KR101878749B1 - 표적 세포의 분리 방법 및 키트 - Google Patents

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Abstract

생물학적 시료 내에서 표적 세포를 분리하는 방법 및 장치를 제공한다. 일 구체예에 따른 생물학적 시료 내에서 표적 세포를 분리하는 방법 및 장치에 의하면, 생물학적 시료 중 표적 세포를 효율적으로 분리, 검출할 수 있다.

Description

표적 세포의 분리 방법 및 키트{Method and kit for target cell isolation}
폴리머에 결합된 항체를 포함하는 입자를 이용한 표적 세포의 분리 방법 및 키트에 관한 것이다.
악성 종양과 관련한 사망은 대부분 최초로 종양이 발생한 지점으로부터 떨어진 조직 및 기관으로의 전이(metastasis)에 의한다. 따라서 전이를 조기에 발견하는 것은 암 환자의 생존 확률에 대한 중요한 결정 요소이며, 종양의 조기 발견 및 종양의 성장을 모니터링하는 것은 암 환자의 성공적인 치료에 매우 중요한 요소로 여겨진다. 암의 진단은 대체로 조직 병리학(histopathology)에 의한 진단 기법을 이용한다. 조직 병리학 진단 기법은 생검체로부터 얻어지는 조직 시료를 사용하여 종양을 진단하는 방법이다. 이러한 조직 병리학에 의한 접근 방법은 종양 세포를 직접적으로 관찰할 수 있도록 한다. 그러나, 생검체 시료를 얻기 위하여 선택한 조직의 위치에서 종양이 존재하는 여부가 부정확할 수 있으며, 생검체로부터 얻어지는 특정 지점에 관한 데이터만 제공하므로, 다른 지점으로 종양이 전이되었는지 여부를 아는데 한계가 있다는 점에서 종양을 진단하거나 모니터링하는데 있어서 그 적용 가능성이 제한될 수 있다.
혈중 종양 세포(circulating tumor cells, CTCs)는 최초로 종양이 검출되기 이전에 환자에게서 발견된다고 알려져 있다. 따라서, CTC는 암의 조기 진단 및 예측에 있어서 중요한 역할을 할 수 있다. 또한, 암은 대체로 혈액을 통해 전이된다는 점에서 혈중 종양 세포는 암의 전이 여부를 진단할 수 있는 표지가 될 수 있다. 또한, 수술을 통해 암 세포를 제거한 후에도 혈중 종양 세포가 발견되는 경우가 있으며, 이러한 경우 암이 재발할 가능성도 존재한다. 그러나, 이러한 혈중 종양 세포는 혈액 내에서 그 양이 매우 적고 세포 자체가 연약하여 이를 감지하고 그 수를 파악하기가 매우 어렵다. 따라서, 환자의 체내에 존재하는 혈중 종양 세포, 암 세포 또는 암 줄기 세포를 검출할 수 있는 높은 민감성을 나타내는 진단 방법이 여전히 필요하다.
관련 기술은 자성 나노 입자를 이용한 CTC 분리 방법을 기재하고 있다. 그러나, 상기 관련 기술은 혈액 중의 혈청을 분리하기 위한 과정을 비롯하여, 자성으로 분리하는 과정에 있어서도 비오틴과 스트랩트아비딘의 친화력을 이용하는 등, 그 과정이 매우 복잡하고, 분리 과정에서 CTC의 손실 위험이 있는 단점이 있다.
따라서, 종래 기술에 의하더라도, 생물학적 시료 중에 포함된 종양 세포를 효율적으로 분리하는 방법 및 이와 관련된 장치가 여전히 요구되고 있다.
음전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자를 제공하는 것이다.
양전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자를 제공하는 것이다.
생물학적 시료 내에서 표적 세포를 분리하는 방법 및 표적 세포 분리 키트를 제공하는 것이다.
일 양상은 음전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자를 제공한다.
용어, "폴리머(polymer)"는 단위체(monomer)가 반복되어 연결된 고분자(macromolecule)의 한 종류를 의미하는 것으로, 호모폴리머(homopolymer), 헤테로폴리머(heteropolymer), 코폴리머(co-polymer)를 모두 포함하며, 선형 폴리머(linear polymer) 또는 가지 폴리머(branched polymer)를 포함하는 개념으로 해석된다. 상기 음전하를 갖는 폴리머는 폴리스티렌술포네이트(polystyrenesulfonate), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리메타아크릴산(polymethacrylic acid), 폴리알콜(polyalcohol), 폴리포스페이트(polyphosphate), 폴리말레산(polymaleic acid), 히알루론산(hyaluronic acid) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 폴리머는 주변 환경의 pH에 따라 상기 입자의 전기적 성질을 변화시키는 역할을 한다. 예를 들어, 폴리말레산이 연결된 입자가 상기 폴리말레산의 pKa 값보다 큰 pH 값을 갖는 용액 중에 존재하는 경우, 상기 입자는 전기적으로 (-)를 가질 수 있으며, 상기 폴리말레산의 pKa 값보다 작은 pH 값을 갖는 용액 중에 존재하는 경우, 상기 입자는 전기적으로 중성이 될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 폴리머는 분자량이 1,000 내지 100,000일 수 있으며, 3,000 내지 50,000의 분자량을 갖는 것일 수 있다. 상기 폴리머가 상기 입자에 연결되어 있음으로써, 상기 입자의 전하 밀도가 증가될 수 있으며, 하기 설명될 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체가 결합될 수 있는 작용기를 제공할 수 있다.
다른 양상은 양전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자를 제공한다.
상기 폴리머는 상기 설명한 바와 같으며, 상기 양전하를 갖는 폴리머는 예를 들어, 폴리아닐린(polyaniline), 폴리피롤(polypyrrol), 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine), 폴리리신(polylysine), 키토산(chitosan) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 폴리머는 주변 환경의 pH에 따라 상기 입자의 전기적 성질을 변화시키는 역할을 한다. 예를 들어, 폴리에틸렌이민이 연결된 입자가 상기 폴리에틸렌이민의 pKa 값보다 작은 pH 값을 갖는 용액 중에 존재하는 경우, 상기 입자는 전기적으로 (+)를 가질 수 있으며, 상기 폴리에틸렌이민의 pKa 값보다 큰 pH 값을 갖는 용액 중에 존재하는 경우, 상기 입자는 전기적으로 중성이 될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 폴리머는 분자량이 100 내지 50,000일 수 있으며, 400 내지 25,000의 분자량을 갖는 것일 수 있다. 상기 폴리머가 상기 입자에 연결되어 있음으로써, 상기 입자의 전하 밀도가 증가될 수 있으며, 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체가 결합될 수 있는 작용기를 제공할 수 있다.
상기 입자에 연결된 폴리머에는 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체가 결합될 수 있다.
용어, "표적 세포(target cell)"는 생물학적 시료 중에서 분리하고자 하는 세포를 의미하는 것으로, 상기 표적 세포는 세포 표면에 표면 마커를 갖는 세포일 수 있으며, 예를 들어, 상기 표적 세포는 혈중 종양 세포(circulating tumor cell), 암 줄기 세포, 면역 세포, 태아 줄기 세포, 태아 세포, 암 세포, 종양 세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
용어, "표면 마커(surface marker)"는 상기 표적 세포의 표면에 존재하며, 표적 세포와 주변의 다른 세포를 구별할 수 있도록 하는 모든 물질로서, 단백질, 당, 지질, 핵산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 일 구체예에 따르면, 상기 표면 마커는 표적 세포에서 특이적으로 발현되어 세포막에 전시되는 단백질일 수 있으며, 예를 들어, 에스트로겐 수용체(estrogen receptor), 프로게스테론 수용체(progesteron receptor), 시냅토피신(synaptophysin), 뮤신 1(mucin 1, MUC1), Bcl-2, MIB1/Ki67, 사이클린 D1(cyclin D1), 사이클린 E(cyclin E), p27, 토포이소머라아제 IIa(topoisomerase IIa), 사이클로옥시게나아제 2(cyclooxygenase 2), ERK1/ERK2, 포스포-S6 리보솜 단백질(phosphor-S6 ribosomal protein), CK5, CK8, CK17, 비멘틴(vimentin), EpCAM(epithelial cell adhesion molecule), c-Met, 시토케라틴(cytokeratines), Her2, EGFR, p53, p63, E-케드헤린(E-cadherin), 프라질 히스티딘 트리아드(fragile histidine triad), 프로테인 티로신 포스파타아제(protein tyrosine phosphatase), β-카테닌(β-catenin), p16, c-kit, 엔도테린-1(endothelin-1), 엔도테린 수용체-α(endothelin receptor-α), 엔도테린 수용체-β(endothelin receptor-β), 키모카인(CXC 모티프) 수용체 4(chemokine(CXC motif) receptor 4), 유방암 저항성 단백질(breast cancer resistance protein), ABCA3, MGMT 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
용어, "특이적 결합(specifically binding)"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호 작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.
상기 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체는 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합(disulfide bond, SS-bond) 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다. 항원 결합 단편(antigen binding fragment)은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 의미한다. 예를 들어, F(ab')2, Fab', Fab, Fv 또는 scFv일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
상기 항체는 폴리클론 항체, 단일클론 항체, 이특이적 항체, 비-인간 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메릭 항체, 단쇄 Fv(scFv), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fv(sdFv) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체는 항원 결합 부위가 외부로 드러날 수 있도록 항체의 불변 영역이 상기 입자에 연결된 폴리머에 결합될 수 있다. 또한, 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항원 결합 단편을 상기 폴리머에 결합시키는 경우에는 항원 결합 부위를 제외한 부분에 링커를 연결함으로써, 상기 입자에 연결된 폴리머에 결합될 수 있다. 따라서, 상기 항체가 결합된 폴리머가 연결된 상기 입자는 상기 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 표적 세포의 표면 마커에만 특이적으로 결합하므로, 생물학적 시료 중에서 분리되어야 할 표적 세포에만 상기 입자가 결합될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 입자에 연결된 폴리머에 한 종류 이상의 상기 항체가 결합될 수 있으며, 폴리머의 분자량에 따라, 상기 폴리머에는 하나 이상의 항체가 결합되어 있을 수 있다. 상기 폴리머에 결합될 수 있는 항체의 농도는 항체의 종류, 폴리머의 분자량, 입자의 크기에 따라 달라질 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 입자는 상기 폴리머 및 상기 항체를 연결하는 protein G, protein L, protein A, protein LA, protein AG 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 더 포함할 수 있다. 상기 단백질은 면역글로불린의 중쇄 불변 영역에 결합하는 미생물 유래의 단백질로서, 항체의 정제에 사용된다. 상기 단백질을 상기 폴리머 및 항체와 연결함으로써, 상기 항체의 항체 결합 부위가 표적 세포의 표면 마커를 향하도록 방향성을 부여할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 입자는 폴리스티렌 입자, 라텍스 입자, 금속 입자, 유리 입자, 자성 입자 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 또한, 일 구체예에 따르면, 상기 입자는 예를 들어, 10 nm 내지 10 ㎛, 100 nm 내지 5 ㎛ 또는 1 ㎛ 내지 3 ㎛의 직경을 가질 수 있다. 상기 입자는 표적 세포의 크기를 선택적으로 증폭할 수 있도록 한다. 예를 들어, 혈액 내의 암세포는 크기가 약 14 내지 24 ㎛로서, 10 내지 20 ㎛의 백혈구와 크기가 유사하여 혈액 내에서 선택적으로 암세포를 분리하기가 어렵다. 상기 입자는 음전하 또는 양전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체가 결합되어 있으므로, 표적 세포의 표면 마커와 결합하여 상기 표적 세포의 주위에 위치하게 된다. 이때, 상기 표적 세포에 상기 입자 자체의 크기가 추가되므로, 시료 내의 다른 세포들과의 크기 차이를 유발하여 표적 세포의 분리를 용이하게 하도록 할 수 있다.
또 다른 양상은 음전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자 및 생물학적 시료를 용액 내에서 접촉시키는 단계; 양전하를 갖는 폴리머가 연결된 입자 또는 양전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자를 상기 용액 내에 첨가하여 상기 음전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자와 결합시키는 단계; 및 상기 용액의 pH 값을 조절하는 단계를 포함하는 생물학적 시료 내에서 표적 세포를 분리하는 방법을 제공한다.
상기 표적 세포를 분리하는 방법을 각각의 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
상기 방법은, 음전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자 및 생물학적 시료를 용액 내에서 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 상기 표적 세포가 존재할 수 있는 어떠한 생물학적 시료라도 가능하며, 예를 들어, 생검시료, 조직시료, 분리된 세포를 액체 매질에 현탁시킨 세포 현탁물, 세포 배양물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 또한, 상기 생물학적 시료는 동물의 체액일 수 있으며, 상기 체액은 혈액, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 뇨, 점막액, 양수 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
예를 들어, 혈중 종양 세포를 분리하기 위해, 혈액을 상기 생물학적 시료로써 사용할 수 있다.
상기 접촉은 상기 생물학적 시료가 포함된 용액에 상기 음전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자를 첨가하는 방식으로 이루어질 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 접촉은 상기 음전하를 갖는 폴리머의 pKa 값과 동일하거나 큰 pH 값을 갖는 용액 내에서 이루어질 수 있다. 이때, 상기 입자는 상기 용액 내에서 전기적으로 중성이 될 수 있다. 상기 용액은 생물학적 시료 및 상기 입자가 안정하게 반응할 수 있는 환경을 제공하는 역할을 하며, 당업계에 널리 알려진 완충액이 사용될 수 있다. 상기 용액은 예를 들어, PBS 또는 PBST일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
일 구체예에 따르면, 상기 방법은 상기 접촉시키는 단계 이전에 상기 생물학적 시료를 전처리하여 상기 생물학적 시료로부터 고분자 및 세포를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 전처리는 상기 시료로부터 상기 세포를 제외한 다른 물질을 감소 또는 제거하는 것일 수 있다. 상기 전처리는 원심분리, 여과, 친화성 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 생물학적 시료가 혈액인 경우, 전처리 과정을 통해 혈장을 제거하고, 혈액 내에 포함된 단백질 및 세포만을 상기 단계에서 사용할 수 있으며, 단백질까지 제거하고 혈액 중에 존재하는 세포만을 상기 단계에 사용할 수 있다. 상기 세포는 표적 세포 및 생물학적 시료 중에 존재할 수 있는 기타의 세포를 포함한다.
또한, 상기 방법은 상기 접촉시키는 단계 이후에, 상기 표적 세포와 결합하지 않은 상기 입자를 제거하기 위해 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 세척은 세척 용액을 흘려 주는 것, 원심분리, 여과, 크로마토그래피 및 이들의 조합으로 이루어진 하나 이상을 수행하여 상기 표적 세포와 결합한 입자 이외의 물질을 제거 또는 감소시키는 것일 수 있다. 상기 세척 용액은 물, 완충액(예, PBS), 생리 식염수 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
이후, 상기 방법은, 양전하를 갖는 폴리머가 연결된 입자 또는 양전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자를 상기 용액 내에 첨가하여 상기 음전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자와 결합시키는 단계를 포함할 수 있다.
이전 단계에서, 상기 용액 중에는 상기 음전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자가 상기 생물학적 시료 중에 포함된 상기 표적 세포와 특이적으로 결합한 상태로 존재하므로, 양전하를 갖는 폴리머가 연결된 입자 또는 양전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자를 상기 용액에 첨가하는 경우, 이는 용액 중에 부유된 상태로 존재할 수 있다. 또한, 상기 용액의 pH 값은 음전하를 갖는 폴리머의 pKa 값과 동일하거나 작을 수 있으므로, 양전하를 갖는 폴리머가 연결된 입자 또는 양전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자는 전기적으로 (+)인 상태로 존재할 수 있다.
마지막으로, 상기 방법은, 상기 용액의 pH 값을 조절하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 조절하는 단계는 상기 음전하를 갖는 폴리머의 pKa 값보다 크고, 상기 양전하를 갖는 폴리머의 pKa 값보다 작은 값의 pH 값을 갖도록 상기 용액의 pH 값을 조절하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 음전하를 갖는 폴리머가 폴리말레산이고, 상기 양전하를 갖는 폴리머가 폴리에틸렌이민인 경우 상기 조절하는 단계에서 용액의 pH 값은 4 초과 10 미만일 수 있으며, 구체적으로, 6 이상 7 이하일 수 있다.
상기 pH 값의 조절은 pH를 낮추거나 높일 수 있는 공지된 어떠한 산 또는 염기를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 단계에서, pH 값을 상기 음전하를 갖는 폴리머의 pKa 값보다 크고, 상기 양전하를 갖는 폴리머의 pKa 값보다 작은 값의 pH 값을 갖도록 조절함으로써, 상기 음전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자는 전기적으로 (-)인 상태로 존재할 수 있고, 상기 양전하를 갖는 폴리머가 연결된 입자 또는 양전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자는 전기적으로 (+)인 상태로 존재할 수 있다. 따라서, 상기 입자들 간에 정전기적 인력이 발생하게 되므로, 상기 표적 세포에 결합된 서로 다른 전기적 성질을 갖는 입자들 간에, 또는 상기 표적 세포에 결합된 입자와 서로 다른 전기적 성질을 갖는 상기 표적 세포에 결합되어 있지 않은 입자들 간에 전기적으로 응집이 형성될 수 있다. 이러한 응집은 상기 표면 마커가 존재하는 표적 세포에서만 형성될 수 있으며, 상기 표적 세포의 전체적인 크기를 증가시킬 수 있으므로, 생물학적 시료 중 다른 세포들과 구별될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 조절하는 단계 이후, 상기 용액으로부터 상기 음전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자가 결합된 표적 세포를 분리시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이전 단계에서 전기적인 응집으로 인하여 전체적인 크기가 증가된 상기 표적 세포는 상기 생물학적 시료 중에 존재하는 다른 세포들과 크기에 있어서 차이가 생기게 되므로, 용이하게 분리될 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 분리는 원심분리, 여과, 크로마토그래피 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 수행하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 생물학적 시료 중에 존재하는 기타 세포들은 통과할 수 있고, 전기적인 응집으로 인하여 전체적인 크기가 증가된 상기 표적 세포는 통과하지 못하는 크기의 포어를 갖는 필터를 이용하여 상기 표적 세포를 분리할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 방법은 분리시키는 단계 이후에 상기 음전하를 갖는 폴리머의 pKa 값보다 작은 pH 값을 갖도록 상기 용액의 pH 값을 조절하는 단계; 및 상기 표적 세포를 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 단계는 상기 분리된 표적 세포를 검출하기 위한 전 단계로, 상기 전체적인 크기가 증가된 세포로부터 상기 표적 세포의 표면 마커에 결합되지 않은 전기적으로 응집된 입자들을 제거하는 과정이다. 이는 상기 표적 세포가 포함된 용액의 pH 값을 상기 입자들 간의 정전기적 인력을 제거하도록 조절하는 것이다. 즉, 상기 입자들이 포함되어 있는 용액의 pH를 음전하를 갖는 폴리머의 pKa 값보다 작게 하여, 음전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자를 전기적으로 중성이 되도록 함으로써, 응집되어 있던 양전하를 갖는 폴리머가 연결된 입자 또는 양전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자가 해체되도록 한다. 예를 들어, 상기 음전하를 갖는 폴리머가 폴리말레산인 경우, 상기 조절하는 단계에서 용액의 pH 값은 1 이상 5 이하일 수 있으며, 구체적으로, 2 이상 4 이하일 수 있다. 상기와 같이 전기적으로 응집된 입자가 제거된 표적 세포는 이후, 당업계에 공지된 전기적 또는 광학적 방법에 의해 검출될 수 있다. 또한, 상기 검출하기 위해 분리된 표적 세포는 당업계에 널리 알려진 배양 방법을 통해 배양되어 실험의 목적에 적합하도록 사용될 수 있다.
다른 양상은 양전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자 및 생물학적 시료를 용액 내에서 접촉시키는 단계; 음전하를 갖는 폴리머가 연결된 입자 또는 음전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자를 상기 용액 내에 첨가하여 상기 양전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자와 결합시키는 단계; 및 상기 용액의 pH 값을 조절하는 단계를 포함하는 생물학적 시료 내에서 표적 세포를 분리하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 상기 설명한 표적 세포를 분리하는 방법과 유사하므로, 둘 사이의 공통된 내용은 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략하고, 각각의 단계를 설명하도록 한다:
상기 방법은, 양전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자 및 생물학적 시료를 용액 내에서 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 접촉은 상기 양전하를 갖는 폴리머의 pKa 값과 동일하거나 작은 pH 값을 갖는 용액 내에서 이루어질 수 있다. 이때, 상기 입자는 상기 용액 내에서 전기적으로 중성이 될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 방법은 상기 접촉시키는 단계 이전에 상기 생물학적 시료를 전처리하여 상기 생물학적 시료로부터 고분자 및 세포를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 방법은 상기 접촉시키는 단계 이후에, 상기 표적 세포와 결합하지 않은 상기 입자를 제거하기 위해 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다.
이후, 상기 방법은, 음전하를 갖는 폴리머가 연결된 입자 또는 음전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자를 상기 용액 내에 첨가하여 상기 양전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자와 결합시키는 단계를 포함할 수 있다.
이전 단계에서, 상기 용액 중에는 상기 양전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자가 상기 생물학적 시료 중에 포함된 상기 표적 세포와 특이적으로 결합한 상태로 존재하므로, 음전하를 갖는 폴리머가 연결된 입자 또는 음전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자를 상기 용액에 첨가하는 경우, 이는 용액 중에 부유된 상태로 존재할 수 있다. 또한, 상기 용액의 pH 값은 양전하를 갖는 폴리머의 pKa 값과 동일하거나 클 수 있으므로, 음전하를 갖는 폴리머가 연결된 입자 또는 음전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자는 전기적으로 (-)인 상태로 존재할 수 있다.
마지막으로, 상기 방법은, 상기 용액의 pH 값을 조절하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 조절하는 단계는 상기 양전하를 갖는 폴리머의 pKa 값보다 작고, 상기 음전하를 갖는 폴리머의 pKa 값보다 큰 값의 pH 값을 갖도록 상기 용액의 pH 값을 조절하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 양전하를 갖는 폴리머가 폴리에틸렌이민이고, 상기 음전하를 갖는 폴리머가 폴리말레산인 경우 상기 조절하는 단계에서 용액의 pH 값은 4 초과 10 미만일 수 있으며, 구체적으로, 6 이상 7 이하일 수 있다.
상기 pH 값의 조절은 pH를 낮추거나 높일 수 있는 공지된 어떠한 산 또는 염기를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 단계에서, pH 값을 상기 양전하를 갖는 폴리머의 pKa 값보다 작고, 상기 음전하를 갖는 폴리머의 pKa 값보다 큰 값의 pH 값을 갖도록 조절함으로써, 상기 양전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자는 전기적으로 (+)인 상태로 존재할 수 있고, 상기 음전하를 갖는 폴리머가 연결된 입자 또는 음전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자는 전기적으로 (-)인 상태로 존재할 수 있다. 따라서, 상기 입자들 간에 정전기적 인력이 발생하게 되므로, 상기 표적 세포에 결합된 서로 다른 전기적 성질을 갖는 입자들 간에, 또는 상기 표적 세포에 결합된 입자와 서로 다른 전기적 성질을 갖는 상기 표적 세포에 결합되어 있지 않은 입자들 간에 전기적으로 응집이 형성될 수 있다. 이러한 응집은 상기 표면 마커가 존재하는 표적 세포에서만 형성될 수 있으며, 상기 표적 세포의 전체적인 크기를 증가시킬 수 있으므로, 생물학적 시료 중 다른 세포들과 구별될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 조절하는 단계 이후, 상기 용액으로부터 상기 양전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자가 결합된 표적 세포를 분리시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이전 단계에서 전기적인 응집으로 인하여 전체적인 크기가 증가된 상기 표적 세포는 상기 생물학적 시료 중에 존재하는 다른 세포들과 크기에 있어서 차이가 생기게 되므로, 용이하게 분리될 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 분리는 원심분리, 여과, 크로마토그래피 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 수행하여 이루어질 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 방법은 분리시키는 단계 이후에 상기 양전하를 갖는 폴리머의 pKa 값보다 큰 pH 값을 갖도록 상기 용액의 pH 값을 조절하는 단계; 및 상기 표적 세포를 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 단계는 상기 분리된 표적 세포를 검출하기 위한 전 단계로, 상기 전체적인 크기가 증가된 세포로부터 상기 표적 세포의 표면 마커에 결합되지 않은 전기적으로 응집된 입자들을 제거하는 과정이다. 이는 상기 표적 세포가 포함된 용액의 pH 값을 상기 입자들 간의 정전기적 인력을 제거하도록 조절하는 것이다. 즉, 상기 입자들이 포함되어 있는 용액의 pH를 양전하를 갖는 폴리머의 pKa 값보다 크게 하여, 양전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자를 전기적으로 중성이 되도록 함으로써, 응집되어 있던 음전하를 갖는 폴리머가 연결된 입자 또는 음전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자가 해체되도록 한다. 예를 들어, 상기 양전하를 갖는 폴리머가 폴리에틸렌이민인 경우, 상기 조절하는 단계에서 용액의 pH 값은 9 이상 14 이하일 수 있으며, 구체적으로, 10 이상 12 이하일 수 있다. 상기와 같이 전기적으로 응집된 입자가 제거된 표적 세포는 이후, 당업계에 공지된 전기적 또는 광학적 방법에 의해 검출될 수 있다. 또한, 상기 검출하기 위해 분리된 표적 세포는 당업계에 널리 알려진 배양 방법을 통해 배양되어 실험의 목적에 적합하도록 사용될 수 있다.
다른 양상은 상단 개구부, 하단 개구부 및 내부에 포어를 포함하는 필터가 배치된 필터 칼럼; 및 상기 필터 칼럼의 내부에 음전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자, 양전하를 갖는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자, 음전하를 갖는 폴리머가 연결된 입자, 양전하를 갖는 폴리머가 연결된 입자 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 입자를 포함하는 표적 세포 분리 키트를 제공한다. 상기 하단 개구부에는 유체의 흐름을 방지할 수 있도록 캡을 더 장착할 수 있다.
상기 키트는 분리하고자 하는 표적 세포의 종류에 따라 상기 항체를 다르게 하여 제작할 수 있으며, 표적 세포의 크기에 따라 필터의 포어 직경을 다르게 하여 제작할 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 포어의 직경은 예를 들어, 1 ㎛ 내지 100 ㎛, 3 ㎛ 내지 50 ㎛ 또는 8 ㎛ 내지 30 ㎛가 되도록 상기 키트를 제작할 수 있다.
일 구체예에 따른 생물학적 시료 내에서 표적 세포를 분리하는 방법 및 키트에 의하면, 생물학적 시료 중에 존재하는 표적 세포를 효율적으로 분리, 검출할 수 있다.
도 1 및 도 2는 일 구체예에 따른 표적 세포의 분리 방법을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 3은 일 구체예에 따른 항체가 결합된 음전하를 갖는 입자에 대한 개략도이다.
도 4는 일 구체예에 따른 CRB(CRB1-1 또는 CRB1-2와 CRB2-1, CRB2-2 또는 CRB2-3) 사이의 응집 및 해체 반응 결과를 보여주는 형광 현미경 사진이다.
도 5는 일 구체예에 따른 CRB1(CRB1-1, CRB1-1-EpC, CRB1-1-GEpC, CRB1-2, CRB1-2-EpC 또는 CRB1-2-GEpC)과 MCF-7 세포 사이의 결합 반응 결과를 보여주는 형광 현미경 사진이다.
도 6는 일 구체예에 따른 CRB1-1-GEpC과 백혈구 사이의 결합 반응 결과를 보여주는 형광 현미경 사진이다.
도 7은 일 구체예에 따른 CRB1-1-GEpC과 MCF-7 세포 사이의 결합 반응 및 MCF-7 세포에 결합된 CRB1-1-GEpC과 CRB2-1 사이의 응집 및 해체 반응 결과를 보여주는 형광 현미경 사진이다.
도 8은 일 구체예에 따른 CRB1-1-GEpC이 결합된 MCF-7을 미세필터를 사용하여 분리한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9a와 도 9b는 일 구체예에 따른 CRB1-1-GEpC과 전처리하지 않은 혈액 내에 포함된 MCF-7 세포 사이의 결합 반응 결과를 보여주는 형광 현미경 사진 및 그래프이다.
도 10a, 도 10b 및 도 10c는 MCF-7 세포에 결합된 CRB1-1-GEpC과 CRB2-1 사이의 응집 반응에 따른 MCF-7 세포의 크기를 나타낸 그래프이다.
도 11은 사용된 입자의 크기에 따른 CRB1-1-GEpC이 결합된 MCF-7 세포의 크기를 나타낸 그래프이다.
도 12는 일 구체예에 따른 표적 세포 분리 키트를 개략적으로 나타낸 모식도이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
도 1 및 도 2는 일 구체예에 따른 표적 세포 분리 방법의 모식도로써, 예를 들어, 혈액 중에서 혈중 종양 세포를 분리하는 방법을 나타낸다.
혈중 종양 세포가 포함된 혈액 시료 중에는 백혈구, 적혈구와 같은 혈구 세포가 함께 존재하며, 상기 혈중 종양 세포의 크기는 상기 혈액 시료 중에 존재하는 백혈구의 크기와 유사하여 크기에 의하여 혈중 종양 세포를 분리할 수 없다. 따라서, 상기 방법은 상기 혈중 종양 세포의 전체적인 크기를 증가시켜 다른 혈구 세포로부터 상기 혈중 종양 세포를 여과에 의해 분리할 수 있다.
상기 방법은, 상기 혈중 종양 세포의 전체적인 크기를 증가시키기 위해 상기 세포의 표면에 입자를 응집시키는 원리를 이용한다. 상기 세포 표면에 입자를 응집시키기 위해 주변 환경의 pH 값에 따라 전기적인 성질이 달라질 수 있는 폴리머가 연결되어 있으며, 상기 혈중 종양 세포만을 특이적으로 응집시키기 위해 상기 혈중 종양 세포의 표면에 전시되는 마커(예를 들어, EpCAM 및/또는 C-Met)를 상기 폴리머에 결합시킨 입자를 사용한다.
도 1을 참고하여 상기 방법을 설명하면, 먼저, 혈중 종양 세포가 포함된 혈액 시료를 얻은 다음, 상기 시료를 약 pH 3 내지 4의 완충액에 현탁시키고, 표면에 아크릴산-말레산 공중합체 또는 술폰산스티렌-말레산 공중합체가 연결되어 있으며, EpCAM 및/또는 C-Met의 항체가 하나 이상 결합된 입자를 상기 완충액에 첨가하여 상기 입자와 상기 혈중 종양 세포를 접촉시킨다. 이 때, 상기 입자에 결합된 EpCAM 및/또는 C-Met의 항체는 혈중 종양 세포 상의 EpCAM 및/또는 C-Met에 특이적으로 결합하게 되므로, 상기 항체가 결합된 입자는 상기 항체를 매개로 혈중 종양 세포의 주변에 위치하게 된다. 또한, 상기 입자에 연결된 아크릴산-말레산 공중합체 또는 술폰산스티렌-말레산 공중합체는 pKa 값이 약 4 정도이므로, 상기 입자는 상기 완충액 내에서 전기적으로 중성을 갖는 상태로 존재하게 된다.
이후, 상기 완충액에 폴리에틸렌이민이 연결된 입자를 첨가하고, 상기 완충액을 pH 6 내지 7 정도로 높이면, 상기 폴리에틸렌이민이 연결된 상기 입자 상의 이민기는 (+) 극성을, 상기 아크릴산-말레산 공중합체 또는 술폰산스티렌-말레산 공중합체가 연결된 입자상의 카르복실기 또는 술폰기는 (-) 극성을 나타내게 되므로, 도 1에서 나타난 바와 같이, 정전기적 인력에 의해 기존에 혈중 종양 세포 상의 EpCAM 및/또는 C-Met에 특이적으로 결합된 입자 주변에 유리된 폴리에틸렌이민이 연결된 입자가 응집될 수 있다. 상기 응집된 입자들로 인해 상기 혈중 종양 세포는 그 전체적인 크기가 증가하여 혈액 시료 중에 존재하는 기타 혈구 세포보다 훨씬 큰 크기를 갖게 된다. 이와 같은 방법으로 증가된 크기의 혈중 종양 세포를 여과를 통해 분리할 수 있으며, 분리 전 또는 목적에 따라서, 분리 후에 상기 응집된 입자를 제거하기 위해 상기 완충액의 pH를 처음과 같이 약 pH 4 정도로 낮춰주면, 도 1에 도시한 바와 같이, 상기 폴리에틸렌이민이 연결된 입자는 전기적인 성질이 중성이 되므로, 상기 입자는 유리될 수 있다. 하기 실시예는 상기 원리에 따른 실험 결과를 나타낸다.
실시예 1: 전하를 갖는 입자( charge reversible bead , CRB )의 제작
중성의 pH에서 음전하를 갖는 입자와 중성의 pH에서 양전하를 갖는 입자를 각각 다음과 같은 방법으로 제작하였다.
먼저, 직경 1 또는 3 ㎛의 폴리스티렌 비드(Polysciences, Inc)를 준비한 다음, 중성의 pH에서 음전하를 갖는 입자는 폴리스티렌 비드를 EDC(N-hydroxysuccinimide)/NHS (1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)로 처리하고, 아크릴산-말레산 공중합체 또는 술폰산스티렌-말레산 공중합체가 상기 폴리스티렌 비드에 연결되도록 하였다. 아크릴산-말레산 공중합체가 연결된 폴리스티렌 입자를 CRB1-1, 술폰산스티렌-말레산 공중합체가 연결된 폴리스티렌 입자를 CRB1-2라 명명하였다. 또한, 중성의 pH에서 양전하를 갖는 입자는 폴리스티렌 비드를 EDC/NHS로 처리한 다음, 폴리에틸렌이민의 선형 폴리머, 폴리에틸렌이민의 가지 폴리머 또는 키토산이 상기 폴리스티렌 비드에 연결되도록 하였다. 폴리에틸렌이민의 선형 폴리머가 연결된 폴리스티렌 입자를 CRB2-1, 폴리에틸렌이민의 가지 폴리머가 연결된 폴리스티렌 입자를 CRB2-2, 키토산이 연결된 폴리스티렌 입자를 CRB2-3이라 명명하였다. 한편, 상기 CRB2-1, CRB2-2 및 CRB2-3에는 붉은색의 형광을 나타내는 Texas Red가 결합하도록 제작하였다.
실시예 2: 항체가 결합된 음전하를 갖는 입자의 제작
상기 원리에 따라 분리하고자 하는 표적 세포로 사용된 세포는 유방암 세포주 MCF-7(한국 세포주 은행)이므로, 이에 존재하는 암세포의 표면 마커인 EpCAM에 특이적으로 결합하는 항체(Human EpCAM/TROP1 Fluorescein MAb (Clone 158206), FAB9601F, R&S system)를 선택하였다. 이후, 상기 실시예 1에서 제작한 CRB1-1 또는 CRB1-2를 5%의 BSA가 포함된 PBS 용액에 넣고, EpCAM에 특이적으로 결합하는 항체(0.65 mg/ml)를 첨가하여 2시간 동안 상온에서 천천히 흔들어 주었다. 그 결과, EpCAM에 특이적으로 결합하는 항체가 결합된 CRB1-1(CRB1-1-EpC이라 명명함) 또는 CRB1-2(CRB1-2-EpC라 명명함)를 제작하였다. 또한, 상기 항체의 결합시 방향성을 향상시키기 위해서 CRB1-1 또는 CRB1-2 를 5%의 BSA가 포함된 PBS 용액에 넣고, protein G(0.65 mg/ml)를 첨가하여 2시간 동안 반응시킨 다음, 상기 반응액에 EpCAM에 특이적으로 결합하는 항체(0.65 mg/ml)를 첨가하여 2시간 동안 상온에서 천천히 흔들어 주었다. 그 결과, EpCAM에 특이적으로 결합하는 항체 및 protein G가 결합된 CRB1-1(CRB1-1-GEpC라 명명함) 또는 CRB1-2(CRB1-2-GEpC라 명명함)를 제작하였다. 항체가 결합된 상기 입자에 대한 개략도를 도 3에 나타내었다.
실시예 3: CRB 간의 응집 및 해체 반응의 확인
상기 실시예 1 및 실시예 2에서 제작된 CRB들이 혼합되어 있을 때, 주변의 pH에 따라 상기 CRB들이 서로 응집 및 해체가 가능한지 여부를 실험하였다.
30 ㎕의 CRB1-1에 30 ㎕의 CRB2-1, CRB2-2, CRB2-3를 각각 PBS 용액이 포함된 시험관에 혼합한 다음, 상기 용액에 NaOH 용액을 조금씩 첨가하여, pH를 7.4로 적정하고, 1시간 동안 방치하였다. 이후, 상기 용액에 다시 HCl 용액을 조금씩 첨가하여, pH를 3으로 적정하고, 1시간 동안 방치하였다. CRB1-2의 경우도 위와 동일한 방법으로 응집 및 해체 반응 시험을 수행하였다. 상기 과정에서 NaOH를 첨가하고 1시간 반응 후, HCl을 첨가하고 1시간 반응 후에 형광 현미경(Olympus IX-81)을 사용하여 상기 입자들의 응집 및 해체 여부를 확인하였다. Texas Red의 형광 세기를 형광 현미경을 통해 관찰한 결과, 상기 혼합된 입자들의 주변 pH가 7.4인 경우에는 상기 두 종류의 입자가 서로 응집됨을 확인할 수 있었으며, 주변 pH가 4로 낮아진 경우에는 상기 두 종류의 입자가 서로 해체됨을 확인할 수 있었다(도 4).
실시예 4: CRB1 과 암세포의 결합 반응의 확인
상기 실시예 2에서 제작된 CRB1-1-EpC, CRB1-2-EpC, CRB1-1-GEpC 또는 CRB1-2-GEpC 30 ㎕를 DMEM 배지에 부유된 1 x 105 개의 유방암 세포 MCF-7에 각각 첨가하여 1시간 동안 방치한 다음, MCF-7과 CRB1-1-EpC, CRB1-2-EpC, CRB1-1-GEpC 또는 CRB1-2-GEpC과의 결합 여부를 형광 현미경(Olympus IX-81)을 사용하여 플루오로세인의 형광 세기를 통해 확인하였다(도 5). 그 결과, 암세포에 상기 첨가된 입자들이 결합하여 전체적인 크기가 원래의 암세포의 크기보다 증가하였음을 확인할 수 있었다. 한편, 대조 실험으로, 혈액 시료에서 분리한 백혈구를 대상으로 상기 실시예와 동일한 방법으로 CRB1-1과의 결합 여부를 확인해본 결과, 백혈구에서는 상기와 같은 결합 반응이 일어나지 않음을 확인할 수 있었다(도 6).
실시예 5: CRB1 이 결합된 암세포와 CRB2 사이의 응집 및 해체 반응의 확인
PBS 용액이 포함된 시험관에 상기 실시예 2에서 제작된 30 ㎕의 CRB1-1-GEpC 및 Hoechst 33342로 염색된 1 x 105 개의 유방암 세포 MCF-7를 혼합하여 1시간 동안 방치한 다음, MCF-7과 CRB1-1-GEpC의 결합 반응 여부를 형광 현미경(Olympus IX-81)을 통하여 확인하였다. 그 결과, CRB1-1-GEpC가 MCF-7에 결합하였음을 확인하였다(도 7). 이후, CRB1-1-GEpC가 결합된 MCF-7에 상기 실시예 1에서 제작한 CRB2-1을 30 ㎕ 첨가하고, 상기 용액에 NaOH 용액을 조금씩 첨가하여, pH를 7.4로 적정한 다음, 1시간 동안 방치한 후, 형광 현미경(Olympus IX-81)을 통해 관찰하였다(도 7). 그 결과, CRB1-1-GEpC가 결합된 MCF-7에 상기 첨가된 CRB2-1이 응집하여 전체적인 크기가 원래의 MCF-7의 크기보다 증가하였음을 확인할 수 있었다. 이후, 상기 용액에 다시 HCl 용액을 조금씩 첨가하여, pH를 3으로 적정하고, 1시간 동안 방치하였다. 그 결과, 용액의 pH가 3으로 낮아진 경우에는 CRB1-1-GEpC가 결합된 MCF-7과 응집하였던 CRB2-1이 해체됨을 확인할 수 있었다(도 7).
상기 CRB2-1를 해체시킨 다음, CRB1-1-GEpC가 결합된 MCF-7만을 포어의 크기가 7 내지 40 ㎛인 미세필터를 사용하여 분리하였다. 미세필터에 흘려준 CRB1-1이 결합된 MCF-7이 포함된 용액의 속도는 10 ul/min이었으며, 용액 1 ml 당 100개의 세포가 포함되도록 하였다. 도 8에 도시한 바와 같이, 5회의 실험 결과, CRB1-1-GEpC가 결합된 MCF-7의 회수율은 평균 91%였으며, 미세필터 내의 포어의 크기가 20 내지 25 ㎛에서 CRB1-1-GEpC가 결합된 MCF-7의 분리가 우수하게 이루어졌음을 확인할 수 있었다. 한편, 상기 분리된 세포를 DMEM 배지를 포함하는 세포 배양용 플레이트에 접종하고, 37℃, 5%의 CO2의 조건에서 24시간 동안 배양한 결과, 대조군인 MCF-7 세포와 비교해볼 때, 동일한 양상으로 성장함을 확인하였다.
실시예 6: 전처리하지 않은 혈액 내에 포함된 암세포 및 CRB1 의 결합 반응 시험
상기 실시예 2에서 제작된 30 ㎕의 CRB1-1-GEpC를 50개의 MCF-7가 포함된 혈액 1 ml에 첨가하여 1시간 동안 방치한 다음, MCF-7과 CRB1-1-GEpC의 결합 여부를 형광 현미경(Olympus IX-81)의 Bright Field 모드에서 관찰하였다(도 9a). MCF-7에 대한 CRB1-1-GEpC의 결합율을 계산하기 위하여 상기 세포에 결합된 양을 면적으로 환산하였다. 비교군으로는 50개의 MCF-7가 포함된 PBS 용액을 사용하였다. 그 결과, 도 9a 및 도 9b에서 보는 바와 같이, MCF-7가 혈액 내에 포함되어 전처리를 하지 않은 경우에도 CRB1-1-GEpC가 MCF-7 세포와 결합하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7: CRB2 가 응집된 CRB1 이 결합된 암세포 및 입자의 크기에 따른 CRB1 이 결합된 암세포의 크기 비교 시험
상기 실시예 2에서 제작한 CRB1-1-GEpC를 이용하여, 실시예 5와 동일한 방법에 의해 CRB1-1-GEpC를 MCF-7 세포와 결합시킨 다음, 형광 현미경(Olympus IX-81)의 Bright Field 모드로 CRB1-1-GEpC가 결합된 MCF-7 세포의 크기를 관찰하였다(n=100). 비교 실험으로 MCF-7 세포 대신 백혈구를 사용하였으며, 대조군으로는 CRB1-1-GEpC가 결합되지 않은 MCF-7를 사용하였다(도 10a). 도 10b에서 보는 바와 같이, CRB1-1-GEpC가 결합된 MCF-7 세포의 크기는 약 20 ㎛ 정도로, CRB1-1-GEpC가 결합되지 않은 MCF-7와 비교할 때, 약 4 내지 10 ㎛ 정도 크기가 증가되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 MCF-7 세포에 CRB1-1-GEpC를 결합시킨 다음, 다시 CRB2-1을 첨가하여 응집 반응을 수행한 결과, 도 10c에서 보는 바와 같이, CRB1-1-GEpC가 결합되지 않은 MCF-7에 비해 약 8 내지 20 ㎛ 정도 크기가 증가하였음을 확인할 수 있었다. 백혈구 중 단핵구(monocyte)의 크기는 14 내지 20 ㎛ 정도로 알려져 있으므로, MCF-7 세포에 CRB1-1-GEpC가 결합되고, CRB2-1이 응집되면, 단핵구를 포함한 다른 백혈구와 크기 차이를 증가시켜 혈액 내에서 MCF-7 세포를 분리할 수 있다. 또한, CRB2-1을 응집시키지 않더라도, CRB1-1-GEpC에서 폴리스티렌 비드의 크기를 증가시킴으로써, 백혈구와의 크기 차이를 나타내도록 할 수 있다. 도 11에서 보는 바와 같이, CRB1-1-GEpC를 구성하는 폴리스티렌 비드의 크기가 1 ㎛에서 3 ㎛로 증가하였을 때, CRB1-1-GEpC가 결합된 MCF-7 세포의 크기가 약 2 ㎛ 정도 증가하였음을 확인할 수 있었다.
실시예 8: 표적 세포 분리 키트를 이용한 표적 세포 분리 방법
도 12는 일 구체예에 따른 표적 세포의 분리 키트를 개략적으로 나타낸 모식도이다. 도 12를 참조하여, 상기 혈중 종양 세포의 분리 및 검출 과정을 예를 들어 설명하도록 한다.
먼저 혈액 시료를 약 pH 3 내지 4의 완충액에 현탁하여 필터 칼럼(100)의 상단 개구부(130)에 주입한다. 이 때, 시료의 유출을 막기 위해 필터 칼럼(100)의 하단 개구부(140)는 캡(150)을 씌워 막을 수 있다. 필터 칼럼(100)의 내부에는 CRB1-1-EpC, CRB1-2-EpC, CRB1-1-GEpC 또는 CRB1-2-GEpC가 포함되어 있으므로, 상기 입자와 상기 혈액 시료 중에 존재하는 혈중 종양 세포가 접촉할 수 있다. 이후, 상기 필터 칼럼의 상단 개구부(130)에 CRB2-1, CRB2-2 또는 CRB2-3를 첨가한 다음, 상기 필터 칼럼(100)에 포함된 완충액을 pH 6 내지 7 정도로 조절한다. 이때, pH의 조절은 필터 칼럼(100)에 산성 용액을 첨가함으로써 조절할 수 있다. 이후, 필터 칼럼(100) 내부에서는 상기 설명한 바와 같이, 응집 반응이 발생하게 되고, 상기 응집된 입자들로 인해 증가된 크기의 혈중 종양 세포는 필터(110)에 존재하는 포어(120)를 통과하지 못하기 때문에 필터 칼럼(100) 내부에 남아있게 되고, 나머지 혈구 세포 및 고분자는 필터(110)를 통과하여 필터 칼럼(100)의 하단 개구부(140)로 배출된다. 이후, 상기 혈중 종양 세포를 검출하기 위해서, 필터 칼럼(100)에 염기성 용액을 첨가하고, 필터 칼럼(100)에 존재하는 CRB2-1, CRB2-2 또는 CRB2-3를 분리하여 제거할 수 있다. 상기 CRB2-1, CRB2-2 또는 CRB2-3가 제거된 혈중 종양 세포는 CRB1-1-EpC, CRB1-2-EpC, CRB1-1-GEpC 또는 CRB1-2-GEpC가 결합된 상태로 분리될 수 있다. 상기 분리된 세포는 당업계에 공지된 방법과 동일하게 배양이 가능하며, 상기 배양 후, 트립신을 처리하면 혈중 종양 세포만을 별도로 분리할 수 있다.
100: 필터 칼럼
110: 필터
120: 포어
130: 상단 개구부
140: 하단 개구부
150: 캡

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  19. 음전하를 갖는 폴리머가 연결되고 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 제1 입자, 및 생물학적 시료를 용액 내에서 접촉시키는 단계;
    양전하를 갖는 폴리머가 연결되고 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 제2 입자를 상기 용액 내에 첨가하여 상기 제1 입자와 결합시키는 단계;
    상기 용액의 pH 값을 조절하는 단계; 및
    상기 용액으로부터 표적 세포를 분리하는 단계를 포함하는,
    생물학적 시료 내에서 표적 세포를 분리하는 방법.
  20. 양전하를 갖는 폴리머가 연결되고 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 제1 입자, 및 생물학적 시료를 용액 내에서 접촉시키는 단계;
    음전하를 갖는 폴리머가 연결되고 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 제2 입자를 상기 용액 내에 첨가하여 상기 제1 입자와 결합시키는 단계;
    상기 용액의 pH 값을 조절하는 단계; 및
    상기 용액으로부터 표적 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료 내에서 표적 세포를 분리하는 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 조절하는 단계는 상기 음전하를 갖는 폴리머의 pKa 값보다 크고, 상기 양전하를 갖는 폴리머의 pKa 값보다 작은 값의 pH 값을 갖도록 상기 용액의 pH 값을 조절하는 단계인 것인 방법.
  22. 제19항에 있어서, 상기 조절하는 단계 이후, 상기 용액으로부터 상기 제1 입자가 결합된 표적 세포를 분리시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  23. 제20항에 있어서, 상기 조절하는 단계 이후, 상기 용액으로부터 상기 제1 입자가 결합된 표적 세포를 분리시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  24. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 방법은 상기 접촉시키는 단계 이전에 상기 생물학적 시료를 전처리하여 상기 생물학적 시료로부터 고분자 및 세포를 분리하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  25. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 동물의 체액인 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 체액은 혈액, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 뇨, 점막액, 양수 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  27. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 분리하는 단계는 원심분리, 여과, 크로마토그래피 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법에 의해 수행되는 것인 방법.
  28. 제22항에 있어서, 상기 방법은 분리시키는 단계 이후에 상기 음전하를 갖는 폴리머의 pKa 값보다 작은 pH 값을 갖도록 상기 용액의 pH 값을 조절하는 단계; 및 상기 표적 세포를 검출하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  29. 제23항에 있어서, 상기 방법은 분리시키는 단계 이후에 상기 양전하를 갖는 폴리머의 pKa 값보다 큰 pH 값을 갖도록 상기 용액의 pH 값을 조절하는 단계; 및 상기 표적 세포를 검출하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  30. 상단 개구부, 하단 개구부 및 내부에 포어를 포함하는 필터가 배치된 필터 칼럼; 및
    상기 필터 칼럼의 내부에, 음전하를 갖는 폴리머가 연결되고 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자, 양전하를 갖는 폴리머가 연결되고 상기 폴리머에 결합된 한 종류 이상의 표적 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합되는 항체를 포함하는 입자, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 입자를 포함하는,
    표적 세포 분리용 키트.
  31. 제30항에 있어서, 상기 포어의 직경은 1 ㎛ 내지 100 ㎛인 것인 키트.
  32. 제30항에 있어서, 상기 포어의 직경은 3 ㎛ 내지 50 ㎛인 것인 키트.
  33. 제30항에 있어서, 상기 포어의 직경은 8 ㎛ 내지 30 ㎛인 것인 키트.
  34. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 음전하를 갖는 폴리머는 분자량이 1,000 내지 100,000인 것인 방법.
  35. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 음전하를 갖는 폴리머는 분자량이 3,000 내지 50,000인 것인 방법.
  36. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 음전하를 갖는 폴리머는 폴리스티렌술포네이트(polystyrenesulfonate), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리메타아크릴산(polymethacrylic acid), 폴리알콜(polyalcohol), 폴리포스페이트(polyphosphate), 폴리말레산(polymaleic acid), 히알루론산(hyaluronic acid) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  37. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 양전하를 갖는 폴리머는 분자량이 100 내지 50,000인 것인 방법.
  38. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 양전하를 갖는 폴리머는 분자량이 400 내지 25,000인 것인 방법.
  39. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 양전하를 갖는 폴리머는 폴리아닐린(polyaniline), 폴리피롤(polypyrrol), 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine), 폴리리신(polylysine), 키토산(chitosan) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  40. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 입자는 상기 폴리머 및 상기 항체를 연결하는 protein G, protein L, protein A, protein LA, protein AG 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 더 포함하는 것인 방법.
  41. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 폴리머는 선형 폴리머(linear polymer) 또는 가지 폴리머(branched polymer)인 것인 방법.
  42. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 입자는 폴리스티렌 입자, 라텍스 입자, 금속 입자, 유리 입자, 자성 입자 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  43. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 표적 세포는 세포 표면에 표면 마커를 갖는 세포인 것인 방법.
  44. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 표적 세포는 혈중 종양 세포(circulating tumor cell), 암 줄기 세포, 면역 세포, 태아 줄기 세포, 태아 세포, 암 세포 및 종양 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  45. 제43항에 있어서, 있어서, 상기 표면 마커는 단백질, 당, 지질, 핵산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 단백질은 에스트로겐 수용체(estrogen receptor), 프로게스테론 수용체(progesteron receptor), 시냅토피신(synaptophysin), 뮤신 1(mucin 1, MUC1), Bcl-2, MIB1/Ki67, 사이클린 D1(cyclin D1), 사이클린 E(cyclin E), p27, 토포이소머라아제 IIa(topoisomerase IIa), 사이클로옥시게나아제 2(cyclooxygenase 2), ERK1/ERK2, 포스포-S6 리보솜 단백질(phosphor-S6 ribosomal protein), CK5, CK8, CK17, 비멘틴(vimentin), EpCAM(epithelial cell adhesion molecule), c-Met, 시토케라틴(cytokeratines), Her2, EGFR, p53, p63, E-케드헤린(E-cadherin), 프라질 히스티딘 트리아드(fragile histidine triad), 프로테인 티로신 포스파타아제(protein tyrosine phosphatase), β-카테닌(β-catenin), p16, c-kit, 엔도테린-1(endothelin-1), 엔도테린 수용체-α(endothelin receptor-α), 엔도테린 수용체-β(endothelin receptor-β), 키모카인(CXC 모티프) 수용체 4(chemokine(CXC motif) receptor 4), 유방암 저항성 단백질(breast cancer resistance protein), ABCA3, MGMT 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  47. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 입자는 10 nm 내지 10 ㎛의 직경을 갖는 것인 방법.
  48. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 입자는 100 nm 내지 5 ㎛의 직경을 갖는 것인 방법.
  49. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 입자는 1 ㎛ 내지 3 ㎛의 직경을 갖는 것인 방법.
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