KR101546076B1

KR101546076B1 - 마그네틱 비드와 식물―유래된 렉틴을 이용한 시료 내 간형 a형 바이러스 또는 노로바이러스의 신속 검출방법

Info

Publication number: KR101546076B1
Application number: KR1020130060995A
Authority: KR
Inventors: 김두운; 권요셉; 고상무; 최종순; 백근식; 이희민
Original assignee: 전남대학교산학협력단; 한국기초과학지원연구원
Priority date: 2013-05-29
Filing date: 2013-05-29
Publication date: 2015-08-20
Also published as: KR20140140311A

Abstract

본 발명은 바이오틴-결합 모이어티(biotin-binding moiety)가 연결된 자성 입자(magnetic particle) 및 바이오틴 모이어티(biotin moiety)가 연결된 식물-유래된 렉틴(plant-derived lectins)을 포함하는 간염 A형 바이러스(hepatitis A virus, HAV) 또는 노로바이러스 검출용 조성물 및 이의 검출방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물 및 방법은 식물-유래된 렉틴을 이용하여 시료 내에서 HAV 또는 노로바이러스를 신속하고 용이하게 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 상술한 바이러스 감염에 의한 피해를 초기에 정확하고 용이하게 진단하는 데 적용될 수 있다.

Description

마그네틱 비드와 식물―유래된 렉틴을 이용한 시료 내 간형 A형 바이러스 또는 노로바이러스의 신속 검출방법{Rapid Methods for Detecting Hepatitis A Virus or Norovirus in a Sample Using a Magnetic Bead and Plant-Derived Lectins}

본 발명은 마그네틱 비드와 식물-유래된 렉틴을 이용한 시료 내 간형 A형 바이러스 또는 노로바이러스용 조성물 및 이를 이용한 검출방법에 대한 것이다.

농수축산물 유래 식품 중 위해요소로 인해 발생한 사건사고들은 국민들의 건강에 심각하게 영향을 미치며 적절한 조기 검출방법 및 제도의 부재로 발생되는 국내 식중독 사례에 의한 경제적 손실이 한 해 1조 3,000억원에 이른다. 바이러스 식중독이 전체 식중독의 34-40%를 차지한다고 계산하더라도 바이러스 식중독에 의한 손실만 4,000억 원에 이르고 있기에 농수축산물 생산 현지에서부터 바이러스성 식중독의 예방차원과 소비자와 생산자에게 안전한 먹거리 생산을 목적으로 활용 가능한 바이러스 진단법 개발연구는 이러한 사회적 손실을 사전에 막을 수 있는 방법이다.

현대도시환경의 위생상태가 많이 개선되고 있음에도 불구하고 최근 노로바이러스(norovirus) 감염사례가 증가하고 있는 추세가 보고되고 있으며, 과일류 및 채소류를 포함한 농산물 검체에서 노로바이러스의 검출사례 또한 국내외에서 보고되고 있다. 노로바이러스는 주로 신선하지 않은 굴을 날로 먹었을 때 발생하기 쉽고, 채소 등에서도 감염될 수 있다. 주로 익히지 않은 음식 중 노로바이러스에 감염된 식품을 섭취하였을 때 감염되기 쉽고, 지하수의 오염으로 인한 식수에 의해서도 감염된다. 이러한 노로바이러스 진단법은 단일클론 또는 다중클론 항체를 이용한 효소면역법, 분자생물학적 검사를 통한 검사법에 국한되어 있어 이를 최종 사용자가 현장에서 사용하기에 부적합한 단계이며, 주로 지하수, 어패류 및 식육제품과 채소류 일부를 대상으로 시험방법이 이뤄지고 있는 현실이다.

따라서, 다양한 농축수산물에 대한 신속진단법을 위해서는 현재 사용되고 있는 바이러스 순수 분리방법 및 분자생물학적 진단법의 한계점을 다음과 같이 해결하는 방안이 필요하다.

첫째, 일반적으로 바이러스의 순수분리는 숙주세포에 접종하여 계대함으로써 다른 종은 희석되고 목표로 하는 종을 다량 배양하여 분리하는 식이었다. 그러나 이와 같은 방법은 시간과 비용이 많이 소요되었다. 그래서 본 연구에서는 시간을 단축시키면서 정확히 목표로 하는 바이러스만을 분리하고자 하였다.

둘째, 식품 중에는 다양한 물질이 존재하고 이들 중 일부는 분자생물학적 특정유전자증폭방식의 반응을 방해하는 물질로 작용하므로 실제로 바이러스가 존재함에도 불구하고 유전자 증폭을 방해하여 바이러스가 오염되지 않은 것으로 잘못 판정하는 경우가 많을 수 있으므로 본 연구에서는 효과적으로 검체에서 바이러스를 검출하기 위해서 마그네틱 면역프로브로서 항체가 아닌 식물성 소재(예컨대, 대두)-유래된 렉틴을 활용하여 효과적으로 회수농축하며 또한 방해물질을 효율적으로 제거하기 위한 바이러스 전처리 기술을 제공하여 검출력을 더욱 높여주며, 기존의 면역학적 방법 및 미세유체방식의 진단법과 결합하여 사용한다면 민감성이 우수한 바이러스 검출 기반을 제공하고자 한다.

본 발명자들은 바이러스(예컨대, HAV 또는 노로바이러스)를 신속하게 검출하기 위한 신규한 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 자성 비드와 식물-유래된 렉틴(구체적으로는, soybean agglutinin)으로 구성된 바이러스 프로브를 제조하였으며, 유전자 증폭 과정(예컨대, RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction))을 통해 시료 내 HAV(hepatitis A virus) 및 노로바이러스를 간편하고 신속하게 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 간염 A형 바이러스(hepatitis A virus, HAV) 또는 노로바이러스 검출용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 시료 내 간염 A형 바이러스(hepatitis A virus, HAV) 또는 노로바이러스 검출 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 바이오틴-결합 모이어티(biotin-binding moiety)가 연결된 자성 입자(magnetic particle) 및 (b) 바이오틴 모이어티(biotin moiety)가 연결된 식물-유래된 렉틴(plant-derived lectins)을 포함하는 간염 A형 바이러스(hepatitis A virus, HAV) 또는 노로바이러스 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 시료 내 간염 A형 바이러스(hepatitis A virus, HAV) 또는 노로바이러스 검출 방법을 제공한다:

(a) 바이오틴-결합 모이어티(biotin-binding moiety)가 연결된 자성 입자(magnetic particle)와 바이오틴 모이어티(biotin moiety)가 연결된 식물-유래된 렉틴(plant-derived lectins)으로 구성된 바이러스 프로브를 제조하는 단계;

(b) 상기 바이러스 프로브를 시료에 첨가하는 단계; 및

(c) 상기 바이러스 프로브로부터 바이러스를 분리 및 검출하는 단계로, 상기 검출은 분리된 HAV 또는 노로바이러스에 대한 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)을 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.

본 발명자들은 바이러스(예컨대, HAV 또는 노로바이러스)를 신속하게 검출하기 위한 신규한 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 자성 비드와 식물-유래된 렉틴(구체적으로는, soybean agglutinin)으로 구성된 바이러스 프로브를 제조하였으며, 유전자 증폭 과정(예컨대, RT-PCR)을 통해 시료 내 HAV 및 노로바이러스를 간편하고 신속하게 검출할 수 있음을 확인하였다.

사람에게 집단식중독을 일으키는 노로바이러스는 1968년 미국오하이오주Norwalk 초등학교에서 발생한 집단 식중독 환자에서 처음으로 발견되어 노워크바이러스로 알려졌으나, 최근에 노로바이러스로 공식 명명이 승인되었다.

노로바이러스는 약 28-35 nm의 직경을 가지는 비외피(nonenveloped) 단일-가닥 RNA 바이러스(약 7.6 kb의 게놈에서 3개의 ORF(1-3)를 발현함)로 분변-구강 경로(fecal-oral route)를 통해 인간들 사이로 전파된다. 노로바이러스는 낮은 양의 투여량(예컨대, 약 18 내지 1,000 바이러스 입자)으로도 감염이 되어 장기간 지속된다. 노로바이러스의 감염은 구토, 수양성 설사, 오심, 메스꺼움, 발열 증상을 나타내는 질환들(예컨대, 식중독, 급성 바이러스 위장염, 등)을 유발한다. 하지만, 노로바이러스의 유전자타입(genotype; 크게 다섯 개의 유전자군, GI-GV)이 매우 다양해서 이에 대한 인체의 면역학적 저항성이 미미한 실정이다.

간염 A형 바이러스(Hepatitis A virus, HAV)는 피코나바이러스 과(picornavirus family)에 속하는 작은 비외피성 20면체형 단일-가닥 RNA 바이러스로, 분변-구강 경로를 통해 전파되는 감염성 또는 유행성 간염의 원인이다. 간염(Hepatitis)은 간의 염증을 의미하는 말로, 염증은 상처 또는 감염에 의해 몸의 조직 또는 기관에 고통스럽고 붉은 부풀어오름을 유발하여 정상적으로 기능할 수 없도록 한다.

노로바이러스 및 간염 A형 바이러스는 모두 작은 물방울(droplet), 오염된 음식, 물, 매개물(fomites; 예컨대, 옷, 침구, 등) 및 사람들 간의 접촉(예컨대, 악수, 섹스, 등)을 통해 감염될 수 있다.

본원발명은 인체에 심각한 손상을 유발하는 노로바이러스 또는 간염 A형 바이러스의 신속하고 편리한 검출 방법을 제공한다.

본원발명의 기술적인 특징은 식물-유래된 렉틴을 이용하여 노로바이러스 또는 간염 A형 바이러스를 분리하고 마그네틱 비드(magnetic beads)를 통해 용이하게 수득하여 검출하는 것이다.

먼저, 노로바이러스 또는 간염 A형 바이러스 검출용 바이러스 프로브를 제작한다. 상기 바이러스 프로브는 바이오틴-결합 모이어티(biotin-binding moiety)가 연결된 자성 입자(magnetic particle) 및 바이오틴 모이어티(biotin moiety)가 연결된 식물-유래된 렉틴(plant-derived lectins)으로 구성된다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 바이오틴-결합 모이어티는 바이오틴 또는 이의 유도체와 결합할 수 있는 물질로, 아비딘 및 스트렙타비딘을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 바이오틴-결합 모이어티가 연결된 자성 입자는 자성을 가지는 물질로, 당업계에 알려진 어떠한 자성입자도 이용될 수 있다. 예를 들어, 산화철 자성 입자로는 마그네타이트(Magnetite; Fe₃O₄), 마그헤마이트(Maghemite; Fe₂O₃) 또는 헤마타이트(Hematite; Fe₂O₃) 등을 들 수 있다. 상기 자성 입자는 외부 자기장을 이용하여 용이하게 분리될 수 있다. 통상적으로, DNA, RNA, 단백질 등을 포함하는 바이오 물질의 분리/정제에 이용되는 자성 입자의 크기는 약 500-2,000 nm가 적당한 것으로 알려져 있다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 자성 입자는 마그네틱 비드를 이용하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 바이오틴 모이어티(biotin moiety)가 연결된 식물-유래된 렉틴(plant-derived lectins)은 타겟 바이러스(예컨대, 노로바이러스 또는 간염 A형 바이러스)와 결합하는 타게팅 모이어티(targeting moiety)로서 기능한다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 바이오틴 모이어티는 아비딘, 스트렙타비딘 또는 이의 유도체들과 결합할 수 있는 바이오틴 또는 이의 유도체를 포함하고, 보다 구체적으로는 바이오틴, 노르바이오틴(norbiotin), 호모바이오틴(homobiotin), 옥시바이오틴(oxybiotin), 이미노바이오틴(iminobiotin), 데스티오바이오틴(desthiobiotin), 디아미노바이오틴(diaminobiotin), 바이오틴 설폭사이드(biotin sulfoxide), 바이오틴 설폰(biotin sulfone) 및 다른 바이오틴 분자들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서의 용어 "타겟팅 모이어티(targeting moiety)"는 타겟 미생물(예컨대, 노로바이러스 또는 간염 A형 바이러스)의 표면에 존재하는 항원에 결합할 수 있는 모든 물질로 단백질, 펩타이드, 항체 또는 이의 단편을 포함하며, 보다 구체적으로는 식물-유래된 렉틴이고, 보다 더 구체적으로는 대두-유래된 렉틴(SBA)이다.

렉틴(soybean agglutinin, SBA)은 비공유적 조합을 통해 세포 표면 카보하이드레이트에 특이적으로 결합하여 세포 응집을 촉발시키는 비면역 기원(nonimmune origin)의 당단백질인 식물 렉틴이다. 따라서, 렉틴은 다양한 형태의 세포들(예컨대, 골수단핵세포, 인간 조혈전구세포, 종양세포, 등)을 분획화시키는데 이용되어 왔다. 대부분의 렉틱이 수용성 카보하이드레이트 또는 당단백질 또는 당지질의 일부인 카보하이드레이트 모이어티에 결합할 수 있기 때문에, 동물 세포를 응집시켜 당컨쥬게이트로 침전시킨다. 따라서, 바이오틴화된 렉틴은 당컨쥬게이트를 조사하기 위한 이상적인 중간매개물이다.

이후, 제조된 바이러스 프로브를 시료에 첨가하여 타겟 바이러스를 분리한다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 바이러스 프로브는 시료 내 HAV 또는 노로바이러스와의 결합을 통해 자성 입자-렉틴-바이러스 복합체(magnetic particle-lectin-virus complex)를 형성한다.

본 발명에서 용어 "시료"는 인체 또는 포유동물로부터 얻어지는 모든 시료를 의미한다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물 및 방법이 적용될 수 있는 시료는 생물학적 시료, 화학적 시료 및 환경 시료를 포함한다. 보다 구체적으로는, 상기 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 바이러스, 세균, 조직, 세포, 림프, 골수액, 타액, 우유, 소변, 분변, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수, 양막액, 세포 조직액 및 세포 배양액을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

마지막으로, 상기 복합체로부터 바이러스를 수득하여 분석한다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 프라이머는 유전자 증폭 반응(amplification reactions)에 이용된다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에서 HAV 또는 노로바이러스의 검출은 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reactions)을 이용하여 실시한다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 본 명세서에 기재된 용어 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고 되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 멀티플렉스 PCR(McPherson and Moller, 2000), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification, TMA; WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication; WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction, CP-PCR; 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction, AP-PCR; 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification, NASBA; 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호 및 제6,063,603호) 및 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)을 포함하나, 이에 한정되지는 않으며 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머"는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 구체적으로는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다. 용어 "어닐링" 또는 "프라이밍"은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.

본 발명의 방법을 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 수득된 마그네틱 비드로부터 추출된 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

본 명세서 용어 "혼성화(hybridization)"는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다. 용어 "어닐링"과 "혼성화"는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 '클레나우' 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg²⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 타겟 미생물(예컨대, 노로바이러스 또는 간염 A형 바이러스)의 존재 유무를 확인할 수 있다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 PCR에 이용되는 프라이머 쌍은 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열목록의 프라이머 쌍 또는 서열목록 제3서열 및 서열목록 제4서열목록의 프라이머 쌍을 포함한다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 증폭은 실시간 PCR에 따라 실시된다.

실시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 분석하는 기술이다(Levak KJ, et al., PCR Methods Appl., 4(6): 357-62(1995)). PCR 생산물의 증가가 타겟 템플레이트의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 C _T 값(threshold cycle)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다. 종래의 PCR 방법에 비해, 실시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태(plateau)에서 측정되는 반면에, 실시간 PCR은 지수성장기(exponential growth phase) 동안 데이터를 얻을 수 있다; (b) 리포터 형광 시그널의 증가는 발생된 앰플리콘(amplicons)의 수와 직접적으로 비례한다; (c) 분해된 프로브는 앰플리콘의 영구적인 기록 증폭(record amplification)을 제공한다; (d) 검출 범위의 증가; (e) 종래 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 적은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다; (g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적다.

PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 한계치(threshold)를 설정하면 한계치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 C _T 값이 산출된다.

실시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 interchelating 방법(SYBR 그린 I 방법), 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다. interchelating 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요하 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있다. 형광 표지 프로브를 이용하는 방법은 고비용이 드는 반면에 검출 특이성이 높아 유사 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다.

먼저, interchelating 방법은 이중 가닥 DNA 결합 다이를 이용하는 방법으로, 비-서열 특이적 형광 intercalating 시약(SYBR 그린 I 또는 ethidium bromide)을 이용하여 비-특이적 증폭 및 프라이머-다이머 복합체를 포함하는 앰플리콘 생산을 정량하는 것이다. 상기 시약은 ssDNA와는 결합하지 않는다. SYBR 그린 I은 이중 가닥 DNA의 마이너 그루브(minor groove)에 결합하는 형광성 다이로, 용액 상에서는 거의 형광을 보이지 않지만 이중 가닥 DNA와 결합하면 강한 형광을 나타내는 시약(interchelator)이다(Morrison TB, Biotechniques., 24(6): 954-8, 960, 962(1998)). 따라서 SYBR 그린 I과 이중 가닥 DNA 간의 결합을 통해 형광을 방출하기 때문에 증폭 산물의 생성량을 측정할 수 있다. SYBR 그린 실시간 PCR은 앰플리콘 동정을 위해 융해점(melting point) 또는 해리 곡선(dissociation curve) 분석과 같은 최적화 과정을 동반한다. 정상적으로 SYBR 그린은 싱글플렉스(singleplex) 반응에 이용되지만, 융해곡선(melting curve) 분석이 동반되면 멀티플렉스(multiplex) 반응에 이용될 수 있다(Siraj AK, et al., Clin Cancer Res., 8(12): 3832-40(2002); 및 Vrettou C., et al., Hum Mutat., Vol 23(5): 513-521(2004)).

C _T (threshold cycle) 값은 반응에서 발생된 형광이 역치(threshold)를 넘어서는 사이클 수를 의미하며, 이는 초기 카피 수의 대수에 반비례한다. 그러므로, 특정 웰에 할당된 C _T 값은 반응에서 앰플리콘의 충분한 수가 축적된 사이클의 수를 반영한다. C _T 값은 ΔRn의 증가가 처음으로 검출된 사이클이다. Rn은 각 시점에서 PCR 동안 발생된 형광 시그널의 크기를 의미하며, ΔRn은 레퍼런스 다이의 형광 방출 강도로 나뉘어진 리포터 다이의 형광방출 강도(표준화된 리포터 시그널)를 의미한다. C _T 값은 LightCycler에서는 Cp(crossing point)로도 명명된다. C _T 값은 시스템이 로그-선형 단계(log-linear phase)에서 PCR 생산물의 지수성장과 관련된 형광 시그널의 증가를 검출하기 시작하는 시점을 나타낸다. 이 시기는 반응에 대한 가장 유용한 정보를 제공한다. 로그-선형 단계의 기울기는 증폭 효율(amplification efficiency, Eff)을 나타낸다(http://www.appliedbiosystems.co.kr/).

한편, TaqMan 프로브는 전형적으로 5'-말단에 형광물질 및 3'-말단에 퀀처(예컨대, TAMRA 또는 비-형광 퀀처(NFQ))를 포함하는 프라이머(예컨대, 20-30 뉴클레오타이드) 보다 더 긴 올리고뉴클레오타이드이다. 여기된 형광물질은 형광을 내기 보다는 근처의 퀀처에 에너지를 전달한다(FRET = Frster or fluorescence resonance energy transfer; Chen, X., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94(20): 10756-61(1997)). 그러므로, 프로브가 정상인 경우, 어떠한 형광도 발생되지 않는다. TaqMan 프로브는 PCR 생산물의 내부 부위에 어닐링할 수 있도록 고안된다. 구체적으로는, TaqMan 프로브는 증폭될 타겟 서열 절편의 내부서열로 고안될 수 있다.

TaqMan 프로브는 어닐링 단계에서 템플레이트 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브 상에 퀀처에 의해 형광 발색이 억제된다. 연장 반응 시에 Taq DNA 폴리머라제가 갖는 5' to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 템플레이트에 혼성화한 TaqMan 프로브가 분해되어 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 퀀처에 의한 억제가 해제되어 형광은 나타낸다. 이 때, TaqMan 프로브의 5'-말단은 상기 연장 프라이머의 3'-말단의 다운스트림에 위치하여야 한다. 즉, 연장 프라이머의 3'-말단이 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 연장되는 경우, 이 중합효소의 5' to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 TaqMan 프로브의 5'-말단이 절단되어 리포터 분자의 형광 시그널이 발생하게 된다.

TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 모두 형광성 물질이다. 본 발명에 이용될 수 있는 형광성 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있으며, 그 예는 다음과 같다(괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다): Cy2^TM (506), YO-PRO^TM-1 (509), YOYO^TM-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX^TM (519), Alexa^TM (520), Rhodamine 110 (520), 5-FAM (522), Oregon Green^TM 500 (522), Oregon Green^TM 488 (524), RiboGreen^TM (525), Rhodamine Green^TM (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green^TM (531), Calcium Green^TM (533), TO-PRO^TM-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3^TM (570), Alexa^TM 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange^TM (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange^TM (576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red^TM (590), Cy3.5^TM (596), ROX (608), Calcium Crimson^TM (615), Alexa^TM 594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PRO^TM-3 (631), YOYO^TM-3 (631), R-phycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TO-PRO^TM-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5^TM (670), Thiadicarbocyanine (671) 및 Cy5.5 (694).

적합한 리포터-퀀처 쌍(pairs)은 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce et al., editors, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2nd EDITION (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, INDICATORS (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; U.S. Pat. Nos. 3,996,345 and 4,351,760.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 바이오틴-결합 모이어티(biotin-binding moiety)가 연결된 자성 입자(magnetic particle) 및 바이오틴 모이어티(biotin moiety)가 연결된 식물-유래된 렉틴(plant-derived lectins)을 포함하는 간염 A형 바이러스(hepatitis A virus, HAV) 또는 노로바이러스 검출용 조성물 및 이의 검출방법에 관한 것이다.

(b) 본 발명의 조성물 및 방법은 식물-유래된 렉틴을 이용하여 시료 내에서 HAV 또는 노로바이러스를 신속하고 용이하게 검출할 수 있다.

(c) 따라서, 본 발명의 방법은 상술한 바이러스 감염에 의한 피해를 초기에 정확하고 용이하게 진단하는 데 적용될 수 있다.

도 1은 본 발명에서 제작된 렉틴-마그네틱 비드를 이용한 타겟 바이러스의 검출 방법을 도식적으로 보여주는 도면이다.
도 2는 본 발명에서 제작된 렉틴-마그네틱 비드를 이용하여 간염 A형 바이러스를 검출한 RT-PCR 결과이다.
도 3은 본 발명에서 제작된 렉틴-마그네틱 비드를 이용하여 노로바이러스를 검출한 RT-PCR 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 간염 A형 바이러스(HAV)와 노로바이러스(Norovirus)의 순수 분리를 위한 렉틱이 연결된 마그네틱 비드의 제조

본 발명은 바이러스 진단기술로 자성체인 마그네틱 비드에 연결된 스트렙타비딘(streptavidin)에 바이오틴화(biotinylation)된 대두-유래 렉틴(Soybean agglutinin, SBA)을 연결하여 바이러스 프로브(probes)를 제조하였다. SBA는 바이오틴-XX 마이크로스케일 단백질 표지 키트(Biotin-XX microscale protein labeling kit, B30010; Molecular Probes)의 제작 방법에 따라 바이오틴화시켰다. 간략하게는, 표지 반응(labeling reaction)을 시작으로 컴포넌트 C를 포함하는 반응 튜브에 100 ㎕의 SBA(1 mg/ml)와 1 M 소듐 바이카보네이트를 섞은 후 1 ㎕의 바이오틴-XX SSE(6-((6-((biotinoyl)amino)hexanoyl) amino)hexanoic acid, sulfosuccinimidyl ester sodium salt)를 첨가하여 상온에서 15분 동안 반응시켰다. 본 기술의 특징 사항으로서의 바이오틴-결합된 SBA를 정제 과정을 거친 후, 바이오틴화된 SBA를 스트렙타비딘이 결합된 마그네틱 비드와 연결하여 바이러스 프로브를 제조하였다(도 1). 제조된 바이러스 프로브를 포함하는 튜브에 간염 A형 바이러스 또는 노로바이러스를 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 면역학적 반응이 끝난 후 바이오틴화된 SBA가 결합된 마그네틱 비드에 항원(예컨대, 바이러스)-렉틴 간의 결합이 이루어진 부분은 자석으로 딸려오게 되고, 결합하지 못한 여타의 바이러스가 포함된 상층액은 PCR 분석을 위해 새로운 1.5 ml 튜브에 옮겼다. 스트렙타비딘에 붙어있는 항원-SBA 결합체를 200 ㎕의 PBS(Phosphate Buffered Saline; 바이오세상, 한국)로 3회에 걸쳐서 세척하여 불순물을 제거한 후, 100 ㎕의 PBS로 현탁하여 새로운 1.5 ml 튜브로 옮겨 상층액을 제거하였다. 상기 튜브에 존재하는 스트렙타비딘에 결합되어 있는 항원-SBA 결합체를 분리하기 위해, 용리액(50 mM Glycine, pH 2.8)으로 용리하고 100 mM Tris 용액을 이용하여 pH 7.5로 중화시켰다. 이후, 간염 A형 바이러스 및 노로바이러스의 분리를 확인하기 위해 RT-PCR을 실시하였다.

실시예 2: 식물(대두)-유래된 렉틴이 결합된 마그네틱 비드를 이용한 간염 A형 바이러스(HAV)와 노로바이러스(Norovirus)의 분리 및 검출

렉틴이 결합된 마그네틱 비드를 이용하여 혼합된 바이러스로부터 분리 및 검출하고자 하는 목적 바이러스의 존재 여부를 확인하고자, 마그네틱 비드에서 세척 후 탈리된 바이러스를 이용하여 RT-PCR을 실시하였다. 상기 PCR에 사용된 프라이머 서열을 다음과 같다: 간염 A형 바이러스용 프라이머 쌍, HAV_VP1_F(5'-tggtttgccatcaacactgagg-3'; 서열목록 제1서열) 및 HAV_VP1_R(5'-acccaaggagtatcaacggcaag-3'; 서열목록 제2서열); 및 노로바이러스용 프라이머 쌍, Noro_Mon431_F(5'-tggaciagrggiccyaayca-3'; 서열목록 제3서열) 및 Noro_Mon433_R(5'-ggayctcatccayctgaacat-3'; 서열목록 제4서열).

검출 대상 바이러스의 확인을 위해, HAV/NoV를 이용한 PCR 조건은 다음과 같다. HAV PCR 조건은 1 사이클 당 (a) 변성 단계, 94℃에서 30초; (b) 어닐링 단계, 57℃에서 30초; 및 (c) 연장 단계, 72℃에서 30초로 구성된 40 사이클의 증폭 단계 및 72℃에서 10분으로 구성된 최종 연장 단계로 실시하였다. 노로바이러스 PCR 조건은 1 사이클 당 (a) 변성 단계, 94℃에서 30초; (b) 어닐링 단계, 60℃에서 30초; 및 (c) 연장 단계, 72℃에서 30초로 구성된 40 사이클의 증폭 단계 및 72℃에서 10분으로 구성된 최종 연장 단계로 실시하였다.

그 결과, 식물-유래된 렉틴에 간염 A형 바이러스 및 노로바이러스가 검출 한계 수준까지 모두 결합하여 RT-PCR로 확인이 가능하였다(도 2 및 도 3). 간염 A형 바이러스 원액은 100배 희석 범위까지 검출이 확인되었으며, 식물-유래된 렉틴을 사용하여 간염 A형 바이러스를 검출하고자 할 때 검출 한계 수준 범위인 100배 희석된 검체까지 RT-PCR로 확인하였다. 노로바이러스 원액은 100배 희석 범위까지 확인되었으며, 식물-유래된 렉틴을 사용 시 100배까지 희석된 검체에서 노로바이러스가 확인되었다.

본 기술의 장점은 고가의 항체를 사용하지 않고 식물-유래된 렉틴을 활용하여 식중독-유발 바이러스를 신속히 분리하고 농축할 수 있는 기반을 제공해 줌으로써 종래의 분자생물학 및 면역학적 검출기법과 혼용하여 사용 시 쉽게 검출대상 바이러스를 검출할 수 있는 기술이라는 점이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 일 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Chonnam National University KOREA BASIC SCIENCE INSTITUTE <120> Rapid Methods for Detecting Hepatitis A Virus or Norovirus in a Sample Using a Magnetic Bead and Plant-Derived Lectins <130> PN130049 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HAV_VP1_F primer <400> 1 tggtttgcca tcaacactga gg 22 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HAV_VP1_R primer <400> 2 acccaaggag tatcaacggc aag 23 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Noro_Mon431_F primer <220> <221> modified_base <222> (6) <223> n indicates 'inosine' base <220> <221> modified_base <222> (12) <223> n indicates 'inosine' base <400> 3 tggacnagrg gnccyaayca 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Noro_Mon433_R primer <400> 4 ggayctcatc cayctgaaca t 21

Claims

(a) 아비딘(avidin) 또는 스트렙타비딘(streptavidin)이 연결된 자성 입자(magnetic particle) 및 (b) 바이오틴이 연결된 식물-유래된 렉틴(plant-derived lectins)을 포함하고, 상기 아비딘 또는 스트렙타비딘과 상기 바이오틴이 결합된 노로바이러스 또는 노로바이러스와 간염 A형 바이러스(hepatitis A virus, HAV) 검출용 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 자성 입자는 자성 비드(magnetic bead)인 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 식물-유래된 렉틴은 노로바이러스와 결합할 수 있는 단백질인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 시료 내 노로바이러스 또는 노로바이러스와 HAV와의 결합을 통해 자성 입자-렉틴-바이러스 복합체(magnetic particle-lectin-virus complex)를 형성하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물로부터 얻어진 노로바이러스 또는 노로바이러스와 HAV의 검출은 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reactions)을 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 조성물.
다음의 단계를 포함하는 시료 내 노로바이러스 또는 노로바이러스와 간염 A형 바이러스(hepatitis A virus, HAV) 검출 방법:
(a) 아비딘(avidin) 또는 스트렙타비딘(streptavidin)이 연결된 자성 입자(magnetic particle) 및 바이오틴이 연결된 식물-유래된 렉틴(plant-derived lectins)을 포함하고, 상기 아비딘(avidin) 또는 스트렙타비딘(streptavidin)과 상기 바이오틴이 결합된 바이러스 프로브를 제조하는 단계;
(b) 상기 바이러스 프로브를 시료에 첨가하는 단계; 및
(c) 상기 바이러스 프로브로부터 바이러스를 분리 및 검출하는 단계로, 상기 검출은 분리된 노로바이러스 또는 노로바이러스와 간염 A형 바이러스(hepatitis A virus, HAV)에 대한 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)을 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 바이러스, 세균, 조직, 세포, 림프, 골수액, 타액, 우유, 소변, 분변, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수, 양막액, 세포 조직액 또는 세포 배양액인 것을 특징으로 하는 방법.