KR102095018B1 - 렉틴이 결합된 나노입자를 이용한 암 진단 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 렉틴이 결합된 나노입자를 이용하여 엑소좀을 검출함으로써 암을 진단하는 방법에 관한 것으로, 상기 나노입자는 암세포가 분비하는 엑소좀을 효과적으로 검출 및 분리할 수 있으므로 암 진단 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

렉틴이 결합된 나노입자를 이용한 암 진단 방법{Methods For Diagnosis Of Cancer Using Lectin-Conjugated Nanoparticles}
본 발명은 렉틴이 결합된 나노입자를 이용하여 엑소좀을 검출함으로써 암을 진단하는 방법에 관한 것이다.
췌장암은 세계적으로 14번째로 다발하는 암으로 5년 생존율이 5% 미만이고, 6개월 이내에 진단된 환자의 반 이상이 사망하는 매우 불량한 예후를 가지고 있어, 진단이 어렵고 가장 낮은 생존율을 나타내는 질환으로 알려져 있다. 췌장암 환자의 사망률이 높은 것은 췌장암의 경우 자각 증상이 없어 초기 진단이 어려울 뿐만 아니라, 초음파나 CT 촬영 등을 이용하여도 쉽게 관찰되지 않기 때문이다. 또한 췌장암은 기존의 화학요법적 치료에 대하여 강한 내성을 가지고 있는 경우가 대부분이고, 외과적인 수술을 통하여 제거하기가 쉽지 않아 초반에 진단이 되지 않으면 치료가 쉽지 않기 때문이다.
따라서 췌장암에 대한 표적 치료 및 진단을 위하여 분자적 특징을 규명하려는 연구가 시도되고 있으나, 암세포는 이형성(heterogeneity)으로 자라기 때문에 췌장암을 비롯한 암의 분자적 특징을 명확하게 규명하기는 어려운 실정이다. 췌장암의 조기 진단 필요성이 꾸준히 제기됨에 따라 최근에는 암 특이적인 바이오마커를 이용하여 췌장암을 진단하려는 연구가 계속되고 있다.
엑소좀은 대부분의 세포에서 분비되는 작은 형태의 소포체(membrane vesicle)로 엑소좀 안에는 세포에서 유래된 다양한 종류의 단백질, 유전물질(DNA, mRNA, miRNA), 지질 등이 포함되어 있는 것으로 알려져 있다.
본 연구자들은 렉틴이 결합되어 있고, 입자 표면의 한쪽면이 금속으로 코팅된 야누스 나노입자(janus nanoparticle)를 이용하여 췌장암 유래 엑소좀을 검출할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
1. 대한민국 등록특허 제 10-1298579호 2. 대한민국 등록특허 제 10-1546076호
본 발명의 일 목적은 엑소좀 결합 분자가 연결된 나노입자를 포함하는 암 진단용 조성물로서, 상기 나노입자는 입자 표면의 일부분이 금속으로 코팅된 것인 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 검사하고자 하는 대상체로부터 분리한 생물학적 시료와 제1항의 조성물을 접촉시키는 단계; 및 나노입자와 결합한 엑소좀을 확인하는 단계를 포함하는 암 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전극이 배치된 하부 기판; 상기 하부 기판과 연결되어 유체가 유동할 수 있는 유체 채널을 형성하는 상부 기판; 및 외부 전원을 포함하는 엑소좀 검출 및 분리 장치에 있어서, 상기 전극은 채널을 통하여 이동하는 유체의 흐름 방향과 직교하도록 배치되고, 상기 유체 채널은 엑소좀 결합 분자가 연결된 나노입자를 포함하는 것인 엑소좀 검출 및 분리 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 엑소좀 결합 분자가 연결된 나노입자를 포함하는 암 진단용 조성물로서, 상기 나노입자는 입자 표면의 일부분이 금속으로 코팅된 것인 암 진단용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, '엑소좀(exosome)'은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 소낭체로, 다른 세포 및 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질, RNA를 전달하는 등 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 암은 유방암, 갑상선암, 위암, 췌장암 및 담도암으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되지 아니한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, '엑소좀 결합 분자'란 검출하고자 하는 엑소좀과 특이적으로 결합할 수 있는 바이오분자 또는 기타 화합물질 등을 포함하는 것으로 본 발명의 일 실시예에 따르면 단백질, 리간드, 앱타머, DNA, 합텐 (hapten), 아비딘 (avidin), 스트렙타비딘 (streptavidin), 뉴트라비딘 (neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G 및 마이크로 RNA로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 단백질은 렉틴(lectin)인 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 렉틴은 푸코오스 당쇄 특이적인 렉틴일 수 있으며, 햅토글로빈 특이적 렉틴인 것이 바람직하다. 상기 렉틴은 겨우살이 및 버섯류 (basidiomycetes)로부터 분리할 수 있으며, 땅비늘버섯(Pholiota terrestris)에서 분리한 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 나노입자는 폴리스티렌(polystyrene) 또는 폴리메틸메타크릴레이트(polymethyl methacrylate) 재질로 이루어진 것일 수 있으나, 엑소좀 결합 분자가 연결될 수 있는 한 그 재질은 제한되지 아니한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 금속은 금(Au), 은(Ag), 백금(Pt), 구리(Cu), 니켈(Ni), 아연(Zn) 및 크롬(Cr)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 금인 것이 바람직하다.
상기 금속을 나노입자의 표면에 코팅하는 방법은 가리움법(masking), 상분리법(phase separation), 및 자가조립법(self assembly)을 이용할 수 있다. 가리움법은 왁스 등의 고체상 물질을 이용하여 입자표면의 절반을 가리고 나머지 절반을 노출 시킴으로써, 노출된 한쪽 표면을 개질시켜 노출되지 않은 면과 다른 성질을 가지게 하는 방법이다. 상 분리법은 둘 혹은 그 이상의 비호환적인, 섞이지않는(incompatible) 구성물들의 혼합을 통해 야누스 입자를 만드는 방법이다. 자가조립법은 블록 공중합체(block copolymer) 또는 유기물과 고분자를 이용하여 야누스 입자를 만드는 방법으로 다양한 종류의 폴리머들을 이용하여 야누스 입자의 표면특성을 조절할 수 있는 점이 장점이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 입자 표면의 일부분이 금속으로 코팅된 나노입자를 야누스 나노입자(Janus nanoparticle)로 명명할 수 있으며, 로마신화의 두 얼굴을 가진 신의 이름을 따서 지어진 이름으로, 하나의 입자에 2개의 구조가 함께 포함된 구조를 말한다. 좁게는 구형 입자를 반으로 나누어 각각이 별도의 구조를 갖는 경우를 의미하지만, 본 명세서에서는 소재 입자 표면을 둘로 나누어 각각의 부분에 서로 다른 특성의 나노입자들이 부착된 경우를 포함하는 의미로 사용하였다.
본 발명의 다른 양상은 검사하고자 하는 대상체로부터 분리한 생물학적 시료와 제1항의 조성물을 접촉시키는 단계; 및 나노입자와 결합한 엑소좀을 확인하는 단계를 포함하는 암 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 생물학적 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 및 뇨로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 혈액, 혈청 또는 혈장인 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 암 진단 방법은 나노입자와 결합한 엑소좀을 확인하는 단계 이후, 엑소좀을 분리하여 엑소좀에 포함된 DNA, 단백질을 분석하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 분리된 엑소좀의 종류에 따라 암의 종류를 판별할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은
전극이 배치된 하부 기판; 상기 하부 기판과 연결되어 유체가 유동할 수 있는 유체 채널을 형성하는 상부 기판; 및 외부 전원을 포함하는 엑소좀 검출 및 분리 장치에 있어서,
상기 전극은 채널을 통하여 이동하는 유체의 흐름 방향과 직교하도록 배치되고, 상기 유체 채널은 엑소좀 결합 분자가 연결된 나노입자를 포함하는 것인 엑소좀 검출 및 분리 장치를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 나노입자는 입자 표면의 일부분이 금속으로 코팅된 것인 바람직하며, 금으로 코팅된 것이 더욱 바람직하다.
상기 엑소좀 검출 및 분리 장치에 교류 전원이 공급되면 나노입자와 가해지는 상대적인 유전영동 힘의 차이에 따라 양/음의 유전영동(positive/negative dielectrophoresis) 방향이 결정되고, 엑소좀과 결합한 나노입자의 경우 단독의 나노입자와 비교하여 유전영동 방향, 즉 유전율에 차이가 발생하므로 이 차이를 확인함으로써 엑소좀과 결합한 나노입자를 분리할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 렉틴이 결합된 나노입자는 암세포가 분비하는 엑소좀을 효과적으로 검출 및 분리할 수 있으므로 암 진단 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 렉틴과 렉틴 특이적 당단백질이 결합하는 모습을 보여주는 도이다.
도 2는 버섯류를 동결건조하여 당쇄 특이적 렉틴을 분리하는 과정을 보여주는 도이다.
도 3은 폴리스티렌 나노입자 단층 제조과정 및 나노입자의 한쪽면에 금 박막을 형성시켜 야누스 나노입자를 제조하는 과정을 보여주는 도이다.
도 4는 야누스 나노입자 합성 과정의 개략도이다.
도 5는 실리콘 웨이퍼상에서 단층 정렬화된(monocrystallized) 폴리스티렌 나노입자의 SEM 이미지이다.
도 6은 500nm의 폴리스티렌 나노 입자의 TEM 사진이다.
도 7은 금/크롬 증착된 폴리스티렌 입자인 야누스 입자의 TEM 사진이다.
도 8은 야누스 나노입자에 렉틴을 결합시키는 과정을 개략적으로 보여주는 도이다.
도 9는 카르복실기 결합된 폴리스티렌 나노입자, 금/크롬 증착된 야누스 나노 입자 및 렉틴이 결합된 야누스 나노 입자의 FTIR 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 10은 카르복실기 결합된 폴리스티렌 나노입자, 금/크롬 증착된 야누스 나노입자 및 렉틴이 결합된 야누스 나노입자의 크기 분포 및 제타 전위를 나타낸 그래프이다.
도 11은 TEM 이미지 및 렉틴이 결합된 야누스 나노입자의 개략도이다.
도 12는 SNA 렉틴의 야누스 나노입자에 대한 결합 정도를 농도에 따라 나타낸 그래프이다.
도 13은 Con A 렉틴의 야누스 나노입자에 대한 결합 정도를 농도에 따라 나타낸 그래프이다.
도 14는 AAL 렉틴의 야누스 나노입자에 대한 결합 정도를 농도에 따라 나타낸 그래프이다.
도 15는 췌장암세포 마커 항체인 CA 19-9의 야누스 나노입자에 대한 결합 정도를 농도에 따라 나타낸 그래프이다.
도 16은 SNA 렉틴이 결합된 야누스 나노입자에 대한 상대 형광 강도를 나타낸 그래프이다.
도 17은 Con A 렉틴이 결합된 야누스 나노입자에 대한 상대 형광 강도를 나타낸 그래프이다.
도 18은 AAL 렉틴이 결합된 야누스 나노입자에 대한 상대 형광 강도를 나타낸 그래프이다.
도 19는 췌장암세포 마커 항체인 CA 19-9에 대한 상대 형광 강도를 나타낸 그래프이다.
도 20은 야누스 나노입자와 결합된 렉틴의 결합 친화성을 조사한 공초점 현미경 사진이다.
도 21은 야누스 나노입자와 결합된 SNA 렉틴과 각 세포와의 결합 친화성을 나타낸 그래프이다.
도 22는 야누스 나노입자와 결합된 Con A 렉틴과 각 세포와의 결합 친화성을 나타낸 그래프이다.
도 23은 야누스 나노입자와 결합된 AAL 렉틴과 각 세포와의 결합 친화성을 나타낸 그래프이다.
도 24는 야누스 나노입자와 결합된 췌장암세포 마커 항체인 CA 19-9과 각 세포와의 결합 친화성을 나타낸 그래프이다.
도 25는 야누스 나노입자와 각 세포와의 결합 친화성을 나타낸 그래프이다.
도 26은 SNA 렉틴이 결합된 야누스 나노입자가 처리된 PANC-1에서의 공초점 z-stack 3차원 재구성 이미지이다.
도 27은 Con A 렉틴이 결합된 야누스 나노입자가 처리된 PANC-1에서의 공초점 z-stack 3차원 재구성 이미지이다.
도 28은 MTT 분석을 통한 SNA 렉틴에 대한 세포 생존력 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 29는 MTT 분석을 통한 Con A 렉틴에 대한 세포 생존력 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 30은 MTT 분석을 통한 AAL 렉틴에 대한 세포 생존력 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 31은 MTT 분석을 통한 췌장암세포 마커 항체인 CA 19-9에 대한 세포 생존력 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 32는 렉틴이 결합된 야누스 나노입자(janus nanoparticle)와 엑소좀의 결합 모습을 예시적으로 보여주는 도이다.
도 33은 야누스 나노입자를 포함하는 미세유체 유전영동 시스템(microfluid dielectrophoresis system)을 이용하여 엑소좀을 분리하는 방법을 개략적으로 보여주는 도이다.
도 34은 야누스 나노입자를 포함하는 미세유체 유전영동 시스템의 작동 원리 및 시뮬레이션 과정을 보여주는 도이다.
도 35은 Panc-1 세포에서 분리된 췌장암 엑소좀을 나타낸 사진이다.
도 36는 SNA 렉딘 단백질이 결합된 야누스 나노입자에 포획된 엑소좀을 나타낸 사진이다.
도 37은 Panc-1 세포의 엑소좀에서의 CD81, CD63 및 EphA2 발현을 웨스턴 블롯팅 분석에 의하여 확인한 사진이다.
도 38은 렉틴이 결합되지 않은 야누스 나노입자, 렉틴이 결합된 야누스 나노입자 및 췌장암세포 마커 항체인 CA 19-9가 결합된 야누스 나노입자와 췌장암 유래 엑소좀의 결합을 확인한 사진이다.
도 39는 각 렉틴에 결합된 야누스 나노입자의 엑소좀 검출능을 나타낸 그래프이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 당 특이적 렉틴 스크리닝
땅비늘버섯(Pholiota terrestris) 및 겨우살이를 동결건조하여 버섯 분말을 제조하고, 상기 버섯 분말로부터 추출물을 수득하였다. 상기 추출물을 원심분리하여 상층액만을 회수하고, 상층액을 거즈로 여과하였다. 거즈 여과 과정을 수차례 반복하여 여과된 버섯 추출물(이하 '여과 버섯 추출물'로 기재함)을 수득하였다.
상기 여과 버섯 추출물에서 푸코오스(fucose) 당쇄 특이적인 렉틴을 분리하기 위하여 하기와 같이 실험하였다. 먼저 췌장암 세포에서 분비되는 엑소좀에서 예상되는 당류가 햅토글로빈(haptoglobin)이기 때문에 세파로스(sepharose) 컬럼에 제조사의 프로토콜에 따라 햅토글로빈을 고정시키고, 수득한 여과 버섯 추출물을 접촉시켰다. 접촉시킨 후 햅토글로빈과의 결합하는 렉틴을 컬럼에서 용출시키고, 렉틴의 결합 상수, 탄수화물-결합 특이성을 분석하여 최적의 렉틴을 선별하였다. 땅비늘버섯 이외에, 다른 식물류 유래 렉틴은 하기 표 1과 같은 시중에서 판매되는 렉틴을 구매하여 사용하였다.
명칭 렉틴 유래 시판 정보
SNA Sambucus Nigra Lectin 딱총나무 L6890, Sigma Aldrich
Con A Concanavalin A 작두콩 61760, Sigma Aldrich
AAL Aleuria Aurantia Lectin 들주발버섯 L-1390, Vector laboratory
도 1은 렉틴과 렉틴 특이적 당단백질이 결합하는 모습을 보여주는 것이다.
도 2에 버섯을 동결건조하여 추출물을 제조하고, 추출물로부터 렉틴을 분리하는 과정을 보여주는 것이다.
실시예 2: 렉틴이 결합된 야누스 나노입자(Janus nanoparticle) 제조
2-1. 금속이 코팅된 폴리스티렌 입자 제조
대류콜로이드조립(convective colloid assembly) 방법 및 공기-물 계면(air-water interface) 자가 조립 방법을 이용하여 폴리스티렌 입자 단층을 제조하였다. 구체적으로 5 ㎛ 내지 100 ㎚ 크기의 폴리스티렌(polystyrene) 입자가 분산된 현탁액에 유리 기판 또는 실리콘 웨이퍼를 담그고, 용액 성분을 증발시켜 유리 기판 또는 실리콘 웨이퍼 위에 고밀도 폴리스티렌 입자 단층(monolayer)을 제조하였다. 상기 폴리스티렌 입자 단층에 이방성 금속(크롬(chromium)은 ~20 ㎚; 금(gold)은 수십 ㎚)을 증착(deposition)시켜 입자 표면의 절반이 금속으로 코팅된 폴리스티렌 입자(이하, '야누스 나노입자'로 기재함)를 제조하였다. 이때 금 박막의 안정적인 형성을 위해 금 증착 전 크롬 증착을 먼저 진행하였다. 증착 과정은 열 또는 전자빔 증발기(thermal or e-beam evaporator)를 이용하였다. 유리 기판 또는 실리콘 웨이퍼 위에 형성된 야누스 나노입자는 스프레이 및 소니케이션(sonication) 과정을 통해 물/에탄올 혼합용매에 재분산시키고, 응집을 방지하기 위해 미량의 계면활성제를 첨가하였다.
도 3은 폴리스티렌 나노입자 단층에 금을 증착시켜 입자의 한쪽면에만 금 박막이 형성된 야누스 나노입자 제조 과정을 보여주는 것이다.
도 4는 야누스 나노입자 합성 과정의 개략도이다.
도 5는 실리콘 웨이퍼상에서 단층 정렬화된(monocrystallized) 폴리스티렌 나노입자의 SEM 이미지이다.
한편, 합성된 야누스 나노입자의 형상분석을 위해 투과전자현미경(TEM) 분석을 진행하였다. 구체적으로, Energy-Filtering Transmission Electron Microscope(LIBRA 120, Carl Zeiss) 장비를 이용해 투과전자형미경 분석을 수행하였으며, 측정하고자 하는 샘플은 Cu gird 위에 로딩하여 준비하였다.
그 결과, TEM 분석을 통해 확인된 야누스 나노입자는 금속증착으로 인하여 전자 밀도가 높아진 영역은 진하게, 증착이 되지 않은 폴리머 부분은 상대적으로 연하게 색이 대조되어 나타남을 확인하여, 야누스 나노입자가 성공적으로 제조되었음을 확인하였다.
도 6은 500nm의 폴리스티렌 나노 입자의 TEM 사진이다.
도 7은 금/크롬 증착된 폴리스티렌 입자인 야누스 입자의 TEM 사진이다.
2-2. 렉틴이 결합된 야누스 나노입자 제작
상기 2-1에서 제조한 야누스 나노입자에 아민(amine)을 처리하여 입자 표면에 1차 아민(primary amine)이 연결되도록 하였다. 1차 아민이 연결된 야누스 나노입자에 N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate (이하, SPDP로 기재함) 및 DTT(dithiothreitol)를 첨가하여 나노입자와 SPDP의 반응을 유도하였다. SPDP는 아민 반응성 NHS ester(N-Hydroxysuccinimide ester)와 티올(thiol) 반응성 피리딜 디설파이드(pyridyl disulfide) 그룹을 함유하고 있으며, 1차 아민이 연결된 야누스 나노입자는 SPDP와의 반응에 의해 활성화되어 티올 반응성 유도체를 형성하였다. 렉틴은 부분적으로 티올을 함유하고 있기 때문에 활성화된 야누스 나노입자와 결합하여 렉틴이 결합된 야누스 나노입자를 제작할 수 있다.
또한, 렉틴에 티올기가 충분하지 않을 경우를 대비하기 위하여 SPDP와 반응하여 활성화된 야누스 나노입자에 sulfo SMCC(sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)를 첨가하고, 반응을 유도하였다. 렉틴에는 아민기가 풍부하기 때문에 야누스 나노입자와 렉틴의 결합을 유도할 수 있다.
도 8는 야누스 나노입자를 활성화시켜 렉틴과 결합시키는 과정을 보여주는 것이다.
2-3. 야누스 나노입자의 특성 및 단백질 결합 가능 여부 평가
상기 2-1 및 2-2에서 제조한 야누스 나노입자에 대한 특성 분석을 위하여, FTIR, DLS 및 ELS 측정을 진행하였다. 또한, 야누스 표면 위 렉틴 수식을 위한 입자의 단백질 결합능 평가를 위하여, BSA를 결합하여 단백질 결합 가능 여부를 평가하였다.
구체적으로, FTIR 은 분말화된 샘플을 이용하여 ALPHA-T(Bruker optics) 장비에서 측정이 이뤄졌으며, 300-4000cm-1 파수 영역에서 측정하였다. 한편, DLS 및 ELS는 Malvern 사의 zetasizer nano ZS90 장비를 이용하여 측정하였다.
그 결과, FTIR 분석을 통해 700cm-1, 755cm-1 파수에서 폴리스티렌 특성피크(peak)가 관측 되었으며, 폴리스티렌 입자의 카르복실기의 특성 또한 1600cm-1 에서 관측되었다. 또한, 단백질 결합으로 인한 CNH 복합 피크와 NH 결합 피크가 각각 1653cm-1 및 3310cm-1 에서 관측되었다. DLS 분석을 통하여 확인한 입자의 크기는 금속 증착과 단백질 결합 여부에 따라 변하였는데, 그 크기는 500nm에서 633nm 까지 관측되었으며, ELS 분석을 통한 제타전위 또한 입자의 처리에 따라 변화하였다.
도 9는 카르복실기 결합된 폴리스티렌 나노입자, 금/크롬 증착된 야누스 나노 입자 및 렉틴이 결합된 야누스 나노 입자의 FTIR 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 10은 카르복실기 결합된 폴리스티렌 나노입자, 금/크롬 증착된 야누스 나노입자 및 렉틴이 결합된 야누스 나노입자의 크기 분포 및 제타 전위를 나타낸 그래프이다.
도 11은 TEM 이미지 및 렉틴이 결합된 야누스 나노입자의 개략도이다. 폴리스티렌 표면에 결합된 렉틴은 히드라지드(hydrazide) 작용화된 금 나노 입자와 렉틴의 탄수화물 알데히드 그룹 사이의 Wolff-Kishner 반응을 통해 확인된다.
2-4. 야누스 나노입자에 결합된 렉틴의 정량 분석
야누스 나노입자에 렉틴의 결합 정도를 확인하기 위하여, BCA 분석을 수행하였다. 구체적으로, BCA 단백질 정량분석은 시중에 판매되는 BCA 단백질 분석 키트(23225, thermo scientific)를 사용하여 진행하였으며, 본 제품의 스탠다드 프로토콜에 따라 분석을 수행하였다.
그 결과, 각 렉틴은 250㎍/㎖ 내지 563㎍/㎖의 단백질 농도를 나타내었다. 이를 통하여, 야누스 나노입자에 렉틴이 결합이 잘 되었음을 확인하였다.
도 12 내지 도 15는 각각 SNA, Con A, AAL 렉틴 및 췌장암세포 마커 항체인 CA 19-9의 야누스 나노입자에 대한 결합 정도를 농도에 따라 나타낸 그래프이다.
실시예 3: 렉틴이 결합된 야누스 나노입자의 친화도 확인
3-1. 렉틴이 결합된 야누스 나노입자의 세포에 따른 친화도 분석
야누스 나노입자의 세포 표면 위 형광분석을 통하여 렉틴이 결합된 야누스 나노입자의 세포에 따른 친화도를 분석하였다.
구체적으로, 야누스 나노입자에 실시예 1에서 선별한 각 렉틴(SNA, Con A, AAL) 또는 항체(CA 19-9)를 결합하여 각 세포주별 렉틴의 친화도를 평가하였으며, 렉틴이 결합된 야누스 나노입자의 상대 형광 강도는 세포주 처리 후 시간에 따라 측정하였다. 형광분석은 Synergy H1(BioTeK) 장비를 이용하여 진행하였으며, 96-웰 플레이트에 배양된 세포 샘플에 렉틴이 결합된 야누스 입자를 처리하여 비교하였다. 측정 조건은 다음과 같다: Excitation: 485, Emission: 528, Optics: Top, Gain: 125, ead Speed: Normal, Delay: 100msec, Measurements/Data Point: 10, Read Height: 5mm.
그 결과, SNA 렉틴이 췌장암 세포주(PANC-1)에 특이적인 친화도를 보이며 나머지 렉틴군의 암세포주에 대한 친화도는 약하거나 나타나지 않았다. CA19-9 또한 PANC-1 에 친화도를 보였으나 SNA 렉틴의 췌장암 세포주에 대한 친화도 보다는 약한 친화도를 보였다는 점에서, SNA 렉틴의 우수한 췌장암 세포주 친화도를 확인하였다.
도 16 내지 도 19는 각각 SNA, Con A, AAL 렉틴 또는 CA19-9 항체가 결합된 야누스 나노입자에 대한 상대 형광 강도를 나타낸 그래프이다. 각 시간(2h, 6h, 12h, 24h)에서의 값은 그림 도 16의 24시간 및 Panc-1에서의 형광 값으로 정규화된 것이다.
3-2. 렉틴이 결합된 야누스 나노입자의 공초점 현미경 분석
렉틴이 결합된 야누스 나노입자의 형광특성을 확인하기 위하여 공초점 현미경분석을 수행하였다. 24시간 배양된 세포에 일정농도의 샘플을 처리하고, 24시간 후 샘플 고정화 처리한 다음 공초점 현미경 분석을 진행하였으며, 24시간 동안 렉틴이 결합된 야누스 나노입자를 처리한 후 세포주를 모니터링 하였다. 청색 형광은 DAPI(ex: 358nm, em: 461nm)에서 나온 것이며, 적색 형광은 야누스 나노입자(ex: 520nm, em: 540nm)의 폴리스티렌에서 나온 것이다.
구체적으로, LSM710(Carl Zeiss, Germany) 공초점 현미경을 이용하여 세포분석을 진행하였으며, 세포핵 DAPI 염색 관찰을 위한 405nm 레이저와 야누스 입자 관측을 위한 514nm 레이저를 사용하였다. 공초점 현미경 분석을 위한 세포 샘플은 인큐베이터에서 하루 배양 후, 각 렉틴이 결합된 야누스 나노입자를 단백질 농도 기준으로 5㎍/㎖ 처리해주었으며, 입자 처리 후 24시간 후에 2% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 조건에서 워싱 과정과 함께 고정화 처리하였다.
그 결과, SNA 렉틴이 췌장암 세포주에 특이적인 친화도를 보여 세포 주변에 야누스 입자의 형광이 잘 관측되었으나, 나머지 렉틴군은 암세포주에 대해약한 친화도를 나타내거나, 또는 친화도를 나타내지 않았다. CA19-9 또한 PANC-1 에 친화도를 보이며, 이에 따른 입자의 형광이 관측되었으나, SNA 렉틴의 췌장암 세포주에 대한 친화도 보다는 약한 친화도를 보였다는 점에서, SNA 렉틴의 우수한 췌장암 세포주 친화도를 확인하였다.
도 20은 야누스 나노입자와 결합된 렉틴의 결합 친화성을 조사한 공초점 현미경 사진이다.
또한, Image J 프로그램을 이용하여, 렉틴이 결합된 야누스 나노입자의 형광이미지를 분석하였다.
구체적으로, 형광세기를 분석하고자 하는 이미지를 프로그램을 통해 불러온 후, 프로그램 내 영역 선택 Tool을 이용하여 분석 영역을 설정하였으며, 이미지 전체를 선택하였다. Analyze 탭의 Measure를 통해 형광감도를 분석한 후, intergrated density 수치를 비교하여 형광이미지의 분석을 수행하였다.
그 결과, SNA 렉틴이 결합된 야누스 나노입자의 PANC-1에 대한 강한 형광 수치를 확인하였으며, CA19-9 에서도 PANC-1 세포주에 대한 강한 형광수치를 확인하였다. 이를 통하여 췌장암 세포주 표면단백질에 시알산(sialic acid)이 많이 당화 되었음을 확인하였고, ALL 렉틴로 인하여 약한 Fucosylation이 나타났음을 확인하였다.
도 21 내지 도 25는 야누스 나노입자와 결합된 각 렉틴, CA19-9 또는 렉틴 및 항체가 결합되지 않은 경우, 각 세포와의 결합 친화성을 나타낸 그래프이다.
한편, 렉틴이 결합된 야누스 나노입자의 형광이미지를 3D z-stack 분석하였다.
구체적으로, LSM710 공초점 장비를 이용하여, 장비 프로그램 내 있는 Stack 옵션을 선택하여 2분동안 총 10장의 이미지를 공초점 위치에 따라 획득하였으며, 프로그램 내에서 분석되어 3차원으로 표시된 이미지를 최종 획득하였다.
그 결과, SNA 렉틴이 결합된 야누스 나노입자가 처리된 PANC-1에서는 세포주변에 야누스 나노입자의 붉은 형광이 잘 관측되었으나, Con A 렉틴이 결합된 야누스 나노입자가 처리된 PANC-1에서는 야누스 나노입자의 형광을 관측하기 어려웠다. 이를 통하여, SNA 렉틴의 PANC-1 세포주에 대한 특이적 친화성을 확인하였다.
도 26 및 도 27은 SNA 또는 Con A 렉틴이 결합된 야누스 나노입자가 처리된 PANC-1에서의 공초점 z-stack 3차원 재구성 이미지이다.
실시예 4: 렉틴이 결합된 야누스 나노입자를 이용한 엑소좀 확인
4-1. 엑소좀 분리
상기 실시예 1에서 선별한 렉틴의 엑소좀 검출 능력을 확인하기 위하여 엑소좀을 분리하였다.
구체적으로, 췌장암 세포주(Human pancreatic ductal carcinoma cell line: Panc-1), 자궁경부암 세포주(human cervical cancer cell: HeLa), 유방암 세포주(human breast adenocarcinoma: MDA-MB-231), 인간 피부 섬유아세포(human dermal fibro blast: HDFB), 인간 배아 신장세포(human embryonic kidney cell: HEK293T) 및 정상 표피세포를 각각 48시간 동안 배양한 후 배양 배지를 수거하여 원심분리로 엑소좀(exosome)을 분리하였다.
4-2. 세포 독성 확인
렉틴이 결합된 야누스 나노입자의 세포주에 대한 독성을 나타내는지 확인하였다.
구체적으로, MTT 분석을 통하여 실시예 4-1의 세포주에 대한 렉틴이 결합된 야누스 나노입자의 독성을 평가하였다. 50㎍/㎖ 내지 2.5㎍/㎖의 단백질 농도에서 독성을 평가하였으며, 렉틴 또는 항체가 결합된 야누스 나노 입자로 24시간 동안 처리한 후 세포주의 생존율을 확인하여 독성을 평가하였다. MTT 분석은 AMRESCO 사의 MTT 시약분말을 2㎎/㎖ 준비하고, 96-웰 플레이트 상에 하루 배양된 세포에 각 농도별로 샘플을 처리해준 후 하루 더 인큐베이터 상에 배양한 다음, 마지막으로 MTT solution을 각 웰에 100㎕ 씩 적용하여 수행하였다. MTT 처리가 완료된 샘플에 대하여, 전술한 형광 분석장비를 이용하여 570nm 파장 영역 에서의 흡광도를 측정함으로써, 세포 독성을 확인하였다.
그 결과, HeLa 세포주에서 SNA 및 Con A 렉틴은 5㎍/㎖ 이상의 농도에서 70% 이하의 생존을 보였고, AAL 렉틴 및 CA19-9 항체는 HEK293 세포주에서 다소 낮은 생존율을 보였으나, 대부분의 경우, SNA, Con A 및 AAL 렉틴은 5㎍/㎖ 농도 이하에서 70% 이상의 생존률을 나타내었다.
도 28 내지 도 31은 MTT 분석을 통한 각 렉틴 또는 CA19-9 항체에 대한 세포 생존력 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
4-2. 렉틴이 결합된 야누스 나노입자를 이용한 췌장암 유래 엑소좀 확인
엑소좀을 분리하기 위한 비유동 유전영동 시스템(non-current dielectrophoresis system)을 제작하기 위하여 유리 기판 또는 실리콘 웨이퍼 위에 원하는 전극 디자인을 가지는 마스크를 올리고, 크롬과 금을 연속적으로 증착시켰다. 이후 전극 위에 입자 현탁액을 가둘 수 있는 챔버를 제작하여 유체의 흐름이 없는 비유동 유전영동 소자를 제작하였다. 유전영동 시스템에 교류전압을 가할 경우 입자와 미디어에 가해지는 상대적인 유전영동 힘의 차이에 따라 양/음의 유전영동(positive/negative dielectrophoresis) 방향이 결정된다. 교류전압의 진동수, 입자의 크기 및 미디어의 유전특성 등에 따른 유전영동 거동을 정확히 분석하고 이를 입자 분리에 적용하면 엑소좀을 분리할 수 있다.
비유동 유전영동 시스템을 이용하여 야누스 입자와 엑소좀의 결합 유무에 따른 유전영동 거동을 1차적으로 확인하고, 연속적인 미세유체 유전영동(microfluid dielectrophoresis) 소자를 구현하여 시간당 엑소좀 분리 수율을 향상시켰다. 미세유체 시스템에서 분리된 엑소좀 결합 야누스 입자를 분리하여 PCR 또는 광학장비로 확인하여 엑소좀 분리 효율을 판단하였다.
각 유전영동 시스템으로 분리한, 엑소좀이 결합된 야누스 나노입자에 대하여 엑소좀 특이마커(CD63)에 대한 ELISA 및 웨스턴 분석을 수행하면 췌장암 특이적인 엑소좀을 확인할 수 있다. 또한, 분리된 엑소좀 내에 존재하는 DNA를 PCR로 분석하여 췌장암 세포에서 특이적으로 발현되는 K-Ras 점 돌연변이(point mutation)를 확인할 수 있다.
도 32는 렉틴이 결합된 야누스 나노입자와 상기 렉틴 특이적 당단백질이 발현된 엑소좀의 결합 모습을 예시적으로 보여주는 것이다.
도 33은 야누스 나노입자를 포함하는 미세유체 유전영동 시스템(microfluid dielectrophoresis system)을 이용하여 엑소좀을 분리하는 방법을 보여주는 도이다.
도 34은 야누스 나노입자를 포함하는 미세유체 유전영동 시스템의 작동 원리 및 시뮬레이션 과정을 보여주는 것이다. 왼쪽 패널은 유체의 흐름이 없는 비유동 시스템에서 야누스 입자의 유전영동 거동을 확인한 후 이를 미세유체 시스템에 적용하여 연속적인 엑소좀 검출 시스템을 구현한 것이다. 야누스 나노입자의 유전영동에 영향을 미칠 수 있는 파라미터에는 AC 주파수 및 전압의 크기, 전극 디자인, 입자의 크기, 전해질 매질의 종류 및 야누스 입자에서 금 박막의 커버리지 등이 있다. 중간 패널은 미세유체 유전영동 시스템에 적용할 전극 패턴을 보여주는 것이고, 오른쪽 패널은 유전영동 실험 결과를 이론적으로 예측/분석할 수 있는 시뮬레이션 프로세스를 보여주는 것이다.
한편, PANC-1 췌장암 세포주로부터 추출한 엑소좀과 각 렉틴이 결합된 야누스 나노입자의 결합능을 비교하였다.
구체적으로, 췌장암 세포주의 엑소좀 판별 여부를 위하여 엑소좀 마커와 췌장암 세포주 마커를 웨스턴 블롯팅(western blotting) 분석을 통해 확인하였다. 각 암세포주 및 일반 세포로부터 분리된 엑소좀을 RIPA buffer containing protease inhibitor cocktail & Phosphatase inhibitor cocktail(Invitrogen)로 용해(lysis)하였다. 각 샘플로부터, BCA 분석(Invitrogen)을 통하여 단백질을 정량(quantification) 하였으며, 이를 통하여 정규화된(normalized) 동량의 단백질을 폴리아크릴아마이드 젤(polyacrylamide gel)을 통하여 전기영동 구배(electrophoretic gradient)를 주었다. 그 후, 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 멤브레인(Merck millipore)으로 트랜스퍼(transfer) 하였으며, 단백질 블롯(blot)을 1시간 동안 실온(room temperature)에서 5% Skim milk in TBST로 블로킹(blocking) 하였다. 그리고 나서 일차 항체(primary antibody)(1:1000 anti-CD63, 1:000 anti-CD81 및 1:1000 anti-EphA2(Santa-Cruz))와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 후, HRP-컨쥬게이트된 이차 항체(conjugated secondary antibody)(Cell signaling)를 1시간 실온에서 반응시켰다. 그 다음, TBST로 3회 10분씩 세척 하였으며, Chemidoc(biorad)를 이용하여 블롯팅(blotting)을 확인하였다. 각 세포로부터 추출된 엑소좀은 미디어를 추출하여, 500g에서 10분간 원심분리 후 상층액을 수득한 다음, 12,000g에서 20분간 원심분리 후 상층액을 수득하였다. 그 후, Exoquick(System biosciences)을 이용하여 엑소좀을 제조사의 프로토콜에 따라 추출하였다.
그 결과, 엑소좀 형태의 미세소낭이 관측되었다. 또한, 웨스턴 블롯팅을 통하여 엑소좀 마커(CD81, CD63)의 여부를 확인하였으며, 동시에 췌장암 세포주 마커 (EphA2)를 확인하여, 췌장암 유래 엑소좀임을 확인하였다. 이를 통하여, SNA 렉틴이 결합된 야누스 나노입자의 췌장암 엑소좀 검출능을 확인하였다.
도 35은 Panc-1 세포에서 분리된 췌장암 엑소좀을 나타낸 사진이다.
도 36는 SNA 렉딘 단백질이 결합된 야누스 나노입자에 포획된 엑소좀을 나타낸 사진이다.
도 37은 Panc-1 세포의 엑소좀에서의 CD81, CD63 및 EphA2 발현을 웨스턴 블롯팅 분석에 의하여 확인한 사진이다.
한편, TEM 분석 및 입자 개수를 통하여 각 렉틴이 결합된 야누스 나노입자와 추출된 엑소좀의 반응 후 엑소좀 결합능을 비교하였다.
구체적으로, 입자 개수는 엑소좀과 야누스 입자의 반응 후 원심분리를 이용하여 엑소좀과 결합된 야누스 나노입자의 분리 후, 상등액에 존재하는 잉여 엑소좀을 검측하여 수행하였으며, Energy-Filtering Transmission Electron Microscope(LIBRA 120, Carl Zeiss) 장비를 이용해 투과전자형미경 분석을 진행하였다. 측정하고자 하는 샘플은 Cu gird 위에 로딩하여 준비하였으며, 엑소좀 분석에는 negative staining을 위해 각 샘플마다 2% uranyl acetate 를 적용하여 염색하였다. 용매 내 존재하는 입자 또는 엑소좀은 Nanoparticle tracking 분석을 통하여 확인하였으며, Malvern Panalytical 사의 NS300 장비를 이용하였다.
구체적으로, 입자 개수는 엑소좀과 야누스 입자의 반응 후 원심분리를 이용하여 엑소좀과 결합된 야누스 나노입자의 분리 후, 상등액에 존재하는 잉여 엑소좀을 검측하여 수행하였다.
그 결과, AAL 렉틴이 엑소좀 검출능이 가장 우수한 것으로 확인되었다. 이는췌장암 세포주는 Fucosylated 단백질을 만들어 내는 것으로 알려져 있는데, 세포의 엑소좀 생성과정중, 세포내 Multivescular body(MVB)로의 intracellular budding 과정을 통해 엑소좀이 형성 되면서 유입된 새포내 단백질 및 엑소좀 단백질의 영향으로 확인된다.
선별된 췌장암 유래 엑소좀과 각 렉틴이 수식된 야누스 나노입자의 반응을 통하여, 렉틴이 결합된 야누스 나노입자의 엑소좀 검출능을 확인하였다.
도 38은 렉틴이 결합되지 않은 야누스 나노입자, 렉틴이 결합된 야누스 나노입자 및 췌장암세포 마커 항체인 CA 19-9가 결합된 야누스 나노입자와 췌장암 유래 엑소좀의 결합을 확인한 사진이다.
도 39는 각 렉틴에 결합된 야누스 나노입자의 엑소좀 검출능을 나타낸 그래프이다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (10)

  1. 엑소좀 결합 분자가 연결된 나노입자를 포함하는 암 진단용 조성물로서,
    상기 나노입자는 입자 표면의 일부분이 금속으로 코팅된 것이고,
    상기 나노입자는 폴리스티렌이고,
    상기 금속은 금(Au)이고,
    상기 암은 췌장암이고,
    상기 엑소좀 결합 분자는 AAL(Aleuria Aurantia Lectin)인 것인
    암 진단용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 검사하고자 하는 대상체로부터 분리한 생물학적 시료와 제1항의 조성물을 접촉시키는 단계; 및
    나노입자와 결합한 엑소좀을 확인하는 단계를 포함하는 췌장암 진단을 위한 정보제공방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 및 뇨로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 췌장암 진단을 위한 정보제공방법.
  9. 전극이 배치된 하부 기판;
    상기 하부 기판과 연결되어 유체가 유동할 수 있는 유체 채널을 형성하는 상부 기판; 및
    외부 전원을 포함하는 엑소좀 검출 및 분리 장치에 있어서,
    상기 전극은 채널을 통하여 이동하는 유체의 흐름 방향과 직교하도록 배치되고,
    상기 유체 채널은 제1항의 조성물을 포함하는 것인 엑소좀 검출 및 분리 장치.
  10. 삭제
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