KR101994370B1 - 항체 및 자성 나노 입자가 결합된 전도성 고분자를 포함하는 혈중 암세포 검출 및 회수용 자성 나노 구조체 - Google Patents

항체 및 자성 나노 입자가 결합된 전도성 고분자를 포함하는 혈중 암세포 검출 및 회수용 자성 나노 구조체 Download PDF

Info

Publication number
KR101994370B1
KR101994370B1 KR1020160107979A KR20160107979A KR101994370B1 KR 101994370 B1 KR101994370 B1 KR 101994370B1 KR 1020160107979 A KR1020160107979 A KR 1020160107979A KR 20160107979 A KR20160107979 A KR 20160107979A KR 101994370 B1 KR101994370 B1 KR 101994370B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
blood
magnetic
cells
present
antibody
Prior art date
Application number
KR1020160107979A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20180022490A (ko
Inventor
조영남
이은숙
홍우영
Original Assignee
주식회사 제놉시
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 제놉시 filed Critical 주식회사 제놉시
Priority to KR1020160107979A priority Critical patent/KR101994370B1/ko
Priority to US15/246,615 priority patent/US20180059114A1/en
Priority to JP2017026925A priority patent/JP6509926B2/ja
Publication of KR20180022490A publication Critical patent/KR20180022490A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101994370B1 publication Critical patent/KR101994370B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y111/00—Oxidoreductases acting on a peroxide as acceptor (1.11)
    • C12Y111/01—Peroxidases (1.11.1)
    • C12Y111/01007—Peroxidase (1.11.1.7), i.e. horseradish-peroxidase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/545—Synthetic resin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/908—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 항체 및 자성 나노 입자가 결합된 전도성 고분자를 포함하는 혈중 암세포 검출 및 회수용 자성 나노 구조체에 관한 것으로, 본 발명에 따른 자성 나노 구조체는 소량의 혈액을 이용하여 초기 암환자의 혈중 암세포 및 다양한 종류의 혈중 암세포를 효율적으로 검출할 수 있으며, 비색 검출을 통하여 육안으로 혈중 암세포의 모니터링이 가능하고, 다량의 자성 나노 입자의 탑재를 통해 발생되는 강한 자기장으로 극미량으로 존재하는 혈중 암세포를 효율적으로 포획할 수 있다. 또한 극소량 존재하는 혈중 암세포의 검출, 분리 및 회수에 있어서, 나노 와이어의 긴 구조 및 다양한 항체의 사용으로 인해, 암 세포와의 접촉을 늘릴 수 있으며 단단한 결합을 형성할 뿐만 아니라, 민감도가 향상되어, 암세포와 여러 상호 작용을 촉진함으로써, 종래 기술에 비하여 현저하게 증가된 검출 및 분리 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명에 따른 자성 나노 구조체는 암 조기 진단, 치료, 뿐만 아니라 혈중 암세포로부터 DNA를 추출하여 유전자 변이 진단 서비스로의 활용이 기대된다.

Description

항체 및 자성 나노 입자가 결합된 전도성 고분자를 포함하는 혈중 암세포 검출 및 회수용 자성 나노 구조체 {Magnetic nanostructure for detecting and isolating circulating tumor cells comprising antibody- and magnetic nanoparticle-conjugated conductive polymer}
본 발명은 항체 및 자성 나노입자가 결합된 전도성 고분자 나노 구조체를 통한 혈중 암세포 검출 및 회수에 관한 것이다.
최근 전 세계적으로 암 질환의 조기 진단 중요성이 크게 부각되고 있으며, 따라서 암 조기 진단 방법에 대한 연구 비중이 증가하고 있는 추세이다.
그러나 현재까지 암 진단 방법은 조직 샘플의 채취 및 내시경 검사 등의 침습적인 방법이 주를 이루고 있어, 기존의 침습적인 진단 및 검사 방법의 대안으로 액체 생체검사가 주목받고 있다. 액체 생체검사는 혈액 등의 체액 검사만으로 신체 부위별 혈액 내에 존재하는 암세포 유래 DNA를 분석하여 암 발생 및 전이 등에 대한 상세한 관찰이 가능하고, 비 침습적인(non-invasive) 방법을 사용하기 때문에, 유전체 분석기술의 급속한 발전과 비용 절감의 장점을 바탕으로 암 진단 기술에 응용하려는 노력이 시도되고 있다.
한편, 순환종양세포(Circulating Tumor Cell, CTC)는 종양 세포의 일부가 원발암에서 떨어져 나와 혈관이나 림프관에 유입되어 다른 조직이나 장기로 이동하는 암의 과정에서 발견되며, 어느 단계에서 종양이 혈류에 순환종양세포를 방출하는지는 완전하게 규명되지 않았지만, 종양의 유형, 크기 및/또는 공격성에 따라 다른 것으로 추정되고 있다.
이에 따라 암 진단에 있어서 순환종양세포(CTC)는 커다란 상관관계를 가지고 있으며, 고형 장기에 발생하는 다양한 종양의 순환종양세포를 검출, 분리하고 특징을 파악하기 위한 방법에 대한 연구가 주목 받고 있다. 따라서 혈액을 이용한 비 침습적, 비수술적인 방법으로 순환종양세포의 검출을 통해 암 진단 및 암 환자의 예후를 관찰할 수 있다는 것이 순환종양세포를 이용한 진단법의 가장 큰 장점이라 할 수 있다.
그러나 진행된 암의 경우, 1밀리리터의 혈액에 1백만 개 이상의 백혈구가 존재하는 반면, 순환종양세포는 10-100 개 정도로 매우 낮은 농도로 존재하여, 혈액 내 백혈구나 혈소판 등에 비해 CTC 분포 정도가 미미하고, 혈중을 순환하는 도중에 대부분 사멸되기 때문에 CTC를 검출하기 어렵다는 한계가 있다(한국 공개 특허 KR 10-2014-0098334).
이에 기존 혈중 암세포의 검출 기술의 문제점을 해결하여 검출 효율을 높일 수 있는 기술 개발이 요구되고 있는 실정이다.
본 발명자는 항체 및 자성 나노 입자가 결합된 전도성 고분자를 포함하는 혈중 암세포 검출 및 회수용 자성 나노 구조체를 제조하여, 상기 구조체가 소량의 혈액을 이용하여 초기 암환자의 순환종양세포 및 다양한 종류의 혈중 암세포를 효율적으로 검출할 수 있으며, 비색 검출을 통하여 육안으로 혈중 암세포의 모니터링이 가능하고, 극소량 존재하는 혈중 암세포의 검출, 분리 및 회수에 있어서 월등하게 향상된 효과를 가지는 것을 확인한 바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은 항체 및 자성 나노 입자가 결합된 전도성 고분자를 포함하는 혈중 암세포 검출 및 회수용 자성 나노 구조체를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 항체 및 자성 나노 입자가 결합된 전도성 고분자를 포함하는 혈중 암세포 검출 및 회수용 자성 나노 구조체를 이용하여 혈중 암세포의 검출 및/또는 회수방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 항체 및 자성 나노 입자가 결합된 전도성 고분자를 포함하는 혈중 암세포 검출 및 회수용 자성 나노 구조체를 포함하는 진단키트를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 항체 및 자성 나노 입자가 결합된 전도성 고분자를 포함하는 혈중 암세포 검출 및 회수용 자성 나노 구조체를 이용하여 암의 발병 및/또는 예후를 진단하기 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 항체 및 자성 나노 입자가 결합된 전도성 고분자를 포함하는 혈중 암세포 검출 및 회수용 자성 나노 구조체를 이용하여 암 진단 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전도성 고분자를 포함하는 혈중 암세포 검출 및 회수용 나노 구조체를 제공한다.
또한, 상기 전도성 고분자는 항체가 결합되고 자성 나노 입자가 탑재된 전도성 고분자일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 항체는 anti-EpCAM(anti-Epithelial cell adhesion molecule), anti-EGFR(anti-Epidermal growth factor receptor), anti-N-cadherin, anti-TROP2(anti-trophoblast cell-surface antigen) 및 anti-vimentin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 항체는 anti-EpCAM(anti-Epithelial cell adhesion molecule), anti-EGFR(anti-Epidermal growth factor receptor), anti-N-cadherin, anti-TROP2(anti-trophoblast cell-surface antigen) 및 anti-vimentin 을 포함하는 항체 혼합물일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 항체 혼합물은 서양고추냉이 과산화효소 (horseradish peroxidase; HRP)를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 전도성 고분자는 폴리아세틸렌(polyacetylene), 폴리피롤(polypyrrole), 폴리티오펜(polythiophene), 폴리피닷(PEDOT: poly(3,4-ethylenedioxythiophene), 폴리아닐린(polyaniline) 또는 이들의 유도체일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 나노 구조체는 나노 와이어, 나노 막대 또는 나노 입자일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 나노 와이어는 사용된 Anodic alumina oxide (AAO) template의 구멍 크기에 따라 100㎚ 내지 300㎚의 직경을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 나노 와이어는 5㎛ 내지 30㎛의 길이일 수 있으며, 평균 17㎛의 길이를 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 혈중 암세포는 순환종양세포(Circulating tumor cell; CTC) 또는 순환종양줄기세포(Circulating Tumor Stem Cell; CTSC)일 수 있고, 바람직하게는 순환종양세포일 수 있다.
또한 본 발명은 (1) 본 발명의 나노 구조체를 대상 시료에 처리하는 단계; 및 (2) 자석에 의해 생성된 자기장을 이용하여 상기 나노 구조체로부터 상기 혈중 암세포를 검출하는 단계를 포함하는 혈중 암세포의 검출 및 회수방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 검출 및 회수방법에 있어, 화합물을 이용하여 상기 나노 구조체로부터 상기 혈중 암세포를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 화합물은 글루타치온(glutathione)일 수 있고, 상기 시료는 혈액일 수 있다.
또한 본 발명은 (1) 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase; HRP)를 더 포함하는 본 발명의 나노 구조체를 대상 시료에 처리하는 단계; 및 (2) 상기 나노 구조체의 색을 육안으로 판단하는 단계를 포함하는 혈중 암세포의 비색검출방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 비색검출방법에 있어, 상기 나노 구조체의 색변화를 분광계 또는 색도계로 측정하여, 대상 시료 내의 혈중 암세포의 농도를 정량하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 시료는 혈액일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 혈중 암세포 검출 및 회수용 나노 구조체를 포함하는 암 진단키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 진단키트는 바이오센서일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 나노 구조체로부터 검출한 혈중 암세포로부터 DNA를 추출 또는 분리하여 분석하는 단계를 포함하는 암의 발병 및/또는 예후를 진단하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 나노 구조체를 이용한 암 진단 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 나노 구조체를 포함하는 혈중 암세포의 검출 및 회수용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 항체 및 자성 나노입자가 결합된 전도성 고분자 나노 구조체는 소량의 혈액을 이용하여 초기 암환자의 혈중 암세포 및 다양한 종류의 혈중 암세포를 효율적으로 검출할 수 있으며, 비색 검출을 통하여 육안으로 혈중 암세포의 모니터링이 가능하다. 또한, 다량의 자성 나노입자의 탑재를 통해 발생되는 강한 자기장으로 인해 극미량으로 존재하는 혈중 암세포를 효율적으로 포획할 수 있다. 이에 더하여, 극소량 존재하는 혈중 암세포의 검출, 분리 및 회수에 있어서, 나노 와이어의 긴 구조 및 다양한 항체의 사용으로 인해, 암 세포와의 접촉을 늘릴 수 있으며 단단한 결합을 형성할 뿐만 아니라, 민감도가 향상되어, 암세포와 여러 상호 작용을 촉진함으로써, 종래 기술에 비하여 현저하게 증가된 검출 및 분리 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명에 따른 자성 나노 구조체는 암 조기 진단, 치료, 뿐만 아니라 혈중 암세포로부터 DNA를 추출하여 유전자 변이 진단 서비스로의 활용이 기대된다.
도 1a는 본 발명의 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 입자(Ab mixture_mPpyNPs)의 전자주사현미경 이미지 결과이다.
도 1b는 본 발명의 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs)를 이용하여 혈중 암세포를 검출 및 분리하는 방법에 대한 개념적 모식도이다.
도 1c는 본 발명의 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs)의 전자주사현미경 이미지 결과이다.
도 1d는 본 발명의 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs)의 평균 길이 분포를 나타낸 것이다.
도 1e는 본 발명의 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs)의 전자투과현미경 이미지 결과이다.
도 1f는 본 발명의 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs) 및 자성 나노 입자(MNPs)의 횡축 이완 값을 나타낸 결과이다.
도 1g는 본 발명의 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs) 및 자성 나노 입자(MNPs)의 자기 이력 곡선(magnetic hysteresis loop)을 나타낸 결과이다.
도 2a는 본 발명의 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs) 및 단일항체를 사용한 나노 와이어(EpCAM_mPpyNWs)의 세포 포집 효율을 비교한 결과이다.
도 2b는 본 발명의 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs)의 다양한 세포 포집 효율을 나타낸 결과이다.
도 2c는 최적 세포 포집을 위한 본 발명의 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs)의 농도를 확인한 결과이다.
도 2d는 본 발명의 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs)의 세포 포집을 도식한 것이다.
도 2e는 본 발명의 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 입자(Ab mixture_mPpyNPs) 및 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs)의 세포 포집 효율을 비교한 결과이다.
도 3a는 본 발명의 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs)를 이용하여 초기 유방암 환자의 혈액으로부터 혈중 암세포를 포집한 결과이다.
도 3b는 본 발명의 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs)를 이용하여 초기 단계의 유방암 환자의 혈액으로부터 혈중 암세포를 포집하여 면역형광분석을 수행한 결과이다.
도 3c는 본 발명의 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs)를 이용하여 초기 유방암 환자의 혈액으로부터 혈중 암세포를 포집하여 면역조직화학 분석을 수행한 결과이다.
도 3d는 본 발명의 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs)를 이용하여 초기 유방암 환자의 혈액으로부터 혈중 암세포를 포집하여 전자주사현미경을 통해 분석한 결과이다.
도 4a 및 도 4b는 글루타치온 화합물을 이용하여 본 발명의 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs)에 포획된 혈중 암세포를 회수한 결과이다.
도 5a는 본 발명의 HRP 및 anti-EpCAM 혼합물 (HRP-loaded/anti-EpCAM)이 결합된 폴리피롤 자성 나노 입자(Ppy NP)를 이용하여 현장 육안 검출이 가능한 비색 면역 반응을 도식한 것이다.
도 5b 및 도 5c는 본 발명의 HRP 및 anti-EpCAM 혼합물 (HRP-loaded/anti-EpCAM)이 결합된 폴리피롤 자성 나노 입자(Ppy NP)를 이용하여 초기 암환자의 샘플에서 포집된 혈중 암세포의 비색 육안 검출을 수행하고, UV 분광광도계로 분석한 결과이다.
도 6a는 본 발명의 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs)를 이용하여, 환자의 암 조직에서 검출된 EGFR Exon 21 L858R 유전자 변이를 암환자의 혈액에서 포집된 CTCs에서도 동일하게 확인한 결과이다.
도 6b는 암환자의 혈액에서 포집된 혈중 암세포(CTCs)의 EGFR Exon 21 L858R 유전자 변이를 디지털 PCR (Digital PCR)로 확인한 결과이다.
본 발명에서 사용되는 용어, "혈중 암세포"는 종양세포의 일부가 원발암에서 떨어져 나와 혈관이나 림프관에 유입되어 다른 조직이나 장기로 이동하는 암의 과정에서 발견되는 세포를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "암세포"의 종류에는 제한이 없으며, 본 발명의 상기 혈중 암세포는 순환종양세포(Circulating tumor cell; CTC) 또는 순환종양줄기세포(Circulating Tumor Stem Cell; CTSC)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "암"의 종류에는 제한이 없으며, 간암, 대장암, 직장암, 자궁내막암, 난소암, 신우암, 췌장암, 소장암, 간췌담도암, 위암, 뇌종양 및 유방암 등을 포함한다.
본 발명의 상기 "항체"는 그 종류에 있어서 제한이 없으나, anti-EpCAM(anti-Epithelial cell adhesion molecule), anti-EGFR(anti-Epidermal growth factor receptor), anti-N-cadherin, anti-TROP2(anti-trophoblast cell-surface antigen) 또는 anti-vimentin 을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 항체는 항체 혼합물일 수 있으며, 본 발명의 항체 혼합물은 anti-EpCAM(anti-Epithelial cell adhesion molecule), anti-EGFR(anti-Epidermal growth factor receptor), anti-N-cadherin, anti-TROP2(anti-trophoblast cell-surface antigen) 및 anti-vimentin 을 포함할 수 있다.
또한, 상기 항체 혼합물은 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase; HRP)를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 전도성 고분자는 폴리아세틸렌(polyacetylene), 폴리피롤(polypyrrole), 폴리티오펜(polythiophene), 폴리피닷(PEDOT: poly(3,4-ethylenedioxythiophene), 폴리아닐린(polyaniline) 또는 이들의 유도체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 전도성 고분자는 다량의 자성 나노 입자를 탑재하며, 비오틴이 부착된 항체가 결합된 전도성 고분자를 포함하는 나노 구조체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 나노 구조체는 나노 와이어, 나노 막대 또는 나노 입자일 수 있으며, 바람직하게는 나노 와이어일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 나노 구조체는 다량의 자성 나노 입자를 탑재하여, 같은 철(Fe) 농도에서 나노 입자보다 큰 횡축이완 값(transverse relaxation rate; R2)을 가지며, 보다 구체적으로 본 발명의 자성 나노 와이어는 20 내지 60 mMFeS-1의 횡축이완 값을 가질 수 있으며, -90 내지 90 emu/g의 포화자화 값을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 나노 와이어는 100㎚ 내지 300㎚의 직경을 가질 수 있고, 5㎛ 내지 30㎛의 길이일 수 있으며, 평균 17㎛의 길이를 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 혈중 암세포의 검출 및 분리방법을 제공한다. 보다 구체적으로 (1) 본 발명의 나노 구조체를 대상 시료에 처리하는 단계; 및 (2) 자석에 의해 생성된 자기장을 이용하여 상기 나노 구조체로부터 상기 혈중 암세포를 검출하는 단계를 포함할 수 있으며, 화합물을 이용하여 상기 나노 구조체로부터 상기 혈중 암세포를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 혈중 암세포 검출 및 분리방법에서 상기 화합물은 글루타치온(glutathione)일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 이황화결합을 끊을 수 있는 효과를 가진다면 어떠한 물질을 사용하여도 무방하다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 혈중 암세포의 비색검출방법을 제공한다. 보다 구체적으로, (1) 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase; HRP)를 더 포함하는 본 발명의 나노 구조체를 대상 시료에 처리하는 단계; 및 (2) 상기 나노 구조체의 색을 육안으로 판단하는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 나노 구조체의 색변화를 분광계 또는 색도계로 측정하여, 대상 시료 내의 혈중 암세포의 농도를 정량하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 시료는 혈액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 혈중 암세포 검출 및 회수용 나노 구조체를 포함하는 암 진단키트를 제공한다. 보다 구체적으로, 상기 진단키트는 바이오센서일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 암의 발병 및/또는 예후를 진단하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 상기 방법은 본 발명의 혈중 암세포 검출 및 회수용 나노 구조체로부터 검출한 혈중 암세포로부터 DNA를 추출 또는 분리하여 분석하는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 분석은 시료 중 DNA의 농도, 카피 수 또는 염기서열을 분석하여 유전자 변이 여부를 확인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 혈중 암세포 검출 및 회수용 나노 구조체를 포함하는 암 진단 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 상기 방법은 본 발명의 혈중 암세포 검출 및 회수용 나노 구조체로부터 검출한 혈중 암세포로부터 DNA를 추출 또는 분리하여 분석하는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 분석은 시료 중 DNA의 농도, 카피 수 또는 염기서열을 분석하여 유전자 변이 여부를 확인할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 구조체의 제조
1-1. 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 입자( Ab mixture_ mPpyNPs )의 제조
히알루론산(Hyaluronic acid)이 결합된 폴리피롤(Ppy) 나노 입자의 합성을 위해, 초순수(ultrapure water) 3.125 ㎖에 폴리비닐피롤리돈(Polyvinyl pyrrolidone; PVP, M.W: 29,000) 0.125 g을 용해시킨 후, 30 분 동안 실온에서 강하게 교반하였다. 이후, 16.25 ㎖의 피롤(pyrrole) 및 1.5 ㎖의 10 ㎚의 자성 나노 입자를 부드럽게 교반하면서 첨가하였다. 10분 후, 125 ㎕의 염화제이철6수화물(iron(II) chloride hexahydrate, 0.75 g/㎖) 및 100 ㎎의 히알루론산(40K)을 신속하게 첨가하고, 상온에서 3시간 동안 중합시켰다. 생성물은 2일 동안 투석에 의해 정제한 후, 정제한 용액을 동결 건조하여 사용할 때까지 진공상태로 보관하였다. 그 후, 약 2 ㎎의 히알루론산이 결합된 폴리피롤 나노 입자(HA-Ppy NPs)를 1 ㎖의 0.4 M EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride) 및 0.1 M NHS(N-hydroxy succinimide)로 45분 동안 혼합한 후 17,000 rpm에서 원심분리 하였다. 마지막으로, 10 ㎕/㎖의 농도로 혼합된 비오틴이 부착된 항체(EpCAM, EGFR, N-cadherin, TROP-2 및 vimentin)와 결합할 10 ㎕/㎖의 스트렙타비딘 1㎖에 히알루론산이 결합된 폴리피롤 나노 입자(HA-Ppy NPs)를 재현탁하였다. 제조한 용액을 다시 17,000 rpm에서 원심분리하고 사용할 때까지 초순수(ultrapure water)에 보관하였다.
그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 주사전자현미경(SEM) 이미지를 통해 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 입자(Ab mixture_mPpyNPs)가 제조된 것을 확인하였다.
1-2. 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNW)의 제조
다공성 알루미나 주형(AAO template, Whatman, pore diameter, 200 ㎚)의 한쪽 면에 약 150 ㎚ 두께의 금(Au)층을 가열증발(thermal evaporation)시켜 증착시켰다. 모든 전기화학적 실험은 금(Au) 코팅된 AAO 주형에서 백금 와이어 상대전극과 Ag/AgCl(3.0 M NaCl type) 비교전극을 구비한 potentiostat/galvanostat(BioLogic SP-150)를 사용하여 측정하였다. 도 1b에 도식한 바와 같이, 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs)의 제조를 위하여, 상온에서 30 ㎕의 자성 나노 입자(~10 ㎚ in a diameter)를 금(Au) 코팅된 AAO 디스크 위에 부착시켜 AAO의 기공(pore)에 도입하였다. 자성 나노 입자가 높은 밀도로 도핑(doping)된, 다섯 가지 유형의 항체가 결합된 폴리피롤(Ppy) 나노 와이어의 제조를 위해, AAO 주형의 기공에 0.01M 폴리(4-스티렌설폰산)(poly(4-styrene sulfonic acid)) 및 1 ㎎/㎖ NHS-SS-biotin (Succinimidyl-2-(biotinamido)-ethyl-1,3'-dithiopropionate)을 함유하는 0.01 M 피롤용액과 함께 1.0 V (vs. Ag/AgCl)에서 7분 동안 크로노암페로메트리(chronoamperometry)를 적용하여 전기 화학적 증착을 수행하였다. 그 후, 자성 나노 입자 및 SS-biotin 분자가 도핑된 프리-스탠딩 폴리피롤 나노 와이어(free-standing Ppy NWs)를 얻기 위해 AAO 주형을 초순수(ultrapure water)로 여러 번 세척하고, 2M의 수산화나트륨(NaOH) 용액에 담갔다. 이어서, 폴리피롤 나노와이어(Ppy NWs)의 카복실산(-COOH; carboxylic acid)기를 활성화하기 위해 폴리피롤 나노와이어(Ppy NWs)에 30 mM의 EDC 및 6 mM의 NHS(N-hydroxy succinimide)를 첨가하였다. 생성된 폴리피롤 나노와이어(Ppy NWs)를 스트렙타비딘 (10 ㎍/㎖)과 함께 추가로 45분 동안 배양한 다음 물로 세척하였다. 이어서, 비오틴이 부착된 항체 혼합물(즉, biotinylated anti-EpCAM, biotinylated anti-EGFR, biotinylated anti-N-cadherin, biotinylated anti-TROP-2 및 biotinylated anti-vimentin, (10 ㎍/㎖ in PBS))을 폴리피롤 나노 와이어(Ppy NWs)의 말단에 스트렙타비딘이 도입된 폴리피롤 나노 와이어(Ppy NWs)와 함께 4℃에서 밤새 반응시켜 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNW)를 제조하였다. 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNW)의 형태(morphology)는 가속 전압 15 kV의 주사전자현미경(G2F30, Tecnai) 및 300 kV의 투과전자현미경을 이용하여 관찰하였다. 자기력 측정은 SQUID-VSM magnetometer(MPMS-VSM, Quantum design)를 이용하여 상온에서 수행하였다. 자기장은 70 내지 70kOe의 세기로 변화시켜 인가하였고, 횡축이완시간(transverse relaxation time, T2)은 7 테슬라(Tesla) MRI(Bruker BioSpin MRI GmbH; echo time[TE]=6.5 ㎳ 및 repetition time[TR]=1,600 ㎳)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이, 주사전자현미경(SEM) 이미지(스케일바 10㎛)를 통해 약 200 ㎚의 직경 및 약 16 ㎛의 평균 길이를 갖는 비교적 긴 길이의 나노 와이어 합성을 확인하였고, 도 1d에 나타낸 바와 같이, 제조된 나노 와이어의 평균 길이 분포를 확인하였다.
또한 도 1e에 나타낸 바와 같이, 전자투과현미경 (TEM) 이미지(스케일바 50㎚)를 통해 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNW) 안에 자성 나노 입자(<10 ㎚의 직경)가 불규칙하게 분포(randomly distributed)되고, 밀도있게 배열된 상태로 매립되어 있음을 확인하였다.
또한, 도 1f에 나타낸 바와 같이, 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNW) 및 자성 나노 입자(MNPs)의 자기공명영상 대비(magnetic resonance imaging contrast)를 측정한 결과, 제조된 나노 와이어(R2 = 53 mMFeS-1)는 나노 입자(R2 = 21 mMFeS-1)보다 큰 횡축이완 값(transverse relaxation rate; R2)을 가지는 것을 확인하였다.
또한, 도 1g에 나타낸 바와 같이, 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNW) 및 자성 나노 입자(MNPs)의 포화자화 값을 측정한 결과, 제조된 나노 와이어(Ms = 82 emu/g)는 나노 입자(Ms = 45 emu/g)보다 상당히 큰 포화자화 값(saturation magnetization value)을 가지는 것을 확인하였으며, 실제로 산화철 자성 나노 입자의 조립(assembly)으로 인하여, 나노 와이어의 자성(magnetism)이 더욱 상승(synergistic)하였으며, 나노 와이어의 공간적 제약(confined geometry)은 나노 와이어가 자기장에 더욱 민감하도록 하여, 각각의 나노 입자가 자기 모멘트를 배향함으로써, 궁극적으로 암세포의 분리에 있어서 정확한 제어 및 선택적인 조작이 가능하도록 하는 것을 예측할 수 있다.
실시예 2. 항체 혼합물의 사용에 따른 자성 나노 구조체의 세포 포집 효율 확인
2-1. 단일항체 또는 항체 혼합물이 결합된 자성 나노 와이어의 세포 포집 효율 비교
EpCAM-양성세포 (HCT116 대장암 세포, MCF7 유방암 세포) 및 EpCAM-음성세포 (MDA-MB-231 유방암 세포, MIA PaCa-2 췌장암 세포)는 American Type Culture Collection(ATCC)로부터 구입하였으며, DMEM 또는 10 %의 소태아혈청(FBS)이 첨가된 RPMI-1640에 100 unit/㎖의 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 배지에, 37 ℃에서 5 % CO2로 가습된 배양기에서 배양되었다. 세포 배양 시약은 Thermo Scientific Hyclone and Gibco에서 구입하였다. 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs) 및 단일항체(EpCAM 항체)가 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(EpCAM_mPpyNWs)의 세포 포집 효율을 평가하기 위해, 상기 실시예 1-2에 기재된 방법으로 항체가 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어를 제조하였다. EpCAM-양성세포(HCT-116, MCF7) 및 EpCAM-음성세포(MIA PaCa-2, MDA-MB-231)를 포함한 네 개의 상이한 세포를, 0.1% PBS(phosphate buffer saline)/BSA(bovine serum albumin) 또는 건강한 공여자로부터 얻은 전혈에 100 cells/㎖의 농도로 처리한 후, 30분 동안 상온에서, 세포 현탁액에 자성 나노 와이어를 첨가하여, 표적 세포가 포집되도록 부드럽게 교반시킨 후 배양하였다. 이후, 자석에 의해 생성된 자기장을 이용하여 포집된 세포를 효율적으로 분리하기 위해, 1.5 ㎖의 마이크로원심분리 튜브를 사용하여, 포집된 세포를 분리하였다. 자석을 이용한 분리는 사마륨 및 코발트 자석(samarium/cobalt magnet)을 포함하는 MagneSphereㄾ Technology Magnetic Separation Stands (Promega, USA)로 수행하였으며, 대략 128 내지 264 kJ/m3에 해당하는 16 내지 33 megagauss-oersteds (MGOe) 에너지(BHmax) 범위로 세포의 분리를 수행하였다.
상층액을 제거한 후, 수집한 세포를 1 × PBS로 세척하고, RPMI-1640 배지에 재현탁 시킨 후, 6-well plate의 커버글라스(cover glass)로 옮겼다. 회수한 세포의 평가를 위해, 염료가 도입된 FITC-anti-EpCAM, Cy3-conjugated anti-CD44 및 Alexa 680-conjugated anti-CD45의 항체를 이용하여 면역 염색을 시행하였다. 염료가 도입된 항체를 제조하기 위해, 항체 및 NHS(N-hydroxy succinimide) 염료(항체:NHS 염료 = 1:2 내지 1:8 molar ratio)는 50 ㎕의 항체에 1 × PBS를 300 ㎕가 되도록 첨가하였다. 이후, 어두운 상온 조건에서 1 시간 동안 부드럽게 혼합하였다. 반응하지 않은 NHS 염료를 제거하기 위해, PD Minitrap G-25 (GE Healthcare, 17-0851-01)을 이용하여 용액의 염분을 제거한 후, Amicon Ultra Centrifugal Filters-30K (Millipore, UFC 503024)를 이용하여 농축한 뒤, 사용하기 전까지 4℃로 보관하였다. 그 후, 커버글라스 위에 회수한 세포를 시딩(seeding)한 후, 형광 염료가 결합된 항체 (FITC-anti-EpCAM, Cy3-conjugated anti-CD44 및 Alexa 680-conjugated anti-CD45) 0.1 μM를 세포 배지에 첨가하고, 37 ℃, 5% CO2 조건의 배양기(incubator)에서 배양하였다. 고정된 세포는 핵을 식별하기 위해 DAPI로 염색하고 PBS로 여러 차례 세정하였다. 표지화 된 세포는 Zeiss LSM 710 ConfoCor 3 형광 현미경으로 관찰하여, 상기 폴리피롤 자성 나노 와이어의 세포의 포집 효율을 확인하였다.
그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs)를 사용하였을 때, 종양 세포의 EpCAM 상태에 관계없이 상당히 높은 포집 효율을 달성한 것을 확인하였다. 한편, EpCAM 단일항체가 결합된 자성 나노 와이어(EpCAM_mPpyNWs)의 경우, MCF7 세포에 있어서 83 %의 최대 포집 효율을 보였지만, 비상피성 세포주의 분리에 있어서 매우 제한된 효율을 보였다.
또한, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs)는 여러 종류의 항체가 나노 와이어 사이의 작용 및 인식을 형성하여 상이한 표현형 및 다양한 농도의 암 세포와 밀착성을 높일 수 있음을 확인하였다.
2-2. 최적의 세포 포집을 위한 자성 나노 와이어의 농도 확인
최적의 세포 포집 효율을 보이는 자성 나노 와이어의 농도를 확인하고자, 상기 실시예 1-2의 방법으로 제조한 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs)를 이용하여, HCT 116 세포를 20 cells/㎖의 농도로 0.1% BSA/PBS에 처리한 후, 자성 나노 와이어의 농도를 달리하여 세포의 포집 효율을 확인하였다.
그 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이, HCT 116 세포주(HCT 116 cell line)의 포집 효율에 영향을 미치는 나노 와이어의 효과적인 농도를 결정하였다. 표적 암 세포에 대해 96 %의 포집 효율로 0.9 ㎎/㎖의 최대 수율을 나타내다가 나노 와이어의 응집과 얽힘의 결과로 점차 감소한 것을 확인하였다.
2-3. 자성 나노 입자 및 자성 나노 와이어의 세포 포집 효율 비교
자성 나노 구조체 및 세포의 직접적인 상호작용을 통해 포집 성능을 비교하고자, 상기 실시예 2-1의 방법으로 세포를 처리하고, 두 개의 서로 다른 세포주(EpCAM-양성 HCT116 세포 및 EpCAM-음성 MDA-MB-231 세포)를 이용하여 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs) 및 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 입자(Ab mixture_mPpyNPs)의 포집 효율을 비교하였다.
그 결과, 도 2d 및 도 2e에 도식한 바와 같이, 나노 와이어 기반의 접근법은 구형 나노 입자에 비해 표적 세포의 분리에 큰 영향을 주는 것을 확인하였다. 나노와이어의 연장된 구조는 충분한 양의 항체를 수용할 수 있는 공간(site)을 제공하고, CTC 포획에 있어서 민감도를 부여하여 손쉽게 특정한 암 세포의 여러 상호 작용을 촉진함으로써 상당한 이점을 제공할 수 있음을 확인하였다. 또한 나노 와이어의 비교적 긴 길이로 인해, 세포 표면을 랩핑(wrapping)함으로써 단단한 결합을 형성하여, 나노 와이어 및 암 세포 간의 결합 활성을 현저하게 조절할 수 있으며, 궁극적으로 향상된 포집 효율을 이끈다.
실시예 3. 나노 와이어 구조체를 이용한 유방암 환자의 혈액 내에 존재하는 세포 포집 효율 확인
3-1. 포집된 세포의 면역형광염색 확인
유방암 환자의 말초 혈액으로부터 희귀 순환종양세포(CTC)를 분리하여, 폴리피롤 나노 와이어 구조체의 성능을 평가하고자, 총 29명의 암 환자의 혈액을 검사하였다. 전혈은 국립암센터(NCC) 임상시험심사위원회의 승인 절차에 따라 anti-coagulant EDTA와 함께 진공채혈기 튜브에 수집하였다. 임상 적용을 위해, 18명의 건강한 지원자 및 초기 단계의 유방암 환자 29명으로부터 혈액 샘플을 수집했다. 대부분의 환자는 국소적인 초기 유방암(단계 I 및 II)이었고, 29명 중에 6명은 수술 전에 보조항암화학요법을 받았다. 별로도 처리되지 않은 환자의 혈액 250㎕∼1㎖의 샘플을 이용하여 CTC 분리 및 분석을 수행하였다. 또한, 대조군으로 건강한 기증자의 말초 혈액 250㎕∼1㎖를 사용하여 CTC 검출을 평가하였다. 환자 샘플에서 포획한 세포는 주변의 백혈구와 구별하기 위하여 DAPI, anti-EpCAM, anti-CD44, anti-vimentin 및 anti-CD45 항체를 이용하여 면역조직학적 분석을 통해 확인하였다. 상기 실시예 2-1의 방법으로 세포의 포집을 확인한 뒤, 포집된 세포는 커버 슬립 플레이트에 옮긴 후, 3.7% 15분 동안 파라포름알데하이드(PFA)로 고정시키고, 0.3% Triton X-100로 10분 간 투과한 후, 5% BSA/PBS 블로킹 용액으로 30분 간 배양하였다. 이어서, anti-EpCAM, anti-CD44, anti-vimentin 및 anti-CD45의 항체를 90 분간 커버 슬립에서 배양하였다. 그 후, Alexa Fluor 488 (Invitrogen; 녹색, EpCAM) 또는 Alexa Fluor 647 (Invitrogen; 적색 CD44, vimentin 및 CD45)가 결합된 이차 항체를 커버 슬립에 추가하였다. 40 분 후, 세포를 Hoechst 33342 (Invitrogen; 청색, 핵)로 염색하고, PBS로 세척하였다. 표지된 세포는 LSM 501 META 공초점현미경(Carl Zeiss, Germany)을 사용하여 분석하였다. 면역형광이미지에서 세포는 DAPI(핵, 청색), CD45(조혈, 적색), EpCAM(상피, 녹색) 및 CD44 또는 vimentin(중간엽, 적색)으로 염색하여, 주변의 백혈구와 구별하였고, 모든 실험은 다섯 번 반복 수행하였다.
그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 모든 암 환자의 혈액 샘플에서 CTCs를 확인하였다. 또한 비-특이적으로 결합된 백혈구의 수가 낮은 것(< 5 WBCs/250 ㎕ of blood)을 발견하여, 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs)가 CTCs의 포집에 매우 선택적이며, 백혈구 제거에 매우 효율적임을 확인하였다. 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs)를 사용하여, 비 전이성 유방암 환자의 혈액 250 ㎕에서 CTCs를 성공적으로 분리해냈다. 한편, 혈액의 양을 250㎕에서 1㎖로 증가하여 CTCs를 분리하였더니, 발견되는 CTCs의 수가 점차적으로 증가하였으나, 18명의 건강한 공여자 중에서 16명은 CTCs가 식별되지 않은 반면, 건강한 공여자 2명의 1㎖ 혈액에서 1 내지 2개의 CTCs가 검출되었다.
또한 도 3b에 나타낸 바와 같이, 면역형광이미지를 확인한 결과, 기준(gold standard)으로써, CTCs는 상피 기원 마커(DAPI+/EpCAM+/CD45-발현)의 표현형 발현으로 분류되었으며, 반면에 백혈구는 DAPI+/EpCAM-/CD45+의 표시로 정의하였다. 많은 수의 CTCs는 CTCs의 대부분이 강한 전이성과 상관관계를 나타내는 상피 및 중간엽 마커(예를 들면, CD44 또는 vimentin)와 함께 발현되었다.
3-2. 포집된 세포의 면역조직화학 확인
상기 실시예 2-1의 방법으로 세포를 포집한 뒤, 포집된 세포의 면역조직화학 분석을 수행하고자, 면역화학염색을 실시하였다. 포집된 세포는 상피 마커인 EpCAM 및 다이아미노벤지딘(diaminobenzidine; DAB)으로 염색하였으며, 헤마톡실린(hematoxylin)으로 대조 염색 하였다. 또한, SuperPicture 3rd Gen IHC 검출 키트(Invitrogen)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하였으며, 포집된 세포는 glass slide에서 400ㅧ의 배율의 현미경(Olympus BX52 microscope) 및 Aperio ImageScope 이미지 분석 프로그램을 이용하여 수행하였다.
그 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이, CTCs는 DAB-기질 반응 결과, 갈색으로 나타났으며, 핵(Nuclei)은 헤마톡실린 대조 염색 결과, 청색으로 염색되어, 면역조직화학 이미지(스케일바 10㎛)를 통한 포획된 CTC를 확인하였다.
3-3. 포집된 세포의 주사전자현미경 확인
항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs)에 의해 포집된 CTCs의 형태학적 분석을 수행하고자, 초기 유방암 환자로부터 포집한 CTCs를 주사전자현미경으로 확인하였으며, 5kV 가속전압의 SEM(JSM-6701F, JEOL)에 의해 형태(morphology)를 관찰하였다. 상기 포집된 세포를 2시간 동안 3.7% 파라포름알데하이드(PFA)로 고정하고, 탈수를 위해 15분마다 에탄올의 농도(50 %, 70 %, 90 %, 100 %)를 증가시켜가며 노출 시킨 후, 공기로 완전히 건조 시켰다. 샘플을 SEM 현미경으로 검사하기 전에 platinum gold로 스퍼터 코팅하였다.
그 결과, 도 3d에 나타낸 바와 같이, 초기 유방암 환자의 포집된 CTCs를 전자주사현미경(SEM) 이미지(스케일바 5㎛)를 통해 확인하였다.
실시예 4. 화합물을 이용한 폴리피롤 자성 나노 와이어의 세포 회수 확인
항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs)에 포집된 세포를 회수하고자, 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs)에 포집된 세포에 50 mM의 글루타치온(GSH) 용액으로 60분 동안 500 rpm으로 진탕 처리하였다. 세포의 성장과 증식을 모니터링하기 위해 방출된 세포를 24-well plate에 접종하였다.
그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 나노 와이어의 내부 도펀트로서 배치된 SS-비오틴 잔기로 인해, 세포의 손상 없이 세포를 분리할 수 있었다. SS-비오틴의 이황화결합을 끊음으로써, 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs)로부터 포획된 세포를 용이하게 회수하여, GSH 화합물을 이용한 세포의 회수를 확인하였다. 또한 도 4b에 나타낸 바와 같이, 나노 와이어로부터 세포가 방출된 24시간 후, 세포의 성장과 증식을 관찰함으로써, GSH 화합물의 처리는 세포의 사멸에 영향을 끼치지 않는 것을 확인하였다.
실시예 5. 비색면역반응을 통한 혈중 암세포의 육안 검출 평가
상기 실시예 3의 초기 암환자의 샘플에서 포집된 혈중 암세포(CTCs)의 이미지 분석을 위해 대표적인 상피 마커를 이용하여 고정한 후 면역 염색을 수행하였으나, 이 방법은 복잡하고 시간이 많이 소요되며 많은 절차를 거쳐야 하므로, 현장 육안 검출 전략을 도입하여 통해 빠르고 신뢰할만한 암 세포의 존재를 예측할 수 있는 간단한 비색 면역 반응을 도 5a에 도식하여 제시하였다
초기 암환자의 샘플에서 포집된 혈중 암세포의 비색 육안 검출을 수행하고자, 히알루론산이 결합된 폴리피롤 자성 나노 입자(HA-PPY NP) 약 2 mg을 1㎖의 0.4 M EDC 및 0.1 M NHS와 45분 동안 혼합한 후, 용액을 17,000 rpm에서 과량의 화학 물질을 제거하기 위해 원심분리 하였다. 그 후, 1㎎의 HRP 및 20㎍의 biotinylated anti-EpCAM (무게비; HRP:anti-EpCAM = 50:1)을 밤새 4 ℃에서 초음파 진동의 조건에서 혼합하였다. 반응하지 않고 남은 잔여 시약은 PD10 컬럼 (GE Healthcare)으로 겔 필터(gel filtration)하여 제거하였다. 이 후, 체외(in vitro) 비색 검출을 위해, 세포에 약 0.15 ㎎의 HRP 및 anti-EpCAM 혼합물(HRP-loaded/anti-EpCAM)이 부착된 폴리피롤 자성 나노 입자(Ppy NP)를 첨가하여, 0 cells/㎖, 3 cells/㎖, 10 cells/㎖, 20 cells/㎖, 50 cells/㎖, 102 cells/㎖ 및 103 cells/㎖의 밀도로 96-well plates에 접종한 후, 플레이트를 10분 간 37℃, 5% CO2 의 가습 배양기에서 유지하였다. 세척을 위해 PBS, 10 mM 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine(TMB) 기질 용액 10 ㎕, 0.1 M H2O2 10 ㎕ 및 0.2 M 아세트산나트륨 완충액 80 ㎕ (pH 5.0)를 어두운 곳에서 3분 간 상온의 조건에서 상기의 분산액에 첨가하였다. 포획된 세포의 숫자와 흡광도 사이의 관계를 확인하기 위해 UV-검출법을 사용하여 652㎚의 파장에서 DU 730 UV-Vis spectrophotometer (Beckman Coulter, USA) 분광광도계로 측정하였다. 임상 샘플은 건강한 기증자 또는 유방암 환자의 혈액 샘플로부터 6-well plates로 옮겨 동일한 UV-vis spectroscopy 분광법을 사용하여 분석하였다.
그 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이, TMB 기질 용액을 세포 현택액에 첨가하여 즉시 반응을 일으킨 결과, 궁극적으로 자성 나노 입자에 포획된 암 세포의 수에 비례하는 색상 신호를 검출할 수 있었다. CTC 검출 및 계산을 위한 비용 효율적인 사전 평가 도구로서, 명확한 색상의 변화는 직접적으로 환자의 혈액에서 CTCs의 존재 혹은 부재를 암시할 뿐만 아니라, 분석 후, 생존 세포의 회수에 있어 해롭지 않은 방법이다. 또한 도 5c에 나타낸 바와 같이, 652 ㎚의 흡광도에서 포획된 암 세포의 수가 증가함으로써 확연한 색 변화를 동반하였으며, 암 세포의 검출에 있어서 충분히 민감하고 선택적임을 확인하였다.
실시예 6. 회수된 혈중 암세포의 유전자 변형 확인
항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs)를 이용하여, 암환자의 혈액에서 포집된 혈중 암세포(CTCs)의 EGFR Exon 21 L858R 유전자 변이를 분석하기 위해, DNA를 추출한 후 digital PCR을 이용하여, 암 조직에서 검출된 EGFR Exon 21 L858R 유전자 변이와 비교하였다.
그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항체 혼합물이 결합된 폴리피롤 자성 나노 와이어(Ab mixture_mPpyNWs)를 이용하여, 환자의 암 조직에서 검출된 EGFR Exon 21 L858R 유전자 변이를 암환자의 혈액에서 포집된 CTCs에서도 동일하게 확인하였으며, 도 6b에 나타낸 바와 같이, 3번 환자의 혈액에서 포집된 혈중 암세포(CTCs)의 EGFR Exon 21 L858R 유전자 변이를 디지털 PCR (Digital PCR)로 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (19)

  1. 전도성 고분자를 포함하는 혈중 암세포 검출 및 회수용 나노 와이어로서, 상기 전도성 고분자는 항체가 결합되고 자성 나노 입자가 탑재된 전도성 고분자이며,
    상기 항체는 anti-EpCAM(anti-Epithelial cell adhesion molecule), anti-EGFR(anti-Epidermal growth factor receptor), anti-N-cadherin, anti-TROP2(anti-trophoblast cell-surface antigen) 및 anti-vimentin을 포함하는 항체 혼합물인 것을 특징으로 하는, 혈중 암세포 검출 및 회수용 나노 와이어.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 항체 혼합물은 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase; HRP)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 혈중 암세포 검출 및 회수용 나노 와이어.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 전도성 고분자는 폴리아세틸렌(polyacetylene), 폴리피롤(polypyrrole), 폴리티오펜(polythiophene), 폴리피닷(PEDOT: poly(3,4-ethylenedioxythiophene), 폴리아닐린(polyaniline) 또는 이들의 유도체인 것을 특징으로 하는, 혈중 암세포 검출 및 회수용 나노 와이어.
  6. 삭제
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 혈중 암세포는 순환종양세포(Circulating tumor cell; CTC) 또는 순환종양줄기세포(Circulating Tumor Stem Cell; CTSC)인 것을 특징으로 하는, 혈중 암세포 검출 및 회수용 나노 와이어.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 혈중 암세포는 순환종양세포(Circulating tumor cell; CTC)인 것을 특징으로 하는, 혈중 암세포 검출 및 회수용 나노 와이어.
  9. (1) 제 1항의 나노 와이어를 대상 시료에 처리하는 단계; 및
    (2) 자석에 의해 생성된 자기장을 이용하여 상기 나노 와이어로부터 상기 혈중 암세포를 검출하는 단계를 포함하는, 혈중 암세포의 검출 및 회수방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    화합물을 이용하여 상기 나노 와이어로부터 상기 혈중 암세포를 분리하는 단계를 더 포함하는, 혈중 암세포의 검출 및 회수방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 화합물은 글루타치온(glutathione)인 것을 특징으로 하는, 혈중 암세포의 검출 및 회수방법.
  12. 제 9항에 있어서,
    상기 시료는 혈액인 것을 특징으로 하는, 혈중 암세포의 검출 및 회수방법.
  13. (1) 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase; HRP)를 더 포함하는 제1항의 나노 와이어를 대상 시료에 처리하는 단계; 및
    (2) 상기 나노 와이어의 색을 육안으로 판단하는 단계를 포함하는, 혈중 암세포의 비색검출방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 나노 와이어의 색변화를 분광계 또는 색도계로 측정하여, 대상 시료 내의 혈중 암세포의 농도를 정량하는 단계를 더 포함하는, 혈중 암세포의 비색검출방법.
  15. 제 13항에 있어서,
    상기 시료는 혈액인 것을 특징으로 하는, 혈중 암세포의 비색검출방법.
  16. 제 1항의 혈중 암세포 검출 및 회수용 나노 와이어를 포함하는 암 진단키트.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 진단키트는 바이오센서인 것을 특징으로 하는, 암 진단키트.
  18. 제 1항의 혈중 암세포 검출 및 회수용 나노 와이어로부터 검출한 혈중 암세포로부터 DNA를 추출 또는 분리하여 분석하는 단계를 포함하는, 암의 발병 또는 예후를 진단하기 위한 정보 제공 방법.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 분석은 시료 중 DNA의 농도, 카피 수 또는 염기서열을 분석하여 유전자 변이 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020160107979A 2016-08-24 2016-08-24 항체 및 자성 나노 입자가 결합된 전도성 고분자를 포함하는 혈중 암세포 검출 및 회수용 자성 나노 구조체 KR101994370B1 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160107979A KR101994370B1 (ko) 2016-08-24 2016-08-24 항체 및 자성 나노 입자가 결합된 전도성 고분자를 포함하는 혈중 암세포 검출 및 회수용 자성 나노 구조체
US15/246,615 US20180059114A1 (en) 2016-08-24 2016-08-25 Magnetic nanostructure for detecting and isolating circulating tumor cells comprising antibody- and magnetic nanoparticle-conjugated conductive polymer
JP2017026925A JP6509926B2 (ja) 2016-08-24 2017-02-16 抗体および磁性ナノ粒子が結合された導電性高分子を含む血中のがん細胞の検出および回収用の磁性ナノ構造体

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160107979A KR101994370B1 (ko) 2016-08-24 2016-08-24 항체 및 자성 나노 입자가 결합된 전도성 고분자를 포함하는 혈중 암세포 검출 및 회수용 자성 나노 구조체

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180022490A KR20180022490A (ko) 2018-03-06
KR101994370B1 true KR101994370B1 (ko) 2019-06-28

Family

ID=61242149

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020160107979A KR101994370B1 (ko) 2016-08-24 2016-08-24 항체 및 자성 나노 입자가 결합된 전도성 고분자를 포함하는 혈중 암세포 검출 및 회수용 자성 나노 구조체

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20180059114A1 (ko)
JP (1) JP6509926B2 (ko)
KR (1) KR101994370B1 (ko)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106537234A (zh) 2014-04-07 2017-03-22 加利福尼亚大学董事会 高度可调节的磁性液晶
CN111100839B (zh) * 2018-10-29 2024-03-08 猎源（上海）生物医药科技有限公司 EGFR/Vimentin/叶酸免疫脂质体磁球、制备方法及试剂盒
KR20200084803A (ko) * 2019-01-03 2020-07-13 주식회사 제놉시 항체가 결합된 엑소좀 분리용 나노와이어 및 이를 이용한 엑소좀 분리 방법
KR102346111B1 (ko) * 2020-02-07 2022-01-03 주식회사 싸이토딕스 Ctc 분리용 마그네틱 비드 및 이를 이용한 ctc 분리방법
CN111856022A (zh) * 2020-07-01 2020-10-30 山东凯歌智能机器有限公司 一种检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin表达的试剂盒及检测方法
CN112011434B (zh) * 2020-08-26 2022-01-04 武汉大学 一种用于富集循环肿瘤细胞的红细胞仿生涂层
CN112370537B (zh) * 2020-11-15 2023-08-11 大连理工大学 一种双靶向磁性荧光纳米微球、其制备方法及在肝癌循环肿瘤细胞中的应用
CN115404220A (zh) * 2021-05-27 2022-11-29 中国科学院化学研究所 一种分离富集循环肿瘤细胞的多肽功能化微纳界面材料及其制备方法和应用
WO2023115171A1 (pt) * 2021-12-20 2023-06-29 Universidade Federal de Uberlândia Método, painel e kit para o diagnóstico e monitoramento do tratamento de pacientes com câncer de mama
CN115219569B (zh) * 2022-06-22 2024-03-12 郑州大学 人工酶检测肿瘤细胞的传感器及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010504532A (ja) * 2006-09-21 2010-02-12 プロメテウス ラボラトリーズ インコーポレイテッド 希少循環細胞における多様なシグナル伝達物質検出のための抗体に基づくアレイ
US20120045748A1 (en) 2010-06-30 2012-02-23 Willson Richard C Particulate labels

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5998224A (en) * 1997-05-16 1999-12-07 Abbott Laboratories Magnetically assisted binding assays utilizing a magnetically responsive reagent
JP2002350443A (ja) * 2001-05-23 2002-12-04 Nitto Denko Corp 免疫測定法
JP4593557B2 (ja) * 2003-02-27 2010-12-08 ベリデックス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 循環腫瘍細胞（ｃｔｃ）：転移癌患者における増悪までの時間、生存および療法に対する応答の早期評価
JP2005090992A (ja) * 2003-09-12 2005-04-07 Abbott Japan Co Ltd 安定化固相化抗ｓｃｃ抗体試薬
US8614466B2 (en) * 2008-11-18 2013-12-24 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Semiconductor for measuring biological interactions
US20110171749A1 (en) * 2009-03-02 2011-07-14 Board Of Trustees Of Michigan State University Nanoparticle tracer-based electrochemical dna sensor for detection of pathogens-amplification by a universal nano-tracer (aunt)
EP2411808B1 (en) * 2009-03-24 2015-11-11 Biocept, Inc. Devices and methods of cell capture and analysis
EP2492351B1 (en) * 2009-07-30 2018-06-06 Fundacion Cidetec Electrochemical sensor for the detection of analytes in liquid media
JP5808349B2 (ja) * 2010-03-01 2015-11-10 カリス ライフ サイエンシズ スウィッツァーランド ホールディングスゲーエムベーハー セラノーシスのためのバイオマーカー
KR101878749B1 (ko) * 2010-03-05 2018-07-17 삼성전자주식회사 표적 세포의 분리 방법 및 키트
WO2012016136A2 (en) * 2010-07-30 2012-02-02 The General Hospital Corporation Microscale and nanoscale structures for manipulating particles
US10739337B2 (en) * 2011-08-30 2020-08-11 Board Of Trustees Of Michigan State University Extraction and detection of pathogens using carbohydrate-functionalized biosensors
KR101355985B1 (ko) * 2011-11-29 2014-01-29 (주)유 바이오메드 다중 암 진단용 조성물
WO2015048315A1 (en) * 2013-09-25 2015-04-02 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable layer-by-layer (lbl) films for cell capture and release
KR101545160B1 (ko) * 2013-11-25 2015-08-19 국립암센터 전도성 고분자를 포함하는 세포의 검출 및 회수용 조성물

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010504532A (ja) * 2006-09-21 2010-02-12 プロメテウス ラボラトリーズ インコーポレイテッド 希少循環細胞における多様なシグナル伝達物質検出のための抗体に基づくアレイ
US20120045748A1 (en) 2010-06-30 2012-02-23 Willson Richard C Particulate labels

Also Published As

Publication number Publication date
JP2018031763A (ja) 2018-03-01
JP6509926B2 (ja) 2019-05-08
US20180059114A1 (en) 2018-03-01
KR20180022490A (ko) 2018-03-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101994370B1 (ko) 항체 및 자성 나노 입자가 결합된 전도성 고분자를 포함하는 혈중 암세포 검출 및 회수용 자성 나노 구조체
Hong et al. Multifunctional magnetic nanowires: a novel breakthrough for ultrasensitive detection and isolation of rare cancer cells from non-metastatic early breast cancer patients using small volumes of blood
Zhang et al. A simple, specific and “on-off” type MUC1 fluorescence aptasensor based on exosomes for detection of breast cancer
US20210041431A1 (en) Nanocomposites, methods of making same, and applications of same for multicolor surface enhanced raman spectroscopy (sers) detections
Song et al. Fluorescent-magnetic-biotargeting multifunctional nanobioprobes for detecting and isolating multiple types of tumor cells
Xu et al. Antibody conjugated magnetic iron oxide nanoparticles for cancer cell separation in fresh whole blood
TWI577389B (zh) 使用多專一性捕捉及雞尾酒檢測試劑檢測胰臟病患之循環腫瘤細胞的方法及套組
Fang et al. Aptamer-conjugated upconversion nanoprobes assisted by magnetic separation for effective isolation and sensitive detection of circulating tumor cells
CN110095608A (zh) 基于磁性分离和dna自组装的肿瘤外泌体纳米荧光传感器
Zheng et al. Detection of the cancer marker CD146 expression in melanoma cells with semiconductor quantum dot label
IL137802A (en) A method for isolating and diagnosing cancer cells
KR20200007065A (ko) 루테리알의 형태특성을 이용한 질병의 진단방법
US10634670B2 (en) Composition comprising of a conducting polymer for detecting, capturing, releasing, and collecting cell
JP2018102284A (ja) 磁性ナノ粒子が搭載された導電性高分子および陽イオン性高分子を含むセルフリーｄｎａ検出および回収用の磁性ナノ構造体
CN106980018B (zh) 一种应用cd45免疫荧光联合cep17探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒及其应用
JP6289477B2 (ja) 金属含有半電導性ポリマードット
CN109100504B (zh) 一种血小板-白细胞混合膜包被免疫磁珠及其制备方法与应用
WO2019231259A1 (ko) 불안정한 세포유리 dna 검출 방법 및 이를 이용한 장치
CN107884377B (zh) 基于细胞外泌体纳米簇探针及其在制备成像制剂中的应用
KR101692052B1 (ko) 표면 증강 라만 산란 방법(sers)을 이용하여 순환 종양세포 및 순환 종양 줄기유사세포를 검출하는 방법 및 이를 이용한 시스템
Yu et al. Functional and biocompatible polymeric ionic liquid (PIL)-decorated immunomagnetic nanospheres for the efficient capture of rare number CTCs
Au et al. Assessing Breast Cancer Margins Ex Vivo Using Aqueous Quantum‐Dot‐Molecular Probes
Shukoor et al. CpG-DNA loaded multifunctional MnO nanoshuttles for TLR9-specific cellular cargo delivery, selective immune-activation and MRI
KR102095018B1 (ko) 렉틴이 결합된 나노입자를 이용한 암 진단 방법
CN111521793A (zh) 检测非小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞cea基因突变的免疫荧光试剂盒及检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant