KR20140073215A - 세포 분리용 조성물, 키트 및 이를 이용한 세포 분리 방법 - Google Patents

세포 분리용 조성물, 키트 및 이를 이용한 세포 분리 방법 Download PDF

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KR20140073215A
KR20140073215A KR1020120141199A KR20120141199A KR20140073215A KR 20140073215 A KR20140073215 A KR 20140073215A KR 1020120141199 A KR1020120141199 A KR 1020120141199A KR 20120141199 A KR20120141199 A KR 20120141199A KR 20140073215 A KR20140073215 A KR 20140073215A
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Abstract

항체 또는 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는 1종 이상의 링커와 고체 지지체의 복합체를 포함하는 세포 분리용 조성물, 키트 또는 이를 이용한 세포 분리 방법을 이용하면, 시료 중 세포를 효율적으로 분리할 수 있다. 아울러, 분리된 세포를 검출하여 질병을 진단할 데 이용할 수 있다.

Description

세포 분리용 조성물, 키트 및 이를 이용한 세포 분리 방법{A composition and a kit for seperating a cell, and a method for seperating a cell using the same}
항체 또는 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는 1종 이상의 링커와 고체 지지체의 복합체를 포함하는 세포 분리용 조성물, 키트 및 이를 이용한 세포 분리 방법에 관한 것이다.
암 줄기 세포(cancer stem cell)는 암의 발생 과정 중 특정 세포에 유전자 변이가 초래되어 줄기 세포처럼 무한히 분열 증식하고, 다양한 표현형을 가진 암세포를 끊임없이 만들어내는 능력을 갖는 세포를 말한다. 종양 조직 안에 소수로 존재하고 있는 암 줄기 세포는 치료에 대한 내성 및 재발, 전환을 유발시키는 주요 원인으로 알려있지만, 암 줄기 세포의 마커나 발현 단백질에 대해서는 알려진 바가 적다.
상피-중간엽 전환(epithelial mesenchymal transition; EMT)는 정상적인 배아 발달 과정에서 발생하는 현상으로, 세포가 상피성(epithelial) 세포 표현형을 상실하고 이동성이 높은 중간엽성(mesenchymal) 세포 표현형으로 전환하는 과정을 말한다. 하지만 이것이 비가역적으로 진행될 경우에는 심장, 간, 신장 및 혈관 기능 부전을 초래할 뿐 아니라 악성 종양의 전환에도 관여하는 것으로 알려져 있다. EMT가 일어나면 상피세포가 세포의 위쪽과 기저쪽이 구분되는 극성을 잃고 세포 모양이 정방형에서 섬유아세포형으로 바뀌고 상피 세포 마커는 감소하고 간엽 세포 마커가 증가한다. 최근에 EMT가 태생기의 조직 형성과 분화 외에도 조직의 재생과 섬유화, 암의 발생과 전환 과정에 다양한 역할을 한다는 것이 알려져 있다.
혈중 종양 세포(circulating tumor cell; CTC)는 혈액 중에 존재하여 체내를 순환하는 종양 세포를 말하고, 원발암(primary cancer)의 전이에 관여하는 인자로 알려져 있다.
그러나, 암 줄기 세포, 상피-중간엽 전환을 거친 세포 또는 혈중 종양 세포와 같은 세포는 인체 내에서 그 양이 매우 적고 세포 자체가 연약하여 이를 감지하고 그 수를 파악하기가 매우 어렵다.
따라서, 환자의 체내에 존재하는 암세포, 혈중 종양 세포 또는 암 줄기 세포 를 포함한 표적 세포를 검출할 수 있는 높은 민감성을 나타내는 진단 방법이 여전히 필요하며, 생물학적 시료 중에 포함된 표적 세포를 효율적으로 분리하는 방법 및 이와 관련된 물질이 여전히 요구되고 있다.
세포 분리용 조성물을 제공한다.
세포 분리용 키트를 제공한다.
세포 분리 방법을 제공한다.
항체 또는 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는 1종 이상의 링커와 고체 지지체의 복합체를 포함하는 세포 분리용 조성물이 제공된다.
상기 용어 "항체(antibody)"는 용어 "면역 글로불린(immunoglobulin; Ig)"과 상호 교환적으로 사용된다. 완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합(disulfide bond; SS-bond)로 결합한다. 항체는 예를 들면, IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM일 수 있다.
상기 용어 "항원 결합 단편(antigen binding fragment)"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 말한다. 항원 결합 단편은 예를 들면, F(ab')2, Fab', Fab, Fv 또는 scFv일 수 있다. Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역만을 가지고 있는 최소의 항체 조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변 영역와 경쇄 가변 영역가 연결되고 단쇄 Fv(single-chain Fv; scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 이중쇄 Fv와 같이 다이머 구조를 이룰 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들면, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술로 제조할 수 있다.
상기 항체 또는 항원 결합 단편은 생성 숙주가 서로 상이한 2 종 이상의 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다. 상기 생성 숙주는 항체를 생성하는 생체이다. 생성 숙주는 예를 들면, 마우스, 래트, 래빗, 고트(goat), 기니 피그 또는 인간일 수 있다.
상기 용어 "링커(linker)"는 비드와 항체 또는 항원 결합 단편을 연결시기는 물질을 말한다. 링커는 예를 들면, 핵산, 단백질, 폴리펩티드, 중합체 또는 이들의 조합일 수 있다. 링커는 항체 또는 항원 결합 단편에 결합 친화도를 갖는 것일 수 있다. 링커는 예를 들면, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 단백질 L, 항-면역글로불린 항체, 자칼린(Jacalin) 또는 이들의 조합일 수 있다. 단백질 A(protein A)는 스타필로코커스 아우레우스의 세포벽에 존재하는 55 KDa의 단백질이다. 단백질 A는 마우스 IgG2a, 마우스 IgG2b, 인간 IgG1 및 인간 IgG2에 높은 친화도로 결합하고, 마우스 IgG3, 마우스IgG1, 인간 IgM, 인간 IgA 및 인간 IgE에 중간 정도의 친화도로 결합한다. 단백질 G(protein G)는 그룹 C 및 G 스트렙토코커스 박테리아에서 발현되는 면역글로불린 결합 단백질이다. 단백질 G는 단백질 A보다 좀더 광범위한 동물 종이나 IgG 서브 유닛에 결합할 수 있다. 단백질 A/G는 단백질 A 및 단백질 G의 IgG 결합 도메인을 조합한 재조합 융합 단백질을 말한다. 단백질 A/G는 모든 서브클래스의 인간 IgG에 결합할 수 있고, 인간 IgA, IgE, IgM 및 IgD에 결합할 수 있다. 또한 단백질 A/G는 모든 서브클래스의 마우스 IgG에 결합할 수 있다. 단백질 L은 펩토스트렙토코커스 마그너스 박테리아의 표면에서 분리된 단백질이다. 면역글로불린의 Fc 영역에 결합하는 단백질 A 및 단백질 G와 달리, 단백질 L은 경쇄 결합(light chain interaction)을 통해 면역글로불린과 결합한다. 단백질 L은 면역글로불린의 중쇄에는 결합하지 않기 때문에, 단백질 A 또는 단백질 G 보다 넓은 범위의 항체와 결합한다. 단백질 L은 IgG, IgM, IgA, IgE 및 IgD을 포함한 모든 항체의 종류와 결합하고, scFv 및 Fab와도 결합한다. 자칼린은 잭프룻(jackfruit)에서 발견되는 식물성 렉틴이다. 자칼린은 뮤신(mucin) 및 IgA1과 같은 O-당단백질과 결합할 수 있다. 용어 "항-면역글로불린 항체(anti-immunoglobulin antibody)"는 "항-항체(anti-antibody)" 또는 "2차 항체(secondary antibody)"와 상호교환적으로 사용할 수 있다. 항-면역글로불린 항체는 항체 또는 Fc 또는 Fab 영역과 같은 항체 단편에 결합하는 단백질을 말한다.
상기 용어 "고체 지지체(solid phase 또는 solid support)"은 크로마토그래피에서 이동상에 대응하는 용어이다. 컬럼 크로마토그래피에 있어서는 분리관에 충전한 흡착제(고체) 또는 담체에 함침시킨 액체, 평판 크로마토그래피에 있어서는 여과지 등의 담체에 유지된 액체가 고체 지지체가 되며, 친화 크로마토그래피에 있어서는 흡착제를 분리를 목적으로 하는 물질에 특이적 친화력을 갖는 화합물을 고체 지지체에 결합시킨 것이 고체 지지체가 될 수 있다. 고체 지지체는 예를 들어 자성 비드(magnetic bead), 폴리스티렌(polystylene) 플레이트 또는 폴리스티렌 비드일 수 있다.
상기 링커와 고체 지지체의 복합체(complex)는 링커와 고체 지지체가 결합한 물질을 말한다. 링커와 고체 지지체는 물리적 또는 화학적으로 결합한 것일 수 있다.
상기 세포는 분리 또는 검출하기를 원하는 세포일 수 있다. 세포는 예를 들면, 암세포, 암 줄기 세포(cancer stem cell; CSC), 혈중 종양 세포(circulating tumor cell; CTC), 상피-중간엽 전환(epithelial mesenchymal transition; EMT)를 거친 세포, 또는 이들의 조합일 수 있다. 암세포는 예를 들면, 간내 담관암, 간암, 갑상선암, 결장암, 고환암, 골수이형성증후군, 교모세포종, 구강암, 균상식육종, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 기저세포암, 난소 상피암, 난소 생식 세포 종양, 남성 유방암, 뇌종양, 뇌하수체선종, 다발성 골수종, 담낭암, 담도암, 대장암, 망막모세포종, 맥락막흑색종, 바터팽대부암, 방광암, 복막암, 부갑상선암, 부신암, 비소세포폐암, 설암, 성상세포종, 소세포폐암, 소아 뇌종양, 소아 림프종, 소아 백혈병, 소장암, 수막종, 식도암, 신경교종, 신경모세포종, 신우요관암, 신장암, 악성 연부 조직 종양, 악성 골종양, 악성 림프종, 악성 중피종, 악성 흑색종, 안종양, 외음부암, 요도암, 원발부위 불명암, 위림프종, 위암, 위유암종, 위장관 간질 종양, 윌름 종양, 유방암, 육종, 음경암, 인두암, 임신 융모 질환, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 전립선암, 전이성 뇌종양, 직장암, 직장유암종, 질암, 척수종양, 청신경초종, 췌장암, 침샘암, 편도암, 편평상피세포암, 폐선암, 폐암, 폐편평상피세포암, 피부암, 항문암, 후두암 또는 이들의 조합으로부터 유래한 암세포일 수 있다. 암 줄기 세포(cancer stem cell; CSC)는 암의 발생과정 중 특정 세포에 유전자 변이가 초래돼 줄기세포처럼 무한히 분열 증식하고, 다양한 표현형을 가진 암세포를 끊임없이 만들어내는 능력을 가진 세포를 말한다. 혈중 종양 세포(circulating tumor cell; CTC)는 혈액 중에 존재하여 체내를 순환하는 희소의 종양세포를 말한다. 혈중 종양 세포는 종양의 전이에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 상기 상피-중간엽 전환(epithelial mesenchymal transition; EMT)를 거친 세포는 예를 들면 혈중 종양 세포일 수 있다.
항체 또는 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는 1종 이상의 링커와 고체 지지체의 복합체를 포함하는 세포 분리용 키트가 제공된다.
상기 항체, 항원 결합 단편, 링커, 고체 지지체, 복합체, 및 세포는 전술한 바와 같다.
상기 키트는 고체 지지체를 분리하기 물질을 더 포함할 수 있다. 키트는 예를 들면, 완충액, 또는 자석을 더 포함할 수 있다.
표적 세포를 포함하는 시료와 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인큐베이션시켜 표적 세포와 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제1 복합체를 형성하는 단계;
항체 또는 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는 1종 이상의 링커와 고체 지지체의 제2 복합체와 상기 인큐베이션된 반응물을 인큐베이션시켜 표적 세포, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 링커 및 고체 지지체를 포함하는 제3 복합체를 형성하는 단계; 및
제3 복합체로부터 표적 세포를 분리하는 단계를 포함하는 세포 분리 방법이 제공된다.
상기 항체, 항원 결합 단편, 링커, 고체 지지체, 복합체, 및 세포는 전술한 바와 같다.
상기 방법은 표적 세포를 포함하는 시료와 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인큐베이션시켜 표적 세포와 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제1 복합체를 형성하는 단계를 포함한다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 고체 지지체에 결합하지 않은 자유 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다. 고체 지지체에 결합하지 않은 자유 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 표적 세포와 결합시키고, 여기에 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는 링커와 고체 지지체의 복합체를 결합시킬 수 있다. 그 결과, 표적 세포, 표적 세포와 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 링커, 및 고체 지지체를 포함하는 복합체를 형성할 수 있다. 이러한 결합은 링커를 매개로 연결되기 때문에 "인다이렉트 결합(indirect binding)"이라고 할 수 있다. 이와 대조적으로, 고체 지지체와 결합한 항체 또는 그의 단편을 이용하여 표적 세포를 분리하는 경우에는 항체와 링커가 직접 연결되기 때문에 "다이렉트 결합(direct binding)"이라고 할 수 있다. 인다이렉트 결합에서는 자유 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 표적 세포에 결합하기 때문에, 다이렉트 결합에 비해 항원 결합 효율이 더 우수하고 세포 분리 효율이 우수할 수 있다.
상기 표적 세포는 분리 또는 검출하기를 원하는 세포를 말한다.
상기 시료는 조직, 혈액, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 뇨, 점막액, 양수 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 인큐베이션은 예를 들면, 인 비트로에서 수행될 수 있다.
상기 제1 복합체는 예를 들면, 표적 세포와 항체의 복합체, 또는 표적 세포와 항원 결합 단편의 복합체일 수 있다.
상기 방법은 항체 또는 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는 1종 이상의 링커와 고체 지지체의 제2 복합체와 상기 인큐베이션된 반응물을 인큐베이션시켜 표적 세포, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 링커 및 고체 지지체를 포함하는 제3 복합체를 형성하는 단계를 포함한다.
제2 복합체는 링커와 고체 지지체가 결합한 물질을 말한다. 링커와 고체 지지체는 물리적 또는 화학적으로 결합한 것일 수 있다.
상기 인큐베이션은 예를 들면, 인 비트로에서 수행될 수 있다.
제3 복합체는 제1 복합체와 제2 복합체가 결합한 물질을 말한다. 제1 복합체와 제2 복합체는 물리적 또는 화학적으로 결합한 것일 수 있다.
상기 방법은 제3 복합체로부터 표적 세포를 분리하는 단계를 포함한다.
상기 방법에서 링커의 종류에 따라 항체 또는 항원 결합 단편에 대한 결합 친화도가 다르기 때문에, 항체 또는 항원 결합 단편의 종류, 예를 들면 항체의 숙주 또는 서브클래스에 따라 링커와 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 선택할 수 있다. 즉, 링커의 종류를 달리하면, 항체 또는 항원 결합 단편을 선택할 수 있고, 그 결과 표적 세포를 선택적으로 분리할 수 있다. 예를 들면, 시료에 마우스 유래 항체와 래빗 유래 항체를 인큐베이션시키고, 항-마우스 면역글로불린 항체를 링커로 사용하면, 마우스 유래 항체가 결합한 세포를 선택적으로 분리할 수 있다.
상기 표적 세포를 분리하는 단계는 세척하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법은 분리된 표적 세포를 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 검출된 세포를 통해 암을 포함한 질병을 진단할 수 있다.
일 구체예에 따른 세포 분리용 조성물, 세포 분리용 키트 또는 세포 분리 방법을 이용하면, 시료 중 세포를 효율적으로 분리할 수 있다. 아울러, 분리된 세포를 검출하여 질병을 진단할 데 이용할 수 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 인다이렉트 결합을 이용한 표적 세포 분리 방법에 대한 모식도이다.
도 2는 단일 항체를 사용한 경우와 다중 항체를 사용한 경우에 EMT 유도 세포와 MCF7의 커버리지 (세포 전체 표면적 중 비드가 결합된 비율, %)을 나타낸다.
도 3은 다이렉트 결합과 인다이렉트 결합의 세포 분리 방법, 및 인다이렉트 결합에서도 링커의 종류에 따른 MCF7의 커버리지(%)를 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 단일 항체와 다중 항체를 이용한 세포 분리 방법에서 비드 사용량의 비교
우선, 단일 항체를 이용하여 세포를 캡쳐하는 경우에 세포에 따라 비드가 결합되는 효율을 확인하였다. 항-EpCAM 마우스 IgG(R&D systems)와 Dynabeads® Protein G(Invitrogen)을 결합시켜 항-EpCAM 마우스 IgG와 비드의 복합체를 제조하였다. 제조된 30 ㎕의 복합체를 동일한 개수의 MCF-7(EpCAM 고발현 세포주)와 EMT(epithelial-mesenchymal transition) 유도 세포(EpCAM 저발현 세포주)에 각각 인큐베이션시키고, 세포에 결합한 비드의 커버리지(세포 전체 표면적 중 비드가 결합된 비율, %)를 확인하였다.
또한, EMT 유도 세포의 결합 효율을 높이기 위해, 암세포 표면 단백질을 인식하는 항-CD818 항체(ABCam), 항-DDR1항체(ABCam), 항-FGFR 항체(Abcam), 항-Muc1 항체(Abcam), 항-CAV1 항체(Fitzgerald), 항-EGFR 항체 (BD) 및 항-EpCAM 항체(R&D systems)의 총 7종의 항체가 각각 결합한 비드를 EMT 유도 세포와 인큐베이션시켜 회수된 EMT 유도 세포의 커버리지를 확인하였다.
도 2에서, "5ul_35ul"는 EMT(epithelial-mesenchymal transition) 유도 세포주에 상기 7종의 항체 비드를 각각 5 ㎕씩 총 35 ㎕를 첨가한 것을 의미하고, "10ul_70ul"는 EMT 유도 세포주에 상기 7종의 항체 비드를 각각 10 ㎕씩 총 70 ㎕를 첨가한 것을 나타내고, "EpCAM only_30ul"는 EMT 유도 세포주에 항-EpCAM 항체 비드를 단독으로 30 ㎕를 첨가한 것을 나타내고, "EpCAM_MCF7"는 MCF7세포주에 항-EpCAM 항체 비드를 단독으로 30 ㎕를 첨가한 것을 나타낸다.
도 2에서 나타난 바와 같이, EMT 유도 세포주의 커버리지는 약 45.62%이나, MCF-7의 커버리지는 약 92.50%였다. 따라서, MCF-7와 비드의 결합 효율에 비해, EMT 유도 세포와 비드의 결합 효율이 상대적으로 낮음을 확인하였다. 또한, 상기 7종의 항체와 결합한 비드를 사용한 경우, EMT 유도 세포의 커버리지는 약 62.95%였다. 상기 7종의 항체와 결합한 비드의 양을 2배 증가시킨 경우, EMT 유도 세포의 커버리지는 약 75.95%였다.
따라서, 다중항체를 사용하여 세포를 분리하는 방법이 단일 항체를 사용하여 세포를 분리하는 방법보다 더 결합 효율이 높지만, 세포 분리 효율을 높이기 위해 비드 사용량이 급격히 늘어날 가능성이 있다. 비드 사용량의 증가는 표적 세포 분리에서 순도 저하로 이어질 수 있다.
실시예 2. 다이렉트 결합과 인다이렉트 결합의 분리 방법, 및 인다이렉트 결합에서도 링커의 종류에 따른 결합 효율의 비교
2-1. 다이렉트 결합과 인다이렉트 결합에 따른 세포- 비드의 결합 효율 비교
다이렉트 결합과 인다이렉트 결합에 따른 EMT 유도 세포의 회수율을 비교하였다.
다이렉트 결합은 유방암 세포주(MCF7)에 과량으로 발현되는 EpCAM 단백질을 인지할 수 있는 마우스 유래 항체를 비드와 결합시킨 후, MCF7-비드를 인큐베이션 시켜 복합체를 합성하였다. 구체적으로, 단백질 G 가 컨쥬게이션된 1 ml의 비드에 200 ㎍의 항-EpCAM 항체(R&D systems)를 첨가하였다. 반응물을 상온에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, 냉장 상태에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 후 반응물을 PBS로 3회 세척하였다. 반응물을 5%(w/v) BSA로 블로킹한 다음 2%(w/v) BSA 용액에 현탁시키고 냉장 보관하였다. 제작된 EpCAM 비드와 5×105 개/ml의 MCF7 암세포를 상온에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후 커버리지를 측정하였다.
인다이렉트 결합은 MCF7 세포주와 EpCAM 항체를 인큐베이션시킨 후, anti-mouse IgG 가 결합된 비드를 인다이렉트 방법으로 인큐베이션시켰다. 구체적으로 goat 유래의 항-마우스 IgG를 비드에 컨쥬게이션시킨 후, 반응물을 PBS로 세척하였다. 반응물을 5%(w/v) BSA로 블로킹한 후 2%(w/v) BSA 용액에 현탁시키고 냉장 보관하였다. 5×105 개/ml의 MCF7 세포주와 EpCAM 항체를 상온에서 인큐베이션시킨 후, 상기 비드를 투입하여 세포-항체-비드 복합체를 형성하였다. 복합체 형성 후 비드가 결합된 세포의 커버리지를 확인하였다.
도 3에서, "Direct"는 마우스 유래 IgG와 비드의 다이렉트 결합을 나타내고, "Indirect"는 마우스 유래 IgG, 항-마우스 IgG 항체 및 비드의 인다이렉트 결합을 나타낸다.
도 3에 나타난 바와 같이, 다이렉트 결합의 경우에, MCF7 세포와 상기 항-EpCAM 마우스 IgG와 비드가 결합한 복합체를 인큐베이션시켰다. 항-EpCAM 마우스 IgG와 비드의 복합체 5 ㎕를 사용하여 MCF7 세포와 반응시킨 경우의 커버리지는 24.69%였다. 항-EpCAM 마우스 IgG와 비드의 복합체의 양을 증가시킬수록 커버리지는 증가하였다.
인다이렉트 결합의 경우에, MCF7 세포와 항-EpCAM 마우스 IgG를 인큐베이션시킨 다음, 인큐베이션 된 반응물에 goat 항-마우스 IgG 항체와 비드가 결합된 복합체를 첨가하고 인큐베이션하였다. 항-마우스 IgG 항체와 비드의 복합체 5 ㎕를 사용하여 MCF7 세포를 결합시킨 경우에 커버리지는 약 47.60%였다. 항-마우스 IgG 항체와 비드의 복합체의 양을 증가시킬수록 커버리지는 증가하였다.
다이렉트 결합 방법과 인다이렉트 결합에 따른 세포 커버리지를 비교한 결과 인다이렉트 결합에 따른 세포 커버리지가 더 높았다. 인다이렉트 결합 방법이 비드 사용량이 적으면서 우수한 커버리지를 나타낸다는 것을 의미한다. 또한, 다이렉트 결합 방법이 항체의 종류가 늘어날수록 비드의 사용량이 증가시키고 순도를 저하시키는 반면에, 인다이렉트 결합 방법은 항체의 사용양이 늘어나더라도 비드의 사용량은 단일 항체를 사용하는 경우와 유사하고, 세포 회수율이 우수하여 비드 사용량 감소 및 순도 증가에 효과가 있음을 확인하였다.
2-2. 링커의 종류에 따른 커버리지의 비교
인다이렉트 결합 중에서도 링커의 종류에 따른 MCF7 세포의 커버리지(%)을 비교하였다.
IgG를 링커로 이용하는 경우에, Dynal-protein G 비드에 항-mouse IgG를 컨쥬게이션시킨 비드를 합성하였다. 세포와 항-EpCAM 항체를 인큐베이션시켜 세포-항체 복합체를 형성한 후, 항-mouse IgG가 결합된 비드를 5 ㎕ 내지 20 ㎕까지 투입하면서 세포-비드간 결합 효율을 측정하였다.
단백질 G를 링커로 이용하는 경우에, 단백질 G 가 결합된 dynal-protein G 비드를 이용하였다. MCF7 세포주와 항-EpCAM 항체를 인큐베이션시킨 후, 단백질 G 를 링커로 이용하여 비드와 세포를 결합시킨 복합체를 형성하였다. 커버리지 측정을 통해 세포-비드간 결합 효율을 확인하였다.
도 3에서, "Indirect"는 마우스 유래 IgG, 항-마우스 IgG 항체 및 비드의 인다이렉트 결합을 나타내고, "PG"는 마우스 유래 IgG, 단백질 G 및 비드의 인다이렉트 결합을 나타낸다.
도 3에 나타난 바와 같이, 항-마우스 IgG 항체와 비드가 결합된 복합체 20 ㎕를 사용하여 MCF7 세포와 비드의 결합 효율을 확인한 결과 커버리지는 약 71.92%였다. 반면에, 단백질 G와 비드가 결합된 복합체 20 ㎕를 사용하여 MCF7 세포와 비드의 결합시킨 경우에 커버리지는 약 57.20%였다.
따라서, 인다이렉트 결합에서 링커의 종류에 따라 회수율이 상이함을 확인하였다.

Claims (20)

  1. 항체 또는 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는 1종 이상의 링커와 고체 지지체의 복합체를 포함하는 세포 분리용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 링커는 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 단백질 L, 항-면역글로불린 항체, 자칼린(Jacalin), 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 생성 숙주가 서로 상이한 2 종 이상의 항체 또는 항원 결합 단편인 것인 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 생성 숙주는 마우스, 래트, 래빗, 고트(goat), 기니 피그 또는 인간인 것인 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 고체 지지체는 자성 비드, 폴리스티렌 플레이트 또는 폴리스티렌 비드인 것인 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 세포는 암세포, 암 줄기 세포, 혈중 종양 세포(circulating tumor cell; CTC), 상피-중간엽 전환(epithelial mesenchymal transition; EMT)를 거친 세포, 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
  7. 항체 또는 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는 1종 이상의 링커와 고체 지지체의 복합체를 포함하는 세포 분리용 키트.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 링커는 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 단백질 L, 항-면역글로불린 항체, 자칼린(Jacalin) 또는 이들의 조합인 것인 키트.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 생성 숙주가 서로 상이한 2 종 이상의 항체 또는 항원 결합 단편인 것인 키트.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 생성 숙주는 마우스, 래트, 래빗, 고트(goat), 기니 피그 또는 인간인 것인 키트.
  11. 청구항 7에 있어서, 상기 고체 지지체는 자성 비드, 폴리스티렌 플레이트 또는 폴리스티렌 비드인 것인 키트.
  12. 청구항 7에 있어서, 상기 세포는 암세포, 암 줄기 세포, 혈중 종양 세포(circulating tumor cell; CTC), 상피-중간엽 전환(epithelial mesenchymal transition; EMT)를 거친 세포, 또는 이들의 조합인 것인 키트.
  13. 표적 세포를 포함하는 시료와 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인큐베이션시켜 표적 세포와 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제1 복합체를 형성하는 단계;
    항체 또는 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는 1종 이상의 링커와 고체 지지체의 제2 복합체와 상기 인큐베이션된 반응물을 인큐베이션시켜 표적 세포, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 링커 및 고체 지지체를 포함하는 제3 복합체를 형성하는 단계; 및
    제3 복합체로부터 표적 세포를 분리하는 단계를 포함하는 세포 분리 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 링커는 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 단백질 L, 항-면역글로불린 항체, 자칼린(Jacalin) 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  15. 청구항 13에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 생성 숙주가 서로 상이한 2 종 이상의 항체 또는 항원 결합 단편인 것인 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 생성 숙주는 마우스, 래트, 래빗, 고트(goat), 기니 피그 또는 인간인 것인 방법.
  17. 청구항 15에 있어서, 링커가 생성 숙주가 서로 상이한 2 종 이상의 항체 또는 항원 결합 단편 중 어느 하나 이상에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
  18. 청구항 13에 있어서, 상기 고체 지지체는 자성 비드, 폴리스티렌 플레이트 또는 폴리스티렌 비드인 것인 방법.
  19. 청구항 13에 있어서, 상기 세포는 암세포, 암 줄기 세포, 혈중 종양 세포(circulating tumor cell; CTC), 상피-중간엽 전환(epithelial mesenchymal transition; EMT)를 거친 세포, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  20. 청구항 13에 있어서, 분리된 표적 세포를 검출하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160091180A (ko) * 2015-01-23 2016-08-02 인제대학교 산학협력단 주파수 위상차를 이용한 세포 분별 방법 및 이를 위한 세포 전도성 조절용 조성물
KR20220115462A (ko) * 2021-02-10 2022-08-17 재단법인 아산사회복지재단 세포 원심분리 및 농축을 이용한 면역세포 검출 방법 및 면역세포 검출용 칩

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11112410B2 (en) * 2016-04-13 2021-09-07 President And Fellows Of Harvard College Methods for capturing, isolation, and targeting of circulating tumor cells and diagnostic and therapeutic applications thereof

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110101072A (ko) * 2010-03-05 2011-09-15 삼성전자주식회사 표적 세포의 분리 방법 및 키트
KR20120017884A (ko) * 2010-08-20 2012-02-29 엘지이노텍 주식회사 자성입자의 항체고정화 방법 및 이를 이용해 제조되는 진단스트립, 진단키트
KR20120025601A (ko) * 2009-06-11 2012-03-15 미네르바 바이오테크놀로지 코포레이션 줄기 세포 및 전구 세포를 배양하는 방법
KR20120060027A (ko) * 2010-12-01 2012-06-11 한국식품연구원 샌드위치 면역분석 바이오칩 및 이를 사용한 면역분석법
KR20120119931A (ko) * 2011-04-15 2012-11-01 한국세라믹기술원 클로로계 실란을 이용하여 시스테인계 단백질 ｇ가 고정화된 기능성 실리카 자성나노입자의 제조방법 및 그 자성나노입자

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6117985A (en) * 1995-06-16 2000-09-12 Stemcell Technologies Inc. Antibody compositions for preparing enriched cell preparations
US7425541B2 (en) * 1998-12-11 2008-09-16 Medarex, Inc. Enzyme-cleavable prodrug compounds
JP2003284568A (ja) * 2002-03-29 2003-10-07 Fukuoka Prefecture 細胞認識及び／又は細胞破壊能を有する新規タンパク質
CN1743849A (zh) 2004-09-03 2006-03-08 上海透景生命科技有限公司 一种多肿瘤标志物并行检测的方法及试剂盒
EP1892530A1 (en) * 2006-08-25 2008-02-27 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG Method for determining transport activity of a transport protein
JP2008102012A (ja) 2006-10-19 2008-05-01 Kanazawa Univ 癌幹細胞の同定および単離方法
WO2009012357A2 (en) * 2007-07-17 2009-01-22 The General Hospital Corporation Methods to identify and enrich for populations of ovarian cancer stem cells and somatic ovarian stem cells and uses thereof
JP5638747B2 (ja) 2008-08-20 2014-12-10 株式会社日立製作所 がん腫の遺伝子診断のための細胞回収及び単離方法並びにキット
IT1391619B1 (it) 2008-11-04 2012-01-11 Silicon Biosystems Spa Metodo per l'individuazione, selezione e analisi di cellule tumorali
US20120100538A1 (en) 2009-03-24 2012-04-26 Biocept, Inc. Devices and methods of cell capture and analysis
ES2557914T3 (es) 2009-03-24 2016-01-29 Biocept, Inc. Dispositivos y métodos de captura y análisis de células

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120025601A (ko) * 2009-06-11 2012-03-15 미네르바 바이오테크놀로지 코포레이션 줄기 세포 및 전구 세포를 배양하는 방법
KR20110101072A (ko) * 2010-03-05 2011-09-15 삼성전자주식회사 표적 세포의 분리 방법 및 키트
KR20120017884A (ko) * 2010-08-20 2012-02-29 엘지이노텍 주식회사 자성입자의 항체고정화 방법 및 이를 이용해 제조되는 진단스트립, 진단키트
KR20120060027A (ko) * 2010-12-01 2012-06-11 한국식품연구원 샌드위치 면역분석 바이오칩 및 이를 사용한 면역분석법
KR20120119931A (ko) * 2011-04-15 2012-11-01 한국세라믹기술원 클로로계 실란을 이용하여 시스테인계 단백질 ｇ가 고정화된 기능성 실리카 자성나노입자의 제조방법 및 그 자성나노입자

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160091180A (ko) * 2015-01-23 2016-08-02 인제대학교 산학협력단 주파수 위상차를 이용한 세포 분별 방법 및 이를 위한 세포 전도성 조절용 조성물
KR20220115462A (ko) * 2021-02-10 2022-08-17 재단법인 아산사회복지재단 세포 원심분리 및 농축을 이용한 면역세포 검출 방법 및 면역세포 검출용 칩

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