有可检测标记物的样品开始。这样的标记物直接或间接反映代谢活性。本领域已知获得样品的多种方法。在一些实施方案中，样品以准备好分析的方式提供。在另一些实施方案中，样品在分析之前需要额外准备。在方框5提供样品之后，方法继续至方框6，其中由标记物产生放大信号。放大的一个非限制性实例是共振拉曼增强。然后方法继续至方框7，其中测量放大信号。这样的测量可在一个或更多时间点进行，包括多个时间点。然后方法继续至方框8，其中由一个或更多时间点包括多个时间点处的放大信号的变化来检测代谢活性。
检测系统图解
图3显示检测样品中的代谢活性的系统实例。参见图3，系统具有控制器301，光源302，样品303，检测器304，以及计算机305。虽然图3以不同的方框代表这些系统组件，应当理解的是，在一些实施方案中，一种或多种系统组件可作为多组件起作用。例如，计算机和控制器可以是同一组件。
参见图3，控制器指导光源照射样品。在一些实施方案中，控制器允许定期照射。在另一些实施方案中，控制器允许连续照射。样品303含有响应于样品中的代谢活性的标记物。样品303中的标记物将信号如光传输至检测器304。检测器304被配置用于测量来自标记物的信号。计算机305被配置用于接收来自检测器的测量结果并确定标记物随时间的变化。这样的变化指示样品中的代谢活性。
铁螯合方法的描述
如图4所示，一实施方案包括采集临床样品11，之后样品制备12。样品制备12将样品转化为分析物14。监测分析物14的代谢活性，在该实施方案中，其表示为铁随时间的螯合(15)。利用拉曼光谱仪来测定代谢活性13。
如前所述，样品制备12将样品转化为测试的分析物。除了限制利用的自由铁之外，测试的分析物包含病原体生长的全部必需元素。将全部铁螯合至专门的铁-蛋白质复合物中，并且病原体必须从该复合物中螯合铁。
在图4中，除了不可利用的自由铁之外，样品制备步骤12包括将临床样品转化成有利于病原体代谢的样品，并且全部铁被螯合至宿主蛋白(如转铁蛋白)。如果初始临床样品是血液，那么样品制备步骤任选包括重力沉降和/或离心血液样品以分离出血清。血清将包括血液中存在的任何病原体，以及支持病原体代谢所必需的除自由铁之外的全部生长介质。如果临床样品是尿液，那么样品制备步骤任选包括将少量尿液样品添加至适当制备的贮存血清中。
病原体浓度可由病原体螯合铁的速率得到。在更高的病原体浓度时，轨迹Fe-Tr峰高对时间的斜率更大。因而，在一些实施方案中，铁螯合的速率用一组不同病原体浓度的已知标准样品来预先表征，并且在一些实施方案中，临床样品的铁螯合速率与这些速率相匹配。
如本文进一步所述，抗菌药物敏感性可通过度量最小抑菌浓度(“MIC”)来表征。由同一临床样品制备一系列渐增抗菌药物浓度的分析物。在一些实施方案中，将渐增浓度的抗病原性物质添加至样品中。监测这些样品的代谢活性提供关于抗病原性物质有效或无效的信息。此外，监测这些样品提供关于有效抗病原性物质的MIC的信息。作为这种实施方案的一个非限制性实例，铁螯合标记物的轨迹不随时间变化的分析是临床样品中病原体浓度的最小抑菌浓度。
如上所述，如果通过拉曼光谱仪监测铁螯合过程，那么测试涉及随时间收集一系列拉曼光谱。非铁标记物的这种收集的假定描述显示在图5中。单独的拉曼光谱包括一个或多个峰如22、22和23，在铁螯合的情况下，这些峰是由Fe-Tr(21和22)或由apo-Tr和/或血清脂蛋白(23)产生。随时间监测Fe-Tr峰中的一个(例如22)的峰高，如图5所示。如果存在活的病原体并且螯合铁以提供Fe-Tr，那么铁-转铁蛋白峰随时间降低，如图6中的轨迹33和34所示。另一方面，如果不存在活的病原体，或者如果分析物中存在活的病原体以及有效的抗菌药物，那么峰高几乎不随时间变化。图6中描绘的四条轨迹代表来自未受感染患者的血清(轨迹31)，具有高剂量耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MRSA)的血清(轨迹33)，具有MRSA和有效剂量的万古霉素的血清(轨迹32)，以及具有MRSA和无效剂量的氨苄青霉素的血清(轨迹34)。
在一些实施方案中，信号质量作为时间的函数增强。例如，由于病原体代谢和消耗铁，铁水平稳步耗减。虽然由于病原体浓度低，铁耗减速率可能较小，但是这种耗减可随时间积累达到显著水平。因而，在约20-30分钟的合理时间间隔之内，能够表征非常低浓度的病原体。
通过铁载体鉴定病原体
可由上述的基本构想得到几个其他实施方案。标记物可由图7中的方案总结。基线标记物是铁-蛋白质复合物(图7描述了铁-转铁蛋白质复合物，但是还可使用其他蛋白)，并且由图7中的方案1描述。如果存在活的病原体并且从铁-蛋白质复合物中螯合铁，那么铁-蛋白质复合物的相应水平降低。该降低通过多种分析方法来监测。在一些实施方案中，分析方法是光谱学的，如拉曼光谱法。在另一些实施方案中，分析方法是光学的。
在某些情况下，活的病原体不能从铁-蛋白质复合物中螯合铁。这样的一个具体实例是致病性分枝杆菌的活病原体。在这种情况下，可在诊断临床样品中存在(或不存在)致病性分枝杆菌的装置中利用标记物。所修饰的标记物由方案2描述。为了从宿主蛋白质复合物中获取铁，致病性分枝杆菌需要必须协同工作的两种铁载体蛋白。这两种铁载体包括细胞内分枝菌素铁载体和细胞外外分枝菌素铁载体。其中，致病性分枝杆菌可根据需要产生分枝菌素铁载体，但是其只在经历非常长时间的铁不足的情况下才产生外分枝菌素铁载体。
因此，当体液如血清中存在致病性分枝杆菌时，通常不能从铁-蛋白质复合物中螯合铁，因而不能生长。血清被认为针对致病性分枝杆菌是抑菌的。然而，如果将外分枝菌素添加到分析样品中，那么将满足铁螯合的所有条件，致病性分枝杆菌开始螯合铁。因此，一些实施方案涉及将促进病原体代谢活性的物质如所述的外分枝菌素铁载体添加至样品中，将所得到的代谢活性(即铁螯合速率)与任选的对照分析(未添加外分枝菌素的分析物)中的代谢活性(即铁螯合速率)进行比较。如果测试的分析物(添加外分枝菌素的分析物)中的铁螯合速率大于对照分析(未添加外分枝菌素的分析物)中的铁螯合速率，那么其是存在致病性分枝杆菌的阳性指示。在一些实施方案中，与对照分析的比较是任选的。在另一些实施方案中，将促进病原体代谢活性的物质添加至样品中，可用于鉴定和/或分类样品中的病原体。
通过自由基和质子的产生检测病原体
在一些实施方案中，病原体的存在通过病原体相关的代谢活性来确定，而病原体相关的代谢活性通过与标记物氧化还原活性相关的共振拉曼光谱的变化确定。测试的分析物中病原体的存在导致产生自由基和质子。根据Mitchell假说(参见Mitchell P.et al.，Biochemical Journal1961;81:24;Mitchell P.，Nature1961Jul;191:144-148)，自由基/质子的产生是保证细胞代谢的结果，这在微生物中得到了验证(Mitchell P.，Fed.Proc.1967Sep;26(5):1370–1379)。该“假说”现在已被证明且被公认为是微生物细胞产生能量的机制。因而，响应于自由基和/或质子的产生的标记物对于检测代谢活性和病原体存在是有用的。这样的标记物包括但不限于，抗氧化剂、自由基清除剂、ROS和RNS敏感性染料，以及质子敏感性化学物质如酸碱指示。此外，类胡萝卜素包括番茄红素(其是人血清/血浆的成分)是非常有效的自由基清除剂——被认为是人血浆中存在的最有效的自由基清除剂(参见Wassermann A.，Molecular Physics1959Apr;2(2):226–228;Content and isomeric ratio of lycopene in food and humanblood plasma10.1016/S0308-8146(96)00177-X:Food Chemistry;ErmakovIV et al.，J.Biomed.Opt.2005;10(6):064028–064028)。接触由细菌/真菌代谢产生的自由基和质子时，生物体中的番茄红素被质子化形成碳正离子并最终反应产生β-胡萝卜素和视黄醛。
番茄红素具有的光吸收谱包括集中于约532nm处的可重现的最大吸收谱。质子化(伴随着其他化学反应)时，番茄红素的光吸收谱红移，并且约532nm处的吸收峰消失。当采用约532nm波长的入射激光收集拉曼光谱时，相应的番茄红素拉曼光谱共振增强。相比之下，当番茄红素被质子化时，约532nm处的最大吸收红移，共振拉曼增强也减少。这些性质导致以下关于人血清或血浆的光学性质的观测结果：(1)采用约532nm波长的激光收集拉曼光谱时，人血清(或血浆)的拉曼光谱主要是番茄红素的拉曼光谱(主要峰在1516cm-1和156cm-1处)，即使番茄红素名义上并不是人血清的主要成分。(2)如果存在活的病原体，并且如果那些病原体正在经历代谢活性，那么拉曼光谱中的番茄红素峰的强度随时间降低。
图8描述了这样的实施方案。参见图8，获得临床样品16并任选地进行样品制备17，以提供进行分析19的样品。分析19包括用拉曼光谱仪18照射分析的样品，以及检测番茄红素的量随时间的变化，如框20所示。这样的变化指示代谢活性，由通过来自分析的信号测定。代谢活性反过来是存在病原体的指示。在一实施方案中，病原体的存在通过它们在代谢期间产生的自由基来检测。虽然所有活的生物体的代谢导致自由基集中于细胞壁，但是细菌和真菌病原体具有单一的细胞壁。因而，真菌和细菌病原体中的代谢产生在它们的细胞壁处集中的自由基，其中这些自由基可由血清中存在的自由基清除剂清除。一些自由基清除剂具有共振增强的拉曼光谱。例如，如上所述，番茄红素是与β-胡萝卜素类似的红色类胡萝卜素；其在532nm处具有强的吸收光谱。因而，当使用532nm激光时，番茄红素具有共振增强的拉曼光谱，其相比血清其他固有成分占主导地位。此外，番茄红素是非常有效的自由基清除剂，并且与由病原体代谢产生的自由基反应。所得到的番茄红素结构变化可通过拉曼光谱法，利用约532nm波长的激光容易地监测。本领域技术人员将认识到，该基本方法可扩展至其他类似的方法。例如，当利用具有480-510nm的稍微更低的激光波长的拉曼散射装置时，可将该基本原理应用于检测β-胡萝卜素(其由一些病原体在其代谢过程中产生)。本领域技术人员还将认识到，可将激光的组合用于开发病原体的生化特征谱。例如，可以使用具有488nm激光波长的拉曼仪表征β-胡萝卜素的产生，以及将其与具有532nm激光波长的拉曼仪相结合表征番茄红素-自由基清除。所得到的生化特征谱表征代谢循环期间β-胡萝卜素的产生，并且可用于鉴定病原体。
在一些实施方案中，标记物消耗的速率与样品中病原体的量成比例。例如，在一些实施方案中，番茄红素峰强度随时间降低的速率与样品中存在的病原体的量成比例，并且那些病原体以该速率代谢。因此，在一些实施方案中，将标记物消耗的速率用于测定样品中的病原体浓度。
参见图5和图6，如果通过拉曼光谱法监测番茄红素消耗作为代谢活性的指示剂，那么测试涉及随时间收集一系列拉曼光谱。这种收集的代表性描述显示于图5中。独立的拉曼光谱包括一个或多个峰，如22、22和23，对于番茄红素消耗的情况，这些峰归因于样品中的番茄红素或其他成分。如果存在活的病原体，番茄红素浓度将减小且番茄红素峰将随时间降低，如图6中的轨迹33和34所示。另一方面，如果不存在活的病原体，或者分析中存在活的病原体以及有效的抗菌药物，那么峰高几乎不随时间变化，如图6所示。如前所述，图6中的四条轨迹代表来自未受感染患者的血清(轨迹31)，具有高剂量耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(“MRSA”)的血清(轨迹33)，具有MRSA和有效剂量的万古霉素的血清(轨迹32)，以及具有MRSA和无效剂量的氨苄青霉素的血清(轨迹34)。
此外，某些病原体产生类胡萝卜素作为代谢活性的标记。在这种情况下，由于样品中标记物的浓度随病原体代谢活性而增加，利用类胡萝卜素作为标记物(即番茄红素)表明存在病原体的轨迹随时间将具有正斜率。然而，表明不存在病原体的轨迹仍将相对保持恒定，因为峰强度几乎保持不变。因而，是代表样品中的代谢活性的标记物峰强度随时间的变化指示代谢活性和病原体的存在。这样的变化可以是标记物消耗或标记物产生，以下将更详细地论述。
通过产生的标记物检测代谢活性
在一些实施方案中，样品中的代谢活性通过产生的标记物来检测。样品中标记物产生的实例包括元素-致病性蛋白质复合物(即，Fe-Tr)，减少的抗氧化剂，减少的自由基清除剂，减少的类胡萝卜素，或甚至减少的番茄红素。因而，样品中的代谢活性可由标记物量的减少(如标记物的消耗)来检测，或者代谢活性可由标记物量的增加来检测。作为这些概念的非限制性实例，番茄红素可以是标记物，并且其在样品中的消耗指示代谢活性。相反地，作为抗氧化剂起作用的番茄红素产物可以是标记物，并且其产生将指示代谢活性。
在一些实施方案中，病原体产生标记物。例如，一些病原体产生类胡萝卜素，特别是番茄红素，并且可以检测这种产生来指示样品中的代谢活性、样品中病原体的存在，甚至有利于样品中的病原体分类。实际上，类胡萝卜素和番茄红素的产生在几种分枝杆菌中已有记录，包括但不限于草分枝杆菌(M.phlei)，堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)和金色分枝杆菌(M.aurum)。此外，本文所述的某些实施方案已用于检测牛分枝杆菌(参见图19和图20)和偶发分枝杆菌(参见图21)中的番茄红素产生。此外，已知海分枝杆菌(M.marinum)和其它分枝杆菌种类中的胡萝卜形成作用，并且被认为是光依赖性的。最后，已知结核分枝杆菌(M.tb)介导类胡萝卜素加氧酶；并且不同的分枝杆菌种类可基于它们产生的类胡萝卜素分型。因而，在一些实施方案中，由样品中类胡萝卜素的产生来检测病原体，特别是分枝杆菌。在另一些实施方案中，由样品中番茄红素的产生来检测病原体，特别是分枝杆菌。
抗菌药物敏感性和/或通过抗菌药物敏感性鉴定病原体
在一些实施方案中，测定了病原体对抗病原性物质的敏感性。例如，测定了特定细菌对特定抗菌和/或抗菌混合物的敏感性。还易于测定特定真菌和病毒关于抗真菌和抗病毒的类似敏感性。此外，在一些实施方案中，样品中的病原体是未知的，测定的敏感性不依赖于知晓病原体身份。因而，在一些实施方案中，易于测定特定治疗可能的有效性或无效性。此外，一些实施方案提供了快速测定最小抑菌浓度(MIC)度量值。
MIC是药物在体内有效抑制靶生物体生长的最小浓度。采用标准MIC测试，测试要求所研究的生物体纯生长，并且临床医生通常在样品采集之后至少48-72小时可得到。然而，在一些实施方案中，由于诸如番茄红素的标记物反映代谢活性，并且当有效的抗病原性药物作用于病原体时预期代谢速率降低，能够比标准测试时间更快地表征MIC度量值。在一些实施方案中，MIC度量值在测试约30分钟内产生。
一些实施方案测定了样品中特定抗病原性物质的有效/无效性，所述样品感染了未知(病原体)和/或一种或多种已知病原体。在另一些实施方案中，测定了样品中多于一种的抗病原性物质的组合物的有效/无效性，所述样品具有未知病原体和/或一种或多种已知病原体。
检测样品中的毒素
毒素对哺乳动物细胞系的一种影响是诱导代谢应激。由于代谢应激而产生自由基，因而哺乳动物细胞在接触毒素时应当产生自由基。类胡萝卜素，特别是番茄红素，是有效的自由基清除剂。因而，哺乳动物细胞接触毒素应当导致番茄红素浓度可测量的变化。这样的变化可利用本文所述的不同方法检测。
在一些实施方案中，将标记物用于检测样品中化学或生物毒素的存在，所述样品如血液、尿液或其他临床样品。其他临床样品包括但不限于，为测试物质以确定其是否有毒和/或毒素浓度而特别制备的样品。在一些实施方案中，标记物是抗氧化剂、自由基清除剂、类胡萝卜素和/或番茄红素。
以血液样品为例，化学或生物毒素是小分子或细胞，它在常规处理方法如离心或重力沉降下将集中于血清中。将哺乳动物细胞与血清或其部分相混合以提供样品。样品中可任选包括营养液。如果样品中存在化学或生物毒素，其将诱导哺乳动物细胞产生自由基。作为对自由基的响应，标记物将经历可测量的变化并提供样品中的毒素检测。
在另一些实施方案中，标记物是番茄红素，并且使用人细胞如HL60细胞。如果样品中存在对人细胞有毒的物质，人细胞将产生自由基。由番茄红素标记物清除自由基将导致番茄红素标记物可测量的变化或产生代表变化的信号。在一些实施方案中，用拉曼仪检测所测量的变化。
在一些实施方案中，测试一种或多种物质来确定它们对人细胞是否有毒。事实上，可将这样的物质与人细胞连同任选的营养液相混合，以及可以检测物质对人细胞的影响。因而，物质的毒性(或样品中存在的毒素)通过自由基的产生或对自由基敏感的标记物变化来检测。在一些实施方案中，测试样品存在一种或多种细菌毒素、真菌毒素和/或化学物质(即有机、无机和有机金属化合物，包括合成这样的化合物中使用的溶剂和试剂)。在另一些实施方案中，一种或多种物质如化学物质(即有机和无机化合物，包括合成化合物所使用的溶剂和试剂)包括于样品中以确定物质是否有毒。在一些实施方案中，测试不同浓度的物质来确定可能的毒性阈值。例如，杀虫剂、药物、药物成分、活性药物成分、载体、填充剂、合成中间体、以及药物中鉴定的杂质代表物质，其毒性或缺少毒性是特别关注的。
在一些实施方案中，所测定的变化和/或信号随时间积累，并且能够检测非常低的毒性水平。在一些实施方案中，检测限是1μM、5μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM和/或100μM，和/或由前述任意两个数值限定的范围，和/或大约前述任意数值。在另一些实施方案中，检测限是约4μM。在另一些实施方案中，检测限小于1μM、5μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM和/或100μM，和/或小于由前述任意两个数值限定的范围，和/或大约前述任意数值。
提高灵敏度和分辨率的测量
从测量系统的角度而言，噪音与所测量的量的平方根成比例。以前的抗菌剂敏感性测试已经测量了与样品中存在的病原体的量成正比的变量，这种方法引起较大的测量误差。例如，U.S.4,448,534描述了用于抗生素敏感性测试的装置，其中在多等分试样盘中的细菌计数通过光密度法来测定。由于基线测量涉及大量的病原性细胞，测量中的误差与病原性细胞数量的平方根成比例，只有当抗菌药物减少大量细胞的活力时，才能识别抗菌药物的作用。该方法导致测试需要大量时间。
如图9所示，大致上任何测量系统中的噪音与所测定噪音的平方根成比例。方案51和52显示有或无背景值B时测量信号S的测量系统的信噪比。方案53总结了以前测量抗生素敏感性的方法，其中N代表与细菌细胞计数成比例的变量，并且ΔN是该变量中的变化。在这种情况下，所测定的量是N±ΔN，并且测量中的噪音变成N±ΔN的平方根。因而，仅当ΔN变得可与N相比时，所测定的信号才高于噪音阈值。这一要求通常转化成从临床样品分离细菌细胞，这样20分钟的倍增时间将形成足够强的信号。可选择地，如果该设备直接操作临床样品，那么所述方法必须等待数个倍增时间，以使细菌细胞计数超过固有的临床样品成分计数。
相比之下，本文所公开的实施方案测定了宿主-病原体相互作用的存在(存在活的病原体时)或者缺乏(不存在活的病原体，或其活性由有效的抗病原性物质如抗菌剂抑制时)。由于在一些实施方案中的基线测量缺乏相互作用，测量灵敏度更大，即使测量所需时间很少时也是如此。一般而言，某些实施方案测定与病原体存在相关的稀缺资源(即，铁或番茄红素)。该益处可通过图9中的方案54描述。信号是ΔSR，其是在稀缺资源水平的变化。在相对较小的背景下测量该信号(2*ΔSR是图9中引用的例子，其可以是不大于ΔSR很多的任何其它数值)。因而，在一些实施方案中，噪音与ΔSR的平方根成比例。
在不同程度上，所有以前的抗菌药物敏感性测试方法受描述于U.S.4,448,534中的这种固有缺陷方法影响。例如U.S.6,379,920描述了将来自未受感染患者的临床样品的拉曼光谱作为从未知临床样品的拉曼光谱中减去的参比的方法。使用该方法，发明人声称可以很快鉴定特定细菌而无需培养。然而，基线测量的是未知临床样品的拉曼光谱，并且含有临床样品的所有固有成分。此外，这些固有成分的拉曼谱带与细菌病原体的拉曼谱带重叠；因而在可进行显著差分测量之前，细菌细胞计数必须非常大。
U.S.3,983,006描述了测定抗生素的最小抑菌浓度(MIC)的方法，其通过缺少或存在抗生素时连续测量响应于细菌悬液的细菌生长速率的光学性质变化来测定。正如U.S.4,448,534，该方法受与大量病原性细胞测量相关的较大测量误差影响，因此在进行有效测量之前，装置需要较大的时标让抗菌剂杀死大量细菌细胞。
由于拉曼放大的增强
一些实施方案利用不同的共振处理来放大所测量的信号。该特征用图10中示意的图来说明。具体地，Fe-Tr与Tr之间存在重要的光学差异。例如，Fe-Tr具有集中于485nm波长处的宽的光吸收峰。由于该光吸收峰，当拉曼激光波长位于该光吸收带之内时，不同的Fe-Tr拉曼谱带显示强烈的共振拉曼增强。图10显示吸收光谱61，1608、1506、1281和1174cm-1处的4个Fe-Tr峰的拉曼截面(分别为62，63，64和65)与波长之间的关系。图10显示如果激光波长位于一个或多个Fe-Tr峰被共振放大的值，那么所得到的拉曼光谱主要是Fe-Tr光谱。此外，共振拉曼增强不局限于以上所述的Fe-Tr体系，而是其他标记物也存在放大。例如，共振拉曼增强可用于诸如抗氧化剂、自由基清除剂和/或类胡萝卜素(即，β-胡萝卜素和番茄红素)的标记物。实际上，番茄红素的拉曼信号通过利用532nm光而被共振增强。这种共振增强可达到约10倍至约1000倍。在一些实施方案中，共振增强可达到约10倍，50倍，100倍，200倍，300倍，400倍，500倍，600倍，700倍，800倍，900倍，和/或1000倍，和/或由前述任意两个数值限定的范围，和/或大约前述任意数值。因而，共振拉曼增强允许测试临床样品而无需细菌的任何分离或生长。在一些实施方案中，使用共振拉曼放大所测量的信号。在另一些实施方案中，使用放大而无需分离样品中的病原体。在一些实施方案中，使用放大而无需增加病原体计数时间。在另一些实施方案中，使用放大而无需在样品中浓缩病原体。
在一些实施方案中，标记物随时间“积分”，以致于所测量信号的变化是累积的。然而，一些标记物是“差分的”。“积分”标记物的一个实例是番茄红素，而荧光生物标记物是“差分”标记物的一个实例。为理解区别，考虑用番茄红素拉曼和荧光生物标记物同时研究少量细菌细胞。假定测量期间细胞的数量并未明显变化，荧光标记物的输出量与该细胞群的代谢速率成比例，如果条件未变化，其可能是常数。然而，相比之下，番茄红素标记物的输出量与总的代谢活性成比例，其是代谢速率的时间积分；因而其随时间稳步变化。因此，经过足够长的时间之后，番茄红素标记物将具有显著区别于初始值的值，其可以在所测量的噪音上相对容易地读出。
利用选择性培养基进行病原体分类
在一些实施方案中，样品中存在抗病原性物质。抗病原性物质的一个实例是选择性培养基或培养液。在一些实施方案中，将选择性培养基用于鉴定样品中的病原体。图11，图12和图13进一步说明了利用选择性培养基的鉴定。图11显示用107cfu/mL金黄色葡萄球菌接种的血清样品在不同时间点处的拉曼光谱。未添加任何培养液，作为时间函数的峰高并未变化。因而，在该方面，未添加培养液的受感染样品的行为几乎与未受感染样品相同。图12示出来自未受感染的发热患者的血清样品稀释于80%培养液的时间曲线。两条轨迹描述了1516和1156cm-1处的峰高，这都是由番茄红素产生的。在这种情况下，两个峰高几乎保持不随时间变化。未添加培养液时，受感染的样品(包括来自受感染患者的样品)证实了这种行为——峰高不随时间变化。
随着添加有利于生长的培养基，峰高开始降低。这样的一个实例描述于图13中，其示出了作为时间函数的来自受感染患者的血清样品在1516和1156cm-1处的峰高(都由番茄红素产生)，并且该血清样品中添加胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB)。TSB是使MRSA生长的选择性培养基。因此，图13示出拉曼峰在1516和1156cm-1处降低，如图13所示。该降低表明存在代谢活性，因而存在病原体。
在一些实施方案中，培养液抑制了某些病原体的生长。在另一些实施方案中，培养液促进某些病原体的生长。在一些实施方案中，利用抗病原性和促病原性培养基的组合。因而，将物质添加至样品能够促进病原体鉴定和/或分类。
虽然没有一种营养培养基有利于一种特定微生物的代谢而抑制所有其他微生物的代谢，使用选择性培养基的组合可帮助我们分类生物体。例如，MacConkey培养基含有胆盐和结晶紫染料，其抑制革兰氏阳性菌，结果将不支持金黄色葡萄球菌的生长代谢活性，而促进革兰氏阴性菌的代谢，所述革兰氏阴性菌如肺炎克雷伯菌(K.pneumonia)，鲍曼不动杆菌(A.baumannii)和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)(MacConkey琼脂平板操作流程[互联网].[数据未知]获自:http://www.microbelibrary.org/index.php/component/resource/laboratory-test/2855-macconkey-agar-plates-protocols。相比之下，由于其包括的抗菌剂抑制革兰氏阴性菌，Columbia CNA培养基(其包括抗菌剂粘菌素和萘啶酸)选择革兰氏阳性菌(Biol230实验室手册，Lab3[互联网].[数据未知];获自：http://faculty.ccbcmd.edu/courses/bio141/labmanua/lab3/lab3.html)。此外，使用甘露醇盐(具有7.5%盐)有利于金黄色葡萄球菌的代谢，抑制革兰氏阴性菌的生长，且主要是抑制表皮葡萄球菌(S.epidermidis)(负责污染伤口培养物的最常见的共生体)的生长(Microbiology.Media.Tests.Pictures.pdf[互联网].[数据未知];获自:http://www.delta.edu/files/Microbiology/Microbiology.Media.Tests.Pictures.pdf)。
另一实例是抗万古霉素肠球菌。可通过使用胆盐七叶苷培养基来筛选这些生物体，由于该培养基中的胆盐抑制其他革兰氏阳性生物体包括MRSA的生长，并且该培养基包含抑制革兰氏阴性菌生长的叠氮化钠，因而其仅支持肠球菌的生长和代谢，而不支持其余前述多重耐药性(“MDR”)细菌的生长和代谢(Microbiology Lab:MOLB2210[互联网].[数据未知];获自:http://www.uwyo.edu/molb2210_lab/info/biochemical_tests.htm#bile)。革兰氏阴性MDR生物体之间的区别可通过利用PC培养基进行(CampbellME，Farmer SW，Speert DP.New selective medium for Pseudomonasaeruginosa with phenanthroline and9-chloro-9-[4-(diethylamino)phenyl]-9,10-dihydro-10-phenylacridinehydrochloride(C-390).J.Clin.Microbiol.1988Sep;26(9):1910–1912)，其特异性支持铜绿假单胞菌的代谢和生长，不支持另外的两种革兰氏阴性杆菌。相比之下，粒子不动杆菌培养基(Leeds Acinetobacter medium，“LAM”)将支持鲍曼不动杆菌的生长和代谢，不支持铜绿假单胞菌或肺炎克雷伯菌的生长(Jawad A，et al.Description of Leeds Acinetobacter Medium，a newselective and differential medium for isolation of clinically importantAcinetobacter spp.，and comparison with Herellea agar and Holton’s agar.J.Clin.Microbiol.1994Oct;32(10):2353–2358)。
因而总之，在一些实施方案中，利用选择性培养基的多步法再细分病原体。步骤包括以上段落所述的不同选择性培养基的一种或多种(或组合)。
用IR吸收光谱法实施
在一些实施方案中，用红外(“IR”)吸收光谱法实施检测代谢活性的方法。IR吸收由与拉曼谱带相同的振动谱带产生。因而，分子的IR信号倾向于与其拉曼信号类似。然而，IR吸收法不能像拉曼法一样采用吸收增强，以最大限度的检测代谢活性(即，如前所述的apo-Tr和Fe-Tr之间的差异)。因此，IR吸收法在分析期间产生类似的基线光谱。例如，Fe-Tr的红外光谱基线倾向于与apo-Tr的红外光谱基线类似。然而，可通过用激光同时照射两个样品来检测和/或区分代谢活性(如apo-Tr和Fe-Tr信号)，所述激光集中于共振吸收增强的波长——这样做，以其改变拉曼谱带非常类似的方式，改变了相应的红外吸收峰。
其他实施方案
其他实施方案提供了表征人或病原性细胞的呼吸作用状态的方法；其中所述方法包括监测呼吸作用期间产生的自由基产量。在一些实施方案中，自由基产量通过其对自由基清除剂的作用来监测。对自由基清除剂的作用通过共振拉曼光谱法来监测。在一些实施方案中，所测定的信号是随时间累积的量，因而产生具有较低噪音的更大测量值。
其他实施方案提供了表征人或致病性细胞的呼吸作用状态的方法；其中所述方法包括监测呼吸作用期间产生的类胡萝卜素产量。在一些实施方案中，类胡萝卜素产量通过共振拉曼光谱法来监测。在一些实施方案中，所测定的信号是随时间累积的量，因而产生具有较低噪音的更大测量值。
在一些实施方案中，用给出病原体代谢的一种标记物的具有波长1的激光，给出病原体代谢的另一标记物的具有波长2的另一激光，以及结合两种标记物来形成病原体的生化特征谱来实现所述方法。在另一些实施方案中，将所述方法应用于鉴定病原体。在一些实施方案中，将所述方法应用于检测、表征和定量临床样品中存在的病原体。在另一些实施方案中，将所述方法应用于检测、表征和定量临床样品中存在的化学或生物毒素。
其他实施方案提供了表征临床样品中存在的病原性细胞的方法，其中所述方法包括监测病原体在临床样品中消耗、生产和/或改变稀缺资源的速率。在一些实施方案中，稀缺资源的测量通过由稀缺资源产生的信号的固有放大方法来进行。在另一些实施方案中，将稀缺资源的消耗或产生绘制为添加至分析中的不同选择性培养基的函数，使用该结果来鉴定病原体。在一些实施方案中，将稀缺资源的消耗或产生绘制为所添加抗菌剂的函数，使用该结果开发针对临床样品中存在的病原体的抗菌药物敏感性信息。
在另一些实施方案中，稀缺资源是番茄红素，病原体通过产生由番茄红素清除的自由基来消耗番茄红素。在一些实施方案中，通过共振拉曼光谱法或通过非共振拉曼光谱法监测番茄红素的消耗。在一些实施方案中，稀缺资源是β-胡萝卜素，且病原体产生β-胡萝卜素。在另一些实施方案中，通过共振拉曼光谱法或通过非共振拉曼光谱法监测β-胡萝卜素的产生。
在另一些实施方案中，稀缺资源是已由脊椎动物宿主螯合至专门的含铁蛋白质的铁。在一些实施方案中，含铁的蛋白质是转铁蛋白。在另一些实施方案中，含铁的蛋白质是乳铁蛋白。在一些实施方案中，含铁的蛋白质是铁蛋白。在一些实施方案中，通过拉曼光谱法监测铁螯合过程。在另一些实施方案中，通过红外吸收光谱法监测铁螯合过程。在一些实施方案中，通过颜色滴定法监测铁螯合过程，包括UV/可见光吸收光谱法。在另一些实施方案中，螯合来自宿主蛋白的铁是通过添加分析中通常不存在的铁载体(siderophore)来实现的。在一些实施方案中，添加对特定病原体特异的铁载体能够识别和鉴定该病原体。
在一些实施方案中，拉曼光谱法通过共振处理来放大，因而提供了增强的检测限和更快的检测时间。
一些实施方案提供了表征临床样品中的未知(或已知)病原体对抗菌剂的敏感性(或抗性)的方法。在一些实施方案中，病原体是细菌。在另一些实施方案中，病原体是真菌。在一些实施方案中，病原体是病毒。
在一些实施方案中，临床样品是血液。在另一些实施方案中，临床样品是尿液。在一些实施方案中，临床样品是脑脊液。在另一些实施方案中，临床样品是唾液。
样品
在一些实施方案中，样品获自处于临床环境的患者。在一些实施方案中，样品包括体液。体液包括但不限于以下液体：羊膜液、水状液、玻璃状液、胆汁、血液、血清、乳汁、脑脊液、乳糜、淋巴液、前列腺液、胃酸、胃液、黏液(包括鼻引流和痰)、腹膜液、脓、胸膜液、唾液、油脂、精液、汗液、泪液、眼内液、分泌物、呕吐物、排泄物以及尿液。
在一些实施方案中，样品取自动物。这些样品包括来自动物的体液和/或拭子。在一些实施方案中，样品通过擦拭物体的表面而取自有生命的或非生命的物体。在另一些实施方案中，获取物体的部分作为样品。
因而，在一些实施方案中，获得样品包括从患者、动物或物体采集样品。然而，在另一些实施方案中，获得样品包括接收已采集和任选地处理的样品。
在一些实施方案中，在采集之后分析之前处理样品。这样的处理包括但不限于添加以下物质：营养素、抗病原性物质(即培养基，选择性和非选择性的；抗生素；抗真菌剂；以及抗病毒剂)、性(pro-pathogenic)物质、标记物、哺乳动物细胞、用于毒性测量的物质、和/或标记物起作用所必需的补充物。其他处理包括常规的样品处理程序，去除样品成分(即，过滤，离心，以及伴随或不伴随过滤或离心的沉淀)，样品固定，以及改变样品气氛(即，操纵气体水平如氧气和二氧化碳；以及在惰性气氛、有氧气氛和/或无氧气氛下放置)。处理可发生在样品分析开始之前，期间或之后。在一些实施方案中，样品被培养。例如，样品任选包括培养液和/或培养基。在另一些实施方案中，样品包括培养的细胞。
在一些实施方案中，样品包括血液和/或血液成分。已知采集血液以及将其处理成其成分的常规样品处理程序。在一些实施方案中，将诸如细胞的血液成分去除。在另一些实施方案中，将诸如红血细胞的血液成分去除。在一些实施方案中，将红血细胞和白血细胞都去除。在另一些实施方案中，获得用于样品的血浆。本领域内已知去除血液成分的方法。实例包括但不限于，重力沉降和/或红血细胞沉降率程序。重力沉降任选在抗凝剂的存在下进行。在一些实施方案中，在进行全血细胞计数之后，获取包含于样品中的血液成分。在另一些实施方案中，包含于样品中的血液成分取自全血细胞计数测试。在一些实施方案中，包含于样品中的血液成分取自红血细胞沉降率程序之后。在另一些实施方案中，包含于样品中的血液成分取自红血细胞沉降率程序期间。
作为样品制备的代表性程序，将患者血液采集到涂布有抗凝剂的真空血液收集管(vacutainer)。合适的抗凝剂包括乙二胺四乙酸(“EDTA”)或柠檬酸，优选EDTA。使真空血液收集管静置约40分钟(但是可选更长的时间)，在该时间期间红血细胞由于重力沉降于瓶中。保持在上面的透明(或淡黄色)液体是血浆。细菌和真菌细胞保留在血浆层。试验表明，当红血细胞由基于该重力的方法分离时，血液中的细菌/真菌细胞基本保持了它们的活力。该方法步骤的优点在于与目前的试验方案一致，不利用任何新的样品处理步骤。临床医生非常熟悉全血细胞计数(“CBC”)试验，其涉及直接将血液采集至抗凝剂涂布的真空血液收集管。其他实施方案包括利用小离心机的样品处理步骤，该离心机以足够低的速度旋转以使血浆层微生物损失达到最低，但还加速了样品处理时间(即，由约40分钟下降至约10分钟或更短)。
照射/光源
并未具体限定照射样品的光源和来源。在一些实施方案中，光源产生具有UV区波长的光。在另一些实施方案中，光源产生具有IR区波长的光。在一些实施方案中，光源产生的光具有以下波长：300nm，350nm，400nm，450nm，500nm，550nm，600nm，650nm，700nm，750nm，800nm，850nm，900nm，950nm，和1000nm，或由前述任意两个数值限定的范围，和/或大约前述任意数值。在一些实施方案中，光源产生的光具有以下波长：低于约600nm，低于约575nm，低于约550nm，低于约540nm，低于约530nm，低于约520，或低于由任意两个前述数值限定的范围，和/或低于大约前述任意数值。在一些实施方案中，光源是激光。在另一些实施方案中，光源是与单色仪联用的照射器。在一些实施方案中，光源基本上是单色的。在一些实施方案中，光源是拉曼光谱仪的一部分。
标记物
用于实施方案中的合适标记物包括产生作为代谢活性函数的可检测变化的化合物。在一些实施方案中，合适的标记物是化合物。化合物的实例包括但不限于，抗氧化剂，自由基清除剂，类胡萝卜素(包括叶黄素类和胡萝卜素类)，有机色素，以及染料。化合物标记物的具体实例包括番茄红素和β-胡萝卜素。其他标记物包括在约1150cm-1至约1165cm-1之间透射光的那些标记物，以及在约1500cm-1至约1550cm-1之间透射光的标记物。在一些实施方案中，使用ROS激活染料作为标记物。
在另一些实施方案和以上更详细的描述中，合适的标记物是蛋白质，包括蛋白质复合物。元素-蛋白复合物是标记物的一个实例。一种具体的元素-蛋白质复合物是铁-蛋白质复合物，更具体是Fe-Tr复合物。
在一些实施方案中，标记物产生放大信号。共振拉曼是放大信号的一个实例。可理解的是，共振拉曼是标记物吸收光谱的函数(参见，即Ermakov et al.，Journal of Biomedical Optics，2005，10(6):064028，其在此通过引用整体并入)。在一些实施方案中，选择光源及其波长以由标记物产生共振增强。例如，β-胡萝卜素在低于约525nm的波长处具有共振拉曼增强。同样地，番茄红素在约532nm处具有共振拉曼增强。此外，Fe-Tr复合物在约550nm至约400nm之间具有共振拉曼增强。
利用在此所概述的原理可以构建联合多种其他测量技术和建立放大方法的几种其他实施方案。作为实例，可将介电共振或弛豫光谱学用于激发与产生、清除或修饰代谢产物或副产物中的一种相关的电子极化、原子极化、偶极子弛豫或离子弛豫中的一种。由于介电共振过程可放大与所监测的分析物相关的信号(例如，如果交变电磁波的频率与所探测的特定模式共振)，可将所得到的分析物信号放大1倍。
其他可能的一组实施方案包括将测量共振过程的探针与测量另一过程(该第二过程可以是共振的或非共振的)的另一探针以提高诊断效率的方式联用。作为例子，实施方案可将共振拉曼方法(与我们所概述的方法类似)与交变电磁场联用，所述交变电磁场的频率与介电模式中的一种共振。可以用2维关联分析方法来实施这一联用，与单独使用共振拉曼法相比，该方法将信噪比再提高10倍。其他可能的实施方案利用表面增强拉曼光谱(SERS)法来检测微生物细胞代谢过程中产生的自由基。根据公开的方法，将引起SERS放大的表面(如金纳米颗粒涂敷于玻璃表面)与优先吸引所有微生物细胞(这种的例子是脂质层)和自由基清除剂(如番茄红素脂蛋白复合物)的表面化学相联用。与未吸附至表面的所有血清成分相比，SERS放大会增强与番茄红素和吸附至脂质表面的所有其他成分相关的信号。因而，可检测吸附至表面的自由基清除剂的任何变化，或任何脂质友好代谢的副产物的任何产生/修饰。
在一些实施方案中，标记物在样品中自然产生。在另一些实施方案中，标记物被添加到样品中。在一些实施方案中，标记物自然存在但将额外的标记物添加到样品中以增加其浓度。可任选在一个或多个数据采集之前、期间或之后添加任意标记物。在一些实施方案中，在用发光/光源照射样品之前添加标记物。
此外，在一些实施方案中，将标记物添加至样品容器的表面，以提供校准系统或信号的方法(通过校准标记物的存在或来自校准标记物的信号强度)。在另一些实施方案中，将校准标记物并入或掺杂至样品容器材料中。在一些实施方案中，样品容器涂有金属氧化物校准标记物。在一些实施方案中，金属氧化物校准标记物是氧化钒。在另一些实施方案中，金属氧化物校准标记物是氧化铝。可通过已知方法涂敷金属氧化物或可通过已知方法并入金属氧化物。一种这样的涂敷方法是溅射涂层技术。样品容器由玻璃制成时，溅射涂层特别适合于涂敷金属氧化物。然而，样品容器可由其他材料制成，如不干扰来自所监测分析物的拉曼光谱的塑料。在一些实施方案中，样品容器其本身就是校准标记物。由金属氧化物产生的信号(如拉曼信号)强度是样品容器上涂层厚度的函数。可通过溅射工艺控制样品容器上的涂层厚度。在一些实施方案中，厚度为0.5nm，1nm，1.5nm，2nm，2.5nm，3nm，3.5nm，4nm，4.5nm，5nm，5.5nm，6nm，6.5nm，7nm，7.5nm，8nm，8.5nm，9nm，9.5nm，10nm，11nm，13nm，15nm，20nm，50nm，以及100nm，或由任意两个前述数值限定的范围，和/或大约前述任意数值。
在一些实施方案中，将校准标记物添加到样品中。校准标记物可以是金属氧化物或纳米颗粒。在一些实施方案中，校准标记物是金属氧化物纳米颗粒。金属氧化物的例子包括二氧化钛。金属氧化物纳米颗粒的例子包括锐钛(anatase titania)。二氧化钛的锐钛型在640cm-1处显示拉曼信号。所期望的校准标记物的强度是样品中校准标记物浓度的函数。金属氧化物，纳米颗粒和金属氧化物纳米颗粒也同样适合于掺杂或并入样品容器材料中。
代谢活性
如上所述，通过标记物信号的变化来检测样品中的代谢活性。在一些实施方案中，通过标记物透射光的变化来检测代谢活性。这种变化包括但不限于，透射光一个或多个波长的强度变化。存在这种变化指示样品中的代谢活性。不存在这种变化指示样品中没有代谢活性。代谢活性指示样品中存在诸如病原体的物质。在一些实施方案中，所检测的代谢活性是由病原体产生的。在另一些实施方案中，代谢活性是由样品中的非病原体成分如细胞产生的。在一些实施方案中，代谢活性出现时，透射光强度增加。在另一些实施方案中，代谢活性出现时透射光强度减弱。
在一些实施方案中，代谢活性是螯合病原体代谢所需的营养素。在一些实施方案中，营养素是诸如铁的元素，螯合由诸如转铁蛋白的酶完成。
在另一些实施方案中，代谢活性是产生自由基。在一些实施方案中，自由基是活性氧类(“ROS”)。在另一些实施方案中，自由基是活性氮类(“RNS”)。在一些实施方案中，标记物清除自由基并被耗减。
在一些实施方案中，代谢活性是产生抗氧化剂。因此，在一些实施方案中，代谢活性导致产生标记物，并且标记物的浓度随时间增加。此外，一些抗氧化剂是自由基清除剂。因而一些实施方案产生自由基清除剂，作为可检测的代谢活性。在另一些实施方案中，代谢活性是产生一种或多种类胡萝卜素。
作为检测代谢活性并基于此决策的代表性方法，一些实施方案测定“斜率”，其是与微生物活性相关的标记物的时间导数。该估算的斜率任选包括其周围的置信区间，并且在一些实施方案中，当斜率+/-置信区间在“未受感染”或“受感染”带时做出诊断决策。在一些实施方案中，受感染/未受感染带的位置通过用已知样品校准来设置，所述已知样品已用已知水平的细菌人工接种。在一些实施方案中，受感染/未受感染带的位置通过有患者样品的临床研究来确认。
其他的实施方案使用其他算法来估算对应于斜率和置信区间的度量值。这些算法包括但不限于特征值分解和主成分分析。用该算法，可将前面很少的主成分(如前面3种)视为测量信号，并且可使用所有更高的成分作为置信区间或噪音的替代测量。
病原体
在一些实施方案中，代谢活性的检测指示样品中存在外来物质。这些外来物质包括但不限于病原体。在一些实施方案中，病原体是细菌。具体细菌的非限制性实例包括以下种类：金黄色葡萄球菌(S.aureus)，鲍曼不动杆菌(A.baumannii)，肺炎克雷伯菌(K.pneumonia)，以及大肠杆菌(Escherichia coli)。在一些实施方案中，病原体是真菌或霉菌。具体真菌的非限制性实例包括以下：白色念珠菌(Candida albicans)。在一些实施方案中，病原体是寄生虫。此外，在一些实施方案中，病原体是病毒。在一些实施方案中，存在两种或更多类型的病原体。
时间点
在一实施方案中，并未具体限定照射样品的时间点。在一些实施方案中，时间点是零至四周之间，零至三周之间，零至二周之间，和/或零至一周之间，和/或大约前述任意数字。在另一些实施方案中，时间点是0至7天之间，0至6天之间，0至5天之间，0至4天之间，0至3天之间，0至2天之间，和/或0至1天之间，和/或大约前述任意数字。在一些实施方案中，时间点是0至24小时之间，0至23小时之间，0至22小时之间，0至21小时之间，0至20小时之间，0至19小时之间，0至18小时之间，0至17小时之间，0至16小时之间，0至15小时之间，0至14小时之间，0至13小时之间，0至12小时之间，0至11小时之间，0至10小时之间，0至9小时之间，0至8小时之间，0至7小时之间，0至6小时之间，0至5小时之间，0至4小时之间，0至3小时之间，0至2小时之间，和/或0至1小时之间，和/或大约前述任意数字。在另一些实施方案中，时间点是0至120分钟之间，0至110分钟之间，0至100分钟之间，0至90分钟之间，0至80分钟之间，0至70分钟之间，0至60分钟之间，0至50分钟之间，0至40分钟之间，0至30分钟之间，0至20分钟之间，0至10分钟之间，0至5分钟之间，0至4分钟之间，0至3分钟之间，0至2分钟之间，和/或0至1分钟之间，和/或大约前述任意数字。
在一实施方案中，完成检测代谢活性的方法不超过四周，三周，两周，一周，或由任意两个前述数字限定的范围，和/或大约前述任意数字。在一些实施方案中，完成检测代谢活性的方法不超过7天，6天，5天，4天，3天，2天，1天，或由任意两个前述数字限定的范围，和/或大约前述任意数字。在另一些实施方案中，完成检测代谢活性的方法不超过24小时，23小时，22小时，21小时，20小时，19小时，18小时，17小时，16小时，15小时，14小时，13小时，12小时，11小时，10小时，9小时，8小时，7小时，6小时，5小时，4小时，3小时，2小时，1小时，或由任意两个前述数字限定的范围，和/或大约前述任意数字。在一些实施方案中，完成检测代谢活性的方法不超过120分钟，110分钟，100分钟，90分钟，80分钟，70分钟，60分钟，50分钟，40分钟，30分钟，20分钟，10分钟，5分钟，4分钟，3分钟，2分钟，1分钟，或由任意两个前述数字限定的范围，和/或大约前述任意数字。
在一实施方案中，并未具体限定照射样品的时间点的数目。在一些实施方案中，照射样品的时间点的数目是1次，2次，3次，4次，5次，6次，7次，8次，9次，10次，15次，20次，25次，30次，40次，50次，60次，70次，80次，90次，100次，或由任意两个前述数字限定的范围，和/或大约前述任意数字。在另一些实施方案中，照射样品的时间点的数目是至少1次，至少2次，至少3次，至少4次，至少5次，至少6次，至少7次，至少8次，至少9次，至少10次，至少15次，至少20次，至少25次，至少30次，至少40次，至少50次，至少60次，至少70次，至少80次，至少90次，和/或至少100次，和/或大约前述任意数字。在一些实施方案中，照射样品的时间点的数目少于2次，少于3次，少于4次，少于5次，少于6次，少于7次，少于8次，少于9次，少于10次，少于15次，少于20次，少于25次，少于30次，少于40次，少于50次，少于60次，少于70次，少于80次，少于90次，和/或少于100次，和/或大约前述任意数字。
可理解的是，在所述实施方案中可利用多个时间点。在这种情况下，多个时间点包括连续测量和在离散时间点的竞争性测量。
实施例
用番茄红素标记物检测病原体
用107cfu/mL耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(“MRSA”)接种血清样品。使用532nm波长测量作为时间函数的拉曼散射谱。1516cm-1处的峰由番茄红素产生，并且观测到该峰值随时间降低，表明番茄红素由代谢活性的细菌消耗，如对应于0.1分钟，10分钟，15分钟和20分钟的4条轨迹所示(参见图14)。虽然图14中未描述，1156cm-1处的其他番茄红素峰也显示出类似的行为。
图15示出健康志愿者血清中1516cm-1处的番茄红素峰的归一化强度对时间曲线，有4部分添加的培养液以及不同的量(无病原体，101cfu/mL，103cfu/mL，105cfu/mL和107cfu/mL)的添加的金黄色葡萄球菌。在所有情况下，对于具有所添加细菌的样品，作为时间函数的峰高降低。相比之下，对照样品(未添加病原体)的高度几乎保持不随时间变化。此外，随着添加细菌量的增加，番茄红素峰的强度以更快的速率降低。图16示出图15中描述的所有曲线的斜率(即时间倒数的)，作为所添加病原体浓度的函数。还描述了表示对照样品斜率的谱带。在所有情况下，谱带的宽度和不确定性对应于估算斜率的95%置信区间(95CI)。
抗菌药物敏感性和/或通过抗菌药物敏感性鉴定病原体
图17和图18示出可使用标记物来估算最小抑菌浓度MIC的方法。图17示出几种样品在1516cm-1(由番茄红素产生)处作为时间函数的拉曼峰高。如图例所示，样品包括人工接种金黄色葡萄球菌至105cfu/mL浓度的血清样品，以及还含有不同浓度的万古霉素(1，5和20μg/mL)的其他样品。如图中所示，峰强度在所有情况下降低，但是对于未添加万古霉素的样品，其以最快的速率降低，并且随着测试中添加更多的万古霉素，斜率逐渐减小。
图18绘出图17中所有轨迹的斜率，作为所添加万古霉素浓度的函数。水平虚线对应于未添加万古霉素的样品的斜率，3个数据点对应于1，5和20μg/mL浓度的万古霉素。黑色实线是3个数据点的对数拟合，MIC对应于黑色实线与虚线相交处的点。在本具体实例中，估算的MIC是0.54μg/mL，这非常接近由传统Kirby Bauer测试估算的MIC(0.7μg/mL)。
图19和图20示出针对用多于一种的生物体共感染的样品表征药效的方法。图19示出1516cm-1处作为时间函数的峰高(其由番茄红素产生)。在本实施例中，样品用革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌共感染。4条轨迹示出添加了万古霉素(20μg/mL)，添加了头孢他啶(20μg/mL)以及同时添加了万古霉素和头孢他啶(都是20μg/mL)的样品的作为时间函数的番茄红素峰高。由于革兰氏阴性菌通常耐受万古霉素，革兰氏阳性菌通常耐受头孢他啶，我们预期单独使用时两种药物都具有部分效力。相比之下，两种药物联用时，我们预期具有最大效力。这与观测结果一致，对于添加万古霉素和头孢他啶的样品，番茄红素峰高的时间斜率最小。图20示出作为药物浓度函数的这些轨迹的斜率，以便以图18相似的方式描述药效。
通过标记物产生检测代谢活性
病原体的存在还可显示为共振放大的多种标记物的产生。一个具体的例子是由某些微生物产生多种类胡萝卜素。一些微生物在光照下合成类胡萝卜素的能力是大自然最微妙的发明之一，目的在于保护细胞免受UV光照和/或其他来源的活性氧类的有害作用。光诱导胡萝卜素形成作用已在几种细菌中有记录，如分枝杆菌种类(KolmanováA，HochmannováJ，Málek I.Carotenoids synthesized by UV-induced mutants of a non-acid-faststrain of Mycobacterium phlei.Folia Microbiol.(Praha)1970;15(6):426–430;Houssaini-Iraqui M，Lazraq MH，Clavel-Sérès S，Rastogi N，David HL.Cloning and expression of Mycobacterium aurum carotenogenesis genes inMycobacterium smegmatis.FEMS Microbiol.Lett.1992Jan;69(3):239–244)。类胡萝卜素的累积很可能是对抗氧化爆发(oxidative burst)生存需要所必需的。
图21示出含有10cfu/mL浓度的牛结核分枝杆菌(M.bovis)的样品中番茄红素的产生。该增加显示于1516cm-1处拉曼峰的强度中，其由番茄红素产生。未添加牛结核分枝杆菌的对照样品并未产生番茄红素。由于番茄红素还能够被病原体代谢消耗，不同条件可引起番茄红素强度开始先增加，之后接着减少，如图22所示。图23示出含偶发分枝杆菌(M.fortiutum)的样品中类似的番茄红素产生。
毒素检测
图24示出一种毒素检测试验的结果。将包括人血清(从健康志愿者采集的血液离心)的对照样品与胰酪胨大豆肉汤培养基和HL60人细胞混合。如所预期的，由拉曼光谱仪测量的对照样品的番茄红素峰高并未显示任何变化。该结果与由人细胞系进行正常代谢时产生可以忽略的自由基一致。相比之下，当分析中添加4μM的毒素根霉菌素(rhizoxin)时，番茄红素峰开始先显著升高，接着稳定下降，与人细胞系的应激代谢一致。图25绘出含根霉菌素的样品的作为时间函数的在1516cm-1处的峰的归一化强度。该图明确显示归一化信号的强度随时间减弱。
参考文献
除非另外指明，本文引用的所有参考文献都通过引用整体并入。
结论
虽然结合其具体的实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员应当理解的是，在不背离本发明精神和范围的情况下，可以进行各种改变和替换等同物。这包括未提供本文所列出的全部益处和特征的实施方案。此外，可以进行多种变型以使特定的情形、材料、物质组成、方法、处理步骤或步骤适应所述实施方案的目的、精神和范围。所有这样的变型意欲在本文所附的权利要求范围之内。因此，本发明的范围仅受所附权利要求限制。

Claims (60)

1.检测样品中的代谢活性的方法，其包括：
获得样品；
用基本上单色的光在多个时间点照射样品；
在多个时间点处测量来自样品中的代谢活性的化学标记物的拉曼散射光；以及
由多个时间点处的拉曼散射光的变化检测代谢活性。
2.检测样品中的代谢活性的方法，其包括：
提供其中具有可检测的标记物的样品，所述可检测的标记物反映样品中的代谢活性；
由标记物产生放大的信号；
在多个时间点测量放大的信号；以及
由多个时间点处放大的信号的变化检测代谢活性。
3.权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述拉曼散射光是共振增强的。
4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述标记物是抗氧化剂。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述标记物是自由基清除剂。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述标记物是类胡萝卜素。
7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述标记物是番茄红素。
8.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述标记物是螯合元素的蛋白质复合物。
9.权利要求1-3和8中任一项所述的方法，其中所述标记物是螯合铁的蛋白质复合物。
10.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述代谢活性是产生自由基。
11.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述代谢活性是产生类胡萝卜素。
12.权利要求1-3和8-9中任一项所述的方法，其中所述代谢活性是螯合铁。
13.权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述拉曼散射光的变化是累积的。
14.权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述代谢活性的存在指示存在病原体。
15.权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述代谢活性的存在指示存在细菌、真菌、寄生虫或病毒。
16.权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述标记物的量由于代谢活性而增加。
17.权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述标记物的量由于代谢活性而减少。
18.权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述样品含有抗病原性物质。
19.权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述样品含有被配置用于允许由所检测的代谢活性进行病原体分类的抗病原性性物质。
20.权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述样品含有被配置用于允许由代谢活性的存在进行病原体分类的培养液。
21.权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述样品含有选自以下的抗病原性物质：抗生素的、抗真菌的和抗病毒的物质；并且其中所检测的代谢活性指示抗致病性物质的有效性或无效性。
22.权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述样品包括体液。
23.权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述样品包括选自以下的体液：血液、脑脊液和尿液。
24.权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述样品被培养。
25.权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述样品包括培养的细胞系。
26.权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述标记物天然存在于样品中。
27.权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述标记物在照射之前被添加到样品中。
28.权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述检测完成不超过约6小时。
29.权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述检测完成不超过约30分钟。
30.权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述样品在样品中或在样品容器上包括校准的拉曼标记物。
31.权利要求30所述的方法，其还包括：询问样品或样品容器中校准的拉曼标记物的存在或强度。
32.权利要求1-7、10、13、17-18和22-31中任一项所述的方法，其中所述代谢活性指示样品中存在有毒物质。
33.检测样品中的代谢活性的系统，其包括：
光源；
控制器，用于用光源定期照射样品，其中所述样品含有响应于样品中的代谢活性的化学标记物；
检测器，其被配置用于测量来自标记物的光信号；以及
计算机，其被配置用于接收来自检测器的光测量结果并确定标记物随时间的变化，所述标记物随时间的变化指示样品中的代谢活性。
34.权利要求33所述的系统，其中所述标记物是抗氧化剂或螯合铁的蛋白质复合物。
35.权利要求33-34中任一项所述的系统，其中所述标记物是自由基清除剂。
36.权利要求33-35中任一项所述的系统，其中所述标记物是类胡萝卜素。
37.权利要求33-36中任一项所述的系统，其中所述标记物是番茄红素。
38.权利要求33-37中任一项所述的系统，其中所述标记物非天然存在于样品中。
39.权利要求33-37中任一项所述的系统，其中所述标记物天然存在于样品中。
40.权利要求33-39中任一项所述的系统，其中所述来自标记物的光信号是来自于斯托克斯-拉曼散射。
41.权利要求33-39中任一项所述的系统，其中所述来自标记物的光信号是来自于反斯托克斯-拉曼散射。
42.权利要求33-41中任一项所述的系统，其中所述样品中的标记物的量随时间累积指示样品中的代谢活性。
43.权利要求33-41中任一项所述的系统，其中所述样品中的标记物随时间减少指示样品中的代谢活性。
44.权利要求33-43中任一项所述的系统，其中由标记物透射的光是共振增强的。
45.权利要求33-44中任一项所述的系统，其中所述代谢活性是产生自由基。
46.权利要求33-44中任一项所述的系统，其中所述代谢活性是螯合铁。
47.权利要求33-46中任一项所述的系统，其中所述由标记物透射的光是累积的。
48.权利要求33-47中任一项所述的系统，其中所述代谢活性的存在指示存在病原体。
49.权利要求33-48中任一项所述的系统，其中所述代谢活性的存在指示存在细菌、真菌、寄生虫或病毒。
50.权利要求33-49中任一项所述的系统，其中所述样品含有抗病原性物质。
51.权利要求33-50中任一项所述的系统，其中所述样品含有被配置用于允许由代谢活性的存在进行病原体分类的抗病原性物质。
52.权利要求33-51中任一项所述的系统，其中所述样品含有被配置用于允许由代谢活性的存在进行病原体分类的培养液。
53.权利要求33-52中任一项所述的系统，其中所述样品含有选自以下的抗病原性物质：抗生素的、抗真菌的和抗病毒的物质；并且其中所检测的代谢活性指示抗病原性物质的有效性或无效性。
54.权利要求33-53中任一项所述的系统，其中所述样品包括体液。
55.权利要求33-54中任一项所述的方法，其中所述时间不超过约6小时。
56.权利要求33-55中任一项所述的方法，其中所述时间不超过约30分钟。
57.权利要求33-56中任一项所述的方法，其中所述信号是共振增强的拉曼光散射。
58.权利要求33-41、43-45、47、50和54-57中任一项所述的方法，其中所述代谢活性指示样品中存在有毒物质。
59.权利要求33-58中任一项所述的系统，其中所述样品在样品中或样品容器上包括校准的拉曼标记物。
60.权利要求59所述的系统，其中所述检测器被配置用于测量样品或样品容器中校准的拉曼标记物的存在或强度。
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