KR101355985B1

KR101355985B1 - 다중 암 진단용 조성물

Info

Publication number: KR101355985B1
Application number: KR1020110125620A
Authority: KR
Inventors: 한정현; 강신원; 엄년식; 강병호; 장은윤; 김형경; 한마음
Original assignee: (주)유 바이오메드
Priority date: 2011-11-29
Filing date: 2011-11-29
Publication date: 2014-01-29
Also published as: KR20130059579A

Abstract

본 발명은 다중 암 진단용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 암 특이 항원을 인식하는 하나 이상의 항체, 상기 항체와 결합하는 나노입자 및 생분해성 고분자를 포함하는 다중 암 진단용 조성물, 상기 조성물의 제조방법 및 상기 조성물을 포함하는 다중 암 진단키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 다중 암 진단용 조성물은 서로 다른 암 특이 항원을 인식하는 서로 다른 하나 이상의 항체와 나노입자가 결합된 결합체가 생분해성 및 생체적합성을 갖는 고분자 내부에 담지되어 있으며, 상기 고분자 또한 표면에 암 특이 항원이 결합될 수 있는 항체가 결합되어 있어, 일차적으로 고분자 표면의 항체로 인한 암 표지가 가능하며 이후 고분자로부터 방출되는 암 특이 항원에 대한 항체와 나노입자의 결합체에 의한 이차 및 삼차적인 암 표지가 가능하여, 궁극적으로 여러 종류의 암을 동시에 진단 및 검출할 수 있는 효과가 있다.

Description

다중 암 진단용 조성물{Composition for diagnosis of multi-cancer}

본 발명은 다양한 종류의 암을 동시에 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 다중 암 진단용 조성물, 상기 조성물의 제조방법 및 상기 조성물을 포함하는 다중 암 진단 키트에 관한 것이다.

우리나라의 경우 암에 의한 사망자 수는 2002년 246,515명(조사망률 인구 10만 명당 512명) 가운데 25.5%(남성 사망자의 29.6%, 여성 사망자의 20.5%)인 62,887명으로 암으로 인한 사망(사망률 인구 10만 명당 130.7명)이 사망원인 1위를 차지하고 있다. 암 사망순위는 폐암, 위암, 간암, 대장암 및 췌장암 순으로, 이들 5대 암에 의한 사망이 전체 암 사망의 약 70%를 차지하고 있다. 또한 남성에 있어 주요 암 사망원인은 폐암, 위암, 간암 및 대장암 등으로 이들 4대 암에 의한 사망자 수(28,147명)가 전체 남성 암 사망자 수(40,177명)의 70%를 차지하고 있으며, 여성에 있어 주요 암 사망원인은 위암, 폐암, 간암, 대장암 및 췌장암 등으로 이들 5대 암에 의한 사망자 수(13,630명)가 전체 여성 암 사망자 수(22,710명)의 60%를 차지하고 있다.

또한 이러한 암의 종류는 현재까지 밝혀진 것만 해도 수십 종에 이르며, 주로 발병 조직의 위치에 따라 구분된다. 암은 성장속도가 매우 빠르고, 주변 조직에 침윤하면서 전이 (metastasis)가 일어나 생명을 위협하게 된다. 이러한 암의 종류로는 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 식도암, 취암, 대장암, 간암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 및 피부암등이 있으며 이러한 암의 발병 기전 또는 형태에 따라 다른 분류 체계에 의해 구분되기도 한다.

한편, 암세포가 어떠한 경로로 어떻게 생기게 되는가 하는 것은 아직 확실히 밝혀지지는 않고 있으나, 정상세포의 증식조절의 기능을 가진 유전자의 변형에 의해, 증식조절이 되지 않는 세포가 생겨 암이 발생하는 것으로 보는 것이 일반적인 견해이다. 이러한 암은 그 진행 정도에 따라, 암세포가 점막 내에 국한 되어있는 상태를 조기암으로 분류하고 있는데, 다양한 암에 있어서 조기암 상태에서 발견된 환자의 치료 예후는 비교적 좋은 것으로 나타난다.

따라서 암의 조기 진단 및 치료는 암의 사망률을 낮추고, 암의 치료비용을 낮추는데 기여할 것으로 평가된다. 그러나 암은 많은 경우에 있어서 초기에는 증상이 없는 경우가 대부분이어서 많은 사람들이 이를 간과하여 암의 사망률을 높이는 원인이 되고 있다.

현재까지의 암을 진단하는 방법은 위장 X-선 촬영으로 이중조영법, 압박촬영법 또는 점막촬영법 등이 있고, 내시경을 사용하여 내부 장기를 직접 육안으로 확인함으로써, X선 검사에서 나타나지 않는 아주 작은 병변까지 발견할 수 있을 뿐 아니라 암이 의심스러운 장소에서 직접 조직검사를 시행하고 있다. 하지만 이 방법은 위생상의 문제와 검사가 진행되는 동안 환자로 하여금 고통을 감수해야 하는 단점이 있다.

또한, 현재까지의 진행되고 있는 암의 치료는 대부분 수술로써 병소를 절제해 내는 것이며, 특히 완치를 목표로 하는 경우 외과적인 절제방법이 유일하다. 이러한 외과적 절제에 있어, 완치를 목표로 하는 수술에서는 가능한 한 넓은 범위를 포함하여 절제하는 것이 원칙이나 수술 후 광범위한 절제로 인한 후유증을 고려하여 그 절제 범위를 정하기도 한다. 다만 이러한 경우에도 암이 다른 장기에 전이되었을 경우에는 근치수술이 불가능하며, 따라서 이때에는 항암제투여 등 다른 방법을 택하게 되는데 현재까지 시판되고 있는 항암제는 일시적인 증상의 완화나 절제술 후 재발의 억제와 생존기간을 연장하는 일시적 효과만 있을 뿐, 근본적인 암의 치료에 있어서는 한계가 있고, 항암제 투여에 따른 부작용 및 경제적 부담으로 환자에게 이중적 고통을 주기도 한다.

따라서 암을 치료하기 위해서는, 치료 이전의 단계에서 높은 민감도와 특이도를 가진 암의 진단 방법의 개발이 무엇보다 중요하며, 이러한 진단은 암의 초기에 발견될 수 있는 것이어야 한다. 이러한 암의 발병여부 및 진행단계의 정확한 판별이 가능하게 하는 암의 진단제 및 외과적 절제술이나 항암제의 단점을 보완한 치료제의 개발을 위한 바이오 마커의 선별 및 진단 마커를 측정하는 제제의 개발은 난치병인 암을 정복하는 필수 불가결한 수단이라 할 수 있다.

그러나 현재까지 개발된 암 진단 바이오마커 또는 암 진단 키트는 특정 하나의 암을 진단하는 방법 또는 하나의 암을 진단하기 위한 다중 진단 방법만이 개발되어 있는데, 이러한 종래기술로 대한민국 공개특허 제2009-0104224호에 다파장 형광분광 및 간섭영상을 융합한 다중모드 조기 암 진단 시스템 및 그 방법에 대한 내용이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허 제911,741호에 다중 파장 오피오 광원 장치 및 이를 이용한 암 진단 시스템에 대한 내용이 개시되어 있을 뿐, 여러 가지의 암을 동시에 진단할 수 있는 기술에 대해서는 거의 연구된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 다양한 암을 한 번에 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 새로운 키트를 제조하였고, 이러한 키트를 통해 여러 가지의 암을 동시에 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명은 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 암 특이 항원을 인식하는 하나 이상의 항체, 상기 항체와 결합하는 나노입자 및 생분해성 고분자를 포함하는 다중 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 다중 암 진단용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 다중 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단 키트를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 암 특이 항원을 인식하는 하나 이상의 항체, 상기 항체와 결합하는 나노입자 및 생분해성 고분자를 포함하는 다중 암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 폐암, 간암 또는 위암일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 나노입자는 금 나노입자, 형광 나노입자 또는 자성 나노입자일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 PLGA(poly lactic-co-glycolic acid)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생분해성 고분자은 내부에 암 특이 항원을 인식하는 항체와 나노입자의 결합체가 하나 이상 포함되어 있으며, 상기 항체는 서로 다른 암 특이 항원을 인식하는 항체일 수 있다.

또한, 본 발명은,

암 특이 항원을 인식하는 제1항체와 금 나노입자를 이온결합 반응시켜 결합체를 생성하는 단계;

제1항체와는 다른 암 특이 항원을 인식하는 제2항체와 형광 나노입자를 이온결합 반응시켜 결합체를 생성하는 단계;

생분해성 고분자를 클로로포름에 녹인 오일 상과 제1항체 및 금 나노입자의 결합체를 함유한 수용액을 혼합시켜 오일 상 내부에 상기 수용액이 분산된 제1용액을 제조하는 단계;

생분해성 고분자를 클로로포름에 녹인 오일 상과 제2항체 및 형광 나노입자의 결합체를 함유한 수용액을 혼합시켜 오일 상 내부에 상기 수용액이 분산된 제2용액을 제조하는 단계; 및

제1용액과 제2용액을 혼합하고 이를 폴리비닐용액에 적하시키면서 초음파 처리하는 단계를 포함하는, 다중 암 진단용 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 제1용액을 제조하는 단계 이전에, 제1항체 및 제2항체와는 다른 암 특이 항원을 인식하는 제3항체와 자성 나노입자를 이온결합 반응시켜 결합체를 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 폐암, 간암 또는 위암이고, 상기 생분해성 고분자는 PLGA(poly lactic-co-glycolic acid)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 결합체는 생분해성 고분자 내부에 담지되고, 상기 생분해성 고분자의 표면은 폴리비닐용액으로 코팅되어 히드록실기(-OH)가 접합되어 있어 암세포 특이 항체가 결합될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 다중 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단 키트를 제공한다.

본 발명은 암 특이 항원을 인식하는 하나 이상의 항체, 상기 항체와 결합하는 나노입자 및 생분해성 고분자를 포함하는 다중 암 진단용 조성물, 상기 조성물의 제조방법 및 상기 조성물을 포함하는 다중 암 진단키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 다중 암 진단용 조성물은 서로 다른 암 특이 항원을 인식하는 서로 다른 하나 이상의 항체와 나노입자가 결합된 결합체가 생분해성 및 생체적합성을 갖는 고분자 내부에 담지되어 있으며, 상기 고분자 또한 표면에 암 특이 항원이 결합될 수 있는 항체가 결합되어 있어, 일차적으로 고분자 표면의 항체로 인한 암 표지가 가능하며 이후 고분자로부터 방출되는 암 특이 항원에 대한 항체와 나노입자의 결합체에 의한 이차 및 삼차적인 암 표지가 가능하여, 궁극적으로 여러 종류의 암을 동시에 진단 및 검출할 수 있는 효과가 있다.

도 1a은 본 발명에 따른 다중 암 특이적인 바이오마커와 생분해성 고분자를 이용한 다중 암 진단용 표지체의 모식도를 나타낸 것이다.
도1b는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 나노입자와 암 진단용 항체의 결합체가 담지된 고분자 나노입자의 주사현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 다중 암 진단 키트의 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 다중 암 진단 키트를 사용하여 나노입자 방출에 따른 색상 및 형광표지를 통한 암 진단 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 동시에 여러 가지의 암을 진단할 수 있는 새로운 암 진단용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 암 특이 항원을 인식하는 하나 이상의 항체, 상기 항체와 결합하는 나노입자 및 생분해성 고분자를 포함하는 다중 암 진단용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

일반적으로 “암 마커”또는 “암 바이오마커”란 정상 세포에 비해 암을 가진 세포 또는 조직에서 증가 또는 감소의 발현 변화를 보여 이를 통해 암을 진단할 수 있는 유기 생체 분자 물질을 의미하며, 암 바이오 마커들의 발현은 mRNA 또는 단백질 수준에서 확인하여 암 발병 여부를 진단할 수 있다.

한편, 본 발명에서는 이러한 암 진단을 위해 동시에 여러 가지의 암을 신속하게 진단할 수 있는 방법을 개발하였는데, 즉, 다중 암 진단용 조성물을 위해 필수 구성으로 암 특이 항원을 인식하는 하나 이상의 항체, 상기 항체와 결합하는 나노입자 및 생분해성 고분자를 포함할 수 있다.

먼저 암 특이 항원을 인식하는 하나 이상의 항체는 각종 암에 대한 바이오마커와 결합할 수 있는 항체를 의미하는 것으로서, 바람직하게는 암 바이오마커로서 폐암의 경우에는 혈장칼리크레인(KLKB1)단편단백질(Fragments), 퍼옥시레독신-IPKP1 (plakophilin 1)또는 ABCC5 (ATP-binding cassette, subfamily C (CFTR/MRP), member 5), KRT15 (keratin 15), KRT14 (keratin 14), TRIM29 (tripartite motif-containing 29), SERPINB5 (serine or cysteine) proteinase inhibitor, clade B(ovalbumin), member 5), TK1 (thymidine kinase 1,soluble), GPX2(glutathione peroxidase 2), MMP1 (matrix metalloproteinase 1) 및 ITGB4 (integrin, beta 4)에 특이적인 항체, 간암의 경우에는 알파펩토프로테인(α-Fetoprotein, AFP), 인간 원암유전자 HCCR-2 또는 리포칼린(Lipocalin, LCN) 2에 특이적인 항체, 위암의 경우에는 항-아포리포프로테인 A-II, 아포리포프로테인 B, 비트로넥틴, 아포리포프로테인 A-I, 아포리포프로테인 C-III, 리포칼린 2, 펄레칸 항체 및 소마토메딘A에 특이적인 항체를 사용할 수 있으며, 이들 항체는 서로 다른 암을 진단할 수 있는 바이오마커에 대한 항체를 하나 이상 사용할 수 있으며 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 본 발명에서 사용한 나노입자는 상기 기술된 암 특이적 항체와 결합할 수 있는 나노입자로서, 금 나노입자, 형광 나노입자 또는 자성 나노입자를 사용할 수 있다.

나노입자란 크기가 수 내지 수백 나노미터(nm, 10억분의 1 미터인 물질, 크기로 인해 원자와 벌크물질의 중간적인 성질을 갖는다)인 입자를 말하는데, 본 발명에 따른 상기 나노입자는 암 특이 항원을 인식하는 항체와 이온 결합 반응을 통해 결합체를 형성할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 상기 나노입자의 사용으로 인해 나노입자가 가지는 특성, 예를 들면 형광, 자성 또는 색상의 표출로 암 진단을 가능하게 할 수 있다.

즉, 본 발명에서 사용한 상기 금 나노입자는 금 나노입자와 결합된 암 특이적 바이오마커에 대한 항체가 암 표적세포에서 암 항원과 결합 또는 반응하게 되면 색 전이 현상에 의한 발색 여부를 통해 암 진단을 할 수 있다.

또한, 상기 자성 나노입자는 현재 생체 물질의 분리, 자기공명 영상 진단 프로브, 거대자기저항센서를 포함한 바이오센서, 마이크로 유체계 센서, 약물/유전자 전달, 및 자성 고온치료 등의 넓은 응용범위에 걸쳐 사용되고 있는데, 특히 자성 나노 입자는 나노입자 주변의 물 분자의 수소원자의 스핀-스핀 이완시간을 단축시켜 자기공명영상 신호를 증폭시키는 효과를 나타내어 공명 영상 진단에 널리 사용되고 있다.

또한, 자성 나노입자는 약물 또는 유전자의 전달을 통한 생체 치료에도 사용될 수 있다. 자성 나노입자에 화학적인 결합 또는 흡착을 통해 약물 또는 유전자를 싣고 외부 자기장을 이용하여 원하는 위치로 이동시켜 특정부위에 약물 및 유전자를 방출을 가능하게 하여 선택적인 치료효과를 가져올 수 있게 한다.

본 발명에서는 상기 자성 나노입자가 결합되어 있는 암 특이적 항체가 항원과 반응하게 되면 전류 신호가 변하게 되고 이를 통해 암 진단이 가능하다.

또한, 형광 나노입자는 형광물질을 함유한 나노입자로서 상기 형광 나노입자가 결합되어 있는 암 특이적 항체가 특정 항원과 반응하게 되면 형광을 나타냄으로 써 이를 통해 암 진단이 가능하다.

또한 본 발명에 따른 다중 암 진단용 조성물은 생분해성 고분자를 포함하고 있는데, 본 발명에서 사용할 수 있는 상기 생분해성 고분자는 체내에서 생분해성과 생체 적합성을 갖는 고분자라면 사용 가능하며, 바람직하게는 미 식약청에서 의료용으로 승인된 지방족 폴리에스테르, 폴리오르소에스 폴리안하이드라이드, 폴리 α-아미노산, 폴리포스파겐, 폴리알킬시아노아크릴-레이트 등이다. 지방족 에스테르의 경우, 특히 폴리락타이드(PLA), 폴리글라이-콜라이드(PGA) 또는 폴리락타이드글라이콜라이드(PLGA) 등을 사용할 수 있고, 본 발명의 일실시예에서는 폴리락타이드글라이콜라이드(PLGA)를 사용하였다.

또한 상기 생분해성 고분자은 내부에 암 특이 항원을 인식하는 항체와 나노입자의 결합체가 하나 이상 포함되어 있으며, 상기 항체는 서로 다른 암 특이 항원을 인식하는 항체일 수 있는데, 본 발명에서 고안한 이러한 다중 암 진단용 조성물의 경우, 실제로 여러 가지의 암을 동시에 신속하게 진단할 수 있는 특징이 있다.

즉 본 발명의 일실시예에 따르면, 폐암 특이적 바이오마커에 대한 항체와 금 나노입자의 결합체 및 간암 특이적 바이오마커에 대한 항체와 형광 나노입자의 결합체를 내부에 담지한 폴리락타이드글라이콜라이드(PLGA) 생분해성 고분자의 나노입자를 폐암과 간암 환자로부터 수득한 시료를 대상으로 진단 가능성을 확인한 결과, 폐암 특이적 항원과 항체의 반응으로 금 나노입자에 의한 색상표지를 확인할 수 있었고, 동시에 간암 특이적 항원과 항체의 반응으로 형광 나노입자의 형광표지를 확인할 수 있었다.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 다중 암 진단용 조성물을 여러가지 암의 발병 여부를 한 번에 진단할 수 있는 용도로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 다중 암 진단용 조성물의 제조방법을 제공할 수 있는데, 상기 방법은 바람직하게, 암 특이 항원을 인식하는 제1항체와 나노입자를 이온결합 반응시켜 결합체를 생성하는 단계; 제1항체와는 다른 암 특이 항원을 인식하는 제2항체와 나노입자를 이온결합 반응시켜 결합체를 생성하는 단계; 생분해성 고분자를 클로로포름에 녹인 오일 상과 제1항체 및 나노입자의 결합체를 함유한 수용액을 혼합시켜 오일 상 내부에 상기 수용액이 분산된 제1용액을 제조하는 단계; 생분해성 고분자를 클로로포름에 녹인 오일 상과 제2항체 및 나노입자의 결합체를 함유한 수용액을 혼합시켜 오일 상 내부에 상기 수용액이 분산된 제2용액을 제조하는 단계; 및 제1용액과 제2용액을 혼합하고 이를 폴리비닐용액에 적하시키면서 초음파 처리하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 상기 본 발명에 따른 방법에서 제1용액을 제조하는 단계 이전에, 제1항체 및 제2항체와는 다른 암 특이 항원을 인식하는 제3항체와 나노입자를 이온결합 반응시켜 결합체를 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다.

보다 구체적으로 상기 본 발명에 따른 조성물의 제조방법을 설명하면, 먼저 암 특이 항원을 인식하는 제1항체와 나노입자를 이온결합 반응시켜 결합체를 생성하는 단계를 수행할 수 있다. 이후 상기 제1항체와는 다른 암 특이 항원을 인식하는 제2항체와 나노입자를 이온결합 반응시켜 결합체를 생성하는 단계를 수행할 수 있다. 이때 상기 이온 결합 반응은 상온에서 1~2시간 동안 반응을 통해 결합체를 생성하게 되며, 제1항체 및 제2항체와 결합하는 상기 나노입자는 각각 서로 다른 나노입자를 사용할 수 있다. 즉, 제1항체와 결합하는 나노입자가 금 나노입자를 사용한다면 제2항체와 결합하는 나노입자는 금 나노입자가 아닌 형광 나노입자 또는 자성 나노입자를 사용할 수 있다.

이후 상기 제1항체 및 제2항체와 나노입자가 결합한 각각의 결합체를 생분해성 고분자 내부에 담지하는 과정을 수행하게 되는데, 이를 위해 먼저 생분해성 고분자를 클로로포름에 녹인 오일 상과 제1항체 및 나노입자의 결합체를 함유한 수용액을 혼합시켜 오일 상 내부에 상기 수용액이 분산된 제1용액을 제조하고, 생분해성 고분자를 클로로포름에 녹인 오일 상과 제2항체 및 나노입자의 결합체를 함유한 수용액을 혼합시켜 오일 상 내부에 상기 수용액이 분산된 제2용액을 제조한 다음, 제1용액과 제2용액을 혼합하고 이를 폴리비닐용액에 적하시키면서 초음파 처리하는 단계를 통해 상기 생분해성 고분자 내부에 상기 결합체들을 모두 담지하게 된다.

또한, 이때 폴리비닐용액에 적하 및 초음파 처리를 통해 상기 생분해성 고분자의 표면은 폴리비닐용액으로 코팅되어 히드록실기(-OH)가 접합된 형태를 가질 수 있으며, 표면에 코팅된 히드록실기(-OH)로 인해 고분자 표면에 암세포 특이적인 항체가 결합될 수 있다. 또한, 상기 생분해성 고분자로는 바람직하게 PLGA(poly lactic-co-glycolic acid)를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 조성물의 제조방법에서 고분자 내부에 항체와 나노입자의 결합체를 담지하는 방법은 이중유화법을 사용한 것으로서, 이중유화법(double emulsion method; water in oil in water: W1/O/W2)은 수용액(W2) 내에 분산되는 오일상(O)의 고분자 입자 내부에 또 다시 수용성(W1) 물질이 담지된 입자의 제조 방법이다.

따라서 이러한 방법으로 제조된 본 발명의 다중 암 진단용 조성물은 먼저 생분해성 고분자 표면에 코팅된 하이드록실기로 인해 1차적으로 고분자입자가 특이 항원의 표지가 가능할 수 있고, 이후 고분자의 생분해성 성질로 인해 고분자 내부에 담지된 항체 및 나노입자의 방출에 따라 제2 및 제3의 항원이 표지될 수 있어, 동시에 여러가지의 암 진단을 가능케 할 수 있다.

그러므로 본 발명은 다중 암 진단용 조성물 및 상기 조성물의 제조방법 뿐만 아니라 본 발명에 따른 다중 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단 키트를 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 진단이 가능한 암은 모든 암의 종류를 진단할 수 있으며, 바람직하게는 폐암, 간암 또는 위암일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

나노입자와 암 진단용 항체와의 결합체 제조

본 발명자들은 다양한 나노입자를 사용하여 다중 암 진단을 할 수 있는 새로운 진단 키트의 제작을 위해, 먼저 나노입자로서 금 나노입자 및 양자점과 같은 형광나노입자를 사용하여 각각 암 특이적인 바이오마커에 대한 항체와 접합시켰다. 즉, 먼저 소듐시트레이트로 제조한 금 나노입자를 농축하고 이 용액 250ul를 취하여 여기에 증류수 650ul와 0.1X PBS 버퍼 100ul를 첨가시킨 다음, 폐암 특이적 바이오마커인 혈장칼리크레인(KLKB1)단편단백질(Fragments)에 대한 항체를 10ul 첨가하고 상온에서 1시간 동안 이온결합 반응시켰다.

또한, 형광 나노입자에 간암 특이적 바이오마커에 대한 항체와의 접합을 위해, 클로로포름에 분산된 형광 나노입자(10mg/ml) 1ml를 과량의 메탄올을 첨가하여 원심분리법으로 세척한 뒤, 클로로포름 1ml에 재분산 시킨 다음, 여기에 클로로포름 9ml를 첨가시키고 Meacapto undecanoic acid 20mg을 첨가하였다. 이후 이 용액을 70℃에서 500rpm으로 교반시켜 주면서 클로로포름을 서서히 증발시켰고, 클로로포름이 완전히 증발되면 여기에 0.001M NaOH 용액 20ml를 첨가하고 교반하여 수용액에 분산된 형광 나노입자를 수득하였다. 이후 이 용액 4ml를 취하여 원심분리방법으로 농축시키고 250ul를 취하여 여기에 증류수 650ul와 0.1X PBS 버퍼 100ul를 첨가시킨 다음, 간암 특이적 바이오마커인 알파펩토프로테인(α-Fetoprotein, AFP)에 대한 항체 10ul를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 이온결합 반응시켰다. 반응 후 상기용액을 13000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 이를 3회 반복한 다음 소혈청알부민 용액 (10mg/ml) 250ul에 재분산 시켰다.

< 실시예 2>

나노입자와 암 진단용 항체의 결합체가 담지된 고분자 나노입자의 제조

상기 실시예 1에서 제조된 폐암 특이적 항체가 결합된 금 나노입자 결합체와 간암 특이적 항체가 결합된 형광 나노입자 결합체를 PLGA(poly lactic-co-glycolic acid) 고분자 내부에 담지하게 위해 먼저 다음과 같이 제1용액을 제조하였다. 제1용액: PLGA 100mg을 클로로포름 2ml에 녹여 오일 상을 제조하고, 여기에 실시예 1에서 제조한 폐암 특이적 항체와 금 나노입자의 결합체가 함유된 수용액 250ul를 첨가시켰다. 이후 두 용액을 혼합한 뒤 강하게 교반시켜 오일 상 안에 수용액이 고르게 미세 분산되도록 하였다. 이후 다음과 같이 제2용액을 제조하였다. 제2용액: PLGA 100mg을 클로로포름 2ml에 녹여 오일 상을 제조하였다. 이후 여기에 형광 나노입자에 간암 특이적 바이오마커에 대한 항체가 결합된 결합체가 함유된 수용액 250ul를 첨가시켰다. 이후 이들 용액을 혼합한 뒤 강하게 교반시켜 오일 상 안에 수용액이 고르게 미세 분산되도록 하였다.

그런 뒤, 위와 같이 제조된 제1용액 및 제2용액을 혼합시킨 다음, 4% PVA(폴리비닐알콜) 용액 50ml에 천천히 적하시키면서 초음파 분산 기를 사용하여 5분 동안 초음파 분산 시켰고, 유기 용매를 제거하기 위해 밤새도록 교반시켰다. 그런 뒤, 상기 시료를 13500rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상층액은 버리고 증류수를 첨가시켜 초음파로 재분산 시킨 다음 다시 원심분리 하였고 이 과정을 3회 반복 수행하였다. 이후 증류수에 재 분산된 입자는 동결 건조하여 4℃에서 보관하였다.

또한, 상기 방법에 따라 PLGA 고분자에 PVA를 처리함으로써 PLGA 고분자 표면에서 폴리비닐알콜과 항체를 접합시키기 위한 콘쥬게이션 반응은 다음에 기술된 바와 같다.

<폴리비닐알콜과 항체를 접합시키기 위한 콘쥬게이션(Conjugation) 반응식>

< 실시예 3>

고분자에 담지된 나노입자의 방출에 따른 암 진단 효능 검사

상기 실시예 2를 통해 제조된 본 발명에 따른 다중 암 진단 키트를 이용하여 실제 다중의 암을 한 번에 진단 가능한지 다음과 같은 실험을 통해 확인하였다. 암진단방법은 샌드위치 측정법을 이용하였다. 본 발명에서 제조한 폐암 및 간암 진단용 1차 항체(항원-디텍터용)가 결합된 금 및 형광나노입자가 담지 된 고분자 나노입자를 콘쥬게이트 패드에 흡착시켰다. 콘쥬게이트패드는 비특이적 반응을 막기 위해 소혈청알부민(10mg/ml) 100ul에 전 처리한다. 콘쥬게이트패드 상단에는 멤브레인 패드를 고정시키고 디스펜서를 이용하여 간암특이적인 2차 항체 라인, 폐암 특이적인2차 항체라인(항원-캡쳐용)(0.5mg/ml) 각각 2ul와 1차 항체 결합 확인을 위한 콘트롤 라인(0.5mg/ml) 각각 2ul씩 심고 건조시켰다. 이후 상단에 흡수패드를 고정시키고 맨 밑에 항원을 떨어뜨리기 위한 샘플 패드를 고정시켜 진단 스트립을 제작하였다. 이후, 폐암 진단 항원 혈장칼리크레인(KLKB1)단편단백질(Fragments) 및 간암 진단 항원 알파펩토프로테인(α-Fetoprotein, AFP)(1ug/ml)을 각각 200ul를 샘플패드에 떨어뜨린 후, 고분자 내에서 나노입자의 방출에 의한 색상표지 및 형광표지에 의한 다중 표지 경향을 관찰하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 금 나노입자는 색상이 표지되는 것으로 나타났으며, 형광 나노입자 역시 동일한 스트립에서 형광을 띄는 것을 확인할 수 있었다.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에서 제조한 다중 암 진단키트를 사용할 경우, 금에 의한 색상표지 및 형광표지의 동시 구현을 통해 다양한 암을 한번에 신속하고 정확하게 진단할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

서로 다른 암 특이 항원을 인식하는 둘 이상의 항체, 상기 항체와 결합하는 나노입자, 및 생분해성 고분자를 포함하고,
상기 생분해성 고분자는 내부에 상기 항체와 나노입자의 결합체가 하나 이상 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 다중 암 진단용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 암은 폐암, 간암 또는 위암인 것을 특징으로 하는 다중 암 진단용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 나노입자는 금 나노입자, 형광 나노입자 또는 자성 나노입자인 것을 특징으로 하는 다중 암 진단용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 생분해성 고분자는 PLGA(poly lactic-co-glycolic acid)인 것을 특징으로 하는 다중 암 진단용 조성물.
삭제
암 특이 항원을 인식하는 제1항체와 금 나노입자를 이온결합 반응시켜 결합체를 생성하는 단계;
제1항체와는 다른 암 특이 항원을 인식하는 제2항체와 형광 나노입자를 이온결합 반응시켜 결합체를 생성하는 단계;
생분해성 고분자를 클로로포름에 녹인 오일 상과 제1항체 및 금 나노입자의 결합체를 함유한 수용액을 혼합시켜 오일 상 내부에 상기 수용액이 분산된 제1용액을 제조하는 단계;
생분해성 고분자를 클로로포름에 녹인 오일 상과 제2항체 및 형광 나노입자의 결합체를 함유한 수용액을 혼합시켜 오일 상 내부에 상기 수용액이 분산된 제2용액을 제조하는 단계; 및
제1용액과 제2용액을 혼합하고 이를 폴리비닐용액에 적하시키면서 초음파 처리하는 단계를 포함하는, 다중 암 진단용 조성물의 제조방법.
제6항에 있어서,
제1용액을 제조하는 단계 이전에, 제1항체 및 제2항체와는 다른 암 특이 항원을 인식하는 제3항체와 자성 나노입자를 이온결합 반응시켜 결합체를 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 암 진단용 조성물의 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 암은 폐암, 간암 또는 위암이고, 상기 생분해성 고분자는 PLGA(poly lactic-co-glycolic acid)인 것을 특징으로 하는 다중 암 진단용 조성물의 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 결합체는 생분해성 고분자 내부에 담지되고, 상기 생분해성 고분자의 표면은 폴리비닐용액으로 코팅되어 히드록실기(-OH)가 접합되어 있어 암세포 특이 항체가 결합될 수 있는 것을 특징으로 하는 다중 암 진단용 조성물의 제조방법.
제1항에 따른 다중 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단 키트.